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特許7233063自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-24
(45)【発行日】2023-03-06
(54)【発明の名称】自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230227BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20230227BHJP
A61K 35/32 20150101ALI20230227BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230227BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20230227BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230227BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20230227BHJP
A61P 5/16 20060101ALI20230227BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230227BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230227BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230227BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20230227BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230227BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20230227BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230227BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230227BHJP
A61P 29/02 20060101ALI20230227BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230227BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230227BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230227BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230227BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230227BHJP
C12Q 1/6881 20180101ALI20230227BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230227BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230227BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
A61K35/28
A61K35/32
A61K38/17
A61K39/395 D
A61K39/395 U
A61K45/00
A61P1/02
A61P1/04
A61P5/14
A61P5/16
A61P7/06
A61P9/00
A61P11/06
A61P17/00
A61P17/06
A61P17/14
A61P19/02
A61P19/08
A61P21/00
A61P21/04
A61P25/00
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P29/02
A61P37/02
A61P37/06
A61P37/08
C12N5/0775
C12Q1/686 Z
C12Q1/6881 Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
G01N33/53 D
G01N33/53 M
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021519517
(86)(22)【出願日】2019-06-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-14
(86)【国際出願番号】 KR2019007121
(87)【国際公開番号】W WO2019240507
(87)【国際公開日】2019-12-19
【審査請求日】2020-12-14
(31)【優先権主張番号】10-2018-0069263
(32)【優先日】2018-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520493429
【氏名又は名称】コアステム カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＲＥＳＴＥＭ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(73)【特許権者】
【識別番号】520493430
【氏名又は名称】忠北大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＵＮＧＢＵＫ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】ギム ギョンスク
(72)【発明者】
【氏名】ハン サンベ
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／２１０７４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０７４７５８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１７／１８８４０３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２８９６４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００１６１１７（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０４３２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Erin Collins, Gary Gilkeson，Hematopoetic and mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of refractory systemic lupus erythematosus - Where are we now?，Clinical Immunology，2013年，Vol.148，pp.328-334
【文献】Weiguo Sui et al.，Hematopoietic and mesenchymal stem cell transplantation for severe and refractory systemic lupus erythematosus，Clinical Immunology，2013年，Vol.148，pp.186-197
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
Ｃ１２Ｎ ５／０７７５
Ｃ１２Ｑ １／６８８１
Ｃ１２Ｑ １／６８６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３又はそのｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤を含むことを特徴とする、間葉系幹細胞の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用組成物。
【請求項2】
前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス又はそれによる合併症であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＣＸＣＲ３の発現レベル又はそのｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤を含むことを特徴とする、間葉系幹細胞の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用キット。
【請求項4】
前記ＣＸＣＲ３の発現レベルを測定する製剤は、ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体であり、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤は、それに特異的に結合するプライマー、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３に記載の有効性予測用キット。
【請求項5】
腎臓において発現されたケモカインＣＸＣＬ１０発現レベルを測定する製剤を含む自己免疫疾患の治療予後予測用組成物であって、前記自己免疫疾患の治療は、ＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞を用いた治療であることを特徴とする、組成物。
【請求項6】
前記ＣＸＣＬ１０を発現する腎臓において、ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞が腎臓に浸潤されるように誘導することを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス又はそれによる合併症であることを特徴とする、請求項５～請求項６のうちいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から発現されるケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量を測定して、自己免疫疾患の治療に対する間葉系幹細胞の有効性を予測するための情報提供方法。
【請求項9】
前記ＣＸＣＲ３又はそのｍＲＮＡ発現がないか、野生型間葉系幹細胞より低い場合、治療有効性がないか低いことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量を測定して、自己免疫疾患に有効な治療効果を示す間葉系幹細胞をスクリーニングする方法。
【請求項11】
請求項１０によってスクリーニングされた間葉系幹細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項12】
請求項１０によってスクリーニングされた間葉系幹細胞を含む薬剤学的組成物をヒトを除く個体に投与又は服用させるステップを含む自己免疫疾患の予防又は治療方法。
【請求項13】
自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物の製造における請求項１０によってスクリーニングされた間葉系幹細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１８年６月１５日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１８－００６９２６３号に基づく優先権の利益を主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。
