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特許7228250分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法および装置
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  • 特許-分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法および装置 図1
  • 特許-分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法および装置 図2a
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-15
(45)【発行日】2023-02-24
(54)【発明の名称】分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法および装置
(51)【国際特許分類】
   G01N 15/02 20060101AFI20230216BHJP
   G01N 37/00 20060101ALI20230216BHJP
   G01N 21/17 20060101ALI20230216BHJP
【FI】
G01N15/02 A
G01N37/00 101
G01N21/17 A
【請求項の数】 12
(21)【出願番号】P 2019571635
(86)(22)【出願日】2018-06-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-08-27
(86)【国際出願番号】 EP2018067100
(87)【国際公開番号】W WO2019002286
(87)【国際公開日】2019-01-03
【審査請求日】2021-03-10
(31)【優先権主張番号】17178099.2
(32)【優先日】2017-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】514159690
【氏名又は名称】メディツィーニシェ・ウニフェルジテート・グラーツ
【氏名又は名称原語表記】MEDIZINISCHE UNIVERSITAET GRAZ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヒル,クリスティアン
【審査官】野田 華代
(56)【参考文献】
【文献】特開2017-026629(JP,A)
【文献】特表2008-536129(JP,A)
【文献】米国特許出願公開第2014/0220557(US,A1)
【文献】特開平05-296914(JP,A)
【文献】HIGURASHI E,OPTICALLY INDUCED ROTATION OF DISSYMMETRICALLY SHAPED FLUORINATED POLYIMIDE MICRO-以下備考,JOURNAL OF APPLIED PHYSICS,米国,AMERICAN INSTITUTE OF PHYSICS,1997年09月15日,VOL:82, NR:6,PAGE(S):2773-2779,http://dx.doi.org/10.1063/1.366163,OBJECTS IN OPTICAL TRAPS
【文献】T. Imasaka,Optical chromatography. A new tool for separation of particles,Dossier,1998年
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
G01N 15/00-15/14
G01N 37/00
G01N 21/17
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
分散された粒子(24a~24p)を有する流体試料(20)を分析する方法であって、
光の光子(a~d)が前記粒子(24a~24p)に運動量を伝達するように、前記流体試料に光を照射するステップと、
前記運動量の伝達によって変化された前記粒子(24a~24p)の少なくとも1つの特性を測定するステップとを含み、
前記光が、伝播方向(3a)に沿って安定的に変化している間に、前記伝播方向(3a)に対して垂直な各平面(36)内の2つ以上の点を指す勾配(31a~31p)を有する強度分布(31)を有する伝播ビーム(3)、および/または、高い強度勾配によって3次元ボリューム内に前記粒子(24a~24p)を閉じ込めるように構成された3D渦トラップビームであり、
前記伝播方向(3a)とほぼ平行またはほぼ反対の方向に前記流体試料(20)を流動させるステップをさらに含む、方法。
【請求項2】
前記伝播ビーム(3)の横電磁モードが、伝播軸(3a)の周りに環状である、前記伝播方向(3a)に対して垂直な平面(36)内に少なくとも1つの極大値(34)を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
粒子(24a~24p)が照射されている間に到達する定常速度、前記照射の中断もしくは開始後の粒子(24a~24p)の速度の減衰もしくは構築挙動、または前記照射によって誘発される軌道角運動量もしくは回転の少なくとも1つを測定するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記流体試料の流量の空間分布(26)は、所定の連続方程式を満たすように構成される、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
