特許 7234540 シュートの培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-02-28

(45)【発行日】2023-03-08

(54)【発明の名称】シュートの培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/04 20060101AFI20230301BHJP

   A01H 4/00 20060101ALI20230301BHJP

【ＦＩ】

C12N5/04

A01H4/00

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2018164657

(22)【出願日】2018-09-03

(65)【公開番号】P2020036545

(43)【公開日】2020-03-12

【審査請求日】2021-07-26

(73)【特許権者】

【識別番号】000183233

【氏名又は名称】住友ゴム工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ

(72)【発明者】

【氏名】岡田 明里

(72)【発明者】

【氏名】谷 千春

【審査官】原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６１－１７７９２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０００－１６６４１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０１－２６９４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１４０３１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１９７５７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ０１Ｈ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養し、シュートを培養する培地が、以下の（１）～（６）の条件のうち少なくとも（２）、（４）、（６）を満たし、培養条件が、以下の（Ａ）、（Ｂ）の条件のうち少なくとも１つを満たす、Ｈｅｖｅａ属に属する植物のシュートの培養方法。
（１）炭素源の濃度が３．０～９．０質量％
（２）ベンジルアデニンの濃度が３．０～８．０ｍｇ／Ｌ
（３）活性炭の濃度が０．０１～０．１質量％
（４）硝酸銀の濃度が０．５～３．０ｍｇ／Ｌ
（５）固形化剤の濃度が０．１～２．０質量％
（６）ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地に植物生長ホルモンを加えた培地である
（Ａ）培養温度が２５～３５℃
（Ｂ）光条件が５～２０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１４～１６時間の明時間

【請求項2】

スクロースを３．０～９．０質量％含む培地でシュートを培養する請求項１記載のシュートの培養方法。

【請求項3】

前記合計値の変化率が０．８２～１．１５、前記シュートの伸長量が１．２ｍｍ以上となるようにシュートを培養する請求項１又は２記載のシュートの培養方法。

【請求項4】

前記シュートがパラゴムノキのシュートである請求項１～３のいずれかに記載のシュートの培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シュートの培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。

【0003】

現状、工業用天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。またゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、採取出来る季節が限られる場合がある。また、成木から天然ゴムを採取できる期間は２０～３０年に限られる。

【0004】

今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれており、天然ゴム資源の枯渇が懸念されていることから、安定的な天然ゴムの供給源が望まれている。

【0005】

このような状況下において、パラゴムノキによる天然ゴムの増産を図る動きが見られる。パラゴムノキは、播種により実生苗を育成させ成長させた後台木とし、クローン苗から得た芽を台木に接ぎ木することで苗を増殖させる。

【0006】

また従来のクローン苗から得たクローン増殖技術である接ぎ芽は、元の木がもつ病気を一緒に継いでしまう可能性があり、罹病した苗を増殖させる可能性がある。

【0007】

更に接ぎ穂は、台木の影響を受ける場合があるため、真のクローン苗とはならない。

【0008】

一方、組織培養を利用したクローン苗を増殖させる方法としてマイクロプロパゲーションがある。例えば、特許文献１では、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させ、このシュートを用いてゴムノキのクローン苗を大量に取得している。また、シュートを用いることで真のクローン苗を作出することもできる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】特開２０１６－１４０３１８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らが鋭意検討した結果、シュートの培養を行った際、培養期間が長くなるとシュートの生育が停滞し、枯死するという問題が生じることが判明した。

【0011】

本発明は、前記課題を解決し、シュートの長期培養を可能とするシュートの培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、鋭意検討した結果、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することにより、シュートの長期培養が可能となることを見出し、本発明を完成した。

