7227640 ポリヌクレオチドトランスフェクションのための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-14

(45)【発行日】2023-02-22

(54)【発明の名称】ポリヌクレオチドトランスフェクションのための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20230215BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20230215BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20230215BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20230215BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20230215BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20230215BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230215BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105

A61K47/64 ZNA

A61K47/42

A61K9/16

A61K9/51

A61K31/713

A61K48/00

A61P35/00

A61P19/02

A61P43/00 105

C12N15/87 Z

C07K7/08

C07K14/00

C12N15/113 Z

【請求項の数】 11

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021028926

(22)【出願日】2021-02-25

(62)【分割の表示】P 2019039619の分割

【原出願日】2014-01-03

(65)【公開番号】P2021100933

(43)【公開日】2021-07-08

【審査請求日】2021-03-26

(31)【優先権主張番号】61/748,615

(32)【優先日】2013-01-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/869,634

(32)【優先日】2013-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/873,187

(32)【優先日】2013-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597025806

【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル・エイ・ウィックリン

(72)【発明者】

【氏名】カーク・ホウ

【審査官】井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】The FASEB Journal, 2012.04, Vol. 26, No. 1 Supplement 1037.4

【文献】European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2005.04, Vol. 59, No. 3, p. 419-429

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物であって、前記ペプチド－ポリヌクレオチド複合体が、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドのモル比率を有し、前記ペプチドが（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、２個以上の近接した塩基性アミノ酸（カチオン性領域）を有し、前記カチオン性領域に隣接して位置する１つ以上のヒスチジン残基を含む、前記薬学的組成物。

【請求項2】

前記ペプチド：ポリヌクレオチドのモル比率が、約５０：１～約１００：１である、請求項１に記載の前記組成物。

【請求項3】

前記複合体が、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有するナノ粒子である、請求項１または２に記載の前記組成物。

【請求項4】

前記ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれかに記載の前記組成物。

【請求項5】

前記ポリヌクレオチドが、核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡである、請求項１～４のいずれかに記載の前記組成物。

【請求項6】

前記ポリヌクレオチドが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１～５のいずれかに記載の前記組成物。

【請求項7】

前記複合体が、アルブミンで被覆されている、請求項１～６のいずれかに記載の前記組成物。

【請求項8】

前記複合体の前記ポリヌクレオチドが、ＳＴＡＴ３、ＪＮＫ２、ｐ６５、及びｐ１００／５２からなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を妨害する、請求項１～７のいずれかに記載の前記組成物。

【請求項9】

ポリヌクレオチドを細胞の細胞質に送達するインビトロ方法であって、細胞をペプチド－ポリヌクレオチド複合体と接触させることを含み、前記ペプチド－ポリヌクレオチド複合体が、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドのモル比率を有し、前記ペプチドが、（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、２個以上の近接した塩基性アミノ酸（カチオン性領域）を有し、前記カチオン性領域に隣接して位置する１つ以上のヒスチジン残基を含む、前記方法。

【請求項10】

ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む組成物であって、前記ペプチド－ポリヌクレオチド複合体が、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドのモル比率を有し、前記ペプチドが（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列が、２個以上の近接した塩基性アミノ酸（カチオン性領域）を有し、前記カチオン性領域に隣接して位置する１つ以上のヒスチジン残基を含み、前記組成物が：
（ｉ）ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合したヌクレオチドを妨害し、それにより腫瘍の治療的処置に用いられる；
（ｉｉ）ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合したヌクレオチドを妨害し、それにより関節炎の治療的処置に用いられる；
（ｉｉｉ）細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害し、それにより血管新生を阻害するため用いられる；
（ｉｖ）細胞におけるＪＮＫ２の発現を妨害し、それにより泡沫細胞形成を阻害するために用いられる；または
（ｖ）細胞におけるｐ６５の発現を妨害し、それにより関節炎の治療的処置に用いられる、ここで、前記ポリヌクレオチドは、それを必要とされる対象における細胞の細胞質に送達される、ものである、
前記組成物。

【請求項11】

（ａ）前記ポリヌクレオチドが、ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合したヌクレオチドを妨害する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドが、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドが、細胞におけるＪＮＫ２の発現を妨害する、または
（ｅ）前記ポリヌクレオチドが、細胞におけるｐ６５の発現を妨害する、
請求項９に記載の前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により認可された補助金番号Ｕ０１ ＣＡ１４１５４１及びＲ０１ ＨＬ０７３６４６－０８による政府の支援の下行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年９月３日に出願された米国仮出願第６１／８７３，１８７号、２０１３年８月２３日に出願された米国仮出願第６１／８６９，６３４号、及び２０１３年１月１日に出願された米国仮出願第６１／７４８，６１５号の優先権を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、薬学的組成物として製剤することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体、及びその使用方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、癌及び炎症疾患を含む数多くの疾患の高度に有効な療法として提案されてきた。しかしながら、２０年近くにわたる集中的な研究にもかかわらず、ｓｉＲＮＡ治療薬は、細胞取り込みの不良及び血清中の遊離ｓｉＲＮＡの不安定性により、臨床用途への移行において限定的な成功を示してきた。カチオン性脂質及びポリマーは、ｓｉＲＮＡトランスフェクションに関しては首尾よく採用されてきたが、許容できない細胞毒性を呈し、反応性酸素種（ＲＯＳ）及びＣａ^＋２漏出を発生させる可能性がある。加えて、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に基づくｓｉＲＮＡトランスフェクション剤は、細胞毒性の減少に関して期待されるが、リソソーム捕捉により、従来の脂質トランスフェクション剤の高効率を達成していない。

【0005】

したがって、疾患を治療するために効率的な細胞取り込み及び細胞質内への送達を可能にする新しいクラスの治療的ｓｉＲＮＡ組成物及びｓｉＲＮＡトランスフェクション剤の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物を包含する。ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドの比率を有する。このペプチドは、（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列である。ある態様では、ペプチドは、少なくとも１つのカチオン性領域、及びペプチドの少なくとも１つのカチオン性領域に隣接して位置する少なくとも１つのヒスチジン残基を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは、核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡである。

【0007】

本発明は、細胞の細胞質にポリヌクレオチドを送達する方法も包含する。本方法は、細胞をペプチド－ポリヌクレオチド複合体と接触させることを含み、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドの比率を有し、ペプチドは、（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様では、このペプチドは、少なくとも１つのカチオン性領域、及びペプチドの少なくとも１つのカチオン性領域に隣接して位置するか、またはその領域内に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは、核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡである。

【0008】

本発明は、細胞の細胞質にポリヌクレオチドを送達することを必要とする対象にそれを行う方法も包含する。本方法は、治療有効量のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物を対象に投与することを含み、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、約５０：１を超え、約２００：１未満のペプチド：ポリヌクレオチドの比率を有し、ペプチドは、（ａ）非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができ、かつ（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様では、このペプチドは、少なくとも１つのカチオン性領域、及びペプチドの少なくとも１つのカチオン性領域に隣接して位置するか、またはその領域内に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基を含む。別の態様では、このポリヌクレオチドは、核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡである。

【0009】

本発明は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができるペプチドをコードするアミノ酸配列も包含する。

【0010】

本発明は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドも包含し、ペプチドは、非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができる。

【0011】

本発明の他の態様及び反復は、以下により詳細に説明される。

【0012】

カラー図面の参照
本出願書類は、少なくとも１つのカラー写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】（Ａ）ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ比の最適化は、最大１５０：１のｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡまで、ｐ５ＲＨＨ量の増加と共にトランスフェクションの効率の増加を明らかにする、及び（Ｂ）アラマーブルーアッセイは、５０ｎＭのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合、最大２００：１のｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比で細胞毒性がないことを示すことを示す、２つのプロットを示す。

【0014】

【図2】（Ａ）５０：１のｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比が完全にｓｉＲＮＡを複合するのに必要とされることを示すゲル遅延度アッセイ、及び（Ｂ）粒径のＳＥＭ分析は、直径が１００ｎｍ～２００ｎｍの小さい複合体を明らかにする動的光散乱データを確認することを示す、電気泳動ゲル及びＳＥＭ顕微鏡写真を示す。（スケールバー１００ｎｍ）

【0015】

【図3-1】（Ａ）フローサイトメトリーによる用量応答は、ｐ５ＲＨＨ媒介トランスフェクションがリポフェクタミン２０００より効率的ではないことを示すが、５ｎＭの低濃度で目に見えるノックダウンを伴う高いｓｉＲＮＡトランスフェクション効率も示す、ウエスタンブロットのプロット及び画像を示す。（Ｂ）アラマーブルーアッセイは、ｐ５ＲＨＨが最大２００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で最小毒性を呈することを示す。ＧＦＰ ｍＲＮＡのウエスタンブロット（Ｃ）及びＲＴ－ＰＣＲ（Ｄ）分析は、配列特異的様式及び約５０ｎＭのＩＣ５０でｐ５ＲＨＨがｍＲＮＡレベルを減少させる能力を確認する。ウエスタンブロット（Ｅ）及びＲＴ－ＰＣＲ（Ｆ）により決定されるように、リポフェクタミン２０００は、１０～２５ｎＭのＩＣ５０で高いトランスフェクション効率を有する。

【図3-2】図３－１に同じ。

【図3-3】図３－１に同じ。

【0016】

【図4-1】（Ａ）フローサイトメトリーを介してＢ１６ＧＦＰ細胞のＧＦＰのノックダウンに関してスクリーニングした際、非機能性メリチン誘導体であるｐ５ＲＷＲがｓｉＲＮＡトランスフェクション能力を呈さないことを示す。ｓｉＲＮＡは送達されたが、５０μＭのクロロキンと共にインキュベートされるまで細胞質に達しない。（Ｂ、Ｃ）共焦点顕微鏡は、ｐ５ＲＷＲが５０μＭのクロロキンと共にインキュベートされなければ細胞質内への顕著なオリゴヌクレオチド放出を顕在化しないことを示すフローサイトメトリーデータを確認する。（Ｄ、Ｅ）比較すると、ｐ５ＲＨＨは、リポフェクタミン２０００を介して、オリゴヌクレオチド送達と類似する細胞質内への十分なオリゴ放出を示す。

【図4-2】図４－１に同じ。

【図4-3】図４－１に同じ。

【0017】

【図5-1】ｐ５ＲＨＨ（Ａ）がＢ１６細胞におけるＳＴＡＴ３タンパク質レベルの減少の開始時にリポフェクタミン２０００（Ｂ）より約５倍効率が良くないことを示すウエスタンブロットデータを示す。ＲＴ－ＰＣＲデータは、ｐ５ＲＨＨ（Ｃ）が５０ｎＭを下回る濃度で活性を失う一方で、リポフェクタミン２０００（Ｄ）が１０ｎＭの低用量で活性を呈することを示す。アラマーブルーによるＢ１６生存率分析は、ｐ５ＲＨＨ（Ｅ）トランスフェクションが配列特異的様式で癌遺伝子発現を発現停止させることによりＢ１６の生存率の減少をもたらす一方で、リポフェクタミン２０００（Ｆ）が非特異的用量依存細胞毒性をもたらすことを示す。

【図5-2】図５－１に同じ。

【図5-3】図５－１に同じ。

【0018】

【図6】ｐ５ＲＨＨ（Ａ）またはリポフェクタミン２０００（Ｂ）によりスクランブルされたまたはＳＴＡＴ３特異的ｓｉＲＮＡを送達する場合の、Ｂ１６細胞におけるＳＴＡＴ３タンパク質レベルの定量化を示す。データは、３つの独立した実験の平均として提示される。

【0019】

【図7-1】（Ａ）ウエスタンブロットは、ＳＴＡＴ３特異的ｓｉＲＮＡで処理されたＨＵＶＥＣにおけるＳＴＡＴ３タンパク質レベルの用量依存減少を示す。（Ｂ）ＲＴ－ＰＣＲデータは、２００ｎＭの高濃度でのＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡにおけるｐ５ＲＨＨ依存６０％ノックダウンを図示する。（Ｃ）ｐ５ＲＨＨは、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした場合、ＨＵＶＥＣ細胞に対して細胞毒性を有さない。（Ｄ）ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡで処理されたＨＵＶＥＣは、（Ｇ）において定量化されるように、対照（Ｅ、Ｆ）と比較した場合、マトリゲル上で６０％の管形成を減少させたことを示す。管形成の減少は、顕微鏡（Ｈ）及びアラマーブルーアッセイ（Ｉ）により決定されるトランスウェル遊走アッセイにおいて、ｂＦＧＦに応答してＨＵＶＥＣ遊走の４０％減少が伴う。

【図7-2】図７－１に同じ。

【図7-3】図７－１に同じ。

【図7-4】図７－１に同じ。

【図7-5】図７－１に同じ。

【0020】

【図8】ｐ５ＲＨＨをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣからのＳＴＡＴ３タンパク質レベルの定量化が約５０ｎＭのＩＣ５０を示すことを示す。３つの独立した実験の平均。

【0021】

【図9-1】（Ａ）リポフェクタミン２０００を使用するＳＴＡＴ３のノックダウンが１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示し、（Ｂ）定量化を示す、代表的なウエスタンブロットを示す。ＲＴ－ＰＣＲは、１０ｎＭでの強力なノックダウンを確認する（Ｃ）。高いｓｉＲＮＡ送達効率にも関わらず、リポフェクタミン２０００は、大規模な細胞毒性をもたらし、わずか５０ｎＭのｓｉＲＮＡで、細胞生存率において＞５０％の減少を伴う。

【図9-2】図９－１に同じ。

【0022】

【図10】スクランブルされたｓｉＲＮＡで処理された試料と比較して、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡがＨＵＶＥＣの移動を＞５０％減少させたことを示す、蛍光顕微鏡によるｂＦＧＦ勾配に応答するＨＵＶＥＣ移動の定量化を示す。

【0023】

【図11-1】（Ａ）ウエスタンブロット分析が、ＩＣ５０＜２５ｎＭのｐ５ＲＨＨによる、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＪＮＫ２のノックダウンを示すことを示す。（Ｂ）重要なことに、ｐ５ＲＨＨは、１００ｎＭのスクランブルされたｓｉＲＮＡをトランスフェクトした際、細胞生存率において約５％の減少しかもたらさない。（Ｃ～Ｅ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡのＪＮＫ２のノックダウンは、スクランブルされたｓｉＲＮＡで処理された細胞及び未処理の対照と比較した場合、５０μｇ／ｍＬのＡｃ－ＬＤＬで一晩インキュベートしたときに、ＲＡＷ２６４．７細胞における脂肪滴蓄積の強力な減少を示す。

【図11-2】図１１－１に同じ。

【0024】

【図12】リポフェクタミン２０００がＩＣ５０＜２５ｎＭによりＲＡＷ２６４．７細胞のＪＮＫ２をノックダウンすることを示すが（Ａ）、１０ｎＭの低濃度で大規模な細胞毒性を誘発する（Ｂ）ことを示す。

【0025】

【図13】（Ａ）５０μｇ／ｍＬのＨＳＡによるｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡナノ粒子の３０分または一晩のインキュベーションは、新しく調製されたｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡナノ粒子と比較した場合、ＧＦＰノックダウンの改善を特徴とすることを示す。（Ｂ）１０％のＦＢＳで補足された正常な細胞培養培地にトランスフェクトされたＢ１６細胞の共焦点顕微鏡は、細胞質内への十分なオリゴヌクレオチド放出を示す。

【0026】

【図14】ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子のアセンブリを示す模式的及び原子間力顕微鏡画像を示す。（Ａ）アルブミン安定化ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子形成のスキーム。（Ｂ）ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の湿式ＡＦＭ撮像は、約５５ｎＭ±１８の平均粒径を明らかにする。

【0027】

【図15】ｓｉＲＮＡ粒子及び粒子のトランスフェクション効率を示すグラフ及び電子顕微鏡図を示す。（Ａ）ｐ５ＲＨＨとパッケージングされた場合、５０ｎＭの最終ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ濃度でＧＦＰノックダウンを呈する細胞のパーセンテージにより測定される、示される期間インキュベートされた複合体のトランスフェクション効率。このデータは、４０分のｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡインキュベーションが最大のトランスフェクションに最適なインキュベーション期間を提供することを示す。（Ｂ）示された期間インキュベートされた粒子は、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ粒子が＜１００ｎｍの大きさを有することを示す。

【0028】

【図16】４℃でのｐ５ＲＨＨ／Ａｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡナノ粒子の取り込み（Ｃ）が３７℃での取り込み（Ｂ）と比較して劇的に減少することを示すグラフを示す。未処理の細胞は、比較のために示される（Ａ）。

【0029】

【図17-1】ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の取り込み及び共局在を示すグラフ及び顕微鏡画像を示す。（Ａ～Ｄ）４０分のｐ５ＲＨＨ／Ａｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡナノ粒子の取り込みは、処理された細胞の６０％が（Ａ）ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を取り込むことを示す。飲食作用阻害剤の存在は、（Ｂ）１００μｇ／ｍＬのフィリピン（小窩阻害剤）及び（Ｃ）１０μＭのＰＡＯ（クラスリン媒介飲食作用阻害剤）がｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の取り込みを阻害しないことを示す。あるいは、（Ｄ）マクロ飲作用阻害剤（ＥＩＰＡ、８０μＭ）による処理がナノ粒子の取り込みをほぼ消失させる。（Ｅ～Ｊ）共焦点顕微鏡により決定される共局在は、ｐ５ＲＨＨ／Ｃｙ－３ ｓｉＲＮＡナノ粒子がＦＩＴＣ－７０ｋＤａデキストラン（Ｊ）と共に取り込まれたが、ＦＩＴＣ－トランスフェリン（Ｉ）と共には取り込まれないことを示す。スケールバー１０μｍ。

【図17-2】図１７－１に同じ。

【図17-3】図１７－１に同じ。

【0030】

【図18】飲食作用阻害剤が示される経路に特異的なマーカーの取り込みのみを阻害することを示すグラフを示す。

【0031】

【図19】１時間以内にＣｙ－３－ｓｉＲＮＡの細胞質放出を示す顕微鏡画像を示す。

【0032】

【図20】（Ａ～Ｃ）バフィロマイシンＡ１の不在下のトランスフェクションと比較して（Ｂ）、バフィロマイシンＡ１がｐ５ＲＨＨ／Ａｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡナノ粒子の取り込みを阻害しない（Ｃ）ことを示すグラフを示す。（Ｄ～Ｆ）一方、バフィロマイシンＡ１の不在下のトランスフェクションと比較して（Ｅ）、バフィロマイシンＡ１は、ＧＦＰ（Ｆ）のノックダウンを遮断し、エンドソームの酸性化がｐ５ＲＨＨ媒介ｓｉＲＮＡのトランスフェクションに重要であることを示す。

【0033】

【図21-1】（Ａ）ｓｉＲＮＡに結合するＴＯＰＲＯ３からの蛍光がｐ５ＲＨＨ（■）を介してパッケージングされる場合、ｐＨ≦５．５で劇的に増加するが、非機能性ペプチドｐ５ＲＷＲ（◆）では増加しないことを示すグラフ及び顕微鏡画像を示す。（Ｂ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ｐ５ＲＨＨはｐＨ４．５でｓｉＲＮＡを放出するが、ｐ５ＲＷＲはｐＨ依存放出を示さないことを確認する。（Ｃ）ｐ５ＲＨＨは低ｐＨでも放出され、ｐＨ≦５．５でｐ５ＲＨＨ放出が増加する。（Ｄ）遊離ｐ５ＲＨＨは、溶血を可能にし、ｐＨ≦５．５でヘモグロビン放出の増加をもたらす。（Ｅ～Ｈ）アクリジンオレンジ放出アッセイは、１００μＭクロロキンと類似する色素放出（Ｆ）によって示されるように、組織培養で試験された場合、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子はエンドソームを妨害することができる（Ｈ）一方、ｐ５ＲＷＲは妨害できない（Ｇ）ことを示す。（Ｉ～Ｋ）様々なｐＨ値でのペプチド－ポリヌクレオチド複合体の解体を示す模式図である。スケールバー５０μｍ。

【図21-2】図２１－１に同じ。

【図21-3】図２１－１に同じ。

【図21-4】図２１－１に同じ。

【0034】

【図22】（Ａ）正規化された溶血が、遊離ｐ５ＲＨＨがＲＢＣを妨害する能力において、ｐＨに依存した減少を示すことを示す２つのグラフを示す。対照的に、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｐＨの減少に伴いＲＢＣの破壊において増加を示し、ｐＨ５．５で遊離ｐ５ＲＨＨの同じ溶解能を回復する。結果は、別の実験で記録されたｐＨ７．５の１００μＭのｐ５ＲＨＨにより最大溶解に正規化された分画溶血として報告される。（Ｂ）０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘにより最大溶血に正規化されたＲＢＣ溶血は、ｐ５ＲＨＨが２００～４００μＭのＩＣ_５０のＲＢＣを溶解することを示す。

【0035】

【図23-1】（Ａ）Ｂ１６ ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰのノックダウンは、ｐ５ＲＨＨのみがＧＦＰ ｓｉＲＮＡを細胞質に首尾よく送達できることを明らかにする一方、ｐ５ＲＷＲはクロロキンにより誘発されたエンドソーム流出を伴っても送達できないことを示すグラフ及び顕微鏡画像を示す。（Ｂ）ＦＡＣＳは、ｐ５ＲＷＲ及びｐ５ＲＨＨの両方が類似する量のａｌｅｘａ４８８標識されたｓｉＲＮＡを送達することを明らかにする。未処理対照（赤色の四角）；５０ｎＭのａ４８８ ｓｉＲＮＡ／ｐ５ＲＷＲ（ベージュ色の四角）；５０ｎＭのａ８８ ｓｉＲＮＡ／ｐ５ＲＷＲ＋クロロキン（青色の四角）；５０ｎＭのａ４８８ ｓｉＲＮＡ／ｐ５ＲＨＨ（緑色の四角）；５０ｎＭのａ８８ ｓｉＲＮＡ／ｐ５ＲＨＨ＋クロロキン（青緑色の四角）。共焦点顕微鏡（スケールバー１０μｍ）は、ｐ５ＲＷＲ（Ｃ）が点状小胞に留まることによりｓｉＲＮＡを送達する一方、ｐ５ＲＨＨは細胞質分布（Ｄ）を達成することを明らかにする。クロロキンとの同時インキュベーションは、ｐ５ＲＷＲによりトランスフェクトされる場合、細胞質にｓｉＲＮＡを放出すること必要とするが（Ｅ）、ｐ５ＲＨＨ媒介トランスフェクション（Ｆ）に対する作用はない。

【図23-2】図２３－１に同じ。

【0036】

【図24-1】（Ａ、Ｂ）ウエスタンブロットが、スクランブルされたｓｉＲＮＡでＦ８細胞を処理した場合に見られないｐ１００／ｐ５２またはｐ６５発現において用量依存減少を示すことを示す、ウエスタンブロット、グラフ、及び顕微鏡画像を示す。（Ｃ）トランスフェクション４８時間後のアラマーブルーアッセイは、スクランブルされたｓｉＲＮＡ（■）がＦ８細胞生存率に影響を及ぼさないことを明らかにする。ｐ６５ ｓｉＲＮＡ（▲）による標準ＮＦκＢ経路のノックダウンは、ほぼ２００ｎＭのＩＣ_５０を有する。ｐ１００／ｐ５２ ｓｉＲＮＡ（●）による非標準ＮＦκＢ経路の標的指向は、１００ｎＭのＩＣ_５０をもたらす。しかしながら、標準及び非標準両方のＮＦκＢ経路の同時遮断（◆）は、ＩＣ_５０を５０ｎＭに向上する。ＩＶＩＳ撮像（スケールバー５ｍｍ）は、Ｃｙ５．５標識されたｓｉＲＮＡの、処置されたマウスの腫瘍への腫瘍局在を明らかにし（Ｅ）、共焦点顕微鏡（Ｇ）により確認される（スケールバー５０μｍ）。未処理対照は比較のために示される（Ｄ、Ｆ）。

【図24-2】図２４－１に同じ。

【図24-3】図２４－１に同じ。

【0037】

【図25】ｐ５ＲＨＨ／Ｃｙ５．５ ｓｉＲＮＡナノ粒子を注射されたマウスからの腫瘍が周辺にＣｙ５．５ ｓｉＲＮＡ蓄積を呈する 一方、限られたＣｙ５．５ ｓｉＲＮＡが腫瘍の中心で見られることを示す共焦点顕微鏡画像を示す。（スケールバー５０μｍ）

【0038】

【図26】ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ粒子を使用する細胞質内へのｓｉＲＮＡ送達の模式図を示し、細胞内への侵入、ならびにエンドソーム及びペプチド／ｓｉＲＮＡ粒子から細胞質内へのｓｉＲＮＡの放出を示す。

【0039】

【図27】生理食塩水対照を投与された動物（Ａ）、及びＣｙ５．５標識ＮＦκＢ ｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡを投与された動物（Ｂ）からの臓器及び腫瘍のＩＶＩＳ画像を示す。

【0040】

【図28-1】リポフェクタミン２０００（Ｂ、Ｄ）と比較した、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ（Ａ、Ｃ）の細胞毒性を示すノーザンブロット及びグラフを示す。

【図28-2】図２８－１に同じ。

【0041】

【図29】コラーゲン抗体誘発マウスモデル及びｓｉＲＮＡの投与の模式図を示す。

【0042】

【図30】（Ａ）足首の厚さ、及び（Ｂ）生理食塩水を投与された動物の関節炎スコア、ならびにスクランブルされたｓｉＲＮＡまたは標準経路のｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた動物を示すグラフ及びＩＶＩＳ画像を示す。（Ｃ）生理食塩水、または標準経路のｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡを投与された動物のＩＶＩＳ画像。