前記流量が放物線状に流れの断面(21a、21b)上で変化し、前記断面(21a、21b)の中心において最高である、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
前記粒子のうちの残余(24f~24h)とは異なる速度で前記伝播方向(3a)に移動する粒子(24a~24e)を、前記粒子のうちの前記残余(24f~24h)から分離するステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
分散された粒子(24a~24p)を有する流体試料(20)を分析する方法であって、
光の光子(a~d)が前記粒子(24a~24p)に運動量を伝達するように、前記試料に光を照射するステップと、
前記運動量の伝達によって変化された前記粒子(24a~24p)の少なくとも1つの特性を測定するステップとを含み、
前記光が、伝播方向(3a)に沿って安定的に変化している間に、前記伝播方向(3a)に対して垂直な各平面(36)内の2つ以上の点を指す勾配(31a~31p)を有する強度分布(31)を有する伝播ビーム(3)、および/または、高い強度勾配によって3次元ボリューム内に前記粒子(24a~24p)を閉じ込めるように構成された3D渦トラップビームであり、
前記粒子(24a~24p)によって前記伝播方向(3a)に対してほぼ垂直な方向に散乱された光を捕捉するステップをさらに含む、方法。
【請求項8】
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法を実行するための装置(1)であって、軸(2a)に沿って細長く、前記軸(2a)に沿って光のビーム(3)を通過させるように構成された、試料(20)を保持するためのチャンバ(2)を備え、
前記チャンバ(2)は、前記ビーム(3)の前記伝播方向(3a)に拡大する円錐形の内側断面を有することを特徴とする、装置(1)。
【請求項9】
ビーム(3)を前記チャンバ(2)へと通過させるように構成されたレーザ(4)をさらに備える、請求項8に記載の装置(1)。
【請求項10】
前記ビーム(3)は、前記チャンバ(2)の前記内側断面(21a、21b)が拡大するにつれて、前記伝播方向(3a)に拡大する、請求項9に記載の装置(1)。
【請求項11】
前記レーザ(4)と前記チャンバ(2)との間の光路内に回折光学素子(6)と列をなした半波長板(5)をさらに備える、請求項9または10に記載の装置(1)。
【請求項12】
前記試料(20)中の粒子(24a~24p)によって前記伝播方向(3a)に対してほぼ垂直に散乱された光のための少なくとも第1の位置感知検出器(10)と、
前記伝播方向(3a)に沿って前記試料(20)を完全に横切った光のための第2の検出器(12)とをさらに備える、請求項8~11のいずれか1項に記載の装置(1)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分散された粒子を有する流体試料を分析するための光学的方法、およびこの方法を実施するのに特に適した装置に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
ナノ粒子は、特にバイオテクノロジーおよび医薬品の分野において、将来の用途に大きい可能性を有する。しかし、不確定かつ異原性の粒子集団は、焦点が合わされ制御された用途のための分析ツールおよび高度な操作ならびに分離機器を必要とする。運動量の伝達を通じてナノサイズからミクロサイズ領域の粒子を操作するために光子を使用することができることが発見されたため、研究の取り組みは、この手法を使用した種々の応用および革新に焦点を当ててきた。この分野の特別な方法論の1つである光学力クロマトグラフィ(OFC)が、(T.Imasaka著「Optical chromatography.A new tool for separation of particles.」(Analusis 26.5:53~53(1998)))に開示されている。この方法は、毛細管内で明確に規定された流体抗力に反作用する光学力を適用することによって、液体媒体中の不均一混合物の特性評価および分離を実現する。それ以来、この技術は成熟して多くの実験機器に結実しており、その一例が、LumaCyte Inc.が販売しており、例えば米国特許第8,753,891号において特許を取得したレーザ力細胞診装置である。
【0003】
これまでのところ、OFCの欠点は、濃度およびスループットに限界があることである。すべての粒子は、レーザビームに対応する1本の線に沿って並んでいる必要がある。これによって、分離領域内での粒子間相互作用に関するダイナミックレンジの限界および深刻な問題が発生する。最終的に、OFCの用途は、高く希釈された試料および特定の単一粒子の用途に限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
発明の目的
したがって、本発明の目的は、OFCにおける粒子間相互作用の問題を軽減し、より希釈度の低い試料においてもOFCの使用を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
この目的は、主請求項に記載の方法およびさらなる独立請求項に記載の装置によって達成される。さらなる有利な実施形態が、従属請求項に詳述されている。
