特許 7233652 口腔内細菌増殖抑制組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-27

(45)【発行日】2023-03-07

(54)【発明の名称】口腔内細菌増殖抑制組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/105 20160101AFI20230228BHJP

   A23L 11/50 20210101ALI20230228BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20230228BHJP

   A61K 36/06 20060101ALI20230228BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20230228BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230228BHJP

【ＦＩ】

A23L33/105

A23L11/50

A61K36/48

A61K36/06 A

A61P1/02

A61P31/04

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2019544488

(86)(22)【出願日】2018-09-05

(86)【国際出願番号】 JP2018032798

(87)【国際公開番号】W WO2019065124

(87)【国際公開日】2019-04-04

【審査請求日】2021-09-01

(31)【優先権主張番号】P 2017184274

(32)【優先日】2017-09-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000210067

【氏名又は名称】池田食研株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504147243

【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学

(74)【代理人】

【識別番号】100216286

【弁理士】

【氏名又は名称】篠崎 史典

(72)【発明者】

【氏名】青木 秀之

(72)【発明者】

【氏名】二井 広平

(72)【発明者】

【氏名】宮島 彩

(72)【発明者】

【氏名】高柴 正悟

(72)【発明者】

【氏名】伊東 孝

(72)【発明者】

【氏名】伊東 昌洋

【審査官】戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１２－０９７０３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Book of Abstracts International Conference on Drug Discovery & Development (ICDDD 2017)，2017年09月12日，p.34

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

Ａ２３Ｌ １１／５０

Ａ６１Ｐ １／０２

Ａ６１Ｐ ３１／０４

ＦＳＴＡ／ＣＡｐｌｕｓ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リゾプス属に属する糸状菌を用いてなる大豆発酵物の、水溶液による水抽出物を有効成分とする口腔内細菌増殖抑制組成物。

【請求項2】

リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス ミクロスポラス（Rhizopus microsporus）、リゾプス オリゼ（Rhizopus oryzae）及びリゾプス ストロニファー（Rhizopus stolonifer）の少なくとも一種である、請求項１に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。

【請求項3】

口腔内細菌増殖抑制が、バイオフィルム形成抑制によるものである、請求項１又は２に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。

【請求項4】

口腔内細菌増殖抑制組成物が飲食品である、請求項１～３に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。

【請求項5】

口腔内細菌増殖抑制組成物が口腔ケア用品である、請求項１～４に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。

【請求項6】

リゾプス属に属する糸状菌を用いて大豆を発酵させることにより大豆発酵物を製造する工程を含む、請求項１～５に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、口腔内細菌増殖抑制組成物（又は、「口腔内細菌増殖抑制用組成物」）等に関する。

【背景技術】

【0002】

戦後、医療の進歩、食生活の改善等に伴い、日本人の平均寿命は急速に伸び、現在日本はＷＨＯ加盟国の中で上位の平均寿命となっている。一方、近年、日常生活を送る上において介護を必要とせず、自分で生活ができる生存期間である健康寿命が重要視されるようになり、この健康寿命と平均寿命の差、即ち不健康期間が長いことが問題となっている。健康寿命を延伸する要因として、歯の本数との関係が報告されている。歯の本数の多い人は少ない人と比べ、認知症発症や転倒する危険性が低いとされている。そこで、日本国内において、８０歳で２０本以上の歯を残すことを目的とした運動、即ち８０２０運動が展開され、歯の多く残る人が増加している。しかし、８０２０運動の結果として、歯が残っているものの、オーラルケアが困難な要介護者が増加しており、歯に形成されたバイオフィルム由来の口腔内細菌による誤嚥性肺炎が問題（日本の死因の３位）となっている。

【0003】

う蝕原因菌とも呼ばれる、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（以下、「Ｓ．ｍｕｔａｎｓ」と略記））は、う蝕の原因となる、う蝕原因菌の一種で、スクロースを基質としてグルカンを産生し、産生されたグルカンにより菌は歯への付着能を有し、バイオフィルムを形成する。形成されたバイオフィルムに誤嚥性肺炎の起因菌等が繁殖した状態となり、これらの細菌が気管、肺へと入り、誤嚥性肺炎を引き起こすとされている。

