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特許7231745抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-20
(45)【発行日】2023-03-01
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20230221BHJP
C07K 5/10 20060101ALI20230221BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20230221BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230221BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20230221BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230221BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230221BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230221BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K5/10 ZNA
C07K7/08
A61P31/14
A61K38/07
A61K38/08
A61K38/10
A61P43/00 111
A61K9/14
A61K9/20
A61K9/16
A61K9/48
A61K9/08
A61K9/10
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021539893
(86)(22)【出願日】2020-06-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-27
(86)【国際出願番号】 CN2020097446
(87)【国際公開番号】W WO2021258250
(87)【国際公開日】2021-12-30
【審査請求日】2021-07-08
(73)【特許権者】
【識別番号】510030331
【氏名又は名称】中国科学院昆明▲動▼物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＫＵＮＭＩＮＧ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ ．ＣＡＳ（ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ）
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．３２ Ｊｉａｏｃｈａｎｇ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ Ｋｕｎｍｉｎｇ， Ｙｕｎｎａｎ ６５０２２３ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001807
【氏名又は名称】弁理士法人磯野国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】頼 仭
(72)【発明者】
【氏名】唐 小梵
(72)【発明者】
【氏名】廖 祉亦
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】bioRxiv，2020年10月23日，<URL:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.23.350348v1.full>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ７／０６
Ｃ０７Ｋ ５／１０
Ｃ０７Ｋ ７／０８
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ａ６１Ｐ ３１／１４
Ａ６１Ｋ ３８／０７
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｋ ９／１４
Ａ６１Ｋ ９／２０
Ａ６１Ｋ ９／１６
Ａ６１Ｋ ９／４８
Ａ６１Ｋ ９／０８
Ａ６１Ｋ ９／１０
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を阻害するための薬剤であって、前記薬剤の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８からなり、前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すことを特徴とする薬剤。
【請求項2】
前記干渉ポリペプチドの作用濃度は、６０ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質当たり０．５～５μＭであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬であって、前記薬の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８からなり、前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示すことを特徴とする薬。
【請求項4】
前記薬の剤形には、粉末、錠剤、顆粒剤、カプセル、溶液、乳剤、懸濁液または注射乳剤が含まれることを特徴とする請求項３に記載の薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬の技術分野に属し、特に、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用に関する。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のパンデミックは、深刻な公衆衛生上の問題を引き起こした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス性のコロナウイルス科であるコロナウイルス亜科に属する、ＲＮＡゲノムが陽性のエンベロープウイルスである。ＣｏＶウイルス粒子には、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）の少なくとも４つの構造タンパク質が含まれている。膜貫通型スパイクタンパク質（Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ウイルス融合タンパク質の一種であり、コロナウイルスは、Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎを介して宿主細胞に侵入し、ウイルスの表面にホモ三量体を形成する。スパイクタンパク質には、宿主細胞受容体への結合を担当するＳ１サブユニットと、ウイルスと細胞膜を融合するＳ２サブユニットとの２つの機能サブユニットが含まれている。したがって、スパイクタンパク質は宿主の範囲と細胞の配向を決定する。スパイクタンパク質は、感染プロセス中に活性化された中和抗体の主な標的でもあり、ワクチン設計の焦点でもあるが、ヒト感染に対する承認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の治療法やワクチンはまだない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