【0006】
発明の開示
本発明者らは、分散された粒子を有する流体試料を分析するための方法を開発した。試料に光が照射され、結果、光の光子が粒子に運動量を伝達する。上記運動量の伝達によって変化する粒子の少なくとも1つの特性が測定される。
【0007】
本発明によれば、光は、
-伝播方向に沿って安定的に変化しながら、伝播方向に対して垂直な各平面内の2つ以上の点を指す勾配を有する強度分布を有する伝播ビーム、および/または、
-高強度勾配によって、粒子を3次元ボリューム内に閉じ込めるように構成された3D渦トラップビームである。
【0008】
本発明者らは、OFCの前述の限界の根本原因は、Imasakaによる方法の当初の概念以来使用されていたビームのタイプにあることを発見した。この光学構成は、力の誘導に標準のTEM00レーザビームプロファイルを使用する。伝播方向に対して垂直な断面では、TEM00ビームはビームの中心に1つのみの極大値を有する。この単一の極大値は、伝播軸に沿って1本の線を規定し、ここで、運動量の伝達を受ける場合、単一の極大値を指す勾配力に起因してすべての粒子が整列する。作用空間は基本的に1次元に制限される。
【0009】
対照的に、本発明によるビームプロファイルは、粒子が運動量の伝達を受けることができる作用空間として機能することができる3次元ボリューメトリック領域において高い強度を提供する。作用空間は、例えば、円錐形であり得る。粒子は、この3次元作用空間内でより自由度が高く、作用空間内でほぼ自由に動き、他の粒子を追い抜く場合さえある。これによって、運動量の伝達によって変化する特性の測定のダイナミックレンジ、感度およびスループットが向上する。例えば、この妨げられない運動を通じて、レーザ力によって誘導される、平衡位置に向かう粒子速度軌道が測定され得、これは、対応する粒子サイズに直接起因し得る。
【0010】
伝播方向に対して垂直な各平面内の2つ以上の点を指す勾配を有するビームは、例えば、TEM00以外の横方向電磁モードを有するレーザビームであり得る。そのようなモードが、断面全体に分布するいくつかの異なる極大値を有する強度プロファイルを有する場合、すなわち、粒子が1つの極大値から次の極大値に移動することができない場合であっても、これらの極大値の各々は粒子にボリューメトリック作用空間を直ちに与える。
【0011】
そのようなビームは、伝播方向に沿った成分を有する好ましい方向で、粒子に正味の力を及ぼすことができる。流体抗力などの反作用力が一切ない場合、粒子は、流体試料を保持している容器の壁に最終的に当たるまで、この好ましい方向に安定的に移動することができる。対照的に、3D渦トラップビームは、高強度の勾配から構成される「非材料壁」によって粒子を閉じ込める。粒子は、渦トラップビームによって画定される3次元ボリューム内を自由に移動することができるが、このボリュームから出ることはできない。このボリュームは、コンテナの任意の壁から遠く離れるように構成することができ、そのため、コンテナ壁に起因する構造物が一切ない状態で粒子を調べることができる。
【0012】
横電磁モードが使用される場合、本発明の特に有利な実施形態では、このモードは、伝播軸を中心として環状である伝播方向に対して垂直な平面内に、少なくとも1つの極大値を有する。この環状の極大値が(ビームの可能な拡大を含む)伝播軸に沿って「押し出される」と、3次元作用空間が形成され、ここで、粒子は環の周に沿った方位角方向に追加の自由度を有する。例えば、照射はまた、粒子に角運動量も伝達することができ、例えば、3次元作用空間内のらせん経路上に粒子を送る。
【0013】
粒子に角運動量を伝達するビームの一例は、円筒形TEM01*モードである。したがって、本発明の特に有利な実施形態では、このようなモードを使用して、3次元作用空間の構築と、粒子への角運動量の伝達の両方を同時に行う。
【0014】
本発明の主な利点は、粒子への運動量の伝達の効果が研究される測定セットアップから、粒子間相互作用の効果が排除されることである。これによって、特に運動量の伝達に応じて粒子が行う運動の解析から、主な誤差の原因が排除される。したがって、本発明のさらに特に有利な実施形態では、方法は、粒子が照射されている間に到達する定常速度、照射の中断もしくは開始後の粒子の速度の減衰もしくは構築挙動、または照射によって誘発される軌道角運動量もしくは回転の少なくとも1つを測定することをさらに含む。
【0015】
同様の誤差の原因が、運動量の伝達に起因する力が流体抗力によって増大または相殺される測定から排除される。したがって、本発明のさらに特に有利な実施形態では、この方法は、伝播方向と実質的に平行または実質的に反対の方向に流体試料を流動させることをさらに含む。
【0016】
粒子の挙動の定量的な分析のために、流体試料を保持しているチャンバ内のすべての粒子の流体抗力が既知であることが最良である。この目的のために、好ましくは、流量の空間分布は、所定の連続方程式を満たすように構成される。例示的な実施形態では、流量は流れの断面上で放物線状に変化し得、同時に上記断面の中心で最も高い。
【0017】
運動量の伝達によって及ぼされる力を流体抗力に対して平衡させることは、例えば、伝播の方向において、粒子のうちの残余とは異なる速度で動く粒子を、粒子のうちの上記残余から分離するために使用され得る。例えば、伝播方向に正味の動きをする粒子が、或る割合のみ存在し得、一方で、他の粒子は静止したまま、または反対方向に移動し得る。この粒子分離は、前述のOFCと同様に機能するが、重要な差異がある。それは、粒子間の実際の違いによって引き起こされる粒子間の動きの違いが、もはや粒子間相互作用の効果と畳み込まれないために、例えば異なるサイズといった粒子を互いに区別できる精度が大幅に改善されることである。
