▶ ゾエティス・サービシーズ・エルエルシーの特許一覧 ▶ ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ，アズ・レプレゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・オブ・アグリカルチャーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-21
(45)【発行日】2023-03-02
(54)【発明の名称】口蹄疫ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/135 20060101AFI20230222BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230222BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230222BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230222BHJP
【ＦＩ】
A61K39/135
A61K39/39
A61P31/12 171
A61P37/04
【請求項の数】
10
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020157185
(22)【出願日】2020-09-18
(62)【分割の表示】P 2017556778の分割
【原出願日】2016-01-15
(65)【公開番号】P2021001205
(43)【公開日】2021-01-07
【審査請求日】2020-10-19
(31)【優先権主張番号】62/104,314
(32)【優先日】2015-01-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】515230154
【氏名又は名称】ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー
(73)【特許権者】
【識別番号】517249691
【氏名又は名称】ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ，アズ・レプレゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー・オブ・アグリカルチャー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】ドミノウスキー，ポール・ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ハーダム，ジョン・モーガン
(72)【発明者】
【氏名】ジャクソン，ジェームズ・アラン
(72)【発明者】
【氏名】ゲイ，サイリル・ジェラルド
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス，ルイス・リーンドロ
(72)【発明者】
【氏名】クラグ，ピーター・ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】リーダー，アイダ・エリザベス
【審査官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５０４５８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５３４４８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５２３１８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２５９１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０７７８２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３０８３６６３（ＣＮ，Ａ）
【文献】CAO YIMEI，ADJUVANTS FOR FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS VACCINES: RECENT PROGRESS，EXPERT REVIEW OF VACCINES，英国，EXPERT REVIEWS LTD，2014年11月01日，VOL:13, NR:11，PAGE(S):1377 - 1385，http://dx.doi.org/10.1586/14760584.2014.963562
【文献】BUCAFUSCO, Danilo et al.，Virology，2015年02月，Vol. 476，pp. 11-18，https://doi.org/10.1016/j.virol.2014.11.023
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－５１／１２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
群を管理する方法であって、抗原成分、並びに、
油エマルション、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン及び、ＣｐＧを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、アジュバント成分
を含む免疫原性組成物を前記群の各メンバーに投与することを含み、
前記組成物において、
ａ）前記抗原成分が、６～１０μｇ／用量のＦＭＤ（口蹄疫）ウイルスを含み；
ｂ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、７５～２００μｇ／用量の量で存在し；
ｃ）ＤＥＡＥデキストランが、７５～２００ｍｇ／用量の量で存在し；
ｄ）前記油エマルションが、油相を含み、そして、前記油相は、組成物の５０～８０ｖ／ｖ％の量で存在する、
さらに、ＦＭＤ感染との接触が疑われる場合に、前記群の前記ワクチン接種を受けたメンバーが、
ｉ）屠殺されない；又は、
ｉｉ）０～３０日間検疫される；又は
ｉｉｉ）感染構内の外に移動される、
前記方法。
【請求項2】
ＦＭＤに感染した反芻動物のＦＭＤ持続の頻度を低減する方法であって、抗原成分、並びに、
油エマルション、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン及び、ＣｐＧを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む、アジュバント成分
を含む免疫原性組成物を、前記感染前の前記反芻動物に投与することを含み、
前記組成物において、
ａ）前記抗原成分が、６～１０μｇ／用量のＦＭＤ（口蹄疫）ウイルスを含み；
ｂ）前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、７５～２００μｇ／用量の量で存在し；
ｃ）ＤＥＡＥデキストランが、７５～２００ｍｇ／用量の量で存在し；
ｄ）前記油エマルションが、油相を含み、そして、前記油相は、組成物の５０～８０ｖ／ｖ％の量で存在する、
前記方法。
【請求項3】
前記ＦＭＤウイルスが、リーダーコード領域（ＬＬ）の欠損及びＤＩＶＡマーカーを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＦＭＤウイルスが、異種カプシドタンパク質を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記群の前記ワクチン接種を受けたメンバーが、屠殺されず、かつ０～３０日間検疫される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記群が、ウシ亜科の動物の群である請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＦＭＤウイルス組成物が、中空糸濾過によって調製される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記抗原成分が、８～１０μｇのＦＭＤ（口蹄疫）ウイルス／用量の量で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記油が、非代謝油である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記油相が、前記組成物の５０．０１ｖ／ｖ％～５５ｖ／ｖ％の量で存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、家畜（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及び他）及び多様な野生動物を含む偶蹄の有蹄動物において非常に伝染しやすいウイルス性疾患である。ＦＭＤＶに感染したウシにおける最も顕著な疾患症状には、口、舌、乳頭、及び脚の上皮の水疱性病変が含まれる。一部の国々、特にアメリカ、カナダ、メキシコ、オーストラリア、及びヨーロッパの大部分では、ＦＭＤが認められないと考えられているが、本疾患は世界中に分布しており、輸出産業に大きな経済的影響を与えている。実際に、過去１０年の間にほとんどすべての大陸で、経済的に壊滅的な被害をもたらす発症が起こっている。
【0002】
現在死滅した抗原のＦＭＤＶワクチンは、時には困難であり得る細胞の増殖に適合された大量（数千リットル）の伝染力の強いＦＭＤＶを増殖させることによって、高価な生物学的封じ込め施設において必然的に生成されている。このプロセスにより、家畜に費用のかかる発症をもたらす生産施設からの伝染力の強いウイルスの脱出が生じる（Ｃｏｔｔａｍ ｅｔ ａｌ．２００８．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ４：１－８を参照されたい）。増殖後、次に、調製された化学薬品及び抗原濃縮物を用いてウイルスを不活性化し、続いて、汚染タンパク質を除去するための精製ステップが必要とされる。血清学的診断検査を介してワクチン接種を受けた動物（ＤＩＶＡ）から感染したものを識別するのは困難である。保護を達成するためにワクチンと循環する野外株との間の適した適合を必要とする、血清型及び亜類型間の干渉効果は、ほとんどあるいは全くない。ワクチンのこうした欠点にもかかわらず、何十億もの用量が、毎年世界中で製造されている。その使用は、ヨーロッパからのＦＭＤＶの根絶、及び大規模なワクチン接種運動を介した世界の多数の地域での疾患の防除にその根拠を有している。骨格及び好適な制限部位を含有する遺伝子操作されたウイルスの生成により、制限部位が異なるＦＭＤ株のカプシドタンパク質の導入に対する遺伝子座を提供するため、不活性化されたワクチンの欠点が部分的に解消されている。それにもかかわらず、抗原の費用は、ＦＭＤ及び大部分の他のワクチンの費用に対する最大の要因となっている。
【0003】
