特許 7227654 固形癌及び微生物感染を治療するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-14

(45)【発行日】2023-02-22

(54)【発明の名称】固形癌及び微生物感染を治療するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/869 20060101AFI20230215BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230215BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230215BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20230215BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230215BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230215BHJP

【ＦＩ】

C12N15/869 Z

C12N15/12

C12N7/01

A61K35/763

A61K48/00

A61P35/00

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021507574

(86)(22)【出願日】2018-08-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-09

(86)【国際出願番号】 CN2018096152

(87)【国際公開番号】W WO2020034051

(87)【国際公開日】2020-02-20

【審査請求日】2021-02-26

(73)【特許権者】

【識別番号】520400807

【氏名又は名称】イムヴィラ・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＶＩＲＡ ＣＯ．， ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ・グレイス

(72)【発明者】

【氏名】チェン・シャオチン

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００５／１０３２３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】PLoS Pathog.，2014年，Volume 10, Issue 5, e1004134，p. 1-13

【文献】Exp. Ther. Med.，2018年04月，Vol. 15，p. 3523-3529

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含む組換え腫瘍溶解性１型単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ-１）であって、
一旦癌細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４を発現する組換えｏＨＳＶ-１。

【請求項2】

前記外因性ポリヌクレオチド断片は、ｏＨＳＶ-１のＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に位置する、請求項１に記載の組換えｏＨＳＶ-１。

【請求項3】

前記癌細胞は、食道癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、又は膀胱癌細胞である、請求項１に記載の組換えｏＨＳＶ-１。

【請求項4】

前記ＳＯＣＳ４は、ヒトＳＯＣＳ４である、請求項１に記載の組換えｏＨＳＶ-１。

【請求項5】

免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする追加の外因性ポリヌクレオチド断片を含む、請求項１に記載の組換えｏＨＳＶ-１。

【請求項6】

請求項１に記載の組換えｏＨＳＶ-１と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項7】

癌の治療用である、請求項６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物感染及び固形癌を治療するための方法及び組成物に関し、特にＳＯＣＳ４を発現する組換えウイルス及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＨＳＶ-１は気道を含む様々な粘膜組織に感染し、ＨＳＶ-１誘導肺炎はウイルスそのものではなく炎症反応による直接的な細胞変性効果であることが報告されている。この制御されていない炎症反応は、「サイトカインストーム」と呼ばれる炎症性サイトカインの過剰放出の結果であり、「サイトカインストーム」は、最初には、インフルエンザによって誘導されたサイトカインが短期間で過剰に産生されることを意味し、制御されていない炎症性反応、重要な免疫病理学、及び重篤な疾患の結末に関連している。残念なことに、サイトカインストームに関与する分子、サイトカインの発症機序への貢献、及び症状を予防又は軽減するための治療戦略についての理解はまだ不十分である。

【0003】

癌細胞内で選択的に複製し、癌細胞を殺傷するように遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、抗腫瘍治療の新しい方法の代表である。その機序の選択性、腫瘍細胞死を調節する潜在力及び腫瘍部位で追加の治療用導入遺伝子を発現する可能性に基づくものであるため、この方法は特に注目されている。腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内注射用に設計されていることを考慮すると、このユニークな癌療法は通常、宿主の抗腫瘍免疫（免疫ウイルス療法、ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）と組み合わせられている。腫瘍溶解性ＨＳＶ（ｏＨＳＶ）に基づく１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-１）、ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｔ-ＶＥＣ、Ｉｍｌｙｇｉｃ）はＦＤＡにより初めて承認されたＯＶである。他のＯＶ候補者のように、ｏＨＳＶに対する宿主反応は複雑で、多方面であり、しかも宿主免疫力と腫瘍微小環境を通じて調節を行い、さらに、種々の免疫反応及び炎症反応は、有利にも有害にもなり得、ＯＶを介して特定の器官（たとえば肺）に送達されることによって誘導されるサイトカインストームは、ますます認められた障害の１つである。サイトカインストームに伴う肺損傷の進展は、その後、すでに各種のウイルス、細菌又は真菌感染において報告されていた。一貫した観察から、サイトカインストームの概念はより複雑であることが示されているが、現在のところ、サイトカインストームを促進する機序についての理解はまだ限られており、適切なサイトカイン放出とサイトカイン過剰産生のバランスを制御する対策はまだ開発されていない。

【発明の概要】

【0004】

本発明の第１の態様は、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含む組換えウイルスであって、一旦細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又はその機能的断片を発現する、組換えウイルスに関する。

【0005】

いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を担持する組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、このウイルスが複製される細胞は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を担持する組換えウイルスベクターであり、このウイルスが複製される細胞は正常細胞である。

【0006】

本発明の別の態様は、治療有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための、又は対象において腫瘍溶解性ウイルス療法の副作用を低減又は解消するための方法であって、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦癌細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又はその機能的断片を発現する方法に関する。

【0007】

本発明のさらなる態様は、治療有効量の組換えウイルスベクターを対象に投与することを含む、対象において微生物感染治療の副作用を低減又は解消するための方法であって、該ベクターは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、該組換えウイルスは、一旦正常細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又はその機能的断片を発現する方法に関する。

【0008】

本発明では、サイトカインストームに対する誘導の制御に及ぼす影響を研究するために、ＳＯＣＳ４タンパク質挿入断片（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｓｅｒｔ）を有するＨＳＶ株（ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４）が構築されている。本発明は、ＭＣＰ-１、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６、及びＩＦＮ-γを含むいくつかの重要な役割を果たす代表的なサイトカインを研究し、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４に感染したマウスにおけるそれらの濃度はＨＳＶ-１（Ｆ）に感染したマウスにおけるそれらの濃度よりもはるかに低く、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスはわずかな肺損傷、わずかな体重減少、及び１００％の生存率を示すことを発見した。本発明は、腫瘍溶解性ウイルス療法によって誘導されるサイトカインストームを調節するための有望な技術案を提供する。

【0009】

本発明の態様をさらに記載する：
［項１］
サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含む組換えウイルスであって、
一旦細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又は前記機能的断片を発現する組換えウイルス。
［項２］
前記ウイルスは腫瘍溶解性ウイルス又はウイルスベクターである、上記項１に記載の組換えウイルス。
［項３］
前記腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解性１型単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ-１）である、上記項２に記載の組換えウイルス。
［項４］
前記外因性ポリヌクレオチド断片は、ｏＨＳＶ-１のＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に位置する、上記項３に記載の組換えウイルス。
［項５］
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス、又はバキュロウイルスに由来する、上記項２に記載の組換えウイルス。
［項６］
前記細胞は癌細胞である、上記項１に記載の組換えウイルス。
［項７］
前記癌細胞は、食道癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、又は膀胱癌細胞である、上記項６に記載の組換えウイルス。
［項８］
前記ＳＯＣＳ４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＮＣ＿００００１４．９であるホモサピエンス由来であるか、又はホモサピエンスと少なくとも８０％の同一性を有する配列由来である、上記項１～７のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
［項９］
免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする追加の外因性ポリヌクレオチド断片を含む、上記項１～８のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
［項１０］
上記項１～９のいずれか１項に記載の組換えウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［項１１］
治療有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法であって、
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦癌細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又は前記機能的断片を発現する方法。
［項１２］
前記腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解性１型単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ-１）である、上記項１１に記載の方法。
［項１３］
前記癌細胞は、食道癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、又は膀胱癌細胞である、上記項１１又は１２に記載の方法。
［項１４］
ＳＯＣＳ４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＮＣ＿００００１４．９であるホモサピエンス由来であるか、又はホモサピエンスと少なくとも８０％の同一性を有する配列由来である、上記項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
［項１５］
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、免疫刺激剤及び／又は免疫治療剤をコードする追加の外因性ポリヌクレオチド断片を含む、上記項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
［項１６］
治療有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む、対象において腫瘍溶解性ウイルス療法の副作用を低減又は解消する方法であって、
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦癌細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又は前記機能的断片を発現する方法。
［項１７］
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性１型単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ-１）である、上記項１６に記載の方法。
［項１８］
前記癌細胞は、食道癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、又は膀胱癌細胞である、上記項１６又は１７に記載の方法。
［項１９］
ＳＯＣＳ４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＮＣ＿００００１４．９であるホモサピエンス由来であるか、又はホモサピエンスと少なくとも８０％の同一性を有する配列由来である、上記項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
［項２０］
前記副作用は、サイトカインの過剰産生である、上記項１６～１９のいずれか１項に記載の方法。
［項２１］
前記副作用は肺組織損傷である、上記項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
［項２２］
治療有効量の組換えウイルスを対象に投与することを含む、対象において微生物感染治療の副作用を低減又は解消する方法であって、
前記組換えウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又は前記機能的断片を発現する方法。
［項２３］
前記組換えウイルスはウイルスベクターである、上記項２２に記載の方法。
［項２４］
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス、又はバキュロウイルスに由来する、上記項２２又は２３に記載の方法。
［項２５］
ＳＯＣＳ４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＮＣ＿００００１４．９であるホモサピエンス由来であるか、又はホモサピエンスと少なくとも８０％の同一性を有する配列由来である、上記項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。
［項２６］
前記微生物感染は、ウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染である、上記項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
［項２７］
前記副作用は、サイトカインの過剰産生である、上記項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
［項２８］
前記副作用は肺組織損傷である、上記項２２～２７のいずれか１項に記載の方法。
本発明の他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から容易に把握できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４再構築の概略図。Ａ）確認されたＳＯＣＳ４遺伝子をＣｌａ Ｉ／Ａｃｃ Ｉ及びＮｏｔ ＩでのｐＮＥＷＵＬ骨格部位に連結する。（Ｂ）ｐＮＥＷＵＬからｐＮＥＷＵＬ骨格のＢｇｌＩＩとＰａｃＩの間の配列（ＵＬ３、ＵＬ４、及びＳＯＣＳ４を含む）を切断し、同じ部位でプラスミドＰｋｏ５．１にクローニングする。