【0002】
本発明は、自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途に関する。
【背景技術】
【0003】
全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）は、多発性機能不全を同伴した全身性自己免疫疾患（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）であって、免疫複合体の沈着と炎症細胞の浸潤を特徴とする。
【0004】
ループス腎炎（ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）は、ＳＬＥ患者の６０％で発生し、罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）と死亡率（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）を増加させる主要原因である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、溶解性因子及び接触依存的方式（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－ａｎｄ ｃｏｎｔａｃｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒｓ）によりＴ細胞、Ｂ細胞、樹脂状細胞、ＮＫ細胞を抑制することができ、Ｔｒｅｇ細胞を増進させるので、ＳＬＥの有望な代替療法として研究されて来た。
【0005】
生体内で効能を発揮するために、ＭＳＣは、炎症部位に効率的に浸潤する。炎症がある腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）ではケモカインが生成され、ＭＳＣは、ケモカイン受容体を発現する。ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸ３ＣＬ１は、ループスモデル動物とＳＬＥ患者の炎症性の腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）から発現され、炎症細胞の腎臓浸潤を増加させる。また、骨髓由来のＭＳＣは、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ４を発現するが、ケモカイン反応性と関連してＭＳＣが炎症組織にどのように浸潤するかに対してはほとんど知られていなかった。いくつかの論文は、ＭＳＣがＣＸＣＬ１２－ＣＸＣＲ４軸（ａｘｉｓ）を用いて炎症組織に浸潤することを示している。しかし、今まで炎症を起こした腎臓へのＭＳＣ浸潤に対するＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＲ３軸（ａｘｉｓ）の役目に対する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｙａｎｇ Ｄ、Ｓｕｎ Ｓ、Ｗａｎｇ Ｚ、Ｚｈｕ Ｐ、Ｙａｎｇ Ｚ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｂ．Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＸＣＲ４－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｓｋｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｒｅａｓ。Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ。２０１３；１５：２０６－１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途を提供する。より詳しくは、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー；ケモカインＣＸＣＬ１０を含む自己免疫疾患の治療予後予測用バイオマーカー；前記バイオマーカーの発現を測定できる製剤を含む診断キット；及びケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が増加された間葉系幹細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー組成物を提供する。
【0009】
また、本発明は、ＣＸＣＲ３の発現レベル又はそのｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤を含む、間葉系幹細胞の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用キットを提供する。
【0010】
一具体例で、ＣＸＣＲ３の発現レベルを測定する製剤は、ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体であり、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルを測定する製剤は、それに特異的に結合するプライマー、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドであってもよい。また、前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、競争的ＲＰ－ＰＣＲキット、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲキット、定量的ＲＴ－ＰＣＲキット又はＤＮＡチップキットであってもよい。
【0011】
前記抗体、プライマー、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドは、本発明が属する技術分野で公知にされた技術を用いて作製できることは自明である。
【0012】
前記キットにおいて、ＣＸＣＲ３又はそのｍＲＮＡ発現がないか、野生型間葉系幹細胞より低い場合、治療有効性がないか低いことが予測できる。このように、バイオマーカーであるＣＸＣＲ３又はそのｍＲＮＡ発現を測定することによって、間葉系幹細胞の自己免疫疾患の治療に対する有効性を予測することができる。
【0013】
前記自己免疫疾患は、ループス（全身性エリテマトーデス）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性進行性硬化症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、炎症性腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ)、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髓炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）で構成された群から選択され得、特に、全身性エリテマトーデス又はそれによる合併症であってもよい。
【0014】
前記合併症は、腎臓損傷（ｋｉｄｎｅｙ ｄａｍａｇｅ）、頭痛、めまい、行動変化（ｂｅｈａｖｉｏｒ ｃｈａｎｇｅｓ）、視力問題（ｖｉｓｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍ）脳卒中、発作、貧血、出血、血液凝固、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、胸膜炎（ｐｌｅｕｒｉｓｙ）、肺炎、心膜炎（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ）、心血管疾患、心臓発作、関節炎、関節痛及び筋肉痛からなる群より選択される一つ以上を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0015】
また、本発明は、ケモカインＣＸＣＬ１０を含む自己免疫疾患の治療予後予測用バイオマーカー組成物を提供する。
【0016】
一具体例で、自己免疫疾患の治療は、ＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞を用いた治療であってもよい。また、ＣＸＣＬ１０は、腎臓から発現されることが好ましい。前記ＣＸＣＬ１０を発現する腎臓で、ＣＸＣＬ１０は、ＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞が腎臓に浸潤されるように誘導できる。
【0017】
また、本発明は、ＣＸＣＬ１０の発現レベルを測定する製剤を含む自己免疫疾患の治療予後予測用キットを提供する。
【0018】
一具体例で、ＣＸＣＬ１０の発現レベルを測定する製剤は、ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体であってもよい。前記抗体は、本発明が属する技術分野で公知にされた技術を用いて作製することができることは自明である。
【0019】
本発明の一部具体例では、ＣＸＣＲ３及び／又はＣＸＣＬ１０の発現レベルを測定することでのみ記載したが、そのｍＲＮＡ発現を測定するによってそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを測定することが含まれることは自明である。
【0020】
また、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から発現されるケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量又はそのｍＲＮＡ発現レベルを測定して自己免疫疾患の治療に対する間葉系幹細胞の有効性を予測するための情報提供方法を提供する。
【0021】
前記バイオマーカーレベルを測定する方法は、逆転写酵素重合反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的逆転写酵素重合酵素反応（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的重合酵素反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）又はＤＮＡチップ方法（ＤＮＡ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈澱分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）又は免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）などを含む。
【0022】
一具体例で、前記自己免疫疾患は、特に、全身性エリテマトーデス又はそれによる合併症であってもよい。
【0023】
また、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量又はそのｍＲＮＡ発現量を測定して自己免疫疾患に有効な治療効果を示す間葉系幹細胞をスクリーニングする方法を提供する。
【0024】
前記スクリーニング方法により選別された間葉系幹細胞の場合、自己免疫疾患の予防又は治療活性に優れる。したがって、前記方法によってスクリーニングされた間葉系幹細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することができる。
【0025】
また、本発明は、前記方法によってスクリーニングされた間葉系幹細胞を含む薬剤学的組成物を個体に投与又は服用させるステップを含む自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供することができる。
