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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-24
(45)【発行日】2023-03-06
(54)【発明の名称】Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/52 20060101AFI20230227BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20230227BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20230227BHJP
【ＦＩ】
C12N9/52 ZNA
C12N1/21
C12N15/57
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2018219142
(22)【出願日】2018-11-22
(65)【公開番号】P2020080710
(43)【公開日】2020-06-04
【審査請求日】2021-10-20
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日置 貴大
(72)【発明者】
【氏名】山下 大智
【審査官】竹内 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】特開平０４－１０８３８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－１１６５６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Industrial Biotechnology: Microorganisms，2017年，Vol. 1，Chapter 7, p. 221-297
【文献】Journal of Molecular Biology，2010年，Vol.396, No.4，pp.908-923
【文献】The Journal of Biological Chemistry，1993年，Vol. 268, No. 12，pp. 9071-9078
【文献】Virulence，2014年，Vol. 5, No. 3，pp. 378-387
【文献】Beta-lytic metalloendopeptidase，UniProt，2016年02月17日，Accession No. A0A0S2FCI9_9GAMM
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを製造させることを含む、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの製造方法。
【請求項2】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼが、配列番号１、４、７、１０もしくは１３のアミノ酸からなるポリペプチドであるか、又は、配列番号１、４、７、１０及び１３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、請求項２記載の方法：配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、及び１５のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするポリヌクレオチドと、を含むポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、請求項２記載の方法：配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２の５２３～１０６２番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号３の５９５～１１３４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号３の１～５９４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号５の６１６～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６の７０９～１２５７番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号６の１～７０８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８の５６５～１１０４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号９の６２５～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号９の１～６２４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１１の５２９～１０６５番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１２の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１４の５５０～１０８６番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１５の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
又は、
配列番号１５の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも９０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが分泌シグナル領域をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記分泌シグナル領域がバチルス属菌由来の分泌シグナル領域である、請求項５記載の方法。
【請求項7】
前記Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入されるバチルス属菌である宿主バチルス属菌が、プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出する菌である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記宿主バチルス属菌が細胞外プロテアーゼ活性を有する、請求項７記載の方法。
【請求項9】
前記プロテアーゼがａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項10】
前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
【請求項11】
得られた培養物からＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼを回収することをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
プロテアーゼのＭ２３ファミリーは、ＭＥＲＯＰＳデータベースにおいて、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ結合を分解できるプロテアーゼとして定義されるプロテアーゼファミリーである。Ｍ２３ファミリープロテアーゼはまた、エラスチンやバクテリア細胞壁のプロテオグリカンの分解活性を有し、溶菌酵素としても知られている。Ｍ２３ファミリープロテアーゼは、Ｍ２３ＡサブファミリーとＭ２３Ｂサブファミリーの２つのサブファミリーに分類され、各サブファミリーは、それぞれいくつかのタイプの酵素を含む。
【0003】
酵素等のタンパク質の商業的生産においては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を導入した大腸菌等の宿主を培養して該タンパク質を発現させ、宿主により生産された成熟型タンパク質を回収する。多くのプロテアーゼでは、最初にプロタンパク質が発現し、これが自己プロセシングを経て成熟型タンパク質に変換され、細胞又は培養物中に蓄積し、目的物として回収される。しかしながら、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、自己プロセシングによる成熟体への変換が起こらず、大腸菌宿主からの成熟型タンパク質の回収は不可能である（非特許文献１、２）。そのため、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの生産方法としては、天然のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ生産菌株を培養する方法が検討されている。非特許文献１では、目的とするＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼを天然に生産する野生型菌株に該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼを生産させる方法が記載されており、さらに生産コストの低下のため、プロテアーゼ生産効率が向上する培養条件が検討されている。また非特許文献３では、生産コストの低下のため、既存のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ生産菌よりも高い生産性を示す菌株を天然から取得している。
【0004】
一方、特許文献１には、アクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus）から単離されたＭ２３Ａサブファミリーに属するβ－リティックプロテアーゼが記載され、また当該酵素を大腸菌やバチルス属菌などの宿主に発現させて製造することが記載されている。しかしながら、特許文献１には実際に異種宿主を用いて当該酵素を生産させたことは記載されていない。特許文献１では、β－リティックプロテアーゼが自己プロセシングする可能性が指摘されている。しかし、上述した非特許文献１、２に開示されるとおり、その後の研究でＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは自己プロセシングできないことが報告されていることから、特許文献１が上述した異種発現系におけるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの自己プロセシング欠如の問題を解決していないことは明らかである。さらに非特許文献３に記載されているように、特許文献１の後、β－リティックプロテアーゼが枯草菌等のグラム陽性菌に対して強い溶菌活性を有していることが報告された。したがって、非特許文献１～３に示される知見は、特許文献１におけるβ－リティックプロテアーゼの大腸菌やバチルス属菌での異種発現の開示が現実的でなく、むしろそのような異種発現は困難であったことを示している。
【0005】
以上のように、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、その優れた特徴があるにもかかわらず、自己プロセシング欠如や溶菌活性のために天然のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ生産菌株を培養する方法でしか成熟型酵素を得られていない。実際にＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型での異種発現に成功した例はこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開平４－１０８３８７号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】Molecules, 2014, 19:4779-4790
【文献】Journal of bacteriology, 1996, 178:6608-6617
【文献】Journal of bioscience and bioengineering, 2003, 95:27-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼが異種宿主中で成熟体に変換されないという従来の知見（例えば非特許文献１、２）に対して驚くべきことに、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼ遺伝子をバチルス属菌宿主に導入し、培養することで、培養物中から成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを効率よく回収可能であることを見出した。
【0010】
したがって、本発明は、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを製造させることを含む、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0011】
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、エラスチンやバクテリア細胞壁の分解活性に加えて角質汚れの洗浄力も有しており、その優れた特徴から様々な産業上の応用が期待される（特願２０１８－００５１９３）。本発明の方法によれば、バチルス属菌宿主を用いることにより、簡便な手順で成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを効率よく製造することができる。本発明によれば、天然に成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを発現する野生型菌株における生産性の低さや、大腸菌宿主における成熟体の欠如などの、従来のＭ２３Ａファミリープロテアーゼ生産における問題を打開することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】組換え枯草菌の培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性。
【図2】組換え枯草菌の培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ像。