【0013】

すなわち、本発明は、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養するシュートの培養方法に関する。

【0014】

上記シュートの培養方法においては、スクロースを３．０～９．０質量％含む培地でシュートを培養することが好ましい。

【0015】

上記シュートの培養方法においては、上記合計値の変化率が０．８２～１．１５、上記シュートの伸長量が１．２ｍｍ以上となるようにシュートを培養することが好ましい。

【0016】

上記シュートの培養方法においては、上記シュートが木本植物のシュートであることが好ましい。

【0017】

上記シュートの培養方法において、上記シュートがＨｅｖｅａ属に属する植物のシュートであることが好ましい。

【0018】

上記シュートの培養方法において、上記シュートがパラゴムノキのシュートであることが好ましい。

【発明の効果】

【0019】

本発明のシュートの培養方法は、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養するので、シュートの長期培養が可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明のシュートの培養方法は、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養する。これにより、シュートの長期培養が可能となるため、例えば、材料の調達が難しい場合や長期間培養したシュートを必要とする実験等において有効に活用することができる。また、植物の需要は季節により変動するものであるが、シュートの長期培養が可能となるため、需要が高まるまでシュートを、生育状態が良好なまま保持しておくことも可能となり、生産計画の自由度を高めることができる。更には、長期間良好な生育状態を保つことで産業上の利便性向上を図ることができる。また、生育状態を揃えやすく、植物を使用する工程を安定した状態で実施できる。

【0021】

上述の通り、本発明者らが鋭意検討した結果、シュートの培養を行った際、培養期間が長くなるとシュートの生育が停滞し、枯死するという問題が生じることが判明した。
生育が停滞し、枯死する理由として、生育に必要な栄養を十分に吸収できなくなることなどが考えられるが、生育停滞や枯死は組織培養においては、避けるべき状態と言える。つまり、シュートの生育を停滞させず、生育状態が良好なままに保持することは、クローンの増殖や組織の利用においても重要な点となる。
一方で、生育状態の判断は、目視での生育状態や大きさで判断されることが多く、特に目視での判断においては、個人差による判断の差が生じやすい方法と言える。生育停滞を回避する方法としては、通常は組織培養を長期において行わない手法をとる必要あるが、材料に限りがある場合や組織利用上、長期培養が必要になる場合がある。

【0022】

そこで、本発明者らは、シュートの生育状態を保持できる培地を開発するとともに、生育状態が保持されている、または生育していることを判断できる指標の作成を試みた。
まず、シュートが生育停滞や枯死していないことを判断するために、色の表見の一つであるＲＧＢの合計値に着目し、一定の生育期間における合計値の変化率により、生育が維持されているか否かを判断する指標とした。通常、生育が良好であるシュートにおいては、ＲＧＢの合計値が２５０～４５０程度である一方、枯死や停滞が進むと合計値が２５０未満や４５０超に変化する。この変化に着目し、合計値の変化率が大きいと枯死や生育停滞が生じている可能性を示唆し、合計値の変化率が小さいと生育が維持されているもしくは活性化している可能性があることを示唆するとの仮説に想到し、実験によりこの仮設が正しいことが判明した。

【0023】

更に、より生育が活性化しているシュートを選別するために、一定の生育期間におけるシュートの伸長量を、シュートの生育の活性化度を判断する指標とした。

【0024】

次に、一定の生育期間をどの培養期間とすべきかを検討した。鋭意検討した結果、長期培養を視野に入れた生育の状態を判断するためには、初期の生育不良の影響を除くことができ、生育が安定してくる培養開始から３週間目のシュートの状態と、培養が比較的長期の状態へ移行していく９週間目のシュートの状態とを比較することが好ましいことが判明した。

【0025】

そして、上記知見を実験により裏付けることにより、培養期間３週間目の状態と９週間目の状態とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養すると、シュートの長期培養が可能となることが判明した。これは、３週間目のシュートの状態と、９週間目のシュートの状態とを比較することにより、初期の生育不良の影響を除外しつつ比較的長期の培養状態を評価でき、３週間目と９週間目との状態を対比した結果、合計値の変化率が０．８０～１．２０であれば、枯死や生育停滞が生じておらず、生育が維持されているもしくは活性化しており、３週間目と９週間目との状態を対比した結果、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上であれば、シュートの生育が活性化しているため、長期培養が可能となるものと推測される。

【0026】

本発明のシュートの培養方法は、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養する。

【0027】

本明細書においてシュートとは、頂芽、腋芽、不定芽の他、多芽体又は苗条原基より分化してきた芽、及びこれらの芽が伸長した状態のものを意味する。

【0028】

本発明の方法が適用できる植物（シュートの由来植物）は、特に限定されないが、木本植物であることが好ましい。
上記木本植物としては、特に制限されず、落葉樹、常緑樹の広い範囲の種類及び品種の木本植物を挙げることができるが、特に、ゴムを資源として採取できるゴムノキであることが好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）がより好ましい。更に好ましくは、Ｈｅｖｅａ属に属する植物等のトウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）に属する植物であり、特に好ましくは、Ｈｅｖｅａ属に属する植物である。なかでも、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が最も好ましい。