【図2】ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４再構築のＰＣＲ確認。（Ａ）バンド１は、ｐＲｅｖｅｉｖｅｒ－Ｍ０２からのＳＯＣＳ４（１３９７ｂｐ）のＰＣＲ産物を示す。（Ｂ）最終的な確認のために再構築ウイルスからＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、１０００ｂｐ～２０００ｂｐの間のバンドは、ＵＬ４９（１４９２ｂｐ）、ＵＬ３（１３１９ｂｐ）、及びＳＯＣＳ４（１３９７ｂｐ）を示す。

【図3】ＰＢＳ、ＨＳＶ－１－Ｆ又はＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスからのＢＡＬＦ中のサイトカイン産量。感染後１日目、３日目、及び７日目にマウス（ｎ＝６）からＢＡＬＦを収集し、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。（Ａ）３日間にわたってＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスから検出されたＭＣＰ-１の濃度と比較したところ、ＨＳＶ－１－Ｆマウスから有意により高濃度のＭＣＰ-１が検出された。ＨＳＶ－１－ＦマウスのＭＣＰ-１産量は７日目に減少したが、ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスでは無視できる差しか示されなかった。（Ｂ）ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスと比較して、ＨＳＶ-１-Ｆマウスでは、１日目と３日目にＩＬ-１βレベルの上昇が観察されたが、７日目には観察されなかった。ＨＳＶ-１-ＦマウスのＩＬ-１β産量は上昇傾向-下降傾向曲線を示した。（Ｃ）ＨＳＶ-１-ＦマウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間でＴＮＦ-αレベルに有意差があり、ＨＳＶ-１-Ｆマウスでは最も高いＴＮＦ-αレベルが１日目に測定され、その後低下した。（Ｄ）ＨＳＶ-１-Ｆマウスで測定したＩＬ-６レベルと比較して、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、１日目、３日目、及び７日目に有意により低レベルのＩＬ-６が測定され、２群ともに７日目に産量が増加した。（Ｅ）ＨＳＶ-１-ＦマウスのＩＦＮ-γ産量はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスからのＩＦＮ-γ産量よりもはるかに高く、３日目に増加し７日目には高レベルを維持した。陰性対照である模擬マウス（ＮＣ）は、評価可能な量のサイトカインを誘導しなかった。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【図4】ＰＢＳ、ＨＳＶ－１－Ｆ又はＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスの血清中からのサイトカイン産量。感染後１日目、３日目、及び７日目に各マウスから血清を収集して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。（Ａ）１日目に、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスから検出されたＭＣＰ-１の濃度と比較して、ＨＳＶ-１-Ｆマウスでは、有意により高濃度のＭＣＰ-１が検出され、ＨＳＶ-１-Ｆマウス中のＭＣＰ-１の産量が連続的に低下したが、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは７日目にのみ低下した。（Ｂ）ＨＳＶ-１-ＦマウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスのＩＬ-１β値は１日目と３日目で類似していたが、ＨＳＶ-１-Ｆマウスでは７日目に強い上昇を示し、このため、２群のマウスの間に有意差が認められた。（Ｃ）ＨＳＶ-１-ＦマウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間でＴＮＦ-αレベルの差が有意であり、７日目にＨＳＶ-１-ＦマウスのＴＮＦ-αレベルが最も高いことを示した。（Ｄ）３日間にわたってＨＳＶ－１－Ｆマウスで測定したＩＬ-６レベルと比較して、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、有意により低レベルのＩＬ-６が測定された。ＨＳＶ－１－ＦマウスではＩＬ-６産量の持続的な増加が検出されたが、ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスでは７日目にのみレベルの増加を示した。（Ｅ）ＨＳＶ-１-Ｆマウスではより多くのＩＦＮ-γ産量が測定され、２群ともに７日目に増加した。陰性対照である模擬マウス（ＮＣ）は、評価可能な量のサイトカインを誘導しなかった。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【図5】ＨＳＶ－１－Ｆ又はＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスからのＢＡＬＦ細胞のフローサイトメトリー解析。感染後１日目と７日目にマウスからのＢＡＬＦ細胞を収集して、ＣＤ１１ｂで染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。（Ａ）１日目及び７日目の各群のマウスの１つの代表的な結果を示す。ＣＤ１１ｂ＋細胞の数が標識されている。（Ｂ）マウス（ｎ＝６）の結果を示す。ＨＳＶ－１－Ｆマウスでは優位なＣＤ１１ｂ＋細胞が検出され、また２群では、７日目に染色陽性の細胞に比べて、１日目に染色陽性の細胞数が多かった。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【図6】ＨＳＶ－１－Ｆ又はＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー解析。感染後１日目と７日目にマウスからの脾臓細胞を収集して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８ａ又はＣＤ４で染色した後、フローサイトメトリー解析を行った。（Ａ）各群のマウスからの代表的なＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞の１日目及び７日目の結果を示す。二重陽性細胞の数を示す。（Ｂ）マウス（ｎ＝６）の結果を示す。１日目から７日目にかけて、二重陽性細胞が大幅に増加し、７日目にＨＳＶ－１－ＦマウスとＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスとの間で二重陽性細胞数の差が認められた。（Ｃ）１日目及び７日目に各群のマウスから産生された典型的なＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞を提示する。二重陽性細胞の数を記録する。（Ｄ）マウス（ｎ＝６）の結果を示す。７日目に有意に上昇したＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞が検出され、ＨＳＶ－１－ＦマウスとＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスとの間で陽性細胞数に有意差が認められた。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【図7】感染マウス中のウイルス力価（Ｖｉｒａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）及び病理分析。ＢＡＬＦを抽出されなかったマウスの肺を、感染マウスから摘出した後に細断し、上澄み液を収集して単層Ｖｅｒｏ細胞上でのウイルス力価解析を行う。（Ａ）１日目に最大ウイルス力価が観察され、その後低下し、７日目にウイルスが検出されなかった。３日目には、ＨＳＶ-１-ＦマウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間でウイルス量に有意差が認められた。（Ｂ）ＢＡＬＦが収集されなかったマウスの肺について病理解析を行い、２００ｘの代表的な写真を示した。１日目には、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスの肺部にはほとんど病理的変化は見られなかったが、ＨＳＶ-１-Ｆマウスの肺には、局所毛細血管の軽度から中等度の拡張と充血を伴う明らかな細胞浸潤が見られた。７日目には、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４に感染したマウスの肺には、いくつかの免疫細胞の浸潤及び毛細血管の軽微な拡張と充血が観察されたが、肺胞壁の構造は破裂しなかった。ＨＳＶ-１-Ｆマウスの肺には、肥厚になり破裂した肺胞壁が出現し、周囲の重篤な充血を伴い、免疫細胞で満たされていた。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【図8】ＰＢＳ、ＨＳＶ－１－Ｆ又はＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスの体重及び死亡率。鼻内経路で感染した後、マウスを１日に２回モニタリングし、１２日間続けた。（Ａ）生存しているすべてのマウスの平均体重（ｇ）を示す。ＨＳＶ-１-Ｆに感染したマウスは２日目に徐々に体重が減少し始め、７日目にはその減少が急激になり、最後に生存したマウスは１０日目に５０％体重が減少した。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４群マウスはわずかに体重が減少し、一般的に１２日目に８０％の体重を維持した。（Ｂ）ＨＳＶ-１-Ｆマウスは７日目に生存率が低下し始め、その後急速に死亡し、１１日目には生存しなかった。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスの生存率は１００％に維持された。ＰＢＳ模擬マウスは体重減少を示さず、死亡もしなかった。＊はｐ値＜０．０５を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

定義
なお、用語「一」又は「１つ」の実体は、その実体のうちの１つ又は複数を意味し、たとえば、「癌細胞」は、１つ又は複数の癌細胞を表すものとして理解される。したがって、用語「１つ」（又は「一」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換的に使用され得る。

【0012】

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療的処置、及び予防的又は防止的対策を意味し、癌の進行など、望ましくない生理学的変化又は病症を予防又は遅延（低減）することを目的とする。検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず、有益又は期待される臨床結果には、症状の寛解、疾患の程度の軽減、疾患状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的）が含まれるが、これらに限定されるものではない。「治療」とは、治療を受けていない場合に予想される生存期間よりも生存期間を延長することを意味することもある。治療を必要とする対象には、既に疾患や病症に罹患している対象と、疾患や病症に罹患しやすい対象や、疾患や病症を予防しようとしている対象とが含まれる。

【0013】

「対象」、「個体」、「動物」、「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は治療を必要とする任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象には、人間、飼い動物、農場動物、動物園動物、競技動物、又はペット、たとえば、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛などが含まれる。本明細書では、対象は人間であることが好ましい。

【0014】

本明細書で使用される場合、たとえば、「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする対象」という語句は、たとえば、検出、診断手順及び／又は治療のための本開示の組換えウイルス又は組成物の投与から利益を得る対象、たとえば、哺乳動物対象を含む。