ＦＭＤの防除の問題は、ウイルス持続の現象によってさらに悪化する。簡潔に言えば、歴史的に、不活性化されたＦＭＤワクチンは、持続または保菌状態（感染及び／または曝露に続いて２８日を過ぎたウイルス出芽として定義される）を予防することが不可能であった。いずれのＦＭＤ症状も示さない出芽動物は、他の動物に対するＦＭＤ感染源であり続ける可能性がある。このように、一般に許容される疾患防除の実施には、疾患の臨床兆候が見られない場合であっても、ワクチン接種を植えた群のすべての動物の屠殺が必要となる。
【0004】
このように、効率を落とすことなく、かつ／またはＦＭＤ持続を低減もしくは除去することなく、低い抗原負荷を有するワクチンを生み出す方法及び組成物が、未だに必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
一態様において、本発明は、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫性組成物を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及びポリカチオン性高分子、アルミニウム源のうちの少なくとも１つを含み、抗原成分は、０．５～８μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原組成物を含む。
【0006】
ある特定の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド
を含有するＣｐＧである。ある特定の実施形態において、ポリカチオン性高分子は、ＤＥＡＥデキストランである。
を含有するＣｐＧである。ある特定の実施形態において、ポリカチオン性高分子は、ＤＥＡＥデキストランである。
【0007】
異なる実施形態において、抗原は、ＦＭＤウイルス組成物であり、０．５～４μｇ／用量、または０．５～２μｇ／用量、もしくは０．５～１μｇ／用量の量で、または約０．５μｇ／用量の量で存在する。
【0008】
ＦＭＤウイルスは、不活性化または弱毒化されている場合がある。ある特定の実施形態において、ＦＭＤウイルスは、不活性化されたＦＭＤ Ａ２４クルゼイロ株である。選択された実施形態において、不活性化された株は、リーダーコード領域（ＬＬ）の欠損を含有し、かつ任意に陰性抗原マーカーを含有する遺伝子操作された株である。
【0009】
ある特定の実施形態において、遺伝子操作されたウイルスは、異種株からのカプシドタンパク質を含有する。
別の態様において、本発明は、以前の態様の実施形態による免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、動物におけるＦＭＤを予防する方法を提供する。異なる実施形態において、動物は、ウシ亜科の動物、ヒツジ、ブタ、及びヤギから選択される。
別の態様において、本発明は、以前の態様の実施形態による免疫原性組成物を、それを必要とする動物に投与することを含む、動物におけるＦＭＤを予防する方法を提供する。異なる実施形態において、動物は、ウシ亜科の動物、ヒツジ、ブタ、及びヤギから選択される。
【0010】
別の態様において、本発明は、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫原性組成物を感染前の反芻動物に投与することを含む、ＦＭＤに感染した反芻動物のＦＭＤ持続の頻度を低減する方法を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分は、６～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含む。
【0011】
また別の態様において、本発明は、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫原性組成物を群の動物に投与することを含む、群を管理する方法を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分は、６～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含み、ＦＭＤ感染との接触が疑われる場合に、群のワクチン接種を受けたメンバーは、屠殺されない。
【0012】
本発明はまた、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫原性組成物を群の動物に投与することを含む、群を管理する方法を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分は、６～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含み、ＦＭＤ感染との接触が疑われる場合に、群のワクチン接種を受けたメンバーは、０～６２日間検疫される。
【0013】
本発明はまた、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫原性組成物を群の動物に投与することを含む、群を管理する方法を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分は、６～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含み、ＦＭＤ感染との接触が疑われる場合に、群のワクチン接種を受けたメンバーは、感染領域の外に移動される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＰＥＧ沈殿と中空糸濃縮抗原との間の質の差を図示している。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用される場合、「約３週間」が１７日～２５日であり、約２週間～約４週間が１０日～４０日である週単位の時間間隔に関して「約」が使用されない限り、その変数の表示値と、表示値の実験誤差以内（例えば、平均の９５％信頼区間以内）の変数値または表示値の１０パーセント以内の変数値のいずれか大きい方のすべての変数値を指す。
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変数に関連して使用される場合、「約３週間」が１７日～２５日であり、約２週間～約４週間が１０日～４０日である週単位の時間間隔に関して「約」が使用されない限り、その変数の表示値と、表示値の実験誤差以内（例えば、平均の９５％信頼区間以内）の変数値または表示値の１０パーセント以内の変数値のいずれか大きい方のすべての変数値を指す。
【0016】
「アジュバント」とは、抗原に対する体液性または細胞性免疫応答を増強する任意の物質を意味する。アジュバントは、通常、注射部位からの抗原の放出の防除及び免疫系の刺激という２つの目的を達成するために使用される。
【0017】
「抗体」とは、特異抗原に対する免疫応答の結果としてその抗原に結合することのできる免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンは、「定常」及び「可変」領域を有する「軽」及び「重」ポリペプチド鎖からなる血漿タンパク質であり、定常領域の組成物に基づいて複数のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）に分けられる。
【0018】
「抗原」または「免疫原」とは、免疫系によって認識され、かつ免疫応答を生成する任意の物質を指す。この用語には、死滅した、不活性化された、弱毒化された、または修飾された生の細菌、ウイルス、または寄生虫が含まれる。抗原という用語はまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含む）、組織、多糖、もしくは脂質、またはその断片が、単独で、またはそれらの任意の組み合わせで含まれる。抗原という用語にはまた、抗イディオタイプ抗体等の抗体またはその断片、及び抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープが含まれる。
【0019】
「緩衝液」とは、別の化学物質の濃度の変化を防ぐ化学系、例えば、水素イオン濃度（ｐＨ）の大きな変化を防ぐ緩衝液として作用するプロトンドナー系及び受容体系を意味する。緩衝液のさらなる例は、弱酸及びその塩（共役塩基）の混合物または弱塩基及びその塩（共役酸）の混合物を含有する溶液である。
【0020】
「～から本質的になる」とは、アジュバント製剤に適用される場合、列挙されていないさらなるアジュバント剤または免疫調節剤が測定可能なアジュバント効果または免疫調節効果を発揮する量でこれらの薬剤を含有しない製剤を指す。
【0021】
「用量」とは、対象に与えられるワクチンまたは免疫原性組成物を指す。「第１回用量」または「初回ワクチン」とは、０日目に与えられた組成物等の用量を指す。「第２回用量」または「第３回用量」または「年１回用量」とは、第１回用量と同じワクチンまたは免疫原性組成物であっても、そうなくてもよい、第１回用量の後に与えられた組成物の量を指す。
【0022】
「乳化剤」という用語は、本開示において広く使用される。それは、通常乳化剤として許容される物質、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）またはＳＰＡＮ（登録商標）の製品ラインの異なる製品（それぞれ、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル及び脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤）、及びＰＥＧ－４０ヒマシ油または別のペグ化硬化油等の異
なる溶解度向上剤を含む。
なる溶解度向上剤を含む。
【0023】
「体液性免疫応答」とは、抗体によって媒介される免疫応答を指す。
対象における「免疫応答」とは、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性及び細胞性免疫応答の発現を指す。免疫応答は、通常、当該技術分野において知られている標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを用いて判定され得る。
対象における「免疫応答」とは、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性及び細胞性免疫応答の発現を指す。免疫応答は、通常、当該技術分野において知られている標準的な免疫アッセイ及び中和アッセイを用いて判定され得る。
【0024】
「免疫学的に有効な量」または「免疫応答を生じさせるのに有効な量」は、受容者において免疫原性応答を誘発するのに有効な量である。免疫原性応答は、診断目的もしくは他の試験のために十分であり得るか、または疾患病原体の感染により生じる健康への悪影響もしくはその合併症を含む疾患の兆候もしくは症状を予防するために適し得る。体液性免疫または細胞媒介性免疫のいずれかまたはその両方が誘発すればよい。免疫原性組成物に対する動物の免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイを介して間接的に、または、野生型株での攻撃の後の兆候及び症状のモニタリングを介して直接的に判断され得、一方、ワクチンがもたらした防御免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、温度値、全身状態ならびに健康状態及び動作全体等の臨床的兆候の低減を測定することによって判断することができる。免疫応答は、細胞性免疫及び／または体液性免疫の誘発を含み得るが、これらに限定されない。