【0026】
また、本発明は、前記方法によってスクリーニングされた間葉系幹細胞を含む薬剤学的組成物の自己免疫疾患の予防又は治療用途を提供することができる。
【0027】
また、本発明は、１）間葉系幹細胞のケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３自体；又は２）ＣＸＣＲ３の発現量を増加させる製剤；を含む、自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【0028】
また、本発明は、間葉系幹細胞のケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３；又はＣＸＣＲ３の発現量を増加させる製剤；を含む薬剤学的組成物を個体に投与又は服用させるステップを含む自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供することができる。
【0029】
また、本発明は、間葉系幹細胞のケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３；又はＣＸＣＲ３の発現量を増加させる製剤；を含む薬剤学的組成物の自己免疫疾患の予防又は治療用途を提供することができる。
【0030】
一具体例において、ＣＸＣＲ３の発現量を増加させる製剤は、ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体であってもよい。前記抗体の場合、その誘導体、又はその生物学的等価物が含まれると判断されなければならず、抗体、その誘導体、又はその生物学的等価物は、本発明が属する技術分野で公知にされた技術を用いて作製することができることは自明である。前記抗体の誘導体及びその生物学的等価物は、ＣＸＣＲ３の発現量を増加させるためにＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体の等価的活性を示すことを言い、アミノ酸配列の変更、結実、添付などによる変異又は各種置換体を含む。
【0031】
また、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞を有効成分で含む、自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【0032】
また、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞を有効成分で含む薬剤学的組成物を個体に投与又は服用させるステップを含む自己免疫疾患の予防又は治療方法を提供することができる。
【0033】
また、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞を有効成分で含む薬剤学的組成物の自己免疫疾患の予防又は治療用途を提供することができる。
【0034】
一具体例で、前記ＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞は、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０で構成された群から選択される最小１種の表面抗原に対して陽性の免疫学的特性；及び（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲで構成された群から選択される最小１種の表面抗原に対して陰性の免疫学的特性を有する。
【0035】
前記自己免疫疾患は、ループス（全身性エリテマトーデス）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、全身性進行性硬化症（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、炎症性腸炎、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ)、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）自己免疫性溶血性貧血（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、自己免疫性脳脊髓炎、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、結節性多発動脈炎（Ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、強直性脊椎炎（Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、線維筋痛症（Ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）で構成された群から選択され得、特に、全身性エリテマトーデス又はそれによる合併症であってもよい。
【0036】
本発明の組成物が薬剤学的組成物で製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）又は培地などを含むが、これに限定されるものではない。
【0037】
本発明の薬剤学的組成物は、経口投与、局所（頬側、舌下、皮膚又は眼球）投与、経皮性投与又は非経口（皮下、皮内、筋肉内、血管内又は関節内）投与することができ、好ましくは、非経口投与方式、より好ましくは、血管内投与することができる。
【0038】
本発明の薬剤学的組成物の適合する投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人を基準として１日当たり１０２－１０１０細胞である。
【0039】
また、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞の自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的製剤を製造するための用途を提供する。
【0040】
また、本発明は、１）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から発現されるケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３又はそのｍＲＮＡの発現量を測定するステップ；及び
２）ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞を自己免疫疾患の治療が必要な個人に投与するステップを含む自己免疫疾患の治療方法を提供する。
２）ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞を自己免疫疾患の治療が必要な個人に投与するステップを含む自己免疫疾患の治療方法を提供する。
【0041】
一具体例で、前記ＣＸＣＲ３の発現量が野生型に比べて増加された間葉系幹細胞は、（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０で構成された群から選択される最小１種の表面抗原に対して陽性の免疫学的特性；及び（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲで構成された群から選択される最小１種の表面抗原に対して陰性の免疫学的特性を有する。
【0042】
前記（ｉ）ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０で構成された群から選択される最小１種の表面抗原に対して陽性の免疫学的特性；及び（ｉｉ）ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲから構成された群より選択される最小１種の表面抗原に対して陰性の免疫学的特性を有する間葉系幹細胞は、本出願人であるコアステムの大韓民国出願第１０－２０１４－００９７１２９号に詳しく記載されており、前記出願の内容は、本願の参照として挿入される。
【発明の効果】
【0043】
本発明によると、自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途を提供することができる。特に、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー；ケモカインＣＸＣＬ１０を含む自己免疫疾患の治療予後予測用バイオマーカー；前記バイオマーカーの発現を測定できる製剤を含む診断キット；及びケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が増加された間葉系幹細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することができる。特に、本発明は、ＭＳＣ浸潤に対するＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＲ３軸（ａｘｉｓ）の役目を明確に糾明することができるので、自己免疫疾患、特に、全身性エリテマトーデスの予防又は治療効果を示すかそれを改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1a-e】図１は、ＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスにＭＳＣｓ又はシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ＣＰ）を１２週齢で一回静脈注射した後、生存率（図１の（ａ））、体重（図１の（ｂ））、ａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ ＩｇＧレベル（図１の（ｃ））及び総ＩｇＧレベル（図１の（ｄ））を測定した結果を示すグラフである。ＷＴ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＣＸＣＲ３－／－：ＣＸＣＲ３が欠乏されたタイプ（＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【図2a-e】図２は、ＣＸＣＲ３を発現する間葉系幹細胞の腎臓浸潤を分析した図である。図２の（ａ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するＭＳＣ（Ｈ－２ｄ）をＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウス（Ｈ－２ｋ）に静脈注射して２４時間後に脾臓を分離し、抗－マウスＭＨＣ－Ｉ（Ｈ－２ｄ）抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ－Ｉ（Ｈ－２ｄ）ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて染色した後、アイレット（ｉｓｌｅｔ）当たりＨ－２ｄ陽性ＭＳＣの数を計数したものを示す。図２の（ｂ）は、８週齢又は２２週齢のＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスの腎臓から総ＲＮＡを分離した後、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１２の遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲで測定した結果である。＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ。図２の（ｃ）は、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＣＭＴＭＲ－標識ＭＳＣ（ＣＭＴＭＲ－ｌａｂｅｌｅｄ ＭＳＣｓ）及びＣＭＦＤＡ－標識内皮細胞（ＣＭＦＤＡ－ｌａｂｅｌｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）の結合速度（ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅｓ）を分析した結果を示す（ｎ＝３）。接合率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、ＣＭＦＤＡ／ＣＭＴＰＸ二重陽性反応（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｖｅｎｔｓ）のポーション（ｐｏｒｔｉｏｎ）で計算された。＊ｐ＜０．０１。図２の（ｄ）は、ＭＳＣを１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１０で２４時間の間処理した後、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９及びＴＩＭＰ－１の遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す。＊ｐ＜０．０１。図２の（ｅ）は、ＭＳＣを１００ｎｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１０で２４時間の間処理した後、リアルタイムＰＣＲを用いてα４インテグリン、β１インテグリン及びＣＤ４４の遺伝子発現程度を測定した結果を示す。＊ｐ＜０．０１。