【0018】
粒子を追跡するために、好ましくは、粒子によって伝播方向に対して実質的に垂直な方向に散乱された光が捕捉される。散乱光は個々の粒子に直接起因し得、粒子を保持する領域の画像を取得することによって、多数の粒子を同時に監視することができる。
【0019】
サイジングおよび特性評価方法は、大まかに、アンサンブル法、カウント法、および分離法に分類することができる。分離と追跡の両方を提供することによって、本発明は、組み合わせ分離-カウント法を提供する。今日使用されている主要なアンサンブル手法は、動的光散乱DLSであり、これには以下の利点がある。
【0020】
-それが使いやすい方法であること。
-必要な試料情報量が最小限であること。
【0021】
-非常に柔軟な試料濃度範囲にわたって使用することができること。
-非常に小さい試料サイズ(0.3nmまで)を測定することができること。
【0022】
-標準化されたプロトコルが利用可能な既知の技法であること。
ただし、以下の点が犠牲となる。
【0023】
-高い多分散指数、PDI(polydispersity index)を有する試料は、散乱強度の差が大きいことに起因して小さい粒子をカバーする傾向があること。
【0024】
-高PDI試料では、平均化によって方法誤差が大きくなること。
-材料の混合が測定に影響を与え、誤差を引き起こすこと。
【0025】
-濃度の低い粒子集団はほとんど検出することができないこと。
-濃度測定は、例えば試料透過を介してなど、間接的な方法でのみ可能であること。
【0026】
-「ユーザーが観察可能な」測定原理ではない。
DLSと比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには以下のいくつかの利点がある。
【0027】
-高PDIの影響は無視することができ、そのため、すべてのサイズピンを通じた走査が可能である。
【0028】
-測定は直接的かつリアルタイムで観測可能な測定値であり、顧客の信頼度が増大する。
【0029】
-検出感度は、各サイズピンにおいて単一粒子検出まで調整することができること。
-少なくとも20nm~100μmの広い範囲の粒子サイズが測定可能であること。
【0030】
-必要な試料ボリュームが、例えば5μl~100μlと少量であること。
-総粒子濃度および各サイズピンの粒子濃度を直接的に導出することができること。
【0031】
-粒子を同じ測定ステップにおいて分離およびサイジングすることができること。
-トラップ、選別、または蛍光測定などの追加の動作を、同じプラットフォーム上で実行することができること。
【0032】
-粒子の固有の特性が検出可能かつ選別可能になる(例えば、タンパク質と脂質との複数の異なる比率)こと。
【0033】
これらの利点に対する些細な代償は、測定の物理的経路がより複雑ということである。サイズ分布は、ブラウン運動を介して直接得られるのではなく、光学的運動量の伝達によって誘発される力の差を介して得られる。また、試料に関してやや多くの情報(すなわち、屈折率)が必要である。
【0034】
今日使用されている主なカウント法は、ナノ粒子追跡分析NTAであり、これは、ブラウン運動の速度を粒子サイズと相関させる方法である。この方法には以下の利点がある。
【0035】
-粒子を直接視覚化することによって、顧客の高い信頼および視覚的な予備試料評価が可能になること。
【0036】
-ブラウン運動のみが検出されるため、散乱強度はサイズ測定に一切影響を与えないこと。
【0037】
-「ワンバイワン(1つずつ)」アプローチが、多分散性をより良好に解決すること。
-屈折率による寄与のない純粋なサイズ測定が可能であること。
【0038】
-粒子の凝集および軟凝集がリアルタイムで観察可能であること。
-濃度測定が可能であること。
【0039】
ただし、以下の点が犠牲となる。
-この方法は、広いサイズ分布に限定されること。「ワンバイワン(1つずつ)」アプローチに起因して、すべてのサイズピンを測定することができるとは限らないため、PDIは完全に推定可能ではない。
【0040】
-3次元ブラウン運動の2次元検出は、固有の測定誤差をもたらすこと。
-追跡間隔が短いと、精度がさらに低下すること。
【0041】
-ガウスビームプロファイルが、異なるサイズの粒子の測定に影響し、さらなる誤差をもたらすこと。
【0042】
-高PDI試料は、散乱強度の差が大きいことに起因して、小さい粒子をカバーすることができること。
【0043】
NTAと比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには以下のいくつかの利点がある。
【0044】
-粒子が測定ウィンドウを通じて自動的に輸送され、高い粒子測定統計を可能にすること。
【0045】
-濃度比に関係なく、大小の粒子の検出が可能であり、そのため、すべてのサイズピンを評価することができ、完全なPDIを推定することが可能であること。
【0046】
-光学的に誘導される力が、好ましい方向を有することができ、結果、3次元における統計的ブラウン運動と比較して、明確な1次元測定パラメータが利用可能であること。したがって、距離、速度、および加(減)速度を、追跡アルゴリズムによって導き出すことができること。