【0029】

上記シュートを誘導するための材料としては、植物の葉柄、葉片、体細胞胚の胚軸、節、腋芽、頂芽等の植物の組織が挙げられる。なかでも、シュートを安定的に誘導することが可能であることから、節、腋芽、又は頂芽を含む組織が好ましい。具体的には、成木や幼木、苗木、クローン苗、又は試験管内で実生苗から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の上記組織などが挙げられる。

【0030】

成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の上記組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後、表面を殺菌又は滅菌することで使用することができるが、試験管内で実生苗から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の上記組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後に使用することが可能である。

【0031】

成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の上記組織を用いる場合、後述する誘導培地で培養する前にまず、組織の表面を洗浄する。例えば、磨き粉で洗浄したり、柔らかいスポンジで洗浄したりしても良いが、流水で洗浄するのが好ましい。当該洗浄用の水は、界面活性剤を約０．１質量％含むものであってもよい。

【0032】

次に、組織を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。なお、殺菌又は滅菌処理の後、更に滅菌水で洗浄してもよい。

【0033】

上記洗浄、殺菌又は滅菌処理を行う具体例として例えば以下の手順が挙げられる。流水で組織の表面を洗浄した後、エタノールで洗浄。次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液で必要に応じて撹拌しながら滅菌。その後、滅菌水を用いて洗浄。

【0034】

シュートの誘導方法は特に限定されないが、上記組織などからシュートを誘導する誘導工程の一例について説明する。

【0035】

（誘導工程）
誘導工程では、上記組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成させる。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地に上記組織を差し込んで培養することでシュートを誘導しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
また、殺菌又は滅菌処理を行った組織を用いる場合には、殺菌剤、滅菌剤の影響を除くため切り口を切除して培養に用いるのが好ましい。

【0036】

植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、サイトカイニン系植物ホルモンを用いることが好ましい。

【0037】

オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、１－ナフタレン酢酸、インドール－３－酪酸、インドール－３－酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２－メチル－４－クロロフェノキシ酢酸、４－フルオロフェノキシ酢酸、２－メトキシ－３，６－ジクロロ安息香酸、２－フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、１－ナフタレン酢酸、インドール－３－酪酸が好ましく、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、１－ナフタレン酢酸がより好ましい。

【0038】

サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンテニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリボシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。

【0039】

炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース等の糖類が挙げられる。なかでも、スクロースが好ましい。

【0040】

誘導培地は、上記組織への成長阻害物質の蓄積を防止するために、更に活性炭を含むことが好ましい。また、シュートの形成を促進するために、更に硝酸銀を含むことが好ましい。更には、シュートの形成を促進するために、ココナッツウォーター（ココナッツミルク）を含んでもよい。

【0041】

誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ Ｒ， Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ １４ １－２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、ＭＢ培地（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍ５（ＴｒｅｅｓＩＩ）ｐ２２２－２４５に記載）、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地、ＭＢ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地、その組成に変更を加えたＭＳ改変培地、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。

【0042】

誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。

【0043】

好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。

【0044】

誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上、更に好ましくは３．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０．０質量％以下、より好ましくは９．０質量％以下、更に好ましくは５．０質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。

【0045】

誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。

【0046】

誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上、最も好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは８．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０～６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８～１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。

【0047】

誘導培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

【0048】

誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。

【0049】

誘導培地のｐＨは、４．０～１０．０が好ましく、５．０～６．５がより好ましく、５．５～６．０が更に好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。

【0050】

誘導工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０～４０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましく、２５～３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１４～１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１～１０週間培養することが好ましく、３～５週間がより好ましい。

【0051】

固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。

【0052】

上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン、又はカイネチン）で、その濃度が３．０～８．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５～３５℃であることが特に好ましい。

【0053】

以上のように、上記組織を上記誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成することが可能である。

【0054】

（シュート培養工程）
本発明では、上記誘導工程等により得られたシュートを培養する。なお、上記誘導工程等により得られたシュートを培養する工程を以下ではシュート培養工程ともいう。

