7227589 疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-14

(45)【発行日】2023-02-22

(54)【発明の名称】疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230215BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230215BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230215BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

C07K14/47

C12Q1/02

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2018156104

(22)【出願日】2018-08-23

(65)【公開番号】P2020030120

(43)【公開日】2020-02-27

【審査請求日】2021-08-05

(73)【特許権者】

【識別番号】000125381

【氏名又は名称】学校法人藤田学園

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】杉原 一廣

(72)【発明者】

【氏名】柴田 俊章

(72)【発明者】

【氏名】小野寺 雄一郎

【審査官】西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４５３０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６７３５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０３１００８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１４－５０４８７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】SUGIHARA, K. et al，Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis，NATURE COMMUNICATIONS，2014年07月22日，Vol.5/No.4478，p.1-9

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）を発現している疾患の発症可能性を評価し、当該疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法であって、
被検動物から採取されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３を測定し、
得られた測定値を、予め設定された基準値と比較して、前記被検動物が前記疾患を発症している可能性を評価する、方法。

【請求項2】

前記測定値が、前記基準値超である場合に、前記被検動物は前記疾患を発症している可能性が高いと評価する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記エクソソームが前記被検動物から採取された血液から分離されたものである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ＣＮＧＢ３の測定を、配列番号２、４～７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記被検動物がヒトである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記疾患が、子宮内膜症又は癌である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

エクソソーム中のＣＮＧＢ３の量からなり、
子宮内膜症又は癌の発症の有無を評価するために用いられる、バイオマーカー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３を高発現している疾患の発症可能性を評価する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

疾患組織や当該組織を構成する細胞に特異的に存在する分子は、当該疾患のマーカーとして有用である。被験者から採取された生体サンプル中に疾患マーカーを調べることにより、当該被験者が当該疾患を発症しているかどうかや発症の可能性を評価することができる。被験者の負担軽減の点から、目的の疾患の発症の有無の検出や発症の可能性の評価は、できるだけ低侵襲なサンプルから調べられることが好ましい。

【0003】

一方で、細胞は様々な大きさの脂質二重膜に包まれた細胞外小胞を分泌していることが知られている。このうちのエクソソーム（exosome）の中には、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡといった核酸やタンパク質が含まれている。エクソソームは、正常細胞ではそれほど多く分泌されておらず、癌などの異常な状態の細胞で分泌量が増大することが報告されている。

【0004】

また、子宮内膜症は、子宮内膜細胞が子宮内腔以外の部位で増殖する疾患である。多くのケースにおいて、骨盤の腹膜や卵巣内で子宮内膜細胞が増殖する。代表的な症状は、月経痛（月経困難症）や不妊症であり、重篤な場合には、激しい疼痛が起こり、失神することもある。さらに、子宮内膜症を発生母体として、癌が発症する場合もある。

【0005】

特許文献１には、ＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）に特異的に結合するＺ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物が開示されている。ＣＮＧＢ３は、子宮内膜症細胞（子宮内膜以外に存在する子宮内膜細胞）の細胞表面に特異的に高発現しており、腹膜表面には発現していない分子である。両ペプチドを、Ｚ１３ペプチド部分により子宮内膜症細胞に共に取り込ませることにより、子宮内膜症細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導させることができる。実際に、子宮内膜症を発症しているヒヒに、Ｚ１３ペプチドとエンドソームエスケープペプチドとの融合ペプチドと、Ｚ１３ペプチドとアポトーシス誘導ペプチドとの融合ペプチドとを含むペプチド組成物を、腹腔鏡を介して腹膜に投与したところ、子宮内膜症の病変の細胞のみ選択的にアポトーシスが誘導され、隣接するその他の細胞ではアポトーシスは誘導されなかった（非特許文献１参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／１４５３０８号明細書