【0004】

現在、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの予防方法として抗菌剤が使用されている。しかしながら、抗菌剤での殺菌は、抗菌剤に不感受性の菌が繁殖する菌交代現象の発生や抗菌剤に耐性のある菌の発現リスク等の問題点がある。このことから、既存の抗菌剤と同等以上の抗菌力価を有し、生体に安全な抗菌物質のニーズが高まっている。他のＳ．ｍｕｔａｎｓの生育あるいはバイオフィルムの形成を抑制する為の方法として、以下が報告されている。

【0005】

例えば大豆あるいは大豆発酵食品を使用したＳ．ｍｕｔａｎｓの生育抑制効果に関しては、納豆、納豆分離菌、及び納豆分離菌培養濾液を有効成分とするＳ．ｍｕｔａｎｓ由来のバイオフィルム形成抑制剤について報告されている。これらは、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来のバイオフィルム形成抑制効果は有するが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの生育は抑制できない。また、納豆を使用した場合には、納豆特有の臭いが問題であるとされている（特許文献１）。
更に、紅麹菌、テンペ菌、酵母菌、クモノスカビ、ケカビ及びコウジ等による大豆発酵物のオートインデューサー－２阻害によるＳ．ｍｕｔａｎｓの生育抑制について報告されているが、ヘキサン抽出物を有効成分とし、水、５０％エタノール抽出物では有効でないとされており、有効成分が水溶性物質でないため使用範囲が限定される問題がある（特許文献２）。

【0006】

また、大豆有効成分のＳ．ｍｕｔａｎｓ抑制効果に関しては、７Ｓグロブリンやダイズタンパク質のサーモリシン分解物等について報告されている。分子量サイズは５０～７５ｋＤａである７Ｓグロブリンに関しては、クオラムセンシングのコントロール因子であるＣｏｍｐｅｔｅｎｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＳＰ）の働きを阻害することで、Ｓ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成を抑制するが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの生育は抑制できない（特許文献３）。また、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物に関しては、ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物である分子量０.３～１０ｋＤａのペプチド(ＬＥＨＡ)がう蝕原因菌及び歯垢形成を抑制するとされているが、ダイズタンパク質を加水分解するために独特な苦味や異臭が発生する課題がある（特許文献４）。

【0007】

一方、インドネシアを代表する発酵食品であるテンペ調製に使用するリゾプス オリゴスポラス（「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌiｇｏｓｐｏｒｕｓ」、現在、「リゾプス ミクロスポラス「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ」に統合）の培養液から精製した分子量が約５.５ｋＤａのペプチドにグラム陰性菌に対する抗菌活性が認められたとの報告があるが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖抑制やバイオフィルム形成抑制効果については確認されていない（非特許文献１）。また、糸状菌であるアスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）培養液から精製した物質「ムタステイン」は、バイオフィルム形成阻害があることが報告されているが、Ｓ．ｍｕｔａｎｓの生育は抑制しない（特許文献５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開２０１４－２２７３５５

【文献】特開２０１２－９７０３９

【文献】特開２０１５－１６６３３４

【文献】特開２００９－２１９４０３

【文献】特開昭６１－４７５１５

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１（１９９２）, ９４－９８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、口腔内細菌の生育阻害とバイオフィルム形成抑制効果等がある大豆発酵物を有効成分とする口腔内細菌増殖抑制組成物を提供すること、及び、該口腔内細菌増殖抑制組成物の製造方法、摂取方法、使用方法等を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者は、微生物による発酵物に着目し、鋭意研究を重ねた結果、インドネシアの伝統的発酵食品として知られるリゾプス属の糸状菌を用いる大豆発酵物が、優れた口腔内細菌の生育阻害効果（抗菌効果）やバイオフィルム形成抑制効果を示し、その結果、該大豆発酵物を含む組成物に口腔内細菌増殖抑制作用があることを初めて見出し、本発明を完成した。

【0012】

すなわち、本発明は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の糸状菌を用いて発酵することにより得られる大豆発酵物又はその抽出物を有効成分として含有する口腔内細菌増殖抑制組成物等に関する。

