ホーム > 特許ランキング > Ｓ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃ ＮＶ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ エス−バイオメディック・ナームローゼ・フェンノートシャップの特許一覧
特許7235654細菌株の複合混合物を用いた皮膚マイクロバイオームの組成を変化させる方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-28
(45)【発行日】2023-03-08
(54)【発明の名称】細菌株の複合混合物を用いた皮膚マイクロバイオームの組成を変化させる方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20230301BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20230301BHJP
A61P 17/08 20060101ALI20230301BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230301BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20230301BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230301BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230301BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230301BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20230301BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 A
A61P17/10
A61P17/08
A61Q19/00
A61K8/99
A61K9/06
A61K9/08
A61K47/42
A61K47/38
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2019521785
(86)(22)【出願日】2017-10-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-12-12
(86)【国際出願番号】 IB2017001481
(87)【国際公開番号】W WO2018073651
(87)【国際公開日】2018-04-26
【審査請求日】2020-10-14
(31)【優先権主張番号】62/536,761
(32)【優先日】2017-07-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/410,329
(32)【優先日】2016-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519142398
【氏名又は名称】エス－バイオメディック・ナームローゼ・フェンノートシャップ
【氏名又は名称原語表記】Ｓ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃ ＮＶ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ベルンハルト・ペーツォルト
(72)【発明者】
【氏名】マルク・グエル
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１７２１９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Plos One, 2014, Vol.9 No.8, Article.e104199(p.1-8)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００
Ａ６１Ｐ １７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２以上の異なる生存アクネ菌(P. acnes)細菌株を含む、対象における皮膚の外見を改善するための組成物であって、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、前記組成物が、前記対象の皮膚に投与される、組成物。
【請求項2】
２以上の異なる生存アクネ菌(P. acnes)細菌株を含む、対象における健全な皮膚を維持するための組成物であって、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、前記組成物が、前記対象の皮膚に投与される、組成物。
【請求項3】
２以上の異なる生存アクネ菌(P. acnes)細菌株を含む、ざ瘡、および脂性肌から成る群から選択される、対象における状態を処置または予防するための組成物であって、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、前記組成物が、前記対象の皮膚に投与される、組成物。
【請求項4】
－担体；－緩衝剤；
－増粘剤；および／または
－ペプトン、
を、さらに含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
増粘剤がヒドロキシエチルセルロース、デンプン、ゴム、カオリン、水和ケイ酸アルミニウム、フュームドシリカ、カルボキシビニルポリマー、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチレングリコールモノステアレート、またはアルギン酸ナトリウムを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
ペプトンがカゼイン由来のトリプシン消化ペプトンである、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項7】
ヒドロキシエチルセルロースがＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項8】
増粘剤の濃度が約２．５％など約１％～５％である、および／またはペプトンの濃度が約０.２５％など約０.０５％～１％である、請求項４－７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
１ｍｌあたり約１０４～１０９コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株など、１ｍｌあたり少なくとも１０４コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、または粉末の形態である、および／または前記組成物が２成分の分配システムの部分である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
－アクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株；－アクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株；および／または
Ｄ１、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ４、Ｋ６、Ｋ９およびＬ１ ＳＬＳＴ型株から成る群から選択される付加的アクネ菌細菌株、
をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
－アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株が組成物中にほぼ同等の濃度で存在する；－アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株が他の生存アクネ菌細菌株より高い濃度で存在する；
－アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株が組成物中にアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株より低い濃度で存在する；
－組成物がアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、場合により、各菌株の相対濃度がそれぞれ約５５％、約３０％、約１０％および約５％である；
－組成物がリボタイプ６(ＲＴ６)アクネ菌株を含まない、および／またはアクネ菌(P. acnes)のファイロタイプＩＩＩ株を含まない；および／または
－組成物が室温で少なくとも３か月安定である、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株が前記組成物に唯一含まれるアクネ菌である、請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
対象における皮膚の外見を改善する方法における化粧品としての、請求項１、４－１３のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記使用が前記対象の皮膚への請求項１、４－１３のいずれか一項に記載の組成物の投与を含む、使用。
【請求項15】
対象がヒト対象である、請求項１４に記載の使用または請求項１－１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
対象が殺菌剤または抗生物質の処置のような標準的なざ瘡処置もまた受けるか、または以前に受けていたものである、請求項１－１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
２以上の異なる凍結乾燥させた生存アクネ菌(P. acnes)細菌株を収容した容器を含む、対象における皮膚の外見を改善するための、対象における健全な皮膚を維持するための、またはざ瘡、および脂性肌から成る群から選択される、対象における状態を処置または予防するためのキットであって、ここで、前記凍結乾燥させた生存細菌株がアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、前記キットが、前記対象の皮膚に投与される、キット。
【請求項18】
殺菌剤または抗生物質をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本願は合衆国法典第３５章、第１１９条(ｅ)のもと、"METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS"と題された、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／４１０,３２９号、および"METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS"と題された、２０１７年７月２５日に出願された米国仮出願番号第６２／５３６,７６１号の利益を主張するものであり、その全体を参照することにより各々の全体の開示を本明細書に包含させる。
本願は合衆国法典第３５章、第１１９条(ｅ)のもと、"METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS"と題された、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／４１０,３２９号、および"METHODS AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE COMPOSITION OF THE SKIN MICROBIOME USING COMPLEX MIXTURES OF BACTERIAL STRAINS"と題された、２０１７年７月２５日に出願された米国仮出願番号第６２／５３６,７６１号の利益を主張するものであり、その全体を参照することにより各々の全体の開示を本明細書に包含させる。
【0002】
技術分野
本発明は皮膚マイクロバイオームを修飾するための方法および組成物に関する。
本発明は皮膚マイクロバイオームを修飾するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
人体は極めて複雑かつ豊富な微生物群集の宿主である。これらの微生物は一般に無害であり、ビタミンを産生する、食物の消化に協力する、または免疫系を刺激することにより、健全な状態に寄与する。ヒト微生物叢は主に、皮膚の表面および深層、唾液および口腔粘膜、結膜ならびに消化管に生息する。
【0004】
ヒト微生物叢は、初めに腸内で、ヒトの健康および疾患における基本的な役割を有することが示された。皮膚は膨大な数の微生物によりコロニー形成され、その多くは有益または無害である。しかしながら、皮膚マイクロバイオームは皮膚の疾患状態において特定の組成を有し、これは健全な皮膚と比較して異なる。尋常性ざ瘡のような疾患は、マイクロバイオームの強力な変化と関連する。
【発明の概要】
【0005】
本発明の態様は２以上の異なる生存アクネ菌(P. acnes)細菌株を含む皮膚への局所投与のための組成物に関し、ここで組成物はアクネ菌単一遺伝子座配列タイピング(ＳＬＳＴ)Ｃ３型株および／またはアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、そして、組成物はペプトンをさらに含む。
【0006】
いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株をさらに含む。いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株をさらに含む。
【0007】
いくつかの実施態様において、ペプトンの濃度は約０.０５％～１％である。いくつかの実施態様において、ペプトンの濃度は約０.２５％である。いくつかの実施態様において、ペプトンはカゼイン由来のトリプシン消化ペプトンである。
【0008】
いくつかの実施態様において、組成物は増粘剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、増粘剤はヒドロキシエチルセルロースを含む。いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースはＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)を含む。いくつかの実施態様において、増粘剤の濃度は約１％～５％である。いくつかの実施態様において、ゲル化剤の濃度は約２.５％である。
【0009】
いくつかの実施態様において、各生存アクネ菌細菌株の濃度は少なくとも組成物の５％である。いくつかの実施態様において、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株は組成物とほぼ同等の濃度で存在する。いくつかの実施態様において、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株は他の生存アクネ菌細菌株より高い濃度で存在する。
【0010】
いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、ここで場合により各菌株の相対濃度はそれぞれ約５５％、約３０％、約１０％および約５％である。
【0011】
いくつかの実施態様において、組成物は少なくとも１ミリリットルあたり１０４コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株を含む。いくつかの実施態様において、組成物は約１ミリリットルあたり１０４～１０９コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株を含む。
【0012】
いくつかの実施態様において、組成物はゲル剤、クリーム剤、軟膏剤またはローション剤の形態である。
【0013】
いくつかの実施態様において、組成物はＤ１、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ４、Ｋ６、Ｋ９およびＬ１ ＳＬＳＴ型株から成る群から選択されるさらなるアクネ菌細菌株をさらに含む。
【0014】