【非特許文献】

【0007】

【文献】Sugihara，et al.，NATURE COMMUNICATIONS、２０１４年、第５巻、記事番号４４７８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３を高発現している疾患の発症可能性を評価する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＣＮＧＢ３が、子宮内膜及び網膜のみならず、幾つかの癌細胞でも発現していること、及び発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３を発現している疾患に罹患している患者から分離されたエクソソームはＣＮＧＢ３を含むことを見出し、本発明を完成させた。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法及びバイオマーカーを提供するものである。
［１］ 発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３（cyclic nucleotide-gated channel beta 3）を発現している疾患の発症可能性を評価し、当該疾患の発症に関する診断のための情報を提供する方法であって、
被検動物から採取されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３を測定し、
得られた測定値を、予め設定された基準値と比較して、前記被検動物が前記疾患を発症している可能性を評価する、方法。
［２］ 前記測定値が、前記基準値超である場合に、前記被検動物は前記疾患を発症している可能性が高いと評価する、前記［１］の方法。
［３］ 前記エクソソームが前記被検動物から採取された血液から分離されたものである、前記［１］又は［２］の方法。
［４］ ＣＮＧＢ３の測定を、配列番号２、４～７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて行う、前記［１］～［３］の方法。
［５］ 前記被検動物がヒトである、前記［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］ 前記疾患が、子宮内膜症又は癌である、前記［１］～［５］のいずれかの方法。
［７］ エクソソーム中のＣＮＧＢ３の量からなり、
子宮内膜症又は癌の発症の有無を評価するために用いられる、バイオマーカー。

【発明の効果】

【0011】

本発明に係る疾患発症の評価方法及びバイオマーカーにより、子宮内膜症や癌などのＣＮＧＢ３を特異的に発現している疾患の発症可能性を簡便かつ効率よく評価することができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

＜ＣＮＧＢ３＞
ＣＮＧＢ３は、正常組織では、子宮内膜と網膜においてのみ高発現している膜タンパク質である。正常組織におけるＣＮＧＢ３の局在は非常に偏っており、松果体において中程度の発現が、骨髄、脈絡叢、輸卵管、眼、卵巣、及び精巣において弱い発現が確認されているのみである。ＣＮＧＢ３は、様々な癌細胞でも比較的強く発現している。ＣＮＧＢ３を発現している癌としては、例えば、子宮癌、子宮頸癌、骨盤腔癌、卵巣癌、乳癌、腹壁腫瘍、大網腫瘍、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、盲腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、舌癌、咽頭癌、鼻癌、耳下腺癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫、骨腫瘍、皮膚癌、肺癌、縦隔癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍等が挙げられる。同種の組織に由来する癌細胞であっても、ＣＮＧＢ３が発現している癌細胞と発現していない癌細胞がある。

【0013】

＜バイオマーカー＞
エクソソームには、当該エクソソームが放出された元の細胞の細胞膜に発現している生体分子を含む。前述の通り、ＣＮＧＢ３は、子宮内膜症細胞の細胞膜に多く発現しており、子宮内膜症細胞から放出されたエクソソームにはＣＮＧＢ３が含まれている。同様に、ＣＮＧＢ３は、様々な癌細胞でも発現しており、癌細胞から放出されたエクソソームにはＣＮＧＢ３が含まれている。このため、エクソソーム中のＣＮＧＢ３量は、子宮内膜症又は癌のバイオマーカーとして有用である。

【0014】

＜疾患発症可能性の評価方法＞
本発明に係る疾患発症可能性の評価方法（以下、「本発明に係る評価方法」ということがある。）は、エクソソーム中のＣＮＧＢ３をバイオマーカーとし、ＣＮＧＢ３を発現している疾患の発症可能性を評価する方法である。発症の原因となる細胞がＣＮＧＢ３を発現している疾患（以下、「ＣＮＧＢ３高発現疾患」ということがある。）を発症している動物の体内においては、当該疾患の原因細胞から、ＣＮＧＢ３を多く含むエクソソームが多く分泌されている。一方で、ＣＮＧＢ３は正常細胞では限られた組織でしか発現していないため、ＣＮＧＢ３高発現疾患を発症していない動物の体内には、ＣＮＧＢ３を多く含むエクソソームは非常に少ない。このため、エクソソーム中のＣＮＧＢ３量に基づいて、ＣＮＧＢ３高発現疾患の発症者群と非発症者群を識別することができる。本発明に係る評価方法は、被検動物から採取されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３を測定し、得られた測定値を予め設定された基準値と比較して、前記被検動物がＣＮＧＢ３高発現疾患を発症している可能性を評価する。

【0015】

ＣＮＧＢ３高発現疾患としては、子宮内膜症やＣＮＧＢ３を発現している癌が挙げられる。また、本発明に係る評価方法により評価される対象の被検動物としては、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物の生物種は特に限定されるものではなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サル、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ、イヌ、ネコ等の家畜や実験動物が挙げられる。本発明に係る評価方法により評価される対象の被検動物としては、ヒト、家畜、実験動物が好ましく、ヒトがより好ましい。