【0013】

本発明は、以下の［１］～［７］の態様に関する。
［１］リゾプス属に属する糸状菌を用いてなる大豆発酵物又はその抽出物を有効成分とする口腔内細菌増殖抑制組成物。
［２］リゾプス属に属する糸状菌が、リゾプス ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びリゾプス ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）の少なくとも一種である、［１］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。
［３］口腔内細菌増殖抑制が、う蝕原因菌、歯周病菌又は日和見感染菌を含む口腔内細菌の生育阻害によるものである、［１］～［２］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。
［４］口腔内細菌増殖抑制が、バイオフィルム形成抑制によるものである、［１］～［３］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。
［５］口腔内細菌増殖抑制組成物が飲食品である、［１］～［４］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。
［６］口腔内細菌増殖抑制組成物が口腔ケア用品である、［１］～［５］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物。
［７］リゾプス属に属する糸状菌を用いて大豆を発酵させることにより大豆発酵物を製造する工程を含む、［１］～［６］に記載の口腔内細菌増殖抑制組成物の製造方法。

【発明の効果】

【0014】

本発明の大豆発酵物又はその抽出物を有効成分として含む口腔内細菌増殖抑制組成物は、口腔内細菌の生育阻害とバイオフィルム形成抑制効果等を奏し、該組成物は口腔内環境改善等に有用である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明は、リゾプス属を含む糸状菌を用いてなる大豆発酵物又はその抽出物を有効成分とする口腔内細菌増殖抑制組成物に係る。

【0016】

本発明で使用される微生物である糸状菌は、リゾプス属に属する糸状菌であり、例えば、リゾプス ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ） 、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及び、リゾプス ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ） 等が挙げられる。特に口腔内細菌の生育抑制やバイオフィルム形成抑制効果の高いリゾプス ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）が望ましい。本発明で使用される糸状菌に属する具体的な菌株は、ＮＢＲＣ 及びＡＴＣＣなどの公的な寄託機関又は法人に寄託されており、これらから容易に入手可能である。このような糸状菌株の好適例として、例えば、実施例で使用されているような、受託番号：ＮＢＲＣ４７１６、受託番号：ＮＢＲＣ３０８１６、及び、受託番号：ＮＢＲＣ３２００２が付されて寄託されている糸状菌株が挙げられる。更に、本発明に於ける「リゾプス ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、リゾプス オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）」には、これら糸状菌株から当業者に公知の任意の方法・手段で誘導される変異株であって、前記のように口腔内環境改善作用効果を有する糸状菌も含まれる。大豆の発酵に際してはこれら糸状菌株の一種を単独又はそれらを組合せて使用してもよい。尚、リゾプス属の微生物は、インドネシアの伝統的発酵食品として知られるテンペの製造に古くから使われてきた糸状菌類であり、極めて安全な微生物であることが特徴である。

【0017】

本発明による大豆発酵物は、主原料である大豆の種類や製造方法、形状、添加物の種類等は特定のものに限定されるものではない。原料の大豆は、糸状菌が発酵できるものであればよく、産地としては、例えば日本産、中国産、北米産、南米産の大豆等いずれもが使用できる。大豆発酵物の製造方法としては、まず大豆を酸性条件下で浸漬を行った後、脱皮を行う。浸漬時に使用する酸は、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等、食用の有機酸であればいずれも使用可能である。添加濃度は、リゾプス属糸状菌の生育を阻害しない濃度であればよく、例えば酢酸であれば約０.２～０.５重量％が好ましく、より好ましくは約０.５重量％である。浸漬処理した大豆について脱皮を行うが、原料中に大豆の外皮が残存しないことが望ましい。また、原料大豆に脱皮大豆を使用することにより、脱皮工程を省くことも可能である。このようにして得られた浸漬処理済み脱皮大豆は、酸性液中で水煮又は、圧力蒸煮を行うが、水煮の時間は約１５～９０分程度が好ましく、より好ましくは約１５～３０分である。加圧蒸煮条件は約１１０～１２５℃ 、約２～５分間加圧蒸煮が好ましく、より好ましくは約１２１℃ 、約２～３分間である。該加圧蒸煮した大豆を冷却後、リゾプス属糸状菌の胞子懸濁液若しくは凍結乾燥菌体等を植菌する。胞子懸濁液、凍結乾燥菌体等の添加量は、約０.１～５.０重量％ が好ましく、より好ましくは約０.２～３.０重量％ である。種菌添加後、よく混合し、これを表面に数十カ所穴を開けたポリ袋に厚さ約１.５ｃ ｍ 程度となるように充填する、若しくは同様の厚さにステンレストレー上に充填し、発酵する。発酵条件としては、温度は約２０～４５℃ 、好ましくは約２５～４０ ℃ である。また、湿度はＲＨ約６０～９８％で、好ましくはＲＨ約７０～９０％である。初発ｐＨは約３.０～７.０で、好ましくは約５.０～６.０である。発酵時間は約１０～１２０時間で、好ましくは約２４～７２時間である。該条件で発酵させることにより、口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果を有する大豆発酵物を得ることができる。
また、大豆発酵物の製造方法として、脱皮大豆、浸漬処理済み脱皮大豆、蒸煮大豆及び/又は、その粉砕物に加水後、発酵することができる。水の割合は、脱皮大豆、浸漬処理済み脱皮大豆、蒸煮大豆及び/又は、その粉砕物を１とした場合、好ましくは０.５以上、より好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上である。発酵条件としては、温度は約２０～４５℃ 、好ましくは約２５～４０ ℃ である。また、初発ｐＨは約３.０～７.０で、好ましくは約５.０～６.０である。発酵時間は約１０～１２０時間で、好ましくは約２４～７２時間である。該条件で発酵させることにより、口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果を有する大豆発酵物を得ることができる。