【図3】組換え枯草菌１６８株及びＤｐｒ９株の培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性。
【図4】組換え枯草菌１６８株及びＤｐｒ９株の培養上清のウェスタンブロッティング像。
【図5】各種Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌の培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0014】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0015】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の位置又は領域は、当該任意の領域に「相当する位置」又は「相当する領域」とみなされる。
【0016】
本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0017】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【0018】
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
【0019】
本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。
【0020】
本発明のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの製造方法は、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌（Bacillus）を培養することを含む。
【0021】
本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する成熟体酵素である。本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの好ましい例としては、β－リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）、ＬａｓＡタンパク質（Las A protein；ＬａｓＡ、Staphylolysinとも呼ばれる）、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ（Aeromonas hydrophila proteinase；ＡｈＰ、Mername-AA291 peptidaseとも呼ばれる）が挙げられる。これらは、ＭＥＲＯＰＳデータベース（[http://merops.sanger.ac.uk]）においてＭ２３Ａサブファミリーに属するプロテアーゼとして開示されている。ＢＬＰ（MEROPS ID：M23.001）は、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＬａｓＡ（MEROPS ID：M23.002）は、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＡｈＰ（MEROPS ID：M23.003）は、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する酵素である。
【0022】
本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの別の好ましい例としては、上記ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰと同等の機能を有するポリペプチドが挙げられる。該ＢＬＰ、ＬａｓＡ及びＡｈＰと同等の機能を有するポリペプチドの例としては、配列番号１、４及び７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の２２位、１２１位及び１２３位に相当する位置にＨｉｓ、３６位に相当する位置にＡｓｐを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＬａｓＡと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列の２３位、１２０位及び１２２位に相当する位置にＨｉｓ、３６位に相当する位置にＡｓｐを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＡｈＰと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列の２１位、１１８位及び１２０位に相当する位置にＨｉｓ、３４位に相当する位置にＡｓｐを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【0023】
本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのさらに別の好ましい例としては、リゾバクター・グモサス（Lysobacter gummosus）由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９４１６９０．１、以下の本明細書においてＬｇＢＬＰという）、及びリゾバクター・アンティビオティカス（Lysobacter antibioticus）由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９７０４３０．１、以下の本明細書においてＬａＢＬＰという）が挙げられる。ＬｇＢＬＰは、配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＬａＢＬＰは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＬｇＢＬＰ及びＬａＢＬＰは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する酵素である。
【0024】
本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのさらに別の好ましい例としては、上記ＬｇＢＬＰ及びＬａＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドが挙げられる。ＬｇＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＬａＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【0025】
好ましくは、本発明により製造されるＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、上記のＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、及びそれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種である。
【0026】
本発明で用いるバチルス属菌に導入される、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上述した本発明の方法で製造される目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と成熟型タンパク質をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである。Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域とは、プロタンパク質上で該プロ領域の下流に位置するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質領域の、立体構造の形成に寄与する領域をいう。当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例としては、ＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、ＬａｓＡのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）、ＡｈＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、ＬｇＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）、及びＬａＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）が挙げられる。当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの別の例としては、分泌シグナルを含むＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）、分泌シグナルを含むＬａｓＡのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）、分泌シグナルを含むＡｈＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）、分泌シグナルを含むＬｇＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、及び分泌シグナルを含むＬａＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）が挙げられる。
【0027】
配列番号２のポリヌクレオチドでは、５２３～１０６２番ヌクレオチド領域がＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号３のポリヌクレオチドでは、５９５～１１３４番ヌクレオチド領域がＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。分泌シグナルをコードする領域は、SignalP（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）等のツールを用いて決定することができる。SignalPでの予測に基づく配列番号３のポリヌクレオチド上のＢＬＰの分泌シグナルコード領域は、１～７２番ヌクレオチド領域である。
配列番号５のポリヌクレオチドでは、６１６～１１６４番ヌクレオチド領域がＬａｓＡの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号６のポリヌクレオチドでは、７０９～１２５７番ヌクレオチド領域がＬａｓＡの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号６のポリヌクレオチド上のＬａｓＡの分泌シグナルコード領域は、１～９３番ヌクレオチド領域である。
配列番号８のポリヌクレオチドでは、５６５～１１０４番ヌクレオチド領域がＡｈＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号９のポリヌクレオチドでは、６２５～１１６４番ヌクレオチド領域がＡｈＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号９のポリヌクレオチド上のＡｈＰの分泌シグナルコード領域は、１～６０番ヌクレオチド領域である。
配列番号１１のポリヌクレオチドは、５２９～１０６５番ヌクレオチド領域がＬｇＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号１２のポリヌクレオチドでは、６２８～１１６４番ヌクレオチド領域がＬｇＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号１２のポリヌクレオチド上のＬｇＢＬＰの分泌シグナルコード領域は、１～９９番ヌクレオチド領域である。
配列番号１４のポリヌクレオチドは、５５０～１０８６番ヌクレオチド領域がＬａＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号１５のポリヌクレオチドでは、６２８～１１６４番ヌクレオチド領域がＬａＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号１５のポリヌクレオチド上のＬａＢＬＰの分泌シグナルコード領域は、１～７８番ヌクレオチド領域である。
上記のポリヌクレオチドにコードされるプロ領域は、その下流に位置する成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する。
配列番号５のポリヌクレオチドでは、６１６～１１６４番ヌクレオチド領域がＬａｓＡの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号６のポリヌクレオチドでは、７０９～１２５７番ヌクレオチド領域がＬａｓＡの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号６のポリヌクレオチド上のＬａｓＡの分泌シグナルコード領域は、１～９３番ヌクレオチド領域である。
配列番号８のポリヌクレオチドでは、５６５～１１０４番ヌクレオチド領域がＡｈＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号９のポリヌクレオチドでは、６２５～１１６４番ヌクレオチド領域がＡｈＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号９のポリヌクレオチド上のＡｈＰの分泌シグナルコード領域は、１～６０番ヌクレオチド領域である。
配列番号１１のポリヌクレオチドは、５２９～１０６５番ヌクレオチド領域がＬｇＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号１２のポリヌクレオチドでは、６２８～１１６４番ヌクレオチド領域がＬｇＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号１２のポリヌクレオチド上のＬｇＢＬＰの分泌シグナルコード領域は、１～９９番ヌクレオチド領域である。
配列番号１４のポリヌクレオチドは、５５０～１０８６番ヌクレオチド領域がＬａＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号１５のポリヌクレオチドでは、６２８～１１６４番ヌクレオチド領域がＬａＢＬＰの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号１５のポリヌクレオチド上のＬａＢＬＰの分泌シグナルコード領域は、１～７８番ヌクレオチド領域である。