いくつかの実施態様において、本発明は対象に組成物を投与することを含む方法である。いくつかの実施態様において、対象はヒト対象である。いくつかの実施態様において、方法は皮膚の外見を改善することおよび／または健全な皮膚を維持することを含む。いくつかの実施態様において、方法はざ瘡、脂性肌、進行性黄斑メラニン減少症、ふけ症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および酒さから成る群から選択される状態を処置または予防することを含む。
【0015】
いくつかの実施態様において、組成物は、対象における皮膚の外見の改善および／または健全な皮膚の維持における使用のためのものである。いくつかの実施態様において、組成物は、対象におけるざ瘡、脂性肌、進行性黄斑メラニン減少症、ふけ症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および酒さから成る群から選択される状態の処置または予防における使用のためのものである。いくつかの実施態様において、対象はヒト対象である。
【0016】
本発明の態様は、対象における皮膚の外見を改善するおよび／または健全な皮膚を維持するための組成物の使用に関し、ここで組成物は２以上の異なる生存アクネ菌細菌株を含み、ここで組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株および／またはアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、そして組成物はペプトンをさらに含む。
【0017】
本発明のさらなる態様は、ざ瘡、脂性肌、進行性黄斑メラニン減少症、ふけ症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および酒さから成る群から選択される状態を処置または予防するための組成物の使用に関し、ここで組成物は２以上の異なる生存アクネ菌細菌株を含み、ここで組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株および／またはアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、そして組成物はペプトンをさらに含む。
【0018】
いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株をさらに含む。いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株をさらに含む。いくつかの実施態様において、ペプトンの濃度は約０.０５％～１％である。いくつかの実施態様において、ペプトンの濃度は約０.２５％である。いくつかの実施態様において、ペプトンはカゼイン由来のトリプシン消化ペプトンである。いくつかの実施態様において、組成物は増粘剤をさらに含む。いくつかの実施態様において、増粘剤はヒドロキシエチルセルロースを含む。いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースはＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)を含む。いくつかの実施態様において、増粘剤の濃度は約１％～５％である。いくつかの実施態様において、ゲル化剤の濃度は約２.５％である。
【0019】
いくつかの実施態様において、各生存アクネ菌細菌株の濃度は少なくとも組成物の５％である。いくつかの実施態様において、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株は、組成物中でほぼ同等の濃度である。いくつかの実施態様において、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株は、他の生存アクネ菌細菌株より高い濃度で存在する。いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型株、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型株、およびアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株を含み、ここで各菌株の相対濃度はそれぞれ、約５５％、約３０％、約１０％および約５％である。いくつかの実施態様において、組成物は少なくとも１ミリリットルあたり１０４コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株を含む。いくつかの実施態様において、組成物は約１ミリリットルあたり１０４～１０９コロニー形成単位(ＣＦＵ／ｍｌ)の各生存アクネ菌細菌株を含む。いくつかの実施態様において、組成物はゲル剤、クリーム剤、軟膏剤またはローション剤の形態である。
【0020】
いくつかの実施態様において、組成物はＤ１、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ４、Ｋ６、Ｋ９およびＬ１ ＳＬＳＴ型株から成る群から選択される付加的アクネ菌細菌株をさらに含む。
【0021】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物はリボタイプ６(ＲＴ６)アクネ菌株を含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物はファイロタイプＩＩＩアクネ菌株を含まない。本明細書に記載のいくつかの方法において、組成物はリボタイプ６(ＲＴ６)アクネ菌株を含まない。本明細書に記載のいくつかの方法において、組成物はファイロタイプＩＩＩアクネ菌株を含まない。本明細書に記載のいくつかの使用の実施態様において、組成物はリボタイプ６(ＲＴ６)アクネ菌株を含まない。本明細書に記載のいくつかの使用の実施態様において、組成物はファイロタイプＩＩＩアクネ菌株を含まない。
【0022】
本発明の各々の限定は本発明の多様な実施態様を包含し得る。従って、任意の１つの要素または要素の組合せを含む本発明の各々の限定は、本発明の各々の態様に包含され得ると考えられる。本発明は、その適用を以下の記載において説明されるまたは図面において示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の実施態様が可能であり、多様な方法で実施および実行できる。
【0023】
図面の簡単な説明
添付の図面は正確な比率であることを意図しない。図面において、いくつかの図において示される同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表される。明確性を目的として、全ての図面において全ての構成要素に符号付けしていない可能性がある。
添付の図面は正確な比率であることを意図しない。図面において、いくつかの図において示される同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で表される。明確性を目的として、全ての図面において全ての構成要素に符号付けしていない可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＲＣＭ培地における種々のアクネ菌株のｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の消費を示す。
【図2】８６時間振盪培養後のグルコース無添加培地における種々のアクネ菌株のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の濃度を示す。ＯＤ(６００ｎｍ)により、濃度は生育に対して標準化される。
【図3】種々の菌株における異性体濃度の経時変化を示す。
【図4】接種後５日目または６日目の混合物におけるＣ３の相対量を示す。開始混合物中に高い割合で存在するとき、Ｃ３は優占菌株のままである。驚くべきことに、低い開始濃度で存在するとき、後期定常期においてＣ３の全体的割合は減少する。
【図5】３７℃でのＲＣＭ培地におけるＣ３、Ｆ４、Ｃ１およびＫ８菌株の増殖曲線を示す。
【図6】３７℃でのグルコース無添加ＰＹ培地におけるＣ３、Ｆ４、Ｃ１、Ｋ８菌株の、２菌株混合物(Ｃ３およびＫ８)および４菌株混合物(Ａ５、Ｃ３、Ｆ４、およびＫ８)の増殖曲線を示す。
【図7】ＲＣＭ寒天培地上における増殖前および５日後のシーケンシングリードにより決定された菌株混合物中の種々のアクネ菌株の相対濃度の変化を示す。驚くべきことに、単離菌として使用したとき極めて増殖が遅いＫ８菌株は、菌株混合物において増殖の５日後に培地中の優占菌株となった。
【図9】１４対象パイロット試験において、全ての対象の皮膚マイクロバイオームにおける９種の最も豊富な細菌の平均化した相対比を示す。
【図10】受容者または非受容者として分類した対象の相対比を示す。
【0025】
【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは完全な細菌皮膚マイクロバイオーム内のアクネ菌の相対量を示す。図１１Ａはパイロット試験中の受容者および非受容者におけるアクネ菌集団の動的生育を示す。受容者群において、アクネ菌は初めに細菌皮膚マイクロバイオームの３４％のみに存在した。ＢＰＯ処置後、この値はさらに減少し、続いて細菌ゲルを使用した後に２倍近くまで増加した。アクネ菌集団は４２日目に６０％で安定化した。非受容者群における動態は同様であった。非受容者の基底状態はより高い４０％のレベルで開始し、受容者群とは対照的に、４２日目において集団における増加は顕著ではなかった。図１１Ｂはアクネ菌の相対比を、データ点の広がりを示す箱ひげ図として示す。受容者群における１日目と４２日目の差異は統計学的に高い関連性がある(ｐ＝０.００１)が、受容者群は、４２日目と１日目で類似した。
【図12】箱ひげ図として表された非炎症性病変の数を示す。３組の箱ひげ図：全体；Ａ２製剤；およびＢ４製剤を示す。統計的有意差についてのｐ値を図の下に示す。
【図13】受容者および非受容者についての非炎症性病変の数を表す。両方の群について、減少は統計的に有意である。
【図14】箱ひげ図として表された炎症性病変の数を示す。３組の箱ひげ図：全体；Ａ２製剤；およびＢ４製剤を示す。
【図15】受容者および非受容者についての炎症性病変を示す。
【図16】受容者および非受容者についてのパイロット試験中の皮膚ｐＨの進展を表す。
【図17】対象の回答の平均値に基づいた対象数の分布を示す。
【図18】１５種の最も一般的に見られるアクネ菌株の相対量を示すヒートマップを示す。ヒートマップは新しい細菌を極めて良好に確立するとして分類された６名の対象の平均を示す。マイクロバイオームの組成における明確な変化が１日目と４２日目の間で見られた。
【図19】写真ベース比較の結果を示すグラフを示す。１日目～２８日目までの結果を１日目～４２日目までの結果と比較した。各写真は、対象が改善したならば＋１、対象が変化していないとみられたならば０、そして対象が悪化したならば－１で評価された。平均は１日目～２８日目：－０.１７であり、１日目～２８日目：０.２９である。差異は統計的に有意な、ｐ＜０.０５であった。
【図20】患者評価概要の結果を示し、これは４２日間の臨床試験中の炎症性および非炎症性病変の改善を示す。
【図21】実験１.２に記載のように、アクネ菌Ｋ８およびＣ３菌株のｐＨ制御培養物およびｐＨ非制御(「酸性化」)培養物のＯＤ６００を示す。グラフは複製培養物からのデータを示す。
【図22】実験１.２に記載のように、アクネ菌Ｋ８およびＣ３菌株のｐＨ制御培養物およびｐＨ非制御(「酸性化」)培養物の生菌数を示す。グラフは複製培養物からのデータを示す。
【図23】実験１.３に記載のように、アクネ菌Ｋ８およびＣ３菌株のｐＨ制御培養物およびｐＨ非制御(「酸性化」)培養物のＯＤ６００を示す。
【図24】実験２.２に記載のように、アクネ菌Ｋ８(左)およびＣ３(右)菌株の培養物の位相差顕微鏡像(５００倍)を示す。
【図25】製剤Ａ２およびＢ４の投与後の種々のアクネ菌株の相対濃度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
詳細な説明
皮膚マイクロバイオームの調節のための組成物および方法が提供される。健全な皮膚、例えばざ瘡のない皮膚の維持において使用するための、またはざ瘡を処置または予防するための、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物が本明細書に記載される。２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、皮膚がマイクロバイオーム疾患状態を健全なマイクロバイオーム状態に戻すことを助け得る。
皮膚マイクロバイオームの調節のための組成物および方法が提供される。健全な皮膚、例えばざ瘡のない皮膚の維持において使用するための、またはざ瘡を処置または予防するための、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物が本明細書に記載される。２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、皮膚がマイクロバイオーム疾患状態を健全なマイクロバイオーム状態に戻すことを助け得る。
【0027】
いかなる理論にも縛られることを願わないが、アクネ菌は皮脂に本来存在するシグナル前駆体分子(リノール酸)を活性シグナル伝達分子(ｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸)に変換し、これは、次に皮膚のアクネ菌コロニー形成に重要な皮脂分泌を刺激する。有意に、このシグナル伝達分子の産生は、ざ瘡の発症の現在の理解の種々の態様間の関連を提供する。
【0028】
実施例１に示すように、驚くべきことに、種々のアクネ菌株は種々のレベルのリノール酸イソメラーゼ活性またはｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸濃度の最終閾値を有することが見出された。例えば、アクネ菌ＳＬＳＴ Ａ１型株は最も多くのｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体を産生することが発見され、一方でアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３、Ｃ１、Ｆ４、Ａ５、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ８およびＬ１型株は極めて少量のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の産生を示した。
【0029】
また驚くべきことに、いくつかの菌株は、菌株混合物中で増殖するときに、別個に増殖するときと異なる増殖パターンを示すことも見出された。例えば、アクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型株は別個ではゆっくりと増殖するが、菌株混合物中で増殖するとき、インキュベート５日後に優占菌株となることが発見された(図７)。従って、本発明の態様は本来ゆっくりと増殖し得るおよび本来は駆逐される可能性のある個々の菌株を含むときでさえ、有利な増殖性質を示す菌株混合物に関する。
【0030】
また驚くべきことに、菌株混合物が個々の菌株より高いレベルの防腐剤を許容できることもまた、ここに見出された。従って、本発明の態様は、皮膚に確立され得るおよび特定の化合物(例えば防腐剤を含む製品)への曝露に対して単一のアクネ菌と比較して改善した生存率を有するアクネ菌株の混合物に関する。この特徴は、個々の菌株と比較して、細菌混合物にヒト対象の皮膚における確立および長期持続性について予想外の利点を提供する。
【0031】
驚くべきことに、２以上の生存アクネ菌株の２つの異なる製剤を用いて、生存アクネ菌株の投与がざ瘡を有する対象における非炎症性病変の相当な減少をもたらし得ることもまた、ここに示される。実施例５に記載のパイロット臨床試験において、本明細書に記載の製剤の投与後、対象の８５％が、ざ瘡に関連する症状の改善を報告した。
【0032】
本発明は、その適用を以下の記載において説明されるまたは図面において示される構成の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の実施態様が可能であり、多様な方法で実施および実行できる。また、本明細書で使用される表現および用語は説明を目的とするものであり、限定するものと理解されるべきではない。本明細書における「含む(including)」、「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(containing)」、「含む(involving)」およびそれらの変化形は、その前に挙げられた項目およびその同等物ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