【0018】

該大豆発酵物はそのままの形態でも利用可能であるが、更に加熱殺菌、マイクロ波殺菌等を行っても利用可能である。また、必要に応じてこれらをペースト状にしたり、凍結乾燥、風乾等による乾燥品としたり、さらに粉砕後、粉末状にしたり、ペースト状にしたり、熱水及びリン酸緩衝生理食塩水、酸性溶液、アルカリ性溶液等の各種の水溶液等による水抽出を行って得られる水抽出液としても利用可能である。さらに該大豆発酵物の水抽出液を酸沈殿、硫酸アンモニウム沈殿、加熱処理等による部分精製品としても利用可能である。酸沈殿の条件としては、該大豆発酵物の水抽出液のｐＨを塩酸などでｐＨを約２.０～６.０、好ましくは約３.０～５.０で調整することにより、口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果を有する組成物が沈殿して得ることができる。硫酸アンモニウム沈殿の条件としては、該大豆発酵物の水抽出液中の最終的な硫酸アンモニウム濃度を２０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上で行うことで、口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果を有する組成物が沈殿して得ることができる。加熱処理の条件としては、該大豆発酵物の水抽出液を約４０℃～９０℃処理、好ましくは約６０～８５℃処理することで口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果を有する組成物を上清に得ることができる。さらに酸沈殿、硫酸アンモニウム沈殿、加熱処理した部分精製品を限外濾過やゲル濾過等により高度に精製した精製品としての利用も可能である。

【0019】

本発明の大豆発酵物又はその抽出物を有効成分として含む口腔内細菌増殖抑制組成物は、口腔内細菌生育阻害やバイオフィルム形成抑制効果等を有する組成物のことである。口腔内細菌としては、当業者に公知の任意の細菌、例えば、う蝕原因菌であれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.等が挙げられる。歯周病菌であれば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ等が挙げられる。日和見感染菌であれば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等が挙げられる。バイオフィルムの初期付着に関わる菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉ等が挙げられる。
従って、本発明は、「口腔内細菌増殖抑制」若しくは上記の少なくともいずれか一つの効果、又はそれらと実質的に同義の作用・効果を有する旨の表示が付された口腔内細菌増殖抑制組成物にも係る。

【0020】

本発明の口腔内細菌増殖抑制組成物は、任意の形態の飲食品として提供することが出来る。例えば、豆乳、コーヒー等の飲料、ビスケット、キャンディ、チョコレート等の菓子、ハンバーグ、コロッケ等の惣菜、ヨーグルト、チーズ等の乳製品、味噌、醤油等の調味料のほか、タブレット、カプセル、顆粒等の健康食品に使用できる。また、本発明の口腔内細菌増殖抑制組成物は、任意の形態の口腔内ケア用品として提供することが出来る。例えば、歯磨き粉、マウスウオッシュ等の口腔内ケア用品に使用することができる。なお、該口腔内細菌増殖抑制組成物の用途・利用方法に関しては、上記の飲食品や口腔内ケア用品の事例になんら限定されるものではない。