【0016】

具体的には、エクソソーム中のＣＮＧＢ３の測定値が、予め設定された基準値超である場合に、当該エクソソームが採取された被検動物は、ＣＮＧＢ３高発現疾患を発症している可能性が高いと評価する。当該基準値は、ＣＮＧＢ３高発現疾患の発症者と非発症者を識別するための基準値である。

【0017】

当該基準値は、例えば、ＣＮＧＢ３高発現疾患の患者群と非患者群のエクソソーム中のＣＮＧＢ３の量を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。本発明におけるエクソソーム中のＣＮＧＢ３量の基準値の決め方は特に限定されるものではなく、例えば、一般的な統計学的手法によって求められる。

【0018】

基準値の求め方の一例としては、例えば、一般的に行われている病理検査等の他の方法によって目的のＣＮＧＢ３高発現疾患の患者であると診断されている患者のエクソソームを採取してそのＣＮＧＢ３の量を測定する。複数の患者について測定した後に、その平均値又は中央値などによりこれらのエクソソーム中のＣＮＧＢ３量を算出し、これが含まれる数値を基準値とすることができる。

【0019】

また、複数のＣＮＧＢ３高発現疾患患者と複数のＣＮＧＢ３高発現疾患の非患者に対して、それぞれエクソソーム中のＣＮＧＢ３量を測定し、平均値又は中央値などによりＣＮＧＢ３高発現疾患患者群とＣＮＧＢ３高発現疾患非患者群のエクソソーム中のＣＮＧＢ３量とばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求め、これを基準値とすることができる。

【0020】

評価対象のＣＮＧＢ３高発現疾患が、ＣＮＧＢ３が発症の原因細胞において特異的に発現している場合、前記基準値は、ＣＮＧＢ３の検出限界値とすることができる。被検動物から採取されたエクソソーム中からＣＮＧＢ３が検出された場合には、当該被検動物は当該ＣＮＧＢ３高発現疾患に発症している可能性が高いと評価し、ＣＮＧＢ３が検出されなかった場合には、当該被検動物は当該ＣＮＧＢ３高発現疾患に発症していない可能性が高いと評価できる。

【0021】

被検動物から採取されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３の量の測定方法は、特に限定されるものではなく、タンパク質の発現を定量的又は半定量的に測定する際に一般的に使用される各種方法で測定することができる。当該方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法、ウェスタンブロット法等の免疫反応を利用した方法が挙げられる。また、被検動物から採取されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３量は、ＣＮＧＢ３を含むエクソソームの量として求めてもよい。ＣＮＧＢ３は主にエクソソームの脂質二重膜表面に存在している。このため、特定の表面分子を有するエクソソームを測定する各種の方法を適用することによっても、エクソソーム中のＣＮＧＢ３の量を測定できる。特定の表面分子を有するエクソソームを測定する装置としては、例えば、「Exo Counter」（ＪＶＣケンウッド社製）、「dNano」（メイワフォーシス社製）、「Nano Sight」（日本カンタム・デザイン社製）、「SP6800」ソニー（株）等のエクソソーム計測システムが挙げられる。

【0022】

免疫反応を利用した測定方法においては、いずれの抗ＣＮＧＢ３抗体を用いてもよい。市販されている抗ＣＮＧＢ３抗体としては、例えば、Biorbyt（Catalog No.orb156415BRT 100UG）、Osenses（Code; OSC00253W）等が挙げられる。また、抗ＣＮＧＢ３抗体に代えて、ＣＮＧＢ３と結合する分子を利用することができる。当該分子としては、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子等のいずれであってもよい。また、当該分子は、標識化物（ＣＮＧＢ３と結合する部位に、直接又は間接的に標識物質が結合したもの）であることも好ましい。当該標識物質は、特に限定されるものではなく、例えば、ビオチン等の低分子であってもよく、蛍光物質であってもよく、酵素であってもよく、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のタグペプチドであってもよい。