【0025】
「免疫原性」とは、免疫または抗原応答を引き起こすことを意味する。したがって、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発する任意の組成物であり得る。
「感染構内」とは、検査結果、適合する臨床兆候、ＦＭＤの症例定義、及び国際標準に基づいて、推定される陽性事例または確認された陽性事例が存在する構内を指す。
「感染構内」とは、検査結果、適合する臨床兆候、ＦＭＤの症例定義、及び国際標準に基づいて、推定される陽性事例または確認された陽性事例が存在する構内を指す。
【0026】
「感染領域」とは、推定または確認された感染構内の周辺を超えた３ｋｍ以内の場所を指す。
「脂質」とは、水中で不溶性であるが、無極性有機溶剤中では溶解可能であり、手触りが油っぽく、かつ炭水化物及びタンパク質と共に生細胞の主要な構造材料を構成する、脂肪、油、ワックス、ステロール、及びトリグリセリドを含む、有機化合物群のいずれかを指す。
「脂質」とは、水中で不溶性であるが、無極性有機溶剤中では溶解可能であり、手触りが油っぽく、かつ炭水化物及びタンパク質と共に生細胞の主要な構造材料を構成する、脂肪、油、ワックス、ステロール、及びトリグリセリドを含む、有機化合物群のいずれかを指す。
【0027】
「薬学的に許容される」とは、医学的な正しい判断の範囲内にある、不必要な毒性、刺激、アレルギー応答等を伴わずに対象の組織と接触させての使用に好適な、妥当な損益比に見合う、かつそれらの意図された使用にとって有効な物質を指す。
【0028】
「ＴＣＩＤ５０」とは、「細胞培養感染量」を指し、接種された細胞培養の所与のバッチの５０％に感染させることが必要とされるウイルスの希釈として定義される。本明細書全体に渡って使用されるＳｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を含む、多様な方法を用いて、ＴＣＩＤ５０を計算し得る。Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法の記載については、Ｂ．Ｗ．Ｍａｈｙ＆Ｈ．Ｏ．Ｋａｎｇｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，２５～４６頁（１９９６年）を参照されたい。
【0029】
持続的な感染または保菌動物とは、臨床疾患の感染または発病後２８日を経過したＦＭＤウイルスを出芽した動物である。
アジュバント製剤及び製造方法
本願は、本発明に好適ないくつかのアジュバント製剤を開示している。これらのアジュバントに共通する特徴は、油及び１つ以上の乳化剤の存在であり、油相は、本明細書で開示したアジュバント製剤を包含する少なくとも５０％のワクチン組成物を含む。
アジュバント製剤及び製造方法
本願は、本発明に好適ないくつかのアジュバント製剤を開示している。これらのアジュバントに共通する特徴は、油及び１つ以上の乳化剤の存在であり、油相は、本明細書で開示したアジュバント製剤を包含する少なくとも５０％のワクチン組成物を含む。
【0030】
複数の油及びそれらの組み合わせは、本発明の使用に好適である。これらの油には、動
物油、植物油、ならびに非代謝油が含まれるが、これらに限定されない。本発明に好適な植物油の非限定的な例は、トウモロコシ油、ピーナッツ油、大豆油、ココナツ油、及びオリーブ油である。動物油の非限定的な例は、スクアランである。非代謝油の好適な非限定的な例には、軽質鉱油、直鎖または分岐の飽和油等が含まれる。
物油、植物油、ならびに非代謝油が含まれるが、これらに限定されない。本発明に好適な植物油の非限定的な例は、トウモロコシ油、ピーナッツ油、大豆油、ココナツ油、及びオリーブ油である。動物油の非限定的な例は、スクアランである。非代謝油の好適な非限定的な例には、軽質鉱油、直鎖または分岐の飽和油等が含まれる。
【0031】
一連の実施形態において、本発明のアジュバント製剤で用いる油は、軽質鉱油である。本明細書で用いる場合、「鉱油」という用語は、蒸留技術によってペトロラタムから得られる液体炭化水素の混合物を指す。この用語は、「液体パラフィン」及び「液体ペトロラタム」、及び「白色鉱油」と同義である。この用語はまた、「軽質鉱油」、すなわち、ペトロラタムの蒸留により同様に得られるが、但し、白色鉱油よりもわずかに低い比重である油を含むことも、意図する。例えば、ＲＥｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈＡＲｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、７８８頁及び１３２３頁）を参照されたい。鉱油は、例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｐａ．）、またはＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＬＥｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）等の種々の商業的供給源から得ることが可能である。好ましい鉱油は、ＤＲＡＫＥＯＬ（登録商標）の名前で市販されている軽質鉱油である
ＦＭＤ持続を予防または除去するのに特に好適な、ある特定の実施形態において、油相は、ワクチン組成物の５０体積％～９５体積％の量で、５０体積％～８５体積％の量で、より好ましくは５０体積％～６０体積％の量で、より好ましくは５０～５２ｖ／ｖ％を超える量で存在する。油相には、任意のかかる乳化剤が存在する場合、油及び乳化剤（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等）が含まれる。油相の体積は、油及び乳化剤の体積の合計として計算される。したがって、例えば、油の体積が組成物の４０％であり、乳化剤の体積が組成物の１２％である場合、油相は、組成物の５２ｖ／ｖ％で存在し得る。同様に、油が組成物の約４５％の量で存在し、かつ乳化剤が組成物の約６％の量で存在する場合、油相は、組成物の約５１ｖ／ｖ％の量で存在する。
ＦＭＤ持続を予防または除去するのに特に好適な、ある特定の実施形態において、油相は、ワクチン組成物の５０体積％～９５体積％の量で、５０体積％～８５体積％の量で、より好ましくは５０体積％～６０体積％の量で、より好ましくは５０～５２ｖ／ｖ％を超える量で存在する。油相には、任意のかかる乳化剤が存在する場合、油及び乳化剤（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等）が含まれる。油相の体積は、油及び乳化剤の体積の合計として計算される。したがって、例えば、油の体積が組成物の４０％であり、乳化剤の体積が組成物の１２％である場合、油相は、組成物の５２ｖ／ｖ％で存在し得る。同様に、油が組成物の約４５％の量で存在し、かつ乳化剤が組成物の約６％の量で存在する場合、油相は、組成物の約５１ｖ／ｖ％の量で存在する。
【0032】
本発明のアジュバントは本発明のワクチンの一部のみを構成するため、油相は、本発明のアジュバントの各々の５０体積％～９５体積％の量で、好ましくは５０体積％～８５体積％より大きい量で、より好ましくは５０体積％～６０体積％の量で、より好ましくは５０～５２ｖ／ｖ％の量で存在することも理解すべきである。
【0033】
実施形態のサブセットにおいて、油及び油溶性乳化剤を足し合わせた体積パ―セントは、少なくとも５０％であり、例えば、５０体積％～９５体積％、好ましくは５０体積％～８５体積％より大きい量で、より好ましくは５０体積％～６０体積％の量で、より好ましくは５０～５２ｖ／ｖ％の量で存在する。したがって、例えば、油は４５体積％の量で存在し得、脂溶性乳化剤は、５ｖ／ｖ％を超える量で存在し得るが、これらに限定されない。したがって、油及び油溶性乳化剤を足し合わせた体積パーセントは、少なくとも５０体積％であり得る。
【0034】
本発明のすべてのワクチンに適用可能である、また別のサブセットにおいて、油の体積パーセントは、ワクチン組成物の４０％を超え、例えば、４０体積％～９０体積％、４０体積％～８５体積％、４３体積％～６０体積％、４４～５０ｖ／ｖ％である。
【0035】
本発明のエマルションでの使用に好適な乳化剤には、天然の生物学的に適合性のある乳化剤及び非天然の合成界面活性剤が含まれる。生物学的に適合性のある乳化剤には、リン脂質化合物及びリン脂質の混合物が含まれる。好ましいリン脂質は、大豆レシチンまたは卵レシチン等のホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水で洗浄し、得られた含水ゴムを分離及び乾燥することにより、ホスファチド及びトリグリセリドの混合物として得られ得る。精製された生成物は、トリグリセリド及び植物油をアセ
トン洗浄により除去した後に残留する、アセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより得られ得る。あるいは、レシチンは、種々の商業的供給源から得られ得る。他の好適なリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離されても、または慣用的に合成されてもよい。
トン洗浄により除去した後に残留する、アセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分画することにより得られ得る。あるいは、レシチンは、種々の商業的供給源から得られ得る。他の好適なリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リン脂質は、天然源から単離されても、または慣用的に合成されてもよい。
【0036】
さらなる実施形態において、本明細書で使用される乳化剤は、レシチンを含まない、または免疫学的に有効ではない量でレシチンを使用する。
本発明のアジュバント製剤での使用に好適な非天然の合成乳化剤には、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名前で市販されている）等のソルビタン系の非イオン性界面活性剤、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油等の源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ Ｍ－５３の名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標登録））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｘ））が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ－８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）及びＳＰＡＮ（登録商標）－８０（ソルビタンモノオレエート）等のＳＰＡＮ（登録商標）及びＴＷＥＥＮ（登録商標）の名前で入手可能な界面活性剤である。