【0043】

【図31】超音波エントロピー撮像を使用した、標準経路のｐ６５サブ単位を標的とするｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡを使用した関節炎療法の有効性を示す画像を示す。

【0044】

【図32-1】コラーゲン抗体誘発関節炎（ＣＡＩＡ）におけるｐ６５－ｓｉＲＮＡナノ療法（ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｙ）が有効であることを示す画像及びグラフを示す。関節炎は、０日目に１．５ｍｇの５－クローン抗体カクテルのｉ．ｐ．注射、続いて、３日目に５０ｕｇのＬＰＳの注射により誘発された。初期関節炎が確立された４日目に、静脈投与される生理食塩水、スクランブルされたナノ粒子、及びｐ６５－ｓｉＲＮＡナノ粒子の３つの処置群（Ｔｘ）にマウスを無作為に分けた。 ４、５、及び６日目。脚は１０日目に撮影した（Ａ～Ｃ）。足首の厚さ（Ｄ）、関節炎スコア（Ｅ）、及び体重損失％（Ｆ）の変化は、毎日記録された。値は平均±ＳＥＭとして提示され、処置群当りｎ＝６～８匹のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図32-2】図３３－１に同じ。

【0045】

【図33-1】ｐ６５－ｓｉＲＮＡナノ療法がＣＡＩＡにおいてｐ６５発現及び炎症を抑制することを示す免疫ブロット及びグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、脚を採取し、均質化し、取り除いた溶解物をｐ６５発現に関してブロットした（Ａ）。溶解物は、サイトメトリービーズアレイ及びＥＬＩＳＡにより炎症サイトカイン［ＴＮＦα（Ｂ）、ＩＬ－１β（Ｃ）、ＩＬ－６（Ｄ）、ＭＣＰ－１（Ｅ）］に関してもアッセイされた。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図33-2】図３３－１に同じ。

【0046】

【図34-1】ナノ粒子投与後の血液学的パラメータを示すグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、ＷＢＣ及び分析血液像のために血液を得た。処置群当りｎ＝６～８匹のマウス。（Ａ）ヘモグロビン、（Ｂ）ＨＣＴ、（Ｃ）血小板、（Ｄ）ＷＢＣ、及び（Ｅ）ＷＢＣ、分割された好中球、ならびにリンパ球。

【図34-2】図３４－１に同じ。

【0047】

【図35-1】ナノ粒子投与後の腎機能を示すグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、電解質及び腎機能分析のために血液を得た。（Ａ）血清ナトリウム、（Ｂ）血清塩化物、（Ｃ）血清カリウム、（Ｄ）ＢＵＮ、（Ｅ）クレアチニン。

【図35-2】図３５－１に同じ。

【0048】

【図36】ナノ粒子投与後の肝機能を示すグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、肝機能試験のために血液を得た。（Ａ）ＡＳＴ、（Ｂ）ＡＬＴ、（Ｃ）総ビリルビン。

【0049】

【図37】ナノ粒子投与後の補体活性化を示すグラフを示す。マウスに、示される対照（ＨＢＳＳ）またはナノ粒子を静脈注射し、補体活性化の指標であるＣ３ａ発生のために３０分で血漿を回収した。インビボにおいて補体を強力に活性化することを示した５０ｍｏｌ％のＤＯＴＡＰ ＰＦＯＢナノ粒子は、正の対照として機能した。ＨＢＳＳとスランブルされた、またはｐ６５－ｓｉＲＮＡナノ粒子群との間に統計的に有意な差はなかった。

【0050】

【図38】ナノ粒子の非特異的作用を示す。１０日目に脾臓を採取し、脾細胞を数え、（Ａ）にグラフ化した。フローサイトメトリーにより脾細胞の亜集団を分析し、（Ｂ）にグラフ化した。

【0051】

【図39-1】ナノ粒子の非特異的作用を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞を脾細胞から正の選択をし、プレート結合抗ＣＤ３モノクローナル抗体（５ｕｇ／ｍｌ）で刺激した。７２時間で、サイトメトリービーズアレイにより、サイトカイン分泌に関して培養上清を分析した。（Ａ）ＴＮＦ－α、（Ｂ）ＩＦＮ－γ、（Ｃ）ＩＬ－６、（Ｄ）ＩＬ－１０。

【図39-2】図３９－１に同じ。

【0052】

【図40】ｓｉＲＮＡナノ粒子に対する液性応答を示すグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、血清を回収した。総ＩｇＧ（Ａ）及びＩｇＭ（Ｂ）レベルは、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された。

【0053】

【図41-1】粒子に対する液性応答を示すグラフを示す。１０日目に、マウスを屠殺し、血清を回収した。ペプチド－ナノ粒子（ｐ５ＲＨＨ、Ａ～Ｂ）及びｓｉＲＮＡ－ナノ粒子（ｐ５ＲＨＨ：ｐ６５ ｓｉＲＮＡ、Ｃ～Ｄ）に特異的に応答するＩｇＭ（Ａ、Ｃ）及びＩｇＧ（Ｂ、Ｄ）は、修正されたサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して評価された。

【図41-2】図４１－１に同じ。

【0054】

【図42-1】末梢血液細胞における非特異的ナノ粒子取り込みを示す。マウスに、ＨＢＳＳ（Ｂ、Ｄ）、またはＣｙ３標識されたスクランブルされた配列を含むナノ粒子（Ａ、Ｃ）を注射した。３０分後、マウスを屠殺し、末梢血液白血球を得、フローサイトメトリーにより、細胞関連ナノ粒子（Ｃｙ３＋細胞）について分析した。細胞は、Ｌｙ６Ｇ（好中球、Ａ～Ｂ）及びＬｙ６Ｃ（単球、Ｃ～Ｄ）で共染色された。

【図42-2】図４２－１に同じ。

【0055】

【図43-1】脾細胞における非特異的ナノ粒子取り込みを示す。マウスに、ＨＢＳＳ（Ｂ、Ｄ）、またはＣｙ３標識されたスクランブルされた配列を含むナノ粒子（Ａ、Ｃ）を注射した。３０分後、マウスを屠殺し、脾細胞を得、フローサイトメトリーにより、細胞関連ナノ粒子（Ｃｙ３＋細胞、ｙ軸）について分析した。細胞は、Ｌｙ６Ｇ（好中球、Ａ、Ｂ）及びＬｙ６Ｃ（単球、Ｃ、Ｄ）で共染色された。

【図43-2】図４３－１に同じ。

【発明を実施するための形態】

【0056】

発明の詳細な説明
本発明は、当該技術分野に既知の他のポリヌクレオチドトランスフェクションの方法と比較して、減少した細胞毒性で細胞の細胞質内にポリヌクレオチドを効率的にトランスフェクトすることができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を提供する。有利に、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、血清の存在下で安定しており、したがって、インビボで細胞の細胞質内にポリヌクレオチドを効率的に送達することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を調製する方法、細胞の細胞質内にポリヌクレオチドをトランスフェクトするための本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の使用方法、及び本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を調製するためのキットを包含する。

【0057】

Ｉ．ペプチド－ポリヌクレオチド複合体
本発明の一態様は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を包含する。本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、細胞の細胞質内にペプチドと会合したポリヌクレオチドを効率的にトランスフェクトすることができる。ペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体、及び細胞は以下に説明される。

【0058】

（ａ）ペプチド
ある態様では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体はペプチドを含む。一般に、及び実施例に記載されるように、本発明のペプチドはメリチンに由来し、膜二重層と相互作用するためのその傾向を維持しながら、その細胞毒性を減弱するように修飾される。さらに、ペプチドは、細胞に対して実質的に非溶解性かつ非細胞毒性である。好ましくは、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に類似する機能を有し、かつ（２）配列番号１のアミノ酸配列に対して類似性または同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含む。

【0059】

本明細書で使用される、句「配列番号１を含むペプチドと実質的に類似する機能」は、エンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができる、実質的に非溶解性及び／または非細胞毒性ペプチドを指す。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは非溶解性である。用語「非溶解性」は、ペプチドと接触する際、細胞の脂質二重層が典型的には損なわれないことを意味する。脂質二重層の一体性は、細胞もしくは細胞外成分の細胞内への不適切な侵入もしくは離脱により評価され得る。例えば、細胞タンパク質及び／または小器官は、損なわれた脂質二重層を有する細胞から漏出し得る。あるいは、細胞外成分（すなわち、例えばギャップ結合を介して通常侵入しないもの）が損なわれた脂質二重層を有する細胞に侵入し得る。しかしながら、ペプチドは細胞の脂質二重層を貫通し、細胞の内部に侵入し得るが、その際に、脂質二重層の一体性は影響を受けないことに留意するべきである。他の実施形態では、本発明のペプチドは、実質的に非細胞毒性である。用語「非細胞毒性」は、ペプチドと接触する際、細胞が典型的には死滅しないことを意味する。典型的には、本発明のペプチドは、細胞生存率を約１０％以下、より好ましくは約７％以下、より好ましくは約５％以下、またはより好ましくは約３％以下まで減少させる。ある特定の実施形態では、本発明のペプチドは、非溶解性かつ非細胞毒性である。

【0060】

以下のセクションＩ（ｂ）及び（ｃ）に記載される、本発明のペプチドは、ポリヌクレオチドと会合することができる。よって、一態様では、本発明のペプチドは、ポリヌクレオチドと相互作用する少なくとも１つのカチオン性領域を含む。典型的には、カチオン性領域は、２個以上の近接した塩基性アミノ酸を有する。重要なことは、本発明のペプチドはエンドソーム溶解能（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ）も保有し、これは、ペプチドがエンドソームからの、及び細胞の細胞質内へのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことを可能にする。用語「エンドソーム溶解」は、エンドソームの溶解を開始または容易にする物質を説明するために使用され得る。実施例に記載されるように、本発明のペプチドのヒスチジン残基のプロトン化は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体の解体を促進し、これは、ペプチドを放出して、ポリヌクレオチド放出のためにエンドソーム膜を透過処理する。よって、別の態様では、本発明のペプチドは、ペプチドの少なくとも１つのカチオン性領域に隣接して位置するか、またはその領域内に位置する少なくとも１つのヒスチジン残基を含む。非限定的な例として、本発明のペプチドが３つのカチオン性領域を含む場合、ペプチドは、ペプチドの第１のカチオン性領域に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、ペプチドの第２のカチオン性領域に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、ペプチドの第３のカチオン性領域に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、ペプチドの第１及び第２のカチオン性領域の各々に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、ペプチドの第１及び第３のカチオン性領域の各々に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、ペプチドの第２及び第３のカチオン性領域の各々に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジン、またはペプチドの第１、第２、及び第３のカチオン性領域の各々に隣接するか、またはその領域内に少なくとも１つのヒスチジンを有し得る。カチオン性領域に隣接するヒスチジン残基は、カチオン性領域の前または後に位置し得る。いくつかの実施形態では、カチオン性領域に隣接するヒスチジン残基は、その領域にすぐ隣接する。他の実施形態では、カチオン性領域に隣接するヒスチジン残基は、その領域にすぐ隣接しない。例えば、ヒスチジン残基は、カチオン性領域から約２、３、４、または５位置以内にあってよい。他の実施形態では、ヒスチジン残基は、カチオン性領域内にある。本発明のペプチドのエンドソーム溶解能は、送達のためにエンドソームから細胞の細胞質内にトランスフェクトされたポリヌクレオチドを放出するために、クロロキン、膜融合性ペプチド、不活性化アデノウイルス、及びポリエチレンイミンなどの追加のエンドソーム溶解剤の必要性を除去する。そのような既知のエンドソーム溶解剤は細胞に対して負の作用を有し、トランスフェクション中に細胞毒性を増加させる可能性がある。

【0061】

いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは配列番号１を含む。他の実施形態では、本発明のペプチドは配列番号１からなる。ある特定の実施形態では、本発明のペプチドは配列番号１の変異体であり、変異体は、配列番号１の少なくとも１０個の近接するアミノ酸を含み、配列番号１を含むペプチドと実質的に類似して機能する。例えば、本発明のペプチドは、配列番号１の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の近接するアミノ酸を包含し得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、表Ａから選択され得る。

【表1】

【0062】

好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドは、非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができる。配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約８０％、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％の同一性を有し得る。配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、保存置換された１個以上のアミノ酸を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個以上のアミノ酸は、得られるペプチドが配列番号１を含むペプチドと実質的に類似して機能する限り、保存置換され得る。

【0063】

別の態様では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有し、非溶解性であり、細胞のエンドソームからのポリヌクレオチドの放出に影響を及ぼすことができるペプチドをコードするアミノ酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する。他の実施形態では、アミノ酸配列は配列番号１である。

【0064】

本発明のペプチドは、当該技術分野において既知の様々な技法を使用して生成することができる。ペプチドは、標準的な技法を使用して単離され得る、標準的な技法を使用して合成され得る、または保管所から購入もしくは得ることができる。

【0065】

本発明のペプチドは標識され得る。好適な標識の非限定的な例としては、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、比色標識、及び共鳴標識が挙げられる。ペプチドを標識する方法は、当該技術分野において周知である。

【0066】

ペプチドは、カーゴ（ｃａｒｇｏ）複合体に結合され得る。本明細書で使用される、用語「カーゴ複合体」は、本発明のポリヌクレオチド以外のペプチドによって保有されるか、またはそれに結合され得る任意の分子または薬剤を指し得る。換言すると、本発明のペプチドは、本発明のポリヌクレオチドに加えて、カーゴ複合体に結合され得る。例えば、カーゴ複合体は、撮像カーゴ、治療薬カーゴ、細胞毒性カーゴ、または標的カーゴであってよい。

【0067】

撮像カーゴ分子及び薬剤の非限定的な例としては、検出可能な物理的もしくは化学的性質を有する任意の分子、薬剤、または材料を挙げることができる。そのような撮像カーゴは、蛍光撮像、磁気共鳴撮像、ポジトロン放出断層撮影、ラマン撮像、光干渉断層撮影、光音響撮像、フーリエ変換赤外撮像、または免疫アッセイの分野において十分に開発されており、一般に、そのような方法に有用な大半の任意の標識は、本発明に適用することができる。使用することができる様々な標識またはシグナル生成系の概要に関しては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，３９１，９０４号を参照。

【0068】

治療薬カーゴの非限定的な例としては、薬理学的薬剤などの生理学的活性を有する任意の物質を含み得る。そのような治療薬カーゴは、鎮痛剤、解熱剤、抗喘息薬、抗生物質、抗うつ剤、抗糖尿病剤、抗真菌剤、降圧薬、抗炎症剤（非ステロイド及びステロイドを含む）、抗悪性腫瘍薬、抗不安薬、免疫抑制剤、抗片頭痛薬、鎮静剤、睡眠薬、抗狭心症薬、統合失調症治療薬、抗躁薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風薬、抗凝固薬、血小板溶解薬、抗線溶薬、血行動態学的薬剤（ｈｅｍｏｒｈｅｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、抗血小板薬、抗けいれん薬、抗パーキンソン病薬、 抗ヒスタミン薬、抗再狭窄剤、鎮痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗感染症剤、気管支拡張薬、ステロイド系化合物及びホルモン、ならびにこれらの組み合わせを含む。あるいは、カーゴ複合体は、分子複合体の成分または薬理学的に許容可能な塩の形態であってよい。

【0069】

細胞毒性カーゴは、細胞に有害な（例えば、死滅もしくは損傷）分子または薬剤を指す。例としては、タキソール（パクリタキセル、ドセタキセル）などの抗微小管薬物、及びビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン）が挙げられる。例えば、例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭素エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピュロマイシン、及びこれらの類似体または相同体を挙げることができる。

【0070】

標的カーゴは、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を細胞に指向する任意の分子または薬剤であってよい。標的カーゴは、真核生物標的細胞または原核生物標的細胞に指向され得る。標的薬剤の非限定的な例としては、抗体もしくは抗体断片、受容体リガンド、小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デンドリマー、微小気泡、またはアプタマーが挙げられる。

【0071】

カーゴ複合体が本発明のペプチドに結合される手段は、実施形態により変動することができ、また変動する。カーゴ複合体は、共有結合または非共有結合を含む、当該技術分野において既知の任意の手段により本発明のペプチドに結合され得る。

【0072】

（ｂ）ポリヌクレオチド
別の態様では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体はポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、またはこれらの組み合わせであってよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは２本鎖である。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは１本鎖である。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１本鎖及び２本鎖の組み合わせである。

【0073】

本発明のポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含み得る。加えて、ポリヌクレオチドは、修飾ＤＮＡ塩基または修飾ＲＮＡ塩基などの修飾核酸塩基を含み得る。修飾は、糖２’位、ピリミジンのＣ－５位、及びプリンの８位で生じ得るが、これらに限定されない。好適な修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基の例としては、２’－フルオロヌクレオチド、２’－アミノヌクレオチド、５’－アミノアリル－２’－フルオロヌクレオチド、及びホスホロチオエートヌクレオチド（モノチオホスフェート及びジチオホスフェート）が挙げられる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド摸倣物であってよい。ヌクレオチド摸倣物の例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）が挙げられる。

【0074】

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、ポリヌクレオチドは発現カセットを含み得る。本明細書で使用される、「発現カセット」は、プロモーターに動作可能に連結されたタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物である。ある特定の実施形態では、核酸構築物は、追加の調節配列をさらに含む。追加の調節配列の非限定的な例としては、転写終結配列を含む。他の追加の調節配列は当該技術分野において既知である。本明細書で使用される、用語プロモーターは、細胞における標的核酸配列の発現を付与もしくは活性化することができる合成または天然由来の分子を意味する場合がある。プロモーターは、本発明のＤＮＡポリヌクレオチドと正常に会合することができるか、または異種プロモーターであり得る。異種プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物などの供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、または臓器に対して、構成的または差次的にＤＮＡ配列の発現を調節することができる。または、プロモーターは、発生段階に対して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発剤もしくは活性化剤（すなわち、誘導性プロモーター）などの外部刺激に応答して発現を調節することができる。プロモーターの非限定的な代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＨＳＰ７０基本プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、テトラサイクリン応答要素（ＴＲＥ）核酸配列を含むプロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。これらの実施形態のいくつかの代替えでは、本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、ベクター内に組み込まれる。当業者は、標準的な組換え技法によりベクターを構築することができるだろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９６を参照、その両方は参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターは、これらに限定されないが、プラスミド、コスミド、転位要素、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、ならびにレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶ等に由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶ等に由来）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（複製能力、複製欠失、及びそのガットレス形態）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチンウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、及びラウス肉腫ウイルスベクターなどの人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。

【0075】

さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡを含む。ＲＮＡ配列の非限定的な例としては、タンパク質、ならびにｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などの非コードＲＮＡをコードすることができるｍＲＮＡを含み得る。例えば、核酸はｍＲＮＡを含み得る。好ましい実施形態では、核酸がｍＲＮＡを含む場合、ｍＲＮＡ分子は、５’キャッピングされる、ポリアデニル化される、またはキャッピング及びポリアデニル化され得る。あるいは、ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの内部オープンリーディングフレームの翻訳のために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。

【0076】

ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞において発現される核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡを含む。細胞において発現される核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡの非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡとしても知られる）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡが挙げられる。一般に、核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡを有する細胞のトランスフェクションは、核酸配列の切断をもたらすことができる、核酸配列のタンパク質への翻訳を強化、防止、もしくは妨害することができる、または核酸配列の転写を調節することができる。

【0077】

好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、細胞において発現される核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。本明細書で使用される、「核酸配列の発現を妨害する」は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体で処理されなかった細胞における核酸配列の発現レベルと比較した場合、核酸配列または核酸配列から翻訳されたタンパク質の発現レベルにおける任意の減少を説明するために使用され得る。実施形態のいくつかの代替えでは、ポリヌクレオチドは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0078】

好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＪＮＫ２をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。ある特定の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。他の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。また他の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。

【0079】

さらに別の好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。ＮＦκＢ経路の非限定的な例としては、標準ＮＦκＢ経路及び非標準ＮＦκＢ経路を挙げることができる。ある特定の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｉＲＮＡである。他の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。また他の好ましい実施形態では、非コードＲＮＡは、ｓｈＲＮＡである。

【0080】

ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の非限定的な例としては、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路の転写因子ｐ６５サブ単位をコードする核酸、及び標準ＮＦκＢシグナル伝達経路の転写因子ｐ１０５／ｐ５０サブ単位をコードする核酸を挙げることができる。本実施形態の代替えの１つでは、本発明のポリヌクレオチドは、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１０５／ｐ５０サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。本実施形態の別の代替えでは、本発明のポリヌクレオチドは、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ６５サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５１（ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＡＵＡ）の核酸配列を有するｓｉＲＮＡを含む。

【0081】

標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の非限定的な例としては、非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸、及び非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のＲｅｌＢサブ単位をコードする核酸を挙げることができる。本実施形態の代替えの１つでは、本発明のポリヌクレオチドは、非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のＲｅｌＢサブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。本実施形態の別の代替えでは、本発明のポリヌクレオチドは、非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５２（ＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＵＡＵ）の核酸配列を有するｓｉＲＮＡを含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することができる２つ以上の非コードＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡ、及び非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。例示的な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ６５サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡ、及び標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することができる非コードＲＮＡを含む。

【0083】

一般に、ｓｉＲＮＡは、長さが約１５～約２９ヌクレオチドの範囲の２本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９ヌクレオチドであってよい。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが約１６～約１８、約１７～約１９、約２１～約２３、約２４～約２７、または約２７～約２９ヌクレオチドであってよい。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが約２１ヌクレオチドであってよい。ｓｉＲＮＡは、任意に、１つまたは２つの１本鎖オーバーハング、例えば、一端または両端に５’オーバーハング、一端または両端に３’オーバーハング、またはこれらの組み合わせをさらに含み得る。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成されるか、あるいは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から生成され得る（以下を参照）。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、２つの配列間に形成された２本鎖において不一致または膨隆が存在しないように、完全に相補的であってよい。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、２つの配列間に形成された２本鎖において１つ以上の不一致及び／または膨隆が存在してもよいように、実質的に相補的であってよい。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの５’端の一端または両端はホスフェート基を有し得るが、他の実施形態では、５’端の一端または両端はホスフェート基を欠損する。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの３’端の一端または両端はヒドロキシル基を有し得るが、他の実施形態では、５’端の一端または両端はヒドロキシル基を欠損する。

【0084】

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と称されるｓｉＲＮＡの１本の鎖は、標的転写物とハイブリダイズするタンパク質を含む。標的転写物は、所望の発現が妨害される細胞によって発現される核酸配列を指す。本発明の治療組成物の文脈において、標的転写物の発現の妨害は、有益な作用をもたらすことができる。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物の領域と完全に相補的であってよい、すなわち、長さが約１５～約２９ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも１６ヌクレオチド、より好ましくは長さが約１８～２０ヌクレオチドの標的領域にわたって１つの不一致または膨隆もない標的転写物にハイブリダイズする。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、標的領域に対して実質的に相補的であってよい、すなわち、アンチセンス鎖及び標的転写物によって形成された２本鎖において１つ以上の不一致及び／または膨隆が存在してもよい。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写物のエクソン配列を標的とする。当業者は、標的転写物用のｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズム、及び／または商業サービスに精通している。例示的な例は、ロゼッタｓｉＲＮＡ設計アルゴリズム（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及びｓｉＧＥＮＯＭＥ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ｓｉＲＮＡは、当業者に周知の方法を使用して、インビトロで酵素的に合成することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野において周知のオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学的に合成することができる。

【0085】

他の実施形態では、非コードＲＮＡは、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってよい。一般に、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（上述される）を媒介するのに十分に長い２本鎖構造を形成するためにハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補的部分、及び２本鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１本鎖部分を含むＲＮＡ分子である。この構造は、ステム－ループ構造とも呼ぶことができ、ステムは２本鎖部分である。いくつかの実施形態では、構造の２本鎖部分は、ｓｈＲＮＡの２本鎖領域に不一致または膨隆が存在しないように、完全に相補的であってよい。他の実施形態では、構造の２本鎖部分は、ｓｈＲＮＡの２本鎖領域に１つ以上の不一致及び／または膨隆が存在してもよいように、実質的に相補的であってよい。構造のループは、長さが約１～約２０ヌクレオチド、好ましくは長さが約４～約１０約ヌクレオチド（ａｂｏｕｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、より好ましくは長さが約６～約９ヌクレオチドであってよい。ループは、標的転写物に相補的である領域の５’または３’端のいずれかに位置し得る（即ち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）。

【0086】

ｓｈＲＮＡは、５’または３’端にオーバーハングをさらに含み得る。任意のオーバーハングは、長さが約１～約２０ヌクレオチド、より好ましくは長さが約２～約１５ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１つ以上のＵ残基、例えば、約１～約５のＵ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡの５’端はホスフェート基を有し得るが、他の実施形態では、有さなくてよい。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡの３’端はヒドロキシル基を有し得るが、他の実施形態では、有さなくてよい。一般に、ｓｈＲＮＡは、保存細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡへと処理される。よって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、同様に、ｓｈＲＮＡの部分（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）に相補的である標的転写物の発現を妨害することができる。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計及び合成用の利用可能な手段（上述される）に精通している。例示的な例としては、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。