【0033】
本発明の態様はマイクロバイオームに関する。本明細書において使用される「マイクロバイオーム」は、身体に生息する全ての微生物を示す。ヒトマイクロバイオームはヒトの健康および疾患における基本的な役割を有する(Consortium, 2012; NIH HMP Working Group et al., 2009)。次世代シーケンシング(ＮＧＳ)技術の開発は、かつてない深度および分解能での微生物群集の研究を可能にした(Human Microbiota issue, Nature 2012を参照)。１０,０００を超える異なる細菌株がヒト身体にコロニー形成し、平均的ヒト身体にはヒト細胞より１０倍多くの細菌が存在する。近年の研究により、体内の細菌群集の組成はヒト身体の健康と密接に結びついていることが示された(Belkaid and Segre, 2014; Consortium, 2012; Zhao, 2010)。結果として、マイクロバイオームの乱れ(distortions)は多様な疾患に関連する。
【0034】
腸マイクロバイオーム、および腸マイクロバイオームの標的操作のための方法は詳細に調査されている(Dore and Blottiere, 2015)。このような治療法の例は、「便移植」の助けを借りた抗生物質耐性細菌クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)の処置である(van Noodら, 2013; Olle, 2013)。
【0035】
近年、研究者らは皮膚マイクロバイオームの調査を開始した(BelkaidおよびSegre, 2014; Ohら、2014)。皮膚は膨大な数の微生物によりコロニー形成され、それらの多くは有益または無害である(GriceおよびSegre、2011)。しかしながら、尋常性ざ瘡のような疾患はマイクロバイオームの強力な変化と関連する(Bek-Thomsenら、2008; Holmes、2013; Kongら、2012)。特に、ざ瘡はヒト皮膚マイクロバイオームの乱れと関連すると考えられる(Fitz-Gibbonら、2013)。この乱れは皮膚細菌アクネ菌の特定のサブセットにより引き起こされると考えられる(LomholtおよびKilian、2010)。
【0036】
本明細書において、組成物および方法は、皮膚マイクロバイオームの乱れに端を発するまたはそれにより影響される皮膚障害に対する処置法を開発するために、皮膚マイクロバイオームの知識を利用する。
【0037】
ざ瘡
本明細書において使用される「尋常性ざ瘡」および「ざ瘡」は、相互交換可能に使用され、世界中で何百万人もの人々に影響を与え、特に十代の人々に多い皮膚状態を示す。ざ瘡はしばしば、皮膚における炎症性および非炎症性病変の形成と関連する。いかなる理論にも縛られることを願わないが、ざ瘡は、少なくとも一部、詰まりおよび／または炎症を起こした毛嚢と関連し得る。ざ瘡はヒト皮膚マイクロバイオームの乱れと関連すると考えられる。この乱れは皮膚細菌の特定菌株であるアクネ菌により引き起こされ得る(Fitz-Gibbonら、2013； Holmes, 2013； LomholtおよびKilian, 2010)。
本明細書において使用される「尋常性ざ瘡」および「ざ瘡」は、相互交換可能に使用され、世界中で何百万人もの人々に影響を与え、特に十代の人々に多い皮膚状態を示す。ざ瘡はしばしば、皮膚における炎症性および非炎症性病変の形成と関連する。いかなる理論にも縛られることを願わないが、ざ瘡は、少なくとも一部、詰まりおよび／または炎症を起こした毛嚢と関連し得る。ざ瘡はヒト皮膚マイクロバイオームの乱れと関連すると考えられる。この乱れは皮膚細菌の特定菌株であるアクネ菌により引き起こされ得る(Fitz-Gibbonら、2013； Holmes, 2013； LomholtおよびKilian, 2010)。
【0038】
ざ瘡の発症は脂腺からの皮脂分泌の開始と関連する(Makrantonakiら、2011;Zouboulis, 2004)。また、アクネ菌の集団密度は産生される皮脂の量と直接関連する(Kearneyら、1984; Kingら、1982; Mourelatosら、2007)。しかしながら、アクネ菌の存在と疾患であるざ瘡の間の明確な分子的繋がりは、現在まで確立するされていない。これは、少なくとも一部は、大部分の成人の皮膚がアクネ菌によりコロニー形成されるが、これらの成人の多くでざ瘡の症状が発症しないという事実のためである。ざ瘡が発症するためには、皮脂の体積および組成における変化に付随する炎症反応が引き起こされなければならない(Pappasら、2009)。
【0039】
現在、ざ瘡についての標準的な処置はマクロライドおよび／またはテトラサイクリン系抗生物質を用いた処置のような長期の抗生物質処置、またはイソトレチノインの全身使用である(Bersonら、2003)。これらの処置は強力な副作用および高い再発率を示す。例えば、イソトレチノインは皮膚刺激を引き起こし、催奇形性作用(先天的欠損症を含む)もまた有する(McLane, 2001)。さらに、イソトレチノインを用いた再発率もまた好ましくなく、４０％を超える(Azoulayら、2007)。イソトレチノインは皮脂産生量を減少させ、それにより間接的に皮膚の細菌密度を減少させることが示しされている(Kingら、1982)。最近数十年間は抗生物質が一般的な処置であるが、１以上の抗生物質に耐性である細菌株の数が劇的に増加している(Leyden, 2001；Rossら、2001)。
【0040】
ざ瘡処置の別の群は、市販(ＯＴＣ)製品および化粧品を含む。一般に使用されるＯＴＣ製品は、過酸化ベンゾイル(例えばＢｅｎｚａｋｎｅｎ、Ｇａｌｄｅｒｍａ Ｓ.Ａ.，ローザンヌ、スイス、およびＡｋｎｅｆｕｇ、Ｄｒ．Ａｕｇｕｓｔ Ｗｏｌｆｆ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ、ビーレフェルト、ドイツ)およびサリチル酸を含む広帯域殺菌剤である。さらに、効果が限定的なまたは証明されていない数多くの天然製品ラインが存在する。
【0041】
ざ瘡のようなマイクロバイオームの乱れに関連する皮膚障害についての現在の治療法は効果が低いか、または重篤な副作用を伴う(McLane, 2001；Tripathiら、2013)。通常、ざ瘡を有する対象の皮膚は、抗生物質またはホルモン剤のような古典的処置中に改善する。しかしながら、対象はほとんどの場合、処置の終了後に再発する。イソトレチノインは約４１％の再発率を有する(Azoulayrら、2007)。従って、対象は有益な効果を維持するために長期の処置が必要とされる。この極めて高い再発率は、治療停止後のマイクロバイオームによる皮膚のコロニー再形成により説明できる。
【0042】
本明細書に記載の組成物および方法は、顕著な副作用を伴わず、再発を予防するざ瘡の効果的な処置についての満たされない需要に取り組む。本明細書に記載の新規なアプローチは健全なマイクロバイオームの移植を含み得る。驚くべきことに、ざ瘡の原因に含まれると考えられるのと同じ細菌種であるアクネ菌株が、ざ瘡を処置または予防するために、またはざ瘡が存在しない状態で皮膚を維持するために使用され得る。顕著な副作用を伴わない、改善した皮膚状態を提供し得る、２以上の生存細菌株を含む組成物が本明細書に記載される。本明細書に記載の組成物中の生存細菌株は、アクネ菌細菌株である。
【0043】
いくつかの実施態様において、組成物は化粧品である。本明細書において使用される「化粧品」は、外見を向上させることを意図する製品を示す。１以上の生存細菌株を含む本明細書に記載の化粧組成物はまた「薬用化粧品」とも称され得る(Draelos, 2009)。
【0044】
本発明の態様は、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物を対象の皮膚に単独で、他の治療法と組み合わせて、または別の治療法の後に投与することに関する。いくつかの態様において、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、皮膚がマイクロバイオーム疾患状態から健全なマイクロバイオーム状態へ回復するのを助け得る。いくつかの実施態様において、対象の皮膚は抗生物質、殺菌剤またはホルモン剤のような標準的なざ瘡治療法により既に処置されている。本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、ざ瘡についての標準的な処置に対する補完的回復方法として使用され、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む該組成物により、抗生物質処置後のざ瘡の再発率を減少させることができる。例えば、２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は対象の皮膚からその天然細菌の大部分が除去されたときである抗生物質または殺菌処置後に使用され得る。組成物中の生存細菌は、病原性細菌株と置き換わり、多種の、健全なおよびバランスのとれた皮膚マイクロバイオームが回復するのを助け得る。従って、いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法は、皮膚から病原性細菌株を除菌し、生存アクネ菌細菌を皮膚に加えて健全な皮膚マイクロバイオームを作ることを含む。
【0045】
本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、個体の皮脂の産生量の減少または増加に使用し得る。本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物はまた、ろ胞および脂腺においてｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を産生し、それにより脂腺の環境へ活性化合物を送達するために使用され得る。これらの方法はｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の標準的局所適用に関連する問題を回避する。
【0046】
本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物はまた、皮膚における皮脂産生を増加または減少させる細菌株の皮膚への提供により、皮膚における細菌密度を増加または減少させ、それにより間接的に細菌密度を変化させるために使用され得る。
【0047】
本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物はまた、皮脂産生を変化させる生存細菌株を皮膚に投与することにより、他の細菌種と比較してまたは真菌類またはダニ類のような微生物叢の他の構成要素と比較して、選択細菌種の比を修飾し、それにより皮膚におけるアクネ菌の細菌密度を間接的に変化させるために使用され得る。
【0048】
本明細書に記載の２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、健全な皮膚、例えばざ瘡のない皮膚を維持するために使用され得る。いくつかの実施態様において、このような組成物の投与はざ瘡の形成の予防を助け得る。いくつかの実施態様において、このような組成物はざ瘡を処置するために使用され得るか、または標準的なざ瘡処置を受けた対象におけるざ瘡の再発を予防するために使用され得る。
【0049】
２以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、皮膚に自然にコロニー形成する１以上の生存細菌の菌株を含む。いくつかの実施態様において、１以上の菌株は天然に存在する。しかしながら、２以上の細菌株を含む組成物は天然に存在しない。２以上の細菌株を含む組成物は、天然での個々の菌株と異なる性質を有する。
【0050】
アクネ菌(P. acnes)
アクネ菌はざ瘡ならびに慢性眼瞼炎および眼内炎のような他の状態に関連する嫌気性グラム陽性桿菌種である。アクネ菌株は大抵の人の皮膚に存在する。アクネ菌株の一部は病原性であるが、他のアクネ菌株は病原性ではないことが報告されている(Fitz-Gibbonら、2013；Lomholtら、2010)。本明細書において使用される「病原性」アクネ菌株は、ざ瘡と関連するアクネ菌株を示す。病原性および非病原性アクネ菌株が同定および選択され得るアッセイが、本明細書に記載される。
アクネ菌はざ瘡ならびに慢性眼瞼炎および眼内炎のような他の状態に関連する嫌気性グラム陽性桿菌種である。アクネ菌株は大抵の人の皮膚に存在する。アクネ菌株の一部は病原性であるが、他のアクネ菌株は病原性ではないことが報告されている(Fitz-Gibbonら、2013；Lomholtら、2010)。本明細書において使用される「病原性」アクネ菌株は、ざ瘡と関連するアクネ菌株を示す。病原性および非病原性アクネ菌株が同定および選択され得るアッセイが、本明細書に記載される。
【0051】
アクネ菌株は、それらの代謝および表現型的行動(LomholtおよびKilian, 2010)において顕著に異なることが示されている。これらの差異は、限定されないが、ノイラミニダーゼ、α－グルコシダーゼまたはヒアルロニダーゼの発現およびウマ血液の溶血、リボース発酵、エリスリトール発酵またはソルビトール発酵を行う能力を含む。さらに、アクネ菌は、ｃｉｓ ９,ｃ－１２ リノール酸をｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸に特異的に変換する活性リノール酸イソメラーゼを発現することが示されている(Rossonら、2004)。リノール酸は皮脂産生の制御における重要な分子であり、リノール酸の減少は多くの研究においてざ瘡の発生と結び付けられている(Downingら、1986；Letaweら、1998)。
【0052】
さらに、アクネ菌死滅細胞または上清はハムスター脂腺細胞において脂質産生を増加させ得ることがが示されている(Iinumaら、2009a)。
【0053】
アクネ菌種はクレードＩ～ＩＩＩに分類され、さらにサブタイプ：ＩＡおよびＩＢを含む(Lomholtら)。ＩＡはさらにＩＡ１およびＩＡ２に細分されている(McDowellら、2012)。アクネ菌株の遺伝子解析が行われ、どの菌株がざ瘡と関連する病原性であり得るか、およびどの菌株が非病原性であり、ざ瘡と関連し得ないかが決定されている(Fitz-Gibbonら、2013、Lomholtら、2010およびKasimatisら、2013)。いくつかの実施態様において、非病原性アクネ菌株は、次のアクネ菌のクラス：Ｉ－２、ＩＩおよびＩＢの１種に由来する。いくつかの非限定的実施態様において、非病原性アクネ菌株は、Scholzら(2014) PLOS ONE 9(8) e104199に記載の、Ｄ１、Ａ５、Ｃ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ４、Ｋ６、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１およびＦ４ ＳＬＳＴ型株から成る群から選択される。
【0054】
Scholtzらに記載のように、および当業者に理解されるように、アクネ菌株は標的遺伝子座のＰＣＲ増幅およびＤＮＡシークエンシングを含む単一遺伝子座配列タイピング(ＳＬＳＴ)を用いて同定され得る。標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５(Scholzらにおいて「ＳＬＳＴ標的配列」と称される)を用いて、アクネ菌についてのＳＬＳＴスキームがScholzらにおいて開発され、記載されている。Scholtzらに記載されるＳＬＳＴスキームに関連するアクネ菌データベースは、medbac.dk/slst/pacnesでオンラインで利用可能である。典型的なＳＬＳＴ型株は、Ａ１～Ａ２４、Ｂ１、Ｃ１～Ｃ４、Ｄ１～Ｄ３、Ｅ１～Ｅ９、Ｆ１～Ｆ１０、Ｇ１、Ｈ１～Ｈ５、Ｋ１～Ｋ１４およびＬ１～Ｌ６を含む。使用者はアクネ菌シークエンスをオンラインデータベースに入力し、ＳＬＳＴ型菌株を同定できる。他のアクネ菌株同定および命名システムは、ＭＬＳＴ９およびＭＬＳＴ８スキーム、リボタイピングおよびｒｅｃＡおよびｔｌｙ配列解析に基づくタイプ割り当てを含む。Scholtzらの図１は、これらの種々の命名規則を示す。当業者は、当分野において既知の種々の命名規則によりどのようにアクネ菌株が同定され、かつ分類され得るかを理解する。