本発明のアジュバント製剤での使用に好適な非天然の合成乳化剤には、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名前で市販されている）等のソルビタン系の非イオン性界面活性剤、ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ヒマシ油等の源から得られる脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、ＳＩＭＵＬＳＯＬ Ｍ－５３の名前で入手可能なステアリン酸）、ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒド重合体（ＴＹＬＯＸＡＰＯＬ（登録商標））、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標登録））；ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標登録）Ｘ））が挙げられる。好ましい合成界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ－８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）及びＳＰＡＮ（登録商標）－８０（ソルビタンモノオレエート）等のＳＰＡＮ（登録商標）及びＴＷＥＥＮ（登録商標）の名前で入手可能な界面活性剤である。
【0037】
一般的に言うと、乳化剤（複数を含む）は、０．０１体積％～４０体積％、好ましくは０．１体積％～１５体積％、より好ましくは２体積％～１０体積％の量でワクチン組成物内に存在し得る。
【0038】
本発明のアジュバント製剤内に存在するさらなる材料には、カチオン性担体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、モノホスホリピドＡ及びその類似物（ＭＰＬ－Ａ）、ポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、サポニン、第４級アンモニウム、ステロール、糖脂質、アルミニウム源（例えば、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）またはＶＡＣ２０（登録商標）湿潤ゲル）及びそれらの組み合わせが含まれる。
【0039】
好適なカチオン性担体には、デキストラン、デキストランＤＥＡＥ（及びその誘導体）、ＰＥＧ、グアーガム、キトサン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ポリエチレンイミン等のポリセルロース誘導体、ポリリジン等のポリアミノ等が含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ホスホロチオエート修飾、ハロゲン化、アルキル化（例えば、エチルまたはメチル修飾）、及びホスホジエステル修飾を含むが、これらに限定されない、修飾された骨格を有し得る、ＯＤＮ（ＤＮＡ系）、ＯＲＮ（ＲＮＡ系）オリゴヌクレオチド、またはキメラＯＤＮ－ＯＲＮ構造が含まれる。ある特定の実施形態において、ポリイノシンシチジル酸またはその誘導体（ポリＩ：Ｃ）を使用し得る。
【0041】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、特異的な塩基配列の背景におけるメチル化されていないＣＧジヌクレオチドの存在を特徴とする（ＣｐＧモチーフ）、最近記載されたクラスの薬物療法剤である。（Ｈａｎｓｅｌ ＴＴ，ＢＡＲｎｅｓ ＰＪ（ｅｄｓ）：Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ＦＯｒ Ａｓｔｈｍａ，ＡｌＬＥｒｇｙ ａｎｄ ＣＯＰＤ．Ｐｒｏｇ ＲＥｓｐｉｒ ＲＥｓ．Ｂａｓｅｌ，ＫＡＲｇｅｒ，２００１，ｖｏｌ３１，ｐｐ２２９－２３
２であり、これは参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制されており、かつ、存在する場合には通常はメチル化されている、真核細胞のＤＮＡにおいては見られないが、細菌ＤＮＡには存在し、ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡに対して免疫刺激特性を付与する。
２であり、これは参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＣｐＧモチーフは、ＣＧジヌクレオチドが抑制されており、かつ、存在する場合には通常はメチル化されている、真核細胞のＤＮＡにおいては見られないが、細菌ＤＮＡには存在し、ＣｐＧモチーフは細菌ＤＮＡに対して免疫刺激特性を付与する。
【0042】
選択された実施形態において、本発明のアジュバントは、いわゆる、Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、より好ましくは、修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド、よりいっそう好ましくは、Ｅ修飾Ｐクラスオリゴヌクレオチドを用いる。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、通常、６～２０ヌクレオチド長のパリンドロームの存在を特徴とするＣｐＧオリゴヌクレオチドである。Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、インビトロ及び／またはインビボでコンカテマーに自発的に自己集合する能力を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、厳密に言えば、一本鎖であるが、パリンドロームの存在により、コンカテマーの形成、または場合によりステムアンドループ構造の形成を可能にする。Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの全体の長さは、１９～１００ヌクレオチドであり、例えば、１９～３０ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、９０～１００ヌクレオチドである。
【0043】
本発明の一態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメイン、及び少なくとも２つのパリンドローム領域を含有し、１つのパリンドローム領域が、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であり、少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に直接またはスペーサを介して接続される。
Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られている技術に従って修飾され得る。例えば、Ｊ修飾とは、ヨード修飾されたヌクレオチドを指す。Ｅ修飾とは、エチル修飾されたヌクレオチド（複数を含む）を指す。したがって、Ｅ修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは５’ヌクレオチド）がエチル化される。さらなる修飾には、６－ニトロ－ベンズイミダゾールの付着、Ｏ－メチル化、プロイニル－ｄＵによる修飾、イノシン修飾、（好ましくは、ウリジンへの）２－ブロモビニルの付着が含まれる。
Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で知られている技術に従って修飾され得る。例えば、Ｊ修飾とは、ヨード修飾されたヌクレオチドを指す。Ｅ修飾とは、エチル修飾されたヌクレオチド（複数を含む）を指す。したがって、Ｅ修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは５’ヌクレオチド）がエチル化される。さらなる修飾には、６－ニトロ－ベンズイミダゾールの付着、Ｏ－メチル化、プロイニル－ｄＵによる修飾、イノシン修飾、（好ましくは、ウリジンへの）２－ブロモビニルの付着が含まれる。
【0044】
Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、ホスホジエステル結合及びホスホロチオエート結合が含まれるが、これらに限定されない、修飾されたヌクレオチド間結合も含有し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、合成されても、商業的供給源から得られてもよい。
【0045】
Ｐクラスオリゴヌクレオチド及び修飾Ｐクラスオリゴヌクレオチドは、２００８年６月１２日に公開された公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／０６８６３８号においてさらに開示されている。修飾Ｐクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの好適な非限定的な例を、以下に提供する（「＊」は、ホスホロチオエート結合を指し、「－」は、ホスホジエステル結合を指す）。
【0046】
【表1】
【0047】
アジュバント組成物で用いるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、使用されるＰクラス免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びその対象とする種の性質に依存する。
油及び乳化剤（複数を含む）に加えて、アジュバント製剤はまた、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせを含む（または、本質的にそれからなる、あるいは、それからなる）。これらのアジュバントは、「ＴＸＯ」と称される。
油及び乳化剤（複数を含む）に加えて、アジュバント製剤はまた、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオン性担体との組み合わせを含む（または、本質的にそれからなる、あるいは、それからなる）。これらのアジュバントは、「ＴＸＯ」と称される。
【0048】
一連の実施形態において、ＴＸＯアジュバントはまた、Ａｌ（ＯＨ）３ゲル等のアルミニウム源を含み得る。アルミニウムを含むＴＸＯアジュバントは、「ＴＸＯ－Ａ」と称される。
【0049】
一連の実施形態において、アジュバントＴＸＯ及びＴＸＯ－Ａは、任意に、例えば、コレステロール、ラノステロール、スチグマステロール等のステロールを含有し得る。ステロールを含有するＴＸＯ及びＴＸＯ－Ａアジュバントは、それぞれ、ＴＣＸＯ及びＴＣＸＯ－Ａと称される。任意に存在するステロールは、最大約１０００μｇ／用量（例えば、１００～１０００μｇ、２００～１０００μｇ、２５０～７００μｇ、または約４００～５００μｇ）の量で存在し得る。
【0050】
一連の実施形態において、ＴＸＯアジュバント内に、好ましくは回文配列を含有し、かつ任意に修飾骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、好ましくはＯＤＮが、５～４００μｇ／用量の量で存在し得、かつポリカチオン性担体が、５～４００ｍｇ／用量の量で存在し得る。