【0023】

例えば、ＣＮＧＢ３と結合するペプチド（以下、「ＣＮＧＢ３結合性ペプチド」ということがある。）としては、例えば、配列番号１（ＶＲＲＡＸＮＸＰＧ；Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸を表す。）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる（特許文献１）。配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１個、２個、又は３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつＣＮＧＢ３に対する結合能を保持しているペプチドや、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有しており、かつＣＮＧＢ３に対する結合能を保持しているペプチドが挙げられる。ＣＮＧＢ３結合性ペプチドとしては、具体的には、配列番号２（ＶＲＲＡＤＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｚ１３ペプチド」ということがある。）、配列番号３（ＶＲＲＡＥＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４（ＶＲＲＡＮＮＬＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５（ＶＲＲＡＮＮＲＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

【0024】

また、ＣＮＧＢ３結合性ペプチドとしては、例えば、配列番号６（ＭＱＲＴＲＡＴＰＧ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｚ２４ペプチド」ということがある。非特許文献１参照。）、配列番号６で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号７（ＶＲＳＳＲＳＴＰＱ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「Ｚ１１ペプチド」ということがある。非特許文献１参照。）、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチドを用いることもできる。

【0025】

免疫反応を利用した測定方法において使用されるＣＮＧＢ３と結合する分子としては、ＣＮＧＢ３結合性ペプチド又はその標識化物が好ましく、ＣＮＧＢ３との結合特異性が高いことから、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるペプチド、又はこれらの標識化物がより好ましく、Ｚ１３ペプチド又はその標識化物が特に好ましい。ＣＮＧＢ３結合性ペプチドとしては、ペプチド部分が全てＬ－アミノ酸からなるものを用いてもよく、Ｄ－アミノ酸からなるものを用いることもできる。例えば、ビオチン化Ｚ１３ペプチドと、酵素や蛍光で標識されたアビジンやストレプトアビジンのセットを用いることができる。

【0026】

なお、本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が欠失する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が置換する」とは、タンパク質を構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「タンパク質においてアミノ酸が付加される」とは、タンパク質中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。

【0027】

ＣＮＧＢ３量の測定に供されるエクソソームは、被検動物から採取されたものであればよく、被検動物から採取された生体試料そのものであってもよいが、当該生体試料から精製されたエクソソームであることが好ましい。生体試料からのエクソソームの分離は、例えば、市販のエクソソーム分離用キットを用いて行うことができる。

【0028】

エクソソームを含む生体試料としては、特に限定されるものではなく、血液、血漿、血清、涙液、唾液、腹腔液、尿等であってもよく、子宮粘膜や消化管粘膜のような粘膜や、肝臓、胃、小腸、大腸等の組織から採取された組織片であってもよい。中でも、血液、血漿、血清は、臨床検体として汎用されており、かつ比較的低侵襲的に採取することが可能である。このため、本発明に係る評価方法においてＣＮＧＢ３量の測定に供されるエクソソームとしては、被検動物から採取された血液、特に血漿又は血清から分離されたエクソソームが好ましい。本発明に係る評価方法は、血清等から分離されたエクソソームをサンプルとして実施できるため、健康診断のようなＣＮＧＢ３高発現疾患のファーストスクリーニングにも有効である。

【0029】

本発明に係る評価方法は、ＣＮＧＢ３高発現疾患の治療における治療効果の評価に用いることができる。例えば、ＣＮＧＢ３高発現疾患患者に対して、ＣＮＧＢ３高発現疾患の治療の開始前と終了後に、本発明に係る評価方法を実施する。当該治療によって、患者の体内において、ＣＮＧＢ３高発現疾患の原因細胞が減少した、若しくは、その生理活性が低下した場合には、当該患者の体内では、ＣＮＧＢ３高発現疾患の原因細胞から分泌されるエクソソームの量が低下する。このため、エクソソーム中のＣＮＧＢ３量が治療前と比較して治療後に有意に減少している場合には、当該治療により治療効果が得られた、と評価できる。また、エクソソーム中のＣＮＧＢ３量の減少の割合が大きければ大きいほど、高い治療効果が得られた、と評価できる。ＣＮＧＢ３高発現疾患の治療の開始前と終了後に加えて、治療期間中にも経時的に本発明に係る評価方法を実施することにより、治療効果をモニタリングすることもできる。

【0030】

また、ＣＮＧＢ３高発現疾患に少なくとも１度罹患した動物に対して、本発明に係る評価方法を経時的に実施することにより、当該罹患動物のＣＮＧＢ３高発現疾患の発症の有無をモニタリングすることができる。例えば、ＣＮＧＢ３高発現疾患が、癌や子宮内膜症のように、治癒した場合でも再発リスクが高い疾患の場合、ＣＮＧＢ３高発現疾患患者に対して本発明に係る評価方法を経時的に実施することにより、再発の有無をモニタリングすることができる。