【0087】

また他の実施形態では、非コードＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ＲＮＡｉ発現ベクターであってよい。典型的には、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤の細胞内（インビボ）合成に使用され得る。一実施形態では、２本の別個の相補的ｓｉＲＮＡ鎖は、２つのプロモーターを含む単一ベクターを使用して転写されてよく、その各々は、単一ｓｉＲＮＡ鎖の転写を指向する（すなわち、各プロモーターは、ｓｉＲＮＡのテンプレートに動作可能に連結されるため、転写が生じ得る）。２つのプロモーターは、同じ配向にあってよく、この場合、各々は、相補的ｓｉＲＮＡ鎖の１つのテンプレートに動作可能に連結される。あるいは、２つのプロモーターは、単一テンプレートに隣接する対向する配向にあってよいため、プロモーターの転写は、２つの相補的ｓｉＲＮＡ鎖の合成をもたらす。別の実施形態では、ＲＮＡｉ発現ベクターは、転写がｓｈＲＮＡを形成するように、２つの相補的領域を含む単一ＲＮＡ分子の転写を駆動するプロモーターを含み得る。

【0088】

一般的に言って、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位のインビボ発現を指向するために利用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターであってよい。Ｕ６またはＨ１プロモーターなどのある特定のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、転写領域内にシス作用調節要素を必要とせず、よって、ある特定の実施形態において好ましい。他の実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩのプロモーターは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位の発現を駆動するために使用され得る。いくつかの実施形態では、組織特異的、細胞特異的、または誘導性Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用され得る。

【0089】

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成テンプレートを提供する構築物は、標準的な組換えＤＮＡ方法を使用して生成され、真核生物細胞における発現に好適な多種多様の異なるベクターのいずれかの中に挿入され得る。ガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３）またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）に見出すことができる。当業者は、ベクターが追加の調節配列（例えば、終結配列、翻訳制御配列等）ならびに選択可能なマーカー配列を含み得ることも理解する。ＤＮＡプラスミドは、当該技術分野において既知であり、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣなどに基づくものを含む。多くの発現ベクターは好適なプロモーターまたは複数のプロモーターを既に含むため、プロモーター（複数可）に対して適切な位置に対象のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を挿入するためにのみ必要であり得る。ウイルスベクターは、ＲＮＡｉ剤の細胞内発現を提供するようにも使用され得る。好適なウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどを含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ＴＲＣ ｓｈＲＮＡ製品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）において提供されるものなど、ｓｈＲＮＡレンチウイルスに基づくベクターまたはレンチウイルス粒子である。

【0090】

本発明の核酸配列は、当該技術分野において既知の様々な異なる技法を使用して得ることができる。ヌクレオチド配列ならびに相同配列は、標準的な技法を使用して単離される、保管所から購入もしくは得ることができる。ヌクレオチド配列が得られたら、当該技術分野において既知の方法を使用して、様々な用途において使用するために増幅され得る。

【0091】

（ｃ）ポリペプチド－ポリヌクレオチド複合体
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、会合して複合体を形成する。本明細書で使用される、用語「会合」は、非共有結合を通したペプチドとポリヌクレオチドとの相互作用、またはペプチドとポリヌクレオチドとの共有結合を指し得る。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、水素結合、イオン結合、ファンデルワールスに基づく結合、疎水結合、または静電気相互作用などの非共有結合を通して会合する。例えば、本発明のペプチドは、全体的に正味正電荷を有し得、これは、本発明の複合体を形成するために、ペプチドに、静電気相互作用を通した本発明のポリヌクレオチドとの会合を可能にし得る。本発明のポリペプチド－ポリヌクレオチド複合体を形成するための方法は、当該技術分野において既知であり、セクションＶ及び実施例においてさらに説明される。

【0092】

本発明のペプチドが本発明のポリヌクレオチドと会合するペプチドとポリヌクレオチドとのモル比は、ペプチド、ポリヌクレオチドの組成、またはポリヌクレオチドの大きさにより変動することができ、また変動し、実験的に決定することができる。本質的には、本発明のペプチドと本発明のポリヌクレオチドとの好適なモル比は、対象のペプチドへの曝露を最小にすると同時に、ペプチドがポリヌクレオチドを完全に複合するモル比であってよい。

【0093】

例えば、本発明のペプチドは、約１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、２００：１、２１０：１、２２０：１、２３０：１、２４０：１、２５０：１、２６０：１、２７０：１、２８０：１、２９０：１、または約３００：１以上のペプチドとポリヌクレオチドのモル比でポリヌクレオチドと会合し得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約１：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、または約５０：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。他の実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、または約１００：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。さらに他の実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２０：１、１２５：１、１３０：１、１３５：１、１４０：１、１４５：１、または約１５０：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。他の実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約１５０：１、１５５：１、１６０：１、１６５：１、１７０：１、１７５：１、１８０：１、１８５：１、１９０：１、１９５：１、または約２００：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。追加の実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約２００：１、２０５：１、２１０：１、２１５：１、２２０：１、２２５：１、２３０：１、２３５：１、２４０：１、２４５：１、または約２５０：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。また他の実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、約２５０：１、２５５：１、２６０：１、２６５：１、２７０：１、２７５：１、２８０：１、２８５：１、２９０：１、２９５：１、または約３００：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。代替えの実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも約２５：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。異なる実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも約５０：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。さらなる実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも約７５：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。またさらなる実施形態では、本発明のペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも約１００：１のペプチドとポリヌクレオチドのモル比で会合する。

【0094】

本発明のポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを完全に複合することができる本発明のペプチドと本発明のポリヌクレオチドとの好適なモル比は、対象のペプチドへの曝露を最小にするために、約５０：１を超えるが、約２００：１未満であってよい。換言すると、いくつかの実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約５０：１～約２００：１であってよい。他の実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約４５：１、約４６：１、約４７：１、約４８：１、約４９：１、約５０：１、約５１：１、約５２：１、約５３：１、約５４：１、または約５５：１であってよい。他の実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約７０：１、約７１：１、約７２：１、約７３：１、約７４：１、約７５：１、約７６：１、約７７：１、約７８：１、約７９：１、または約８０：１であってよい。さらに他の実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約９５：１、約９６：１、約９７：１、約９８：１、約９９：１、約１００：１、約１０１：１、約１０２：１、約１０３：１、約１０４：１、または約１０５：１であってよい。また他の実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約１４５：１、約１４６：１、約１４７：１、約１４８：１、約１４９：１、約１５０：１、１５１：１、約１５２：１、約１５３：１、約１５４：１、または約１５５：１であってよい。他の実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約１９５：１、約１９６：１、約１９７：１、約１９８：１、約１９９：１、約２００：１、約２０１：１、約２０２：１、約２０３：１、約２０４：１、または約２０５：１であってよい。好ましい実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約１５０：１であってよい。別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約１００：１であってよい。別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約５０：１の間であってよい。別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約５０：１～約１００：１であってよい。別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドとｓｉＲＮＡポリヌクレオチドとのモル比は、約７５：１～１５０：１であってよい。

【0095】

ペプチドがポリヌクレオチドを完全に複合することができるモル比を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載されるゲル遅延度アッセイを含み得る。対象のペプチドへの曝露を最小にするモル比を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、ポリペプチドの用量増加を使用する細胞毒性測定を含み得る。

【0096】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、直径が約５０ｎｍ～約９９９ｎｍ、より好ましくは直径が約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、より好ましくは直径が約５０ｎｍ～約２５０ｎｍであってよい。そのため、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、「ナノ粒子」と称することができる。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または約１２０ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、または２２０ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、または２７０ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、または３４５ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約３５０、３５５、３６０、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、または４１５ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、または５００ｎｍである。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、または６３０ｎｍである。

【0097】

好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約５０～約２５０ｎｍである。例えば、本発明のナノ粒子は、直径が約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、約１５０、約１５１、約１５２、約１５３、約１５４、約１５５、約１５６、約１５７、約１５８、約１５９、約１６０、約１６１、約１６２、約１６３、約１６４、約１６５、約１６６、約１６７、約１６８、約１６９、約１７０、約１７１、約１７２、約１７３、約１７４、約１７５、約１７６、約１７７、約１７８、約１７９、約１８０、約１８１、約１８２、約１８３、約１８４、約１８５、約１８６、約１８７、約１８８、約１８９、約１９０、約１９１、約１９２、約１９３、約１９４、約１９５、約１９６、約１９７、約１９８、約１９９、約２００、約２０１、約２０２、約２０３、約２０４、約２０５、約２０６、約２０７、約２０８、約２０９、約２１０、約２１１、約２１２、約２１３、約２１４、約２１５、約２１６、約２１７、約２１８、約２１９、約２２０、約２２１、約２２２、約２２３、約２２４、約２２５、約２２６、約２２７、約２２８、約２２９、約２３０、約２３１、約２３２、約２３３、約２３４、約２３５、約２３６、約２３７、約２３８、約２３９、約２４０、約２４１、約２４２、約２４３、約２４４、約２４５、約２４６、約２４７、約２４８、約２４９、または約２５０ｎｍであってよい。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約５０～約２００ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約５０～約１５０ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約５０～約１００ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約７５～約１２５ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約１００～約１５０ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約１２５～約１７５ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約１５０～約２００ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約１７５～約２２５ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約２００～約２５０ｎｍである。別の好ましい実施形態では、発明のナノ粒子は、直径が約１８０～約２００ｎｍである。

【0098】

ある特定の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、直径が約５～約３０ｎｍのより小さい粒子の凝集体を含み得る。そのため、本発明のナノ粒子は、直径が約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０ｎｍのより小さい粒子の凝集体を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、直径が約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または約１５ｎｍのより小さい粒子の凝集体を含む。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、直径が約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０のより小さい粒子の凝集体を含む。さらに他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、直径が約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または約２５ｎｍのより小さい粒子の凝集体を含む。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、直径が、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０ｎｍのより小さい粒子の凝集体を含む。

【0099】

本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の安定性を強化するためにさらに修飾され得る。例えば、本発明のナノ粒子は、安定性を強化するためにアルブミンで被覆され得る。アルブミンで被覆された本発明のナノ粒子は、直径が約５～約９０ｎｍ以上であってよい。そのため、本発明のナノ粒子は、直径が約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０ｎｍの粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約５、約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０ｎｍの粒子を含む。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、または約５５ｎｍの粒子を含む。さらに他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、または約８０ｎｍの粒子を含む。他の実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約８０、約８５、または約９０ｎｍ以上の粒子を含む。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径が約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５ｎｍの粒子を含む。

【0100】

粒径は、当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。粒子の大きさを測定する方法の非限定的な例としては、動的光散乱、レーザー回折、エレクトロゾーン（電気感知ゾーン）、光遮断（フォトゾーン及び単一粒子光学感知（ＳＰＯＳ）とも称される）、ふるい分け分析、空気力学測定、空気透過径、沈降、粒子のゼータ電位の測定、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態では、粒径は、動的光散乱によって評価される。別の好ましい実施形態では、粒径は、粒子のゼータ電位を測定することにより評価される。さらに別の好ましい実施形態では、粒径は、動的光散乱または粒子のゼータ電位を測定することにより評価される。

【0101】

本発明のナノ粒子は、約－１５～約２０ｍＶ、好ましくは約０ｍＶ以上のゼータ電位を有し得る。例えば、ナノ粒子は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０ｍＶ以上のゼータ電位を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約１、約２、約３、約４、または約５ｍＶのゼータ電位を有する。他の実施形態では、ナノ粒子は、約１０、約１１、約１２、約１３、または約１４ｍＶのゼータ電位を有する。さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ｍＶのゼータ電位を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１、約２、約３、約４、または約５ｍＶのゼータ電位を有する。他の実施形態では、ナノ粒子は、約１０、約１１、１２、約１３、または約１４ｍＶのゼータ電位を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約３．７２ｍＶのゼータ電位を有する。別の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１２ｍＶのゼータ電位を有する。さらに別の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１３．１ｍＶのゼータ電位を有する。

【0102】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約１：１～約３０：１、好ましくは約５：１～約２５：１の陽：負の電荷比を有し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、または約８：１の陽：負の電荷比を有する。他の実施形態では、ナノ粒子は、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、または約１４：１の陽：負の電荷比を有する。さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、約２２：１、約２３：１、約２４：１、約２５：１、または約２６：１の陽：負の電荷比を有する。

【0103】

セクションＩ（ａ）に記載される、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、細胞の細胞質内にポリヌクレオチドを効率的に放出することができる。ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、対象に投与されるとき、ポリヌクレオチドを分解から保護することもできてよい。そのため、本発明のペプチド－ポリヌクレオチドナノ粒子は、血清の存在下で安定性を維持することができる。ナノ粒子は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０分間、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９時間、約１、２、３、４、５、６、７日間以上、血清の存在下で安定性を維持することができる。ナノ粒子は、約５０、１００、１５０、２００、または約３００μｇ／ｍｌ以上のヒト血清アルブミンの存在下で安定性を維持することができる。ナノ粒子の安定性は、ナノ粒子がナノ粒子のペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドの活性を維持する能力を測定することにより、または経時的にナノ粒子の大きさの変化を測定することにより決定され得る。ナノ粒子の大きさを測定する方法は、このセクションに記載される通りである。

【0104】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を調製する方法は、一般的に、本発明のペプチドを本発明のポリヌクレオチドと接触させて、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を形成することを含む。典型的には、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を形成するのに好適な条件下でインキュベートすることにより、ペプチド及びポリヌクレオチドを接触させる。ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を形成するのに好適な条件は、実施例に記載される通りであってよい。典型的には、そのような条件は、約３０℃～約４０℃の温度、及び約２０秒～約６０分以上のインキュベーション時間を含み得る。好適な温度は、約３０℃を下回る場合がある。例えば、インキュベーションは氷上で生じ得る。当業者は、インキュベーションの期間及び温度が、ペプチド及びポリヌクレオチドにより変動することができ、また変動し、実験的に決定することができることを理解する。

【0105】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、ナノ粒子の安定性を強化するためにさらに修飾され得る。例えば、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、ナノ粒子の安定性を強化するために架橋され得る。当業者は、好適な架橋剤がナノ粒子の組成及び抗体または抗体断片により変動することができ、または変動することを認識するだろう。いくつかの態様では本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、グルタルアルデヒド、ビス－カルボンサンスペーサー、ビス－カルボンサン活性エステルなどの化学架橋剤を使用して、カルボジイミドカップリングプロトコルによるビス－リンカーアミン／酸を使用して、またはクリックケミストリープロトコル、カルボジイミドカップリングケミストリー、アシル化、活性エステルカップリング、もしくはアルキル化を使用して化学的に架橋され得る。

【0106】

あるいは、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、ナノ粒子の安定性を強化することができる化合物で被覆され得る。安定性を強化するためにナノ粒子を修飾する方法は、当該技術分野において既知であり、Ｎｉｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．９：４７５４－４７６２に記載される通りであってよく、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0107】

本明細書で使用される、用語「被覆」は、非共有結合を通したペプチド－ポリヌクレオチド複合体の化合物との相互作用、またはペプチド－ポリヌクレオチド複合体と化合物との共有結合を指し得る。好ましい実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体及び被覆化合物は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールスに基づく結合、疎水結合、または静電気相互作用などの非共有結合を通して会合する。例えば、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、全体的に正味正電荷を有し得、被覆化合物は、本発明の複合体を形成するために、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体及び化合物が静電気相互作用を通して会合することを可能にし得る全体的に負電荷を有し得る。

【0108】

ナノ粒子の安定性を強化するためにナノ粒子を被覆するために使用することができる化合物の非限定的な例としては、アルブミン、オレイン酸などの脂肪酸、ポリエチレングリコール、キトサンなどの多糖、ヘパリン、もしくはへパラン、及び他のグリコサミノグリカン、または当業者に既知の他の公開された被覆材料が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の安定性は、ナノ粒子を脂肪酸で被覆することにより強化され得る。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の安定性は、ナノ粒子を多糖で被覆することにより強化され得る。

【0109】

好ましい実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子の安定性は、ナノ粒子をアルブミンで被覆することにより強化され得る。アルブミンは、血清中に通常見られる負に荷電された球状タンパク質である。理論に拘束されないが、本発明のナノ粒子をアルブミンで被覆することは、凝結を防止することにより、ナノ粒子の安定性を強化することができると考えられる。好ましくは、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子を被覆するために使用することができるアルブミンは、血清アルブミンであり、ウシ血清アルブミン及びヒト血清アルブミンを含み得る。例示的な実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子の安定性は、ナノ粒子をヒト血清アルブミンで被覆することにより強化され得る。

【0110】

本質的に、ナノ粒子は、ナノ粒子を、アルブミンを含む溶液とインキュベートすることにより、アルブミンで被覆されている。ナノ粒子は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または約１ｍｇ／ｍｌ以上のアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、または約０．３ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体のナノ粒子は、約０．３、０．３５、０．４、０．４５、または約０．５ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。さらに他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約０．５、０．５５、０．６、０．６５、または約０．７ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約０．７、０．７５、０．８、０．８５、または約０．９ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。追加の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約０．９、０．９５、１、または約１．５ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。好ましい実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むナノ粒子は、約０．４、０．４５、０．５、０．５５、または約０．６ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含む溶液中でインキュベートされ得る。

【0111】

ペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を被覆するために、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または約６０分間以上アルブミンとインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む粒子は、約５、１０、１５、または約２０分間アルブミンとインキュベートされる。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む粒子は、約２０、２５、３０、または約３５分間アルブミンとインキュベートされる。さらに他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む粒子は、約３５、４０、４５、または約５０分間アルブミンとインキュベートされる。他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む粒子は、約５０、５５、または約６０分間アルブミンとインキュベートされる。好ましい実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む粒子は、約２５、３０、または約３５分間アルブミンとインキュベートされる。

【0112】

（ｄ）細胞
本発明の別の態様では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、細胞の細胞質内にポリヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。いくつかの実施形態では、細胞は原核生物細胞である。好ましい実施形態では、細胞は真核生物細胞である。細胞は、インビトロ、インビボ、原位置、またはエクスビボであってよい。細胞は、単一細胞であるか、または組織もしくは臓器を含んでよい。用語「細胞」は、対象の細胞も指す。

【0113】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドのトランスフェクションに好適な条件下、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の存在下で細胞をインキュベートすることにより、インビトロで細胞に投与され得る。ペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドのトランスフェクションに好適な条件は、実施例に記載される通りであってよい。当業者は、インキュベーションの期間は、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体及び細胞により変動することができ、また変動することを理解する。典型的には、そのような条件は、約１０分～２４時間のインキュベーション時間を含み得る。より好ましくは、トランスフェクション条件は、約１５分～３時間のインキュベーション時間を含み得る。

【0114】

本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む組成物を対象に投与することにより、インビボで（すなわち、対象の）細胞に投与され得る。好適な組成物は、以下のセクションＩＩでさらに詳細に説明される。

【0115】

ＩＩ．薬学的組成物
本発明の別の態様では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、投与に好適な薬学的組成物中に組み込むことができる。本発明の薬学的組成物は、細胞において通常発現される１つまたは２つ以上の核酸配列の発現を妨害するために使用され得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、細胞において通常発現される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の核酸配列の発現を妨害するために使用され得る。当業者は、薬学的組成物が、疾患を治療する、疾患を予防する、または良好な健康状態を増進するために投与され得ることを理解する。そのため、本発明の薬学的組成物は、妨害された発現が組成物を投与された対象に測定可能かつ有益な作用（すなわち、有意な効果）をもたらすように、細胞において通常発現される任意の核酸配列の発現を妨害するために使用され得る。

【0116】

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、細胞において通常発現される１つの核酸配列の発現を妨害するために使用される。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害するために使用される。別の好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、ＪＮＫ２をコードする核酸配列の発現を妨害するために使用される。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ６５サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害するために使用される。別の好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害するために使用される。

【0117】

他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、細胞において通常発現される２つの核酸配列の発現を妨害するために使用される。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ６５サブ単位をコードする核酸配列、及び標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害するために使用される。

【0118】

本発明の薬学的組成物が細胞において通常発現される２つ以上の核酸配列の発現を妨害するために使用される場合、薬学的組成物は、２つ以上のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の混合物を使用して製剤化され得、各複合体は、細胞において通常発現される異なる核酸配列の発現を妨害することができるポリヌクレオチドを含む。あるいは、２つ以上のポリヌクレオチドは、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体の混合物を生成するために使用され得、各ポリヌクレオチドは、細胞において通常発現される異なる核酸配列の発現を妨害することができる。

【0119】

本発明の薬学的組成物は、所望により１つ以上の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、及びビヒクルも含み得る。本明細書で使用される、用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合性である、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するそのような培地及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または薬剤が本発明ナノ粒子と不適合でない限りを除き、組成物におけるその使用は想定される。補足的な活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。

【0120】

本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化され得る。好適な投与経路は、非経口、経口、肺、経皮、経粘膜、及び直腸投与を含む。本明細書で使用される、用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、もしくは胸骨内注射、または注入技術を含む。

【0121】

非経口、皮内、もしくは皮下用途に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用の水などの減菌希釈剤、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸、もしくはリン酸塩などの緩衝液；及び塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの等張性を調節するための薬剤。ｐＨは、塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入され得る。

【0122】

経口用組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含み得る。経口用組成物は、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療的投与の目的において、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で使用され得る。経口用組成物は、口腔洗浄剤として使用するための流体担体を使用することによっても調製することができ、流体担体における化合物は、経口的に適用され、すすがれ、吐出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤及び／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ剤等は、以下の成分または類似する性質の化合物のうちのいずれかを含み得る：微結晶セルロース、トラガントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなど崩壊剤；ステアリン酸塩もしくはステロテスなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑走剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味などの風味剤。吸入による投与において、化合物は、好適な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサ、またはネブライザからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0123】

好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、非経口投与と適合性があるように製剤化される。例えば、注射可能な使用に好適な薬学的組成物は、減菌水溶液（水可溶性の場合）または分散剤、及び減菌注射可能溶液または分散剤の即時調製物用の減菌粉末を含み得る。静脈内投与において、好適な担体は、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。例示的な実施形態では、本発明の薬学的組成物は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に製剤化される。

【0124】

全ての場合において、組成物は減菌であってよく、容易な注射器通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する範囲まで流体であってよい。組成物は、製造及び保管の条件下で安定していてよく、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましくてよい。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物中に含むことによってもたらされ得る。

【0125】

滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙される成分のうちの１つまたはその組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末に加えて、事前に滅菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望される成分が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥である。

【0126】

全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであってよい。経粘膜または経皮投与において、透過される膜に適切な透過剤が製剤に使用される。そのような透過剤は、一般的に、当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与に関しては、洗剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含み得る。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与において、活性化合物は、当該技術分野において一般的に既知である軟膏、油薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。化合物は、直腸送達に関しては、坐剤（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどに基づく従来の坐剤）または滞留浣腸の形態にも調製され得る。

【0127】

一実施形態では、活性化合物は、埋込剤及びマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生体分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかである。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される、当業者に既知の方法により調製することができる。

【0128】

薬学的組成物のさらなる製剤は、例えば、実施者に一般的に知られる製剤技法の概要を提供する、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）、及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，１６Ｅｄ ＩＳＢＮ：０－９１２７３４－０４－３，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに記載され得る。