【0051】
例えば、ある特定の実施形態において、一用量のＴＸＯは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの約５～４００μｇ／用量（例えば、６．２５～２００μｇ、または６．２５～１００μｇ、または６．２５～５０μｇ、または６．２５～２５μｇ、または６．２５～１０
μｇ、または１０～２００μｇ、または２５～２００μｇ、または２５～１００μｇ、または２５～５０μｇ、または２５～１００μｇ、または５０～１００μｇ／用量）を含み得、かつポリカチオン性担体は、約５～約５００ｍｇ／用量（例えば、６．２５～２００ｍｇ、または６．２５～１００ｍｇ、または６．２５～５０ｍｇ、または６．２５～２５ｍｇ、または６．２５～１０ｍｇ、または１０～２００ｍｇ、または２５～２００ｍｇ、または２５～１００ｍｇ、または２５～５０ｍｇ、または２５～１００ｍｇ、または５０～１００ｍｇ／用量）の量で存在し得る。
μｇ、または１０～２００μｇ、または２５～２００μｇ、または２５～１００μｇ、または２５～５０μｇ、または２５～１００μｇ、または５０～１００μｇ／用量）を含み得、かつポリカチオン性担体は、約５～約５００ｍｇ／用量（例えば、６．２５～２００ｍｇ、または６．２５～１００ｍｇ、または６．２５～５０ｍｇ、または６．２５～２５ｍｇ、または６．２５～１０ｍｇ、または１０～２００ｍｇ、または２５～２００ｍｇ、または２５～１００ｍｇ、または２５～５０ｍｇ、または２５～１００ｍｇ、または５０～１００ｍｇ／用量）の量で存在し得る。
【0052】
ある特定の実施形態において、ＴＸＯアジュバントは、下記のように調整され、
ａ）ソルビタンモノオレエートが、軽質鉱油内に溶解される。得られた油剤は、除菌濾過され、
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デキストランＤＥＡＥ及びポリエトキシ化（２０）ソルビタンモノオレエートは、水相内に溶解され、よって水溶液を形成し、かつ
ｃ）継続的な均質化の下で油剤に水溶液を加え、よってアジュバント製剤ＴＸＯを形成する。
ａ）ソルビタンモノオレエートが、軽質鉱油内に溶解される。得られた油剤は、除菌濾過され、
ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デキストランＤＥＡＥ及びポリエトキシ化（２０）ソルビタンモノオレエートは、水相内に溶解され、よって水溶液を形成し、かつ
ｃ）継続的な均質化の下で油剤に水溶液を加え、よってアジュバント製剤ＴＸＯを形成する。
【0053】
一連の実施形態において、ＴＸＯ－Ａアジュバント内に、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＸＯアジュバントとして存在し、アルミニウム源が、最大４０ｖ／ｖ％（例えば、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％）の量で存在する。一連の実施形態において、アルミニウム源が、ワクチン組成物の２ｖ／ｖ％～２０ｖ／ｖ％、より好ましくは約５ｖ／ｖ％～約１７ｖ／ｖ％で存在する。
【0054】
ある特定の実施形態において、ＴＸＯ－Ａアジュバントは、ＴＸＯアジュバントと同様に調製され、アルミニウム源が、水溶液に加えられる。
ＴＣＸＯ及びＴＣＸＯ－Ａアジュバントの調製において、コレステロールが油剤に溶解され、かつＴＣＸＯ及びＴＣＸＯ－Ａを製造する他のステップは、それぞれ、ＴＸＯ及びＴＸＯ－Ａの調製において使用されたステップと同様である。
抗原
発明者らは、驚くべきことに、本発明のアジュバントが、抗原の用量をＦＭＤウイルスの１０μｇ～０．５μｇ低減したときであっても、口蹄疫からの十分な保護をもたらすことが可能であることを発見した。したがって、本発明の異なる実施形態において、ＦＭＤウイルスの量が、０．５μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、または約１０μｇであり得る。抗原の量が、ＦＭＤウイルスの０．５～１μｇ、１～２μｇ、２～３μｇ、３～４μｇ、４～５μｇ、５～６μｇ、６～８μｇ、８～１０μｇ（１４０個のＳ粒子）であり得る。
ＴＣＸＯ及びＴＣＸＯ－Ａアジュバントの調製において、コレステロールが油剤に溶解され、かつＴＣＸＯ及びＴＣＸＯ－Ａを製造する他のステップは、それぞれ、ＴＸＯ及びＴＸＯ－Ａの調製において使用されたステップと同様である。
抗原
発明者らは、驚くべきことに、本発明のアジュバントが、抗原の用量をＦＭＤウイルスの１０μｇ～０．５μｇ低減したときであっても、口蹄疫からの十分な保護をもたらすことが可能であることを発見した。したがって、本発明の異なる実施形態において、ＦＭＤウイルスの量が、０．５μｇ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、または約１０μｇであり得る。抗原の量が、ＦＭＤウイルスの０．５～１μｇ、１～２μｇ、２～３μｇ、３～４μｇ、４～５μｇ、５～６μｇ、６～８μｇ、８～１０μｇ（１４０個のＳ粒子）であり得る。
【0055】
現在、ＦＭＤの７つの血清型が単離されている。このウイルスの７つの血清型のうち、Ａ、Ｃ、Ｏ、Ａｓｉａ１及びＳＡＴ３には、はっきりした系統があるように映り、ＳＡＴ１及びＳＡＴ２は、分解されていない分岐群である。各血清型内に、複数の株が存在する。例えば、Ａ２４クルゼイロは、血清型Ａに属し、Ｏ１Ｃａｍｐｏｓは、血清型Ｏに属する。
【0056】
任意の血清型のＦＭＤウイルスは、かかるウイルスが病原性でないという条件で、本発明の抗原として使用され得る。病原性は、ウイルスの不活性化、例えば、ホルムアルデヒドまたはＢＥＩによる治療によって低減される場合がある。
【0057】
ある特定の実施形態において、ウイルスは、培養継代によって、または遺伝子組み換え手段を介して弱毒化される場合がある。例えば、リーダータンパク質Ｌｐｒｏコード領域の欠損が、ウシ及びブタにおいて弱毒化されたＦＭＤウイルスをもたらすことが、これまでに証明されている。例えば、米国特許第ＵＳ５，８２４，３１６号、米国特許第ＵＳ８
，７６５，１４１号、ウイルス学１９９７ ２２７（１）：９６－１０２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２０１２ ８６：１１６７５－１１６８５を参照されたい。Ｌタンパク質のＳＡＰドメイン内の位置５５及び５８での点突然変異がまた、細胞培養内の軽度に弱毒化された表現型を発現した生存ウイルスをもたらし、かつブタのＦＭＤモデルにおいて保護的であった。米国特許第ＵＳ８，８４６，０５７号を参照されたい。
，７６５，１４１号、ウイルス学１９９７ ２２７（１）：９６－１０２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ２０１２ ８６：１１６７５－１１６８５を参照されたい。Ｌタンパク質のＳＡＰドメイン内の位置５５及び５８での点突然変異がまた、細胞培養内の軽度に弱毒化された表現型を発現した生存ウイルスをもたらし、かつブタのＦＭＤモデルにおいて保護的であった。米国特許第ＵＳ８，８４６，０５７号を参照されたい。
【0058】
ある特定の実施形態において、ウイルスはまた、ＤＩＶＡ（ワクチン接種を受けた動物から感染したものを識別する）アッセイを可能にする陰性抗原マーカーを含有する。ある特定の実施形態において、陰性抗原マーカーが、３Ｄ及び／または３Ｂタンパク質に導入される。例えば、配列番号１９、２０、２１、２２を参照されたい。
【0059】
他のウイルスと同様に、ＦＭＤウイルスは、継続的に進化し、かつ突然変異するため、それに対してワクチン接種する際の困難の１つは、血清型間で、かつ血清型内であっても大きなばらつきがあることである。血清型間に干渉効果がなく（１つの血清型に対するワクチンは、必ずしも、任意の他のワクチンに効果があるわけではない）、加えて、所与の血清型内の２つの株は、所与の遺伝子に対して３０％も異なるヌクレオチド配列を有し得る。これは、ＦＭＤワクチンが関連する株に高度に特異的でなければならないことを意味している。
【0060】
したがって、ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼ制限部位が、ウイルスのゲノムに導入され、ここでは異種ＦＭＤ株からのタンパク質の導入（例えば、外側カプシドを形成するタンパク質）を可能にする。
【0061】
ある特定の実施形態において、抗原成分は、リーダータンパク質の欠損、３Ｂ及び／または３Ｄタンパク質の陰性マーカー突然変異によって、かつ異種株からの抗原（例えば、カプシドタンパク質）の配列のより容易な導入のための制限エンドヌクレアーゼ部位の導入によって、任意に修飾され得るＦＭＤ株Ａ２４クルゼイロを含む。抗原の好適な非制限的な例は、米国特許第ＵＳ８，７６５，１４１号に記載されている。遺伝的に修飾されたＦＭＤＶのＲＮＡゲノムに対応するＤＮＡ配列がまた、配列番号１５（Ａ２４ＬＬ３ＤＹＲ）及び配列番号１７（Ａ２４ＬＬ３ＢＰＶＫＶ３ＤＹＲ）に提供される。したがって、例えば、配列番号１５に記載されたＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列は、ＦＭＤＶウイルスのＲＮＡゲノム（すなわち、ＦＭＤＶをコードするＲＮＡ）に対する鋳型であり、すなわち、それと相補的であり、またはそれを「コードする」。ある特定の実施形態において、ウイルスは、異種ＦＭＤ株（すなわち、系統Ｃ、Ｏ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ３、ＳＡＴ１及びＳＡＴ２、Ｔｕｒｋｅｙ０６の株、及び系統Ａの他の株を含むが、これらに限定されない、Ａ２４クルゼイロ以外のＦＭＤの株）のカプシドタンパク質を含む。かかる異種抗原の非制限的な例を、配列番号２３（Ａｓｉａ１－Ａ２４ＬＬ３ＢＰＶＫＶ３ＤＹＲ）及び配列番号２４（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／０６－Ａ２４ＬＬ３ＢＰＶＫＶ３ＤＹＲ）に図示している。さらに、Ｏ１Ｃａｍｐｏｓ－Ａ２４ＬＬ３ＢＰＶＫＶ３ＤＹＲ（全ゲノム、Ｏ１ｃａｍｐｏｓとも称される）、Ｃ３Ｉｎｄａｉａｌ－Ａ２４ＬＬ３ＢＰＶＫＶ３ＤＹＲ（全ゲノム）、及びカプシドＡｒｇｅｎｔｉｎａ２００１イソ９３（カプシド及び２Ａ部分的配列）が、それぞれ、配列番号２５、２６、及び２７に提供される。
【0062】
かかる抗原の変異型がまた、想定される。変異型は、標準パラメータを用いて記載された整列プログラムのうちの１つを用いた基準配列と少なくとも８０％一致し（例えば、８５％一致する）、９０％一致し、９５％一致し、９６％一致し、９７％一致し、９８％一致し、または９９％一致する。ＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＰＨＩＬＩＰを含むが、これらに限定されない、配列同一性を判定するための複数の整列ツールが入手可能である。
【0063】