【実施例】

【0031】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0032】

［参考例１］
各種臓器の癌組織のパラフィン包埋切片を、抗ＣＮＧＢ３抗体で免疫染色し、ＣＮＧＢ３の発現の有無を調べた。
組織切片は、市販されているヒトの卵巣癌組織アレイ（Ovary cancer tissue array）（US Biomax社製）４種のうちの２種類（OV20811及びOV2088）と、各種臓器の癌組織アレイ（Multiple organ tumor tissue array）のうちの２種類（FDA800a及びMC964a）を用いた。また、抗ＣＮＧＢ３抗体は、市販されている抗体のうち、Biorbyt（Catalog No.orb156415BRT 100UG）（以下、「抗体orb」ということがある。）及びOsenses（Code; OSC00253W）（以下、「抗体253W」ということがある。）の２種類を用いた。

【0033】

組織切片の免疫染色は以下の通りにして行った。まず、パラフィン包埋組織切片を、液状免疫実験用ブロッキング剤（イムノブロック、DSファーマバイオメディカル社製）で３０分間反応させて非特異的反応をブロッキングした後、ＴＢＳＴ（Tween 20含有トリス緩衝生理食塩水）による５分間の洗浄処理を２回行った。次いで、当該組織切片を、０．３％の過酸化水素水に浸漬させて５分間反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性のブロッキング処理を行った後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。続いて、当該組織切片を、抗ＣＮＧＢ３抗体をREAL Antibody Diluent（Code S2022、Dako社製）で１００倍に希釈した一次抗体溶液に浸漬させて室温で３０分間反応させた後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。さらに、当該組織切片を、標識二次抗体（EnVision+System-HRP 標識 Polymer 抗ウサギ抗体、Dako社製）と室温で３０分間反応させた後、ＴＢＳＴによる５分間の洗浄処理を２回行った。その後、当該組織切片を、ＤＡＢ発色試薬［DAB + Liquid （ラージサイズ）、RUO（K3468）、Dako社製］で５分間処理して発色させた。ＤＡＢ発色後の組織切片は、水洗した後、マイヤーヘマトキシリンで２分間処理して核を染色した後、封入した。

【0034】

ヒトの卵巣癌組織アレイのうちのOV20811の染色結果を表１～６に、OV2088の染色結果を表７～１２に、それぞれ示す。各種臓器の癌組織アレイのうちのFDA800aの染色結果を表１３、１４に、MC964aの染色結果を表１５～１７に、それぞれ示す。表中、各抗ＣＮＧＢ３抗体の欄が「＋」は当該抗体で免疫染色された結果を、「－」は当該抗体で免疫染色されなかった結果を、それぞれ意味する。大部分の組織切片が抗ＣＮＧＢ３抗体による免疫染色されており、ＣＮＧＢ３が発現していることがわかった。

【0035】

【表1】

【0036】

【表2】

【0037】

【表3】

【0038】

【表4】

【0039】

【表5】

【0040】

【表6】

【0041】

【表7】

【0042】

【表8】

【0043】

【表9】

【0044】

【表10】

【0045】

【表11】

【0046】

【表12】

【0047】

【表13】

【0048】

【表14】

【0049】

【表15】

【0050】

【表16】

【0051】

【表17】

【0052】

［実施例１］
血液から分離されたエクソソーム中のＣＮＧＢ３量を測定し、ＣＮＧＢ３高発現疾患患者とＣＮＧＢ３高発現疾患の非罹患者を識別できるかを調べた。なお、以降の実験は、浜松医科大学制度審査委員会の承認を受けて行われた。

【0053】

＜血清サンプル＞
健常者（腫瘤を持たず、何等かの疾患への罹患が確認されておらず、健康と予想されるヒト）２名、及び浜松医科大学大学病院の患者（卵巣癌患者３名、子宮体癌患者３名、乳癌患者３名、子宮頸癌患者１名、大腸癌患者２名、子宮内膜症患者３名、及び子宮腺筋症患者１名）から採取された血液を遠心分離し、得られた血清アリコートを－８０℃で保存した。子宮腺筋症患者は、子宮内膜症と子宮筋腫の両方を発症している患者である。