上記のポリヌクレオチドにコードされるプロ領域は、その下流に位置する成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する。
【0028】
したがって、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドが挙げられる。該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドの例としては、配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列、配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列、配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列、又はこれらと少なくとも８０％同一な配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。これらポリヌクレオチドにコードされるプロ領域は、その下流に位置するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する。該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質をコードするポリヌクレオチドの例としては、上述したＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、及びそれらと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【0029】
目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、以下が挙げられる：
配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２の５２３～１０６２番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号３の５９５～１１３４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号３の１～５９４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号５の６１６～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６の７０９～１２５７番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号６の１～７０８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８の５６５～１１０４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号９の６２５～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号９の１～６２４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１１の５２９～１０６５番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１２の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１４の５５０～１０８６番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１５の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；及び、
配列番号１５の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２の５２３～１０６２番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号３の５９５～１１３４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号３の１～５９４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号５の６１６～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６の７０９～１２５７番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号６の１～７０８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａｓＡ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８の５６５～１１０４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号９の６２５～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号９の１～６２４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＡｈＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１１の５２９～１０６５番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１２の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬｇＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１４の５５０～１０８６番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１５の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域にＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド（好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；及び、
配列番号１５の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質（ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ、ＬａＢＬＰ、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはＬａＢＬＰ又はそれと同等の機能を有するポリペプチド）をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
【0030】
上記のポリヌクレオチドに含まれる、ＢＬＰ、ＬａｓＡ、ＡｈＰ、ＬｇＢＬＰ及びＬａＢＬＰ、ならびにそれらと同等の機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例としては、配列番号２の５２３～１０６２番の配列、配列番号５の６１６～１１６４番の配列、配列番号８の５６５～１１０４番の配列、配列番号１１の５２９～１０６５番の配列、及び配列番号１４の５５０～１０８６番の配列、ならびにそれらのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。これらのヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドは、いずれもペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
【0031】
当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、常法に従って調製することができる。例えば、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼを本来生産する微生物から常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。例えば、ＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２及び３）は、Lysobacter sp. (NBRC 12725又はNBRC 12726)、Achromobacter lyticus M497-1、Lysobacter sp. IB-9374、Lysobacter gummosus DSMZ 6980等から調製することができる。ＬａｓＡのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号５及び６）は、Pseudomonas aeruginosa PA01、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145、Pseudomonas aeruginosa FRD1等から調製することができる。ＡｈＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８及び９）は、Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966、Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier (ATCC 51307)等から調製することができる。ＬｇＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１及び１２）は、Lysobacter gummosus等から調製することができる。ＬａＢＬＰのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４及び１５）は、Lysobacter antibioticus等から調製することができる。上記微生物は、公的微生物保存機関より購入することができる。
【0032】
上記の手順で得られたプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して、さらに部位特異的変異導入を行うことにより、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製してもよい。あるいは、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該プロタンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学合成してもよい。
【0033】
当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、制御領域と作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、「制御領域」とは、その下流に配置された遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、該下流に配置された遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。より具体的には、遺伝子のコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して該コーディング領域の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における制御領域とは、遺伝子のコーディング領域の上流２００～６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２－１３４６）。
【0034】
当該制御領域の好ましい例としては、バチルス属菌で機能する制御領域、例えば、バチルス属細菌由来のα－アミラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、ａｐｒＥ遺伝子又はｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子（特開２０００－２１００８１号公報）の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子（特開２０１１－１０３８７公報）の制御領域、ならびに、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域（いずれも、特開２００９－０８９７０８号公報を参照）、などが挙げられるが、特に限定されない。該制御領域のより好ましい例として、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号１６）、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号１７）が挙げられる。また、好ましい制御領域としては、配列番号１６又は１７と少なくとも８０％の同一性を有し、かつ遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。
【0035】
また当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させる機能を有する分泌シグナルをコードする配列（分泌シグナル配列と呼ぶ）と作動可能に連結されていてもよい。当該分泌シグナル配列の好ましい例としては、バチルス属菌で機能する分泌シグナル配列、例えばバチルス属菌由来の分泌シグナル配列が挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列の好ましい例としては、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列（配列番号１８）、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列（配列番号１９）、枯草菌アミラーゼ遺伝子ａｍｙＥの分泌シグナル配列（配列番号２０）などが挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列のさらなる例としては、配列番号１８～２０のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、かつ発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させる機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。これらのバチルス属菌由来の分泌シグナル配列に連結される該プロタンパク質をコードする配列は、天然型Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル配列（例えば、上述した配列番号３、６、９、１２又は１５に含まれる分泌シグナル配列）を含んでいてもいなくてもよい。