【0015】

本明細書において使用される「治療有効量」又は「薬学的有効量」という用語は、臨床的に顕著な効果を発揮し得る各活性成分の量を指す。たとえば、製剤方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病理状況、飲食、投与時間、投与間隔、投与方式、排泄速度及び反応敏感性の要素により、各種の方式で単回用量の組換えウイルスの薬学的有効量を投薬することができる。たとえば、単回用量の組換えウイルスの薬学的有効量は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ又は０．０２～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これに限定されるものではない。単回用量の薬学的有効量は、単位剤形の単一製剤に配合されてもよいし、適当に別々の剤形に配合されてもよいし、多剤量容器に収容されるように製造されてもよい。

【0016】

本明細書で互換的に使用され得る用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態、すなわちリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを指す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡヘテロ接合体、又はプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的、生化学的に修飾された、非天然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（一般にＲＮＡ又はＤＮＡ中に発現され得る）、又は修飾又は置換された糖又はリン酸基を含んでいてもよい。もしくは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートのような合成サブユニットのポリマーを含んでいてもよく、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ-ＮＨ２）又はホスホルアミデート-リン酸ジエステルを混合したオリゴマーであってもよい。

【0017】

さらに、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うことができ、それによって「必須でない」アミノ酸領域における保存的な置換又は変化をもたらす。たとえば、指定されたタンパク質から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸配列は、１つ又は複数の単独のアミノ酸置換、挿入又は欠失（たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個又はそれ以上の単独のアミノ酸置換、挿入又は欠失）以外、開始配列と同一であってもよい。いくつかの実施形態では、指定されたタンパク質から誘導されたポリペプチド又はアミノ酸配列は、この開始配列に対して、１～５個、１～１０個、１～１５個、又は１～２０個の単独のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有する。

【0018】

本明細書で使用される用語「組換えウイルス」又は「再構築ウイルス」は、たとえば、異種核酸構築体をウイルスのゲノムに付加又は挿入することによって、及び／又はウイルスのゲノムから内因性ポリヌクレオチドを欠失させることによって、遺伝的に改変されたウイルスを指す。本出願で使用される場合、この用語は、ＳＯＣＳ４タンパク質又はその機能的断片をコードする異種核酸配列断片を担持する組換え腫瘍溶解性ウイルス又は組換えウイルスベクターを指す。

【0019】

腫瘍溶解性ウイルス
本分野においては、多くの腫瘍溶解性ウイルスが知られ、記載されており、これらのいずれかが本発明に使用されることが考えられる。たとえば、適切な腫瘍溶解性ウイルスは、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、水疱性口炎ウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、牛痘ウイルス、及びこれらのウイルスの突然変異株を含む。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、複製選択的であるか、又は複製能を有する。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。

【0020】

いくつかの実施形態では、現在の方法及び組成物で使用可能な腫瘍溶解性ウイルスは複製選択的である。なお、腫瘍溶解性ウイルスの複製を遺伝子発現の調節因子（たとえば、アルブミン遺伝子の５’側から誘導されたエンハンサー／プロモーター領域）の制御下に置くと、腫瘍溶解性ウイルスを複製選択的にすることができる。たとえば、ＨＳＶ遺伝子をＴＧＦ-βプロモーターに作動可能に連結することにより、ＨＳＶの主要転写単位を腫瘍成長因子-β（ＴＧＦ-β）プロモーターの転写制御下に置くことができる。同じタイプの非腫瘍細胞に対してＴＧＦ-βを過剰発現する腫瘍細胞があることが知られている。したがって、ＴＧＦ-βプロモーターの転写によって複製が制御されている腫瘍溶解性ウイルスは、同じタイプの非腫瘍細胞よりも一部の腫瘍細胞内で複製され得ることから、複製選択的である。影響を受けた細胞において選択的に過剰発現を引き起こすことが知られている任意の遺伝子発現の調節因子を使用して、同様に複製選択的な腫瘍溶解性ウイルスを製造することができる。たとえば、複製選択的な腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＣＰ３４．５をコードする遺伝子が突然変異又は欠失されたＨＳＶ-１突然変異体であってもよい。

【0021】

本発明による腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノム中に他の修飾をさらに含むことができる。たとえば、Ｕ_Ｌ４４遺伝子に挿入された他のＤＮＡを含むことができる。この挿入によってＵ_Ｌ４４遺伝子の機能不活性化及び切断表現型の生成を発生させるか、又は不活性化された遺伝子に挿入するか又は欠失した遺伝子を置換することができる。

【0022】

腫瘍溶解性ウイルスにはまた、１つ又は複数のプロモーターを組み込むことができ、これらのプロモーターは、増強されたレベルの腫瘍細胞特異性をこのウイルスに付与する。このようにして、腫瘍細胞特異的プロモーターを用いて、腫瘍溶解性ウイルスを特定の腫瘍タイプに標的化することができる。「腫瘍細胞特異的プロモーター」又は「腫瘍細胞特異的転写調節配列」又は「腫瘍特異的プロモーター」又は「腫瘍特異的転写調節配列」という用語は、正常細胞と比較して標的腫瘍細胞中に高いレベルで存在する転写調節配列、プロモーター及び／又はエンハンサーを表す。たとえば、本発明に使用される腫瘍溶解性ウイルスは、外因的に付加された調節因子（たとえばテトラサイクリン）の制御下にあり得る。

【0023】

一実施形態では、本発明の腫瘍溶解性ウイルス（たとえば、ｏＨＳＶ）は、少なくとも１種のウイルス複製に必要なウイルスタンパク質を腫瘍特異的プロモーターの制御下に置くように操作される。又は、細胞傷害剤をコードする遺伝子（ウイルス遺伝子又は外因性遺伝子）を腫瘍特異的プロモーターの制御下に置いてもよい。本明細書で使用される場合、細胞傷害剤とは、細胞死を引き起こす任意のタンパク質を意味する。たとえば、リシン、ジフテリア毒素、又はそれらの切断形態を含む。プロドラッグ、サイトカイン又はケモカインをコードする遺伝子も含まれる。このような腫瘍溶解性ウイルスは、標的化された腫瘍において高度に発現されている遺伝子からのプロモーター、たとえば上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）又は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のプロモーター、又は腫瘍に関連する他のプロモーター又はエンハンサーエレメントを利用することができる。

【0024】

本発明に使用される腫瘍溶解性ウイルスの１つは腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）である。ｏＨＳＶは、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１つ又は複数をコードする１つ又は複数の外因性核酸を含む。このような外因性核酸を含むｏＨＳＶを生成する方法は、本分野において公知である。ｏＨＳＶゲノムにおける核酸の具体的な挿入位置は、当業者によって決定することができる。

【0025】

腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）は、本分野において公知であり、１型単純ヘルペスウイルス及び２型単純ヘルペスウイルスを含む。一実施形態では、本発明の方法、組成物、及びキットに使用されるｏＨＳＶは、複製選択的であるか、又は複製能を有するものであり、たとえば、本明細書に記載の一実施例が挙げられる。一実施形態では、ｏＨＳＶは複製能を有しない。

【0026】

その中でも、１型単純ヘルペスウイルス、たとえば、機能的ＩＣＰ３４．５を発現しないＨＳＶ-１ウイルスのバリアントは好ましいウイルスであり、したがって、対応する野生型よりも著しく低い神経毒性を示す。このようなバリアントには、ｏＨＳＶ-Ｒ３６１６が含まれるが、これに限定されるものではない。他の例示的なＨＳＶ-１ウイルスは、１７１６、Ｒ３６１６及びＲ４００９を含む。使用し得る複製選択性を有する他のＨＳＶ－１ウイルス株は、たとえばＲ４７Δ（タンパク質ＩＣＰ３４．５及びＩＣＰ４７をコードする遺伝子が欠失している）、Ｇ２０７（ＩＣＰ３４．５及びリボヌクレオチド還元酵素をコードする遺伝子が欠失している）、ＮＶ１０２０（ＵＬ２４、ＵＬ５６及び内部反復をコードする遺伝子が欠失している）、ＮＶ１０２３（ＵＬ２４、ＵＬ５６、ＩＣＰ４７及び内部反復をコードする遺伝子が欠失している）、３６１６-ＵＢ（ＩＣＰ３４．５及びウラシルＤＮＡグリコシラーゼをコードする遺伝子が欠失している）、Ｇ９２Δ（アルブミンプロモーター駆動に必要なＩＣＰ４遺伝子の転写）、ｈｒＲ３（リボヌクレオチド還元酵素をコードする遺伝子が欠失している）、Ｒ７０４１（Ｕｓ３遺伝子が欠失している）、及び機能的ＩＣＰ３４．５を発現しないＨＳＶ株を含む。

【0027】

本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるｏＨＳＶは、本明細書に記載のＨＳＶ-１突然変異株のうちの１つに限定されない。任意の単純ヘルペスウイルスの複製選択的株を使用することができる。本明細書に記載のＨＳＶ-１突然変異株に加えて、本分野では、複製選択性を有する他のＨＳＶ-１突然変異株も記載されている。さらに、本明細書に記載の方法及び組成物には、ＨＳＶ-２突然変異株、たとえばＨＳＶ-２株２７０１（ＲＬ遺伝子が欠失している）、Ｄｅｌｔａ ＲＲ（ＩＣＰ１０ＰＫ遺伝子が欠失している）、及びＦｕｓＯｎ－Ｈ２（ＩＣＰ１０ＰＫ遺伝子が欠失している）を使用することもできる。