【0054】

＜エクソソーム分離＞
エクソソームは、Exosome Isolation Kit（富士フィルム・和光純薬社製）を用い、製造者の使用説明書に従って血清から単離した。具体的には、まず、血清を１，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。次いで、この上清１．０ｍＬを、エクソソーム捕捉ビーズと４℃で１８０分間、ローテーターで混合した。その後、当該補足ビーズを洗浄した後、１００μＬの溶出バッファーでエクソソームを溶出し、－２０℃で保存した。

【0055】

＜ペプチド合成＞
Ｚ１３ペプチド（ＶＲＲＡＤＮＲＰＧ：配列番号２）にビオチンを結合させたビオチン化Ｚ１３ペプチド（Ｌ－アミノ酸からなるペプチド）は、GenScript社により合成されたものを用いた。

【0056】

＜アビジンブロッティング＞
８００μＬの血清から単離されたエクソソームを濃縮Laemmli緩衝液と混合して測定サンプルを調製した。当該測定サンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、次いでＰＶＤＦ膜に移した。ＰＶＤＦ膜を室温で６０分間、５％ＢＳＡ含有ＴＢＳＴ（０．１ｖ／ｖ％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中でブロッキングした。ブロッキング後のＰＶＤＦ膜は、洗浄後、１．０μｇ／ｍＬのビオチン化Ｚ１３ペプチド含有ＴＢＳＴ中、４℃で一晩インキュベートした。その後、当該膜をＴＢＳＴで洗浄し、続いて、０．１μｇ／ｍＬ ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合アビジン（Thermo Fisher Scientific社製）含有ＴＢＳＴ中、室温で６０分間インキュベートした。当該膜上のＣＮＧＢ３は、ＣＣＤカメラシステム（ATTO社製）及びＥＣＬ ｐｒｉｍｅ（GE Healthcare社製）を用いて検出した。デンシトメトリー分析は、画像解析ソフトウェア「CS Analyzer 4」（ATTO社製）を用いて行った。

【0057】

＜統計分析＞
全ての分析は、医学統計ソフトウェア「GraphPad Prism 6」（GraphPad Software社製）を用いて行った。

【0058】

各測定サンプルのアビジンブロッティングの結果に得られたＣＮＧＢ３のバンドのシグナル強度及びその相対値（健常者１のシグナル強度を１とした相対値）を表１８に示す。ただし、乳癌患者１及び２は、少量の血清しか確保できなかったため、１００μＬの血清より単離したエクソソームを用い、乳癌患者３は、３７．５μＬの血清から単離したエクソソームを用いた。そのため、乳癌患者サンプルのシグナル強度は、血清使用量の逆数を乗じることで補正を行った。

【0059】

【表18】

【0060】

この結果、全てのサンプルにおいて、ＣＮＧＢ３のバンドが検出され、これらのエクソソームにはＣＮＧＢ３が含まれていることが確認された。癌患者、子宮内膜症患者、及び子宮腺筋症患者から分離されたエクソソームのＣＮＧＢ３量は、健常者から分離されたエクソソームの２倍以上であった。これらの結果から、腫瘍患者、子宮内膜症患者、及び子宮腺筋症患者のような、疾患の原因細胞でＣＮＧＢ３が高発現している患者の血清から分離されたエクソソームには、健常者の血清から分離されたエクソソームよりも有意に多くのＣＮＧＢ３が含まれており、よって、適切な基準値（カットオフ値）を設定することにより、エクソソーム中のＣＮＧＢ３の量に基づいてＣＮＧＢ３高発現疾患の発症の可能性が評価できることが確認できた。

【0061】

また、健常者のエクソソームにも非常に少量ではあるがＣＮＧＢ３が存在していることが確認された。これは、ＣＮＧＢ３結合性ペプチドのようなＣＮＧＢ３との結合性の高い分子を用いたことにより、血清中のエクソソームのＣＮＧＢ３を非常に高感度に検出できたためと推察された。健常者の体内にある極めて微量の癌細胞から放出されたＣＮＧＢ３を含むエクソソームが検出できたことから、ＣＮＧＢ３結合性ペプチドを利用することにより、血清中のエクソソームを検体とした場合でも、進行癌が検出できるだけではなく、非常に早期の癌の検出も可能であることが期待できる。

【配列表】

0007227589000001.app