【0036】
したがって、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述したプロモーター、分泌シグナル配列、及びターミネーターを含んでいてもよい。
【0037】
バチルス属菌への当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入は、定法に従って行うことができる。例えば、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主バチルス属菌細胞に導入して、該宿主細胞のゲノムに該ポリヌクレオチドを組み込むことができる。又は、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、宿主バチルス属菌細胞に導入してもよい。
【0038】
宿主バチルス属菌細胞へのポリヌクレオチドやベクターの導入には、例えば、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の公知の形質転換技術を適用することができる。
【0039】
当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び必要に応じて制御領域もしくは分泌シグナル配列を、常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより構築することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、好ましくは、宿主細胞内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは発現ベクターである。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【0040】
当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入されるバチルス属菌としては、特に制限されないが、枯草菌又はその変異株が好ましい。好ましくは、該バチルス属菌は、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼ以外の他のプロテアーゼを、細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出（以下、この過程を単に「放出」と呼ぶ）する。当該他のプロテアーゼの例としては、ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。従来、これらの細胞外プロテアーゼは組換え酵素の生産性を低下させる要因であることが知られており、これらの細胞外プロテアーゼを欠損させた枯草菌株で組換え酵素の生産性が向上したことも報告されている（特開２００６－１７４７０７号公報）。これに対し、本発明によるＭ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法では、これらの細胞外プロテアーゼを保持するバチルス属菌を酵素生産用の宿主としてむしろ好ましく利用する。
【0041】
ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸは、枯草菌遺伝子である。これらの遺伝子の遺伝子番号とコードするタンパク質の機能を表１に示す。ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸに相当する遺伝子としては、それぞれ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、及びａｐｒＸと、ヌクレオチド配列において少なくとも８０％の同一性を有し、かつ（表１に記載される）同じ機能のタンパク質をコードするバチルス属菌由来の遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、上述したＢＳＯＲＦ ＤＢで検索することができる。
【0042】
【表1】
【0043】
したがって、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入される当該バチルス属菌は、好ましくは細胞外プロテアーゼ活性を有する。微生物の細胞外プロテアーゼ活性は、該微生物の培養上清のアゾカゼイン分解活性を測定することで検出することができ、培養上清のアゾカゼイン分解活性は、後述する実施例４（４－２）に示す方法に従って測定することができる。培養上清がアゾカゼイン分解活性を有する微生物は、細胞外プロテアーゼ活性を有すると判断される。
【0044】
好ましくは、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入される当該バチルス属菌は、ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子、ｅｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｗｐｒＡ又はこれに相当する遺伝子、ｍｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｎｐｒＢ又はこれに相当する遺伝子、ｂｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｎｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子、ｖｐｒ又はこれに相当する遺伝子、及びａｐｒＸ又はこれに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現し、該遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は放出する枯草菌又はその変異株である。より好ましくは、該バチルス属菌は、ａｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子、ｅｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｗｐｒＡ又はこれに相当する遺伝子、ｍｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｎｐｒＢ又はこれに相当する遺伝子、ｂｐｒ又はこれに相当する遺伝子、ｎｐｒＥ又はこれに相当する遺伝子、ｖｐｒ又はこれに相当する遺伝子、及びａｐｒＸ又はこれに相当する遺伝子を発現し、該遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は放出する枯草菌又はその変異株である。
【0045】
本発明の方法においては、上記のような手順で得られた、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換えバチルス属菌を培養する。該バチルス属菌は、一般的なバチルス属菌の培養方法に従って培養すればよい。例えば、バチルス属菌の培養のための培地は、菌の生育に必要な炭素源及び窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、菌種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
【0046】
本発明の方法において、当該組換えバチルス属菌の培養により、目的のＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質が発現される。発現したプロタンパク質は、細胞外に分泌又は放出され、そこで該バチルス属菌が分泌又は放出した他の細胞外プロテアーゼの作用によりプロセシングされ、酵素活性を有する成熟型Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼへと変換される。したがって、本発明の方法では、成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼが、該組換えバチルス属菌の細胞外に製造される。製造された成熟型Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、培養物の細胞外成分中に蓄積する。
【0047】
以上の手順で、本発明の方法により成熟型Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼが製造される。製造されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、常法に従って培養物中から回収することができる。本発明の方法では、製造されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼは細胞外に蓄積するので、細胞を破壊することなく目的の酵素を回収することが可能である。例えば、培養物から遠心分離又はろ過などによって細胞を除去し、集めた上清又はろ液から、硫酸アンモニウム等の塩又はエタノール等の有機溶媒による沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法により、酵素を回収することができる。
【0048】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0049】
〔１〕Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを製造させることを含む、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼの製造方法。
〔２〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼが、配列番号１、４、７、１０もしくは１３のアミノ酸からなるポリペプチドであるか、又は、配列番号１、４、７、１０及び１３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドである、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔２〕記載の方法：
配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、及び１５のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするポリヌクレオチドと、を含むポリヌクレオチド、
好ましくは、該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列、配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列、配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列、又はこれらと少なくとも８０％同一な配列からなりかつその下流に位置するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与するポリヌクレオチドである。
〔４〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔２〕記載の方法：
配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２の５２３～１０６２番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号３の５９５～１１３４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号３の１～５９４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号５の６１６～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６の７０９～１２５７番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号６の１～７０８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８の５６５～１１０４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号９の６２５～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号９の１～６２４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１１の５２９～１０６５番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１２の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１４の５５０～１０８６番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１５の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；又は、
配列番号１５の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