これを考慮して、本発明は、調製が簡単で、低コストで、薬に適している、抗ウイルス効果を発揮することができる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明の上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決手段を提供する。
【0005】
本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供し、前記干渉ポリペプチドには、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８が含まれ、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
【0006】
本発明はまた、トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を阻害するための薬剤を提供する。前記薬剤の有効成分には、干渉ポリペプチドが含まれ、前記干渉ポリペプチドには、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８が含まれ、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
【0007】
好ましくは、前記干渉ポリペプチドの作業濃度は０．５～５μＭ／６０ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。
【0008】
本発明はまた、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬を提供し、前記薬の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８を含み、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
【発明の効果】
【0009】
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供し、前記干渉ポリペプチドは、トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合部位に基づいて設計され、新型コロナウイルスに感染した細胞を効果的に治療できる。本発明の実施例において、ＳＰＲ検証後、設計された７つの干渉ポリペプチドはすべてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を有意に阻害し、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害する。
本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供し、前記干渉ポリペプチドは、トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合部位に基づいて設計され、新型コロナウイルスに感染した細胞を効果的に治療できる。本発明の実施例において、ＳＰＲ検証後、設計された７つの干渉ポリペプチドはすべてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を有意に阻害し、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質受容体結合領域ＲＢＤとトランスフェリン受容体の結合を検証した図であり、上から下への曲線は、それぞれ２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、７．８１２５ｎＭ、および３．９０６２５ｎＭのスパイクタンパク質濃度を表している。
【図2】タンパク質ドッキング分析のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合位置を示す図である。
【図3】干渉ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を阻害できるというＳＰＲ検証図である。
【図4A】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4B】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4C】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4D】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4E】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4F】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4G】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4H】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【図4I】干渉ポリペプチドによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞を阻害する比較図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明を、実施例を参照しながら以下でさらに説明する。
【0012】
本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供し、前記干渉ポリペプチドには、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８が含まれ、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
【0013】
本発明の前記干渉ポリペプチドの配列情報を表１に示す。
【0014】
【表1】
【0015】
本発明は、前記干渉ポリペプチドの調製方法を特に限定するものではなく、好ましくは、人工合成により前記干渉ポリペプチドを調製する。本発明において、トランスフェリン受容体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合してヒト細胞に感染することができ、前記干渉ポリペプチドは、トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を阻害できることにより、抗新型コロナウイルスと新型コロナウイルス感染の治療の効果を達成することができる。
【0016】
本発明はまた、トランスフェリン受容体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の結合を阻害するための薬剤を提供し、前記薬剤の有効成分には、干渉ポリペプチドが含まれ、前記干渉ポリペプチドには、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８が含まれ、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。
【0017】