【0028】

ＨＳＶの非ラボ株を単離して、本発明での使用に適したものとすることもできる。さらに、ＨＳＶ-２突然変異株（たとえば、ＨＳＶ-２株ＨＳＶ-２７０１、ＨＳＶ-２６１６及びＨＳＶ-２６０４）は本発明の方法に使用することができる。

【0029】

一実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含む組換えｏＨＳＶ-１であり、ここで、この外因性ポリヌクレオチド断片はｏＨＳＶ-１のＵ_Ｌ３とＵ_Ｌ４遺伝子の間に位置する。一実施形態では、組換えｏＨＳＶ-１はＦ株（ｏＨＳＶ-１（Ｆ））である。

【0030】

ウイルスベクター
本発明の一実施形態では、組換えウイルスはＳＯＣＳ４をコードするポリヌクレオチドを担持する組換えウイルスベクターである。ウイルスベクターはベクター、ベクターウイルス粒子又はベクター粒子と呼ぶこともできる。別の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス、又はバキュロウイルスから誘導される。本発明に使用される「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスから誘導された、ベクターであって、ポリヌクレオチド（たとえば、ＳＯＣＳ４又はそのバリアントをコードする）を正常細胞に送達し、該細胞内で該ポリヌクレオチドを発現させるためのベクターを指す。

【0031】

レトロウイルスベクターは、任意の適切なレトロウイルスから誘導することができる。多くの異なるレトロウイルスが同定されている。たとえば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、鳥類骨髄細胞腫ウイルス２９（ＭＣ２９）及び鳥類赤血球増加症ウイルス（ＡＥＶ）を含む。レトロウイルスはバブルウイルスから誘導されてもよい。

【0032】

レンチウイルスはより大きな集団のレトロウイルスの一部である。簡単に言えば、レンチウイルスは霊長類集団と非霊長類集団に分けられる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルス集団には、プロトタイプ「レンチウイルス」ビスナ／メディウイルス（ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ、ＶＭＶ）及び関連するヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。本明細書で使用されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターから誘導され得る少なくとも１つの構成要素を含むベクターである。好ましくは、この構成要素は、そのベクターを介した細胞の感染、遺伝子の発現、又は複製される生物学的機序に関与する。レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（たとえば、ＨＩＶ-１）又は非霊長類レンチウイルスに由来することができる。非霊長類レンチウイルスの例は、自然に霊長類に感染しないレンチウイルス科ファミリーの任意のメンバーであってもよく、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、メディビスナウイルス（ＭＶＶ）、又は馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むことができる。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、又はビスナレンチウイルスから誘導される。

【0033】

本発明の別の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであってもよい。アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を介して複製されない二本鎖線状ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡ無エンベロープウイルスであり、インビボ、エクスビボ、及びインビトロで一連のヒトと非ヒト由来の細胞タイプを形質導入することができる。これらの細胞には、気道上皮細胞、肝細胞、筋肉細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮細胞、及び有糸分裂後期の終末分化細胞（たとえばニューロン）が含まれる。アデノウイルスは、遺伝子治療及び異種遺伝子発現のためのベクターとして使用されてきた。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは、最大８ｋｂの外因性挿入ＤＮＡを収容することができ、相補的な細胞株内で効率的に複製して１ミリリットル当たり１０^１２個の形質導入単位までの非常に高い力価を生成することができる。したがって、アデノウイルスは初代非複製細胞における遺伝子発現を研究するのに最適なシステムの１つである。アデノウイルスゲノム由来のウイルス又は外因性遺伝子の発現は複製細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入る。一旦細胞内に入ると、アデノウイルスベクターが宿主染色体に組み込まれることはほとんどない。逆に、それらは（宿主ゲノムとは独立した）付加体として、宿主細胞核内に線形ゲノムの形で存在する。

【0034】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高い組み込み頻度を有し、非分裂細胞に感染することができるので、本発明で使用される魅力的なベクター系である。これにより、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は哺乳動物細胞への遺伝子の送達に用いられ得る。ＡＡＶは広い宿主範囲で感染性を有する。組換えＡＡＶベクターはすでに遺伝子の標識、及びヒト疾患に参与する遺伝子のインビトロ、エクスビボ及びインビボの形質導入に使用されている。大きなペイロード（最大８～９ｋｂ）を効果的に結合することができるいくつかのＡＡＶベクターが開発されている。このようなベクターは、ＡＡＶ５キャプシド及びＡＡＶ２ ＩＴＲを有する。

【0035】

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）はエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、天然にニューロンに感染することができる。外因性ＤＮＡの大部分を収容することができるので、魅力的なベクター系となり、ニューロンへの遺伝子の送達のベクターとして使用されている。治療手順でＨＳＶを使用するには、ウイルス株を弱毒化する必要があり、このため、溶解サイクルを確立することができない。特に、ＨＳＶベクターをヒトの遺伝子治療に用いる場合、必須遺伝子にポリヌクレオチドを挿入することが好ましい。これは、ウイルスベクターが野生型ウイルスに遭遇すると、組み換えにより野生型ウイルスに異種遺伝子を導入することができるからである。しかしながら、複製を防止するように組換えウイルスを構築する場合には、複製に必要なウイルス遺伝子にオリゴヌクレオチドを挿入することにより実現することができる。

【0036】

本発明のウイルスベクターは、牛痘ウイルスベクター、たとえばＭＶＡ又はＮＹＶＡＣであってもよい。牛痘ベクターの代替物には、ＡＬＶＡＣと呼ばれる鶏痘又はカナリア痘などのアビポックスベクター（ａｖｉｐｏｘ ｖｅｃｔｏｒ）、及び、ヒト細胞内で感染し、組換えタンパク質を発現することができるが複製することができない、アビポックスベクターに由来するウイルス株が含まれる。なお、組換え遺伝子が挿入された後も、ウイルスゲノムの一部は完全なままであってもよい。これは、ウイルスベクターが細胞を感染し、その後追加の遺伝子を発現する能力を保持し得る概念を意味し、この追加の遺伝子は、その複製をサポートし、感染細胞の溶解及び死を促進することができる。

【0037】

ＳＯＣＳ４、機能的断片及びバリアント
本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス又はウイルスベクターは、ＳＯＣＳ４又はその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、ウイルスゲノム中に発現可能な形態で組み込まれる。したがって、このウイルスは、ＳＯＣＳ４を感染細胞に送達するためのベクターとして使用される。本発明は、様々な形態のＳＯＣＳ４（たとえば、本明細書に記載の形態のＳＯＣＳ４）の使用を期待しており、様々な形態のＳＯＣＳ４は、ＳＯＣＳ４の機能的ドメイン又は治療的ＳＯＣＳ４ドメイン又は治療的ＳＯＣＳ４バリアント、ならびにそれらの断片、バリアント及び誘導体、これらの形態のＳＯＣＳ４（本明細書に記載のもの）の１つを含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。

【0038】

本明細書で使用される「ＳＯＣＳ４」という用語は、ＳＨ２ドメイン及びＳＯＣＳ ＢＯＸドメインを含むタンパク質であるサイトカインシグナル伝達阻害因子４を指す。したがって、このタンパク質はサイトカインシグナル伝達阻害因子（ＳＯＣＳ）に属し、ＳＴＡＴ誘導ＳＴＡＴ阻害剤（ＳＳＩ）タンパク質ファミリーとも呼ばれる。シグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を阻害することにより、ＳＯＣＳ４は免疫シグナル伝達を阻害することが知られているが、機能的ＳＯＣＳ４を欠乏したマウスはＡ型インフルエンザウイルスの原発性感染に対して非常に感受性が高く、肺部での炎症性サイトカイン産生の失調、ウイルス除去の遅延、及びインフルエンザ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の感染部位への輸送の損傷を示している。ＳＯＣＳ４の機能的断片／バリアント／誘導体とは、天然ＳＯＣＳ４と実質的に相同なポリペプチドを指すが、１つ又は複数の欠失、挿入又は置換により、天然ＳＯＣＳ４と異なるアミノ酸配列を有する。ＳＯＣＳ４の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００００１４．９を有するホモサピエンス由来である。

【0039】

本発明に使用される、ＳＯＣＳ４の所望の生物学的活性を保持する天然ＳＯＣＳ４タンパク質の断片、バリアント及び誘導体が、腫瘍溶解性ウイルス又はウイルスベクターを介して送達されることも期待される。一実施形態では、ＳＯＣＳ４の断片、バリアント又は誘導体の生物学的活性は、対応する天然ＳＯＣＳ４タンパク質の生物学的活性と実質的に等しい。一実施形態では、活性を決定するための生物学的活性は、サイトカインシグナル伝達を阻害する活性である。一実施形態では、断片、バリアント、又は誘導体によって１００％の活性が保持される。一実施形態では、完全長の天然ＳＯＣＳ４と比較して１００％未満の活性（たとえば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％）が保持される。

【0040】

たとえば、ＳＯＣＳ４バリアントは、天然ＳＯＣＳ４ヌクレオチド配列の１つ又は複数の付加、欠失、突然変異又は置換によって取得することができる。バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然ＳＯＣＳ４配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上同じであることが好ましい。たとえば、天然配列と突然変異配列との間の相同性の程度又は同一性の百分率を決定するために、この目的のために一般的にワールドワイドウェブ上で使用されている無料のコンピュータプログラムを使用して、２つの配列を比較することができる。