【0129】

当業者は、薬学的組成物中の本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の濃度が、一部、投与経路、対象、及び投与の理由により変動することができ、また変動し、実験的に決定することができることを認識する。薬学的組成物中の本発明のナノ粒子などの活性剤の濃度を実験的に決定する方法は、当該技術分野において既知である。一般に、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体に約０．１ｎＭ～約５０μＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。例えば、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４１ｎｍ、４２ｎｍ、４３ｎｍ、４４ｎｍ、４５ｎｍ、４６ｎｍ、４７ｎｍ、４８ｎｍ、４９ｎｍ、５０ｎｍ、５１ｎｍ、５２ｎｍ、５３ｎｍ、５４ｎｍ、５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、６１ｎｍ、６２ｎｍ、６３ｎｍ、６４ｎｍ、６５ｎｍ、６６ｎｍ、６７ｎｍ、６８ｎｍ、６９ｎｍ、７０ｎｍ、７１ｎｍ、７２ｎｍ、７３ｎｍ、７４ｎｍ、７５ｎｍ、７６ｎｍ、７７ｎｍ、７８ｎｍ、７９ｎｍ、８０ｎｍ、８１ｎｍ、８２ｎｍ、８３ｎｍ、８４ｎｍ、８５ｎｍ、８６ｎｍ、８７ｎｍ、８８ｎｍ、８９ｎｍ、９０ｎｍ、９１ｎｍ、９２ｎｍ、９３ｎｍ、９４ｎｍ、９５ｎｍ、９６ｎｍ、９７ｎｍ、９８ｎｍ、９９ｎｍ、１００ｎｍ、１０１ｎｍ、１０２ｎｍ、１０３ｎｍ、１０４ｎｍ、１０５ｎｍ、１０６ｎｍ、１０７ｎｍ、１０８ｎｍ、１０９ｎｍ、１１０ｎｍ、１１１ｎｍ、１１２ｎｍ、１１３ｎｍ、１１４ｎｍ、１１５ｎｍ、１１６ｎｍ、１１７ｎｍ、１１８ｎｍ、１１９ｎｍ、１２０ｎｍ、１２１ｎｍ、１２２ｎｍ、１２３ｎｍ、１２４ｎｍ、１２５ｎｍ、１２６ｎｍ、１２７ｎｍ、１２８ｎｍ、１２９ｎｍ、１３０ｎｍ、１３１ｎｍ、１３２ｎｍ、１３３ｎｍ、１３４ｎｍ、１３５ｎｍ、１３６ｎｍ、１３７ｎｍ、１３８ｎｍ、１３９ｎｍ、１４０ｎｍ、１４１ｎｍ、１４２ｎｍ、１４３ｎｍ、１４４ｎｍ、１４５ｎｍ、１４６ｎｍ、１４７ｎｍ、１４８ｎｍ、１４９ｎｍ、１５０ｎｍ、１５１ｎｍ、１５２ｎｍ、１５３ｎｍ、１５４ｎｍ、１５５ｎｍ、１５６ｎｍ、１５７ｎｍ、１５８ｎｍ、１５９ｎｍ、１６０ｎｍ、１６１ｎｍ、１６２ｎｍ、１６３ｎｍ、１６４ｎｍ、１６５ｎｍ、１６６ｎｍ、１６７ｎｍ、１６８ｎｍ、１６９ｎｍ、１７０ｎｍ、１７１ｎｍ、１７２ｎｍ、１７３ｎｍ、１７４ｎｍ、１７５ｎｍ、１７６ｎｍ、１７７ｎｍ、１７８ｎｍ、１７９ｎｍ、１８０ｎｍ、１８１ｎｍ、１８２ｎｍ、１８３ｎｍ、１８４ｎｍ、１８５ｎｍ、１８６ｎｍ、１８７ｎｍ、１８８ｎｍ、１８９ｎｍ、１９０ｎｍ、１９１ｎｍ、１９２ｎｍ、１９３ｎｍ、１９４ｎｍ、１９５ｎｍ、１９６ｎｍ、１９７ｎｍ、１９８ｎｍ、１９９ｎｍ、２００ｎｍ、２０１ｎｍ、２０２ｎｍ、２０３ｎｍ、２０４ｎｍ、２０５ｎｍ、２０６ｎｍ、２０７ｎｍ、２０８ｎｍ、２０９ｎｍ、２１０ｎｍ、２１１ｎｍ、２１２ｎｍ、２１３ｎｍ、２１４ｎｍ、２１５ｎｍ、２１６ｎｍ、２１７ｎｍ、２１８ｎｍ、２１９ｎｍ、２２０ｎｍ、２２１ｎｍ、２２２ｎｍ、２２３ｎｍ、２２４ｎｍ、２２５ｎｍ、２２６ｎｍ、２２７ｎｍ、２２８ｎｍ、２２９ｎｍ、２３０ｎｍ、２３１ｎｍ、２３２ｎｍ、２３３ｎｍ、２３４ｎｍ、２３５ｎｍ、２３６ｎｍ、２３７ｎｍ、２３８ｎｍ、２３９ｎｍ、２４１ｎｍ、２４２ｎｍ、２４３ｎｍ、２４４ｎｍ、２４５ｎｍ、２４６ｎｍ、２４７ｎｍ、２４８ｎｍ、２４９ｎｍ、２５１ｎｍ、２５２ｎｍ、２５３ｎｍ、２５４ｎｍ、２５５ｎｍ、２５６ｎｍ、２５７ｎｍ、２５８ｎｍ、２５９ｎｍ、２６１ｎｍ、２６２ｎｍ、２６３ｎｍ、２６４ｎｍ、２６５ｎｍ、２６６ｎｍ、２６７ｎｍ、２６８ｎｍ、２６９ｎｍ、２７１ｎｍ、２７２ｎｍ、２７３ｎｍ、２７４ｎｍ、２７５ｎｍ、２７６ｎｍ、２７７ｎｍ、２７８ｎｍ、２７９ｎｍ、２８１ｎｍ、２８２ｎｍ、２８３ｎｍ、２８４ｎｍ、２８５ｎｍ、２８６ｎｍ、２８７ｎｍ、２８８ｎｍ、２８９ｎｍ、２９１ｎｍ、２９２ｎｍ、２９３ｎｍ、２９４ｎｍ、２９５ｎｍ、２９６ｎｍ、２９７ｎｍ、２９８ｎｍ、２９９ｎｍ、３００ｎｍ、３０１ｎｍ、３０２ｎｍ、３０３ｎｍ、３０４ｎｍ、３０５ｎｍ、３０６ｎｍ、３０７ｎｍ、３０８ｎｍ、３０９ｎｍ、３１０ｎｍ、３１１ｎｍ、３１２ｎｍ、３１３ｎｍ、３１４ｎｍ、３１５ｎｍ、３１６ｎｍ、３１７ｎｍ、３１８ｎｍ、３１９ｎｍ、３２０ｎｍ、３２１ｎｍ、３２２ｎｍ、３２３ｎｍ、３２４ｎｍ、３２５ｎｍ、３２６ｎｍ、３２７ｎｍ、３２８ｎｍ、３２９ｎｍ、３３０ｎｍ、３３１ｎｍ、３３２ｎｍ、３３３ｎｍ、３３４ｎｍ、３３５ｎｍ、３３６ｎｍ、３３７ｎｍ、３３８ｎｍ、３３９ｎｍ、３４０ｎｍ、３４１ｎｍ、３４２ｎｍ、３４３ｎｍ、３４４ｎｍ、３４５ｎｍ、３４６ｎｍ、３４７ｎｍ、３４８ｎｍ、３４９ｎｍ、３５０ｎｍ、３５１ｎｍ、３５２ｎｍ、３５３ｎｍ、３５４ｎｍ、３５５ｎｍ、３５６ｎｍ、３５７ｎｍ、３５８ｎｍ、３５９ｎｍ、３６０ｎｍ、３６１ｎｍ、３６２ｎｍ、３６３ｎｍ、３６４ｎｍ、３６５ｎｍ、３６６ｎｍ、３６７ｎｍ、３６８ｎｍ、３６９ｎｍ、３７０ｎｍ、３７１ｎｍ、３７２ｎｍ、３７３ｎｍ、３７４ｎｍ、３７５ｎｍ、３７６ｎｍ、３７７ｎｍ、３７８ｎｍ、３７９ｎｍ、３８０ｎｍ、３８１ｎｍ、３８２ｎｍ、３８３ｎｍ、３８４ｎｍ、３８５ｎｍ、３８６ｎｍ、３８７ｎｍ、３８８ｎｍ、３８９ｎｍ、３９０ｎｍ、３９１ｎｍ、３９２ｎｍ、３９３ｎｍ、３９４ｎｍ、３９５ｎｍ、３９６ｎｍ、３９７ｎｍ、３９８ｎｍ、３９９ｎｍ、４００ｎｍ、４０１ｎｍ、４０２ｎｍ、４０３ｎｍ、４０４ｎｍ、４０５ｎｍ、４０６ｎｍ、４０７ｎｍ、４０８ｎｍ、４０９ｎｍ、４１０ｎｍ、４１１ｎｍ、４１２ｎｍ、４１３ｎｍ、４１４ｎｍ、４１５ｎｍ、４１６ｎｍ、４１７ｎｍ、４１８ｎｍ、４１９ｎｍ、４２０ｎｍ、４２１ｎｍ、４２２ｎｍ、４２３ｎｍ、４２４ｎｍ、４２５ｎｍ、４２６ｎｍ、４２７ｎｍ、４２８ｎｍ、４２９ｎｍ、４３０ｎｍ、４３１ｎｍ、４３２ｎｍ、４３３ｎｍ、４３４ｎｍ、４３５ｎｍ、４３６ｎｍ、４３７ｎｍ、４３８ｎｍ、４３９ｎｍ、４４０ｎｍ、４４１ｎｍ、４４２ｎｍ、４４３ｎｍ、４４４ｎｍ、４４５ｎｍ、４４６ｎｍ、４４７ｎｍ、４４８ｎｍ、４４９ｎｍ、４５０ｎｍ、４５１ｎｍ、４５２ｎｍ、４５３ｎｍ、４５４ｎｍ、４５５ｎｍ、４５６ｎｍ、４５７ｎｍ、４５８ｎｍ、４５９ｎｍ、４６０ｎｍ、４６１ｎｍ、４６２ｎｍ、４６３ｎｍ、４６４ｎｍ、４６５ｎｍ、４６６ｎｍ、４６７ｎｍ、４６８ｎｍ、４６９ｎｍ、４７０ｎｍ、４７１ｎｍ、４７２ｎｍ、４７３ｎｍ、４７４ｎｍ、４７５ｎｍ、４７６ｎｍ、４７７ｎｍ、４７８ｎｍ、４７９ｎｍ、４８０ｎｍ、４８１ｎｍ、４８２ｎｍ、４８３ｎｍ、４８４ｎｍ、４８５ｎｍ、４８６ｎｍ、４８７ｎｍ、４８８ｎｍ、４８９ｎｍ、４９０ｎｍ、４９１ｎｍ、４９２ｎｍ、４９３ｎｍ、４９４ｎｍ、４９５ｎｍ、４９６ｎｍ、４９７ｎｍ、４９８ｎｍ、４９９ｎｍ、５００ｎｍ、５０１ｎｍ、５０２ｎｍ、５０３ｎｍ、５０４ｎｍ、５０５ｎｍ、５０６ｎｍ、５０７ｎｍ、５０８ｎｍ、５０９ｎｍ、５１０ｎｍ、５１１ｎｍ、５１２ｎｍ、５１３ｎｍ、５１４ｎｍ、５１５ｎｍ、５１６ｎｍ、５１７ｎｍ、５１８ｎｍ、５１９ｎｍ、５２０ｎｍ、５２１ｎｍ、５２２ｎｍ、５２３ｎｍ、５２４ｎｍ、５２５ｎｍ、５２６ｎｍ、５２７ｎｍ、５２８ｎｍ、５２９ｎｍ、５３０ｎｍ、５３１ｎｍ、５３２ｎｍ、５３３ｎｍ、５３４ｎｍ、５３５ｎｍ、５３６ｎｍ、５３７ｎｍ、５３８ｎｍ、５３９ｎｍ、５４０ｎｍ、５４１ｎｍ、５４２ｎｍ、５４３ｎｍ、５４４ｎｍ、５４５ｎｍ、５４６ｎｍ、５４７ｎｍ、５４８ｎｍ、５４９ｎｍ、５５０ｎｍ、５５１ｎｍ、５５２ｎｍ、５５３ｎｍ、５５４ｎｍ、５５５ｎｍ、５５６ｎｍ、５５７ｎｍ、５５８ｎｍ、５５９ｎｍ、５６０ｎｍ、５６１ｎｍ、５６２ｎｍ、５６３ｎｍ、５６４ｎｍ、５６５ｎｍ、５６６ｎｍ、５６７ｎｍ、５６８ｎｍ、５６９ｎｍ、５７０ｎｍ、５７１ｎｍ、５７２ｎｍ、５７３ｎｍ、５７４ｎｍ、５７５ｎｍ、５７６ｎｍ、５７７ｎｍ、５７８ｎｍ、５７９ｎｍ、５８０ｎｍ、５８１ｎｍ、５８２ｎｍ、５８３ｎｍ、５８４ｎｍ、５８５ｎｍ、５８６ｎｍ、５８７ｎｍ、５８８ｎｍ、５８９ｎｍ、５９０ｎｍ、５９１ｎｍ、５９２ｎｍ、５９３ｎｍ、５９４ｎｍ、５９５ｎｍ、５９６ｎｍ、５９７ｎｍ、５９８ｎｍ、５９９ｎｍ、６００ｎｍ、６０１ｎｍ、６０２ｎｍ、６０３ｎｍ、６０４ｎｍ、６０５ｎｍ、６０６ｎｍ、６０７ｎｍ、６０８ｎｍ、６０９ｎｍ、６１０ｎｍ、６１１ｎｍ、６１２ｎｍ、６１３ｎｍ、６１４ｎｍ、６１５ｎｍ、６１６ｎｍ、６１７ｎｍ、６１８ｎｍ、６１９ｎｍ、６２０ｎｍ、６２１ｎｍ、６２２ｎｍ、６２３ｎｍ、６２４ｎｍ、６２５ｎｍ、６２６ｎｍ、６２７ｎｍ、６２８ｎｍ、６２９ｎｍ、６３０ｎｍ、６３１ｎｍ、６３２ｎｍ、６３３ｎｍ、６３４ｎｍ、６３５ｎｍ、６３６ｎｍ、６３７ｎｍ、６３８ｎｍ、６３９ｎｍ、６４０ｎｍ、６４１ｎｍ、６４２ｎｍ、６４３ｎｍ、６４４ｎｍ、６４５ｎｍ、６４６ｎｍ、６４７ｎｍ、６４８ｎｍ、６４９ｎｍ、６５０ｎｍ、６５１ｎｍ、６５２ｎｍ、６５３ｎｍ、６５４ｎｍ、６５５ｎｍ、６５６ｎｍ、６５７ｎｍ、６５８ｎｍ、６５９ｎｍ、６６０ｎｍ、６６１ｎｍ、６６２ｎｍ、６６３ｎｍ、６６４ｎｍ、６６５ｎｍ、６６６ｎｍ、６６７ｎｍ、６６８ｎｍ、６６９ｎｍ、６７０ｎｍ、６７１ｎｍ、６７２ｎｍ、６７３ｎｍ、６７４ｎｍ、６７５ｎｍ、６７６ｎｍ、６７７ｎｍ、６７８ｎｍ、６７９ｎｍ、６８０ｎｍ、６８１ｎｍ、６８２ｎｍ、６８３ｎｍ、６８４ｎｍ、６８５ｎｍ、６８６ｎｍ、６８７ｎｍ、６８８ｎｍ、６８９ｎｍ、６９０ｎｍ、６９１ｎｍ、６９２ｎｍ、６９３ｎｍ、６９４ｎｍ、６９５ｎｍ、６９６ｎｍ、６９７ｎｍ、６９８ｎｍ、６９９ｎｍ、７００ｎｍ、７０１ｎｍ、７０２ｎｍ、７０３ｎｍ、７０４ｎｍ、７０５ｎｍ、７０６ｎｍ、７０７ｎｍ、７０８ｎｍ、７０９ｎｍ、７１０ｎｍ、７１１ｎｍ、７１２ｎｍ、７１３ｎｍ、７１４ｎｍ、７１５ｎｍ、７１６ｎｍ、７１７ｎｍ、７１８ｎｍ、７１９ｎｍ、７２０ｎｍ、７２１ｎｍ、７２２ｎｍ、７２３ｎｍ、７２４ｎｍ、７２５ｎｍ、７２６ｎｍ、７２７ｎｍ、７２８ｎｍ、７２９ｎｍ、７３０ｎｍ、７３１ｎｍ、７３２ｎｍ、７３３ｎｍ、７３４ｎｍ、７３５ｎｍ、７３６ｎｍ、７３７ｎｍ、７３８ｎｍ、７３９ｎｍ、７４０ｎｍ、７４１ｎｍ、７４２ｎｍ、７４３ｎｍ、７４４ｎｍ、７４５ｎｍ、７４６ｎｍ、７４７ｎｍ、７４８ｎｍ、７４９ｎｍ、７５０ｎｍ、７５１ｎｍ、７５２ｎｍ、７５３ｎｍ、７５４ｎｍ、７５５ｎｍ、７５６ｎｍ、７５７ｎｍ、７５８ｎｍ、７５９ｎｍ、７６０ｎｍ、７６１ｎｍ、７６２ｎｍ、７６３ｎｍ、７６４ｎｍ、７６５ｎｍ、７６６ｎｍ、７６７ｎｍ、７６８ｎｍ、７６９ｎｍ、７７０ｎｍ、７７１ｎｍ、７７２ｎｍ、７７３ｎｍ、７７４ｎｍ、７７５ｎｍ、７７６ｎｍ、７７７ｎｍ、７７８ｎｍ、７７９ｎｍ、７８０ｎｍ、７８１ｎｍ、７８２ｎｍ、７８３ｎｍ、７８４ｎｍ、７８５ｎｍ、７８６ｎｍ、７８７ｎｍ、７８８ｎｍ、７８９ｎｍ、７９０ｎｍ、７９１ｎｍ、７９２ｎｍ、７９３ｎｍ、７９４ｎｍ、７９５ｎｍ、７９６ｎｍ、７９７ｎｍ、７９８ｎｍ、７９９ｎｍ、８００ｎｍ、８０１ｎｍ、８０２ｎｍ、８０３ｎｍ、８０４ｎｍ、８０５ｎｍ、８０６ｎｍ、８０７ｎｍ、８０８ｎｍ、８０９ｎｍ、８１０ｎｍ、８１１ｎｍ、８１２ｎｍ、８１３ｎｍ、８１４ｎｍ、８１５ｎｍ、８１６ｎｍ、８１７ｎｍ、８１８ｎｍ、８１９ｎｍ、８２０ｎｍ、８２１ｎｍ、８２２ｎｍ、８２３ｎｍ、８２４ｎｍ、８２５ｎｍ、８２６ｎｍ、
８２７ｎｍ、８２８ｎｍ、８２９ｎｍ、８３０ｎｍ、８３１ｎｍ、８３２ｎｍ、８３３ｎｍ、８３４ｎｍ、８３５ｎｍ、８３６ｎｍ、８３７ｎｍ、８３８ｎｍ、８３９ｎｍ、８４０ｎｍ、８４１ｎｍ、８４２ｎｍ、８４３ｎｍ、８４４ｎｍ、８４５ｎｍ、８４６ｎｍ、８４７ｎｍ、８４８ｎｍ、８４９ｎｍ、８５０ｎｍ、８５１ｎｍ、８５２ｎｍ、８５３ｎｍ、８５４ｎｍ、８５５ｎｍ、８５６ｎｍ、８５７ｎｍ、８５８ｎｍ、８５９ｎｍ、８６０ｎｍ、８６１ｎｍ、８６２ｎｍ、８６３ｎｍ、８６４ｎｍ、８６５ｎｍ、８６６ｎｍ、８６７ｎｍ、８６８ｎｍ、８６９ｎｍ、８７０ｎｍ、８７１ｎｍ、８７２ｎｍ、８７３ｎｍ、８７４ｎｍ、８７５ｎｍ、８７６ｎｍ、８７７ｎｍ、８７８ｎｍ、８７９ｎｍ、８８０ｎｍ、８８１ｎｍ、８８２ｎｍ、８８３ｎｍ、８８４ｎｍ、８８５ｎｍ、８８６ｎｍ、８８７ｎｍ、８８８ｎｍ、８８９ｎｍ、８９０ｎｍ、８９１ｎｍ、８９２ｎｍ、８９３ｎｍ、８９４ｎｍ、８９５ｎｍ、８９６ｎｍ、８９７ｎｍ、８９８ｎｍ、８９９ｎｍ、９００ｎｍ、９０１ｎｍ、９０２ｎｍ、９０３ｎｍ、９０４ｎｍ、９０５ｎｍ、９０６ｎｍ、９０７ｎｍ、９０８ｎｍ、９０９ｎｍ、９１０ｎｍ、９１１ｎｍ、９１２ｎｍ、９１３ｎｍ、９１４ｎｍ、９１５ｎｍ、９１６ｎｍ、９１７ｎｍ、９１８ｎｍ、９１９ｎｍ、９２０ｎｍ、９２１ｎｍ、９２２ｎｍ、９２３ｎｍ、９２４ｎｍ、９２５ｎｍ、９２６ｎｍ、９２７ｎｍ、９２８ｎｍ、９２９ｎｍ、９３０ｎｍ、９３１ｎｍ、９３２ｎｍ、９３３ｎｍ、９３４ｎｍ、９３５ｎｍ、９３６ｎｍ、９３７ｎｍ、９３８ｎｍ、９３９ｎｍ、９４０ｎｍ、９４１ｎｍ、９４２ｎｍ、９４３ｎｍ、９４４ｎｍ、９４５ｎｍ、９４６ｎｍ、９４７ｎｍ、９４８ｎｍ、９４９ｎｍ、９５０ｎｍ、９５１ｎｍ、９５２ｎｍ、９５３ｎｍ、９５４ｎｍ、９５５ｎｍ、９５６ｎｍ、９５７ｎｍ、９５８ｎｍ、９５９ｎｍ、９６０ｎｍ、９６１ｎｍ、９６２ｎｍ、９６３ｎｍ、９６４ｎｍ、９６５ｎｍ、９６６ｎｍ、９６７ｎｍ、９６８ｎｍ、９６９ｎｍ、９７０ｎｍ、９７１ｎｍ、９７２ｎｍ、９７３ｎｍ、９７４ｎｍ、９７５ｎｍ、９７６ｎｍ、９７７ｎｍ、９７８ｎｍ、９７９ｎｍ、９８０ｎｍ、９８１ｎｍ、９８２ｎｍ、９８３ｎｍ、９８４ｎｍ、９８５ｎｍ、９８６ｎｍ、９８７ｎｍ、９８８ｎｍ、９８９ｎｍ、９９０ｎｍ、９９１ｎｍ、９９２ｎｍ、９９３ｎｍ、９９４ｎｍ、９９５ｎｍ、９９６ｎｍ、９９７ｎｍ、９９８ｎｍ、９９９ｎｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２１μｍ、２２μｍ、２３μｍ、２４μｍ、２５μｍ、２６μｍ、２７μｍ、２８μｍ、２９μｍ、３０μｍ、３１μｍ、３２μｍ、３３μｍ、３４μｍ、３５μｍ、３６μｍ、３７μｍ、３８μｍ、３９μｍ、４０μｍ、４１μｍ、４２μｍ、４３μｍ、４４μｍ、４５μｍ、４６μｍ、４７μｍ、４８μｍ、４９μｍ、または約５０μｍのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約０．１ｎＭ～約１．０ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１ｎＭ～約１０ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１ｎＭ～約１００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１ｎＭ～約２００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１ｎＭ～約５０ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１０ｎＭ～約１００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１０ｎＭ～約２００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約５０ｎＭ～約１００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約５０ｎＭ～約２００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１００ｎＭ～約２００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１５０ｎＭ～約２００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約２００ｎＭ～約１００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約５００ｎＭ～約１０００ｎＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中に約１μＭ～約５０μＭのポリヌクレオチドを含むように製剤化され得る。本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中のペプチドの濃度は、ポリヌクレオチドの所望の濃度及び本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体中のペプチドとポリヌクレオチドとの比率に基づき計算され得る。

【0130】

薬学的組成物はまた、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または約７００μｇ／ｍｌ以上の本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むように製剤化されてもよい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００μｇ／ｍｌの本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むように製剤化される。他の実施形態では、薬学的組成物は、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または約３００μｇ／ｍｌの本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むように製剤化される。さらに他の実施形態では、薬学的組成物は、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または約５００μｇ／ｍｌの本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むように製剤化される。さらに他の実施形態では、薬学的組成物は、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、または約７００μｇ／ｍｌの本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含むように製剤化される。

【0131】

ＩＩＩ．使用方法
別の態様では、本発明は、細胞の細胞質内にポリヌクレオチドをトランスフェクトするために、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を使用するための方法を包含する。いくつかの実施形態では、細胞はインビトロである。他の実施形態では、細胞はインビボである。よって、本発明は、細胞の細胞質内にポリヌクレオチドをトランスフェクトすることを必要とする対象にそれを行うために本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を使用するための方法も包含する。一般的に言って、本発明の方法は、ポリヌクレオチドのトランスフェクションに好適な条件下で、細胞を本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体と接触させることを含む。好適な細胞及び条件は、セクションＩに上述される。細胞がインビボである実施形態では、本発明の方法は、典型的には、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。好適な薬学的組成物は、セクションＩＩに記載される。

【0132】

別の態様では、本発明は、対象の状態を治療するための方法を包含する。本方法は、治療有効量のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、対象の細胞内にペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドを効率的にトランスフェクトまたは送達することができる。

【0133】

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、細胞において発現される核酸配列の発現を調節または阻害することができる非コードＲＮＡを含む。細胞において発現される核酸配列の発現を調節または阻害することができるポリヌクレオチドを効率的にトランスフェクトすることにより、本発明の方法は、細胞において通常発現される核酸配列の発現を調節または阻害することにより治療することができる任意の状態を治療するために使用され得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するために本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を対象に投与する方法を包含する。他の好適な実施形態では、本発明は、対象におけるＳＴＡＴ３調節不全に関連する状態を治療するために、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を対象に投与する方法を包含する。他の好ましい実施形態では、本発明は、対象におけるＪＮＫ２調節不全に関連する状態を治療するために、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を対象に投与する方法を包含する。特定の疾患？

【0134】

他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象において欠乏する、または不在であるタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。対象における欠乏または不在タンパク質を特徴とする疾患の非限定的な例としては、下位運動ニューロン疾患、ポンペ病、リソソーム蓄積症、及び多形神経膠芽腫が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、リソソーム蓄積症の対象において欠乏する、または不在であるタンパク質をコードするＤＮＡを含む。酵素補充療法は、リソソーム蓄積症に特によく適しており、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、発現カセット、またはリソソーム蓄積症の対象において欠乏する、または不在であるタンパク質をコードするベクターを、対象の細胞質内にトランスフェクトするために使用され得る。リソソーム蓄積障害は、活性化因子欠乏症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、α－マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児性、後期乳児性／若年性、成人性／慢性）、Ｉ細胞疾患／ムコリピドーシスＩＩ、乳児性遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠乏症、クラッベ病（乳児発症、遅発性）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症（偽性ハーラーポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｄ、モルキオ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＶＡ、モルキオ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＩＸヒアルロニダーゼ欠乏症、ＭＰＳ ＶＩマロトー・ラミー症候群、ＭＰＳ ＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型）、多重スルファターゼ欠乏症、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ６疾患（非定型後期乳児性、遅発性バリアント、早期若年性）、バッテン・シュピールマイアー・フォークト／若年性ＮＣＬ／ＣＬＮ３疾患、フィンランドバリアント後期乳児性ＣＬＮ５（Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｖａｒｉａｎｔ Ｌａｔｅ Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ＣＬＮ５）、ジャンスキー・ビールショフスキー疾患／後期乳児性ＣＬＮ２／ＴＰＰ１疾患、Ｋｕｆｓ／成人発症ＮＣＬ／ＣＬＮ４疾患、ノーザン癲癇（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）／バリアント後期乳児性ＣＬＮ８、サンタブオリ・ハルチア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ）／乳児性ＣＬＮ１／ＰＰＴ疾患、β－マンノシドーシス、ポンペ病／グリコーゲン蓄積症ＩＩ型、濃化異骨症、サンドホフ病／成人発症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス－－乳児性、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス－－若年性、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病を含むが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、対象は、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ Ｉ、ＭＰＳ ＩＩ］ ＭＰＳ ＶＩ、及びグリコーゲン蓄積症ＩＩ型からなる群から選択される疾患の治療を必要とする。