【0047】
-検出感度は、単一粒子の検出まで、各サイズピンにおいて調整することができること。
【0048】
-粒子の固有の特性が検出可能であり、選別可能である(タンパク質と脂質との比率など)こと。
【0049】
-トラップ、選別、または蛍光測定などの追加の操作を、同じプラットフォーム上で実行することができること。
【0050】
DLSとの比較と同様に、主な代償は、試料の屈折率が分かっていることが必要であり、測定の物理的経路がより複雑ということである。
【0051】
現在使用されている主な分離方法は、非対称フロー式フィールドフロー分別(AF4)、およびサイズ排除クロマトグラフィ(SEC)であり、ゲル浸透クロマトグラフィ(GPC)が最も顕著な実施形態である。これらの分離方法には、以下の利点がある。
【0052】
-GPC/SECは非常に小さい粒子(少数のDA分子)を分離可能であること。
-GPC/SECは、はるかに高いスループットに拡張可能であること。
【0053】
-AF4は、1nm~50μmの広い分離範囲を提供すること。
-AF4には固定相がなく、そのため、マトリックス相互作用が一切ないこと。
【0054】
-これらの技術は十分に確立されており、そのため、承認された規格およびプロトコルが利用可能であること。
【0055】
ただし、以下の点が犠牲となる。
-高度な訓練を受けたオペレータが必要であること。
【0056】
-せん断劣化、カラムの目詰まり、および固定相との望ましくない相互作用によって、GPC/SEC測定にアーチファクトがもたらされること。
【0057】
-マトリックス相互作用が回復の問題を引き起こすこと。
-分離と検出とは別個の装置によって実行する必要があり、分析がより複雑になること。
【0058】
-GPC/SECは、より大きい分子とポリマーとをほとんど分離することができない(範囲は約20nmにおいて終端する)こと。
【0059】
-AF4では、膜相互作用および初期分離開始条件が非常に厳密であること。
-AF4膜は消耗部品であり、設置が難しく、細孔サイズの製造ばらつきに起因して再現性が低いこと。
【0060】
-GPC/SECは非常にコストがかかること。
GPC/SECおよびAF4と比較して、本発明による分離と追跡との組み合わせには、以下のいくつかの利点がある。
【0061】
-同種および異種試料に適用可能であること。粒子は、溶液中に存在することもでき、または、エマルジョンもしくは分散液などのコロイド系として存在することもできること。
【0062】
-GPC/SECとは対照的に、固定相は不要であること。
-AF4とは対照的に、膜は不要であること。
【0063】
-この方法は非常に感度が高く、単一粒子ろ過まで、非常に低濃度の試料に使用可能であること。
【0064】
-動作を直接観察し、性能を評価することができること。
些細な代償として、分離ボリュームは溶媒の屈折率に依存し、分離は光学コントラストに依存する(光学コントラストが高いほど分離性能が向上する)。
【0065】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、光の波長よりも大きい少なくとも1つの粒子が不均一に照明され、不均一な照明によって引き起こされる粒子の圧縮が検出される。この圧縮はより正確に測定することもでき、3次元作用ボリューム内で利用可能な空間がより多いため、問題の粒子に対する照明パターンは、光を遮る他の粒子によって意図せずに変更されることはなく、問題の粒子はまた、他の粒子と直接相互作用することもない。
【0066】
本発明による方法の主な利点は以下のとおりである。
粒子はビーム内で妨げられずに移動することができるため、光学的に誘導された力と流体抗力との間の単なる平衡位置に加えて、粒子の非平衡速度追跡が可能になる。
【0067】
3次元作用空間のボリュームは、TEM00モードによって形成される単なる1次元チャネルの「ボリューム」よりも何倍も大きいため、それに応じて大きい分離領域を使用して、粒子をろ過、分離、濃縮することができる。これによって、10粒子/ml程度の粒子濃度を使用することができるようになるが、従来技術では、低濃度試料中の単一粒子の研究しかできなかった。
【0068】
試料のマイクロ流体流を円錐粒子閉じ込めに合わせて調整することによって、測定は高強度領域と低強度領域の両方で高感度となり、ダイナミックレンジをさらに改善することができる。
【0069】
粒子が互いに整列する必要がないため、はるかに大きい3次元作用空間が、はるかに高いスループットを可能にする。10粒子/分程度のスループットに到達可能である。
【0070】
3次元作用空間では、粒子が凝集する傾向が大幅に減少する。
本発明は、本発明による方法を実行するための装置も提供する。この装置は、試料を保持するためのチャンバを備える。チャンバは軸に沿って細長く、上記軸に沿ってビームを通過させるように構成される。
【0071】
本発明によれば、チャンバは、ビームの伝播方向において実質的に拡大する円錐形の内側断面を有する。
【0072】
本発明者らは、この設計が、光の光子から粒子への運動量の伝達によって誘発される力に対して、チャンバ内のマイクロ流体抗力を有利に適合させることを発見した。ビームの伝播軸に沿った異なる平衡位置が、この伝播軸に対して垂直な軸に沿った異なる距離に対応する。その結果、マイクロ流体工学的に決定される流れプロファイルに起因して、大きい粒子ほど、低光学強度領域において小さい抗力を受ける。これによって、明確で効率的かつ高感度の作用空間が作成され、感度およびダイナミックレンジがさらに向上する。