【図3a-f】図３は、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣの免疫抑制能力を分析した結果である。図３の（ａ）は、ＷＴ及びＣＸＣＲ３－／－マウスから生成されたＭＳＣから総ＲＮＡ及びタンパク質を分離し、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ４のレベルをＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）及びウェスタンブロット（ＷＢ）により測定した結果を示す。図３の（ｂ）は、ＭＳＣ移動（ＭＳＣ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を分析した結果を示す。ＭＳＣ移動は、８μｍ気孔フィルタ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）のあるトランスウェルプレートを用いてトランスウェルアッセイ（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ａｓｓａｙ）で確認した。上部ウェルを３７℃で２時間の間０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でコーティングした後、２００μｌの培地での２Ｘ１０４ＭＳＣ（２×１０４ＭＳＣｓ ｉｎ ２００ｍｌ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ）を上部ウェルにローディングし、下部ウェルには、１０％ ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌ ＣＸＣＬ１０（Ｒ＆Ｄシステム、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を含有する５００μｌの培地を添加した後、２４時間後、フィルタ上部の非移動細胞を除去して膜を１０％ホルマリンで固定させた後、フィルタの下側に移動したＭＳＣｓを０．５％水晶紫色で１０分間染色し、移動されたＭＳＣの数を倒立光学顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で計数した。＊ｐ＜０．０１。図３の（ｃ）は、９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にＭＳＣを０．０３－０．３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加し、Ｔ細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加し、コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）を１μｇ／ｍｌで添加して７２時間の間培養した後、培地に蓄積されたＩＦＮ－γのレベルをＥＬＩＳＡキットを用いて測定した結果を示す。＊ｐ＜０．０１。図３の（ｄ）は、９６ウェルプレートにＭＳＣを０．０３－０．３×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加し、Ｂ細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加し、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を１μｇ／ｍｌで添加して７２時間の間培養した後、培地に蓄積されたＩｇＭのレベルをＥＬＩＳＡキットを用いて測定した結果を示す。＊ｐ＜０．０１。図３の（ｅ）及び図３の（ｆ）は、ＭＳＣ培養２０日目に新しい培地に交替し、２４時間後に培地から可溶性因子のレベルを測定した結果を示す。Ｇｒｉｅｓｓ試薬でＮＯレベルを測定し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いてＴＧＦ－βとＰＧＥ２のレベルを測定した。
【発明を実施するための形態】
【0045】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。本発明の目的、特定、長所は、以下の実施例を通じて容易に理解される。本発明は、ここで説明する実施例に限定されず、他の形態で具体化され得る。ここで紹介される実施例は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者に本発明の思想が十分に伝達されるようにするために提供されるものである。したがって、以下の実施例によって本発明が制限されてはいけない。
【0046】
＜実施例＞
［材料及び方法］
（間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ））
マウスＭＳＣは、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ、京畿道所在）又はＣＸＣＲ３－／－（Ｂ６．１２９Ｐ２－Ｃｘｃｒ３ｔｍｌＤｇｅｎ／Ｊ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）の脛骨（ｔｉｂｉａｅ）及び大腿骨（ｆｅｍｕｒｓ）のＢＭ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）細胞から収得した（ＣＸＣＲ３－／－は、ＣＸＣＲ３が欠乏された形態を示す）。ＢＭ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むα－ＭＥＭ培地で３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。非付着性細胞（ｎｏｎ－ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を１日目に除去し、付着細胞を３日ごとに培地を補充（ｍｅｄｉｕｍ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｍｅｎｔ）して培養した後、１７日から２０日の間に用いた。全ての動物実験は、忠北大学校動物実験倫理委員会の承認を受けて承認された指針によって実行された。
［材料及び方法］
（間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ））
マウスＭＳＣは、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ、京畿道所在）又はＣＸＣＲ３－／－（Ｂ６．１２９Ｐ２－Ｃｘｃｒ３ｔｍｌＤｇｅｎ／Ｊ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）の脛骨（ｔｉｂｉａｅ）及び大腿骨（ｆｅｍｕｒｓ）のＢＭ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）細胞から収得した（ＣＸＣＲ３－／－は、ＣＸＣＲ３が欠乏された形態を示す）。ＢＭ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＰＢＳ、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むα－ＭＥＭ培地で３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。非付着性細胞（ｎｏｎ－ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を１日目に除去し、付着細胞を３日ごとに培地を補充（ｍｅｄｉｕｍ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｍｅｎｔ）して培養した後、１７日から２０日の間に用いた。全ての動物実験は、忠北大学校動物実験倫理委員会の承認を受けて承認された指針によって実行された。
【0047】
（ＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスモデル）
ＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明暗周期（１２ｈ ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｃｙｃｌｅ）下で２１～２４℃及び４０～６０％の相対湿度条件の特定病源菌がない状態で保管された。ＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスにＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水、コントロール、ｎ＝６）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）、野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ＭＳＣ（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｎ＝６）及びＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣｓ（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｎ＝６）を１２週で一回腹腔内注射した。生存率と体重は毎週測定した。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入したＥＬＩＳＡキットを用いて尿（ｕｒｉｎｅ）でのタンパク質レベルと、血清での抗－ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ及び総ＩｇＧを測定した。免疫化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のために、１８週齢のＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウス（Ｈ－２ｋ）にＭＳＣ（Ｈ－２ｄ）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで静脈注射した。２４時間後、腎臓に浸潤したＭＳＣの数は、マウスＭＨＣ－１（Ｈ－２ｄ）に対する一次マウス抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ－１（Ｈ－２Ｄｂ））と、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）と接合された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の抗－マウス（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧを用いて決定し、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｔａｉｎｅ）した。
ＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）から購入した。マウスは、１２時間の明暗周期（１２ｈ ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｃｙｃｌｅ）下で２１～２４℃及び４０～６０％の相対湿度条件の特定病源菌がない状態で保管された。ＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスにＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水、コントロール、ｎ＝６）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）、野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ＭＳＣ（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｎ＝６）及びＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣｓ（１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｎ＝６）を１２週で一回腹腔内注射した。生存率と体重は毎週測定した。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入したＥＬＩＳＡキットを用いて尿（ｕｒｉｎｅ）でのタンパク質レベルと、血清での抗－ｄｓＤＮＡ ＩｇＧ及び総ＩｇＧを測定した。免疫化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のために、１８週齢のＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウス（Ｈ－２ｋ）にＭＳＣ（Ｈ－２ｄ）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで静脈注射した。２４時間後、腎臓に浸潤したＭＳＣの数は、マウスＭＨＣ－１（Ｈ－２ｄ）に対する一次マウス抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ－１（Ｈ－２Ｄｂ））と、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）と接合された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の抗－マウス（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧを用いて決定し、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｔａｉｎｅ）した。
【0048】
（リアルタイム－ＰＣＲ）
トリゾール試薬（ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用いて脾臓細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離した。分光光度計を用いてＲＮＡを定量して１ｍｇ／ｍｌの濃度で－８０℃で保管した。ｃＤＮＡは、ＲＴキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、大田、韓国）を用いて３μｇ総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）から合成した。ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ｉＮＯＳ、ＴＧＦ－β及びＣＯＸ－２に対するｍＲＮＡの発現レベルをＰＣＲで分析した。用いられたプライマー配列は、次の通りである：ＣＣＲ５、センス、５‘－ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＡ－３’（配列番号１）、アンチセンス、５’－ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＡ－３’（配列番号２）；ＣＣＲ７、センス、５’－ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＣＧ Ｇ－３’（配列番号３）；アンチセンス、５’－ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＣＡＡ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＣＴ Ｇ－３’（配列番号４）；ＣＸＣＲ３、センス、５’－ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＧＣ Ｇ－３’（配列番号５）、アンチセンス、５’－ＧＡＡ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＣＧ－３’（配列番号６）；ＣＸＣＲ４、センス、５’－ＧＧＣ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＣＧ ＡＧＴ ＧＴＴ ＧＣ－３’（配列番号７）、アンチセンス、５’－ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ－３’（配列番号８）；ｉＮＯＳ、センス、５’－ＣＣＴ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ－３’（配列番号９）、アンチセンス、５’－ＧＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＴ ＴＧＧ Ｇ－３’（配列番号１０）；ＴＧＦ－β、センス、５’－ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＧＴ ＡＣ－３’（配列番号１１）、アンチセンス、５’－ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧ－３’（配列番号１２）；ＣＯＸ－２、センス、５’－ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＴ－３’（配列番号１３）、アンチセンス、５’－ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡ－３’（配列番号１４）；β－ａｃｔｉｎ、センス、５’－ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ Ｃ－３’（配列番号１５）及びアンチセンス５’－ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＡＧ ＴＣＣ Ｇ－３（配列番号１６）’を含む。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルから分離し、５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した。
トリゾール試薬（ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用いて脾臓細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを分離した。分光光度計を用いてＲＮＡを定量して１ｍｇ／ｍｌの濃度で－８０℃で保管した。ｃＤＮＡは、ＲＴキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、大田、韓国）を用いて３μｇ総ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）から合成した。ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ｉＮＯＳ、ＴＧＦ－β及びＣＯＸ－２に対するｍＲＮＡの発現レベルをＰＣＲで分析した。用いられたプライマー配列は、次の通りである：ＣＣＲ５、センス、５‘－ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＡＣ ＴＧＡ ＴＡ－３’（配列番号１）、アンチセンス、５’－ＧＡＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＡ－３’（配列番号２）；ＣＣＲ７、センス、５’－ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＣＡ ＧＣＧ Ｇ－３’（配列番号３）；アンチセンス、５’－ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＣＡＡ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＣＴ Ｇ－３’（配列番号４）；ＣＸＣＲ３、センス、５’－ＧＴＡ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＡＧ ＴＧＣ Ｇ－３’（配列番号５）、アンチセンス、５’－ＧＡＡ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＣＧ－３’（配列番号６）；ＣＸＣＲ４、センス、５’－ＧＧＣ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＣＧ ＡＧＴ ＧＴＴ ＧＣ－３’（配列番号７）、アンチセンス、５’－ＧＴＡ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ－３’（配列番号８）；ｉＮＯＳ、センス、５’－ＣＣＴ ＴＣＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＧＣ－３’（配列番号９）、アンチセンス、５’－ＧＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＧＧＧ ＣＴＴ ＴＧＧ Ｇ－３’（配列番号１０）；ＴＧＦ－β、センス、５’－ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＧＴ ＡＣ－３’（配列番号１１）、アンチセンス、５’－ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧ－３’（配列番号１２）；ＣＯＸ－２、センス、５’－ＧＧＡ ＧＡＧ ＡＣＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＴ－３’（配列番号１３）、アンチセンス、５’－ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡ－３’（配列番号１４）；β－ａｃｔｉｎ、センス、５’－ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ Ｃ－３’（配列番号１５）及びアンチセンス５’－ＴＡＡ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＡＡ ＣＡＧ ＴＣＣ Ｇ－３（配列番号１６）’を含む。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルから分離し、５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した。