当業者であれば、これらの値が、コドンの縮退、アミノ酸類似性、読取枠の位置付け等を考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によりコードしたタンパク質の対応する同一性を判定するために適切に調節され得ることを理解するだろう。
【0064】
ある特定の実施形態において、変異型は、特異的で例示的なヌクレオチドまたはアミノ酸配列を超えるものを包含し、かつその機能的等価物を含む。所与の部位に化学的に等価なアミノ酸の生成を生じるが、コードしたポリペプチドの機能的特性に影響を与えない核酸の断片の変更例が、当該技術分野において知られている。したがって、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸に対するコドンは、グリシン等の別の疎水性の低い残基、またはバリン、ロイシン、またはイソロイシン等の疎水性の高い残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、グルタミン酸に対する別のアスパラギン酸等に対する１つの陰電荷を持つ残基、またはアルギニンに対する別のリジン等に対する１つの陽電荷を持つ残基の置換をもたらす変化はまた、機能的に等価な製品を生成することが期待できる。ポリペプチド分子のＮ末端及びＣ末端部の変更を生じるヌクレオチドの変化はまた、ポリペプチドのアッセイを変更することが期待されないだろう。提案された修飾の各々は、コードした製品の生物学的活性の保持の判定のように、当該技術分野の所定の技術内にある。
【0065】
本発明のポリペプチドはまた、アミノ酸置換、欠損、切断、及び挿入を含む多様な方法で変更され得る。本発明のタンパク質の要素及び断片を組み合わせることによって、かつ他のタンパク質を用いて、関心の特性を有する新規のタンパク質が生成される。かかる操作の方法は、通常、当該技術分野において知られている。したがって、本発明の遺伝子及びヌクレオチド配列には、自然に発生した配列及び突然変異の形態の両方が含まれる。同様に、本発明のタンパク質には、自然に発生したタンパク質ならびに変形例、及びその修飾形態が含まれる。かかる変異型は、親ＦＭＤウイルスの所望の修飾活性を保持し続けるだろう。変異型をコードしたＤＮＡにおいて生じ得る突然変異は、読取枠の配列を配置してはならず、好ましくは、二次的なｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的な領域を生成しないだろう。
【0066】
本発明に好適な抗原を増殖及び精製する方法が、当該技術分野において知られており、中空糸濾過及びＰＥＧ沈殿を含むが、これらに限定されない。これらの方法は、いくらか異なる抗原組成物を生み出す。例えば、ＰＥＧ沈殿では、抗原組成物は、非構造的なタンパク質が枯渇している。例えば、中空糸濾過等の他の方法では、抗原組成物は、構造的及び非構造的ＦＭＤタンパク質の両方を含有している。したがって、ある特定の実施形態において、ＦＭＤ抗原は、構造的タンパク質を含む。例えば、ＦＭＤ抗原が中空糸濾過によって調製される、他の実施形態において、ＦＭＤ抗原は、構造的及び非構造的タンパク質の両方、具体的には３Ｄタンパク質を含む。
【0067】
感染動物からワクチン接種を受けたものを識別するための固有の抗原マーカーを欠いている、現在のワクチンプラットフォームを使用すると、非構造的タンパク質に対する抗体の存在が感染動物を特定するという事実に起因して、これが未だ望ましいため、非構造的タンパク質の除去が望ましい。しかしながら、ＦＭＤＬＬ３Ｂ３Ｄプラットフォームとの関連において、抗原調製における非構造的タンパク質の存在は、ワクチン接種を受けたもとと感染動物との識別を妨げるものではない。非構造的タンパク質及びアジュバントを含む本発明の抗原製剤が、精製された抗原製剤より少ない用量で臨床疾患に対する保護を提供し、また、反芻動物における持続感染のより有用な構築を防止するのは、このような関連においてである。
【0068】
組成物
本発明の組成物は、標準的な緩衝液、安定剤、賦形剤、保存剤及び／または溶解剤等の、ヒトを含む動物に対する許容される担体を含む許容される慣例に従って製剤化され得、
また、持続的な放出を促進するように製剤化され得る。賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリコール等が含まれる。等張性に対する添加剤には、特に、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれる。安定剤には、特に、アルブミンが含まれる。修飾された生ワクチンを製剤化するのに特に有用であるものを含む、他の好適な賦形剤及び添加剤が知られており、または当業者に明らかであるだろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＲＥｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈＡＲｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０年，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
本発明の組成物は、標準的な緩衝液、安定剤、賦形剤、保存剤及び／または溶解剤等の、ヒトを含む動物に対する許容される担体を含む許容される慣例に従って製剤化され得、
また、持続的な放出を促進するように製剤化され得る。賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリコール等が含まれる。等張性に対する添加剤には、特に、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれる。安定剤には、特に、アルブミンが含まれる。修飾された生ワクチンを製剤化するのに特に有用であるものを含む、他の好適な賦形剤及び添加剤が知られており、または当業者に明らかであるだろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＲＥｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ＰｈＡＲｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０年，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【0069】
本発明の組成物は、例えば、特に、追加のアジュバント、またはサイトカイン等の１つ以上の追加の免疫調節性成分をさらに含み得る。本発明のワクチンにおいて使用され得るかかる追加のアジュバントの非制限的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＩＢｉ社、モントリオールハミルトン）、フロイント完全及び不完全アジュバント、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）、ＱＳ－２１（ＣａｍｂＲＩｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カルフォルニア州エメリービル）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、及びアブリジンリピド－アミンアジュバントが含まれる。ワクチンに含まれ得る他の免疫調整剤には、例えば、１つ以上のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインが含まれる。
【0070】
アジュバント組成物の投与の経路には、非経口、経口、口鼻、経鼻、気管内、局所、皮下、筋肉内、経皮、皮内、腹腔内、眼球内、静脈内、舌投与が含まれる。注射器、ドロッパー、無針注射デバイス、パッチ等を含む、任意の好適なデバイスが、組成物を投与するために用いられ得る。使用のために選択された経路及びデバイスは、アジュバントの組成物、抗原、及び対象に依存し、当業者は周知である。
【0071】
ＦＭＤの高い感染性に鑑みて、ＦＭＤの発症を含有し、かつ／または除去するために行う必要がある対策は、例えば、アメリカ合衆国農務省等の規制当局によって規制され、かつＯＩＥ（国際獣疫事務局）等の国際機関によって承認されている。対策は、動物の移動の停止、乳、肉、皮等を含む動物製品の移動に対する有用な防除、抜き打ち政策（罹患した群の動物、及び適切な場合、動物間の直接接触により、または病原体との関節接触により感染を被った他の群の動物の屠殺）を含み得るが、これらに限定さない。隣接する群の動物は、ワクチン接種を受けた後に屠殺されることが多い。
【0072】
発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載した一定の免疫原性組成物が、感染後２８日より長期間、ＦＭＤの存在または出芽として定義される持続を防ぐことを発見した。ある特定の実施形態において、かかる免疫原性組成物が、抗原成分及びアジュバント成分を含み、アジュバント成分が、油相を含有するエマルションを含み（または、それから本質的になる、またはそれからなる）、かかる油相が、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分が、少なくとも６μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含む。。
【0073】
ある特定の実施形態において、抗原は、６～２０μｇ／用量のＦＭＤウイルス、例えば、８～２０、１０～２０、１２～２０、１４～２０、１６～２０、１８～２０、６～１０、６～１２、６～１８、８～１２、または８～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量で存在し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０μｇ／用量であり得る。ポリカチオン性高
分子は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０ｍｇ／用量の量で存在し得る。
分子は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０ｍｇ／用量の量で存在し得る。
【0074】
したがって、本発明はまた、抗原成分及びアジュバント成分を含む免疫原性組成物を感染前の反芻動物に投与することを含む、ＦＭＤに感染した反芻動物のＦＭＤ持続の頻度を低減する方法を提供し、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み（または、本質的にそれからなる、もしくはそれからなる）、油相は、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量の量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分は、少なくとも６μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ（口蹄疫）抗原を含む。
【0075】