【0041】

天然アミノ酸配列の変化は、当業者に知られている多くの公知技術のいずれかによって行うことができる。たとえば、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に突然変異を導入することができ、前記オリゴヌクレオチドの両側が天然配列の断片と連結可能な制限部位である。連結後、生成された再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換又は欠失を有するアナログをコードする。又は、必要な置換、欠失又は挿入に応じて変化する特定のコドンを有する、変化したヌクレオチド配列を提供するために、オリゴヌクレオチド指向性の部位特異的な突然変異形成方法を採用することができる。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＳＯＣＳ４バリアントは保存的に置換された配列を含むことができ、これは、天然ＳＯＣＳ４ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基が異なる残基で置換され、保存的に置換されたＳＯＣＳ４ポリペプチドが天然ＳＯＣＳ４ポリペプチドの生物学的活性と実質的に同等の所望の生物学的活性を保持することを意味する。保存的置換の例としては、ＳＯＣＳ４の二次構造及び／又は三次構造を変化させないアミノ酸の置換が含まれる。

【0043】

その他の核酸
ＳＯＣＳ４核酸を含む組換え腫瘍溶解性ウイルス又はウイルスベクターは、本明細書では第２の異種核酸配列、第３の異種核酸配列などと称される追加の異種核酸配列（たとえば、発現可能な形態で）をさらに含むことができる。あるいは、組換え腫瘍溶解性ウイルス又はウイルスベクターは、追加の異種核酸配列を含まなくてもよい。

【0044】

任意の所望のＤＮＡを挿入することができ、これには、選択的マーカーをコードするＤＮＡ、好ましくは治療的で生物学的に活性なタンパク質（たとえば、インターフェロン、サイトカイン、ケモカイン）をコードする遺伝子、又はより好ましくはプロドラッグ変換酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ｃｙｐ４５０、及びその他を含む）をコードするＤＮＡが含まれる。一実施形態では、核酸は、腫瘍の成長を阻害するタンパク質（たとえば、化学療法剤、成長調節剤）、又は免疫応答を修飾するタンパク質をコードする。化学療法剤の例としては、マイトマイシンＣが挙げられる。一実施形態では、核酸は、成長調節分子（たとえば、腫瘍の腫瘍発生において失われたもの）をコードする。このような分子の例は、カスパーゼファミリー由来のタンパク質、たとえばカスパーゼ-９（Ｐ５５２１１（ＣＡＳＰ９＿ＨＵＭＡＮ）； ＨＧＮＣ： １５１１１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ８４２２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００１３２９０６７； ＯＭＩＭ： ６０２２３４５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｐ５５２１１３）、カスパーゼ-８（Ｑ１４７９０ （ＣＡＳＰ８＿ＨＵＭＡＮ）； ９６０６ ［ＮＣＢＩ］）、カスパーゼ-７（Ｐ５５２１０ （ＣＡＳＰ７＿ＨＵＭＡＮ）； ９６０６ ［ＮＣＢＩ］）及びカスパーゼ-３（ＨＣＧＮ： １５０４； Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６４３０５； ＨＰＲＤ：０２７９９； ＭＩＭ：６００６３６； Ｖｅｇａ：ＯＴＴＨＵＭＧ０００００１３３６８１）；アポトーシス促進タンパク質、たとえば、Ｂａｘ（ＨＧＮＣ： ９５９１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５８１２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ００００００８７０８８７； ＯＭＩＭ： ６０００４０５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ０７８１２３）、Ｂｉｄ（ＨＧＮＣ： １０５０１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ６３７２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ００００００１５４７５７； ＯＭＩＭ： ６０１９９７５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｐ５５９５７３）、Ｂａｄ（ＨＧＮＣ： ９３６１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５７２２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００００２３３０７； ＯＭＩＭ： ６０３１６７５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ９２９３４）、Ｂａｋ（ＨＧＮＣ： ９４９１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５７８２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ００００００３０１１０７； ＯＭＩＭ： ６００５１６５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ１６６１１３）、ＢＣＬ２Ｌ１１（ＨＧＮＣ： ９９４１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： １００１８２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００１５３０９４７； ＯＭＩＭ： ６０３８２７５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： ０４３５２１３）、ｐ５３（ＨＧＮＣ： １１９９８１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ７１５７２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００１４１５１０７； ＯＭＩＭ： １９１１７０５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｐ０４６３７３）、ＰＵＭＡ （ＨＧＮＣ： １７８６８１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ２７１１３２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００１０５３２７７； ＯＭＩＭ： ６０５８５４５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ９６ＰＧ８３； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ９ＢＸＨ１３）、Ｄｉａｂｌｏ／ＳＭＡＣ（ＨＧＮＣ： ２１５２８１； Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ： ５６６１６２； Ｅｎｓｅｍｂｌ： ＥＮＳＧ０００００１８４０４７７； ＯＭＩＭ： ６０５２１９５； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ｑ９ＮＲ２８３）に制限されない。一実施形態では、核酸は、Ｆｌｔ-３リガンド、ＨＭＢＧ１、カルシニューリン、ＧＩＴＲリガンド、インターロイキン-１２、インターロイキン-１５、インターロイキン１８、又はＣＣＬ１７を含むがこれらに限定されない免疫調節剤（たとえば、免疫刺激性導入遺伝子）をコードする。

【0045】

当業者は、腫瘍溶解性ウイルスに外因性核酸を挿入することができる。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはＨＳＶであり、外因性核酸がウイルスゲノムのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に挿入されるか、又は欠失したＴＫ遺伝子に置換される。腫瘍溶解性ウイルスが第２の外因性核酸を含む場合、該核酸は抗癌遺伝子又は腫瘍溶解性遺伝子産物をコードすることが好ましい。遺伝子産物は、ウイルスに感染された細胞の成長又は複製のみを阻害する産物（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）であってもよく、又はウイルスに感染された細胞を溶解する際に顕著なオブザーバー効果を発揮する産物（たとえばチミジンキナーゼ）であってもよい。

【0046】

組成物
本発明の別の態様は、治療有効量の組換えウイルス及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、対象において腫瘍を治療する、又は腫瘍溶解性腫瘍療法又は抗ウイルス治療の副作用を解消又は低減するためのものである。組換えウイルスは、適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤中で製造することができる。これらの製剤は、通常の保存及び使用の条件下で、微生物の成長を防止するために防腐剤を含むことができる。注射用途に適した薬物形態は、無菌水溶液又は分散液と、無菌注射液又は分散液を一時的に製造するための無菌粉末とを含む。いずれの場合も、この形態は無菌でなければならず、注射を容易にするために流体でなければならない。生産及び保存の条件下で安定していなければならず、微生物（たとえば、細菌や真菌）による汚染から保護されていなければならない。

【0047】

担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適度な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングを用いること、分散液の場合は所望の粒径を維持すること、界面活性剤を用いることなどにより維持することができる。微生物の作用は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、メルチオレートなどの各種抗菌剤や抗真菌剤によって予防することができる。多くの場合、糖や塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収は、組成物に吸収遅延剤（たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによって延長され得る。

【0048】

水溶液中での非経口投与の場合、たとえば、溶液は、溶液を適切に緩衝し（必要に応じて）、まず、十分な塩水又はブドウ糖で液体希釈剤を等張する必要がある。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、及び腹膜内投与に特に適している。この点に関して、本開示によれば、使用し得る無菌水性媒体は当業者に周知のものである。たとえば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解するか、皮下灌流液１０００ｍＬに加えるか、又は推薦された注入部位に注射することができる。用量は、治療対象の状況によっては必ず何らかの変化が生じる。いずれの場合も、投与担当者は、個々の対象の適切な用量を決定しなければならない。さらに、人体投与の場合、製剤はＦＤＡ生物製品基準が要求する無菌性、発熱性、一般安全性、及び純度基準に合致しなければならない。

【0049】

注射可能な無菌溶液は、活性化合物を所望の量で上記に挙げられた各成分と共に適当な溶媒中に混合した後、濾過滅菌することにより製造される。通常、分散液は、基本分散媒及び上記に挙げられたものからの所望の他の成分を含む無菌担体中に、滅菌された様々な活性成分を混合することによって製造される。無菌注射溶液を製造するための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、その前の無菌濾過溶液から活性成分及び任意の他の所望の成分の粉末を製造する真空乾燥、及び凍結乾燥技術である。

【0050】

本明細書で使用される「担体」には、すべての溶媒、分散媒、担体、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。薬物活性物質におけるそのような媒体及び試薬の用途は、本分野において公知である。いずれかの従来の媒体又は試薬が活性成分と非相溶性でない限り、治療用組成物におけるその用途が期待される。補充された活性成分も、組成物中に混合されていてもよい。

【0051】

「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与された場合にアレルギー又は類似の副作用を生じない分子実体及び成分を指す。タンパク質を活性成分として含有する水性組成物の製造は、本分野において十分に理解されている。通常、このような組成物は、注射剤、又は液体溶液又は懸濁液に製造され、また、注射前に液体中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態に製造され得る。

【0052】

治療法
本発明の別の態様は、対象において増殖性障害を治療する方法に関する。この方法は、本明細書に記載のＳＯＣＳ４核酸配列を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することによって、望ましくない増殖を示す細胞を有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む。