【0055】
本明細書において使用される、細菌株を「タイピングする」とは、例えばＳＬＳＴを用いることにより細菌株を同定することを示す。アクネ菌ＳＬＳＴ Ｄ１、Ａ５、Ｃ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ４、Ｋ６、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１およびＦ４型株のような本明細書に記載の菌株を同定するためにＳＬＳＴにおいて使用される対立遺伝子配列を表１に列挙する。当業者は、Scholtzらに開示されるものに対応する本明細書において使用される菌株の命名を理解し、アクネ菌株が、例えばＳＬＳＴを使用することによりこれらの特定の菌株のいずれかに対応するか否かを特定する方法を理解する。
【0056】
従って、アクネ菌株はScholtzらに記載の標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５を用いたＳＬＳＴ型命名に基づいて、本明細書に記載される。例えば、「アクネ菌株Ｃ３」は、Scholtzらに記載の標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５を用いたアクネ菌ＳＬＳＴ Ｃ３型を示す。「アクネ菌株Ｋ８」はScholtzらに記載の標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５を用いたアクネ菌ＳＬＳＴ Ｋ８型を示す。「アクネ菌株Ａ５」はScholtzらに記載の標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５を用いたアクネ菌ＳＬＳＴ Ａ５型を示し、「アクネ菌株Ｆ４」はScholtzらに記載の標的遺伝子座ＰＰＡ２３８５を用いたアクネ菌ＳＬＳＴ Ｆ４型を示す。
【0057】
本明細書に記載の細菌組成物は、２以上のアクネ菌株を含む。例えば、細菌組成物は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０を超えるアクネ菌株を含み得る。いくつかの実施態様において、組成物は２、３、４または５の異なるアクネ菌株を含む。アクネ菌株の１以上は非病原性菌株であり得る。いくつかの実施態様において、細菌組成物中の全てのアクネ菌株は非病原性菌株であり得る。いくつかの実施態様において、アクネ菌株は、菌株を同定するためおよび組成物に該菌株を含めるか否かについて選択するために、遺伝子型判定される。本明細書に記載の細菌組成物に含まれるアクネ菌は、脂質産生を増加または減少させるために選択され得る。
【0058】
いくつかの実施態様において、２以上の異なるアクネ菌細菌株を含む組成物は、アクネ菌株Ｃ３、アクネ菌株Ｋ８またはアクネ菌株Ｃ３およびアクネ菌株Ｋ８の両方を含む。いくつかの実施態様において、アクネ菌株Ｃ３およびアクネ菌株Ｋ８は組成物中にほぼ同等の濃度で存在する。他の実施態様において、アクネ菌株Ｃ３は組成物中にアクネ菌株Ｋ８より高い濃度で存在する。他の実施態様において、アクネ菌株Ｃ３は組成物中にアクネ菌株Ｋ８より低い濃度で存在する。
【0059】
いくつかの実施態様において、２以上の異なるアクネ菌細菌株を含む組成物は、アクネ菌株Ａ５および／またはアクネ菌株Ｆ４を含む。例えば、組成物はアクネ菌株Ｃ３および／またはアクネ菌株Ｋ８、および／またはアクネ菌株Ａ５および／またはアクネ菌株Ｆ４を含み得る。いくつかの実施態様において、組成物はアクネ菌株Ｃ３およびアクネ菌株Ｋ８およびアクネ菌株Ａ５およびアクネ菌株Ｆ４を含む。
【0060】
いくつかの実施態様において、アクネ菌株の混合物は１以上のクレードＩ菌株および１以上のクレードＩＩ菌株を含む。いかなる理論にも縛られることを願わないが、クレードＩＩ菌株は低病原性であり得る；いずれにしても、これらの菌株はまた、クレードＩ菌株より増殖が遅く、それ自体で皮膚にコロニー形成できる可能性が低いものであり得る。従って、本発明の態様はクレードＩおよびクレードＩＩ菌株を含み、クレードＩＩ菌株による皮膚のコロニー形成を可能にする菌株混合物に関する。
【0061】
いくつかの態様において、本明細書に記載の１以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、アクネ菌株Ｈ１(６６０９)を含む(Hunyadkuertiら)。このアクネ菌株のゲノムは配列決定され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＰ００２８１５で利用可能である(Hunyadkuertiら)。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、特定のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９配列を有するアクネ菌株を含む(Brueggemann、2012、Fitz-Gibbon 2013)。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物はアクネ菌株Ｋ１、Ｋ４およびＨ１(６６０９)の１以上を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、アクネ菌株Ｋ１、Ｋ４、Ｄ１、Ａ５、Ｃ３およびＨ１(６６０９)の各々を含む。
【0062】
本発明の態様は、アクネ菌株の混合物に関する。アクネ菌株の選択は、少なくとも一部、菌株が病原性であるか否かの決定を含み得る。この決定は公開情報、先の報告および／またはアクネ菌株が病原性であるか否かを決定するための実験的試験に基づき得る。いくつかの実施態様において、非病原性アクネ菌株のみが選択される。
【0063】
アクネ菌株の選択は、少なくとも一部、どの菌株または菌株の組合せが化粧または医薬組成物における使用に適切な条件において安定であるかの決定もまた含み得る。いくつかの実施態様において、増加した安定性を示すアクネ菌株が選択される。安定性は当分野で既知の方法を用いて、例えばコロニー形成単位(ＣＦＵ)の変化を測定することにより評価され得る。
【0064】
本明細書に記載の細菌組成物に含まれるアクネ菌株は天然に存在し得るか、遺伝的に修飾され得る。遺伝的に修飾された菌株は自然突然変異誘発および／または遺伝子操作により修飾され得る。いくつかの実施態様において、アクネ菌株の遺伝的修飾はｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の産生に影響を与え、および／またはそのリノール酸イソメラーゼ活性を増加または減少させる。いくつかの実施態様において、アクネ菌株は細菌株の分類および／または特定の細菌株の選択に使用され得る種々のレベルのリノール酸イソメラーゼを示す。
【0065】
いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌細菌株はｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を産生する能力に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌細菌株は、その天然の環境においてそれが産生するｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌細菌株は、それが産生するｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の最大濃度に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌細菌株はそれが産生する酵素、リノール酸イソメラーゼの活性に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、リノール酸活性を有さないアクネ菌株が選択される。他の実施態様において、低レベルのリノール酸活性を有するアクネ菌株が選択される。他の実施態様において、高レベルのリノール酸活性を有するアクネ菌株が選択される。
【0066】
いくつかの実施態様において、アクネ菌株によるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の産生は、２００４年６月１日に登録された「Linoleate isomerase」と題された米国特許第６，７４３，６０９号に記載され、参照により包含される方法を用いて検出される。いくつかの実施態様において、産生されるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量は、ＦＡＭＥ(脂肪酸メチルエステル)および／またはＧＣ(ガスクロマトグラフィー)を用いて検出される。
【0067】
いくつかの実施態様において、アクネ菌株は５００ｐｐｍのリノール酸を最大２５０ｐｐｍのｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸に変換でき、かつこの濃度を一定に保つことができる。いくつかの実施態様において、アクネ菌株はリノール酸をｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸に変換する高い能力を有するアクネ菌から選択される。他の実施態様において、アクネ菌株はリノール酸をｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸に変換する低い能力を有するアクネ菌から選択される。
【0068】
いかなる理論にも縛られることを願わないが、いくつかの実施態様において、アクネ菌株がゼロから低レベルのリノール酸イソメラーゼを含む細菌組成物は、ざ瘡を予防または処置するために有益であり得る。なぜならば、このような組成物は皮脂分泌を減少させ得るからである。いくつかの実施態様において、組成物は標準的なざ瘡処置(例えば殺菌剤または抗生物質)終了後のざ瘡の再発を避けるのに有用であり得る。
【0069】
いくつかの実施態様において、細菌組成物は皮膚ろ胞におけるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸のレベルを増加させるために使用され得る。他の実施態様において、細菌組成物は皮膚ろ胞におけるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸のレベルを減少させるために使用され得る。いくつかの実施態様において、アクネ菌株の組合せは、美容または医療目的のためにｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を直接脂腺へ送達するために使用される。
【0070】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の細菌組成物は高い皮脂産生レベルを有する皮膚、例えば脂性肌における皮脂産生を減少させるために使用される。他の実施態様において、本明細書に記載の細菌組成物は低い皮脂産生レベルを有する皮膚、例えば乾燥肌における皮脂産生を増加させるために使用される。いくつかの実施態様において、高いリノール酸イソメラーゼ活性を有する菌株の組合せは、十分な皮脂産生を欠く個体の皮膚に適用される。いくつかの実施態様において、このような個体は皮脂産生の減少を経験し得る高齢者である。
【0071】
いくつかの実施態様において、アクネ菌株により産生されるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量は、試験された菌株におけるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の産生を、ｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を産生しないことが知られているまたは無視できるもしくは平均量より低い量のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を産生するアクネ菌株と比較することにより評価される。他の実施態様において、アクネ菌株により産生されるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量は、試験された菌株におけるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の産生を、平均または平均より高い量のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸を産生することが知られているアクネ菌株と比較することにより評価される。いくつかの実施態様において、産生されるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の相対量が測定または評価される。他の実施態様において、産生されるｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の絶対量が測定または評価される。
【0072】
いくつかの実施態様において、アクネ菌株により分解されるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量は、試験された菌株におけるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解速度を、ｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を分解しないことが知られているまたは無視できるもしくは平均量より低い量のｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を分解するアクネ菌株と比較することにより評価される。他の実施態様において、アクネ菌株により分解されるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量は、試験された菌株におけるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解速度を、平均または平均より高い量のｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解速度を有することが知られているアクネ菌株と比較することにより評価される。いくつかの実施態様において、分解されるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の相対量が測定または評価される。他の実施態様において、分解されるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の絶対量が測定または評価される。
【0073】
いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株は遅いまたは無視できるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解または変換を示す。いくつかの実施態様において、組成物中の全てのアクネ菌細菌株は遅いまたは無視できるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解または変換を示す。
【0074】
いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株はその遅いまたは無視できるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解または変換に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株はその天然の環境においてそれが分解するｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の量に基づいて選択される。いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株は、それが分解するｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の最大濃度に基づいて選択される。
【0075】
いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株は、より少ないｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を分解するように、またはｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸をよりゆっくりと分解するように遺伝的に修飾される。