異なる実施形態において、抗原の量は、６～２０μｇ／用量のＦＭＤウイルス、例えば、８～２０、１０～２０、１２～２０、１４～２０、１６～２０、１８～２０、６～１０、６～１２、６～１８、８～１２、または８～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０μｇ／用量であり得る。ポリカチオン性高分子は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０ｍｇ／用量の量で存在し得る。
【0076】
免疫原性組成物の反芻動物への投与（例えば、ウシ、ヒツジ、ラクダ等）は、群管理の実施の変更を可能にする。ある特定に実施形態において、群のワクチン接種を受けたメンバーは、ＦＭＤウイルスとの接触が疑われた後に屠殺されない。
【0077】
代替的な（またはさらなる）実施形態において、ワクチン接種を受けた動物が、より短時間、隔離状態にされる。したがって、ある特定の実施形態において、ＦＭＤとの接触が疑われる動物が、３０日未満、例えば、２８日間または２９日間、隔離状態にされる場合がある。
【0078】
さらに、封じ込め領域としてのエリアの指定は、通常、３０日以上の封じ込め領域からの動物または動物製品の移動の禁止という厳しい制限を意味している。したがって、ある特定の実施形態において、ＦＭＤとの接触が疑われる動物は、ＦＭＤとの接触が疑われるものから３０日未満以内に、例えば、２８日または２９日以内に、封じ込め領域から移動される場合がある。
【0079】
抗原成分が、例えば、上に記載したように、遺伝子操作されたＦＭＤ抗原を必要とする実施形態において、感染動物からワクチン接種を受けたものを識別することが可能である。したがって、さらなる実施形態において、群を管理する方法（または、ＦＭＤに感染した反芻動物のＦＭＤ持続の頻度を低減する方法）。
【0080】
つまり、ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、抗原成分及びアジュバント成分を含み、アジュバント成分は、油相を含有するエマルションを含み（または、本質的にそれからなる、もしくはそれからなる）、油相が、少なくとも５０ｖ／ｖ％の免疫原性組成物、７５～２００μｇ／用量の免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及び７５～２００ｍｇ／用量のポリカチオン性高分子を含み、抗原成分が、少なくとも６μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含み、抗原成分が、群管理に使用され得る、少なくとも６μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当する量のＦＭＤ抗原を含み、ＦＭＤとの接触が疑われる場合に、群のワクチン接種を受けたメンバーは、接触が疑われた後０～３０日間
屠殺されず、かつ／または検疫され、かつ／または接触が疑われる３０日以内に感染構内の外に移動される。
屠殺されず、かつ／または検疫され、かつ／または接触が疑われる３０日以内に感染構内の外に移動される。
【0081】
異なる実施形態において、抗原の量は、６～２０μｇ／用量のＦＭＤウイルス、例えば、８～２０、１０～２０、１２～２０、１４～２０、１６～２０、１８～２０、６～１０、６～１２、６～１８、８～１２、または８～１０μｇ／用量のＦＭＤウイルスに相当し得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの量は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０μｇ／用量であり得る。ポリカチオン性高分子は、例えば、７５～１００、７５～１２５、７５～１５０、７５～１５０、１００～２００、１００～１５０、１２５～２００、１２５～１７５、または１２５～１５０ｍｇ／用量の量で存在し得る。
【0082】
本発明は、以下の非限定的な例においてさらに説明されるであろう。
【実施例】
【0083】
実施例１．抗原の調製
２つの方法を使用して中空糸濾過及びＰＥＧ沈殿を調製した。
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿の方法は、当該技術分野において知られている。簡潔に言えば、ＢＨＫ－２１細胞をＦＭＤウイルスに感染させた。次に（２４～３６時間後）、凍結溶解によって細胞を溶解させ、低速遠心分離（５００ｘｇ）によって細胞溶解物を細胞残骸から浄化させた。構造的及び非構造的タンパク質の両方を含有する上澄みに、ＰＥＧ（８ｗ／ｖ％）を加えた。混合物を４℃で１２～１８時間培養した。この培養中、ＦＭＤＶ粒子をＰＥＧと関連付けた。１６，０００ｘｇの遠心分離、ならびにＰＥＧ及びウイルスを含有した沈殿ペレットの採取によって、抗原を回収した。細胞及びウイルスの非構造タンパク質を含有した上澄みを捨てた。次に、ウイルス粒子が結合したペレットを少量の緩衝液で洗浄してＰＥＧからＦＭＤＶ粒子を溶出させた。
２つの方法を使用して中空糸濾過及びＰＥＧ沈殿を調製した。
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿の方法は、当該技術分野において知られている。簡潔に言えば、ＢＨＫ－２１細胞をＦＭＤウイルスに感染させた。次に（２４～３６時間後）、凍結溶解によって細胞を溶解させ、低速遠心分離（５００ｘｇ）によって細胞溶解物を細胞残骸から浄化させた。構造的及び非構造的タンパク質の両方を含有する上澄みに、ＰＥＧ（８ｗ／ｖ％）を加えた。混合物を４℃で１２～１８時間培養した。この培養中、ＦＭＤＶ粒子をＰＥＧと関連付けた。１６，０００ｘｇの遠心分離、ならびにＰＥＧ及びウイルスを含有した沈殿ペレットの採取によって、抗原を回収した。細胞及びウイルスの非構造タンパク質を含有した上澄みを捨てた。次に、ウイルス粒子が結合したペレットを少量の緩衝液で洗浄してＰＥＧからＦＭＤＶ粒子を溶出させた。
【0084】
本明細書に記載したさらなる方法は、ＦＭＤＶ培養の上澄みの中空糸濃度に基づいている。本方法のステップは、まず、細胞残骸及び大きい材料を培養（ＦＭＤウイルスに感染し、かつ凍結溶解によって溶解したＢＨＫ－２１細胞）から除去する。培養材料を、１０μｍのカプセルフィルタ、４．５μｍのカプセルフィルタを通して、次に最後に０．８μｍ／０．２μｍのフィルタを通して連続的に圧送した。次に、０．０１μｍ未満の粒子が膜を通って流動することを可能にする中空糸限外濾過カートリッジを用いて、この濾液を濃縮した。ＦＭＤＶ粒子及び多数の非構造的タンパク質がカラム回路内に残っていると同時に、液体及びより小さいタンパク質は、膜を通して廃棄物へと流れる。濃縮物が所望の体積、通常、１０倍の濃度に達するまで、カラム回路を走行させた。
【0085】
図１は、ＰＥＧ沈殿抗原と中空糸濃縮抗原との間の質の差を図示しているウェスタンブロットである。中空糸濃縮抗原は、３Ｄタンパク質、最大ＦＭＤＶ非構造的タンパク質、及びカプシドタンパク質（構造的タンパク質）に対する特異的な抗体を用いたウェスタンブロット染色によって本図に示すように、大量の構造的及び非構造的タンパク質を含有する。対照的に、ＰＥＧ沈殿抗原（レーン９）は、構造的タンパク質を含有するが、検出可能なレベルの３Ｄタンパク質は含有していなかった。
実施例２．ＴＸＯでアジュバントされたＦＭＤワクチンの効果
動物及び試料の採取
１８０～２３０ｋｇの体重の生後６～８カ月のホルスタイン種去勢ウシを本研究に使用した。動物は、０日で採取した血清試料から後に判定されたように、ワクチン接種の前に、３Ｄ ＥＬＩＳＡ検査によって判定されたように、ＦＭＤＶ－反応性抗体を含まなかった。ＢＳＬ－３－Ａｇ動物検査施設の１つの部屋に、２８匹すべての動物を集めた。完全
な食糧ペレットまたはアルファルファキューブを、適宜入手可能な水及び塩ブロックと共に動物に給餌した。０日の前に５日間、動物を施設に順応させた。Ｂｏｖｉ－Ｓｈｉｅｌｄ ＧＯＬＤ（登録商標）５、Ｍｉｃｏｔｉｌ（登録商標）３００、Ｌｉｑｕａｍｙｃｉｎ（登録商標）ＬＡ－２００（登録商標）、及びＤｅｃｔｏｍａｘ（登録商標）により、動物を予め治療した。連続した耳タグ番号を有する動物の群（各々、ｎ＝４）を治療群に割り当てた。
実施例２．ＴＸＯでアジュバントされたＦＭＤワクチンの効果
動物及び試料の採取
１８０～２３０ｋｇの体重の生後６～８カ月のホルスタイン種去勢ウシを本研究に使用した。動物は、０日で採取した血清試料から後に判定されたように、ワクチン接種の前に、３Ｄ ＥＬＩＳＡ検査によって判定されたように、ＦＭＤＶ－反応性抗体を含まなかった。ＢＳＬ－３－Ａｇ動物検査施設の１つの部屋に、２８匹すべての動物を集めた。完全
な食糧ペレットまたはアルファルファキューブを、適宜入手可能な水及び塩ブロックと共に動物に給餌した。０日の前に５日間、動物を施設に順応させた。Ｂｏｖｉ－Ｓｈｉｅｌｄ ＧＯＬＤ（登録商標）５、Ｍｉｃｏｔｉｌ（登録商標）３００、Ｌｉｑｕａｍｙｃｉｎ（登録商標）ＬＡ－２００（登録商標）、及びＤｅｃｔｏｍａｘ（登録商標）により、動物を予め治療した。連続した耳タグ番号を有する動物の群（各々、ｎ＝４）を治療群に割り当てた。
【0086】
ワクチン接種後、有害事象は報告されなかった。
０日（ワクチン接種前）、４日、７日、１４日、２１日（攻撃前）、２４日、２８日、３１及び４２日で、血清試料を得るための血清分離装置の血液チューブをすべての動物から回収した。血清中和法でＦＭＤＶに対する中和抗体の存在について検査するまで（源泉の５０％で同族ＦＭＤＶの１００ＴＣＩＤ５０を中和させるために最後の血清希釈の逆数として報告される）、または抗３Ｄｐｏｌ反応を研究するために（競合する酵素結合免疫吸着検査法により）、血清試料を凍結状態にした。
０日（ワクチン接種前）、４日、７日、１４日、２１日（攻撃前）、２４日、２８日、３１及び４２日で、血清試料を得るための血清分離装置の血液チューブをすべての動物から回収した。血清中和法でＦＭＤＶに対する中和抗体の存在について検査するまで（源泉の５０％で同族ＦＭＤＶの１００ＴＣＩＤ５０を中和させるために最後の血清希釈の逆数として報告される）、または抗３Ｄｐｏｌ反応を研究するために（競合する酵素結合免疫吸着検査法により）、血清試料を凍結状態にした。
【0087】
ＯＩＥ（「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＦＯｒ ＴｅｒＲＥｓｔＲＩａｌ Ａｎｉｍａｌｓ」）が推奨するように、ワクチン接種を受けたウシのワクチンの有効性に対する攻撃は、皮内舌（ＩＤＬ）経路による針注射によるものであった。ワクチン接種後２１日で、すべてのワクチン接種済み及び未接種の動物に、２，５００ＢＴＩＤ５０／０．１ｍｌを有する０．１ｍｌ／各の４回の接種として分割された同族のＦＭＤＶ Ａ２４クルゼイロの１０，０００ＢＴＩＤ５０（５０％のウシ亜科の動物の舌の感染用量）を有するＩＤＬを接種した。すべての動物が、攻撃後１０日間従わされ、熱、鼻汁、唾液分泌、食欲減退、及び／または歩行困難が発現する臨床疾患の発症を検証した。２１日（接種前）及び２４日、２８日ならびに３１日で鎮静剤（工程の持続時間に対して胸を地面につけて腹ばいになる姿勢を維持するように、０．２２ｍｇ／ｋｇでキシラジンを与えられたＩＭ）により、蹄の小嚢の存在に対する臨床評価を行った。鎮痛剤を、２ｍｇ／ｋｇの用量で、トラゾリン、ＩＶと入れ替えた。ワクチン