【0055】

シュート培養工程では、誘導工程等により形成させたシュートを、シュート培養培地（好ましくは植物生長ホルモン及び炭素源を含むシュート培養培地）で培養することにより、シュートを培養する。具体的には、誘導工程等により形成させたシュート（例えば、２ｃｍ程度）をシュート培養培地に差し込み移植し、培養することで、シュートが伸長し、また新たな芽を取得することも可能となる。
なお、シュート培養培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することでシュートが伸長しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、シュート培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
ここで、本明細書において、シュート培養工程で用いる「誘導工程等により形成させたシュート」とは、シュートを誘導するための材料として用いられた腋芽等の組織から切断されたシュートの切片を意味する。
また、シュート培養工程で用いるシュートとしては特に限定されず、どのような方法により形成されたシュートであっても用いることができる。

【0056】

シュート培養工程では、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率（培養期間３週間目におけるＲＧＢの合計値と９週間目におけるＲＧＢの合計値の変化率）が０．８０～１．２０となるようにシュートを培養する。合計値の変化率の下限は好ましくは０．８２、より好ましくは０．８５であり、合計値の変化率の上限は好ましくは１．１５、より好ましくは１．１０である。
合計値の変化率が上記範囲内であると、枯死や生育停滞が生じておらず、生育が維持されているもしくは活性化できていることを意味する。
ここで、合計値の変化率が１．２０とは、培養期間３週間目に比べて、培養期間９週間目において、合計値が１．２０倍となっていることを示す。
なお、本明細書において、ＲＧＢの合計値は、Ｒ値、Ｇ値、Ｂ値の合計値（和）を意味し、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定される。

【0057】

培養期間３週間目、９週間目におけるそれぞれのシュートのＲＧＢの合計値は、好ましくは２００以上、より好ましくは２５０以上、更に好ましくは２８０以上であり、好ましくは５００以下、より好ましくは４５０以下、更に好ましくは４２０以下である。これにより、効果がより好適に得られる。

【0058】

シュート培養工程では、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートの伸長量（培養期間３週間目～９週間目におけるシュートの伸長量）が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養する。シュートの伸長量は好ましくは１．２ｍｍ以上、より好ましくは１．５ｍｍ以上、更に好ましくは２．０ｍｍ以上であり、上限は特に限定されない。シュートの伸長量が上記範囲内であると、シュートの生育が活性化できていることを意味する。
なお、本明細書において、シュートの伸長量は、後述の実施例に記載の方法により測定される。

【0059】

なお、本明細書において、培養期間については、シュート培養培地にシュート（シュートの切片）を移植したときを培養開始（０時間）とし、培養期間３週間目は、培養開始後５０４時間、培養期間９週間目は、培養開始後１５１２時間を意味し、新たなシュート培養培地に移植した（植え替えた）際は培養期間をリセットせずに、培養期間を累積加算することとする。

【0060】

シュート培養培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むことが好ましい。該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、サイトカイニン系植物ホルモンを使用することが好ましい。

【0061】

オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができる。

【0062】

サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。

【0063】

シュート培養培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでも、スクロースが好ましい。

【0064】

シュート培養培地は、上記誘導培地同様、更に、活性炭、硝酸銀を含むことが好ましい。

【0065】

シュート培養培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えた同様のものを用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地、ＭＢ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地、その組成に変更を加えたＭＳ改変培地、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましく、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものが更に好ましい。

【0066】

シュート培養培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。

【0067】

好適なシュート培養培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。

【0068】

シュート培養培地中の炭素源（好ましくはスクロース）の濃度は、好ましくは３．０質量％以上、より好ましくは５．０質量％以上である。該炭素源（好ましくはスクロース）の濃度は、好ましくは９．０質量％以下、より好ましくは７．０質量％以下である。

【0069】

シュート培養培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０８ｍｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０ｍｇ／Ｌである。

【0070】

シュート培養培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、シュート培養培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは３．５ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは４．０ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは８．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。

【0071】

シュート培養培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

【0072】

シュート培養培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。

【0073】

シュート培養培地のｐＨは、４．０～１０．０が好ましく、５．０～６．５がより好ましく、５．５～６．０が更に好ましい。

【0074】

シュート培養工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０～４０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましく、２５～３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、５～２０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１４～１６時間の明時間という条件などが挙げられる。