【0076】
所定の方法を用いて個々の菌株および組合せを試験し、どの組合せが安定な組成物をもたらすかが決定され得る。いくつかの実施態様において、このような組成物は少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間または３０週間以上、室温で安定である。いくつかの実施態様において、このような組成物は少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月または６か月以上、室温で安定である。
【0077】
いくつかの実施態様において、組成物は少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間または３０週間以上、約４℃で安定である。いくつかの実施態様において、組成物は少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月または６か月以上、約４℃で安定である。
【0078】
いくつかの実施態様において、細菌組成物はドナー対象の皮膚マイクロバイオームから採取することにより製剤される。例えば、サンプルはざ瘡を有さない対象から採取され得る。他の実施態様において、サンプルは軽度の、中程度のまたは重度のざ瘡を有する対象から採取される。いくつかの実施態様において、ざ瘡を有するまたはざ瘡になりやすい対象から採取されるが、ざ瘡の発症に関連する細菌株はサンプルから除去される。サンプルは培養され得て、場合により他の成分と組み合わされて細菌組成物を形成し得る。他の実施態様において、細菌組成物は１以上の単離細菌株から形成され得る。
【0079】
ドナー対象から採取されたサンプルは、非病原性アクネ菌株を含むかどうかを調べるために試験され得る。いくつかの実施態様において、ドナー対象の皮膚に由来する１以上の非病原性アクネ菌株が選択され、レシピエント対象に投与される。レシピエント対象はドナー対象と同一であっても、ドナー対象と異なってもよい。
【0080】
いくつかの実施態様において、細菌組成物は、１以上のアクネ菌株に加えて１以上の他の細菌株、例えば非病原性細菌を含み得る。いくつかの実施態様において、１以上の非病原性細菌株は抗生特性を有する。いくつかの実施態様において、細菌組成物は１以上の表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)株を含み得る。
【0081】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアクネ菌株は配列番号：１～７６から選択される配列を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のアクネ菌株は、配列番号：１～７６から選択される配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％または９９.９％同一である配列を含む。
【0082】
いくつかの実施態様において、組成物は配列番号：２７と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％または９９.９％同一であるアクネ菌および／または配列番号：６４と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.１％、９９.２％、９９.３％、９９.４％、９９.５％、９９.６％、９９.７％、９９.８％または９９.９％同一であるアクネ菌株を含む。いくつかの実施態様において、組成物は配列番号：２７を含むアクネ菌株および／または配列番号：６４を含むアクネ菌株を含む。
【0083】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物はリボタイプ６(ＲＴ６)アクネ菌株を含まない。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物はファイロタイプＩＩＩアクネ菌株を含まない。
【0084】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0085】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【0086】
【表1-11】
【表1-12】
【0087】
【表2】
【0088】
リノール酸およびその異性体ｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸
リノール酸は２つの不飽和二重結合を有するＣ１８脂肪酸である。通常、主異性体はｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２である。この異性体はまた、皮脂において遊離の脂肪酸として分泌される。インビトロで、リノール酸は脂腺細胞における脂質産生を刺激し、皮脂産生を調節するフィードバックループに関与し得る。それはまた抗生特性を有し、種々のアクネ菌はリノール酸に対して種々の感受性を示す抗生特性も有する(Hong Lioe Koら, 1978; Madli PuhvelおよびReisner, 1970)。しかしながら、リノール酸はまた、アクネ菌の食物源である皮脂の産生のための刺激剤として作用する。いかなる理論にも縛られることを願わないが、平衡が存在することがあり、これは細菌集団および宿主の皮脂産生により決定される、皮脂におけるリノール酸濃度により表される。この平衡は、ろ胞にコロニー形成しているアクネ菌によるｃｉｓ,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解／変換速度に依存する。
リノール酸は２つの不飽和二重結合を有するＣ１８脂肪酸である。通常、主異性体はｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２である。この異性体はまた、皮脂において遊離の脂肪酸として分泌される。インビトロで、リノール酸は脂腺細胞における脂質産生を刺激し、皮脂産生を調節するフィードバックループに関与し得る。それはまた抗生特性を有し、種々のアクネ菌はリノール酸に対して種々の感受性を示す抗生特性も有する(Hong Lioe Koら, 1978; Madli PuhvelおよびReisner, 1970)。しかしながら、リノール酸はまた、アクネ菌の食物源である皮脂の産生のための刺激剤として作用する。いかなる理論にも縛られることを願わないが、平衡が存在することがあり、これは細菌集団および宿主の皮脂産生により決定される、皮脂におけるリノール酸濃度により表される。この平衡は、ろ胞にコロニー形成しているアクネ菌によるｃｉｓ,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解／変換速度に依存する。
【0089】
リノール酸の共役異性体、すなわちｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１１ リノール酸およびｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸は、フードサプリメントとして注目を集めている(Churrucaら、2009)。リノール酸 ｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ １２はＰＰＡＲ受容体ファミリー(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体) (Moya-Camarenaら、1999)において作用する。ＰＰＡＲ－αの活性化は上皮モデルにおけるコレステロールを含む脂質合成を活性化する(Rivierら、2000)。ｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸はＲＯＳ(活性酸素種)を増加させ、抗癌活性を有することもまた、報告されている(Pierreら、2013)。
【0090】
表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)
表皮ブドウ球菌は、ヒト皮膚の通常の要素であるグラム陽性細菌である。表皮ブドウ球菌は、エピデルミン、Ｐｅｐ５、エピシジン２８０、エピランシンＫ７およびエピデルミシンＮＩ０１を含む５つのランチビオティクスを産生し得る。ランチビオティクスは非タンパク質アミノ酸、ランチオニンおよび３－メチルランチオニンを含む抗生物質様ペプチドを示す(Schnellら、1988)。エピデルミンはアクネ菌に対して極めて活性である(Allgaierら、1985)。Goetzらは、エピデルミンについてさらに詳細に記載している。Wangらは、表皮ブドウ球菌がグリセロールの発酵を媒介し、アクネ菌の増殖を阻害し得ることを報告する。
表皮ブドウ球菌は、ヒト皮膚の通常の要素であるグラム陽性細菌である。表皮ブドウ球菌は、エピデルミン、Ｐｅｐ５、エピシジン２８０、エピランシンＫ７およびエピデルミシンＮＩ０１を含む５つのランチビオティクスを産生し得る。ランチビオティクスは非タンパク質アミノ酸、ランチオニンおよび３－メチルランチオニンを含む抗生物質様ペプチドを示す(Schnellら、1988)。エピデルミンはアクネ菌に対して極めて活性である(Allgaierら、1985)。Goetzらは、エピデルミンについてさらに詳細に記載している。Wangらは、表皮ブドウ球菌がグリセロールの発酵を媒介し、アクネ菌の増殖を阻害し得ることを報告する。
【0091】
本明細書に記載の細菌組成物に含まれる表皮ブドウ球菌菌株は、天然に存在し得る、または遺伝的に修飾され得る。遺伝的に修飾された菌株は自然な突然変異および／または遺伝子操作により修飾され得る。いくつかの実施態様において、表皮ブドウ球菌菌株の遺伝的修飾はその抗生特性を増加させる。いくつかの実施態様において、細菌組成物は１以上のアクネ菌株および１以上の表皮ブドウ球菌菌株を含み得る。１以上のアクネ菌株は、１以上の表皮ブドウ球菌菌株の抗生特性に対して耐性であり得る。いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌株は、１以上の他の細菌株、例えば表皮ブドウ球菌の抗生特性に対するそれらの耐性を増加させるために、遺伝的に修飾される。いくつかの実施態様において、１以上のアクネ菌株は、１以上の他の細菌株の抗生特性に対するそれらの耐性を増加させるために、自然な変異誘発および／または遺伝子操作により修飾される。
【0092】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１以上の生存アクネ菌細菌株を含む組成物は、１以上の抗生物質、殺菌剤(例えば、ＢＰＯ)またはサリチル酸を含む。当業者は、あらゆる抗生物質または殺菌剤が本発明の特定の実施態様と適合し得ることを理解する。
【0093】
皮膚マイクロバイオーム移植
本発明の態様は、例えば移植による、皮膚マイクロバイオームの調節に関する。移植は１以上の対象間で行われ得る。いくつかの実施態様において、移植は１の個体で行われ、同一の対象がドナーかつレシピエントである。他の実施態様において、移植は２以上の対象間で行われる。いくつかの実施態様において、１のドナー対象および１のレシピエント対象が存在する。他の実施態様において、複数のドナー対象および／または複数のレシピエント対象が存在する。複数の移植方法が使用され、種々の細菌組成物の製剤が得られる。いくつかの実施態様において、非修飾マイクロバイオームが移植される、つまり、ドナーのマイクロバイオームが単離され、レシピエントに送達するために調製される。他の実施態様において、製剤されたマイクロバイオームが移植される、つまり、ドナーのマイクロバイオームが単離され、場合により、遺伝子型を同定され、製剤のために特定の菌株(例えば、特定の遺伝子型を有する菌株)が選択される。いくつかの実施態様において、製剤化され、遺伝子操作されたマイクロバイオームを移植する、つまり、ドナーのマイクロバイオームを単離し、遺伝子型を同定し、特定の菌株を選択し、遺伝的変異体を菌株から単離し、製剤を生産する。
本発明の態様は、例えば移植による、皮膚マイクロバイオームの調節に関する。移植は１以上の対象間で行われ得る。いくつかの実施態様において、移植は１の個体で行われ、同一の対象がドナーかつレシピエントである。他の実施態様において、移植は２以上の対象間で行われる。いくつかの実施態様において、１のドナー対象および１のレシピエント対象が存在する。他の実施態様において、複数のドナー対象および／または複数のレシピエント対象が存在する。複数の移植方法が使用され、種々の細菌組成物の製剤が得られる。いくつかの実施態様において、非修飾マイクロバイオームが移植される、つまり、ドナーのマイクロバイオームが単離され、レシピエントに送達するために調製される。他の実施態様において、製剤されたマイクロバイオームが移植される、つまり、ドナーのマイクロバイオームが単離され、場合により、遺伝子型を同定され、製剤のために特定の菌株(例えば、特定の遺伝子型を有する菌株)が選択される。いくつかの実施態様において、製剤化され、遺伝子操作されたマイクロバイオームを移植する、つまり、ドナーのマイクロバイオームを単離し、遺伝子型を同定し、特定の菌株を選択し、遺伝的変異体を菌株から単離し、製剤を生産する。
【0094】
いくつかの実施態様において、方法は、ドナー対象の皮膚から１以上の生存細菌株を得て、ここで該生存細菌株がアクネ菌株であること；１以上の生存細菌株が病原性であるかどうかを決定すること；そして病原性が病原性でないならば、投与を必要とするレシピエント対象の皮膚に殺菌剤または抗生物質を投与した後に、該対象の皮膚に１以上の生存細菌株を投与することを含む。いくつかの実施態様において、１以上の生存アクネ菌株が病原性であるかどうかを決定するためにアッセイを実施する。例えば、アッセイはどのようにして生存細菌株がｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を変換または分解するかを評価するために実施され得る。いくつかの実施態様において、組成物中の１以上のアクネ菌細菌株はその遅いまたは無視できるｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸分解または変換に基づいて選択される。
【0095】
他の皮膚状態
ざ瘡に加えて、本明細書に記載の組成物は、ふけ症、進行性黄斑メラニン減少症、アトピー性皮膚炎または酒さのような他の皮膚状態を処置または予防するために使用され得る。
ざ瘡に加えて、本明細書に記載の組成物は、ふけ症、進行性黄斑メラニン減少症、アトピー性皮膚炎または酒さのような他の皮膚状態を処置または予防するために使用され得る。
【0096】
ふけ症は、皮膚マイクロバイオームの比率における不均衡と関連する。ふけ症は慢性的にまたは発赤および刺激を伴い得る特定の原因の結果として経験され得る。主な寄与体はアクネ菌および表皮ブドウ球菌であり、マラセチア・レストリカ(Malassezia restricta)もまた含み得る。ふけ症については、表皮ブドウ球菌およびマラセチア・レストリカと比較してよりアクネ菌についてのより低い発生率が存在する(Clavaudら、2013；Wangら、2015)。これはアクネ菌細菌を用いた補充療法がふけ症の処置に有益であり得ることを示す。
【0097】
アクネ菌は、主に若年成人における、特に女性における、主に体幹の中央部分における一般的な色素沈着低下である進行性黄斑メラニン減少症に関与することが知られている(Westerhofら、2004)。それは皮膚に白斑として現れるため、より濃い皮膚の色を有する患者に多く診断される。近年、進行性黄斑メラニン減少症はアクネ菌のクレードＩＩＩと関連することが報告された(Barnardら、2016)。本明細書に記載の組成物は、クレードＩ株およびＩＩ株を含み、クレードＩＩＩ株を含まない。従って、本明細書に記載の組成物は、進行性黄斑メラニン減少症を処置または予防するために使用され得る。
【0098】
アトピー性皮膚炎(アトピー性湿疹としても知られる)は皮膚マイクロバイオームの強いディスバイオシスを示す紅斑と関連する。炎症は赤く、腫大した、痒いおよびひび割れた皮膚をもたらす。膝の裏側、肘の前面、手、足が最も罹患しやすい領域である。皮膚軟化薬は、アトピー性皮膚炎の処置に有効であることが示されている。本明細書に記載の細菌組成物を与えられた患者は、一般に改善された皮膚状態を示す。従って、本明細書に記載の組成物は、アトピー性皮膚炎を処置または予防するために使用され得る。