【0049】
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＧＥＲ）とＳｔｅｐｏｎｅｐｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を実行した。用いられたプライマー配列は、次の通りである；ＣＸＣＬ１０、センス、５’－ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＧＡ ＡＧ－３’（配列番号１７）、アンチセンス、５’－ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＣ－３’（配列番号１８）；ＣＸＣＬ１２、センス、５’－ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＣＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＡＴＣ ＴＧ－３’（配列番号１９）、アンチセンス、５’－ＣＧＧ ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＡＣ ＴＴＧ ＴＣ－３’（配列番号２０）；ＭＭＰ－２、センス、５’－ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＣＣ ＣＧＧ ＣＧＡ ＴＧＴ Ｃ－３’（配列番号２１）、アンチセンス、５’－ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＣＡ ＡＧＧ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＴＣ－３’（配列番号２２）；ＭＭＰ－９、センス、５’－ＣＴＧ ＧＡＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＴＡ ＡＡＧ－３’（配列番号２３）、アンチセンス、５’－ＣＴＣ ＧＣＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＣＴＴ ＣＡＧ ＡＧ－３’（配列番号２４）；ＴＩＭＰ－１、センス、５’－ＴＴＡ ＴＣＣ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＧＣ ＡＴＴ ＴＡ－３’（配列番号２５）、アンチセンス、５’－ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＧ－３’（配列番号２６）；インテグリンα４、センス、５’－ＣＴＣ ＣＣＴ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＴＣ ＡＡ’（配列番号２７）、アンチセンス、５’－ＴＧＴ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＣＣＡ－３’（配列番号２８）；インテグリンβ１、センス、５’－ＧＧＣ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＴＡ ＣＣＣ ＴＡＴ’（配列番号２９）、アンチセンス、５’－ＣＡＴ ＴＣＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＣＧ ＴＴＣ－３’（配列番号３０）；ＣＤ４４、センス、５’－ＧＡＣ ＣＧＧ ＴＴＡ ＣＣＡ ＴＡＡ ＣＴＡ ＴＴＧ ＴＣ’（配列番号３１）、アンチセンス、５’－ＣＡＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＴ ＧＴＧ－３’（配列番号３２）。各サンプルの相対的ｍＲＮＡ量は、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）であるβ－ａｃｔｉｎのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）と比較した臨界周期（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ）を基準に計算された。
【0050】
（ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ））
細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）を準備して界面活性剤－不溶性物質（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を除去した後、同量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥに分画して純粋な（ｐｕｒｅ）ニトロセルローズ膜に移した。膜を５％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を含有するＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＴＢＳ）で１時間の間ブロッキングした後、５％ ＢＳＡを含有するＴＴＢＳ内の１次抗体の適切な希釈液と共に２時間の間インキュベーションした。
細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）を準備して界面活性剤－不溶性物質（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を除去した後、同量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥに分画して純粋な（ｐｕｒｅ）ニトロセルローズ膜に移した。膜を５％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を含有するＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＴＢＳ）で１時間の間ブロッキングした後、５％ ＢＳＡを含有するＴＴＢＳ内の１次抗体の適切な希釈液と共に２時間の間インキュベーションした。
【0051】
ブロット（ｂｌｏｔ）をビオチン標識二次抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と共に１時間の間培養した後、ＨＲＰ－結合されたストレプトアビジン（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で１時間の間インキュベーションした。シグナルは、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）により検出された。ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ４に対する抗－マウス抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【0052】
（免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｓｓａｙ））
２０週齢のＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスにＭＳＣｓを静脈注射した（１×１０６ ｃｅｌｌ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。２４時間後に腎臓をＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスから分離して４％ホルマリンで固定させてＰＢＳに浸した。エタノールとキシレンで脱水させた後、組織をパラフィンに挿入して４μｍ切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）に切った後、抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために切片をマイクロウエーブオーブン（６５０Ｗ、２０分）で加熱した後、３％過酸化水素（３％ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）で内因性ペルオキシダーゼ活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を遮断させた。その後、切片を１次抗体と共にインキュベーションした（マウスＭＨＣ－１ Ｈ－２Ｄｂ（ｄｉｌｕｔｅｄ １：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に対するマウス抗体、４℃で一晩恒温処理）。その後、全ての切片をＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）と接合された２次抗体の抗－マウスＩｇＧと共に室温で１時間の間インキュベーションした。２－成分（ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）高感度ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）発色基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて１０時間の間シグナルを成長（ｄｅｖｅｌｏｐ）させてヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）でカウンター染色した。
２０週齢のＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスにＭＳＣｓを静脈注射した（１×１０６ ｃｅｌｌ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。２４時間後に腎臓をＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスから分離して４％ホルマリンで固定させてＰＢＳに浸した。エタノールとキシレンで脱水させた後、組織をパラフィンに挿入して４μｍ切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）に切った後、抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために切片をマイクロウエーブオーブン（６５０Ｗ、２０分）で加熱した後、３％過酸化水素（３％ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）で内因性ペルオキシダーゼ活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を遮断させた。その後、切片を１次抗体と共にインキュベーションした（マウスＭＨＣ－１ Ｈ－２Ｄｂ（ｄｉｌｕｔｅｄ １：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に対するマウス抗体、４℃で一晩恒温処理）。その後、全ての切片をＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）と接合された２次抗体の抗－マウスＩｇＧと共に室温で１時間の間インキュベーションした。２－成分（ｔｗｏ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）高感度ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）発色基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて１０時間の間シグナルを成長（ｄｅｖｅｌｏｐ）させてヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）でカウンター染色した。