【0075】

固体培地の場合、シュート培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。

【0076】

上述の条件のなかでも、シュート培養培地が、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地であることが好ましく、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地に植物生長ホルモンを加えた培地であることがより好ましく、ＭＢ培地又はその組成に変更を加えたＭＢ改変培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加えた培地であることが更に好ましい。このような培地でシュートを培養することにより、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することが可能となる。
更に、シュート培養培地中の、（１）炭素源（好ましくはスクロース）の濃度が３．０～９．０質量％、（２）サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が３．０～８．０ｍｇ／Ｌ、（３）活性炭の濃度が０．０１～０．１質量％、（４）硝酸銀の濃度が０．５～３．０ｍｇ／Ｌ、（５）固形化剤の濃度が０．１～２．０質量％、のいずれかの条件を満たすことが好ましく、（１）～（５）の全ての条件を満たすことがより好ましい。このような培地でシュートを培養することにより、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することが可能となる。
また、培養条件としては、（Ａ）培養温度が２５～３５℃、（Ｂ）光条件が５～２０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１４～１６時間の明時間という条件、のいずれかの条件を満たすことが好ましく、（Ａ）～（Ｂ）の全ての条件を満たすことがより好ましい。このような培養条件でシュートを培養することにより、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することが可能となる。
また、誘導培地で培養した期間が３ヶ月未満のシュートを用いることも好ましい。

【0077】

本発明では、培養期間３週間目の状態と９週間目の状態とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養するため、シュートの長期培養が可能となる。培養期間としては、特に限定されないが、好ましくは９週以上、より好ましくは１０週以上、更に好ましくは１２週以上、特に好ましくは１５週以上である。
本発明では、シュートの長期培養が可能となるため、培養しているシュートを、例えば３週間毎に新しいシュート培養培地へ移植することで、培養を継続すればよい。

【0078】

以上のように、誘導工程等により形成させたシュート（シュートの切片）を、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるように培養することにより、シュートの長期培養が可能となり、シュートを伸長させることができる。また、このシュート培養工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。このシュート培養工程により伸長させたシュートは、安定して成長したシュートであるため、好適に発根工程に供することが可能である。

【0079】

（発根工程）
発根工程では、シュート培養工程により伸長させたシュートを発根誘導培地で培養することにより発根させる。
発根方法は特に限定されないが、発根工程の一例について説明する。

【0080】

発根工程では、例えば、シュート培養工程により伸長させたシュートを発根誘導培地で培養して発根させる。なお、発根誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することで発根させやすくなるため、固体培養が好ましい。また、発根誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。

【0081】

発根誘導培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むものであるが、該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、オーキシン系植物ホルモンを用いることが好ましい。

【0082】

オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、１－ナフタレン酢酸、インドール－３－酪酸、インドール－３－酢酸が好ましく、インドール－３－酪酸がより好ましい。

【0083】

サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましい。

【0084】

発根誘導培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでもスクロースが好ましい。

【0085】

発根誘導培地は、上記誘導培地同様、更に、活性炭、硝酸銀を含むことが好ましい。

【0086】

発根誘導培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えた同様のものを用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。

【0087】

発根誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。

【0088】

好適な発根誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。

【0089】

発根誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０．０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。

【0090】

発根誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを加える場合の、発根誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下である。

【0091】

発根誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。

【0092】

発根誘導培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

【0093】

発根誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。

【0094】

発根誘導培地のｐＨは、４．０～１０．０が好ましく、５．０～６．５がより好ましく、５．５～６．０が更に好ましい。

【0095】

発根工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０～４０℃が好ましく、２０～４０℃がより好ましく、２５～３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１４～１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１～１０週間培養することが好ましく、４～８週間がより好ましい。

【0096】

固体培地の場合、発根誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。

【0097】

上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン（特に、インドール－３－酪酸）で、その濃度が３．０～６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５～３５℃であることが特に好ましい。

【0098】

以上のように、シュートを上記発根誘導培地で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（本明細書において、発根したシュートを「幼植物」とも称する。）が得られ、完全な植物体であるクローン苗が形成される。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、馴化させてから土壌に移植してもよい。馴化させる方法は特に限定されない。
なお、上記形成されたクローン苗を用いて、誘導工程、シュート培養工程、発根工程を繰り返し実施することにより、優良品種のクローン苗を大量に安定的に生産することも可能である。