【0099】
酒さは顔の発赤、顔の皮膚における小さな拡張した血管、膿疱、丘疹および腫脹により特徴付けられる皮膚状態である。４つのタイプの酒さが存在し、そのうち３つは皮膚に影響する。本障害は尋常性ざ瘡または脂漏性皮膚炎と混同され得るか、共存し得る。頭皮または耳における発疹の存在は異なるまたは共存する診断を示唆する。これは、酒さが、時々これらの他の領域に現れ得るが、主として顔面診断であるためである。酒さの処置は、重篤度およびサブタイプにより変化する。本明細書に記載の組成物を用いたアクネ菌を用いた補充療法は酒さを処置または予防するために使用され得る。
【0100】
処置
本明細書で使用される用語、処置する(treat)、処置された(treated)または処置する(treating)とは、ざ瘡のような障害について使用されるとき、少なくとも１つのざ瘡の症状を改善すること、例えばざ瘡に関連する病変の減少および改善を示す。本明細書で使用される、予防するとは、病変のようなざ瘡の症状の形成を予防することおよび／または少なくとも１つのざ瘡の症状が悪化するのを予防すること、例えば病変をさらに予防することもしくは存在する病変が悪化するのを予防することを示す。
本明細書で使用される用語、処置する(treat)、処置された(treated)または処置する(treating)とは、ざ瘡のような障害について使用されるとき、少なくとも１つのざ瘡の症状を改善すること、例えばざ瘡に関連する病変の減少および改善を示す。本明細書で使用される、予防するとは、病変のようなざ瘡の症状の形成を予防することおよび／または少なくとも１つのざ瘡の症状が悪化するのを予防すること、例えば病変をさらに予防することもしくは存在する病変が悪化するのを予防することを示す。
【0101】
本発明の態様は、皮膚の外見を改善することおよび／または健全な皮膚を維持することに関する。本発明のさらなる態様は、ざ瘡、脂性肌、進行性黄斑メラニン減少症(Barnardら、2016)、ふけ症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎および酒さからなる群から選択される状態を処置または予防することに関する。
【0102】
対象
本明細書に記載の組成物はヒトまたは非ヒト対象に投与され得る。いくつかの実施態様において、対象はざ瘡を有するもしくはざ瘡を発症するリスクを有するヒトまたは非ヒトである。いくつかの実施態様において、対象はヒトである。いくつかの実施態様において、対象は家庭用ペット、例えばネコまたはイヌのような飼育動物である。いくつかの実施態様において、対象はウシ、ヤギ、ウマ、ブタまたはヒツジのような家畜である。皮膚を有するあらゆる動物は、本発明の態様に適合し得ると理解されるべきである。
本明細書に記載の組成物はヒトまたは非ヒト対象に投与され得る。いくつかの実施態様において、対象はざ瘡を有するもしくはざ瘡を発症するリスクを有するヒトまたは非ヒトである。いくつかの実施態様において、対象はヒトである。いくつかの実施態様において、対象は家庭用ペット、例えばネコまたはイヌのような飼育動物である。いくつかの実施態様において、対象はウシ、ヤギ、ウマ、ブタまたはヒツジのような家畜である。皮膚を有するあらゆる動物は、本発明の態様に適合し得ると理解されるべきである。
【0103】
いくつかの実施態様において、ざ瘡を有する対象は炎症性病変および／または非炎症性病変を有する。いくつかの実施態様において、多数の非炎症性病変を有するが選択される。いくつかの実施態様において、非炎症性病変の数に基づいて無作為化される。
【0104】
有効量
本明細書に記載の組成物は、有効量で投与される。用語、本発明の組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量をいう。例えば、ざ瘡を処置するための有効量の組成物は、少なくとも１つのざ瘡の症状を改善する(例えば病変における減少および改善)ために十分なその量である。有効量は、任意の特定の用途についての有効量は、処置される状態、投与される特定の組成物、対象の体格または状態の重篤度のような因子により変化し得る。当業者は過度の実験を必要とすることなく、経験的に有効量を決定できる。
本明細書に記載の組成物は、有効量で投与される。用語、本発明の組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量をいう。例えば、ざ瘡を処置するための有効量の組成物は、少なくとも１つのざ瘡の症状を改善する(例えば病変における減少および改善)ために十分なその量である。有効量は、任意の特定の用途についての有効量は、処置される状態、投与される特定の組成物、対象の体格または状態の重篤度のような因子により変化し得る。当業者は過度の実験を必要とすることなく、経験的に有効量を決定できる。
【0105】
組成物
化粧または医薬組成物を含む局所投与のための組成物は、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、エアロゾルスプレー剤を含むスプレー剤、坐剤、液剤、血清剤または粉剤を含む。いくつかの実施態様において、製剤は２成分の分配システムである。さらに、従来の薬学的担体、液状、粉末状もしくは油状基剤または増粘剤が、局所投与用医薬製剤において使用され得る。このような成分の例は、多様なヒドロキシル化された化合物、例えばプロピレングリコール、エチルアルコール、グリセリンおよびブチレングリコールのようなモノマー性グリコール、ポリグリセリルメタリレートのようなポリマー性保湿剤、パルミチン酸およびステアリン酸の誘導体、脂肪酸のトリグリセリド、ラノリン、植物または鉱油ならびにワックスを含む。
化粧または医薬組成物を含む局所投与のための組成物は、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、エアロゾルスプレー剤を含むスプレー剤、坐剤、液剤、血清剤または粉剤を含む。いくつかの実施態様において、製剤は２成分の分配システムである。さらに、従来の薬学的担体、液状、粉末状もしくは油状基剤または増粘剤が、局所投与用医薬製剤において使用され得る。このような成分の例は、多様なヒドロキシル化された化合物、例えばプロピレングリコール、エチルアルコール、グリセリンおよびブチレングリコールのようなモノマー性グリコール、ポリグリセリルメタリレートのようなポリマー性保湿剤、パルミチン酸およびステアリン酸の誘導体、脂肪酸のトリグリセリド、ラノリン、植物または鉱油ならびにワックスを含む。
【0106】
驚くべきことに、ここにおいて、皮膚に非病原性アクネ菌株を確立するための有効な方法は、複数の菌株混合物内にあることが見出された。菌株混合物内で、増殖の遅い菌株が皮膚に確立され得る。いくつかの実施態様において、菌株は、得られた皮膚に確立された菌株が低いリノール酸イソメラーゼ活性を有するように選択される。天然の状況において、新しい菌株が皮膚マイクロバイオームに時々追加されるが(Ohら、2016)、高いイソメラーゼ活性を有する集団が低いイソメラーゼ活性を有する集団に置き換わることはないと考えられる。本明細書に記載のアプローチ(殺菌および接種の組合せを含む)は、低いイソメラーゼ活性を有する集団による高いイソメラーゼ活性を有する集団の天然ではない置き換えを提供する。
【0107】
本明細書に開示されるように、非病原性アクネ菌Ｋ８株のような、いくつかの増殖が遅い菌株は、菌株混合物中でより効率的に増殖し、いくつかの実施態様において菌株混合物中で優占種となることが、予想外に見出された。従って、いくつかの実施態様において、種々のアクネ菌株の混合物は、増殖が遅い菌株を他の増殖が速い菌株と混合物ことにより、皮膚を増殖が遅い菌株をより効率的にコロニー形成させるために使用され得る。
【0108】
いくつかの実施態様において、組成物は細菌数を安定化するための培地を含む。培地は純水、ＰＢＳ、ペプトンおよび／または希釈したもしくは希釈していない適切な増殖培地またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施態様において、細菌組成物(例えば、ゲル)は、細菌の安定化を助ける低い割合のペプトンを含む。いくつかの実施態様において、細菌組成物におけるペプトンの割合は、約０.０５％または約０.１％である。ペプトンの割合は、０.００５％～１％、または０.０５％～１％の範囲であり得る。例えば、ペプトンの割合は約０.００５、０.００６％、０.００７％、０.００８％、０.００９％、０.０１％、０.０２％、０.０３％、０.０４％、０.０５％、０.０６％、０.０７％、０.０８％、０.０９％、０.１％、０.２％、０.３％、０.４％、０.５％、０.６％、０.７％、０.８％、０.９％または１.０％であり得る。いくつかの実施態様において、ペプトンの割合は０.００５％未満である。いくつかの実施態様において、ペプトンの割合は１％より大きい。いくつかの実施態様において、ペプトンの割合は約０.２５％である。
【0109】
他の実施態様において、適切な増殖培地がペプトンの代わりに使用される。
【0110】
いくつかの実施態様において、ペプトンの供給源はカゼインに由来し、例えばカゼイン由来のトリプシン消化ペプトンである。しかしながら、ペプトンのあらゆる形態または供給源は、本発明の態様に適合し得ると理解されるべきである。例えば、いくつかの実施態様において、ペプトンはトリプシン消化物ではなく、酸分解物である。いくつかの実施態様において、ペプトンは肉に由来する。
【0111】
いくつかの実施態様において、組成物はｐＨの安定化を助けるための緩衝成分を含む。いくつかの実施態様において、ｐＨは４.５～８である。例えば、ｐＨは約４.５、４.６、４.７、４.８、４.９、５.０、５.１、５.２、５.３、５.４、５.５、５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９または８.０(中間の任意の値を含む)であり得る。いくつかの実施態様において、ｐＨは約７.０である。
【0112】
緩衝剤の非限定的な例は、ＡＣＥＳ、アセテート、ＡＤＡ、水酸化アンモニウム、ＡＭＰ(２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール)、ＡＭＰＤ(２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール)、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ビス－トリス、ビス－トリスプロパン、ボレート、ＣＡＢＳ、カコジレート、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、カーボネート(ｐＫ１)、カーボネート(ｐＫ２)、ＣＨＥＳ、シトレート(ｐＫ１)、シトレート(ｐＫ２)、シトレート(ｐＫ３)、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、エタノールアミン、ホルメート、グリシン(ｐＫ１)、グリシン(ｐＫ２)、グリシルグリシン(ｐＫ１)、グリシルグリシン(ｐＫ２)、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ヒスチジン、ヒドラジン、イミダゾール、マレート(ｐＫ１)、マレート(ｐＫ２)、マレアート(ｐＫ１)、マレアート(ｐＫ２)、ＭＥＳ、メチルアミン、ＭＯＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ホスフェート(ｐＫ１)、ホスフェート(ｐＫ２)、ホスフェート(ｐＫ３)、ピペラジン(ｐＫ１)、ピペラジン(ｐＫ２)、ピペリジン、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、プロピオン酸、ピリジン、ピロホスフェート、スクシネート(ｐＫ１)、スクシネート(ｐＫ２)、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、タウリン(ＡＥＳ)、ＴＥＳ、トリシン、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびＴｒｉｚｍａ(トリス)を含み得る。
【0113】
いくつかの実施態様において、製剤は増粘剤である。増粘剤の非限定的な例は、ヒドロキシエチルセルロース(例えばＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標))、デンプン、アラビアゴムのようなゴム、カオリンもしくは他の粘土、水和ケイ酸アルミニウム、フュームドシリカ、カルボキシビニルポリマー、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたは他のセルロース誘導体、エチレングリコールモノステアレートおよびアルギン酸ナトリウムを含み得る。
【0114】
いくつかの実施態様において、増粘剤はヒドロキシエチルセルロースである。いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースはＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)(Ａｓｈｌａｎｄ社)を含む。いくつかの実施態様において、ＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)はＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ＨＸ(Ｃａｅｓａｒ＆Ｌｏｒｅｔｚ ＧｍｂＨ、注文番号４４８２、ＣＡＳ：９００４－６２－０）またはＮＡＴＲＯＳＯＬ（登録商標）Ｇ（Ｃａｅｓａｒ＆Ｌｏｒｅｔｚ ＧｍｂＨ、注文番号４４８４、ＣＡＳ：９００４－６２－０)である。ヒドロキシエチルセルロースのあらゆる形態は、本発明の態様と適合し得ると理解されるべきである。いくつかの実施態様において、粘性型はＨＨＲ－Ｐ、ＨＨ、Ｈ４、Ｈ、ＭＨ、Ｍ、Ｋ、Ｇ、ＥまたはＬである。
【0115】
いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースのような増粘剤の濃度は、約１％～５％である。例えば、濃度は約１％、約１.１％、約１.２％、約１.３％、約１.４％、約１.５％、約１.６％、約１.７％、約１.８％、約１.９％、約２.０％、約２.１％、約２.２％、約２.３％、約２.４％、約２.５％、約２.６％、約２.７％、約２.８％、約２.９％、約３.０％、約３.１％、約３.２％、約３.３％、約３.４％、約３.５％、約３.６％、約３.７％、約３.８％、約３.９％、約４.０％、約４.１％、約４.２％、約４.３％、約４.４％、約４.５％、約４.６％、約４.７％、約４.８％、約４.９％または約５.０％であり得る。他の実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースのような増粘剤の濃度は、１％未満または５％より高い。いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースのような増粘剤の濃度は、約１.５％である。いくつかの実施態様において、ヒドロキシエチルセルロースのような増粘剤の濃度は、約２.５％である。
【0116】
いくつかの実施態様において、組成物は１以上の生存アクネ菌株を少なくとも１０４～１０９／ｍｌのコロニー形成単位(ＣＦＵ)で含む。例えば、ＣＦＵは少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または１０９／ｍｌより大きくてよい。いくつかの実施態様において、全てのアクネ菌株は少なくとも１０４～１０９／ｍｌのコロニー形成単位(ＣＦＵ)で組成物中に存在する。いくつかの実施態様において、細菌組成物は、室温で少なくとも３ヶ月を超えて、安定なＣＦＵを示す。いくつかの実施態様において、ＣＦＵ数は保存初期に短期間変動し(例えば、２週間)、その後安定化する。
【0117】
いくつかの実施態様において、組成物は約２.５％の増粘剤(例えばＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標)ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ))；約０.２５％のペプトン(例えばカゼイン由来のトリプシン分解ペプトン)；および約１０４～１０９／ｍｌのＣＦＵの２以上の生存アクネ菌株(例えば、約１０７／ｍｌの各生存アクネ菌株)を含む。
【0118】