【0135】

ペプチド、ポリヌクレオチド、及びペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、セクションＩに記載される通りであってよい。本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物は、セクションＩＩに記載される通りであってよい。本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を投与する方法、及び状態を治療する方法は、以下に記載される。

【0136】

（ａ）それを必要とする対象への投与
ある態様では、本発明は、治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを包含する。本明細書で使用される、句「それを必要とする対象」は、予防または治療的処置を必要とする対象を指す。対象は、ゲッ齒類、ヒト、家畜動物、ペット動物、または動物園の動物であってよい。一実施形態では、対象は、ゲッ齒類、例えば、マウス、ラット、モルモット等であってよい。別の実施形態では、対象は、家畜動物であってよい。好適な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、及びアルパカを挙げることができる。また別の実施形態では、対象は、ペット動物であってよい。ペット動物の非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、及びトリなどのペットを挙げることができる。さらに別の実施形態では、対象は、動物園の動物であってよい。本明細書で使用される、「動物園の動物」は、動物園において見ることができる動物を指す。そのような動物は、非ヒト霊長類、大型のネコ、オオカミ、及びクマを含み得る。好ましい実施形態では、対象は、マウスである。別の好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。

【0137】

セクションＩＩに記載される、本発明の薬学的組成物は、その意図される投与形態と適合性であるように製剤化される。好適な投与経路は、非経口、経口、肺、経皮、経粘膜、及び直腸投与を含む。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、注射により投与される。

【0138】

当業者は、対象に投与される組成物の量及び濃度が、一部、対象及び投与の理由によることを認識する。最適な量を決定するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、薬学的組成物中の本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体の濃度は、セクションＩＩに記載される通りであってよい。

【0139】

本発明の組成物は、典型的には、対象に利益を提供するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。この量は、「治療有効量」と定義される。治療有効量は、特定の組成物の有効性もしくは効力、治療される障害、投与の期間もしくは頻度、投与方法、ならびに対象の特定の治療応答を含む、対象の大きさ及び状態により決定され得る。治療有効量は、当該技術分野に既知の方法を使用して決定され得、実験的に決定され得る、マウスなどの動物モデルにおいて決定された治療有効量から導かれる、またはこれらの組み合わせである。加えて、投与経路は、治療有効量を決定する際に考慮され得る。治療有効量の決定において、当業者は、特定の対象における特定の化合物の投与に付随する任意の有害作用の存在、性質、及び程度も考慮する場合がある。

【0140】

本発明の薬学的組成物が注射によって対象に投与される場合、組成物は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００ｍｇ／ｋｇ以上の量で、ボーラスで対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または約５ｍｇ／ｋｇの量で対象に投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約５、５．５、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、または約１５ｍｇ／ｋｇの量で対象に投与される。さらに他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または約３０ｍｇ／ｋｇの量で対象に投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または約４５ｍｇ／ｋｇの量で対象に投与される。追加の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００ｍｇ／ｋｇ以上の量で対象に投与される。好ましい実施形態では、組成物は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、または約１．５ｍｇ／ｋｇの量で、ボーラスで対象に投与される。

【0141】

組成物は、ある期間にわたって、２つ以上のボーラスを対象に注射することによっても投与され得る。例えば、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のボーラスを対象に注射することによって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１、２、３、４、または５つ以上のボーラスを対象に注射することによって投与される。他の実施形態では、組成物は、５、６、７、８、９、１０以上のボーラスを対象に注射することによって投与される。好ましい実施形態では、組成物は、２、３、または４つのボーラスを対象に注射することにより投与される。ボーラスは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１時間毎、もしくは約１２時間毎に対象に注射されるか、またはそれらは、約１、２、３、４、５、６日毎、もしくは約７日毎に注射され得る。好ましい実施形態では、ボーラスは、ほぼ毎日注射され得る。

【0142】

（ｂ）ＮＦκＢ媒介状態の治療
上述のように、本発明の方法は、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するために使用され得る。本発明の方法は、ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するように使用され得る。本発明の方法は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路、非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路、または標準及び非標準両方のＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するように使用され得る。実施例に記載されるように、出願者は、意外にも、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路及び非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することが相乗的であることを発見した。用語「相乗的」は、２つ以上の薬剤が相乗的に作用して、各薬剤の独立した作用の付加以上の作用をもたらす作用を指す。相乗作用測定の１つは、Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ併用係数法により示すことができる。Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ係数法は、メジアン効果方程式（ｍｅｄｉａｎ－ｅｆｆｅｃｔ ｅｑｕａｔｉｏｎ）に基づき、単一の実体と複数の実体、及び一次動力学と高次動力学を関連付ける質量作用法則の原理から導かれ、ミカエリス－メンテン、ヒル、ヘンダーソン－ハッセルバルヒ、及びスキャッチャードの式を包含する。Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ併用係数法は、付加作用がＣＩ＝１をもたらし、相乗作用がＣＩ＜１をもたらし、拮抗作用がＣＩ＞１をもたらす、併用係数（ＣＩ）をもたらす。Ｔｉｎｇ－Ｃｈａｏ Ｃｈｏｕ，２００８，Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｅｒｓｕｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆Ｌｙｍｐｈｏｍａ，４９：２０５９－２０８０を参照。

【0143】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標準ＮＦκＢ伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するように使用され得る。実施形態の例示的な代替えでは、対象におけるＮＦκＢ媒介状態は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路の転写因子ｐ６５サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することにより治療される。

【0144】

他の実施形態では、本発明の方法は、非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するように使用され得る。実施形態の例示的な代替えでは、対象におけるＮＦκＢ媒介状態は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することにより治療される。

【0145】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列、及び非標準ＮＦκＢシグナル伝達経路と正常に会合した核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＮＦκＢ媒介状態を治療するように使用され得る。実施形態の例示的な代替えでは、対象におけるＮＦκＢ媒介状態は、標準ＮＦκＢシグナル伝達経路の転写因子ｐ６５サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害し、かつ標準ＮＦκＢシグナル伝達経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位をコードする核酸配列の発現を妨害することにより治療される。

【0146】

用語「ＮＦκＢ媒介状態」は、ＮＦκＢシグナル伝達経路におけるシグナル伝達の調節不全により生じ得る任意の状態を説明するために使用され得る。ＮＦκＢ媒介状態の非限定的な例としては、炎症障害、自己免疫疾患、移植拒絶、骨粗鬆症、癌、関節炎、アルツハイマー病、関節炎、粥状動脈硬化、ウイルス感染、または毛細血管拡張性運動失調症を挙げることができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、炎症障害を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、自己免疫疾患を治療するために使用される。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、移植拒絶を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、骨粗鬆症を治療するために使用される。追加の実施形態では、本発明の方法は、アルツハイマー病を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、粥状動脈硬化を治療するために使用される。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、ウイルス感染を治療するために使用される。また他の実施形態では、本発明の方法は、毛細血管拡張性運動失調症を治療するために使用される。

【0147】

ｉ．癌の治療
好ましい実施形態では、本発明の方法は、新生物または癌を治療するために使用される。新生物は、悪性または良性であってよく、癌は、原発性または転移性であってよく、新生物または癌は、初期または後期であってよい。癌または新生物は、対象の癌腫瘍に核酸配列を送達することにより治療され得る。癌または新生物は、癌細胞の成長を遅らせる、または癌細胞を死滅させることにより治療され得る。

【0148】

いくつかの実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドは、対象の癌細胞にインビボでナノ粒子のポリヌクレオチドを送達することにより癌または新生物を治療することができる。本発明の方法で治療することができる新生物または癌の非限定的な例としては、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫（小児期小脳または大脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹膠腫、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性膠腫、上衣芽細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路、及び視床下部膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児期、胃腸）、未知の原発性癌、中枢神経系リンパ腫（原発性）、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍におけるユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍（小児期）、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼球内黒色腫、網膜芽腫）、胆嚢癌、胃（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、生殖細胞腫瘍（小児期頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性栄養膜腫瘍、膠腫（成人、小児期脳幹、小児期大脳星状細胞腫、小児期視覚路、及び視床下部）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頚部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路膠腫（小児期）、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、有毛細胞）、唇及び口腔癌、肝癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系）、マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ）、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫（小児期）、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（成人悪性、小児期）、潜在性原発性を伴う転移性扁平上皮頚癌、口癌、多発性内分泌腫瘍症候群（小児期）、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（慢性）、骨髄性白血病（成人急性、小児期急性）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害（慢性）、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮性癌（表面上皮性－間質腫瘍）、卵巣生殖細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓癌、膵臓癌（膵島細胞）、副鼻腔及び鼻腔癌、上皮小体癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児期）、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍形成、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盤及び尿管移行細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫（小児期）、唾液腺癌、肉腫（ユーイングファミリーの腫瘍、カポジ、軟組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、皮膚癌（メルケル細胞）、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、潜在性原発性（転移性）を伴う扁平上皮頚癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児期）、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚）、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫（小児期）、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌（小児期）、腎盤及び尿管の移行細胞癌、栄養膜腫瘍（妊娠性）、未知の原発部位（成人、小児期）、尿管及び腎盤移行細胞癌、尿道癌、子宮癌（子宮内膜）、子宮肉腫、腟癌、視覚路及び視床下部の膠腫（小児期）、外陰癌、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、ならびにウイルムス腫瘍（小児期）を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞白血病及びリンパ腫を治療するために使用される。例示的な実施形態では、本発明の方法は、ヒトＴリンパ親和性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）誘発成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）を治療するために使用される。

【0149】

他の実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドは、インビトロで癌細胞に送達され得る。例えば、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体のポリヌクレオチドは、インビトロで癌細胞系に送達され得る。癌細胞は、インビトロで培養された癌細胞系であってよい。実施形態のいくつかの代替えでは、癌細胞系は、まだ説明されていない原発性細胞系であってよい。原発性癌細胞系を調製する方法は、当業者に既知の標準的な技法を利用する。他の代替えでは、癌細胞系は、確立された癌細胞系であってよい。癌細胞系は、付着性または非付着性であるか、または細胞系は、当業者に既知の標準的な技法を使用して、付着、非付着、または器官成長を促進する条件下で成長させることができる。癌細胞系は、接触阻害されるか、または非接触阻害され得る。

【0150】

いくつかの実施形態では、癌細胞系は、腫瘍に由来する確立されたヒト細胞系であってよい。腫瘍に由来する癌細胞系の非限定的な例としては、骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ＣＡＬ－７２、Ｇ－２９２、ＨＯＳ、ＫＨＯＳ、ＭＧ－６３、Ｓａｏｓ－２、及びＵ－２ ＯＳ；前立腺癌細胞系ＤＵ１４５、ＰＣ３、及びＬｎｃａｐ；乳癌細胞系ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－４３８、及びＴ４７Ｄ；骨髄性白血病細胞ＴＨＰ－１、膠芽腫細胞系Ｕ８７；神経芽細胞腫細胞系ＳＨＳＹ５Ｙ；骨癌細胞系Ｓａｏｓ－２；結腸癌細胞系ＷｉＤｒ、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ、ＨＴ２９、ＤＬＤ－１、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬＯ ２０１、ＨＣＴ－１５、ＳＷ６２０、ＬｏＶｏ、ＳＷ４０３、ＳＷ４０３、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３、ＳＷ８３７、ＳＷ９４８、ＳＷ１４１７、ＧＰＣ－１６、ＨＣＴ－８ＨＣＴ １１６、ＮＣＩ－Ｈ７１６、ＮＣＩ－Ｈ７４７、ＮＣＩ－Ｈ５０８、ＮＣＩ－Ｈ４９８、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、ＳＮＵ－Ｃ２Ａ、ＬＳ １８０、ＬＳ １７４Ｔ、ＭＯＬＴ－４、ＬＳ５１３、ＬＳ１０３４、ＬＳ４１１Ｎ、Ｈｓ ６７５．Ｔ、ＣＯ ８８ＢＶ５９－１、Ｃｏ８８ＢＶ５９Ｈ２１－２、Ｃｏ８８ＢＶ５９Ｈ２１－２Ｖ６７－６６、１１１６－ＮＳ－１９－９、ＴＡ ９９、ＡＳ ３３、ＴＳ １０６、Ｃａｃｏ－２、ＨＴ－２９、ＳＫ－ＣＯ－１、ＳＮＵ－Ｃ２Ｂ、及びＳＷ４８０；Ｂ１６－Ｆ１０、ＲＡＷ２６４．７、Ｆ８細胞系、ならびに膵臓癌Ｐａｎｃ１を挙げることができる。例示的な実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、Ｆ８細胞系に投与され得る。別の例示的な実施形態では、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体は、Ｂ１６－Ｆ１０細胞系に投与され得る。

【0151】

ｉｉ．関節炎状態の治療
他の好ましい実施形態では、本発明の方法は、関節炎状態を治療するために使用される。関節炎状態の非限定的な例としては、変形性関節症、関節リウマチ、痛風及び偽痛風、敗血症性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、スチル病、狼瘡、または感染もしくは治療に起因する関節炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、変形性関節症を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、関節リウマチを治療するために使用される。さらに他の実施形態では、本発明は、痛風を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、偽痛風を治療するために使用される。追加の実施形態では、本発明の方法は、敗血症性関節炎を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、強直性脊椎炎を治療するために使用される。また他の実施形態では、本発明の方法は、若年性特発性関節炎を治療するために使用される。他の実施形態では、本発明の方法は、スチル病を治療するために使用される。追加の実施形態では、本発明の方法は、狼瘡を治療するために使用される。さらに他の実施形態では、本発明の方法は、感染または治療に起因する関節炎を治療するために使用される。例えば、本発明の方法は、コラーゲン抗体誘発関節炎に起因する関節炎を治療するために使用され得る。

【0152】

本明細書で使用される、用語、「関節炎状態を治療する」は、関節炎の症状の軽減を説明するために使用され得る。関節炎の種類に関わらず、関節炎の症状の非限定的な例としては、様々なレベルのとう痛、腫れ、関節の硬直、手を使用するまたは歩くのが不可能、倦怠感及び疲労感、体重損失、睡眠不足、筋肉の痛み及び筋痛、圧痛、及び関節運動の困難が挙げられる。関節炎の症状を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、関節炎スコアを使用する、または画像に基づく測定を使用する、足首などの関節炎関節の厚さの測定を含み得る。

【0153】

いくつかの実施形態では、関節炎の症状は、足首の厚さににより測定される。そのため、本発明の方法を使用して関節炎の状態を治療することは、薬学的組成物で治療されなかった対象と比較した場合、本発明の薬学的組成物で治療された対象の足首の厚さの増加を防止することができる。

【0154】

他の実施形態では、関節炎の症状は、関節炎スコアを使用して測定される。関節炎スコアを測定する方法は、当該技術分野において既知であり、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）スコア、関節リウマチ重篤度スコア（ＲＡＳＳ）、またはＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ関節リウマチ分類基準を含み得る。そのため、本発明の方法を使用して関節炎の状態を治療することは、薬学的組成物で治療されなかった対象と比較した場合、本発明の薬学的組成物で治療された対象の関節炎スコアの増加を防止することができる。例えば、本発明の方法を使用して関節炎の状態を治療することにより、ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ関節リウマチ分類基準を使用して、約１、２、３、４、５、６、７、８、または９を上回る関節炎スコアの増加を防止することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して関節炎の状態を治療することにより、約１、２、または約３を上回る関節炎スコアの増加を防止することができる。

【0155】

さらに他の実施形態では、関節炎の症状は、画像に基づく測定を使用して測定される。画像に基づく測定を使用して関節炎の症状を測定する方法は、当該技術分野において既知であり、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ Ａｃｏｕｓｔ Ｓｏｃ Ａｍ．１２９：３７５６、Ｈｕｇｈｅｓ ２０１１ ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎ Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ Ｆｒｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ．５８：２３６１－２３６９、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．３３：１２３６－１２４３、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１２１：３５４２－３５５７、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｊ Ａｃｏｕｓｔ Ｓｏｃ Ａｍ．１３３：２８３－３００、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１２６：２３５０－２３５８に記載される超音波分子撮像を使用するものを含み得、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0156】

（ｃ）ＳＴＡＴ３調節不全に関連する状態の治療
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるＳＴＡＴ３調節不全に関連する状態を治療するために、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を対象に投与する方法を包含する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、対象においてＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＳＴＡＴ３調節不全に関連する状態を治療するために使用される。例えば、本発明の方法は、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、癌を治療するように使用され得る。癌または新生物は、セクションＩＩＩ（ｃ）ｉに記載される通りであってよい。癌または新生物は、癌細胞の成長を遅らせる、または血管新生を防止することにより治療され得る。いくつかの実施形態では、癌または新生物は、癌細胞の成長を遅らせることにより治療される。他の実施形態では、癌または新生物は、血管新生を防止することにより治療される。用語「血管新生」は、組織における新しい血管の形成、内皮細胞が増殖するための刺激、または増殖する内皮細胞の生存の促進を意味する。好ましい実施形態では、本発明は、対象においてＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、対象における癌を治療するように使用される。例示的な実施形態では、本発明は、癌細胞の成長を遅らせることによって対象においてＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、対象における癌を治療するように使用される。別の例示的な実施形態では、本発明は、血管新生を防止することによって対象においてＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、対象における癌を治療するように使用される。

【0157】

ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、ＳＴＡＴ３タンパク質の発現レベルを減少させることができる。ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡのレベルを減少させることもできる。例えば、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡのレベルを、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または約１０倍以上減少させることができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡのレベルを、約１、２、３、４、または約５倍減少させる。他の実施形態では、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡのレベルを、約５、６、７、８、９、または約１０倍以上減少させる。

【0158】

一般に、本発明の薬学的組成物が細胞において通常発現される核酸配列の発現を妨害する能力を測定する滴定曲線は、ＩＣ_５０を決定するために実施され得る。例えば、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物のＩＣ_５０は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９、または約１００ｎＭ以上であってよい。いくつかの実施形態では、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物のＩＣ_５０は、約１０、１５、２０、２５、または約３０ｎＭである。他の実施形態では、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物のＩＣ_５０は、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ｎＭである。さらに他の実施形態では、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物のＩＣ_５０は、約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９、または約１００ｎＭ以上である。好ましい実施形態では、細胞におけるＳＴＡＴ３の発現を妨害することができるペプチド－ポリヌクレオチド複合体を含む薬学的組成物のＩＣ_５０は、約４０、４５、５０、５５、または７０ｎＭである。

【0159】

ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、血管新生を防止することができる。血管新生を測定する方法は、当該技術分野において既知であり、実施例に記載される通りであってよく、マトリゲル管形成アッセイ及びトランスウェル細胞遊走アッセイを含み得る。ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、マトリゲル管形成を、約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または約９５％以上減少させることができる。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、マトリゲル管形成を、約３０、３５、４０、４５、または約５０％減少させる。他の実施形態では、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、マトリゲル管形成を、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または約９５％以上減少させる。好ましい実施形態では、ＳＴＡＴ３をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、マトリゲル管形成を、約５０、５５、６０、６５、または約７０％減少させる。

【0160】

（ｄ）ＪＮＫ２調節不全に関連する状態の治療
他の実施形態では、本発明は、対象におけるＪＮＫ２調節不全に関連する状態を治療するために、本発明のペプチド－ポリヌクレオチド複合体を対象に投与する方法を包含する。例示的な実施形態では、本発明は、対象においてＪＮＫ２をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、対象におけるＪＮＫ２調節不全に関連する状態を治療するように使用される。例えば、本発明の方法は、ＪＮＫ２をコードする核酸配列の発現を妨害することにより、粥状動脈硬化を治療するように使用され得る。いくつかの好ましい実施形態では、粥状動脈硬化は、泡沫細胞形成を阻止することにより治療される。泡沫細胞形成は、粥状動脈硬化巣の特徴であり、特定の病巣に蓄積し、よって、壊死性の粥状動脈硬化の中心が作られるときに問題となり得る。例示的な実施形態では、複合体のポリヌクレオチドが抗ＪＮＫ２ ｓｉＲＮＡであるペプチド－ポリヌクレオチド複合体が、泡沫細胞形成を阻止するために使用される。

【0161】

ＩＶキット
本発明の別の態様は、キットを包含する。本キットは、本発明のペプチドを含む第１の組成物と、任意に、ポリヌクレオチドを含む第２の組成物とを含む。あるいは、対象のポリヌクレオチドは、キットのユーザによって提供され得る。キットに提供される指示に従い、キットのユーザは、本発明のペプチドを含む組成物と、ポリヌクレオチドを含む組成物とを混合して、ペプチド－ポリヌクレオチド複合体を形成することができる。キットの指示には、好適な割合でペプチドとポリヌクレオチドとを混合するための説明書を含み得る。好適な比率は、セクションＩに上述される。キットは、好適な緩衝液、水、架橋試薬、またはアルブミンも含み得る。

【0162】

定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指すように、同義に使用される。本用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学摸倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用され、これらは、修飾された残基、及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーを含む。

【0163】

２つ以上のペプチドに対する、用語「相同」、「同一」、またはパーセント「同一」は、以下に説明されるデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動整合及び視覚検査により（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照）測定される、同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基を有する（すなわち、比較枠または指定された領域にわたる最大一致と比較し、整合される場合、特定の領域にわたって約６０％同一、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）２つ以上の配列またはサブ配列を指す。本定義は、欠失及び／または付加を有する配列、ならびに置換を有するもの、ならびに天然に存在する、例えば、多型または対立遺伝子変異体、及び人工変異体も含む。以下に記載される、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等も考慮し得る。

【0164】

用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋」は、その本来の状態に見られる、通常それに付随する成分を実質的に、または本質的に含まない材料を指す。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高処理液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して決定される。調製物に存在する優勢種であるタンパク質または核酸は、実質的に精製される。いくつかの実施形態では、用語「精製される」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを意味する。好ましくは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。他の実施形態では、「純粋」または「精製」は、精製される組成物から少なくとも１つの混入物を除去することを意味する。この場合、精製は、精製される化合物が同種、例えば１００％純粋であることを必要としない。

【実施例】

【0165】

以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本開示の実践において良好に機能するように発明者によって見出された技法を表し、よって、その実践に好ましい様式を構成すると考えられ得ることを、当業者であれば理解するであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、なおも同様または類似の結果を得ることができることを理解するであろう。

【0166】

実施例１～８の導入
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、癌及び粥状動脈硬化を含む数多くの疾患の高度に有効な療法として提案されてきた。しかしながら、２０年近くにわたる集中的な研究にもかかわらず、ｓｉＲＮＡ治療薬は、臨床用途への移行において限定的な成功を示してきた。ｓｉＲＮＡに基づく治療の成功を妨げる主な障害は、細胞取り込みの不良及び血清中の遊離ｓｉＲＮＡの不安定性を含む。その大きな分子量（約１４ｋＤａ）及び高い表面電荷が、ｓｉＲＮＡが活性である細胞質コンパートメントに達するためにｓｉＲＮＡが細胞膜を通過するのを妨げるため、ＲＮＡｉの良好な誘発を阻止する。これらの特質は、わずか約１０分の血清半減期と合わせて、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション剤へのパッケージングを必要とする。これらの薬剤は、血清エンドヌクレアーゼからｓｉＲＮＡを保護し、飲食作用を通してｓｉＲＮＡの取り込みを促進することができる。残念ながら、これらの飲食作用経路は、ｓｉＲＮＡが強くなる酸性環境によって分解されるエンドソーム／リソソームコンパートメントに閉じ込められたままであることを回避しなければならないとき、別の障害を提示する。

【0167】

これらの課題にも関わらず、カチオン性脂質及びポリマーは、ｓｉＲＮＡトランスフェクションに首尾よく採用されてきた。残念ながら、これらの種類のトランスフェクション剤は、許容できない細胞毒性を呈する可能性がある。細胞内の膜二重層へのカチオン性脂質の組み込みは、細胞質内へのｓｉＲＮＡ放出を促進するが、同時に、高分子量ポリエチレンイミンカチオン性ポリマーによって共有される副作用である反応性酸素種（ＲＯＳ）及びＣａ＋２漏出を発生させる。細胞毒性を減少させるためのこれらのｓｉＲＮＡ担体の継続的な開発にも関わらず、これらの薬剤は、血清タンパク質との凝集及び補体活性化により、全身的にインビボで投与される場合、困難に直面してきた。全身的なｓｉＲＮＡ送達の問題を解決するには、新しいクラスのｓｉＲＮＡトランスフェクション剤の開発か必要である。

【0168】

細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に基づくｓｉＲＮＡトランスフェクション剤は、細胞毒性の減少に関して期待されてきた。ＣＰＰに基づくｓｉＲＮＡトランスフェクションは細胞毒性がほぼないように思われるが、ペプチドに基づくトランスフェクション剤は、従来の脂質トランスフェクション剤の高効率を達成していない。ペプチドに基づくトランスフェクションがリソソーム捕捉により制限されることを示唆する見解がＶｅｌｄｈｏｅｎら（２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：６５６１－７３）の研究により提供されている。ＣＰＰがエネルギー依存様式でｓｉＲＮＡの取り込みを媒介することを示唆する初期の研究にも関わらず、ＣＰＰ及びｓｉＲＮＡのアセンブリにより生成されたナノ粒子は、形質膜陥入され、細胞基質コンパートメントにアクセスするために、エンドソーム－リソソーム経路を回避しなければならないようである。この障害を考慮して、既存のＣＰＰ技術は、ＣＰＰの膜活性脂質またはエンドソーム溶解剤への化学的抱合を通して新しいレベルの高度化を達成したが、これらは尚もさらなるペプチド処理及び精製を必要とする。