【0021】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

【実施例1】

【0022】

脱皮大豆１００ｇに対して、５倍量の重量の３％醸造酢水溶液を加え、室温で一晩、浸漬処理を行った。浸漬処理後、水切りすることにより、浸漬大豆１６０ｇを得た。浸漬大豆１６０ｇに水道水３２０ｇを加え、圧力鍋を使用して、１００℃にて１０分間蒸煮処理を行った。蒸煮処理後、水切りし、蒸煮大豆２００ｇを得た。調製した蒸煮大豆１００ｇに対して、リゾプス ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ（以下、「Ｒ. ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ」と略記）） ＮＢＲＣ３０８１６の胞子懸濁液を１×１０^６個の胞子数になるように添加し、十分に混合することにより種付処理を行った。これを穴開き袋に充填し、３２℃に設定した恒温槽内で、４０時間発酵処理を行った。発酵処理後、９０℃、３０分間の殺菌を行い、さらに凍結乾燥を行い、大豆発酵物粉末を得た。大豆発酵物粉末２．５ｇに対し、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記）１５ｍＬを加え、室温、１時間、振盪抽出した後に、遠心分離することで得られた上清を５０ｍＬ容量のメスフラスコに回収した。これを３回繰り返し、ＰＢＳを用いて５０ｍＬにメスアップすることで大豆発酵物抽出液である実施品１を得た。

【実施例2】

【0023】

実施例１と同様に、リゾプス ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ（以下、「Ｒ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ」と略記））ＮＢＲＣ３２００２の胞子懸濁液を使用することにより、大豆発酵物抽出液である実施品２を得た。

【実施例3】

【0024】

実施例１と同様に、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（以下、「Ｒ. ｏｒｙｚａｅ」と略記）） ＮＢＲＣ４７１６の胞子懸濁液を使用することにより、大豆発酵物抽出液である実施品３を得た。

【0025】

［比較例１］
実施例１と同様な方法で得られた蒸煮大豆を凍結乾燥することで、蒸煮大豆粉末を得た。蒸煮大豆粉末２．５ｇに対し、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記）１５ｍＬを加え、室温で１時間、振盪抽出した後に、遠心分離することで得られた上清を５０ｍＬ容量のメスフラスコに回収した。これを３回繰り返し、ＰＢＳを用いて５０ｍＬにメスアップすることで大豆抽出液である比較例１を得た。

【0026】

［比較例２～４］
市販のフリーズドライ納豆粉末又は緑茶粉末又は甘草根粉末２．５ｇに対し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１５ｍＬを加え、室温で１時間、振盪抽出した後に、遠心分離することで得られた上清を５０ｍＬ容量のメスフラスコに回収した。これを３回繰り返し、ＰＢＳを用いて５０ｍＬにメスアップすることで納豆抽出液（比較例２）、緑茶抽出液（比較例３）及び、甘草根抽出液（比較例４）を得た。

【0027】

［比較例５］
マヌカハニー（ＭＧＯ４００＋、固形分約８０％）３．１ｇをＰＢＳに溶解させ５０ｍＬにメスアップすることでマヌカハニー抽出液を得た（比較例５）。

【実施例4】

【0028】

（実施品１、実施品２、実施品３、比較品１及び比較品２のう蝕原因菌に対する抗菌活性の強さ）
１２穴プレートにブレインハートインヒュージョンブロス３．２ｍＬ、比較品１～２、又は、実施品１～３を０．０８ｍＬ、ＰＢＳ０．３２ｍＬ及び、１×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳ．ｍｕｔａｎｓ菌懸濁液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養１８時間後における培養液の菌量を比較した。菌量は濁度（吸光度６６０ｎｍ）で評価した。その結果、表1に示されるように、蒸煮大豆及び納豆と比較し、リゾプス属の大豆発酵物において強いＳ．ｍｕｔａｎｓに対する抗菌効果が認められた。

【0029】

【表1】

【実施例5】

【0030】

（抗菌スペクトル）
１２穴プレートにブレインハートインヒュージョンブロス２．８ｍＬ及び、実施品１を０．８ｍＬ及び、１×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（以下、「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」と略記）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（以下、「Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ」と略記）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（以下、「Ｐ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ」と略記）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ（以下、「Ｓ．ｍｉｔｉｓ」と略記）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（以下、「Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ」と略記）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（以下、「Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ」と略記）の菌懸濁液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養１２時間後における培養液の菌量をＡＴＰ量で比較した。ＡＴＰ量は、ＡＴＰ測定キット（キッコーマンバイオケミファ製）を使用して測定を行った。その結果、表２に示されるように、コントロールと比較し、リゾプス属の大豆発酵物において、日和見感染菌の一種であるＳ．ａｕｒｅｕｓや歯周病菌の一種であるＰ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する抗菌効果が認められた。特にバイオフィルムの初期形成の代表的な菌であるＳ．ｍｉｔｉｓやＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、敗血症や心内膜炎の原因菌の一種であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに対し、強い抗菌活性が認められた。