〔５〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが分泌シグナル領域をさらに含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記分泌シグナル領域がバチルス属菌由来の分泌シグナル領域である、〔５〕記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記バチルス属菌が、プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出する菌である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記バチルス属菌が細胞外プロテアーゼ活性を有する、〔７〕記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記プロテアーゼがａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔７〕又は〔８〕記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕好ましくは、得られた培養物からＭ２３Ａファミリープロテアーゼを回収することをさらに含む、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔２〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼが、配列番号１、４、７、１０もしくは１３のアミノ酸からなるポリペプチドであるか、又は、配列番号１、４、７、１０及び１３のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドである、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔２〕記載の方法：
配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、及び１５のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；又は
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼをコードするポリヌクレオチドと、を含むポリヌクレオチド、
好ましくは、該Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドが、配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列、配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列、配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列、配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列、又はこれらと少なくとも８０％同一な配列からなりかつその下流に位置するＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与するポリヌクレオチドである。
〔４〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔２〕記載の方法：
配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２の５２３～１０６２番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号２の１～５２２番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号３の５９５～１１３４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号３の１～５９４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号５の６１６～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号５の１～６１５番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６の７０９～１２５７番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号６の１～７０８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８の５６５～１１０４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号８の１～５６４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号９の６２５～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号９の１～６２４番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１１の５２９～１０６５番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１１の１～５２８番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１２の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１４の５５０～１０８６番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；
配列番号１４の１～５４９番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド；
配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１５の６２８～１１６４番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド；又は、
配列番号１５の１～６２７番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも８０％同一でありかつＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
〔５〕好ましくは、前記Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが分泌シグナル領域をさらに含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記分泌シグナル領域がバチルス属菌由来の分泌シグナル領域である、〔５〕記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記バチルス属菌が、プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出する菌である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記バチルス属菌が細胞外プロテアーゼ活性を有する、〔７〕記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記プロテアーゼがａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＸ、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１種である、〔７〕又は〔８〕記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕好ましくは、得られた培養物からＭ２３Ａファミリープロテアーゼを回収することをさらに含む、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
【実施例】
【0050】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0051】
以下の実施例で用いたプライマーの配列を表２に示す。
【0052】
【表2】
【0053】
実施例１ 組換え枯草菌によるＢＬＰ生産
（１－１）ＢＬＰ発現プラスミドの構築
ＢＬＰ遺伝子（配列番号３）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＢＬＰ／ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ／ＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ（配列番号２１及び２２）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ－Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ－ｓｉｇ－Ｒ（配列番号２３及び２４）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液をＥＣＯＳTM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ）を構築した。
（１－１）ＢＬＰ発現プラスミドの構築
ＢＬＰ遺伝子（配列番号３）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＢＬＰ／ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ／ＢＬＰ＿Ｓ２３７ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ（配列番号２１及び２２）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ－Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ－ｓｉｇ－Ｒ（配列番号２３及び２４）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液をＥＣＯＳTM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ）を構築した。
【0054】
（Ａ）ｐＨＹ－ＢＬＰ２
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアΔＢＬＰｓｉｇ＿Ｆ／ΔＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号２５及び２６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ２）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ２は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアΔＢＬＰｓｉｇ＿Ｆ／ΔＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号２５及び２６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ２）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ２は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0055】
（Ｂ）ｐＨＹ－ＢＬＰ３
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアＢＬＰｓｉｇ＿Ｆ／ＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号２７及び２８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ３）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ３は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ＢＬＰプレプロタンパク質（分泌シグナル＋プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアＢＬＰｓｉｇ＿Ｆ／ＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号２７及び２８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ３）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ３は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ＢＬＰプレプロタンパク質（分泌シグナル＋プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0056】
（Ｃ）ｐＨＹ－ＢＬＰ４
ｐＨＹ－ＢＬＰ２を鋳型としてプライマーペアΔｐｒｏ＿Ｆ／Δｐｒｏ＿Ｒ（配列番号２９及び３０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ４）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ４は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＢＬＰ成熟タンパク質をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
ｐＨＹ－ＢＬＰ２を鋳型としてプライマーペアΔｐｒｏ＿Ｆ／Δｐｒｏ＿Ｒ（配列番号２９及び３０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ４）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ４は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＢＬＰ成熟タンパク質をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0057】
（Ｄ）ｐＨＹ－ＢＬＰ５