【0169】

以下に提示される実施例は、ミツバチ毒の細孔形成成分である、細胞溶解性ペプチドであるメリチンの修飾に基づく効率的なペプチド系ｓｉＲＮＡトランスフェクションの代替え戦略を提案する。膜二重層における細孔を形成するメリチンの能力は、エンドソーム流出を改善し、それによって、改善されたＲＮＡｉの細胞基質コンパートメント内へのより効率的なｓｉＲＮＡ送達のための段階を設定し、従来のＣＰＰに基づく戦略に関連する低効率を克服することができる単純ペプチドの開発の基礎として機能することができることを示唆する。発明者により行われた以前の研究は、メリチンが膜二重層と相互作用するためのその傾向を維持しながら、その細胞毒性を減弱するように修飾され得ることを示した。本実施例に示されるように、ペプチド／ｓｉＲＮＡ相互作用を強化するための修飾と共にこれらの変更を組み込むことにより、メリチン由来ペプチドは、それらの固有の膜活性性質により、細胞質コンパートメントにｓｉＲＮＡを安全に送達することができる。

【0170】

実施例１．ｓｉＲＮＡノックダウンのスクリーニング
ＧＦＰ－ＰＥＳＴを安定して発現するＢ１６細胞のノックダウンは、ＰＥＳＴ配列がＧＦＰ半減期を２６から１０時間に短縮するため、ＧＦＰ発現の効率的なｓｉＲＮＡノックダウンに迅速なスクリーニングを可能にする。次いで、メリチン誘導体は、細胞毒性を減少させ、同時にオリゴヌクレオチドとの相互作用を改善するように設計された修飾に基づき選択された。これらのペプチドは、Ｂ１６ ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰのノックダウンのためにＧＦＰ ｓｉＲＮＡを送達するそれらの能力に関してスクリーニングされた（表１、図１）。ｐ５ＲＨＨは、特に効率的なｓｉＲＮＡトランスフェクションを呈し、製剤のさらなる特徴付け及び最適化のために選択された。

【表2】

【0171】

トランスフェクションに最適なｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比を決定するためにフローサイトメトリーが実施され、トランスフェクション効率は、ｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比が１５０：１の最大までｐ５ＲＨＨ含量の増加と共に改善された（図１Ａ）。対照的に、スクランブルされたｓｉＲＮＡは同じ条件下でＧＦＰ発現レベルに対して作用はなかった。最大２００：１の比率までペプチドに関連する細胞毒性の兆候はなかったが（図１Ｂ）、ｐ５ＲＨＨへの曝露を最小にするために、残りの実験に関しては１００：１のｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比が選択された。

【0172】

実施例２．ナノ粒子形成及び特徴付け
メリチン誘導体ｐ５ＲＨＨの全体的な正味正電荷に基づき、負に荷電されたｓｉＲＮＡと静電気的に相互作用するであろうと予想された。これらの相互作用は、遊離の未結合ｓｉＲＮＡのみが電場の存在下でポリアクリルアミドゲルに移動できるゲル遅延度アッセイを使用して、様々なペプチド：ｓｉＲＮＡ比で監視された。これらのアッセイにおいて、ゲル上に装填する前に、４０分間、一定量のｓｉＲＮＡを、ＰＢＳ中の増加量のｐ５ＲＨＨと混合した（図２Ａ）。少なくとも５０：１のペプチド：ｓｉＲＮＡ比がｓｉＲＮＡを完全に圧縮するために必要であることは明らかであり、これは、５０：１を下回るｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比のＦＡＣＳによって指摘された、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの欠如を確認した（図１Ａ）。

【0173】

動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位測定（表２）は、粒径が有効表面電荷に密接に関係があることを明らかにした。０ｍＶに近い表面電荷を保有する粒子は、最も大きい直径を呈する一方、ゼータ電位の規模が大きい粒子は、小さい直径を有する。１９０ｎｍの最も小さい粒径は、１００：１のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比またはおよそ１２：１（＋／－）の電荷比で生成されることが分かった。ｐ５ＲＨＨ：ｓｉＲＮＡ比を２００：１に増加しても（＋／－比を２４：１に倍増させる）ゼータ電位は増加しないが、粒径の増加は生じることに留意することが重要である。この現象は、他のペプチドトランスフェクション剤で以前に報告されたが、原因はまだ確立されていない。凍結割断ＳＥＭ（図２Ｂ）は、全体的な直径がほぼ１５０ｎｍの明確なナノ粒子の存在を示す。興味深いことに、これらの粒子は、合体して安定したより大きな直径の粒子を形成する、より小さな１０～２０ｎｍの粒子の凝集体からなるように思われる。大きさが原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって評価される場合、７２時間後の粒径は、＜１００ｎｍ、典型的には、およそ５０～１００ｎｍである。全体として、粒径がＤＬＳにより評価される場合、粒径は、凝集体が分析結果（ａｎｓｗｅｒ）に含まれるため、より大きいように思われる場合がある。ＳＥＭまたはＡＦＭによってより正確に測定される活性粒子の大きさは、およそ５０～１００ｎｍである。

【表3】

【0174】

実施例３．ＬＦ２０００との比較
フローサイトメトリーを使用した用量応答分析は、ｐ５ＲＨＨをトランスフェクトされたＧＦＰ ｓｉＲＮＡによるＧＦＰノックダウンが高度に効率的であり、５ｎＭの低い濃度で、約１５％の細胞においてＧＦＰ発現を減少させる能力を有することを明らかにした（図３Ａ）。スクランブルされたｓｉＲＮＡは、同じ条件下でトランスフェクトされた際、ＧＦＰタンパク質に対して作用がなかった（図３Ｃ、Ｄ）。しかしながら、リポフェクタミン２０００との比較では、ｐ５ＲＨＨは、ｓｉＲＮＡのトランスフェクトにおいてあまり効率的ではなく、報告された１０ｎＭのリポフェクタミン２０００のＩＣ_５０と比較して、ＲＴ－ＰＣＲに基づき５０ｎＭのＩＣ_５０を有する（図３Ｅ、Ｆ）。加えて、フローサイトメトリーにより指摘されるように、ｐ５ＲＨＨが低濃度でｓｉＲＮＡをトランスフェクトする能力は、ウエスタンブロットまたはＲＴ－ＰＣＲでは明らかではなく、ＦＡＣＳによるノックダウンを示す低パーセンテージ（約１５％）の細胞による可能性がある。しかしながら、ｐ５ＲＨＨがリポフェクタミン２０００に対して細胞毒性プロファイルを劇的に改善することは容易に明らかであり、これは、試験された最高濃度においてさえも、細胞生存率における最小限の減少（約３％）から明らかである（図３Ｂ）。

【0175】

実施例４．細胞質内への効率的なｓｉＲＮＡ放出
共焦点顕微鏡によりｓｉＲＮＡトランスフェクションに不活性であることが知られているメリチン誘導体（ｐ５ＲＷＲ：ＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱＲＷＲＲＲＲ（配列番号８３）、表１、図１）の分析は、ｐ５ＲＷＲでパッケージングされたオリゴヌクレオチドが、エンドソーム溶解剤として知られる５０μＭのクロロキンの存在下での共インキュベーションなしでは細胞質に達しないことを明らかにする（図４Ｂ、Ｃ）。ＧＦＰノックダウンのＦＡＣＳ分析は、ｐ５ＲＷＲでトランスフェクトされたｓｉＲＮＡがクロロキンの補助なしでＧＦＰノックダウンを開始することができないことを確認する（図４Ａ）。これらのデータは、ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡナノ粒子がエンドソームコンパートメント内に捕捉されたままであり、ＲＮＡｉを開始できないことを示唆する。比較すると、トランスフェクション２４時間後に分析された際、ｐ５ＲＨＨのみが細胞質内にオリゴヌクレオチドを送達することができ（図４Ｄ、Ｅ）、ｐ５ＲＨＨが固有のエンドソーム溶解能を保有することを示唆する。

【0176】

実施例５．癌成長を遅らせるためのｓｉＲＮＡ送達
シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）は、多種多様なヒト悪性病変に重要な役割を果たすと考えられる、よく知られた癌遺伝子である。ｐ５ＲＨＨが構成的に活性化された癌遺伝子を下方調節する能力を試験するために、ＳＴＡＴ３依存として知られるＢ１６－Ｆ１０細胞におけるＳＴＡＴ３発現を標的とした。ＳＴＡＴ３特異的ｓｉＲＮＡの送達は、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの分解をもたらし、続いて、ＳＴＡＴ３タンパク質発現における減少をもたらした（ｐ５ＲＨＨ ＩＣ_５０：約５０ｎＭ、リポフェクタミン２０００ ＩＣ_５０：約１０ｎＭ）（図５Ａ～Ｄ、図６）。ｐ５ＲＨＨ媒介ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡトランスフェクションは、アラマーブルーアッセイにより決定されるように、トランスフェクション７２時間後にＢ１６－Ｆ１０生存率（２００ｎＭで６０％）の減少をもたらした（図５Ｅ）。重要なことは、スクランブルされたｓｉＲＮＡは、Ｂ１６生存率に対して作用を示さず、ＳＴＡＴ３特異的またはスクランブルされたｓｉＲＮＡのいずれかを送達された際に細胞生存率において同等の減少をもたらした（２００ｎＭで最大６０％）リポフェクタミン２０００と比較して（図５Ｆ）、ｐ５ＲＨＨの安全性を示す。

【0177】

実施例６．血管新生を防止するためのｓｉＲＮＡ送達
病理学的血管新生は、癌、粥状動脈硬化、及び炎症を含む多くの疾患状態の特徴である。ＳＴＡＴ３は、血管新生中の内皮細胞の遊走及び成熟において主要な媒介物であることが前に示された。したがって、ｐ５ＲＨＨが血管新生の遮断のためにＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡをＨＵＶＥＣ細胞に送達する能力は、マトリゲル管形成アッセイ及びトランスウェル細胞遊走アッセイの使用により説明された。ｐ５ＲＨＨ／ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡナノ粒子をトランスフェクトされたＨＵＶＥＣは、ＨＵＶＥＣ生存率において任意の付随する減少を伴わずに（図７Ｃ）、約５０ｎＭのＩＣ５０（図７Ａ、Ｂ、図８）で、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいて減少を呈した。Ｂ１６－Ｆ１０細胞のトランスフェクションと同様に、リポフェクタミン２０００媒介トランスフェクションは、ＩＣ_５０が約１０ｎＭであったが、強い細胞毒性を呈し、２５ｎＭの低いｓｉＲＮＡ用量で細胞生存率は４０％減少した（図９）。

【0178】

ｐ５ＲＨＨ媒介ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡトランスフェクションは細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、ＨＵＶＥＣを処置するために使用されたｐ５ＲＨＨ／ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ＨＵＶＥＣの処置のためのスクランブルされたｓｉＲＮＡと比較して、管形成において約６０％の減少を示した（図７Ｄ～Ｆ）。加えて、ｐ５ＲＨＨでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの遊走は、アラマーブルー（図７Ｉ）及び蛍光顕微鏡（図７Ｈ、図１０）により定量化されるように、５０％減少した。これらのデータは、高効率で、ｐ５ＲＨＨが病理学的血管新生を防止するために一次ヒト内皮細胞を安全にトランスフェクトすることができることを示す。

【0179】

実施例７．泡沫細胞形成を減少させるためのｓｉＲＮＡ送達
粥状動脈硬化巣を特徴付ける妨害された内皮細胞関門は、粥状動脈硬化を、ナノ粒子に基づく療法の主な標的とする。粥状動脈硬化巣の特徴である泡沫細胞形成をｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子で阻止することができることを確実にするために、ＪＮＫ２ ｓｉＲＮＡがＲＡＷ２６４．７（マウス単球／マクロファージ細胞系）に送達された。ＪＮＫ２は、既知の泡沫細胞形成の媒介物であり、スカベンジャー受容体ＡによるＡｃ－ＬＤＬならびにＣＤ３６によるｏｘＬＤＬの両方の取り込みにおいて関係付けられてきた。ｐ５ＲＨＨは、細胞毒性なくＪＮＫ２ ｓｉＲＮＡをＲＡＷ２６４．７細胞に送達することができ（図１１Ａ、Ｂ）、２５ｎＭの低い濃度でＪＮＫ２タンパク質レベルにおける強力な減少をもたらす。比較すると、リポフェクタミン２０００は、ウエスタンブロットにより決定されるように、類似するＩＣ_５０を有するが、広範囲に及ぶ細胞毒性を呈する（図１２）。減少したＪＮＫ２タンパク質レベルは、オイルレッドＯ染色後、光顕微鏡により決定されるように、５０μｇ／ｍｌのＡｃ－ＬＤＬの存在下で１２時間インキュベートされたＲＡＷ２６４．７細胞において泡沫細胞形成を抑制した（図１１Ｃ～Ｅ）。これらの画像は、未処置対照及びスクランブルされたｓｉＲＮＡ処置細胞おいて広範囲に及ぶ脂質滴蓄積を示すが、ＪＮＫ２特異的ｓｉＲＮＡで処置されたＲＡＷ２６４．７細胞において脂質滴蓄積はなかった。

【0180】

実施例８．血清の存在下のｐ５ＲＨＨの性能
実験に使用された粒子が血清の存在下で安定していることを確実にするために、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を、１２時間または一晩、１５０μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中でインキュベートした。動的光散乱は、新しく調製した粒子と比較した際、大きさが変化しなかったことを明らかにする（表３）。さらに、ＨＳＡと共にインキュベートされたナノ粒子のゼータ電位は、正が低くなり、これは、ナノ粒子を負で荷電されたアルブミンで被覆したことによる可能性がある。これらの粒子の活性が試験された際、ＧＦＰ発現をノックダウンするそれらの能力は、新しいナノ粒子と比較して、偶然にも強化された（図１３Ａ、Ｂ）。これらの実験は、ある特定の条件下で経時的にさらにより強力なトランスフェクション剤へとそれらを成熟させる、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の血清安定性を示し、これは、インビボ環境への適用性の可能性を示唆する。

【表4】

【0181】

実施例１～８の考察
出願者は、新規ペルフルオロカーボンナノエマルジョン製剤におけるカチオン性脂質に基づく高度に効率的なｓｉＲＮＡ送達を前に調査した。高効率のトランスフェクションがインビトロで達成されたにも関わらず、高ナノ粒子濃度でのトランスフェクションの問題は、従来のカチオン性脂質トランスフェクション剤に付随する課題を示した。本発明の実施例では、メリチンの膜挿入及び細孔形成能が以前に報告されたＣＰＰに基づくｓｉＲＮＡトランスフェクション剤の主な欠点であるエンドソーム流出の新規手段を提供するだろうという仮説に基づき、高効率のｓｉＲＮＡトランスフェクション剤を実現するために、メリチンペプチドが修飾された。

【0182】

実際、本明細書に提示される実験は、ｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡの細胞質内への放出を容易にすることができることを示す。不活性メリチン誘導体（ｐ５ＲＷＲ）の分析は、従来のＣＰＰに基づくｓｉＲＮＡ送達と同様に、ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡ粒子がエンドソーム内に取り込まれ、細胞質にアクセスするためにエンドソーム溶解剤を必要とすることを示唆する。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、細胞膜と会合するナノ粒子、及び後続の飲食作用に重要な役割を果たすことが示された特徴である、ゼータ電位測定によって決定される正の表面電荷を有する。表面電荷の類似性に基づき、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、不活性ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡ複合体と同様に、同じ飲食作用機構を介して処理される可能性があり、これは、ｐ５ＲＨＨが効率的な様式でエンドソーム／リソソーム経路からのｓｉＲＮＡの放出を促進する可能性があることを示唆する。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の内部移行に関与する正確な取り込み経路を決定する必要があるが、不活性ｐ５ＲＷＲ複合体の分析は、細胞によるｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子処理の潜在的な機構の見解を提供する。

【0183】

効率的なエンドソーム流出に関与する正確な性質はまだ明らかにされていないが、オリゴヌクレオチドトランスフェクションに使用されるヒスチジル化ペプチドに対する研究は、ｐ５ＲＨＨの機能に関してある洞察を提供する。ヒスチジル化ペプチド及びポリマーは、本来、リソソーム酸性化（ｐＨ約４．５）中のヒスチジンのイミダゾール基（ｐＫａ約６．０）のプロトン化に基づくプラスミド放出を補助するために設計された。これらのポリマーは、プロトンスポンジ効果を介してエンドソーム溶解を駆動するために高ヒスチジン含量（８０～９０％のヒスチジン）を組み込む。ｐ５ＲＨＨは、２つのヒスチジン残基のみを保有し、よってエンドソームを溶解するために十分なプロトンを緩衝することができない可能性がある。しかしながら、ヒスチジン残基のプロトン化は、５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の解体及びｐ５ＲＨＨの放出を促進して、ｓｉＲＮＡ放出のためにエンドソーム膜を透過処理する可能性がある。低ｐＨでのｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡの解体及び溶解能の詳細な研究は、現在進行中である。

【0184】

ｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡを細胞質に送達する能力は、５ｎＭの低い濃度でＧＦＰ発現の定量可能な減少をもたらす。しかしながら、ｐ５ＲＨＨは、それでもＢ１６－Ｆ１０細胞またはＨＵＶＥＣにおいてリポフェクタミン２０００により提供されるトランスフェクション効率のレベルを達成することができない。ｐ５ＲＨＨは、ＲＡＷ２６４．７細胞をトランスフェクトされた場合、改善された効率を呈するように思われ、ＩＣ_５０は、リポフェクタミン２０００とほぼ等しい。予想通り、異なる細胞型は、異なる飲食作用機構を好み、これは異なる細胞型におけるトランスフェクション効率間の相違を説明し得る。それにも関わらず、ｐ５ＲＨＨは、細胞毒性に関して従来のカチオン性脂質に基づくトランスフェクションに対して実質的な改善を呈し、全ての試験された濃度での様々なマウス及びヒト細胞系に対する細胞生存率において最小限の減少を呈する。さらに、ｐ５ＲＨＨ媒介トランスフェクションの効率は、粒子が血清安定性について試験するために使用される血清アルブミンと共に最初にインキュベートされる場合、増加したトランスフェクション効率が観察されることにより示唆されるように、さらに最適化され得るように思われる。ゼータ電位測定は、アルブミンがｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を被覆することを示唆するが、これがどのようトランスフェクションを強化するかは明らかではない。既存の研究は、アルブミンが低ｐＨで脂質二重層の融合を補助することができ、この活性がエンドソーム流出において役割を果たす可能性があることを示してきた。観察されたｓｉＲＮＡトランスフェクション効率における改善は、ｐ５ＲＨＨ媒介トランスフェクションの効率を最大にするための改善された製剤方法に関して興味深い手段を確立するはずである。

【0185】

ｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡを、癌細胞、内皮細胞、及びさらにはマクロファージにトランスフェクトする能力は、トランスフェクション活性の広域スペクトルを指し示し、同時に好ましい細胞毒性特徴を維持する。ナノ粒子（約１９０ｎｍ）の大きさを考慮すると、無償内皮細胞関門を通した血管漏出を必要としない疾患プロセスが標的とされる。癌、血管新生、及び粥状動脈硬化は、ナノ粒子の周囲組織内への強化された漏出を伴う不連続内皮細胞関門を特徴とする。癌において、この作用は、「血管透過性及び滞留亢進製」として広く知られており、類似する作用は重度の粥状動脈硬化の状態に関して前に報告されている。さらに、本実施例におけるナノ粒子の大きさは、腎臓濾過ならびに網内系による取り込みの両方を避けることにより、好ましい薬物動態及び血清半減期をもたらすはずである。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、トランスフェクション前にヒト血清アルブミンの存在下で２４時間インキュベートされる場合、大きさの安定性を呈し、かつｓｉＲＮＡトランスフェクション能も維持し、この問題は、一部のＣＰＰトランスフェクション剤の活性を減少することが認められている。詳細なｓｉＲＮＡ保護及び長期安定性の分析が行われる必要があるが、これらのデータは、インビボ環境においてトランスフェクションに利用される場合、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子が治療的利益を提供する可能性があることを示唆する。

【0186】

そのため、新規メリチン誘導体ｐ５ＲＨＨは、静電気的にｓｉＲＮＡと相互作用し、後のｍＲＮＡの配列特異的分解及び様々な細胞型における減少したタンパク質発現を伴う細胞質内への効率的な送達を示す安定したナノ粒子を形成する能力を呈する。我々の研究は、いずれの細胞毒性の兆候を明らかにしなかったが、臨床環境におけるｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の利用可能性を示唆する。血清タンパク質の存在下でのこれらの粒子の安定性は、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子がインビボでｓｉＲＮＡを血管内標的または内皮細胞関門不全を特徴とする患部組織に送達するための良好な試験候補であろうことを示唆する。

【0187】

実施例１～４の方法
ペプチド／ｓｉＲＮＡナノアセンブリの調製及び分析
メリチン誘導体は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって製剤化され、使用前にＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ遊離水（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中１０ｍＭに溶解され、－８０℃で、４μｌのアリコートに保管された。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）中１：２００でｐ５ＲＨＨを希釈し、３０秒間ボルテックスにかけ、続いて、適切な量のｓｉＲＮＡ（１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）中１０μＭのストック濃度）を添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ中で振盪させながら、３７℃で４０分間インキュベートすることにより調製した。得られたナノ粒子を、１２％のポリアクリルアミドゲル上での分解、続いて、臭素エチジウム染色により、ｓｉＲＮＡ組み込みについて分析した。動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位測定は、ゼータ＋粒径分析計（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）で行われた。血清安定性分析は、新しく形成されたペプチド／ｓｉＲＮＡナノ粒子を１０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ）中で一晩インキュベートすることにより行われ、その後、ＤＬＳ及びゼータ電位測定が続いた。

【0188】

細胞培養
Ｂ１６Ｆ１０及びＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）細胞系を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）で補足されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中、標準的な細胞培養条件下（加湿インキュベータにおいて３７℃及び５％のＣＯ_２）で維持した。ＧＦＰを安定して発現するＢ１６Ｆ１０細胞は以下のように生成された。Ｂ１６Ｆ１０は、ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ－Ｎ１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とｐＥＦ６Ｖ５ＨｉｓＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のマウスオルニチンデカルボキシラーゼ（Ｓ４２１－Ｖ４６１）からのＰＥＳＴ配列との融合物をトランスフェクトされた（リポフェクタミン２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。細胞は、抗生物質を選択することなく、フローサイトメトリーによる細胞選別を４回行うために選択された。細胞のアリコートは、ＥＧＦＰ発現レベルが大して変化することなく、１ヶ月間、連続培地で維持された。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入し、製造者の指示に従い、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１μｇ／ｍＬのヘミコハク酸、０．７５Ｕ／ｍＬのヘパリン硫酸、１０ｍＭのＬ－グルタミン、２％のウシ胎仔血清で補足されたＶａｓｃｕＬｉｆｅ基本培地（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。全ての実験において、ＨＵＶＥＣは継代３で使用された。

【0189】

ｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクション前に、細胞を、６ウェルプレート中で１２時間平板培養し、標準的な細胞培養条件下で培養した。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製し、１ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍＩ（Ｇｉｂｃｏ）の最終容量で、または１０％のＦＢＳで補足された適切な培地中で４時間、細胞と共にインキュベートした。トランスフェクションは、細胞培養表面積に基づき、１２ウェルプレートに平板培養された細胞について適切に調整された。トランスフェクション後、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、分析する前にさらに２４～７２時間、標準的な細胞培養培地と共にインキュベートした。リポフェクタミン２０００は、製造者のプロトコルに従い使用された。簡潔に、リポフェクタミン２０００を、ＯｐｔｉｍｅｍＩ中で、８．４μｇ／ｍｌの最終の濃度に希釈し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、ｓｉＲＮＡを希釈した脂質に添加し、トランスフェクションのために、ＯｐｔｉｍｅｍＩで１ｍＬの総容量に希釈する前に、さらに４０分間インキュベートした。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（センス：５’－ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ－３’；配列番号５６）をＳｉｇｍａから購入した。ｓｉＧＥＮＯＭＥマウスＭＡＰＫ９ ｓｉＲＮＡ１、ｓｉＧＥＮＯＭＥマウスＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ２、及びｓｉＧＥＮＯＭＥヒトＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ２遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。スクランブルされたｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した。

【0190】

ウエスタンブロット
トランスフェクション２４または４８時間後、１ｍＭのＰＭＳＦ及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１００～２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＩｇｅｐａｌＣＡ－６３０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロール）を、６ウェルプレートの各ウェルに添加し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞溶解物を、４℃で５分間遠心分離し、上清を－２０℃で保管した。ＴＢＳ－Ｔ中の５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）で遮断する前に、可能化物を、Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分解し、０．２２μｍのニトロセルロースに移した。使用された一次抗体は、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１：１５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、マウス抗β－アクチン（１：１０００，Ｓｉｇｍａ）、マウス抗ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ウサギ抗ＪＮＫ２（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であった。使用された二次抗体は、抗ウサギＨＲＰ（１：５０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗マウスＨＲＰ（１：５０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。ブロットは、ＥＣＬウエスタンブロット基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して開発された。ノックダウンは、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のデンシメトリーを使用して定量化され、未処理対照に正規化された。全てのデータは、３つの独立した実験の平均として提示される。