【0053】

一実施形態では、この増殖性疾患は腫瘍であり、本発明の方法は腫瘍の進行を阻害する方法に関する。有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍と接触させて、該ウイルスを腫瘍細胞に送達する。「腫瘍」又は「癌」という用語は、制御されていない増殖をしている組織塊又は組織のタイプ又は細胞のタイプを指す。本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、制御されずに成長する（すなわち、過剰増殖性疾患）形質転換された細胞を含む悪性組織を指す。腫瘍は白血病、リンパ腫、骨髄腫、形質細胞腫など、及び固形腫瘍を含む。本発明にしたがって治療することができる固形腫瘍の例には、肉腫及び癌が含まれるが、これらに限定されるものではなく、前記肉腫及び癌は、たとえば、メラノーマ、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管腺肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｔｕｍｏｒ）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精原細胞腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ）、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経グリオーマ、星細胞腫、神経芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫、心室管膜腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫である。

【0054】

副作用を解消又は低減する方法
本発明の別の態様は、対象において腫瘍溶解性ウイルス療法の副作用を低減又は解消するための方法に関し、この方法は、治療有効量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを該対象に投与することを含み、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦癌細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又はその機能的断片を発現する。

【0055】

いくつかの実施形態では、副作用はサイトカインの過剰産生であり、本明細書ではサイトカインストームとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＭＣＰ-１、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α、及びＩＦＮ-γのいずれか１つ又は複数である。いくつかの実施形態では、サイトカインの過剰産生の臨床症候群又は結果は肺組織損傷である。いくつかの実施形態では、肺組織損傷は、細胞浸潤、軽度から中等度の拡張、局所毛細血管充血、肺胞壁の肥厚、肺胞壁の破裂、肺胞壁周囲の充血、及び満たしている免疫細胞のいずれか１つ又は複数の特徴であることが示されている。

【0056】

本発明の別の態様は、対象において微生物感染治療の副作用を低減又は解消する方法に関する。この方法は、治療有効量の組換えウイルスを該対象に投与することを含み、該組換えウイルスは、サイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）又はその機能的断片をコードする外因性ポリヌクレオチド断片を含み、一旦細胞内で複製されると、ＳＯＣＳ４又はその機能的断片を発現する。いくつかの実施形態では、微生物感染は、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染のいずれか１種である。

【0057】

いくつかの実施形態では、副作用はサイトカインの過剰産生であり、本明細書ではサイトカインストームとも呼ばれる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＭＣＰ-１、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α、及びＩＦＮ-γのいずれか１つ又は複数である。いくつかの実施形態では、サイトカインの過剰産生の臨床症候群又は結果は肺組織損傷である。いくつかの実施形態では、肺組織損傷は、細胞浸潤、軽度から中等度の拡張、局所毛細血管充血、肺胞壁の肥厚、肺胞壁の破裂、肺胞壁周囲の充血、及び満たしている免疫細胞のいずれか１つ又は複数の特徴であることが示されている。

【0058】

実施例
材料及び方法
動物：６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは広東省実験動物センターから購入し、微生物病原体なしで、広州医科大学動物センターで飼育した。マウスに関するすべての手順は、広州医科大学動物保護及び使用委員会により承認されている。

【0059】

細胞及びウイルス株：Ｖｅｒｏ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られ、そしてＤＭＥＭ（高糖）で培養し、ここでＤＭＥＭ（高糖）には５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）又は５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の新生ウシ血清（ＮＢＣＳ）がそれぞれ補充された。我々の研究室で使用されているプロトタイプＨＳＶ-１ウイルス株ＨＳＶ-１（Ｆ）は、Ｖｅｒｏ細胞上で増殖され、滴定された。ホモサピエンスのサイトカインシグナル伝達阻害因子４（ＳＯＣＳ４）ｍＲＮＡを有するｐＲｅｖｅｉｖｅｒ－Ｍ０２は、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ Ｉｎｃ．から購入されたものである。

【0060】

ＳＯＣＳ４を発現するＨＳＶ組換えウイルスの構築：ホモサピエンスのＳＯＣＳ４遺伝子配列に基づいて２つのオリゴヌクレオチドプライマー：順方向、５’－ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＧ－３’（Ａｃｃ Ｉ部位及び下線が引かれたシグナルペプチドＨｍｍ３８を有する）；逆方向、５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣ－３’（Ｎｏｔ Ｉ部位を有する）を設計した。９５℃で１分間の変性ステップ、５８℃で３０秒間のプライマーアニールステップ、７２℃で２分間のプライマー伸長ステップからなるＰＣＲサイクルを、全反応体積５０μＬで３０サイクル行った。ＳＯＣＳ４のＰＣＲ産物をＴ-ｅａｓｙプラスミドに連結し、ＸＬ-１ｂｌｕｅ細胞に形質転換してシークエンシングに送って確認した。確認されたＳＯＣＳ４遺伝子をＴ－ｅａｓｙプラスミドから切り取り、Ｃｌａ Ｉ／Ａｃｃ ＩとＮｏｔ Ｉの部位でベクターｐＮＥＷＵＬ骨格に連結し（図１Ａ）、次に、ｐＮＥＷＵＬからＢｇｌＩＩとＰａｃＩの間の配列（ＵＬ３、ＵＬ４、及びＳＯＣＳ４を含む）を切断し、同じ部位でプラスミドＰｋｏ５．１にクローニングした（図１Ｂ）。組換えプラスミドをＢＡＣに形質変換し、クロラムフェニコール及びブレオマイシン（ｚｅｏｃｉｎ）を有するＬＢプレート上に４３℃で一晩培養した後、細菌クローンを選択してクロラムフェニコール及びショ糖を有するＬＢプレート上に３０℃で一晩濃縮してプラスミドＰｋｏ５．１を切り取った。ＳＯＣＳ４遺伝子のＰＣＲによる同定後、陽性組換えＢＡＣを培養して増殖させた後、Ｌｉｐｏｅｃｔａｍｉｎｅ^（Ｒ）ＬＴＸ及びＰＬＵＳを用いて、製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の取扱書にしたがってＶｅｒｏ細胞に形質変換した。ウイルス細胞変性効果を示すまで細胞をインキュベートした。ウイルスプラーク（Ｖｉｒａｌ ｐｌａｑｕｅ）をミルク１ｍＬに収集し、凍結融解（－８０℃と３７℃）を３回行い、ウイルスを放出した。ウイルスをＶｅｒｏ細胞（ＰＤ）２５ｃｍに接種して培養し、ＤＮＡを抽出してＰＣＲを行い、最終確認（ＵＬ３、ＵＬ４、及びＳＯＣＳ４遺伝子を含む）に用いた。所望のウイルスをＨＳＶ-ＳＯＣＳ４と命名し、収穫して-８０℃で保存し、さらなる使用に備えた。

【0061】

マウス感染：ＢＡＬＢ／ｃマウスをランダムに３群に分け、１群はＨＳＶ-１（Ｆ）で感染し、１群はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４で感染し、１群はＰＢＳで模擬感染とした。詳しくは、マウスを１匹ずつ軽度麻酔した後、鼻内経路で１０^６ ＰＦＵのＨＳＶ-１（Ｆ）又はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４のＰＢＳ溶液３０μＬ又はＰＢＳ３０μＬのみで感染した。感染後、マウスの体重を毎日量り、その発症率と死亡率を１２日間持続して監視した。

【0062】

血清と気管支肺胞洗浄液サンプルの収集及びダブルサンドイッチＥＬＩＳＡ：感染後１日目、３日目、及び７日目に各マウスからの眼窩血を収集し、血清を分離した後、-２０℃で保存して、後のＥＬＩＳＡアッセイに用いた。出血後、マウスを殺し、気管に挿入された鈍針を介してＰＢＳ １ｍＬで肺を３回洗浄し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集した。サンプルを遠心分離した後、上澄み液を除去してＥＬＩＳＡアッセイに用い、同じ群の２匹のマウスの細胞を組み合わせることにより、フローサイトメトリー解析に十分な細胞を得た。ＢＡＬＦ及び血清サンプルについて、ＭＣＰ-１、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α及びＩＦＮ-γを含むサイトカイン群をダブルサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。各種類のサイトカインの濃度を、製造元（Ｄａｋｅｗｅ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）の取扱書にしたがって、検量線に対して決定した。

【0063】

細胞分離及びフローサイトメトリー解析：ＢＡＬＦから取得した細胞をＴｒｉｓ－ＮＨ_４Ｃｌで処理して赤血球を溶解し、その後、２回洗浄し、冷ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁させた。殺されたマウスからの脾臓を切除し、十分に粉砕し、無菌金網を介して組織を洗浄した。脾臓細胞の懸濁液を収集し、赤血球を溶解した後、細胞を洗浄して再懸濁させた。ＢＡＬＦ細胞と脾臓細胞をカウントし、２×１０^６個細胞／ｍＬに調節した。細胞を洗浄して表面マーカーとして、脾臓細胞用のＡＰＣ-ＣＤ４（ＡＰＣ抗マウスＣＤ４ ｍＡｂ、クローンＧＫ１．５）、ＦＩＴＣ-ＣＤ８ａ（ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ８ ｍＡｂ、クローン５３-６．７）、及びＰＥ－ＣＤ６２Ｌ（ＰＥ抗マウスＣＤ６２Ｌ ｍＡｂ、クローンＭＥＬ－１４）、並びに、ＢＡＬＦ細胞用のＰＢ-ＣＤ１１ｂ（ＰＢ抗マウスＣＤ１１ｂ ｍＡｂ、クローンＭ１／７０）で染色した。すべての細胞を１０分間染色し、洗浄して２％ホルムアルデヒド－ＰＢＳに再懸濁させ、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）及びＣｙｔＥｘｐｅｒｔ ２．０ソフトウェア上でフローサイトメトリー解析を行った。