【0073】
チャンバは、例えば、計算流体力学を使用して設計され、対応する微細加工技術を使用して製造されてもよい。
【0074】
本発明の特に有利な実施形態では、装置は、ビームをチャンバに通過させるように構成されたレーザをさらに備える。好ましくは、チャンバの内側断面が拡大するにつれて、ビームは伝播方向に拡大する。このとき、チャンバの形状は、その中に作成された3次元作用空間の形状に最適に適合される。
【0075】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、レーザとチャンバとの間の光路は、回折光学素子と列をなした半波長板を備える。このセットアップを使用して、上記の方法のコンテキストにおいて最も有用であるTEM01*モードを形成することができる。
【0076】
本発明のさらに特に有利な実施形態では、装置は、試料中の粒子によって伝播方向に対して実質的に垂直に散乱された光のための少なくとも第1の位置感知検出器と、伝播方向に沿って試料を完全に横切った光のための第2の検出器とをさらに備える。このとき、個々の粒子が光子からの運動量の伝達とマイクロ流体抗力との組み合わせの下でチャンバを通じて移動しているときにそれらを追跡するために、第1の検出器を使用することができる。同時に、第2の検出器を使用して、チャンバの状態を制御し、ビームプロファイルを評価することができる。
【0077】
3次元作用空間は、試料チャンバのマイクロ流体設計とともに用いて、OFCを「特殊な用途のためのニッチな存在」から、マルチパラメータ粒子特性評価、分離、および操作プラットフォームにする。このプラットフォームは、
-粒子特性評価、
-粒子分離、ならびに、
-トラップおよび単一粒子分析、
の3つの主要な操作モードにおいて操作することができる。
【0078】
これらのすべての動作モードは、ラベルフリー、無接触(すなわち、固定相なし)、かつ非侵襲的に、高価な医薬品または希少な生物学的抽出物向けの5μlまでの極めて低い試料ボリュームを許容する連続フローまたは液体環境におけるバッチセットアップとして動作する。以下に、3つの動作モードを要約し、現在市販されている競合技術を参照する。
【0079】
粒子特性評価は、例えばDLS、NTAおよびMALSと競合する。粒子サイズおよびサイズ分布は、「粒子速度追跡」および増強された「平衡距離検出」によって、20nm~100μmの範囲内で測定することができる。粒子散乱によって、任意の選択した「サイズピン」の粒子を単一粒子感度まで視覚化することができる。
【0080】
粒子分離は、例えばAF4、GPC/SEC、FPLC、FACSおよびAUCと競合する。粒子は、サイズを参照するか、または、粒子組成の差などの固有の特性を参照して分離することができる。このように、例えば、細胞集団を、FACSまたは超遠心分離と同様に選別することができる。したがって、本方法は、調整可能な膜サイズを有する機械的フィルタと同様に機能する光学フィルタを提供し得る。
【0081】
トラップおよび単一粒子分析は、例えば、AFM、マイクロピペット吸引、光ストレッチャ、光トラップ、マイクロ流体ラボオンチッププラットフォームと競合する。3次元作用空間内での粒子の妨げられない運動に起因して、粘弾性粒子の特性および細胞剛性が、粒子の観察される挙動から推定可能である。赤血球などの粒子の変形性を調べることができる。トラップされた、または他の様態で分離された単一の細胞または粒子は、透過光および蛍光顕微鏡法、またはラマン分光法などの他の光学的方法を使用して分析することもできる。
【0082】
本方法および装置は、例えば、製薬産業において、
-薬物設計(例えば、ワクチン特性評価、抗体およびタンパク質ベースの薬物開発)、
-ヒト免疫ワクチン接種のためのピーナッツアレルゲンによってコーティングされたプロタミンオリゴヌクレオチドなどの薬学的に活性なナノ粒子の特性評価および分離、
-ワクチン開発(例えば、ワクチン接種の可能性を提供する外膜小胞の形成のサイズ測定および時間関連定量化)、
-製剤開発(例えば、治療薬投与のための乳化制御、またはマイクロエマルジョンの物理的パラメータ)、
-オンライン品質管理(例えば、微粒子形成制御、充填密度評価、産業用マイクロ流体スタックのバイパス評価、または化学療法用のドキシル-リポソーム製剤)、
のために使用されてもよい。
【0083】
本方法および装置は、例えば、
-赤血球の変形能(例えば、糖尿病診断のためのヘモグロビンのグリコシル化)、または、
-細胞粘弾性特性の測定(例えば、がん細胞は正常細胞に対して細胞軟化を示す)、
を研究するための医学的および臨床的診断に使用されてもよい。
【0084】
本方法および装置は、例えば、ナノサイズの食品添加物の開発(例えば、立体安定性測定を介した香味料および栄養素のナノカプセル化)のために食品産業で使用されてもよい。
【0085】
本方法および装置は、例えば、化粧品および香水産業において、
-リポソームクリーム製剤の特性評価(例えば、ニオソームの研究開発)、
-日焼け止め、化粧品およびクリームに使用される粒子の特徴、または、
-香りの保持に使用されるナノ粒子の特性評価、
のために使用されてもよい。
【0086】
本方法および装置は、例えば、バイオテクノロジーにおいて、
-細菌の細胞外膀胱の研究(例えば、検出、定量化およびサイジング)、または、
-微生物叢の研究および特性評価、
のために使用されてもよい。
【0087】
図面の説明