【0191】

リアルタイムＰＣＲ
トランスフェクション２４時間後、ＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡを生成した。使用するまで、ｃＤＮＡを－２０℃で保管した。ＲＯＸを備えるｉＴａｑ ＳＹＢＲグリーン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＳＹＢＲグリーン検出を使用して、ｍＲＮＡレベルを定量化した。Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマーアッセイ（Ｑｉａｇｅｎ）は、各遺伝子に遺伝子特異的プライマーを提供した。対照の遺伝子は、種適切Ｂアクチンに正規化された。結果は、３つの独立した実験の未処理の対照に対する平均「倍率変化」として報告される。

【0192】

共焦点顕微鏡
Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ガラスカバースリップ上で培養され、標準的なトランスフェクション手順により、Ｃｙ５．５標識された抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）をトランスフェクトされた。トランスフェクション１２時間後、細胞を、ＰＢＳ中で３×洗浄し、ガラススライド上に載置する前に４％のＰＦＡ（ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に固定した。Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｔａ５１０（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）の共焦点顕微鏡により、細胞を撮像した。

【0193】

フローサイトメトリー
Ｂ１６－ＧＦＰ細胞がＧＦＰ特異的またはスクランブルされたｓｉＲＮＡを含むｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子をトランスフェクトされた２４時間後、ＧＦＰ蛍光分析のために、細胞を、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．２％のＦＢＳ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。

【0194】

細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、アラマーブルー（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、トランスフェクション７２時間後に決定された。簡潔に、アラマーブルーを、フェノールレッドを含まない培地中に１：１０で希釈し、２～４時間、細胞と共にインキュベートした。５７０ｎｍでの励起、及び５８５ｎｍでの発光による蛍光プレート読取装置（Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で蛍光を測定した。

【0195】

管形成アッセイ
マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、氷浴中４℃で一晩解凍し、その後、３７℃で１時間、２４ウェルプレート中でゲル化させた。ＳＴＡＴ３特異的または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした２４時間後、ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、３０，０００細胞／ウェルの細胞密度で、マトリゲルで平板培養した。倒立顕微鏡による視覚化前に２４時間、管形成を進行させた。管形成スコアは、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）において測定される、未処理対照に正規化された視野当りの管長の合計に基づき決定された。

【0196】

ＨＵＶＥＣ遊走アッセイ
１．０μｍ孔径（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）の１２ウェルのトランスウェルインサートの底部を、室温で１時間、０．１％のブタのゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。次いで、前もって２４時間、ＳＴＡＴ３特異的または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたＨＵＶＥＣを、トリプシン処理し、成長因子を含まない培地中に再懸濁し、３０，０００～５０，０００細胞／ウェルの密度で、先端のトランスウェルチャンバに添加した。底部のチャンバは、成長因子を含まないＶａｓｃｕＬｉｆｅ基本培地±５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含んだ。１２時間、ポリマーインサートを通して細胞を遊走させた。遊走しなかった細胞を減菌コットンスワブで先端のチャンバから除去し、アラマーブルーにより遊走した細胞数を決定した。データは、３つの独立した実験の平均正規化遊走として提示される。視覚化において、インサートを切り取り、ガラススライド上に載置した。細胞核を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１０（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＤＡＰＩ染色で視覚化し、視野当りの平均細胞数として報告した。

【0197】

泡沫細胞形成アッセイ／オイルレッドＯ染色
ＪＮＫ２特異的または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした４８時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞を、さらに２４時間、±５０ｕｇ／ｍｌのＡｃ－ＬＤＬ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を、オイルレッドＯで染色して、泡沫細胞形成を視覚化した。簡潔に、０．２２μｍフィルタを通して濾過する前に、オイルレッドＯを、一晩、純粋なメタノール（０．５ｇ／１００ｍＬ）中に溶解した。次いで、オイルレッドＯストックを、蒸留水中に３：５で希釈し、オイルレッドＯ希釈標準溶液を作製し、０．２２μｍフィルタを通して２度目の濾過を行った。細胞を、室温で１０分間、４％のＰＦＡに固定し、オイルレッドＯストック希釈標準溶液中で１５分間染色する前に、６０％のメタノールで洗浄した。染色後、ガラススライド上に載置する前に、細胞を６０％のメタノールで１回、そして、蒸留水で１回洗浄した。

【0198】

実施例９～１４の導入
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介したｍＲＮＡの転写後分解は、多くの臨床的に適切な疾患の治療において有益であることを証明し得る遺伝子発現を発現停止するための目標アプローチを提供する。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を哺乳類細胞の細胞質内に送達することにより誘発され得、その後、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ誘発発現停止複合体（ＲＩＳＣ）への組み込みが相補的ｍＲＮＡの配列特異的切断をもたらす。細胞質におけるｓｉＲＮＡの活性を考慮すると、ｓｉＲＮＡは、細胞質コンパートメントに達するために、不透過性細胞膜を迂回しなければならない。残念なことに、ｓｉＲＮＡの大きい分子量（約２１ｋＤａ）及び負の電荷により、ネイキッドｓｉＲＮＡは、細胞膜を通して自由に拡散することができず、細胞取り込み及び後続のエンドソーム流出を補助するための効果的な送達系が必要とされる。

【0199】

一般的なｓｉＲＮＡ送達系は、カチオン性脂質及びポリマーを含み、これらは効率的であるが、毒性の可能性があるため妨げられる。最近の研究は、毒性の副作用がないため、ｓｉＲＮＡトランスフェクションのための多塩基ペプチドまたはペプチド形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に重点を置いている。残念なことに、多くの研究は、過剰なエンドソーム封入の結果としてペプチドと複合される場合、高度に効率的なｓｉＲＮＡ送達を達成することに適度な成功しか報告されていない。ペプチドに基づくｓｉＲＮＡベクターの進行を妨げる主な障害としてエンドソーム封入を認識することによって、ペプチド媒介トランスフェクションを改善するためには、新しい戦略が開発されなければならないことが強調される。したがって、発明者は、正味正電荷を保有する膜妨害ペプチドが、ｓｉＲＮＡを複合し、かつエンドソームコンパートメントを妨害する両方を行うそれらの２重機能により、効率的なｓｉＲＮＡトランスフェクションの未開拓の代替えを提供することを提案する。

【0200】

残念なことに、良好なペプチド媒介トランスフェクションを可能にする機構はまだ完全に明らかにされていないため、ｓｉＲＮＡトランスフェクションにおけるメリチン誘導体の利用は、予測が困難である。例えば、ｖａｎ Ａｓｂｅｃｋら（２０１３；ＡＣＳ Ｎａｎｏ ７：３７９７－３８０７）による最近の研究は、ポリアニオン巨大分子による脱複合体化に対する感受性が、改善されたトランスフェクションの一因となるが、細胞質へのｓｉＲＮＡ送達において脱複合体化が果たす役割は確立されなかったと結論付けている。さらに、インフルエンザウイルスからのｐＨ応答膜融合性ペプチドは、以前に、ペプチド媒介トランスフェクションを増加させるために利用されてきたが、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを改善するそれらの能力は、増加したｓｉＲＮＡパッケージングまたは取り込みに寄与し得るが、エンドソーム流出には寄与しない。Ｃｐｐ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、物理化学的観点から十分に特徴付けされてきたが、エンドソーム封入及び後続のＲＮＡｉの誘発の良好な迂回に起因するペプチド／ｓｉＲＮＡナノ複合体のトランスフェクションに関与する機構はまだ解明されていない。ペプチド／ｓｉＲＮＡナノ複合体の細胞内処理及び細胞質へのｓｉＲＮＡ放出の機構に関するさらなる研究は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションのためのペプチドをさらに開発するために必要である。

【0201】

発明者は、メリチン誘導体であるｐ５ＲＨＨが全ての試験された用量で顕著な細胞毒性なく、２５ｎＭの低いＩＣ_５０でｉＲＮＡをトランスフェクトすることができることを前に報告した（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；３４：３１１０－３１１９）。本明細書の実施例では、このペプチドは、ヒトＴリンパ親和性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）誘発成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）のマウスモデルにおいて、標準及び非標準の両方のＮＦκＢシグナル伝達経路の同時ノックダウンのためのｐ６５及びｐ１００／５２ｓｉＲＮＡの送達に採用される。強化された安定性に関して、アルブミン被覆されたｐ５ＲＨＨの製剤がｐＨ起動ナノ粒子の解体に寄与する顕著なトランスフェクション効率を呈することが本明細書において示される。作用機構に関する詳細な研究は、エンドソームｐＨへの曝露がナノ粒子の解体及びエンドソーム流出の両方を起動することを明らかにする。さらに、エンドソーム妨害だけでは良好なＲＮＡｉの誘発を引き起こさないが、同時にベクターからのｓｉＲＮＡ放出を必要とすることは、非機能メリチン誘導体との比較から明らかである。

【0202】

本明細書に提示される結果は、ペプチドベクターによる細胞質内への異なるｓｉＲＮＡ送達をもたらす一般的なパラメータを提供し、これは、ｓｉＲＮＡ治療薬の非共有結合ペプチド／ｓｉＲＮＡナノ複合体の開発に役立ち得る。

【0203】

実施例９：アルブミン安定化ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の製剤化
ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を製剤化するために、ｐ５ＲＨＨ（ＤＩ Ｈ_２Ｏ中１０ｍＭのストック）を、１：２００でダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、３０秒間ボルテックスにかけ、続いて、適切な量のｓｉＲＮＡ（１×ｓｉＲＮＡ中１００μＭストック）を添加し、３７℃で４０分間インキュベートする（図１４Ａ）。ディープエッチ電子顕微鏡により追跡される粒径に基づき、４０分のインキュベーションが選択された。電子顕微鏡（図１５Ａ）は、この時間点で形成された粒子がさらなる凝集を呈さず、プラットホームにアルブミン表面被覆を介した動的安定を可能にすることを示す。特に、４０分のインキュベーションは、Ｂ１６－Ｆ１０黒色腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現のノックダウンに基づく最大トランスフェクション効率も呈する（図１５Ｂ）。

【0204】

アルブミンは、凝結を防止するために、ナノ粒子を被覆することにより強化されたナノ粒子の安定性をもたらすことが知られている。アルブミン安定化製剤は、使用前に０．５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（ＤＩ Ｈ_２Ｏ中５０ｍｇ／ｍｌのストック）の存在下で引き続き３０分間インキュベーションすることを含む。製剤化７２時間後のアルブミン安定化ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の大きさは、湿式原子間力顕微鏡により約５５ｎＭ±１８であると測定され（図１４Ｂ）、アルブミンがｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の凝結を防止することを示す。

【0205】

実施例１０．ペプチド／ｓｉＲＮＡナノ粒子の細胞侵入のメカニズム
ペプチド／ｓｉＲＮＡナノ粒子の細胞侵入を囲む不確定要素を考慮して、ｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡの細胞質送達を達成する機構の見解を提供するために、取り込みアッセイが行われた。ｐ５ＲＨＨでパッケージングされたＡｌｅｘａ４８８標識された、スクランブルされたｓｉＲＮＡの取り込みを示すフローサイトメトリーは、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子取り込みにおける選択された飲食作用経路の役割を決定するための簡便な実験ツールを提供する。４℃での細胞のインキュベーションはｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みのほぼ完全な阻害をもたらすため、ｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡの細胞質放出に直接的な膜移行を媒介するという仮説は却下される（図１６）。代わりに、飲食作用阻害剤の存在下におけるｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みの研究は、マクロ飲作用がｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みに関与する主な経路であることを示す（図１７Ａ～Ｄ）。マクロ飲作用阻害剤ＥＩＰＡは、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みを劇的に減少させる一方、小窩阻害剤、フィリピン、及びクラスリン媒介飲食作用（ＣＭＥ）阻害剤ＰＡＯは、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みに対して作用がない。

【0206】

取り込み機構を評価するためのエンドソーム阻害剤の使用は、非特異的であり、細胞型依存でもあることが示された。そのため、取り込み阻害アッセイは、標準的なエンドソームマーカートランスフェリン（ＣＭＥ）及び７０ｋＤａデキストランの阻害により示される（マクロ飲作用）、予測される経路に特異的であることが決定された阻害剤濃度で（図１８）、４０分間のみ行われた。Ｂ１６細胞は、カベオリン－１を発現しないことが知られており、予想通り、カベオリンマーカーコレラ毒素Ｂの取り込みはこの細胞型において測定可能ではなかった（未公開の観察）。

【0207】

共焦点顕微鏡は、ｐ５ＲＨＨ／Ｃｙ３－ｓｉＲＮＡのＦＩＴＣ－７０ｋＤａデキストランとの強い共局在を示すが（図１７Ｊ）、ＦＩＴＣトランスフェリンとは共局在しない（図１７Ｉ）ことを示すフローサイトメトリーのデータを確認する。さもなければ分析を交絡させる可能性がある細胞質または核蛍光をもたらす場合があるＣｙ－３標識されたｓｉＲＮＡの細胞質内への放出を最小限にするために、細胞は取り込みマーカーと共に４０分間のみインキュベートされ、よって、細胞質放出を呈する細胞は、これらの問題を避けるために撮像されない。興味深いことに、Ｃｙ－３標識されたｓｉＲＮＡの迅速な（＜１時間の取り込み及び放出）は、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡなの粒子により誘発された迅速なエンドソーム放出を確認する（図１９）。

【0208】

これらの結果は、塩基残基を含む多くの正に荷電されたペプチドの細胞取り込みを調節する一般的な規則に従う。具体的に、アルギニン残基は、細胞表面プロテオグリカンと２座のイオン相互作用を形成することができ、これは、原形質膜との密接な会合をもたらす。さらに、これらの非特異的結合相互作用は、マクロ飲作用による流体相取り込みに必要とされるアクチン再配列を刺激することができる。正に荷電されたペプチドの強力な取り込みは、原形質膜との静電気会合及び後続の流体相取り込みが実質的なペプチド／ｓｉＲＮＡ取り込みを達成するのに十分であることを示す。

【0209】

実施例１１．飲食作用後のｓｉＲＮＡ輸送
初期の飲食作用事象後の適切なｓｉＲＮＡ輸送も、良好なｓｉＲＮＡトランスフェクションに極めて重要である。特に、エンドソーム及びリソソームのｐＨは、膜結合液胞型ＡＴＰａｓｅｓを介した酸性化により厳密に制御され、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子から環境感受性ｓｉＲＮＡを放出する誘因を提供し得る。これらの液胞型ＡＴＰａｓｅｓによりもたらされる低ｐＨがエンドソームからのｓｉＲＮＡ放出に関与するかを決定するために、細胞を、トランスフェクション中、バフィロマイシンＡ１の存在下でインキュベートした。バフィロマイシンＡ１なしでトランスフェクトされた対照細胞と比較して（図２０Ｅ）、バフィロマイシンＡ１処理された細胞（図２０Ｆ）、は、フローサイトメトリーにより決定される、ＧＦＰノックダウンのほぼ完全な損失をもたらす。バフィロマイシンＡ１はｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みを遅らせることができるため、Ｂ１６細胞における蛍光標識されたｓｉＲＮＡの取り込みのフローサイトメトリーの評価は、これらのアッセイにおいて使用されたバフィロマイシンＡ１の濃度がｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ取り込みを損なわなかったことを確実にするために利用された（図２０Ａ～Ｃ）。これらのデータは、ｐ５ＲＨＨを介して細胞に送達される際の、ｓｉＲＮＡの細胞質放出におけるエンドソーム酸性化の重要性を確認する。

【0210】

実施例１２：酸性ｐＨでのナノ粒子の一体性
エンドソームの酸性化はｐ５ＲＨＨがｓｉＲＮＡを細胞質に送達する能力に重要であるため、次第に増加する酸性環境がナノ粒子の一体性にどのように影響を及ぼすかを解明するために、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を低ｐＨでインキュベートした。核酸染色ＴＯＰＲＯ３を使用する色素結合アッセイは、増加したＴＯＰＲＯ３蛍光強度により表されるように、ｓｉＲＮＡがｐＨ≦５．５で次第にアクセス可能になることを明らかにした（図２１Ａ）。増加した色素のアクセス容易性が増加したｓｉＲＮＡ放出と相関したか否かを決定するために、追加の試料を２０％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、遊離ｓｉＲＮＡを分解した（図２１Ｂ）。これらのデータに基づき、ｓｉＲＮＡは、４．５のｐＨが達成されるまで自由にゲル内に遊走しないようである。まとめると、これらのアッセイは、粒子の解体及びｓｉＲＮＡ放出のｐＨ依存機構を示唆し、粒子の解体を開始するのに必要とされるｐＨ（ｐＨ５．５）より低いｐＨ（４．５）が、ｓｉＲＮＡが完全に放出されるために必要である。ｐ５ＲＨＨとは対照的に、ｐ５ＲＷＲは、ｐＨ≦５．５でのＴＯＰＲＯ３蛍光の欠如（図２１Ａ）、及びゲル移動により測定されるｓｉＲＮＡ放出の欠如（図２１Ｂ）により示されるように、ｐＨに応答することができない。

【0211】

粒子の解体を実証するために、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子からのｐＨ依存ｐ５ＲＨ放出は、１０Ｋの透析膜を通した透析後に定量化された。これらのアッセイは、粒子アセンブリ後、約４０％のｐ５ＲＨＨが遊離のままであり、強いｐ５ＲＨＨの放出がｐＨ≦５．５で生じた（図２１Ｃ）ことを明らかにする。このｐＨ依存は、ｓｉＲＮＡ色素結合に見られたｐＨ依存と一致し、ｐＨが実際にナノ粒子の解体ならびに後続のｐ５ＲＨＨ及びｓｉＲＮＡ両方の放出を起動することを確認する。

【0212】

解放されたｐ５ＲＨＨの溶解能は、赤血球（ＲＢＣ）溶血アッセイによりインビトロで定量化することができる。減少するｐＨでインキュベートされた場合、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子がＲＢＣを溶解する能力は、ｐＨ≦５．５での遊離ｐ５ＲＨＨの放出により強化される（図２１Ｄ）。これらのアッセイは、高温で観察される自己溶血の速度を減少させるために、４℃で行われた。ＲＢＣ溶血は、遊離ｐ５ＲＨＨが膜結合構造を溶解することができ、無償細胞においてエンドソーム膜を潜在的に妨害することができることを示す（図２２）。

【0213】

生存細胞におけるエンドソームの妨害がアクリジンオレンジ染色により観察された。最初に、細胞を、エンドソームにおいて低ｐＨで赤を発光し、細胞質ｐＨで緑を発光するアクリジンオレンジ（１０μＭ、１５分）で充填した。エンドソームの妨害は、１００μＭのクロロキンの存在下で、細胞質の緑色蛍光の増加によって視覚化され得る（図２１Ｆ）。同様に、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞も細胞質エンドソーム小胞からアクリジンオレンジを放出し、効率的なエンドソーム妨害を確認し、一方、ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡナノ粒子をトランスフェクトされた細胞は、エンドソーム妨害を呈さなかった（図２１Ｈ、Ｇ）。これらの結果は、ナノ粒子の解体、及び細胞状況におけるエンドソーム妨害についてインビトロで測定された膜活性ペプチドの放出の重要性を強調する（図２１Ｉ～Ｋ）。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｐＨ応答性であり、エンドソーム妨害においてｐ５ＲＨＨを放出するが、ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、解体されず、エンドソームの一体性を変更しない。

【0214】

ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子のｐＨ応答性質の潜在的な機構の１つは、ヒスチジン残基のプロトン化であるように思われる。増加したｓｉＲＮＡ色素結合及びｐ５ＲＨＨ放出がヒスチジンのｐＨ＜ｐＫａで記録されるため、６のｐＫａで、ヒスチジンは、粒子の解体に重要な誘因を提供する可能性がある。従来、ヒスチジンのプロトン化は、多くの場合、ヒスチジン含有ポリマーの緩衝能がＣｌ^－対イオンの蓄積、及び最終的にエンドソームの浸透圧破裂をもたらすプロトンスポンジ効果の文脈において、ｓｉＲＮＡ送達の誘因として使用されてきた。浸透圧破裂に関してエンドソーム緩衝に依存する方法と比較して、本発明のペプチドにおける２つのヒスチジンのみの存在は、これらの提案されたメリチンに対する修飾がエンドソーム流出に対するプロトンスポンジ効果を達成するのに適切な緩衝能をもたらさない可能性があることを示唆する。例として、ＴＡＴは、細胞質内への良好な核酸放出ために少なくとも１０のヒスチジン残基により増大されなければならないことが示されてきた。アクリジンオレンジ放出に関して観察されたｐ５ＲＨＨによるエンドソーム溶解に対するプロトンスポンジ効果のいくらかの寄与が存在することは完全に除外できないが、わずか２つのヒスチジン残基の必要性は、ｐＨが粒子の解体及び後続の膜溶解ペプチドの放出を起動する兆候である。浸透圧破裂は、あるとすれば、副次的な役割を果たす可能性がある。

【0215】

実施例１３．ｓｉＲＮＡナノ粒子によるＢ１６ ＧＦＰ細胞におけるＧＦＰの良好なノックダウン
ｐ５ＲＨＨがＧＦＰ ｓｉＲＮＡをＢ１６－ＧＦＰ細胞に送達する能力を検査した際、５０ｎＭのｓｉＲＮＡでのＧＦＰ発現における強力な減少が、トランスフェクション２４時間後、ウエスタンブロットにより観察された。（図２３Ａ）。さらに、既知のエンドソーム溶解剤である５０μＭのクロロキンの存在下での細胞のトランスフェクションは、ノックダウンを改善しない。クロロキンによるさらなるノックダウンの欠如は、共焦点顕微鏡により視覚化される研究結果である、ｐ５ＲＨＨ自体がエンドソームコンパートメントからｓｉＲＮＡを完全かつ効率的に放出することができることを検証する（図２３Ｄ、Ｆ）。

【0216】

ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡナノ粒子のほぼ等しい取り込みにも関わらず（図２３Ｂ）、ｐ５ＲＷＲは、クロロキンの存在下でもＧＦＰノックダウンを誘発することができない（図２３Ａ）。共焦点顕微鏡は、高程度のエンドソーム封入を明らかにし、クロロキンで処理されなければ（図２３Ｅ）、ｐ５ＲＷＲ／ｓｉＲＮＡナノ粒子が細胞質に達しない（図２３Ｃ）ことを示唆する。クロロキンによるエンドソーム放出にも関わらず、ＧＦＰノックダウンが損なわれたままであるという事実は（図２３Ａ）、ＲＮＡ誘発発現停止複合体に対するｓｉＲＮＡアクセス容易性が損なわれることを示し、ＴＯＰＲＯ３結合及びインビトロでのゲル移動シフトアッセイにより観察されるｐ５ＲＷＲに基づくナノ粒子からのｓｉＲＮＡ放出が不良であることを示す（図２１Ａ、Ｂ）。

【0217】

これらのデータは、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子が低ｐＨに応答して解体する能力が細胞質へのｓｉＲＮＡ送達に重要であることを強調する。具体的には、ベクターからのｓｉＲＮＡ放出及びｐ５ＲＨＨによる同時エンドソーム溶解によるナノ粒子の解体は、遊離ｓｉＲＮＡの細胞質コンパートメントへのアクセスをもたらす協調された事象である。良好なｓｉＲＮＡトランスフェクションにおける協調されたｓｉＲＮＡ放出及びエンドソーム流出の本質的な役割は、周知である。例えば、エンドソームにおける未成熟なｓｉＲＮＡ放出は、エンドソームヒドラーゼによるｓｉＲＮＡ分解を可能にする。一方、ｓｉＲＮＡに非常に強く結合するペプチドは、良好なＲＮＡｉを防止するとも仮定される。したがって、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子からのｓｉＲＮＡ放出は、最大ｍＲＮＡ分解のためにエンドソーム流出と同時でなければならない。

【0218】

実施例１４．成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）モデルにおけるＮＦκＢ経路を標的とするｓｉＲＮＡの高効率インビボトランスフェクション
アルブミン被覆されたｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の治療可能性は、ＨＴＬＶ－１誘発ＡＴＬＬのマウスモデルである、Ｆ８細胞における標準及び非標準両方のＮＦκＢシグナル伝達経路を標的とするｓｉＲＮＡの高度に効率的なトランスフェクションにより示された。転写因子ＮＦκＢは、抗アポトーシスタンパク質の発現を駆動することによって化学療法に対する耐性を促進する、ＡＴＬＬにおけるその中心的な役割により治療標的として選択された。小分子プロテアソーム阻害剤及びＩＫＫ複合体の阻害剤は、いくつかのＡＴＬＬ疾患モデルにおいてＮＦκＢの活性化を減少させることができるが、それらの特異性及びインビボでＮＦκＢを不活性化する能力に関する問題は、より具体的な治療薬の必要性を強調する。ｓｉＲＮＡを介した標準及び非標準両方のＮＦκＢシグナル伝達経路の直接阻害により提供される潜在的な相乗効果は、治療の成功に必要とされるＮＦκＢシグナル伝達の良好な遮断のカギであり得る。