本発明の態様は、種々の生存アクネ菌株の混合物を含む組成物に関する。混合物は２以上の菌株を含む。いくつかの実施態様において、組成物は少なくとも２種の異なる生存アクネ菌株を含む。２種の異なる菌株は、同等の濃度または異なる濃度で存在し得る。いくつかの実施態様において、組成物は、アクネ菌株Ｃ３とアクネ菌株Ｋ８の２種の菌株混合物を含む。特定の実施態様において、両方の菌株は同等の濃度で存在する。特定の実施態様において、両方の菌株は約５ｘ１０６／ｍｌのＣＦＵで存在する。
【0119】
いくつかの実施態様において、組成物は、少なくとも４種の異なる生存アクネ菌株を含む。特定の実施態様において、組成物はアクネ菌株Ｃ３、アクネ菌株Ａ５、アクネ菌株Ｆ４およびアクネ菌株Ｋ８の４種の混合物を含む。４種の異なる菌株は、同等の濃度または異なる濃度で存在し得る。特定の実施態様において、菌株Ｃ３、Ａ５、Ｆ４およびＫ８の相対濃度はそれぞれ、約５５％、３０％、１０％および５％である。いくつかの実施態様において、菌株Ｃ３、Ａ５、Ｆ４およびＫ８についてのＣＦＵ値はそれぞれ、約５.５ｘ１０６／ｍｌ、約５.５ｘ１０６／ｍｌ、約１ｘ１０６／ｍｌおよび約５ｘ１０５／ｍｌである。
【0120】
いくつかの実施態様において、各生存アクネ菌細菌株は、少なくとも組成物の約５％を構成する。
【0121】
いくつかの実施態様において、組成物はサリチル酸をさらに含む。いくつかの実施態様において、組成物は０.０５～１０％のサリチル酸を含む。例えば、組成物は約０.０５、約０.１０％、約０.１５％、約０.２０％、約０.２５％、約０.３０％、約０.３５％、約０.４０％、約０.４５％、約０.５０％、約０.５５％、約０.６０％、約０.６５％、約０.７０％、約０.７５％、約０.８０％、約０.８５％、約０.９０％、約０.９５％、約１.０％、約１.５％、約２.０％、約２.５％、約３.０、約３.５％、約４.０％、約４.５％、約５.０％、約５.５％、約６.０％、約６.５％、約７.０％、約７.５％、約８.０％、約８.５％、約９.０％、約９.５％または１０％のサリチル酸を含み得る。他の実施態様において、組成物は０.０５％未満のサリチル酸または１０％より多くのサリチル酸を含む。いくつかの実施態様において、長期間顔に保持される組成物において、サリチル酸の割合は２％未満または２％と同等である。いくつかの実施態様において、顔から洗い流され、長期間顔に保持されていない組成物において、サリチル酸の割合は３％未満または３％と同等である。驚くべきことに、アクネ菌株はサリチル酸により阻害されないため、皮膚状態(例えば、ざ瘡またはふけ)の処置のための本明細書に記載の組成物中にサリチル酸を含有させることができる。
【0122】
いくつかの実施態様において、細菌組成物は１以上の抗炎症性化合物と組み合わせられる。いかなる理論にも縛られることを願わないが、抗炎症性化合物は、短時間で炎症性病変を減少させ得るが、細菌組成物は根底にある問題に対処し得て、長期効果をもたらし得る。
【0123】
いくつかの実施態様において、組成物は参照により包含される米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような皮膚軟化剤を含む。皮膚軟化剤の非限定的な例は、ステアリルアルコール、モノリシノレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，３－ジオール、ミンクオイル、セチルアルコール、イソステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸、パルミチン酸イソブチル、ステアリン酸イソセチル、オレイルアルコール、ラウリン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、オレイン酸デシル、オクタデカン－２－オール、イソセチルアルコール、パルミチン酸セチル、ジメチルポリシロキサン、セバシン酸ジ－ｎ－ブチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ポリエチレングリコール(polthylene glycol)、トリエチレングリコール、ラノリン、ゴマ油、ココナッツ油、落花生油、ヒマシ油、アセチル化ラノリンアルコール、石油、鉱油、ミリスチン酸ブチル、イソステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸イソプロピル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸ミリスチルを含む。
【0124】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるようなタンパク質安定化が、組成物中に含まれる。非限定的な例は、グリセロール、エチレンジアミン四酢酸、システインならびにロイペプチン、ペプスタチン、アンチパインおよびシスタチンのようなプロテイナーゼ阻害剤を含む。
【0125】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような湿潤剤が、組成物中に含まれる。湿潤剤の非限定的な例は、グリセリン、ソルビトール、２－ピロリドン－５－カルボン酸ナトリウム、可溶性コラーゲン、フタル酸ジブチルゼラチンを含む。
【0126】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような収斂剤が、組成物中に含まれる。非収斂剤の非限定的な例は、アルニカの花またはその抽出物、低級アルキルアルコール、マンサク、ホウ酸、乳酸、メントール(methol)、カンファー、フェノールスルホン酸亜鉛、酢酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび塩化亜鉛または硫酸亜鉛を含む。
【0127】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような色素は組成物中に含まれる。色素の非限定的な例は、二酸化チタンオキシド、雲母、酸化鉄、バリウムレーキ、カルシウムレーキ、アルミニウムレーキ、オキシ塩化ビスマス、ジルコニウムレーキおよび酸化カルシウムを含む。
【0128】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような着色剤が、組成物中に含まれる。着色剤の非限定的な例は、シコニン、β－カロテン、パプリカ、紅麹菌、サフラワーレッド、サフラワーイエロー、赤キャベツ色素、ムラサキイモ色素、リコペン、カカオ色素、ブドウ色素、コチニール、ラック色素、ビーツ赤、ヘマテイン、赤色２１５号、赤色２１８号、赤色２２３号、赤色２２５号、橙色２０１号、橙色２０６号、黄色２０１号、緑色２０２号および紫色２０１号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、赤色１０４(１)号、赤色１０５(１)号、赤色１０６号、黄色４号、黄色５号、緑色３号、青色１号、青色２号、赤色２０１号、赤色２１３号、赤色２１４号、赤色２２７号、赤色２３０(１)号、赤色２３０(２)号、赤色２３１号、赤色２３２号、橙色２０５号、橙色２０７号、黄色２０２(１)号、黄色２０２(２)号、黄色２０３号、緑色２０１号、緑色２０４号、緑色２０５号、青色２０２号、青色２０３号、青色２０５号および褐色２０１号を含む。
【0129】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるようなＵＶ－ＡおよびＵＶ－Ｂ照射フィルター、日焼け止め、フリーラジカルブロッカー、ビタミン抽出物または抗酸化剤が、組成物中に含まれる。
【0130】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような界面活性剤または溶媒が、組成物中に含まれる。溶媒の非限定的な例は、水、エチルアルコール、トルエン、塩化メチレン、イソプロパノール、ｎ－ブチルアルコール、ヒマシ油、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびテトラヒドロフランを含む。ｉ)脂肪酸の金属塩またはアルカノールアミン塩(例えばラウリン酸ナトリウムおよびトリエタノールアミンオレイン酸；アルキルベンゼンスルホン、例えばトリエタノールアミンドデシルベンゼンスルホン酸塩；アルキルスルフェート、例えばラウリル硫酸ナトリウム；アルキルエーテル硫酸塩、例えばラウリルエーテル硫酸ナトリウム(２～８ＥＯ)；スルホコハク酸塩、例えばジオクチルスルホンコハク酸ナトリウム；硫酸モノグリセリド、例えばモノステアリン酸グリセリルモノ硫酸ナトリウム；イソチオネート、例えばナトリウムイソチオネート；メチルタウリド、例えばＩｇｅｐｏｎ Ｔ；アシルサルコシン、例えばミリスチルサルコシンナトリウム；アシルペプチド、例えばＭａｙｐｏｎｓおよびｌａｍｅｐｏｎｓ；アシルラクチレート、ポリアルコキシル化エーテルグリコレート、例えばｔｒｉｄｅｃｅｔｈ－７ カルボン酸；ホスフェート、例えばナトリウムジラウリルホスフェートのようなアニオン性界面活性剤；カチオン性界面活性剤、例えばサパミン塩酸塩のようなアミン塩；四級アンモニウム塩、例えばＱｕａｔｅｒｎｉｕｍ ５、Ｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ ３１およびＱｕａｔｅｒｎｉｕｍ １８；両性界面活性剤、例えばミラノールのようなイミダゾール化合物、例えばＭｉｒａｎｏｌ；Ｎ－アルキルアミノ酸、例えばコカミノプロピオン酸ナトリウムおよびアスパラギン誘導体；ベタイン、例えばコカミドプロピルベタイン；ノニオン性界面活性剤、例えばオレイン酸エタノールアミドのような脂肪酸アルカノールアミド；エステルまたはポリアルコール、例えばＳｐａｎ；ポリグリセロールエステル、例えば脂肪酸および１個または数個のＯＨ基を用いてエステル化されたポリグリセロールエステル；ポリアルコキシル化誘導体、例えばポリオキシ：ポリオキシエチレンステアリン酸塩；エーテル、例えばポリオキシエーテルラウリルエーテル；エステルエーテル、例えばＴｗｅｅｎ；アミンオキシド、例えばココナッツおよびドデシルジメチルアミンオキシドを含む。いくつかの実施態様において、１以上の界面活性剤または溶媒が含まれる。
【0131】
いくつかの実施態様において、参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような防腐剤、防腐性、色素または着色剤、芳香剤、マスキング剤および担体(例えば水および低級アルキル、アルコール)が、組成物に含まれる。
【0132】
組成物が粉末であるいくつかの実施態様において、粉末は参照により包含させる米国特許第５，５２５，３３６号に開示されるような胡粉、タルク、フラー土、コロイド状二酸化ケイ素、ポリアクリル酸ナトリウム、テトラアルキルおよび／またはトリアルキルアリールアンモニウムスクメタイトおよび化学修飾されたケイ酸アルミニウム・マグネシウムを含み得る。いくつかの実施態様において、組成物は香料を含む。
【0133】
本発明の組成物は、投与されるとき、治療的に有効な、薬学的に許容される量で、薬学的に許容される製剤として適用される。いずれかの本発明の組成物は、治療有効量で対象に投与され得る。対象に投与されるとき、有効量は処置される対象の特定の状態または所望の結果に依存する。治療的有効量は、例えば、本明細書に記載するような因子を使用しておよび通常の範囲内の試験を用いて、当業者により決定される。
【0134】
いくつかの実施態様において、１以上の次の物質：局所抗生物質(例えば、クリンダマイシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニダゾール)、経口抗生物質(例えばテトラサイクリン、エリスロマイシン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン)、局所レチノイド(例えば、アダパレン、タザロテン、トレチノイン)、経口レチノイド(例えば、イソトレチノイン)、過酸化ベンゾイル、サリチル酸、硫黄、アゼライン酸および抗微生物ペプチドおよびその誘導体(例えば、リポヘキサペプチド ＨＢ１３４５、オリゴペプチド－１０、マガイニン(例えば、ペキシガナン)、プロテグリン(例えば、イセガナン)、インドリシジン(例えば、オミガナン、ＭＢＩ ５９４ＡＮ)、ヒスタチン(例えば、Ｐ１１３ Ｐ１１３Ｄ)、ヒト殺菌／透過性増加タンパク質(例えば、ＸＭＰ.６２９、ニュープレックス)、カテリシジン(例えば、カテリシジン－ＢＦ)が、本明細書に記載の組成物に含まれる。
【0135】
いくつかの実施態様において、組成物は、クリーム剤または軟膏剤のような局所形態で投与される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物の投与は、組合せ処置の部分を構成する、または対象の皮膚のより早期の処置の後に行われる。
【0136】
適用される組成物の適切な量は、多くの種々の因子に依存し得て、通常の試験を通して当業者により決定され得る。考慮すべきいくつかの非限定的な因子は、薬剤の生物活性およびバイオアベイラビリティ、投与方式、半減期および処置される対象の特徴を含む。
【0137】
いくつかの実施態様において、細菌組成物は感受性の皮膚を有する対象には適用されない。いくつかの実施態様において、ざ瘡の処置または予防のために細菌組成物を使用するとき、処置される対象は不必要な日光曝露を回避し、日焼け止め剤を使用する。いくつかの実施態様において、処置される皮膚が発赤、腫脹、火傷、掻痒または剥皮により特徴付けられる炎症を起こしているならば、製品は頻度を少なくして、またはより低い濃度で使用される。
【0138】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物は、健全な皮膚を維持するために、対象の皮膚に投与される。組成物は１回または複数回投与され得る。いくつかの実施態様において、組成物は規則的な間隔で投与されるが、他の実施態様において、組成物は不規則な間隔で投与される。例えば、組成物は約１５分毎、約３０分毎、約１時間毎、約２時間毎、約３時間毎、約４時間毎、約５時間毎、約６時間毎、約７時間毎、約８時間毎、約９時間毎、約１０時間毎、約１１時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約３日毎、約４日毎、約５日毎、約１週毎、約２週毎、約３週毎、約４週毎、約５週毎、約６週毎、約７週毎、約８週毎またはそれ以上または以下の頻度(中間の全ての値を含む)で投与され得る。
【0139】
いくつかの実施態様において、組成物は、当業者により認識されるように、殺菌または抗生物質のような標準的なざ瘡処置もまた受けるまたは以前に受けていた対象に投与される。いくつかの実施態様において、組成物は標準的なざ瘡処置と並行して投与される。他の実施態様において、組成物は標準的なざ瘡処置後に投与される。組成物は先の処置の直後に投与され得るまたは、先の処置から時期を遅らせて組成物を投与し得る。先の処置後、組成物は１回または複数回投与される。いくつかの実施態様において、組成物は先の処置後に規則的な間隔で投与されるが、他の実施態様において、組成物は先の処置後に不規則な間隔で投与される。例えば、組成物は約１５分毎、約３０分毎、約１時間毎、約２時間毎、約３時間毎、約４時間毎、約５時間毎、約６時間毎、約７時間毎、約８時間毎、約９時間毎、約１０時間毎、約１１時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約３日毎、約４日毎、約５日毎、約１週間毎、約２週毎、約３週毎、約４週毎、約５週毎、約６週毎、約７週毎、約８週毎またはそれ以上または以下の頻度で(中間の全ての値を含む)、先の処置後に投与され得る。
【0140】
本発明の態様は、細菌株、例えば表皮ブドウ球菌を変異させることを包含する。変異は、いくつかの実施態様において、アミノ酸置換を選択することにより、または核酸またはポリペプチドにおける選択部位の無作為変異誘発により行われ得る。変異がバリアントポリペプチドに所望の性質を提供するか否かを決定するために、１以上の活性についてバリアントポリペプチドを発現させ、試験し得る。さらなる変異が、ポリペプチドのアミノ酸配列について無変化であるバリアントに対して(または非バリアントポリペプチドに対して)行われ得るが、これは特定の宿主における翻訳に好ましいコドンを提供する。例えば、大腸菌(E. coli)における核酸の翻訳に好ましいコドンは、当業者によく知られている。ポリペプチドの発現を強化するために、さらなる他の変異が遺伝子の非コード配列またはｃＤＮＡクローンに対して行われ得る。バリアントポリペプチドの活性は、バリアントポリペプチドを細菌または真核発現ベクターにエンコードする遺伝子をクローニングすること、適切な宿主細胞をベクターに導入すること、バリアントポリペプチドを発現させることおよび本明細書に記載のポリペプチドの機能的能力について試験することにより、試験され得る。