【0053】
（セルバインティングアッセイ（Ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ））
内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、３７℃で１０分間無血清培地（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で０．５μＭ ＣＭＦＤＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び５μＭ ＣＭＴＰＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＭＳＣで標識した。染色した後、細胞を１０％ ＦＢＳを含有する培養培地で２回洗浄した。ＭＳＣｓ（１×１０６）と内皮細胞（１×１０６）を１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で混合して８００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、ペレットを３７℃で１０分間培養した。その後、細胞混合物を柔らかに懸濁させてフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。接合率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、ＣＭＦＤＡ／ＣＭＴＰＸ二重陽性反応（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｖｅｎｔｓ）のポーション（ｐｏｒｔｉｏｎ）で計算された。
内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、３７℃で１０分間無血清培地（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で０．５μＭ ＣＭＦＤＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び５μＭ ＣＭＴＰＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＭＳＣで標識した。染色した後、細胞を１０％ ＦＢＳを含有する培養培地で２回洗浄した。ＭＳＣｓ（１×１０６）と内皮細胞（１×１０６）を１２×７５ｍｍポリスチレンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で混合して８００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、ペレットを３７℃で１０分間培養した。その後、細胞混合物を柔らかに懸濁させてフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。接合率（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は、ＣＭＦＤＡ／ＣＭＴＰＸ二重陽性反応（ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｖｅｎｔｓ）のポーション（ｐｏｒｔｉｏｎ）で計算された。
【0054】
（統計分析）
データは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ、６匹マウス）で実行された３回以上の独立的な実験の平均±ＳＥＭを示す。ｐ値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて計算した。
データは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ、６匹マウス）で実行された３回以上の独立的な実験の平均±ＳＥＭを示す。ｐ値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて計算した。
【0055】
［実験結果］
（ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣの治療活性（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）分析）
まず、ＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスモテルでＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ（ＣＸＣＲ３が欠乏されたＭＳＣ）の治療活性（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認した。ＷＴ ＭＳＣ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＭＳＣ）は、マウス生存期間を著しく延長させた：ＷＴ ＭＳＣを受けたマウスの６６％は、２２週まで生存したが、対照群マウスは、１６％のみ生存した（図１の（ａ））。一方、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣを受けたマウスの場合、ただ３３％のみ生存した（図１の（ａ））。ＭＳＣは、体重に影響を及ぼさないことが確認された（図１の（ｂ））。ＷＴ ＭＳＣは、ａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ（図１の（ｃ））と総ＩｇＧ抗体（図１の（ｄ））の血清レベル及び蛋白尿レベル（図１の（ｅ））を減少させたが、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、減少させなかった。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で用いられるシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）も疾病を緩和させた。このようなデータは、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣがＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスでループス症状を好転させないことを示す。
（ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣの治療活性（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）分析）
まず、ＭＲＬ．ＦａｓｌｐｒマウスモテルでＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ（ＣＸＣＲ３が欠乏されたＭＳＣ）の治療活性（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認した。ＷＴ ＭＳＣ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＭＳＣ）は、マウス生存期間を著しく延長させた：ＷＴ ＭＳＣを受けたマウスの６６％は、２２週まで生存したが、対照群マウスは、１６％のみ生存した（図１の（ａ））。一方、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣを受けたマウスの場合、ただ３３％のみ生存した（図１の（ａ））。ＭＳＣは、体重に影響を及ぼさないことが確認された（図１の（ｂ））。ＷＴ ＭＳＣは、ａｎｔｉ－ｄｓＤＮＡ（図１の（ｃ））と総ＩｇＧ抗体（図１の（ｄ））の血清レベル及び蛋白尿レベル（図１の（ｅ））を減少させたが、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、減少させなかった。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で用いられるシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）も疾病を緩和させた。このようなデータは、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣがＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスでループス症状を好転させないことを示す。
【0056】
（ＭＳＣの腎臓浸潤の分析）
図２は、ＣＸＣＲ３を発現する間葉系幹細胞の腎臓浸潤効果を分析した図である。ＷＴ ＭＳＣｓは、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ細胞より炎症のある腎臓によく移動（ホーミング）することが確認された（図２の（ａ））。２２週齢のＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスの腎臓は、８週齢に比べてＣＸＣＬ１０を高く発見させたが、二つのマウスが全て同様にＣＸＣＬ１２を発現させた（図２の（ｂ））。このようなデータは、炎症性腎臓がＣＸＣＬ１０を高く発現させ得、これは腎臓に対するＭＳＣ誘導を増加させ得ることを示唆する。次に、ＣＸＣＬ１０がＭＳＣ浸潤をどのように増加させるかに対して分析した。ＣＸＣＬ１０は、ＷＴ ＭＳＣと内皮細胞の接合を増加させたが、これは腎臓へのＭＳＣ浸潤のために重要な段階である。しかし、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、内皮細胞との接合を増加させなかった（図２の（ｃ））。また、ＣＸＣＬ１０は、間質移動（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に重要な酵素であるＭＭＰ－２とＭＭＰ－９の発現を増加（図２の（ｄ））させたが、ＭＳＣによるα４／β１インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）とＣＤ４４の発現には影響を及ぼさなかった（図２の（ｅ））。このような結果は、ＣＸＣＬ１０が炎症性腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）でのＭＳＣ浸潤を向上させる重要なケモカインであることを示唆する。
図２は、ＣＸＣＲ３を発現する間葉系幹細胞の腎臓浸潤効果を分析した図である。ＷＴ ＭＳＣｓは、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ細胞より炎症のある腎臓によく移動（ホーミング）することが確認された（図２の（ａ））。２２週齢のＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスの腎臓は、８週齢に比べてＣＸＣＬ１０を高く発見させたが、二つのマウスが全て同様にＣＸＣＬ１２を発現させた（図２の（ｂ））。このようなデータは、炎症性腎臓がＣＸＣＬ１０を高く発現させ得、これは腎臓に対するＭＳＣ誘導を増加させ得ることを示唆する。次に、ＣＸＣＬ１０がＭＳＣ浸潤をどのように増加させるかに対して分析した。ＣＸＣＬ１０は、ＷＴ ＭＳＣと内皮細胞の接合を増加させたが、これは腎臓へのＭＳＣ浸潤のために重要な段階である。しかし、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、内皮細胞との接合を増加させなかった（図２の（ｃ））。また、ＣＸＣＬ１０は、間質移動（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に重要な酵素であるＭＭＰ－２とＭＭＰ－９の発現を増加（図２の（ｄ））させたが、ＭＳＣによるα４／β１インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）とＣＤ４４の発現には影響を及ぼさなかった（図２の（ｅ））。このような結果は、ＣＸＣＬ１０が炎症性腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）でのＭＳＣ浸潤を向上させる重要なケモカインであることを示唆する。