【0099】

本発明では、また、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することにより、シュートの長期培養が可能となる知見を活かして、培養培地や培養条件の評価を行うことができる。
具体的には、シュートの培養を行い、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際の、シュートのＲＧＢの合計値の変化率、シュートの伸長量に基づいて、培養培地や培養条件がシュートの長期培養に適しているか否かを判断することができる。
このように、本発明は、シュートの培養を行い、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際の、シュートのＲＧＢの合計値の変化率、シュートの伸長量に基づいて、培養培地を評価する方法、シュートの培養を行い、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際の、シュートのＲＧＢの合計値の変化率、シュートの伸長量に基づいて、培養条件を評価する方法も提供する。

【実施例】

【0100】

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【0101】

以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＫＩ：カイネチン
硝酸銀：メルク社製の硝酸銀
ゲル化剤：フルカ（ＦＬＵＫＡ）社製のアガー（Ａｇａｒ）（パウダー）
消毒剤：ユナイテッド ドラッグ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｄｒｕｇ）社製、ピラッド－ポビドン（Ｐｙｒａｄ－Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）（商品名）（ポビドンヨード溶液）

【0102】

＜誘導工程＞
パラゴムノキの苗木から腋芽を含む組織を採取した。
次に、苗木から採取した腋芽を含む組織を流水で洗浄し、更に７０質量％エタノールで洗浄した後、約５～１０体積％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄した。

【0103】

次に、滅菌した組織を誘導培地（固体培地）に差し込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）に、ベンジルアデニン５．０ｍｇ／Ｌ、硝酸銀１．０ｍｇ／Ｌ、スクロース３．０質量％、活性炭０．０５質量％を添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、ゲル化剤を０．２７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。

【0104】

パラゴムノキの上記組織を誘導培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で培養し、シュートを誘導した。なお、４週間ごとに同じ組成の誘導培地に移植する植え継ぎを行った。

【0105】

（実施例、比較例）
＜シュート培養工程＞
誘導工程により誘導されたシュートを２０ｍｍ程度に切り出し、全ての葉を切り落としてシュートの切片を調製した。そして、調製したシュートの切片をシュート培養培地で培養した（シュート培養工程）。シュート培養培地は、下記表１に記載の基本培地に、下記表１に記載の所定濃度のスクロース等を添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、ゲル化剤を０．２７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
なお、表１において、植物齢とは、誘導培地で培養した期間を意味する。

【0106】

調製したシュートの切片をシュート培養培地（固体培地）に差し込み、表１に記載の培養温度、１２．５μｍｏｌ／ｍ^２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で１５週間培養した（ｎ＝５）。なお、３週間ごとに同じ組成のシュート培養培地に移植する植え継ぎを行った。そして、培養中１週間（１６８時間）経過毎に観察（シュートの長さの測定）、写真撮影（ＲＧＢの合計値の評価）を行った。

【0107】

〔シュートの伸長量の評価〕
培養期間３週間目（培養開始後５０４時間）と９週間目（培養開始後１５１２時間）において測定したシュートの長さから、培養期間３週間目～９週間目におけるシュートの伸長量を算出した。

【0108】

〔ＲＧＢの合計値の評価〕
培養期間３週間目（培養開始後５０４時間）と９週間目（培養開始後１５１２時間）において撮影した写真から、培養期間３週間目のシュートのＲＧＢの合計値、培養期間９週間目のシュートのＲＧＢの合計値を算出し、培養期間３週間目と９週間目におけるＲＧＢの合計値の変化率を算出した。
写真からＲＧＢの合計値を測定する方法は、撮影した写真をＲＧＢ値を測定可能なソフトウエアで開き、シュートにあたる部分のＲＧＢ値を測定した。
なお、シュートのうち、生長点付近をＲＧＢの合計値を測定する箇所とし、ＲＧＢの合計値は生長点付近の座標の平均値とした。

【0109】

〔シュートの長期培養の可否〕
シュートを１５週間培養した後、（１）茎の伸長、（２）脇芽の伸長、（３）葉の展開、について目視で生育状態を判断した。
○、△の場合に、シュートの長期培養が可能と判断した。
○：（１）～（３）の少なくとも１つが観察
△：生存しているが増殖が見られない
×：枯れ、葉の先端の白変又は茶変が観察

【0110】

実施例、比較例における、培地の配合、培養温度、及び評価結果を表１に示す。

【0111】

【表1】

【0112】

表１より、培養期間３週間目と９週間目とを対比した際に、シュートのＲＧＢの合計値の変化率が０．８０～１．２０、シュートの伸長量が１．０ｍｍ以上となるようにシュートを培養することにより、シュートの長期培養が可能となることが分かった。