本発明の前記干渉ポリペプチドの作業濃度は、好ましくは、０．５～５μＭ／６０ｎＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。本発明において、前記薬剤の有効成分は、単一の干渉ポリペプチド成分または複数の干渉ポリペプチドの混合物であってもよく、混合物中の各干渉ポリペプチドの混合比を特に制限しないので、総エネルギーは０．５～５μＭ／６０ｎＭ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に達することができると十分である。
【0018】
本発明はまた、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２薬を提供し、前記薬の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７及び／又はＱＫ８を含み、
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。本発明の前記薬の有効成分である干渉ポリペプチドの作業濃度および比例関係などはすべて上記と同じであり、ここではさらに説明しない。
前記ＳＬ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に、前記ＦＧ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に、前記ＤＬ１２のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に、前記ＲＫ４のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に、前記ＳＤ６のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に、前記ＨＦ７のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、前記ＱＫ８のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示す。本発明の前記薬の有効成分である干渉ポリペプチドの作業濃度および比例関係などはすべて上記と同じであり、ここではさらに説明しない。
【0019】
本発明の前記薬の剤形は、特に限定されず、好ましくは、粉末、錠剤、顆粒剤、カプセル、溶液、乳剤、懸濁液または注射剤を含む。本発明の前記薬はまた、薬学的に許容される賦形剤を含む。本発明では、前記剤形の薬を調製する場合、好ましくは、異なる剤形の薬の従来の調製方法に従って調製すればよい。
【0020】
本発明はまた、新型コロナウイルスに感染した細胞を治療する方法を提供する。前記新型コロナウイルスに感染した細胞を、干渉ポリペプチドと混合し、ここで、細胞とポリペプチドの混合比は４×１０４ｃｅｌｌｓ：８００ｎＭである。
【0021】
本発明はまた、静脈内注射によって、上記の干渉ポリペプチドを体内に注射することにより、新型コロナウイルス感染によって引き起こされる疾患を治療する方法を提供し、前記干渉ポリペプチドの注射量は、好ましくは０．５～１ｍｇ／ｋｇである。本発明において、前記静脈内注射を行う場合、好ましくは単一のポリペプチドを注射する。
【0022】
本発明によって提供される抗新型コロナウイルス薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を、実施例を参照しながら以下に詳細に説明するが、それらは、本発明の保護の範囲を制限するものとして理解することはできない。
【0023】
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合領域ＲＢＤとトランスフェリン受容体の結合に関するＳＰＲ検証
まず、トランスフェリン受容体（１１０２０－Ｈ０７Ｈ、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃｈｉｎａ）を２００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）で希釈（２０μｇ／ｍｌ）し、次にＣＭ５センサーチップ（ＢＲ１０００１２、ＧＥ、ＵＳＡ）に流し、５μｌ／ｍｉｎの流量で流れ、２０００共振ユニット（ＲＵ）に達した。チップ上の残りの活性部位を、７５μｌのエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）でブロックした。スパイクタンパク質ＲＢＤ（３．９０６２５、７．８１２５、１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０ｎＭ）含有のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液は、１０μｌ／ｍｉｎの流速で、それらと固定化されたトランスフェリン受容体との相互作用を分析した。ＢＩＡソフトウェア（ＧＥ、米国）を使用して、結合ＫＤおよびＫａとＫｄの速度定数を決定した。結果が図１に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤは強い結合能でトランスフェリン受容体に結合し、Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤはそれぞれ９．３６×１０４Ｍ－１ｓ－１、４×１０－３ｓ－１および４３ｎＭであった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合領域ＲＢＤとトランスフェリン受容体の結合に関するＳＰＲ検証
まず、トランスフェリン受容体（１１０２０－Ｈ０７Ｈ、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃｈｉｎａ）を２００μｌの酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）で希釈（２０μｇ／ｍｌ）し、次にＣＭ５センサーチップ（ＢＲ１０００１２、ＧＥ、ＵＳＡ）に流し、５μｌ／ｍｉｎの流量で流れ、２０００共振ユニット（ＲＵ）に達した。チップ上の残りの活性部位を、７５μｌのエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）でブロックした。スパイクタンパク質ＲＢＤ（３．９０６２５、７．８１２５、１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０ｎＭ）含有のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液は、１０μｌ／ｍｉｎの流速で、それらと固定化されたトランスフェリン受容体との相互作用を分析した。ＢＩＡソフトウェア（ＧＥ、米国）を使用して、結合ＫＤおよびＫａとＫｄの速度定数を決定した。結果が図１に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤは強い結合能でトランスフェリン受容体に結合し、Ｋａ、Ｋｄ、ＫＤはそれぞれ９．３６×１０４Ｍ－１ｓ－１、４×１０－３ｓ－１および４３ｎＭであった。
【0024】
実施例２
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質－トランスフェリン受容体結合部位のタンパク質ドッキング予測