【0064】

ウイルス力価解析及び病理学的解析用の肺サンプル：血液を収集して殺した後、各群の２匹のマウスの肺を直接摘出し、細胞培地で完全に細断し、組織ホモジネートを収集し、遠心分離して上澄み液を収集してウイルス力価解析に用いた。Ｖｅｒｏ細胞を、２×１０^５個／ウェルで細胞が９０％の単層を形成するまで６ウェルプレート上に成長させた後、上澄み液サンプルを添加した。２４時間インキュベートした後、慎重に細胞を除去し、遠心分離し、細胞塊をミルク１ｍＬに重懸濁させ、－８０℃で保存した。上記の３回の凍結融解処理後、放出されたウイルスサンプルを１％ＮＢＣＳで、それぞれ１：１００、１：１０００、及び１：１００００に希釈した。６ウェルプレート上のＶｅｒｏ単層細胞に各希釈液１００μＬを加えて２時間培養した後、培地を新しい培地（ＢＭＥ＋１％ＮＢＣＳ＋０．５％ＩｇＧ）に交換し、さらに７２時間インキュベートした。その後、細胞を収集し、０．０３％メチレンブルーで染色してプラークを定量化した。ＨＳＶ-１（Ｆ）感染、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４感染マウスのマウス肺（ｎ＝２、ＢＡＬＦ未収集）の病理解析を広州医科大学病理学部門で行った。

【0065】

結果及び検討
ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４組換えウイルスの構築
ＳＯＣＳ４遺伝子挿入断片を用いて新しいＨＳＶ-１株を再構築し、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４と命名し、ＳＯＣＳ４タンパク質の発現を証明することに成功し、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４を鼻内感染マウスに用いて、サイトカインストームに対するＨＳＶ-ＳＯＣＳ４の作用を評価した。ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４ウイルスを再構築するために、ＳＯＣＳ４遺伝子をＢＡＣに挿入した。ＳＯＣＳ４遺伝子のＰＣＲ産物とシークエンシング同定のいずれによっても、この組換え体が確認された。図２Ａは、ｐＲｅｖｅｉｖｅｒ－Ｍ０２からのＳＯＣＳ４（１３９７ｂｐ）のＰＣＲ産物を示し、図２Ｂに示すように、最後のＰＣＲは、ＵＬ２（１４９２ｂｐ）、ＵＬ３（１３１９ｂｐ）、及びＳＯＣＳ４（１３９７ｂｐ）の断片を含むことを確認した。

【0066】

ウイルス感染後のＢＡＬＦ及び血清中のサイトカイン産量
肺に灌流されたサイトカインは血流に入ることができるので、局所的な反応と全身的な反応との間の直接的な交流を提供でき、そのため、感染後１日目、３日目、及び７日目にＢＡＬＦと血清サンプルを収集し、サイトカインストームの核心にあるいくつかのサイトカインを検出した。

【0067】

サイトカイン分泌におけるＳＯＣＳ４タンパク質の作用を解析するために、ＰＢＳ又はＨＳＶ-１（Ｆ）又はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４ウイルスで感染したマウスからの、感染後１日目、３日目、及び７日目のＢＡＬＦと血清中の主要な炎症サイトカイン（たとえばＭＣＰ-１、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、ＴＮＦ-α、及びＩＦＮ-γ）マップを解析した。検査の各時点で、模擬マウスはＢＡＬＦ又は血清中に評価可能な量のサイトカインを誘導しなかった。ＢＡＬＦサンプル中のサイトカイン産量の結果を図３に示す。１日目、３日目、７日目に、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスからのサイトカインのレベルと比較して、２群間で無視できる差しか示さなかった７日目のＩＬ-１β産量を除き、ＨＳＶ-１（Ｆ）感染マウスからの５種類のすべてのサイトカインには有意により高レベルが観察された。ＨＳＶ-１（Ｆ）感染マウスにおけるＩＬ-１β産量の上昇-下降傾向曲線を見出し、７日目には約５０％まで急速に低下した（図３ｂ）。ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＩＬ-６とＩＦＮ-γの産量は増加傾向にあり、前者は７日目、後者は３日目に増加した。ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスでは１日目と３日目に最高のＭＣＰ-１レベルが検出され、その後７日目に低下した。１日目にも最も高いＴＮＦ-αレベルが観察されたが、３日目には低下した。興味深いことに、解析された時点には、７日目にＩＬ-６が有意に増加したことに加えて、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４感染マウスからのＢＡＬＦのサイトカイン分泌が安定しており、差がわずかしかなかった。

【0068】

体循環中のサイトカイン産量に対するＳＯＣＳ４タンパク質の影響を分析するために、マウス血清を収集してＥＬＩＳＡを行い、その結果を図４に示す。１日目には、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスで検出されたＭＣＰ-１の濃度と比較して、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスでは有意により高濃度のＭＣＰ-１が検出され、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスでは産量が連続的に低下したが、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは７日目にのみ低下した。さらに、２群の各日の時点に、ＢＡＬＦ中のＭＣＰ-１レベルは血清中のＭＣＰ-１レベルよりもはるかに高かった。ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、ＩＬ-１β値は１日目と３日目で類似していたが、７日目にＨＳＶ-１（Ｆ）マウスでは激しい上昇が検出された。そのため、この２群の間には有意差があった。１日目と３日目にＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのこの値がＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスの値よりも高かった以外、ＴＮＦ-α産生においても類似の増幅パターンが観察された。１日目、３日目、及び７日目には、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスではＩＬ-６レベルの上昇が持続的に検出されたが、７日目にのみＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスのレベルの増加が認められ、測定した毎日、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＩＬ-６レベルはＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスのＩＬ-６レベルよりもはるかに高かった。その結果から明らかなように、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、１日目と３日目にＩＦＮ-γの差の増加は軽微であったが、７日目には顕著になった。７日目の血清中のＩＦＮ-γ濃度はＢＡＬＦ中のＩＦＮ-γ濃度よりも高く、このことから、活性化されたＴ細胞がＩＦＮ-γ産生の主な源となることが確認された。ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４マウスの血清中のサイトカイン産量をさらに評価するために、１２日目にサイトカインレベルを測定したが、有意差は認められなかった（データは示されていない）。要するに、ＢＡＬＦでは、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４感染マウスのサイトカイン産量は各時点でほぼ一致していたが、血清では、多様性が示された。

【0069】

ＩＬ-１βは主にＤＣとマクロファージから産生され、炎症促進活性を駆動するキーサイトカインである。感染初期に発生する場合、回復を促進し、しかし、感染の後期に発生する場合、重篤な発症機序や死亡率をもたらす破壊的炎症反応と関連する。ＢＡＬＦサンプルではＩＬ-１βは初期（１日目と３日目）に高いレベルに維持され、その後７日目に分解を示すことを発見し、逆には、７日目にＨＳＶ-１（Ｆ）マウスでは、血清中の産量が増加した。しかし、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、すべての時点でＢＡＬＦと血清のＩＬ-１βはかなり低いレベルに維持されていた。これらのデータから明らかなように、ＳＯＣＳ４タンパク質は初期のＢＡＬＦ中のＩＬ-１β産量及び後期の血清中の産量を抑えることができる。

【0070】

ＩＬ-１とＩＬ-６の作用は相乗的であり、ＩＬ-１は主に感染初期に発現し、その後ＩＬ-６の発現が増加する。ＨＳＶ感染部位におけるＢＡＬＦ中のＩＬ-６産生は報告されており、我々の結果と一致しており、つまり、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＢＡＬＦ中のＩＬ-６レベルの激しい上昇は明らかであり、その後、特に７日目に、持続的に増加し、比較的低濃度の血清でも同様の増加を示した。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、ＩＬ-６レベルはＢＡＬＦ、血清ともに有意に制限され、７日目に上昇を伴った。ある意味では、ＩＬ-６の後期の大量生産はウイルスの存在とは無関係であり、Ｔｈ２反応の促進につながる可能性がある。

【0071】

もう１つの重要な急性反応サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ-α）は主にマクロファージ、肺上皮細胞、及びヘルパーＴ細胞から産生し、感染後の初期に出現し得る。ＴＮＦ-αはＨ５Ｎ１ウイルス感染後の重篤な疾患の症状を促進し、サイトカインストームの典型的な特徴を表し、ＨＳＶ感染に関連する免疫病理学にも関与している。感染後の初期にウイルスとマクロファージ及びＮＫ細胞との相互作用により、ＴＮＦ-αは先天性免疫系から放出され（たとえば、測定における１日目のＢＡＬＦ中の有意に高いレベル）、また、ウイルス特異的ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することにより、適応免疫系から放出され、たとえば、７日目のＨＳＶ-１（Ｆ）マウスからの血清中のＴＮＦ-αレベルの増加が観察された。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４に感染したマウスのＴＮＦ-αレベルの変化は、ＢＡＬＦ及び血清サンプルでは、毎日の時点で区別できなかった。報告によれば、抗ＴＮＦ治療はＨ３Ｎ２ウイルス攻撃後の体重減少と疾患の重症度を低減させることができ、それは、ＴＮＦが将来性のある治療的標的である可能性があることを示しており、阻害されたＴＮＦ産生はＨＶＳ感染による症状を軽減することもできると推定されている。