実施例１に記載するように、抗原を調整した。抗原貯蔵液は、中空糸濾過（プレップＡ）によって調製された５．５１μｇ／ｍｌの抗原、またはＰＥＧ沈殿（プレップＢ）によって調製された１０．２６μｇ／ｍｌの抗原を含有した。
実施例１に記載するように、抗原を調整した。抗原貯蔵液は、中空糸濾過（プレップＡ）によって調製された５．５１μｇ／ｍｌの抗原、またはＰＥＧ沈殿（プレップＢ）によって調製された１０．２６μｇ／ｍｌの抗原を含有した。
【0088】
動物に投与された免疫原性組成物の詳細を、表１に提供する。各群は、４匹の動物を含有した。
【0089】
【表2】
【0090】
群Ｔ０２～Ｔ０６の免疫原性組成物が、ワクチン接種の日に均質化され、０日の動物に投与された。
ウイルスの単離及び定量的なｒＲＴ－ＰＣＲの両方を用いて判定されたウイルス（ＦＭＤＶウイルスＲＮＡ及び／または感染ＦＭＤＶのいずれか）の存在または不存在として、持続を測定した。定量的なｒＲＴ－ＰＣＲに対して使用されたプライマは、次の通りであった。
正方向（配列番号２８）：ＧＡＣＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＡ
逆方向（配列番号２９）：ＴＧＣＧＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡ
Ｔａｑｍａｎプローブ：（ＦＡＭレポータ、ＴＡＭＲＡ消光剤、配列番号３０）ＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡＣ
ＦＭＤＶに対する血清中和価を表２に要約する。
ウイルスの単離及び定量的なｒＲＴ－ＰＣＲの両方を用いて判定されたウイルス（ＦＭＤＶウイルスＲＮＡ及び／または感染ＦＭＤＶのいずれか）の存在または不存在として、持続を測定した。定量的なｒＲＴ－ＰＣＲに対して使用されたプライマは、次の通りであった。
正方向（配列番号２８）：ＧＡＣＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＣＡ
逆方向（配列番号２９）：ＴＧＣＧＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡ
Ｔａｑｍａｎプローブ：（ＦＡＭレポータ、ＴＡＭＲＡ消光剤、配列番号３０）ＴＣＣＴＴＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＡＣ
ＦＭＤＶに対する血清中和価を表２に要約する。
【0091】
【表3】
【0092】
ａ，ｂ，ｃ各日内の同じ文字を有する治療群は、アルファ＝０．０５で有意に異ならない。
蹄の小嚢の存在（１）または不存在（０）として、ＦＭＤＶの兆候を採点し、すなわち、１個の蹄に対する小嚢の存在が、点数１を生じ、２個のみの蹄に対する小嚢の存在が、点数２を生じ、すべての４個の蹄に対する小嚢が、点数４を生じた。いったん動物が点数４を得ると、研究の持続時間の間、点数４を有するものとみなされた。
蹄の小嚢の存在（１）または不存在（０）として、ＦＭＤＶの兆候を採点し、すなわち、１個の蹄に対する小嚢の存在が、点数１を生じ、２個のみの蹄に対する小嚢の存在が、点数２を生じ、すべての４個の蹄に対する小嚢が、点数４を生じた。いったん動物が点数４を得ると、研究の持続時間の間、点数４を有するものとみなされた。
【0093】
各蹄に対する、かつ試験の各日に対する個々の動物の点数を表３に示している。表４では、任意の蹄が陽性であるかどうかに従った各動物の点数の要約を示している。
【0094】
【表4-1】
【0095】
【表4-2】
【0096】
＊この動物に対する全ての蹄が、すべての４個の蹄について小嚢を予め有したため、「１」として自動的に点数化した。
【0097】
【表5】
【0098】
＊この動物に対する全ての蹄が、すべての４個の蹄について小嚢を予め有したため、「はい」として自動的に点数化した。
Ｔ０１（陰性対照）のすべての動物が、２４日に始まる蹄の小嚢を示した。２８日及び３１日に、小嚢を有するすべてのＴ０１動物にすべての蹄が発見された。対照的に、Ｔ０３（ＰＥＧによる２μｇ用量のＦＭＤＶ）を除くすべての群に対して完全な保護（すなわち、蹄の小嚢がない）が観察され、１匹の動物（Ｒ１４－７７）が２４日、２８日、及び３１日に点数１を得た。検査された免疫原性組成物の持続感染に対する効果を表５及び表６に図示している。攻撃後２８日後（表５及び表６で示すように、ワクチン接種後４９日）の食道咽頭音流体内の感染ウイルスまたはウイルスＲＮＡの存在として、持続が定義された。表５では、プロパング試料からのｍＬ当たりＦＭＤＶ ＲＮＡ複製番号の個々の動物及び治療群の逆変換された最小二乗手段に対する定量的なｒＲＴ－ＰＣＲの結果を示している。表６では、プロパング試料ウイルス単離検査の結果を陽性または陰性のいずれかとして報告した。表５の１．８７未満の値を、アッセイの検出の制限に起因した「陰性」
として点数化した。
Ｔ０１（陰性対照）のすべての動物が、２４日に始まる蹄の小嚢を示した。２８日及び３１日に、小嚢を有するすべてのＴ０１動物にすべての蹄が発見された。対照的に、Ｔ０３（ＰＥＧによる２μｇ用量のＦＭＤＶ）を除くすべての群に対して完全な保護（すなわち、蹄の小嚢がない）が観察され、１匹の動物（Ｒ１４－７７）が２４日、２８日、及び３１日に点数１を得た。検査された免疫原性組成物の持続感染に対する効果を表５及び表６に図示している。攻撃後２８日後（表５及び表６で示すように、ワクチン接種後４９日）の食道咽頭音流体内の感染ウイルスまたはウイルスＲＮＡの存在として、持続が定義された。表５では、プロパング試料からのｍＬ当たりＦＭＤＶ ＲＮＡ複製番号の個々の動物及び治療群の逆変換された最小二乗手段に対する定量的なｒＲＴ－ＰＣＲの結果を示している。表６では、プロパング試料ウイルス単離検査の結果を陽性または陰性のいずれかとして報告した。表５の１．８７未満の値を、アッセイの検出の制限に起因した「陰性」
として点数化した。
【0099】
【表6-1】
【0100】
【表6-2】
【0101】
【表7】
【0102】
１群（生理食塩水の対照）に対して、３匹の動物が、ｒＲＴ－ＰＣＲによるＦＭＤＶに対して少なくとも１回陽性であり、２匹の動物が、ウイルス単離に対して常に陽性であった。
【0103】
Ｔ０２群では、ｒＲＴ－ＰＣＲによってＦＭＤＶを保有する動物は発見されなかったが、単一の時点のみで（４２日、攻撃後２１日）ウイルス単離アッセイによって陽性であるが、その後（持続感染の不存在を示す４９日及び５２日）陰性である１匹の動物（Ｒ１４－７４）が発見された。Ｔ０２の他の動物は、３８日以上で、ｒＲＴ－ＰＣＲによって、またはウイルス単離アッセイによってのいずれでも検出可能なＦＭＤＶを保有しなかった。
【0104】
Ｔ０３群では、１匹の動物（Ｒ１４－７９）が、ＦＭＤＶ感染から完全に保護され、２匹の動物が、検査日の３日または４日にＦＭＤＶの存在を示し（ｒＲＴ－ＰＣＲによって、またはウイルス単離アッセイによってのいずれでも）、１匹の動物（Ｒ１４－７７）が
、３８日及び４２日に検査の両方によってＦＭＤＶの存在を示したが、その後は示さなかった。
、３８日及び４２日に検査の両方によってＦＭＤＶの存在を示したが、その後は示さなかった。
【0105】
Ｔ０４群では、すべての４匹の動物が、５２日に渡る１つまたは両方の検査によってＦＭＤＶの持続を示した。
Ｔ０５群では、１匹の動物（Ｒ１４－６２）は、ｒＲＴ－ＰＣＲによってだがウイルス単離によってではなく３８日にのみウイルスの存在を示し、その後の検査によってはいずれもウイルスは検出されなかった。ＦＭＤＶは、Ｔ０５群の他の３匹の動物に対する任意の時間でのｒＲＴ－ＰＣＲによって、またはウイルス単離アッセイによってのいずれでも検出されなかった。
Ｔ０５群では、１匹の動物（Ｒ１４－６２）は、ｒＲＴ－ＰＣＲによってだがウイルス単離によってではなく３８日にのみウイルスの存在を示し、その後の検査によってはいずれもウイルスは検出されなかった。ＦＭＤＶは、Ｔ０５群の他の３匹の動物に対する任意の時間でのｒＲＴ－ＰＣＲによって、またはウイルス単離アッセイによってのいずれでも検出されなかった。
【0106】
Ｔ０６群では、２匹の動物が、持続から完全に保護されると同時に、他の２匹は、試験されたすべての時点で陽性のｒＲＴ－ＰＣＲまたはウイルス単離であった。
Ｔ０７群では、４匹の動物のうちの３匹が、完全に保護されると同時に、１匹の動物（Ｒ１４－７１）は、各時点でｒＲＴ－ＰＣＲ及びウイルス単離の両方に対して陽性であった。
Ｔ０７群では、４匹の動物のうちの３匹が、完全に保護されると同時に、１匹の動物（Ｒ１４－７１）は、各時点でｒＲＴ－ＰＣＲ及びウイルス単離の両方に対して陽性であった。
【0107】
表７は、持続実験の結果を要約する。動物は、ｎｅｉＴｈｅｒｒＲＴ－ＰＣＲまたはウイルス単離アッセイが４９日（攻撃後２８日）及び５２日（攻撃後３１日）の両方についてＦＭＤＶを検出した場合に、非持続とみなされた。
【0108】
【表8】
【0109】
８μｇの抗原を投与された８匹の動物（群Ｔ０２及びＴ０５）のうちの２匹のみが、これまでウイルスの存在を示し、それは１日のみ（各々３７日及び４２日についての１日）についてであった。これらの群の他の動物は、完全に保護された。感染後２８日及び３１日の両方についてウイルスの存在が検出されなかったことを鑑み、８μｇの抗原を投与された動物のいずれも、持続的に感染したものとみなされた。２μｇの抗原を投与された８匹の動物（群Ｔ０３及びＴ０６）のうちの５匹が、ウイルス持続を示した。０．５μｇの抗原を投与された８匹の動物（群Ｔ０４及びＴ０７）のうちの４匹が、持続を示した。
【0110】
総合すれば、これらの結果は、８μｇの抗原を投与された動物のＦＭＤＶウイルス持続からの保護を示しており、中空糸濾過による抗原の精製がＰＥＧ沈殿と比較して有益であるようである。２つの抗原製剤間の主な差は、中空糸濾過製剤内の構造的タンパク質に加えて非構造的タンパク質が存在していることである。したがって、理論によって束縛されるものではないが、表８で図示するように、抗原が構造的及び非構造的タンパク質の両方、具体的には３Ｄタンパク質を含有するワクチンによって誘発された免疫応答の質は、予防的なＦＭＤＶ持続においてより有用であるようである。
【0111】
【表9】
【0112】
本明細書で引用されるすべての刊行物（特許刊行物及び非特許刊行物の両方）は、本発明が関連する当業者の技術の水準を示す。これらの刊行物はすべて、個々の刊行物が各々参照により組み込まれたものとして明確かつ個別に示された場合と同じ程度に参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0113】
本明細書において本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態が本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示の実施形態に多くの修正を加えることができ、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の構成を考案することができることを理解されたい。
【図1】
【配列表】