トランスフェリン受容体の既知の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＸ８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＺＧ）を使用し、タンパク質ドッキング分析にＺＤＯＣＫを使用した結果を図２に示し、分子ドッキングの結果は、トランスフェリン受容体がスパイクタンパク質のＲＢＤ領域と相互作用することを示した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質－トランスフェリン受容体結合部位のタンパク質ドッキング予測
トランスフェリン受容体の既知の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＸ８）とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＬＺＧ）を使用し、タンパク質ドッキング分析にＺＤＯＣＫを使用した結果を図２に示し、分子ドッキングの結果は、トランスフェリン受容体がスパイクタンパク質のＲＢＤ領域と相互作用することを示した。
【0025】
実施例３
干渉ポリペプチドの化学的調製法、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎによる合成
１．樹脂の膨潤
置換度０．３のＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ ５ｇを秤量し、反応カラムに注ぎ、ＤＣＭ５０ｍｌを加えて膨潤させ、３０分間浸した。
２．脱保護
反応カラムからＤＣＭをすべて吸引ろ過して除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えてＦｍｏｃを脱着除去し、窒素で３０分間バブリングし、吸引ろ過して除去し、ＤＭＦで５回洗浄し、吸引ろ過して除去した。
３．縮合反応
ＴＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性剤の組み合わせで縮合し、秤量したＴＢＴＵと接続されたアミノ酸を３倍の投与量で計算し、５０ｍｌのＤＭＦで溶解して反応カラムに加え、ＤＩＥＡ（１．５５ｍｌ）を加え、窒素でバブリングし、１時間反応させた。
４．検出、洗浄
サンプリングチューブを使用して反応カラムから少量の樹脂を取り出し、小さな試験管に注ぎ、ＤＭＦで一回洗浄し、ＤＭＦを捨て、液体Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ３滴ずつ加え（液体Ａ：ニンヒドリンアルコール溶液、液体Ｂ：２０％アルコールと８０％フェノール混合溶液、液体Ｃ：再蒸留ピリジン）、ヒーターに入れ、１２０℃で３分間加熱し、取り出して、溶液及び樹脂の色を観察し、溶液が黄色、樹脂が無色または淡黄色である場合、縮合反応が完了したことを示し、反応カラム中の反応を停止し、吸引ろ過して除去して、ＤＭＦで３回洗浄した。
５．再入れ
樹脂の色が緑、青、紫などの他の色であることが検出された場合は、反応が完了していないことを示し、このときに同じ方法で３回吸引ろ過して除去して洗浄し、現在の反応の同量を秤量し、それを反応カラムに入れて、検出反応が完了するまで、再反応させた。
６．縮合し続け
後続のアミノ酸接続についてステップ２～５を繰り返し、異なるアミノ酸の秤量は同じアルゴリズムを使用して計算され、ＴＢＴＵ／ＤＩＥＡの量は変更されなかった。
７．収縮
最後のアミノ酸接続が完了した後、２つのステップを繰り返し、ＤＣＭで３回洗浄し、メタノールで３回洗浄し、吸引ろ過して除去して、樹脂を注ぎ出し、オーブンランプで乾燥させて、５００ｍｌビーカーに入れた。
８．切削
ビーカーに１００ｍｌの切削液（比率はＴＦＡ／チオアニソール／フェノール／ＥＤＴ／水＝８６／５／４／３／２）を加え、マグネチックスターラーに置き、ビーカーに磁石を入れ、２時間撹拌して反応させた後、サンドコアファンネルでろ過し、サンドコアの樹脂をＴＦＡで２回すすぎ、切削液を６００ｍｌの氷エーテルに注ぎ、このとき、ポリペプチドが析出してポリペプチドエーテル懸濁液を形成し、大型遠心分離機を使用してそれぞれ遠心分離を繰り返し、上清を捨て、エーテルを加えて洗浄し、このプロセスを３回繰り返し、次にオーブンランプで焼いてエーテルの残留物を除去すると、得られた固体が標的ポリペプチドの粗生成物であった。
９．精製
粗生成物を水に溶解し、ろ過した後、高速液体クロマトグラフィーで分離精製し、最終的に純度９５％以上の標的ペプチド生成物が得られた。
１０．調製
７グラムの粗生成物を特定の比率ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ １：４（Ｖ／Ｖ）溶液に溶解し、少量のサンプルを採取してサンプルのピーク時間を分析した。（高速液体クロマトグラフＨＰＬＣ分析）カラム１００ＤＡＣを調製したカラムを選択し、サンプルをカラムに入れ、粗生成物のピーク時間に応じてグラジエントを選択し、分離に入り、ＨＰＬＣチャートに従って不純物を個別に収集し、ＬＣ－ＭＳを使用して収集した製品が必要かどうかを判断し、必要な物質を検出用に残した。ＨＰＬＣ認定製品を、回転蒸して凍結乾燥した。必要な量の製品を得た（白色粉末の状態）。
干渉ポリペプチドの化学的調製法、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎによる合成
１．樹脂の膨潤
置換度０．３のＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ ５ｇを秤量し、反応カラムに注ぎ、ＤＣＭ５０ｍｌを加えて膨潤させ、３０分間浸した。
２．脱保護
反応カラムからＤＣＭをすべて吸引ろ過して除去し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加えてＦｍｏｃを脱着除去し、窒素で３０分間バブリングし、吸引ろ過して除去し、ＤＭＦで５回洗浄し、吸引ろ過して除去した。
３．縮合反応
ＴＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性剤の組み合わせで縮合し、秤量したＴＢＴＵと接続されたアミノ酸を３倍の投与量で計算し、５０ｍｌのＤＭＦで溶解して反応カラムに加え、ＤＩＥＡ（１．５５ｍｌ）を加え、窒素でバブリングし、１時間反応させた。
４．検出、洗浄
サンプリングチューブを使用して反応カラムから少量の樹脂を取り出し、小さな試験管に注ぎ、ＤＭＦで一回洗浄し、ＤＭＦを捨て、液体Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ３滴ずつ加え（液体Ａ：ニンヒドリンアルコール溶液、液体Ｂ：２０％アルコールと８０％フェノール混合溶液、液体Ｃ：再蒸留ピリジン）、ヒーターに入れ、１２０℃で３分間加熱し、取り出して、溶液及び樹脂の色を観察し、溶液が黄色、樹脂が無色または淡黄色である場合、縮合反応が完了したことを示し、反応カラム中の反応を停止し、吸引ろ過して除去して、ＤＭＦで３回洗浄した。
５．再入れ
樹脂の色が緑、青、紫などの他の色であることが検出された場合は、反応が完了していないことを示し、このときに同じ方法で３回吸引ろ過して除去して洗浄し、現在の反応の同量を秤量し、それを反応カラムに入れて、検出反応が完了するまで、再反応させた。
６．縮合し続け
後続のアミノ酸接続についてステップ２～５を繰り返し、異なるアミノ酸の秤量は同じアルゴリズムを使用して計算され、ＴＢＴＵ／ＤＩＥＡの量は変更されなかった。
７．収縮
最後のアミノ酸接続が完了した後、２つのステップを繰り返し、ＤＣＭで３回洗浄し、メタノールで３回洗浄し、吸引ろ過して除去して、樹脂を注ぎ出し、オーブンランプで乾燥させて、５００ｍｌビーカーに入れた。
８．切削