【0031】

【表2】

【実施例6】

【0032】

（バイオフィルム形成抑制試験）
１２穴プレートの底面にガラスプレート（１０×１０×１ｍｍ）を置き、１％スクロース添加トリプティカーゼソイブロス（表３）２．８ｍＬ及び、実施品１又は、０.０５％塩化セチルピリジニウム（以下、「ＣＰＣ」と略記）を０．８ｍＬ及び、１×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳ.ｍｕｔａｎｓ菌懸濁液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養１２時間後におけるガラスプレート上の菌量を実施例５と同様にＡＴＰ量で評価した。その結果、表４に示されるように、コントロールと比較し、リゾプス属の大豆発酵物においてＳ.ｍｕｔａｎｓ由来のバイオフィルム形成抑制が認められた。また、リゾプス属の大豆発酵物のバイオフィルム形成抑制は、市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣと同等の強さであった。

【0033】

【表3】

【0034】

【表4】

【実施例7】

【0035】

（既存のう蝕原因菌に抗菌作用のある各種食品素材及び薬剤との抗菌活性の比較）
１２穴プレートにブレインハートインヒュージョンブロス３．２ｍＬ及び、実施品１又は比較品３～５を０．４ｍＬ及び、１×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳ．ｍｕｔａｎｓ菌液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養１２時間後における培養液の菌量を実施例５と同様にＡＴＰ量で評価した。その結果、表５に示されるように、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに抗菌効果がある緑茶、甘草、マヌカハニーと比較し、リゾプス属の大豆発酵物においてＳ.ｍｕｔａｎｓへの強い抗菌効果が認められた。また、リゾプス属の大豆発酵物の抗菌効果は、市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣと同等の強さであった。

【0036】

【表5】

【実施例8】

【0037】

（各種発酵条件（温度、時間）で発酵した大豆発酵抽出液の調製）
実施例１と同様な方法で発酵温度と発酵時間を変え、発酵温度２８℃及び発酵時間２４時間の大豆発酵物の抽出液（実施品４）、発酵温度２８℃及び発酵時間４８時間の大豆発酵物の抽出液（実施品５）、発酵温度２８℃及び発酵時間７２時間の大豆発酵物の抽出液（実施品６）、発酵温度３２℃及び発酵時間２４時間の大豆発酵物の抽出液（実施品７）、発酵温度３２℃及び発酵時間４８時間の大豆発酵物の抽出液（実施品８）、発酵温度３２℃及び発酵時間７２時間の大豆発酵物の抽出液（実施品９）の各大豆発酵物の抽出液を調製した。尚、各大豆発酵物の抽出液は実施例１に従って調製した。

【実施例9】

【0038】

（各種発酵条件（温度、時間）で発酵した大豆発酵抽出液のう蝕原因菌に対する抗菌活性の強さ）
試験管にトリプティカーゼソイイーストエキストラクト（表６）ブロス３．２ｍＬ及び、比較品１、又は、ＰＢＳ、又は、実施品４～９の大豆発酵抽出液０．４ｍＬ及び、１×１０^３ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳ．ｍｕｔａｎｓ菌懸濁液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養２４時間後における培養液の菌量を実施例４と同様に濁度（吸光度６６０ｎｍ）で評価した。その結果、表７に示されるように、コントロールと比較し、いずれの発酵温度で調製されたリゾプス属の大豆発酵物においても、発酵時間の長い大豆発酵物ほどＳ.ｍｕｔａｎｓへの強い抗菌効果が認められた。

【0039】

【表6】

【0040】

【表7】

【実施例10】

【0041】

（増殖抑制効果の持続性）
試験管にトリプティカーゼソイイーストエキストラクトブロス３．２ｍＬ及び、実施品６の大豆発酵抽出液 又は、ＰＢＳを０．４ｍＬ及び、１×１０^３ＣＦＵ／ｍＬとなるよう調整したＳ．ｍｕｔａｎｓ菌懸濁液０．４ｍＬを加え、３７℃で培養した。培養液の濁度（吸光度６６０ｎｍ）を経時的に測定し、各検体の抗菌活性を評価した。その結果、表８に示されるように、コントロールと比較し、リゾプス属の大豆発酵物において１４日間、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果が認められた。