以下では、本発明を、範囲を限定することを一切意図することなく、図を使用して説明する。
【図面の簡単な説明】
【0088】
図1】装置1のプロトタイプ実施形態の概略図である。
図2】いくつかの使用可能な横電磁モードの図である。
図3】3D円錐形状作用空間の光線光学モデルの図である。
図4】粒子分離中に予想され得る顕微鏡写真の例示的な図である。
図5】粒子の速度を追跡することができる顕微鏡写真の例示的な図である。
【発明を実施するための形態】
【0089】
図1は、装置1のプロトタイプの実施形態を示している。装置1は、流体試料20を収容するためのチャンバ2を備えている。試料20は、マイクロ流体シリンジポンプ15によって、1mlシリンジから0.1~10μl/分の速度で20μl試料ループ16を通り、直径約600μmの10μl溶融シリカ毛細管チャンバ2へと圧送され、チャンバ2を右から左へと横切る。チャンバ2を横切った後、試料20は試料収集器17によって収集される。チャンバ2は、軸2aで細長くなっている。
【0090】
532nm DPSSレーザ4から放出される光が、対物レンズ8aと絞り8bとを備える空間フィルタ8を通過する。第1のレンズ7aによって、光は、第2のレンズ7bによって再集束される前に、溶融シリカ半波長板5および回折光学素子6を通過する平行ビームに変換される。このようにして、規定の環サイズを有する円筒形のTEM01*モードから実質的になるビーム3が形成され、言い換えれば、対物レンズ8aの焦点領域におけるレーザビームプロファイルは、渦変換されて環状モードになる。
【0091】
チャンバ2は透明であり、対物レンズ10aおよびカメラ10bを備える位置感知検出器10によって観察することができる。この位置感知検出器10は、チャンバ2内の試料20によって伝播方向3aに対して垂直な方向に散乱された光、および、補助光源9からチャンバ2を通過し同じ方向に透過した補助光を捕捉することができる。
【0092】
チャンバ2を通過した後、ビーム3の一部分は、ビームスプリッタ11によって分割され、レンズ12aとカメラ12bとを備える第2の検出器12に供給される。ビームスプリッタ11は、レーザ4が非常に強い(例えば、3WのCW出力)ため、強度を低減する役割を果たす。したがって、ほとんどの強度は、ビームダンプ13において破棄される。
【0093】
カメラ10bおよびカメラ12bの両方からの画像情報は、コンピュータ14によって記録され、コンピュータ14はまた、レーザ4およびマイクロ流体シリンジポンプ15も制御する。
【0094】
図2は、本発明のコンテキストにおいて使用可能な2つの例示的なモードについて、伝播方向3aに対して垂直な平面36におけるレーザビーム3の強度分布31を示している。
【0095】
図2aは、円筒形TEM01*モードを示している。断面の様々な領域の強度が、各領域を埋めるドットの密度によって示される。円32の内側および円35の外側では、強度が消失するため、これらの領域はドットで埋められていない。円32から半径方向外側に移動すると、比較的低い強度の領域に行き当たり、この領域から、円33aおよび円33bによって境界付けられる比較的高い強度の領域に移行することになる。後者の領域内で、環状強度極大値が円34によって示される。円33bと円35との間には、比較的強度の低いさらなる領域がある。より低い強度からより高い強度を指す様々な例示的な勾配31a~31pを図2aに示す。
【0096】
円33aと円33bとの間の高強度領域が、図面の平面に対応する平面36から伝播方向3aに沿って「押し出される」と、この領域は、流体試料20に含まれる粒子24a~24pがビーム3からの運動量の伝達によって駆動されて移動し得る連続的な3次元作用空間を形成する。具体的には、この空間内で、粒子24a~24pは互いに追い越し合い、環の円周を回って方位角方向にも(例えば、極大値を表す円34に沿って)移動する可能性がある。したがって、伝播方向3aに沿った前進運動と組み合わさって、粒子24a~24pの運動は、例えばらせん運動になり得る。
【0097】
図2bは、本発明のコンテキストにおいて使用可能な別のモードを示している。これは円筒形TEM02モードである。強度プロファイル31は、基本的に、低強度領域37aおよび高強度領域38aが埋め込まれた第1のローブと、低強度領域37bおよび高強度領域38bが埋め込まれた第2のローブと、低強度領域37cおよび高強度領域38cが埋め込まれた第3のローブと、低強度領域37dおよび高強度領域38dが埋め込まれた第4のローブとに分割される。
【0098】
各高強度領域38a~38dは、平面36から伝播方向3aに押し出されると、試料20に含まれる任意の粒子24a~24pに対するそれ自体の作用空間を形成する。しかしながら、粒子24a~24pは、そのような領域38a~38dから別の領域に移動することはできない。
【0099】
図3は、散乱力Fscatがチャンバ2内の流体抗力Fdragとどのように平衡するかを示しており、散乱力Fscatを理解するために、光線光学モデルが使用される。強度プロファイル31を有するビーム3の伝播方向3aに沿って、チャンバ2の断面21a、21bは、ビーム3が拡大するにつれて実質的に拡大する。これによって、ビーム3の伝播方向3aとは反対の方向に左側の入口22から右側の出口23に流れる試料20の流量26が、断面21a、21bの中心で最大となる放物線状に変化し、一方、強度プロファイル31を有するビーム3の強度は断面21a、21bの中心で最小となる。
【0100】