ビーカーに１００ｍｌの切削液（比率はＴＦＡ／チオアニソール／フェノール／ＥＤＴ／水＝８６／５／４／３／２）を加え、マグネチックスターラーに置き、ビーカーに磁石を入れ、２時間撹拌して反応させた後、サンドコアファンネルでろ過し、サンドコアの樹脂をＴＦＡで２回すすぎ、切削液を６００ｍｌの氷エーテルに注ぎ、このとき、ポリペプチドが析出してポリペプチドエーテル懸濁液を形成し、大型遠心分離機を使用してそれぞれ遠心分離を繰り返し、上清を捨て、エーテルを加えて洗浄し、このプロセスを３回繰り返し、次にオーブンランプで焼いてエーテルの残留物を除去すると、得られた固体が標的ポリペプチドの粗生成物であった。
９．精製
粗生成物を水に溶解し、ろ過した後、高速液体クロマトグラフィーで分離精製し、最終的に純度９５％以上の標的ペプチド生成物が得られた。
１０．調製
７グラムの粗生成物を特定の比率ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ １：４（Ｖ／Ｖ）溶液に溶解し、少量のサンプルを採取してサンプルのピーク時間を分析した。（高速液体クロマトグラフＨＰＬＣ分析）カラム１００ＤＡＣを調製したカラムを選択し、サンプルをカラムに入れ、粗生成物のピーク時間に応じてグラジエントを選択し、分離に入り、ＨＰＬＣチャートに従って不純物を個別に収集し、ＬＣ－ＭＳを使用して収集した製品が必要かどうかを判断し、必要な物質を検出用に残した。ＨＰＬＣ認定製品を、回転蒸して凍結乾燥した。必要な量の製品を得た（白色粉末の状態）。
【0026】
実施例４
干渉ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を阻害するＳＰＲ検証
異なる濃度の干渉ポリペプチド（０．５および５μＭ）をスパイクしたスパイクタンパク質（６０ｎＭ）を、２０μｌ／ｍｉｎの流速で、スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合に対する干渉ポリペプチドの阻害効果を検出した。
干渉ポリペプチドがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を阻害するＳＰＲ検証
異なる濃度の干渉ポリペプチド（０．５および５μＭ）をスパイクしたスパイクタンパク質（６０ｎＭ）を、２０μｌ／ｍｉｎの流速で、スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合に対する干渉ポリペプチドの阻害効果を検出した。
【0027】
結果を図３に示すように、７つの干渉ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質のトランスフェリン受容体への結合を有意に阻害した。
【0028】
実施例５
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に対する干渉ポリペプチドの阻害効果
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（昆明細胞バンク）をさまざまな干渉ポリペプチドで１時間前処理し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスを加えて１時間感染させた。次に、ウイルス干渉ポリペプチド混合物を除去し、干渉ポリペプチドを含む新鮮な培地を使用して細胞をさらに培養した。４８時間後、細胞上清を収集し、溶解緩衝液（１５５９６０１８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）で溶解して、さらなる細胞病原性効果（ＣＰＥ）および定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）定量分析を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞に対する干渉ポリペプチドの阻害効果
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（昆明細胞バンク）をさまざまな干渉ポリペプチドで１時間前処理し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスを加えて１時間感染させた。次に、ウイルス干渉ポリペプチド混合物を除去し、干渉ポリペプチドを含む新鮮な培地を使用して細胞をさらに培養した。４８時間後、細胞上清を収集し、溶解緩衝液（１５５９６０１８、Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳＡ）で溶解して、さらなる細胞病原性効果（ＣＰＥ）および定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）定量分析を行った。
【0029】
ｑＲＴ－ＰＣＲで使用される増幅プライマーはＮＰ遺伝子プライマーであった：
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）：ＧＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＴ、
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）：ＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧ、
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）：５’－ＦＡＭ－ＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ－ＴＡＭＲＡ－３’。
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）：ＧＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＡＴ、
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）：ＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧ、
Ｔａｒｇｅｔ－２－Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）：５’－ＦＡＭ－ＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ－ＴＡＭＲＡ－３’。
【0030】
結果を図４に示すように、７つの干渉ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害することができ、また、ＳＬ８、ＦＧ８、ＤＬ１２、ＲＫ４、ＳＤ６、ＨＦ７、およびＱＫ８は、８０μＭの濃度でそれぞれ８７、７５、９９、９９、９８、８９、および９９％のウイルス感染を阻害し、７つのポリペプチドの半数阻害濃度ＥＣ５０は、それぞれ１０、２０、５、１０、６．４、１１．４、および３．３μＭであった。
【0031】
上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎない。当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、いくつかの改善および修正を行うことができ、これらの改善および修正もまた、本発明の保護範囲と見なされるべきであることを指摘されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【配列表】