【0042】

【表8】

【実施例11】

【0043】

（毒性試験）
ラットの下顎Ｍ１頬側歯肉から採取した上皮をコラーゲナーゼタイプＩ及び、ディスパーゼＩＩを含む酵素溶液（２０％牛胎盤血清含有アルファＭＥＭに溶解）にて６０分間処理をした。酵素処理後、遠心分離にて上清を除去し、Ｔ-２５フラスコに全量播種した。Ｔ-２５フラスコに播種した細胞について、リン酸緩衝生理液（ｐＨ７.２）で２回洗浄、０.０５％トリプシンを含むＥＤＴＡ溶液にて８分間処理後、１０％牛胎盤血清含有アルファＭＥＭに懸濁、遠心分離にて上清を除去し、再び１０％牛胎盤血清含有アルファＭＥＭに懸濁を行い、細胞数をカウントした。細胞数をカウントした細胞について、アルファＭＥＭにて１０倍希釈を行い、６０ｍｍのディッシュに播種し、第１継代細胞を調製した。同様な操作を行い３回継代した第４継代細胞を調製した。調製した第４継代細胞を９６ウェルプレートに１０^３個となるよう播種し、４８時間培養後、コンフルエントな状態になったことを確認し、第４継代細胞の培養培地を実施品１の大豆発酵抽出液を２％含むアルファＭＥＭ及び、ＣＰＣを０.０５％含むアルファＭＥＭに培地交換し、第４継代細胞を３７℃、４８時間培養した。培養後、セルカウンティングキット-８を用い吸光度４５０ｎｍを測定し、各検体の細胞生残率を評価した。その結果、表９に示されるように、市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣでは、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果と共に毒性が認められたが、リゾプス属の大豆発酵物においては、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果は認められたが、毒性は認められなかった。

【0044】

【表9】

【0045】

本発明では、実施例４のように、リゾプス属の糸状菌であるＲ. ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｒ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒ. ｏｒｙｚａｅの大豆発酵物においてう蝕原因菌であるＳ．ｍｕｔａｎｓに強い抗菌作用があることが分かった。しかも実施例４、７のように既存のＳ．ｍｕｔａｎｓに抗菌作用のある各種食品素材に比べ強い抗菌効果が認められ、さらに市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣと同等の強さであることが分かった。また、実施例５では、各種口腔内細菌に対する抗菌効果を調べた結果、日和見感染菌の一種であるＳ．ａｕｒｅｕｓや歯周病菌の一種であるＰ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する抗菌効果が認められた。特にバイオフィルムの初期形成の代表的な菌であるＳ．ｍｉｔｉｓやＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、敗血症や心内膜炎の原因菌の一種であるＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに対し、強い抗菌活性が認められた。実施例６において、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ由来のバイオフィルム形成抑制効果も認められ、その効果は、市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣと同等の強さであった。このことから本発明の口腔内細菌増殖抑制組成物は、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの抗菌効果と共に、バイオフィルム形成抑制効果もあることが分かった。実施例９、１０では、リゾプス属の大豆発酵物において発酵時間の長い発酵物ほどＳ.ｍｕｔａｎｓへの強い生育阻害効果（抗菌効果）があること、更に、１４日間にわたりＳ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果が認められ抗菌活性の持続性があることが分かった。また、実施例１１では、市販のＳ.ｍｕｔａｎｓの殺菌剤である０.０５％ＣＰＣでは、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果と共に毒性が認められたが、リゾプス属の大豆発酵物においては、Ｓ.ｍｕｔａｎｓの生育阻害効果は認められたが、毒性は認められず、生体に安全な抗菌物質であることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0046】

既存のＳ．ｍｕｔａｎｓの予防方法である抗菌剤による殺菌は、抗菌剤に不感受性の菌が繁殖する菌交代現象の発生や抗菌剤に耐性のある菌の発現リスク等の問題点がある。また、既存の食品素材のＳ．ｍｕｔａｎｓに対する抗菌効果は、既存の抗菌剤と同等以上の抗菌力価を有していなかった。本発明の口腔内細菌増殖抑制組成物は、既存の抗菌剤と同等以上の抗菌力価を有し、かつ、生体に安全な抗菌物質でありながら、口腔内細菌の増殖抑制とバイオフィルム形成抑制効果を提供できる。