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアΔＢＬＰｓｉｇ２＿Ｆ／ＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号３１及び２８）を用いてＰＣＲを行った。枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３９０，ｐ．２４９）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーペアａｍｙＥｓｉｇ（ＢＬＰ）＿Ｆ／ａｍｙＥｓｉｇ（ＢＬＰ）＿Ｒ（配列番号３２及び３３）を使用して、同様にＰＣＲを行った。得られた断片を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ５）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ５は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ａｍｙＥ分泌シグナル配列（配列番号２０）、ＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
ｐＨＹ－ＢＬＰを鋳型としてプライマーペアΔＢＬＰｓｉｇ２＿Ｆ／ＢＬＰｓｉｇ＿Ｒ（配列番号３１及び２８）を用いてＰＣＲを行った。枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３９０，ｐ．２４９）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーペアａｍｙＥｓｉｇ（ＢＬＰ）＿Ｆ／ａｍｙＥｓｉｇ（ＢＬＰ）＿Ｒ（配列番号３２及び３３）を使用して、同様にＰＣＲを行った。得られた断片を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、プラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ５）を構築した。ｐＨＹ－ＢＬＰ５は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ａｍｙＥ分泌シグナル配列（配列番号２０）、ＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0058】
（１－２）組換え枯草菌の作製
宿主には、枯草菌１６８株を使用した。（１－１）で得たＢＬＰ発現プラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ２～５及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、以下の方法によって宿主に導入した。１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株を植菌し、３０℃、２００ｓｐｍで一晩振盪培養した。得られた培養液１０μＬを１ｍＬの新たなＬＢ培地に植菌して３７℃、２００ｓｐｍで３時間培養した。培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液３３μＬ、各プラスミド２０ｎｇを混合し、さらに１００μＬの４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。得られた液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地（０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％）に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
宿主には、枯草菌１６８株を使用した。（１－１）で得たＢＬＰ発現プラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ２～５及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、以下の方法によって宿主に導入した。１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株を植菌し、３０℃、２００ｓｐｍで一晩振盪培養した。得られた培養液１０μＬを１ｍＬの新たなＬＢ培地に植菌して３７℃、２００ｓｐｍで３時間培養した。培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液３３μＬ、各プラスミド２０ｎｇを混合し、さらに１００μＬの４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。得られた液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地（０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％）に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
【0059】
（１－３）組換え枯草菌の培養及び培養上清の取得
終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加したＬＢ培地１ｍＬに（１－２）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ4、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加したＬＢ培地１ｍＬに（１－２）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ4、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
【0060】
（１－４）培養上清における酵素活性の測定
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｐｎ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質［以下ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ］（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｐｎ）とは２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴のアッセイプレ－ト（ＡＧＣテクノグラス、３８８１－０９６）に（１－３）で得た培養上清（適宣希釈）を２μＬ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２００μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭ ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧの代わりにＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及びＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２（ペプチド研究所）の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及び１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２を含む溶液の蛍光強度をＸとしたとき、Ｘ／ｍｉｎの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｐｎ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質［以下ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ］（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｐｎ）とは２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴のアッセイプレ－ト（ＡＧＣテクノグラス、３８８１－０９６）に（１－３）で得た培養上清（適宣希釈）を２μＬ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２００μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭ ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧの代わりにＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及びＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２（ペプチド研究所）の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及び１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２を含む溶液の蛍光強度をＸとしたとき、Ｘ／ｍｉｎの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。
【0061】
測定の結果を図１に示す。空ベクターを導入した組換え株の培養上清ではＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性は検出されなかったが、ＢＬＰプロタンパク質をコードするプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ２、３、５）を導入した組換え株の培養上清では、ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出された。このことから、ＢＬＰプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え枯草菌の培養上清中に、グリシン－グリシン結合の分解活性を有する酵素が存在することが示された。また、ＢＬＰの本来の分泌シグナルを含むプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ３）を導入した組換え株と比較して、Ｓ２３７分泌シグナルを含むプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ２）及びａｍｙＥ分泌シグナルを含むプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ５）を導入した組換え株では、培養上清のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性は高かった。このことから、枯草菌で効率的に働く分泌シグナルをプロタンパク質に連結することで、ＢＬＰの生産性が向上することが示された。また、ＢＬＰのプロ領域を含まないプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ４）を導入した組換え株の培養上清ではＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出されなかったことから、ＢＬＰ成熟体の生産にはプロ領域が必須であることが示された。
【0062】
（１－５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
（１－３）で得た培養上清に終濃度２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ナカライテスク）を混合した。この混合液を２５ｍＭのジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と１：１で混合し、１００℃で５分間加熱した。得られた溶液をサンプルとして、Ａｎｙ ｋＤTMミニプロティアンＴＧＸTMステインフリーゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。マーカーにはプレシジョンＰｌｕｓプロテインTM未着色スタンダード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。
（１－３）で得た培養上清に終濃度２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ナカライテスク）を混合した。この混合液を２５ｍＭのジチオトレイトール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と１：１で混合し、１００℃で５分間加熱した。得られた溶液をサンプルとして、Ａｎｙ ｋＤTMミニプロティアンＴＧＸTMステインフリーゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。マーカーにはプレシジョンＰｌｕｓプロテインTM未着色スタンダード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。
【0063】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、ＢＬＰプロタンパク質をコードするプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ２、３）を導入した組換え枯草菌の培養上清では、ＢＬＰ成熟体（１９．３ｋＤａ）の位置にバンドが検出された（図２）。
【0064】
実施例２ 細胞外プロテアーゼが成熟ＢＬＰ生産に与える影響
（２－１）ＢＬＰ－ＦＬＡＧ発現プラスミドの構築
（１－１）で得たプラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ２を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿ＦＬＡＧ＿Ｆ／ＢＬＰ＿ＦＬＡＧ＿Ｒ（配列番号３４及び３５）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行い、反応液をＥＣＯＳTM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧ）を構築した。プラスミドＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、Ｃ末端にＦＬＡＧ（登録商標）タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫのアミノ酸配列）を付加したＢＬＰプロタンパク質をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ－ＦＬＡＧ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