【0219】

ｓｉＲＮＡは、標準経路のｐ６５サブ単位及び非標準経路のｐ１００／ｐ５２サブ単位を標的とするように選択された。トランスフェクション２４時間後に行われたウエスタンブロットは、細胞がスクランブルされたｓｉＲＮＡ対照をトランスフェクトされた際には見られなかった両方のタンパク質の発現において、用量依存減少を明らかにした（図２４Ａ、Ｂ）。トランスフェクション４８時間後のアラマーブルーアッセイ（図２４Ｃ）は、細胞生存率における強力な減少がｐ６５及びｐ１００／ｐ５２ｓｉＲＮＡの両方で記録されたため、インビトロでのこれらの経路のノックダウンが治療的に関連することを示す。さらに、ｐ１００／ｐ５２ｓｉＲＮＡによる非標準ＮＦκＢ経路の遮断（約１００ｎＭのＩＣ_５０）が、この細胞系において標準経路（約２００ｎＭのＩＣ_５０）の遮断よりも優れていることは明らかである。非標準経路は、抗アポトーシスタンパク質発現の促進において、標準経路よりも大きな役割を果たすと仮定され、ＡＴＬＬ細胞の増殖の調節により望ましい標的と考える。ｐ５ＲＨＨ媒介ｓｉＲＮＡ送達を利用する、本明細書に提示されるデータは、この仮説を確認するだけでなく、ｐ６５及びｐ１００／ｐ５２両方のｓｉＲＮＡを同時にパッケージングする単一のｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ製剤により標準及び非標準両方のＮＦκＢ経路を標的とする場合の相乗応答も明らかにする。この２重標的ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ製剤の使用は、ＮＦκＢ遮断媒介細胞死を改善し、ＩＣ_５０は約５０ｎＭである。インビトロでのＲＢＣ及びインビボでのエンドソーム膜を溶解する能力にも関わらず、スクランブルされたｓｉＲＮＡによるトランスフェクションは、Ｆ８細胞のいずれの毒性ももたらさないことに留意することが重要である。発明者による研究は、メリチンのＮ末端切り詰めがその溶解能を２倍の規模で減少させることを示し（未公開の観察）、ｐ５ＲＨＨが高濃度でエンドソームを溶解することができるように思われるが、ｐ５ＲＨＨは、エンドドーム放出及び細胞質における希釈後は、安全である。組織培養におけるｐ５ＲＨＨの安全性を考えて、パイロット実験は、インビボ送達される場合のｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の腫瘍局在化を検査するために行われた。ＩＶＩＳ撮像及び共焦点顕微鏡は、１ｍｇ／ｋｇの用量で自然発生ＡＴＬＬ腫瘍を保有するマウスに尾静脈注射により導入された場合の、Ｃｙ５．５標識された、スクランブルされたｓｉＲＮＡの腫瘍送達を明らかにする（図２４Ｄ～Ｇ及び図２７）。ｐ５ＲＨＨ／Ｃｙ５．５ ｓｉＲＮＡナノ粒子を注射されたマウスからの腫瘍は、周辺にＣｙ５．５ ｓｉＲＮＡ蓄積を呈する一方、限られたＣｙ５．５ ｓｉＲＮＡは、腫瘍の中心で見られる（図２５）。

【0220】

ＮＦκＢ発現自体を標的とするための以前の試みは、治療可能性が限られる、ネイキッドアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはレンチウイルスｓｈＲＮＡ発現の使用に重点を置いている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、非効率的であり、本明細書に提示されるｓｉＲＮＡ製剤よりも１桁大きいインビトロでのオリゴヌクレオチドを必要とする。一方、ｓｈＲＮＡ発現のウイルスベクターは、癌の誘発から飽和作用に関連する毒性の範囲に及ぶ、ヒトにおける試験に多くの課題を提示する。両方のＮＦκＢ経路を同時に標的にする能力により、現在のｓｉＲＮＡアプローチは、ＮＦκＢ標的ｓｉＲＮＡの高度に効率的で低毒性のトランスフェクションにｐ５ＲＨＨを使用することにより、ＮＦκＢ誘発により駆動されるＡＴＬＬまたは他の疾患プロセスの治療のための相乗的戦略を示すと考えられる。

【0221】

実施例１～１４の結論
要約すると、膜溶解ペプチドは、代替えのＰＴＤ媒介トランスフェクションに関連するｓｉＲＮＡ封入を防止することによってｓｉＲＮＡの細胞質送達を促進するためのエンドソーム流出剤として採用することができる。最終的な大きさが約５５ｎｍのアルブミン安定化ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ製剤が報告される。これらのナノ粒子は、マクロ飲作用を介して流体相取り込みにより形質膜陥入される。後続のエンドソーム酸性化は、遊離ｐ５ＲＨＨの放出により引き起こされるｓｉＲＮＡ放出及びエンドソーム流出の同時発生を伴うｐＨ媒介粒子解体の誘因を提供する（図２６）。ＡＴＬＬのモデルにおいてｐ６５及びｐ１００／ｐ５２ｓｉＲＮＡの同時トランスフェクションに利用される場合、ｐ５ＲＨＨは、細胞生存率において相乗的減少を媒介し、さらなるインビボ試験の可能性を示唆する。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子がペプチド及びｓｉＲＮＡ放出をエンドソームと効率的に協調させる固有の能力は、様々な疾患基質におけるｐ５ＲＨＨ媒介トランスフェクションの使用の可能性を予示する。さらに、ｐ５ＲＨＨの作用機構の分析は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションのための今後のペプチドベクターのさらなる開発を導く可能性がある見解を提供する。

【0222】

実施例９～１４の材料及び方法
ペプチド／ｓｉＲＮＡナノ粒子の調製及び分析
メリチン誘導体ｐ５ＲＨＨ（ＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＲＲＲＨＲＲＨＣ；配列番号１）及びｐ５ＲＷＲ（ＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱＲＷＲＲＲＲ；配列番号５５）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、使用前にＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅ遊離水（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中１０ｍＭで溶解され、－８０℃で、４μｌのアリコートに保管された。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡトランスフェクション複合体を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）中１：２００でｐ５ＲＨＨを希釈し、３０秒間ボルテックスにかけ、続いて、ｓｉＲＮＡ（１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中１０μＭのストック濃度）を添加して、１００：１のペプチドとｓｉＲＮＡとの比率を得、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒ中で振盪させながら、３７℃で４０分間インキュベートすることにより調製した。動物実験に関して、ペプチド及びｓｉＲＮＡは、氷上で１０分間、１０倍高い濃度でインキュベートされた。湿式原子間力顕微鏡は、ＡＲＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｈｉｔｅ Ｂｅａｒ Ｌａｋｅ，ＭＮ）により行われた。

【0223】

細胞培養
Ｂ１６－Ｆ１０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）細胞系を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）で補足されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中、標準的な細胞培養条件下（加湿インキュベータにおいて３７℃及び５％のＣＯ２）で維持した。Ｆ８細胞を、前の刊行物に従い、１０％のウシ胎仔血清で補足されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。

【0224】

フローサイトメトリーによる取り込み阻害
飲食作用阻害剤の存在下、または不在下で、Ｂ１６－Ｆ１０細胞を、ｐ５ＲＨＨ（２５ｎＭ）、ＦＩＴＣ－トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または７０ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）でパッケージングされたａｌｅｘａ４８８標識されたｓｉＲＮＡと共に４０分間インキュベートした。インキュベーション後、フローサイトメトリー分析のために、細胞をＰＢＳ中で３×洗浄し、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．２％のＦＢＳ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ）に再懸濁した。阻害剤は以下の通り使用された：ＥＩＰＡ（８０μＭ，Ｓｉｇｍａ）、フィリピン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、及びＰＡＯ（１０μＭ Ｓｉｇｍａ）。

【0225】

共焦点顕微鏡
ｐ５ＲＨＨナノ粒子及び適切な取り込みマーカーと共に４０分間または２４時間インキュベートする前に、Ｂ１６－Ｆ１０細胞を、ガラススリップ上で一晩培養した。７０ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（１０ｍｇ／ｍｌ）またはＦＩＴＣ－トランスフェリン（２５μｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下で、ｐ５ＲＨＨ／Ｃｙ－３ ｓｉＲＮＡナノ粒子を、２００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度で添加した。インキュベーション後、細胞を、１０分間、ＰＢＳ中で３×、氷上で洗浄し、ガラススライド上に載置する前に４％のパラホルムアルデヒド（ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に固定した。Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｔａ５１０（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）により、細胞を撮像した。

【0226】

ＧＦＰノックダウンの分析
Ｂ１６ ＧＦＰ細胞は、６ウェルプレート中、１５０，０００細胞／ウェルで平板培養され、後に、１μＭバフィロマイシンＡ１（ＤＭＳＯ中１ｍＭストック、Ｓｉｇｍａ）の存在下、または不在下で、１ｍＬの１０％ＤＭＥＭ中５０ｎＭのｓｉＲＮＡの最終濃度で１２時間トランスフェクトされた。Ｂ１６－ＧＦＰ細胞がＧＦＰ特異的またはスクランブルされたｓｉＲＮＡを含むｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子をトランスフェクトされた２４時間後、ＧＦＰ蛍光分析のために、細胞を、トリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．２％のＦＢＳ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡ（センス：５’－ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ－３；配列番号８４’）をＳｉｇｍａから購入した。スクランブルされたｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した。

【0227】

低ｐＨでのｓｉＲＮＡ色素アクセス容易性
予め形成されたｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を、１：１０００で希釈されたＴＯＰＲＯ３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下、示されるｐＨで３０分間、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ）中でインキュベートした。ＴＯＰＲＯ３蛍光は、６４２ｎｍでの励起及び６６１ｎｍでの発光で、９６ウェルプレート中で測定された。次いで、蛍光値はｓｉＲＮＡのみの対照に正規化され、３つの独立した実験の平均として提示される。

【0228】

ｐＨ依存ゲル移動アッセイ
ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を、２０％のＴＢＥ－ＰＡＧＥゲル上で分解する前に、示されるｐＨで３０分間、ＨＢＳＳ中でインキュベートした。ｓｉＲＮＡは、１：１００００に希釈された１×ＴＢＥ（ＩＢＩＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＳＹＢＲ ＧＯＬＤで１５分間染色することにより視覚化される。

【0229】

リソソーム妨害に関するアクリジンオレンジ染色
カバースリップ上で平板培養されたＢ１６Ｆ１０細胞を、１５分間、１０μＭのアクリジンオレンジで充填し、１００ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度の１０％のＥＭＥＭ中のｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の存在下で１２時間インキュベーションする前に、ＰＢＳ中で３×洗浄した。あるいは、撮像前に１５分間、細胞を１００μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ）に曝露した。生存細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１０（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の蛍光顕微鏡で視覚化した。

【0230】

ＲＢＣ溶血
４℃で保管する前に、ウサギの赤血球（ＲＢＣ）を、遠心分離及びＰＢＳ中で３×洗浄することにより、全血から単離した。溶血試験の前に、ＲＢＣを、ｐＨ適切ＨＢＳＳ中で３×洗浄し、１：５０００で希釈した。次いで、ｐＨ特異的緩衝液中のＲＢＣを、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子と共に１２時間インキュベートした。ＲＢＣ残余物を、遠心分離によりペレット化し、５５０ｎｍのＵＶ吸光度により上清のヘモグロビン含量を測定した。次いで、吸光度値は、ｐ５ＲＨＨのみの対照による最大溶解に対して正規化され、３つの独立した実験の平均として提示される。

【0231】

Ｆ８細胞におけるＮＦκＢノックダウンの分析
Ｆ８細胞は、２００，０００細胞／ウェルで、６ウェルプレート中で平板培養され、１ｍＬの最終容量の様々なｓｉＲＮＡ濃度で、指定されるｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた。ｓｉＧＥＮＯＭＥマウスＮＦκＢ（ｐ６５）ｓｉＲＮＡ５及びｓｉＧＥＮＯＭＥマウスＮＦκＢ２（ｐ１００／ｐ５０）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。スクランブルされたｓｉＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した。トランスフェクション２４時間後、Ｆ８細胞を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＡＫＲ－１０００において、１０００ｒｐｍでペレット化した。次いで、細胞ペレットを、１ｍＭのＰＭＳＦ及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＩｇｅｐａｌＣＡ－６３０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロール）に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞溶解物を、４℃で５分間遠心分離し、上清を－２０℃で保管した。ＴＢＳ－Ｔ中の５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）で遮断する前に、溶解物をＮｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分解し、０．２２μｍのニトロセルロースに移した。使用された一次抗体は、ウサギ抗ｐ６５（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ウサギ抗ｐ１００／ｐ５０（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）であった。二次抗体：抗ウサギＨＲＰ（１：５０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ブロットは、ＥＣＬウエスタンブロット基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して開発された。

【0232】

Ｆ８細胞生存率測定
トランスフェクション前に、Ｆ８細胞を、４００μｌ中２０，０００細胞／ウェルで、２４ウェルプレート中で１２時間平板培養し、標準的な細胞培養条件下で培養した。ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製し、アラマーブルー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生存率を測定する前に、６００μｌの最終容量で、４８時間、細胞と共にインキュベートした。簡潔に、アラマーブルーを、細胞培養培地中に１：１０で希釈し、２～４時間、細胞と共にインキュベートした。５７０ｎｍでの励起、及び５８５ｎｍでの発光による蛍光プレート読取装置（Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で蛍光を測定した。

【0233】

動物実験
実験動物プロトコルは、ワシントン大学医学部の動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって承認された。自然発生腫瘍を有するトランスジェニックマウスは、Ｒａｔｎｅｒ ｌａｂからの寄贈であった。パイロット実験のために進行性腫瘍を有するマウスを選び、屠殺２４時間前に１ｍｇ／ｋｇの単一用量を注射した。動物を生理食塩水で灌流し、ＩＶＩＳ撮像及び凍結切片のために腫瘍を切除した。

【0234】

実施例１５．ｐ５ＲＨＨ細胞毒性．
Ｂ１６ ＧＦＰ細胞は、ＧＦＰ特異的またはスクランブルされたｓｉＲＮＡを含む増加濃度のｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子をトランスフェクトされた。比較のため、Ｂ１６ ＧＦＰ細胞は、リポフェクタミン２０００を使用して、増加濃度のＧＦＰ特異的またはスクランブルされたｓｉＲＮＡもトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞から抽出したＲＮＡを、ノーザンブロット分析を使用して分析し、トランスフェクトされたＢ１６細胞の正規化された生存率を決定した（図２８）。リポフェクタミン２０００を使用したトランスフェクションとは対照的に（図２８Ｂ、Ｄ）、ｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡは、全ての試験した用量で安全であると決定された（図２８Ａ、Ｃ）。

【0235】

実施例１６．ＮＦκＢ遮断はコラーゲン抗体誘発関節炎において関節炎の症状を緩和する。
アルブミン被覆されたｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の治療可能性は、コラーゲン抗体誘発マウスの関節炎モデルにおいて示された。簡潔に、本モデルは、モノクローナル抗体をコラーゲンＩＩに注射し、続いて、数日後、関節炎の症状を増強するために、リポ多糖を注射することを含む。コラーゲン抗体誘発マウスモデル及びｓｉＲＮＡの投与は、図２９に記載される通りである。

【0236】

標準経路のｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡが使用された。スクランブルされたｓｉＲＮＡは、対照として使用された。ｓｉＲＮＡは、Ｃｙ５．５で標識された。各投与のｓｉＲＮＡの濃度は、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡであった。３匹のマウスに生理食塩水を投与し、３匹のマウスにスクランブルされたｓｉＲＮＡを投与し、４匹のマウスにｐ６５ｓｉＲＮＡを投与した。関節炎の重篤度は、足首の厚さのランク付け、関節炎スコア、ならびに０、３、４、６、８、及び１０日目の体重によって決定された。

【0237】

図３０に示される、標準経路のｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡ粒子を使用するＮＦκＢ遮断は、足首の厚さ（図３０Ａ））及び関節炎スコア（図３０Ｂ）により測定されるように、コラーゲン抗体誘発関節炎を減少させる。ＩＶＩＳ撮像は、ｓｉＲＮＡが動物の関節炎の脚に蓄積したことを示す（図３０Ｃ）。

【0238】

加えて、ｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡを使用して関節炎を治療する有効性を視覚化するために、超音波分子撮像が使用された。超音波撮像は、治療中の類似する組織についてサブボクセル解像度で、物理的組成（線維症、浮腫、炎症細胞等）及び組織の構成における変化を測定する（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ Ａｃｏｕｓｔ Ｓｏｃ Ａｍ．１２９：３７５６、Ｈｕｇｈｅｓ ２０１１ ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎ Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ Ｆｒｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ．５８：２３６１－２３６９、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．３３：１２３６－１２４３、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１２１：３５４２－３５５７、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｊ Ａｃｏｕｓｔ Ｓｏｃ Ａｍ．１３３：２８３－３００、Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１２６：２３５０－２３５８）。

【0239】

エントロピー撮像は、脚の３つの骨が、生理食塩水（プラセボ）で処置した４日後、視認可能である（青または赤）ことを示す。脚の骨の３つはｐ６５サブ単位を標的とするｓｉＲＮＡを有するｐ５ＲＨＨ／ｓｉＲＮＡで処置された４日後、動物において視認可能であるが、それらのピクセル値は正常な背景に非常に近い（図３１）。

【0240】

実施例１７．コラーゲン抗体誘発関節炎における炎症応答を抑制するためのｓｉＲＮＡナノ粒子
この試験の目的は、ｓｉＲＮＡナノ粒子がマウスにおけるコラーゲン抗体誘発関節炎における炎症応答を抑制する能力を示すためである。ＮＦｋＢ経路は、標準ＮＦｋＢ経路の主な転写調節因子であるｐ６５サブ単位に対してｓｉＲＮＡを組み込むことにより、炎症における中央チェックポイントとして標的にされる。ナノ粒子は通常の方法で調製され、関節腫脹が確立された後、３連続日用量で静脈内注射された。関節応答は経時的に測定され、材料の安全性を定義するために、いくつかの他の試験が行われた。

【0241】

関節炎の誘発及び治療：Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ－ＣＩＡアテローム性モノクローナル抗体５－クローンカクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．）で、コラーゲン抗体誘発関節炎モデル（ＣＡＩＡ）を使用して、関節炎を誘発した。６～８週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、０日目に１．５ｍｇの５－クローン抗体カクテル、そして３日目に５０ｕｇのＬＰＳをｉ．ｐ．注射した。初期関節炎が全てのマウスにおいて確立された４日目に始まって、動物は、毎日、生理食塩水、スクランブルされたＲＮＡ配列を有するナノ粒子、またはｐ－６５ｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｋｇ、尾静脈による静脈）の連続静脈注射を受けた。関節炎の臨床症状は、０～３のスケールで毎日評価された（０＝腫脹または紅斑なし、１＝わずかな腫脹または紅斑、２＝適度な紅斑及び複数の指もしくは脚全体の腫脹、３＝明白な紅斑及び脚全体の腫脹、３×４の最大スコア＝１匹のマウス当り１２）。ダイヤルカリパスにより、脚の厚さにおけるベースラインからの変化を毎日決定し、後脚２本の測定から、各マウスに関して、足首の厚さの平均変化を決定した。２日に１回、マウスを量り、ベースラインからの体重損失のパーセンテージを計算した。９日目に、マウスを屠殺し、分析のためにそれらの血液、脚、及び臓器を採取した。

【0242】

サイトカイン分析：１ｍｌのＰＢＳ中で脚を均質化し、溶解物を遠心分離により取り除いた。製造者の推奨に従い、マウス炎症キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、サイトメトリービーズアレイにより、脚の溶解物におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＭＣＰ－１の濃度を測定した。製造者の推奨に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＩＬ－１βを測定した。

【0243】

血液学パラメータ及び血清化学検査：１０日目の血液は、下大静脈から採取され、ＷＢＣ／分析血液像及び血清化学検査（肝臓及び腎臓機能）のために送られた。分析は、ワシントン大学比較医学部（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって行われた。

【0244】

ナノ粒子に対する免疫応答：標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、総ＩｇＧ及びＩｇＭを測定した。簡潔に、９６ウェルプレートを、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）またはヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）捕捉抗体（ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断した後、希釈したマウス血清（１：４０，００～１：４００，００希釈）をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１００ｕｌのＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）またはヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）抗体（ＰＢＳ中１％のＢＳＡにおいて１：３，０００希釈）をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、１００μＬの過酸化色素原溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、発色現像を４５０ｎｍで読み取った。精製されたマウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＩｇＭ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、標準曲線を確立するために使用された。

【0245】

ｐ５ＲＨＨペプチドまたはペプチド：ｓｉＲＮＡナノ粒子に対するＩｇＭまたはＩｇＧ特異的応答を測定するために、Ｉｍｍｕｎｌｏｎ ４ ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、２μＭのｐ５ＲＨＨペプチド濃度の１００μｌ／ウェルのｐ５ＲＨＨペプチドまたはｓｉＲＮＡ－ｐ５ＲＨＨナノ粒子のいずれかと共に、４℃で一晩インキュベートした。プレートのウェルの表面に被覆された材料の量を決定するために、ｐ５ＲＨＨは１つのトリプトファン残基を有するため、蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、未結合のｐ５ＲＨＨペプチドまたはｓｉＲＮＡ－ｐ５ＲＨＨナノ粒子が測定された。トリプトファン蛍光発光スペクトル（３００ｎｍ～５００ｎｍ）は、２８０ｎｍでの励起後に測定された。標準曲線が生成され、未結合材料の量が標準曲線に対して計算された。ペプチド被覆されたプレートに関して、被覆されたペプチドは、２．２１μｇ／ｍｌの濃度を有し、ｓｉＲＮＡ－ｐ５ＲＨＨナノ粒子（ＮＰ）被覆されたプレートに関して、ペプチドの濃度は３．５８μｇ／ｍｌであった。洗浄し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断した後、希釈したマウス血清（１：１０～１：１００希釈）をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、上記のＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）またはヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）抗体を添加した。上記のように、過酸化色素原溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、発色現像を行った。データは、直接吸光度（４５０ｎｍのＯＤ）として提示される。

【0246】

非特異的ナノ粒子取り込み：マウスに、２００ｕｌのＨＢＳＳまたはＣｙ３標識されたペプチド：スクランブルされたＲＮＡ配列ナノ粒子を静脈注射した。３０後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリーにより細胞関連Ｃｙ３標識された粒子を分析するために、末梢血液白血球及び脾細胞を得た。特異的な共局在を探すために、Ｌｙ６Ｇ（好中球）及びＬｙ６Ｃ（単球）でも、細胞を染色した。

【0247】

補体活性化：マウスに、２００ｕｌのペプチド：ｓｉＲＮＡナノ粒子を静脈注射した。ＮＰ注射３０分後、血液を下大静脈から１０ｍＭ ＥＤＴＡ管に直接回収し、さらなるエクスビボ補体活性化を防止した。Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡ用に回収された血液から新しい血漿を準備した。簡潔に、ラット抗マウスＣ３ａ（４μｇ／ｍＬ）モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でプレートを一晩被覆した。試薬希釈液（ＰＢ中１％のＢＳＡ）で、室温で１時間遮断した後、プレートをＥＬＩＳ洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０）で３×洗浄し、試料（試薬希釈剤において１：１００で希釈された１００μＬの同日の新しく得た血漿）と共に室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し（３×）、ビオチン化抗マウスＣ３ａ（２５０ｎｇ／ｍＬ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをストレプトアビシン－ペルオキシダーゼ（４００ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬの過酸化色素原溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、発色現像を４５０ｎｍで読み取った。標準曲線を確立するために、マウス組換えＣ３ａ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した。

【0248】

結果：足首の厚さ及び関節炎スコアの両方が、活性ｓｉＲＮＡにより疾患プロセスの初期に減少するが、スクランブルｓｉＲＮＡでは減少しない（図３２）。体重は群内で相違はなかった。脚の溶解物から得られた分子標的であるｐ６５は、活性ｓｉＲＮＡにより減少した（図３３）。広範なサイトカイン抑制が脚で観察され、上流ＮＦｋＢチェックポイントの阻害と一致する。

【0249】

実験の最終日に行われた血液試験は、ＲＢＣ、ＷＢＣ（分析血液像を含む）、または血小板における変化を明らかにしなかった（図３４）。腎臓機能試験は、適切な血清化学検査または腎臓機能（図３５）における変化を明らかにせず、肝臓機能試験も変化がなかった（図３６）。補体活性化試験は、ナノ粒子療法に関連した大幅な減少を明らかにせず、先天性免疫活性化を避けることを示す（図３７）。脾細胞計数におけるわずかな上昇が観察され、存在した細胞の型において変化はなく、ナノ粒子に対する免疫応答性に対する最小限の作用を示す（図３８）。

【0250】

脾臓からのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ３抗体を用いた抗原投与に対する未変性免疫応答性は、重要な免疫エフェクターに関して十分に保存され、患部関節における炎症の広範な局所阻害にも関わらず、全身性免疫応答性が維持されるだろうことを示す（図３９）。ｓｉＲＮＡナノ粒子に対する抗体の短期誘発は観察されず、適応免疫刺激の欠如、及び連続注射後の薬剤に対する耐性を避ける可能性を示す（図４０）。ネイキッドｓｉＲＮＡまたは完全に形成されたｓｉＲＮＡ粒子のいずれかに関して、免疫応答は観察されず、適応免疫刺激の欠如を確認した（図４１）。

【0251】

白血球によるナノ粒子複合体の関節への送達を除外するために、さもなければ、炎症プロセスの顕著な成分である、末梢循環における好中球及び単球による粒子の取り込みの欠如が、これらの細胞型と会合するナノ粒子からの最小限のシグナルのみを示すフローサイトメトリーにより確認された。これは、有力な標的細胞型が既に関節自体に内在し、関節に到達する前に末梢循環において阻害されないことを示唆する（図４２）。脾臓において、好中球及び単球が任意の顕著な程度まで粒子を取り込まないことも明らかであり、ナノ粒子が脾臓を避け、免疫応答を刺激せず、また活性脾細胞により炎症組織にも輸送されないことを確認する（図４３）。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図24-3】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32-1】

【図32-2】

【図33-1】

【図33-2】

【図34-1】

【図34-2】

【図35-1】

【図35-2】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39-1】

【図39-2】

【図40】

【図41-1】

【図41-2】

【図42-1】

【図42-2】

【図43-1】

【図43-2】

【配列表】

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