【0057】
（ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣの免疫抑制能力の分析）
ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ腎臓浸潤能力の欠陷にもかかわらずＷＴ ＭＳＣと類似した表現型を示した。ＭＳＣのマーカーとして知られたＣＤ３４及びＭＨＣ－ＩＩを発現するが、ＣＤ７３及Ｓｃａ－１は発現しなかった。ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲとＷＢ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を用いて分析した結果、ＷＴ ＭＳＣｓは、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４を発現したが、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ＣＸＣＲ３を発現せず、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４は、発現することが確認された（図３の（ａ））。また、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、トランスウェル分析でＣＸＣＬ１０側に移動しなかった（図３の（ｂ））。しかし、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ＷＴ ＭＳＣと同様にＴ細胞のＩＦＮ－γ生産とＢ細胞のＩｇＭ生産を抑制した（図３の（ｃ）、図３の（ｄ））。ＷＴ ＭＳＣと同様に、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ｉＮＯＳ、ＴＧＦ－β及びＣＯＸ－２ ｍＲＮＡを発現（図３の（ｅ）し、ＮＯ、ＴＧＦ－β及びＰＧＥ２を生産した（図３の（ｆ））。このような結果は、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣｓがＣＸＣＬ１０に移動しないことを除いては、ＷＴ ＭＳＣと類似した表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）及び免疫抑制能力（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有していることを示唆する。
ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣ腎臓浸潤能力の欠陷にもかかわらずＷＴ ＭＳＣと類似した表現型を示した。ＭＳＣのマーカーとして知られたＣＤ３４及びＭＨＣ－ＩＩを発現するが、ＣＤ７３及Ｓｃａ－１は発現しなかった。ＲＴ－ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲとＷＢ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を用いて分析した結果、ＷＴ ＭＳＣｓは、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４を発現したが、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ＣＸＣＲ３を発現せず、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ４は、発現することが確認された（図３の（ａ））。また、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、トランスウェル分析でＣＸＣＬ１０側に移動しなかった（図３の（ｂ））。しかし、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ＷＴ ＭＳＣと同様にＴ細胞のＩＦＮ－γ生産とＢ細胞のＩｇＭ生産を抑制した（図３の（ｃ）、図３の（ｄ））。ＷＴ ＭＳＣと同様に、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣは、ｉＮＯＳ、ＴＧＦ－β及びＣＯＸ－２ ｍＲＮＡを発現（図３の（ｅ）し、ＮＯ、ＴＧＦ－β及びＰＧＥ２を生産した（図３の（ｆ））。このような結果は、ＣＸＣＲ３－／－ＭＳＣｓがＣＸＣＬ１０に移動しないことを除いては、ＷＴ ＭＳＣと類似した表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）及び免疫抑制能力（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）を有していることを示唆する。
【0058】
ＭＳＣの腎臓浸潤は、多段階過程である：一番目の段階は、血管系を通じて炎症部位に伝達されるＭＳＣの全身投与（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）である。二番目の段階は、血液中のＭＳＣの捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）、圧延（ｒｏｌｌｉｎｇ）、内皮細胞接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）及び内皮細胞透過（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）で構成される。最後段階は、間質移動（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）である。白血球の圧延（ｒｏｌｌｉｎｇ）及び付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）は、Ｌ－セレクチン（Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、ＶＬＡ－４及びＬＦＡ－１に依存するが、ＭＳＣの場合はそうではないかも知れない。炎症組織の内皮細胞がＥ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、ＶＣＡＭ－１及びＩＣＡＭ－１を発現し、ＭＳＣは、ＣＤ４４及びα４β１インテグリンを発現し、これらの相互作用によってＭＳＣが内皮細胞に堅固に付着され得ると報告されたことがある。私たちのデータによると、ＭＳＣは、ＣＸＣＬ１０刺激がない場合にもＣＤ４４とＶＬＡ－４をよく発現したが、これは、内皮細胞に結合するＭＳＣがＣＸＣＬ１０に独立的に作用することを意味することができる。また他のＣＸＣＬ１０－非依存的機序（ＣＸＣＬ１０－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）として、白血球より大きいＭＳＣは、マイクロキャピラリー（ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）で非特異的に抑留され得る。ＣＸＣＬ１０がＭＳＣと内皮細胞の接合を増加させる方法を明確にするためにはもっと多くの研究が必要である。
【0059】
ループス性マウス（ｌｕｐｕｓ－ｐｒｏｎｅ ｍｉｃｅ）とＳＬＥ患者の炎症性腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３及びＣＸ３ＣＬ１を高く発現するが、これは、炎症性腎臓に炎症細胞の移動を誘導する。ＳＬＥ患者の場合、腎臓にＣＸＣＲ３＋Ｔ細胞が多く、血液には少ない。ＣＸＣＬ１０は、ＳＬＥ患者で最も多く増加し、腎臓でＣＸＣＲ３＋免疫細胞と同一な地域に分布する。炎症性腎臓（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）に対する免疫細胞浸潤に対してはよく知られているが、ＭＳＣ浸潤ではほとんど知られなかった。ＭＳＣは、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＲ４を発現すると知られている。そのうち、ＣＣＲ２とＣＸＣＲ４は、心臓と皮膚へのＭＳＣ浸潤に対する調節因子としてよく知られている。しかし、ＭＳＣが炎症のある腎臓に移動するためにＣＸＣＲ３が必要であるかは知られていない。本実験データでは、腎臓炎の腎臓へのＭＳＣ浸潤においてＣＸＣＲ３の重要な役目を示す。ＣＸＣＲ３－欠乏（ＣＸＣＲ３－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）ＭＳＣは、ＷＴ ＭＳＣよりＭＲＬ．Ｆａｓｌｐｒマウスで内皮細胞に対する結合力が少なく、ＭＭＰ９発現が少なく、炎症性腎臓への浸潤が少なく、結果的に、ループス症状の改善効果が低いと確認された。ただし、ＣＸＣＲ３－欠乏ＭＳＣは、ＷＴ ＭＳＣと類似した増殖及び免疫抑制能力を示した。
【0060】
本発明は、診断分類（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び進行性ループス腎炎（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）に対する非侵襲的バイオマーカー（ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）の開発に影響を及ぼし得る。ＳＬＥ患者で非活性ＬＮ（ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）に緩和（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）されながら尿（ｕｒｉｎｅ）ＣＸＣＬ１０は減少される。これは、治療後ＳＬＥ患者のＬＮ改善をモニタリングするにおいて良いバイオマーカーであることを示唆する。ＣＸＣＲ３に対するＭＳＣの遺伝子組換えは、ＳＬＥ患者の治療効能を向上させることにおいて有望な戦略である。損傷された部位に対するＭＳＣの浸潤過程を理解することは、ＭＳＣの治療効能を向上させるツール（ｔｏｏｌ）を提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【0061】
本発明によると、自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー、診断キット及び治療用用途を提供することができる。特に、本発明は、ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３を含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の自己免疫疾患の治療に対する有効性予測用バイオマーカー；ケモカインＣＸＣＬ１０を含む自己免疫疾患の治療予後予測用バイオマーカー；前記バイオマーカーの発現を測定できる製剤を含む診断キット；及びケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３の発現量が増加された間葉系幹細胞を含む自己免疫疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することができる。特に、本発明は、ＭＳＣ浸潤に対するＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＲ３軸（ａｘｉｓ）の役目を明確に糾明することができるので、自己免疫疾患、特に、全身性エリテマトーデスの予防又は治療効果を示すかこれを改善することができる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【配列表】