【0072】

単球走化性タンパク質-１（ＭＣＰ-１）は、主に炎症刺激と組織損傷後の単球、マクロファージ、上皮細胞、及び内皮細胞である複数タイプの細胞から迅速に産生される。単球走化性タンパク質-１（ＭＣＰ-１）は単球、メモリＴ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞を組織損傷や感染の部位まで募集し、しかも、通常、炎症期間内に組織で発現される。ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスから初期のＢＡＬＦでＭＣＰ-１の有意に高いレベルを観察し、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＢＡＬＦサンプルでより多くのＣＤ１１ｂ＋細胞が発見されたことを示した。

【0073】

ＩＦＮ-γは、ＤＣやマクロファージの活性化促進、ＮＫ細胞の細胞毒性増強、Ｂ細胞の抗体産生誘導など、様々な機能を有する強力なサイトカインである。ＨＳＶ-１（Ｆ）に感染したマウスでは、３日目に示されたＢＡＬＦ中の増加したＩＦＮ-γレベルは、主に感染初期のＮＫ細胞によって産生された可能性があり、また、ウイルスの複製を制御するのに役立ち、２群のマウスからの血清中には、後期（７日目）レベルが上昇したのは、Ｔ細胞がＩＦＮ-γの主要な源となったためであるが、後期反応では、ＩＦＮ-γのいくつかの活性は炎症と肺損傷に関連している。さらに、肺組織にウイルスが認められなかった場合、１２日目にＨＳＶ-ＳＯＣＳ４に感染したマウスの血清サンプルでは、ＩＦＮ-γの延長した無差別な産生が観察され、これは、他のサイトカインや免疫応答の特徴により下流でＩＦＮ-γが誘導され、ＳＯＣＳ４タンパク質がこの血清中のこのような延長した産生を阻害することを確認した。炎症性サイトカインは細胞活性化と組織損傷を担当し、さらに、１種のサイトカインの放出は新たなサイトカインの産生を誘導し、その結果、細胞と器官の壊死をさらに引き起こす。ＨＳＶ-１（Ｆ）に感染したマウスと比較して、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、ＢＡＬＦ及び血清中の炎症性サイトカイン産量の安定した低レベルはマウスの肺損傷の軽減に関連していると考えられた。

【0074】

ウイルスによる鼻内感染後のＢＡＬＦ及び脾臓の細胞解析
ＢＡＬＦと血清中のサイトカインのレベルの違いが免疫細胞の数に関係しているか否かを調べるために、ＢＡＬＦから細胞を収集し、感染したマウスから脾臓を収集してフローサイトメトリー解析を行った。１日目と７日目にサイトカイン産量の差が明らかになったので、１日目と７日目から細胞を収集して比較した。マクロファージ、好中球、及びＮＫ細胞を含むＣＤ１１ｂ陽性細胞がＢＡＬＦに存在する主要な細胞集団を構成していることを考慮し、ＨＳＶ-１（Ｆ）に感染したマウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４に感染したマウスとの間のＣＤ１１ｂ＋細胞数の変化を解析するようにした。その結果から明らかなように、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスからのＣＤ１１ｂ＋細胞はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスからのＣＤ１１ｂ＋細胞よりも優れており、２群では、７日目よりも１日目に染色された陽性細胞が多かった（図５）。脾臓からのＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方を染色し、ＣＤ６２Ｌを活性化マーカーとして使用した。図６に示すように、２群のマウスでは、１日目に二重陽性細胞はほとんどなかったが、７日目に有意に増加したＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞が検出され、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間で陽性細胞数の差が有意であった。ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞にも同様のパターンが観察された（図６）。

【0075】

１日目には、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＢＡＬＦに優勢な数のＣＤ１１ｂ＋細胞（マクロファージ、単球、好中球、及びＮＫ細胞を含む）が認められ、これは、ＢＡＬＦ中で高いＭＣＰ-１レベルの結果であった。報告によれば、炎症性サイトカインの一次波を迅速に分泌することにより、マクロファージは肺内でＨＳＶに対する第１の防御線において重要な役割を果たし、これは、１日目にＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＢＡＬＦ中のＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、及びＩＬ-６の産量増加を解釈しており、つまり、初期反応時にマクロファージとＮＫ細胞がこれらのサイトカインの主要な源であるからである。肺及び肺胞腔へのマクロファージの募集は初期免疫応答のマーカーであり、脾臓のＣＤ４とＣＤ８ Ｔ細胞は適応免疫応答の活性を反映することができる。ＣＤ６２Ｌは通常、Ｔ細胞の活性化マーカーとして使用され、リンパ球を感染や炎症の部位に導く点で主要な作用を果たす。１日目には、２群の脾臓ともに活性化Ｔ細胞は認められなかったが、７日目には細胞が有意に大きく活性化され、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスのＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はすべてＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスより２倍高く、これは、７日目にＨＳＶ-１（Ｆ）マウスの血清中で上昇したＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、及びＩＦＮ-γのレベルと密接に関連している。サイトカインの産生及び／又は感染細胞の直接溶解を介して、影響を受けたＴｈ細胞及びＣＴＬはウイルス感染の効果的な解決に不可欠であるが、これらの同じ機序は肺損傷にも寄与する。いくつかの報告から明らかなように、インフルエンザに感染したマウスでは、急性肺損傷（ＡＬＩ）は肺胞環境におけるサイトカインストームと直接関連している。

【0076】

ウイルス力価及び肺部の病理学的変化
サイトカインとウイルス複製／除去との相関性を評価するために、感染マウス肺からのウイルス力価を定量化した。１日目には、最大ウイルス力価が観察されたが、その後大幅に低下し、７日目には、ウイルスが検出されず、さらに、３日目には、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間でウイルス除去率に有意差が見られた（図７Ａ）。ＢＡＬＦを収集していないマウスの肺を組織病理学的に解析し、典型的な２００倍写真を図７Ｂに示す。１日目には、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスでは、肺の病理学的変化はほとんどなかった。しかし、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスの肺部には有意な細胞浸潤を示し、局所毛細血管の軽微な拡張と充血を伴っていた。７日目には、ＨＳＶ－ＳＯＣＳ４に感染したマウスの肺にはいくつかの免疫細胞の浸潤、及び毛細血管の軽度から中等度の拡張と充血が観察されたが、肺胞壁の構造は破裂しなかった。ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスの肺部には、重篤な病理学的変化が見られ、つまり、肺胞壁は厚くなって破裂し、周囲は厳重に充血し、免疫細胞が満たされている。

【0077】

その結果から明らかなように、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスとＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスとの間で、１日目には、肺におけるウイルス力価は類似していたが、３日目に低下し、２群の間で有意な差が検出された。この迅速なウイルス除去は先天性免疫機構と一致し、大量の免疫細胞の活性化（１日目にフローサイトメトリー及び病理学的解析により観察されたような）のため、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスの肺からウイルス量の低下が検出された。通常、溶解性感染は７日目に停止するため、ウイルスは検出されない。ＨＳＶ-１（Ｆ）感染後、７日目には、マウスのサイトカインのレベルとＴ細胞の増加と一致するように、マウス肺の重篤な病理学的変化が観察された。

【0078】

ＨＳＶ-１（Ｆ）又はＨＳＶ-ＳＯＣＳ４による鼻内感染後のマウスの体重及び死亡率
鼻内経路で感染した後、体重と発症死亡率（ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）を確認するために、すべてのマウスを１日に２回、１２日間検出した。ＨＳＶ-１（Ｆ）に感染したマウスは、２日目から体重が徐々に減少し始め、７日目にはその減少が急激になり、最後に生存したマウスは１０日目に５０％体重が減少し（図８Ａ）、それと同様に、生存率の百分率は７日目から減少し始め（図８Ｂ）、その後、マウスは急速に死亡したが、１１日目には、ＨＳＶ-１（Ｆ）群のマウスは生存しなかった。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４群マウスはわずかに体重が減少し、一般的に１２日目に８０％の体重を維持した。ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスの生存率は１００％に維持されており、ＨＳＶ-１（Ｆ）感染群の生存率とは有意に異なっていた。模擬マウスは体重減少も死亡もなかった。

【0079】

肺損傷（他の臓器損傷も伴う可能性がある）のため、７日目には、ＨＳＶ-１（Ｆ）マウスの体重が過度に減少し始め、８日目に７５％、１１日目に１００％の死亡率に達した。一方、ＨＳＶ-ＳＯＣＳ４マウスは、１２日目にわずかな体重減少を示し、死亡しなかった。これらの結果から、サイトカインストームの過剰放出を制御することにより感染マウスの体重、健康、及び生存を維持できることを示している。我々の結果から、ＳＯＣＳ４タンパク質挿入断片を有するＨＳＶがサイトカインの過剰産生、免疫細胞の過剰浸潤を阻害し、肺部の病理学的損傷を軽減しマウスの死亡率を低下させることを示している。

【0080】

ウイルス感染に対する免疫力は多面的かつ高度に複雑であり、サイトカインの誘導は冗長性と増幅カスケードを有する一連の蔓延ネットワークであり、このため、介入策略は多種のサイトカイン経路を対象とすべきである。ＨＳＶ-１バリアントのＨＳＶ-ＳＯＣＳ４株を組み換えた試みは、サイトカインストーム及びその壊滅的結果を阻害するために、価値のあるツールを提供し、ｏＨＳＶの臨床治療を改善することができる。

【0081】

なお、好ましい実施形態及び任意の特徴によって本発明を具体的に開示しているが、当業者であれば、本明細書に開示された本発明を修正、改良、及び変形することができ、そのような修正、改良、及び変形は、本開示の範囲内であると考えられる。ここで提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲を制限することを意図していない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】