粒子24c~24pは様々なサイズを有し、それらは、両方とも粒子サイズとともに増加する散乱力Fscatおよび抗力Fdragを受ける。その結果、両方の力が平衡状態にあるチャンバ2内の位置は、異なるサイズの粒子24c~24pに対して異なる。これを使用して、粒子をそれらのサイズに従って分離することができる。
【0101】
図3の右側には、4つの例示的な光子a~dからの運動量の伝達によって、ビーム3の強度プロファイル31が例示的な粒子24aおよび24bに力を及ぼす様子が概略的に示されている。光子a~dがプロセス中に散乱される方向、および衝突時に各光子a~dが粒子24a~24bに及ぼす力が示される。厳密に言えば、レーザビーム3の強度が高いということは、1秒あたりより多くの光子が粒子24a、24bに衝突することを意味する。図3の部分光線光学モデルでは、これは、より強い力を及ぼす強度分布31のより高い強度の領域から入来する光子によってモデル化される。
【0102】
すべての衝突する光子によって粒子24a、24bに加えられる合計の力は、伝播方向3aに平行な方向の成分Fscat、および、伝播方向3aに対して垂直な、強度極大値に向かう方向における成分Fgradを有すると理解することができる。
【0103】
図1および図3において説明したセットアップでは、粒子への力の伝達は1pN~1nN程度であり得る。試料20の液体は、例えば、水、EtOH、またはイソプロパノールであってもよい。濃度勾配によって、液体環境に追加の力が導入され得る。
【0104】
図4は、試料20が異なるサイズの粒子24a~24gを含む場合に、図1に示される装置1のカメラ10b上で予測され得る顕微鏡画像を示している。図4に示す例では、試料20は、ポリスチレンビーズが水の中で非常に高く希釈された試料である。ビーズは、図4において5つの例が24a~24eとラベル付けされている、各々が940nmのサイズのビーズの第1の部分と、図4において3つの例が24f~24hとラベル付けされている、各々が200nmのサイズのビーズの第2の部分とを含む。
【0105】
より大きいビーズ24a~24eは、レーザビーム3による照射からより大きい力を受けるため、それらはチャンバ2の左側の第1の領域25aに蓄積する。一方、小さいビーズ24f~24hは、右側で、チャンバ2の右側の第2の領域25bに蓄積する。領域25aおよび25bの幅は、ビーズ群24a~24eおよび24f~24hにおける分散度の測度である。
【0106】
図4に示される粒子のサイズは、相対的な縮尺では描かれていない。すなわち、200nmサイズのビーズ24f~24hは、940nmサイズのビーズ24a~24eのサイズの4分の1未満に描かれていない。この理由は、粒子24a~24hによって散乱される光の画像では、両方のタイプの粒子がほぼ同じサイズにされてしまうためである。
【0107】
図5は、異なるサイズの3つの例示的な粒子24a~24cが、右から左に向けられるレーザビーム3からの散乱力、および、左から右に向けられる流体流からの抗力を受けている間に、いくつかの画像フレームi)~iv)の期間にわたって追跡されるときに、図1に示す装置1のカメラ10b上で予測され得る顕微鏡画像を示す。図4とは対照的に、粒子24a、24b、および24c間のサイズ差は、これらの粒子間の区別をよりよく視覚化するために、図5では誇張されたスケールで描かれている。
【0108】
粒子24aは最大の粒子であり、フレームi)~iv)のシーケンス内で右から左に最も速く移動する。粒子24bは最小の粒子であり、最も遅く移動する。粒子24cは、粒子24aのサイズと粒子24bのサイズとの間のサイズを有する。粒子24cは粒子24aと同時にチャンバ2の左側に到達するが、フレームi)内で粒子24aよりも左側から移動し始めている。したがって、粒子24cは、粒子24aよりも低速に移動するが、粒子24bよりも高速に移動する。
【0109】
粒子24a~24cの速度は、それらのサイズに数学的に相関させることができ、そのため、個々の粒子24a~24cを追跡することによって、それらのサイズを決定することができる。
【0110】
参照記号のリスト
1 装置
2 チャンバ
2a チャンバ2の軸
3 ビーム
3a ビーム3の伝播方向
4 レーザ
5 半波長板
6 回折素子
7a,7b レンズ
8 空間フィルタ
8a 空間フィルタ8の対物レンズ
8b 空間フィルタ8の絞り
9 補助光源
10 位置感知検出器
10a 検出器10の対物レンズ
10b 検出器10のカメラ
11 ビームスプリッタ
12 透過光の検出器
12a 検出器12のレンズ
12b 検出器12のカメラ
13 ビームダンプ
14 コンピュータ
15 マイクロ流体シリンジポンプ
16 試料ループ
17 試料収集器
20 流体試料
21a,21b チャンバ2の断面
22 チャンバ2の入口
23 チャンバ2の出口
24a~24p 粒子
25a,25b サイズの異なる粒子24a~24hが集まる領域
26 チャンバ2の流量の空間分布
31 ビーム3の強度分布
31a~31p 強度分布31の勾配
32 低強度領域の内部限界
33a 高強度領域の内部限界
33b 高強度領域の外部限界
34 環状強度極大値
35 低強度領域の外部限界
36 伝播方向3aに対して垂直な平面
37a~37d 低強度領域
38a~38d 高強度領域
a~d 光子
~F光子a~dが及ぼす力
drag 流体抗力
grad 低強度に向かう勾配力
scat 光誘導散乱力
x,z 座標軸
図1
図2a
図2b
図3
図4
図5