（２－１）ＢＬＰ－ＦＬＡＧ発現プラスミドの構築
（１－１）で得たプラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ２を鋳型としてプライマーペアＢＬＰ＿ＦＬＡＧ＿Ｆ／ＢＬＰ＿ＦＬＡＧ＿Ｒ（配列番号３４及び３５）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行い、反応液をＥＣＯＳTM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧ）を構築した。プラスミドＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、Ｃ末端にＦＬＡＧ（登録商標）タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫのアミノ酸配列）を付加したＢＬＰプロタンパク質をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＢＬＰ－ＦＬＡＧ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0065】
（２－２）組換え枯草菌の作製及び培養上清の取得
宿主には、枯草菌１６８株、及び９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸ）を欠損した枯草菌Ｄｐｒ９株（特開２００６－１７４７０７号公報の実施例１～５において作製されたＫａｏ９株）を使用した。（２－１）で得たプラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧ及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、（１－２）と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。得られた組換え枯草菌コロニーを（１－３）と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
宿主には、枯草菌１６８株、及び９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸ）を欠損した枯草菌Ｄｐｒ９株（特開２００６－１７４７０７号公報の実施例１～５において作製されたＫａｏ９株）を使用した。（２－１）で得たプラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ－ＦＬＡＧ及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、（１－２）と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。得られた組換え枯草菌コロニーを（１－３）と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
【0066】
（２－３）培養上清における酵素活性の測定及びウェスタンブロッティング
（２－２）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。また（２－２）で得た培養上清を用いて、（１－５）と同様の手順でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲルを、トランスブロットＴｕｒｂｏTMシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏＴＭミニＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。転写後のメンブレンをｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＲＰ標識抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ抗体（ＣＳＴ）と反応させた後、イムノスターTMゼータ（富士フイルム和光純薬）を用いて目的タンパク質を検出した。
（２－２）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。また（２－２）で得た培養上清を用いて、（１－５）と同様の手順でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲルを、トランスブロットＴｕｒｂｏTMシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とトランスブロットＴｕｒｂｏＴＭミニＰＶＤＦ転写パック（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。転写後のメンブレンをｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＲＰ標識抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ抗体（ＣＳＴ）と反応させた後、イムノスターTMゼータ（富士フイルム和光純薬）を用いて目的タンパク質を検出した。
【0067】
酵素活性の測定の結果、１６８株の組換え体ではＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出されたが、細胞外プロテアーゼを欠損したＤｐｒ９株の組換え体ではＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出されなかった（図３）。またウェスタンブロットの結果、１６８株の組換え体ではＢＬＰ成熟体（１９．３ｋＤａ）の位置にバンドが検出されたが、Ｄｐｒ９株の組換え体ではＢＬＰプロタンパク質（３８．１ｋＤａ）の位置にバンドが検出された（図４）。これらの結果から、培養物中の細胞外プロテアーゼが、活性型ＢＬＰ成熟体の生産において重要な役割を担っており、とりわけ、ＢＬＰの成熟化に働いていることが示された。
【0068】
一方、９株のプロテアーゼ欠損株（Δｅｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｎｐｒＢ、Δｂｐｒ、ΔｎｐｒＥ、Δｖｐｒ、ΔａｐｒＥ、及びΔａｐｒＸ）については、全て株の組換え体の培養上清からＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が測定された。そのうち８株の活性は１６８株に対して８０％以上であった。残り１株も１６８株に対して５０％以上のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性を有していた。これら及び上記のＤｐｒ９株での結果から、細胞外プロテアーゼが活性型ＢＬＰ成熟体の生産に寄与していることが示唆された。
【0069】
実施例３ 組換え枯草菌による各種Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼの生産
（３－１）ＬａｓＡ発現プラスミドの構築
ＬａｓＡ遺伝子（配列番号６）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿ＣＲ（配列番号３６及び３７）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号３８及び３９）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＬａｓＡ）を構築した。ｐＨＹ－ＬａｓＡを鋳型として、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｒ（配列番号３８及び４０）、及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して、ＰＣＲ、ＤｐｎＩ消化、及びライゲーションを行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬａｓＡ２）を構築した。ｐＨＹ－ＬａｓＡ２は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬａｓＡプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬａｓＡ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
（３－１）ＬａｓＡ発現プラスミドの構築
ＬａｓＡ遺伝子（配列番号６）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａｓＡ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａｓＡ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿ＣＲ（配列番号３６及び３７）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号３８及び３９）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＬａｓＡ）を構築した。ｐＨＹ－ＬａｓＡを鋳型として、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ＬａｓＡ＿Ｃｈｉｓ＿ｎ＿Ｒ（配列番号３８及び４０）、及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して、ＰＣＲ、ＤｐｎＩ消化、及びライゲーションを行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬａｓＡ２）を構築した。ｐＨＹ－ＬａｓＡ２は、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬａｓＡプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬａｓＡ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0070】
（３－２）ＡｈＰ発現プラスミドの構築
ＡｈＰ遺伝子（配列番号９）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡｈＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡｈＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＡｈＰ＿Ｆ／ＡｈＰ＿Ｒ（配列番号４１及び４２）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ－Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ－Ｒ（配列番号２３及び４３）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＡｈＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＡｈＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ＡｈＰ分泌シグナル配列、ＡｈＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＡｈＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
ＡｈＰ遺伝子（配列番号９）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＡｈＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＡｈＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＡｈＰ＿Ｆ／ＡｈＰ＿Ｒ（配列番号４１及び４２）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｖｅｃｔｏｒ－Ｆ／ｖｅｃｔｏｒ－Ｒ（配列番号２３及び４３）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＡｈＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＡｈＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、ＡｈＰ分泌シグナル配列、ＡｈＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＡｈＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0071】
（３－３）ＬｇＢＬＰ発現プラスミドの構築
Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｇｕｍｍｏｓｕｓ由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９４１６９０．１、以下ＬｇＢＬＰという）の遺伝子（ＬｇＢＬＰ遺伝子、配列番号１１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬｇＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬｇＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬｇＢＬＰ＿Ｆ／ＬｇＢＬＰ＿Ｒ（配列番号４４及び４５）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号３８及び３９）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬｇＢＬＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＬｇＢＬＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬｇＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬｇＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｇｕｍｍｏｓｕｓ由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９４１６９０．１、以下ＬｇＢＬＰという）の遺伝子（ＬｇＢＬＰ遺伝子、配列番号１１）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬｇＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬｇＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬｇＢＬＰ＿Ｆ／ＬｇＢＬＰ＿Ｒ（配列番号４４及び４５）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ（配列番号３８及び３９）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬｇＢＬＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＬｇＢＬＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬｇＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬｇＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0072】
（３－４）ＬａＢＬＰ発現プラスミドの構築
Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９７０４３０．１、以下ＬａＢＬＰという）の遺伝子（ＬａＢＬＰ遺伝子、配列番号１４）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａＢＬＰ＿Ｆ／ＬａＢＬＰ＿Ｒ（配列番号４６及び４７）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ （配列番号３８及び３９） を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬａＢＬＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＬａＢＬＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬａＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬａＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９７０４３０．１、以下ＬａＢＬＰという）の遺伝子（ＬａＢＬＰ遺伝子、配列番号１４）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したもの（ＬａＢＬＰ／ｐＵＣ５７）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。ＬａＢＬＰ／ｐＵＣ５７を鋳型とし、プライマーペアＬａＢＬＰ＿Ｆ／ＬａＢＬＰ＿Ｒ（配列番号４６及び４７）を使用して、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）のプロトコルに従いＰＣＲを行った。ｐＨＹ－Ｓ２３７（ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１）を鋳型とし、プライマーペアｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｆ／ｐＨＹ＿ｊｕｓｔ＿Ｒ＿ＮＥＷ （配列番号３８及び３９） を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理した。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に形質転換して、プラスミド（ｐＨＹ－ＬａＢＬＰ）を構築した。ｐＨＹ－ＬａＢＬＰは、Ｓ２３７プロモーター配列（配列番号１６）、Ｓ２３７分泌シグナル配列（配列番号１８）、ＬａＢＬＰプロタンパク質（プロ領域＋成熟体）をコードする配列、Ｓ２３７ターミネーター配列の順に連結したＬａＢＬＰ遺伝子発現用配列と、ｐＨＹ３００ＰＬＫベクター配列からなる。
【0073】
（３－５）組換え枯草菌の作製
宿主には、枯草菌１６８株を使用した。（３－１）～（３－４）で得た各プラスミド及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、（１－２）と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。
宿主には、枯草菌１６８株を使用した。（３－１）～（３－４）で得た各プラスミド及び空ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）のそれぞれを、（１－２）と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。
【0074】
（３－６）組換え枯草菌の培養及び培養上清の取得
（３－５）で得た組換え枯草菌コロニーを（１－３）と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
（３－５）で得た組換え枯草菌コロニーを（１－３）と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
【0075】
（３－７）培養上清の酵素活性測定
（３－６）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。なおＬａｓＡ活性の測定においては、空ベクター導入株及びＬａｓＡ発現プラスミド導入株の培養上清をアミコンウルトラ１０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０倍に濃縮したものを使用した。測定の結果、全てのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼについて、プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え枯草菌の培養上清では、空ベクター導入枯草菌の培養上清よりも高いＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出された（図５）。
（３－６）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。なおＬａｓＡ活性の測定においては、空ベクター導入株及びＬａｓＡ発現プラスミド導入株の培養上清をアミコンウルトラ１０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０倍に濃縮したものを使用した。測定の結果、全てのＭ２３Ａサブファミリープロテアーゼについて、プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え枯草菌の培養上清では、空ベクター導入枯草菌の培養上清よりも高いＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出された（図５）。
【0076】
実施例４ 枯草菌細胞外プロテアーゼ活性の測定
（４－１）枯草菌の培養及び培養上清の取得
枯草菌１６８株、９株の細胞外プロテアーゼ欠損株（Δｅｐｒ株、ΔｗｐｒＡ株、Δｍｐｒ株、ΔｎｐｒＢ株、Δｂｐｒ株、ΔｎｐｒＥ株、Δｖｐｒ株、ΔａｐｒＥ株、及びΔａｐｒＸ株）及びＤｐｒ９株をＬＢ培地１ｍＬにそれぞれ植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ4；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
（４－１）枯草菌の培養及び培養上清の取得
枯草菌１６８株、９株の細胞外プロテアーゼ欠損株（Δｅｐｒ株、ΔｗｐｒＡ株、Δｍｐｒ株、ΔｎｐｒＢ株、Δｂｐｒ株、ΔｎｐｒＥ株、Δｖｐｒ株、ΔａｐｒＥ株、及びΔａｐｒＸ株）及びＤｐｒ９株をＬＢ培地１ｍＬにそれぞれ植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ4；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
【0077】
（４－２）培養上清のアゾカゼイン分解活性測定
培養上清中に含まれるプロテアーゼの活性を測定する基質として、アゾカゼイン（ＳＩＧＭＡ）を用いた。基質溶液（１％（ｗ／ｖ）アゾカゼイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に（４－１）で得た培養上清を５０μＬ添加して３７℃で１８時間反応させた。５％トリクロロ酢酸水溶液２ｍＬを添加して反応を停止し、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を適宣希釈して光路長１ｃｍのキュベットを用いて３４０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清と５％トリクロロ酢酸水溶液の添加順を逆にしたものを対照とした。対照と比較して統計学的に有意（ｔ検定、ｐ＜０．０５）な吸光度の増加が検出された培養上清を、アゾカゼイン分解活性ありと判定した。測定の結果、１６８株及び９株の細胞外プロテアーゼ欠損株（Δｅｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｎｐｒＢ、Δｂｐｒ、ΔｎｐｒＥ、Δｖｐｒ、ΔａｐｒＥ、及びΔａｐｒＸ）の培養上清ではアゾカゼイン分解活性が検出され、一方、Ｄｐｒ９株の培養上清では検出されなかった（検出限界以下）。これらの結果は、それぞれの株の活性型ＢＬＰ生産能と一致した（表３）。
培養上清中に含まれるプロテアーゼの活性を測定する基質として、アゾカゼイン（ＳＩＧＭＡ）を用いた。基質溶液（１％（ｗ／ｖ）アゾカゼイン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に（４－１）で得た培養上清を５０μＬ添加して３７℃で１８時間反応させた。５％トリクロロ酢酸水溶液２ｍＬを添加して反応を停止し、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清を適宣希釈して光路長１ｃｍのキュベットを用いて３４０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清と５％トリクロロ酢酸水溶液の添加順を逆にしたものを対照とした。対照と比較して統計学的に有意（ｔ検定、ｐ＜０．０５）な吸光度の増加が検出された培養上清を、アゾカゼイン分解活性ありと判定した。測定の結果、１６８株及び９株の細胞外プロテアーゼ欠損株（Δｅｐｒ、ΔｗｐｒＡ、Δｍｐｒ、ΔｎｐｒＢ、Δｂｐｒ、ΔｎｐｒＥ、Δｖｐｒ、ΔａｐｒＥ、及びΔａｐｒＸ）の培養上清ではアゾカゼイン分解活性が検出され、一方、Ｄｐｒ９株の培養上清では検出されなかった（検出限界以下）。これらの結果は、それぞれの株の活性型ＢＬＰ生産能と一致した（表３）。
【0078】
【表3】
【0079】
実施例５ 天然のＢＬＰ生産菌とのＢＬＰ生産性比較
（５－１）ＢＬＰ生産菌の培養及び培養上清の取得
これまで、活性型のＢＬＰを生産する方法としては、単離された天然のＢＬＰ生産菌を培養する方法のみが実証されている。本実施例では、天然のＢＬＰ生産菌にＢＬＰを生産させ、その生産性を実施例１のＢＬＰ生産性組換え枯草菌と比較した。
（５－１）ＢＬＰ生産菌の培養及び培養上清の取得
これまで、活性型のＢＬＰを生産する方法としては、単離された天然のＢＬＰ生産菌を培養する方法のみが実証されている。本実施例では、天然のＢＬＰ生産菌にＢＬＰを生産させ、その生産性を実施例１のＢＬＰ生産性組換え枯草菌と比較した。
【0080】
天然のＢＬＰ生産菌であるAchromobacter lyticus M497-1株をＬＢ培地１ｍＬに植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ4；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
【0081】
（５－２）培養上清の酵素活性測定
（５－１）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。測定の結果、Achromobacter lyticus M497-1株の培養上清からは１４Ｕ／ｍＬのＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出された。これは実施例１の成熟ＢＬＰ発現組換え枯草菌による活性（図１、それぞれ４３、５９４及び６１３Ｕ／ｍＬ）と比較して大幅に小さい値であった。なお、これまでの報告で最も効率的にＢＬＰを生産する菌株は、非特許文献３に記載のLysobacter sp. IB-9374株である。しかし、その生産性はAchromobacter lyticus M497-1株の２．４倍とされており、実施例１の組換え枯草菌によるＢＬＰ生産性には遠く及ばないものと思われる。以上のことから、本発明は、異種発現というだけでなくその生産性においても既存技術に対して大きく優位性を持つ技術である。
（５－１）で得た培養上清の酵素活性を（１－４）と同様の手順で測定した。測定の結果、Achromobacter lyticus M497-1株の培養上清からは１４Ｕ／ｍＬのＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が検出された。これは実施例１の成熟ＢＬＰ発現組換え枯草菌による活性（図１、それぞれ４３、５９４及び６１３Ｕ／ｍＬ）と比較して大幅に小さい値であった。なお、これまでの報告で最も効率的にＢＬＰを生産する菌株は、非特許文献３に記載のLysobacter sp. IB-9374株である。しかし、その生産性はAchromobacter lyticus M497-1株の２．４倍とされており、実施例１の組換え枯草菌によるＢＬＰ生産性には遠く及ばないものと思われる。以上のことから、本発明は、異種発現というだけでなくその生産性においても既存技術に対して大きく優位性を持つ技術である。
【0082】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】