【0141】
本発明による細菌細胞は、富培地または最少培地を含む多様な培地において培養され得る。当業者により理解されるように、通常の最適化は多様なタイプの培地の使用を可能にする。培地は糖源を含む種々の付加的成分を追加され得る。追加成分のいくつかの限定的な例は、グルコース、アミノ酸、抗生物質およびＡＴＣＣ Ｔｒａｃｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含む。同様に、培地の他の態様および本発明の細胞の増殖条件は、通常の試験を通して最適化され得る。例えば、ｐＨ、温度および組成物中の成分の濃度は、最適化され得る因子の非限定的な例である。
【0142】
本発明に関連する増殖細胞に使用される液体および／または固体培養物は、当分野で知られ、使用されるいずれかの培養容器に収容される。
【0143】
いくつかの実施態様において、細菌株はバッチで増殖させる。いくつかの実施態様において、細菌株は発酵槽で増殖させる。いくつかの実施態様において、細菌株を含む組成物は包装される。特定の実施態様において、細菌株を含む組成物は経腸シリンジまたは小袋に包装される。
【0144】
キット
本発明はまた、キットにおいて上記組成物のいずれかを提供する。いくつかの実施態様において、キットは生存細菌を収容した容器または凍結乾燥させた生存細菌を収容した容器を含む。キットは、ペプトンのような培地を含む第二の容器を含み得る。いくつかの実施態様において、抗生物質、殺菌剤(例えば、ＢＰＯ)および／またはサリチル酸を含み得る。いくつかの実施態様において、抗生物質、殺菌剤および／またはサリチル酸は、生存細菌を含む組成物の提供前に皮膚を前処置するために使用される。キットはまた、組成物を投与するための指示書を含む。特定の実施態様において、指示書は細菌株と組成物の他の成分を混合させるために提供される。いくつかの実施態様において、キットは対象に細菌組成物を適用するためのアプリケーターを含む。
本発明はまた、キットにおいて上記組成物のいずれかを提供する。いくつかの実施態様において、キットは生存細菌を収容した容器または凍結乾燥させた生存細菌を収容した容器を含む。キットは、ペプトンのような培地を含む第二の容器を含み得る。いくつかの実施態様において、抗生物質、殺菌剤(例えば、ＢＰＯ)および／またはサリチル酸を含み得る。いくつかの実施態様において、抗生物質、殺菌剤および／またはサリチル酸は、生存細菌を含む組成物の提供前に皮膚を前処置するために使用される。キットはまた、組成物を投与するための指示書を含む。特定の実施態様において、指示書は細菌株と組成物の他の成分を混合させるために提供される。いくつかの実施態様において、キットは対象に細菌組成物を適用するためのアプリケーターを含む。
【0145】
本発明は以下の実施例によりさらに説明され、これは決してさらなる限定と理解されるべきではない。本願を通じて引用される全ての引用文献(文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む)の全体的な内容は、参照により本明細書に明確に包含させる。
【実施例】
【0146】
実施例１：種々のアクネ菌株は種々のレベルのリノール酸イソメラーゼ活性またはｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸濃度の最終閾値を有する
複数の異なるアクネ菌株のリノール酸イソメラーゼ活性を特徴付けるために、試験を実施した。アクネ菌株はリノール酸を含まない増殖培地で増殖させた(Rossonら、2004)。Ｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を増殖培地に添加し、その後脂肪酸メチルエステルへの変換およびその後のガスクロマトグラフィーを含むアッセイを用いて、種々の時点でのｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体およびｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の量を決定した。不飽和脂肪酸のｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体を区別するために確立された方法がKramerら、2004に記載され、これをその全体における参照により本明細書に包含させる。
複数の異なるアクネ菌株のリノール酸イソメラーゼ活性を特徴付けるために、試験を実施した。アクネ菌株はリノール酸を含まない増殖培地で増殖させた(Rossonら、2004)。Ｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を増殖培地に添加し、その後脂肪酸メチルエステルへの変換およびその後のガスクロマトグラフィーを含むアッセイを用いて、種々の時点でのｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体およびｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の量を決定した。不飽和脂肪酸のｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体を区別するために確立された方法がKramerら、2004に記載され、これをその全体における参照により本明細書に包含させる。
【0147】
驚くべきことに、培地および接種条件の選択が、これらの試験を行うための重要な可変因子であることが分かった。培地におけるリノール酸の減少を測定するために、いくつかの他のタイプの培地においてリノール酸沈殿が観察されたため、強化クロストリジウム培地(ＲＣＭ)を使用した。
【0148】
ｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の分解を示す結果を図１に示す。試験の最初の４８時間で大部分の分解が生じる、極めて迅速なｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の減少が観察された。菌株Ａ１は培地からリノール酸を完全に枯渇させるが、菌株Ｃ３は驚くべきことに、リノール酸の分解が遅く、平衡濃度に達することもまた、観察された。いかなる理論にも縛られることを願わないが、ざ瘡患者は通常、皮脂において、健全な対象と比較して低いリノール酸濃度を有する。従って、分解が遅い菌株の集団は皮脂に高いリノール酸濃度をもたらし、これは有利であり得る。
【0149】
極めて少量のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体が、ＲＣＭのような富培地で検出され、これはＲＣＭのような富培地は脂腺において遭遇する環境に存在しないからであると考えられる。特に、グルコースは通常、脂腺では有限であり、細菌の代謝プログラムに影響し得る(ImおよびHoopes、1974)。アクネ菌について使用される全ての先の培地(例えば、ＲＣＭ、ＢＨＩ、ＧＡＭ)は少なくとも３ｇ／Ｌのグルコースを含むが、一方で脂腺において、グルコースは比較的低い濃度(例えば、約０.６～１.４ｇ／ｋｇ乾燥重量(ImおよびHoopes、1974))で生じるのみである。
【0150】
従って、全てのアクネ菌株が増殖するグルコース無添加培地をここで設計し、１１種のアクネ菌株を試験し、特徴付けるために使用した。細菌が遭遇する天然の環境に類似するため、細菌の増殖およびｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の生成の測定を可能にするペプトンおよび酵母抽出物(ＰＹ－培地)から最小培地を確立した。
【0151】
最少培地においてサンプルを振盪させることを含めてｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の産生を評価するための条件を開発した。複数の菌株を用いて行われた経時的分析を図３に示す。個々の菌株の増殖が異なるため、読み取りは、寒天プレート上のＣＦＵ数により確認された、６００ｎｍで測定された光学密度(ＯＤ)により標準化補正した。ＯＤを標準化するために、各培養物のＯＤを各菌株のバイオマスについての測定値として使用した。全てのＯＤ測定値を、次いで最高測定値で除して、相対的な増殖を表す因子を導いた。次いで、測定されたｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸濃度を、核菌株についてのこの因子で乗じた。根底にある前提は、高い光学密度まで増殖する菌株は、増殖が遅い菌株より少ない細胞あたりのイソメラーゼを産生するはずであるとのことである。補正したｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体の濃度を図２に示す。ざ瘡に関連する菌株Ａ１(McDowellら、2012、PLoS ONE 7、e41480)は多くのｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体を産生した。極めて少量のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸異性体を産生する菌株は、Ｃ３、Ｃ１、Ｆ４、Ａ５、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ８およびＬ１であった。Ｋ株およびＬ１株は、ほとんど増殖を示さなかった。これらの菌株はまた、富培地において極めて遅い増殖をし、天然にほとんど存在しない。下で検討されるように、予想外に、他の菌株との特定の組合せにおいて、Ｋ８株は改善した増殖を示した。
【0152】
材料および方法
各菌株を前培養物として増殖させ、前培養物をＯＤにより標準化した。各々の試験前に、１.７ｍＭのｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を含む新鮮培地を調製した。培養物をその後、静置または２２０ｒｐｍで振盪して、３７℃でインキュベートした。サンプルを種々の時点で採取し、直に脂質抽出およびガスクロマトグラフィー(ＧＣ)解析まで－８０℃で凍結した。
各菌株を前培養物として増殖させ、前培養物をＯＤにより標準化した。各々の試験前に、１.７ｍＭのｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸を含む新鮮培地を調製した。培養物をその後、静置または２２０ｒｐｍで振盪して、３７℃でインキュベートした。サンプルを種々の時点で採取し、直に脂質抽出およびガスクロマトグラフィー(ＧＣ)解析まで－８０℃で凍結した。
【0153】
ＧＣ分析について、培地中の脂質を抽出し、それらのメチルエステルに変換した。このために、１００μｌの培地サンプルを９００μｌのＨ２Ｏで希釈した。２０μｇのヘプタデカン酸を内部標準として添加し、完全な脂質フラクションを酢酸エチルで抽出した。有機相をその後分離し、窒素下で乾燥させた。脂質をその後、１４％ 三フッ化ホウ素－メタノール溶液(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号Ｂ１２５２)を用いて変換し、ヘキサンで抽出し、窒素下で乾燥させ、１００μｌのヘキサン中に再懸濁した。その後、ＦＩＤ検出器を備えたＶａｒｉａｎ ＣＰ ３８００ガスクロマトグラフで、サンプルを分析した。使用したカラムは、ＣＰ－ＷＡＸ ５８(ＦＦＡＰ)キャピラリーカラム ２５ｍｘ０.３２ｍｍ Ｉ.Ｄ(Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州)であり、温度プログラムは１２０℃(１分)－１２０℃～２５０℃(２０℃／分)－２５０℃(１２分)であった。
【0154】
実施例２：細菌株混合物の最適化
実施例１は、単離したアクネ菌株がそれらの増殖行動において有意に異なったことを示す。一般に、クレードＩ由来の菌株は増殖が速いことが分かったが、クレードＩＩ由来の菌株は増殖が遅いことが分かった(例えば、図５を参照)。一般に、ざ瘡に関連しないと考えられる菌株は、クレードＩＩに由来することがより多い(LomholtおよびKilian、2010；Yuら)。この遅い増殖は、これらの菌株が、殺菌後に皮膚にコロニー形成する可能性が低いことを示す。クレードＩＩ由来の菌株はまた、ヒト対象においてあまり見られない。天然において、皮膚は増殖が速いクレードＩ由来の菌株によりコロニー形成される傾向がある。対照的に、クレードＩＩ菌株による皮膚のコロニー形成を可能にする菌株混合物が本明細書に記載される。
実施例１は、単離したアクネ菌株がそれらの増殖行動において有意に異なったことを示す。一般に、クレードＩ由来の菌株は増殖が速いことが分かったが、クレードＩＩ由来の菌株は増殖が遅いことが分かった(例えば、図５を参照)。一般に、ざ瘡に関連しないと考えられる菌株は、クレードＩＩに由来することがより多い(LomholtおよびKilian、2010；Yuら)。この遅い増殖は、これらの菌株が、殺菌後に皮膚にコロニー形成する可能性が低いことを示す。クレードＩＩ由来の菌株はまた、ヒト対象においてあまり見られない。天然において、皮膚は増殖が速いクレードＩ由来の菌株によりコロニー形成される傾向がある。対照的に、クレードＩＩ菌株による皮膚のコロニー形成を可能にする菌株混合物が本明細書に記載される。
【0155】
さらなる増殖曲線試験は、２種または４種の菌株混合物が、混合物における最も速い純粋な単離種と同等の速さで増殖することを示した。驚くべきことに、寒天上で５日間増殖させた６種の菌株から成る混合物の組成物を分析したとき、細菌の大部分は個々に増殖させたときに増殖が遅いことが観察されたＫ８株に由来することが分かった(図７)。従って、菌株混合物は、本来増殖が遅く、本来駆逐される可能性のある菌株を含むとしても、有利な増殖性質を有する菌株混合物が生み出され得る。
【0156】
クレードＩのＡ１株は、尋常性ざ瘡に関連することが報告されている(LomholtおよびKilian、2010、PLoS One 5；McDowellら、2012、PLoS ONE 7、e41480)。クレードＩＩ由来の菌株と混合して皮膚を共にコロニー形成するためのクレードＩＡ１由来の菌株を選択するために、ｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸のｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ 異性体への変換基準を菌株の選択のために使用した。防腐剤を有する化粧品および衛生用品の増加する使用は皮膚で優占種となる増殖が速い菌株の自然選択をもたらすため、このような菌株混合物を用いた皮膚のコロニー形成は、一部は自然に起こりにくい。従って、自然に起こるアクネ菌株の移動(例えば、近接した身体の接触による)において、移動した細菌の大部分は、１種の菌株のみに由来する。
【0157】
増殖行動およびｔｒａｎｓ－１０,ｃｉｓ－１２ リノール酸の両方に基づいて、細菌株混合物を含む組成物において使用するための、コロニー形成のための菌株として、Ｃ３株を選択した。その後、皮膚上の組成物の開始濃度を変化させる効果を、試験した。６種の異なる菌株を同量混合させ６種の菌株の１種を過剰に添加した。増殖の５日後または６日後、混合物の組成物をその後評価した。増殖曲線に関するこのデータに基づいて、細菌株混合物を含む組成物中の菌株の濃度を選択した。
【0158】
高濃度(例えば、６０％以下)のクレードＩ由来の菌株を添加し、それらはｃｉｓ－９,ｃｉｓ－１２ リノール酸の低い変換率を示し、中高ＯＤまで増殖し、５日から６日で混合物の相対量が減少を示した。
【0159】
混合物は、所定の菌株が最大で集団の５０％で存在するように調製された。天然では、ほとんどの時間、１種のアクネ菌株は、１個体において観察されたアクネ菌集団の９０％以上で存在する可能性がある。
【0160】
アクネ菌の増殖行動は、いくつかの菌株については開始ＣＦＵ数に大きく依存することが観察された。従って、培養物が定常状態に達した後に、どのようにして混合物における１つの菌の相対的割合が展開するかを調査した。驚くべきことに、菌株が優占種となる根底の動態は、少なくとも一部は細菌の開始量により決定され、菌株により異なることが分かった。
【0161】
前培養物をＲＣＭ培地で増殖させ、遠心分離後、ＰＢＳ中で再懸濁した。培地をＯＤ ０.５に対して標準化した。その後１ｍｌの培地を５０μｌの標準化した懸濁液に接種した。プレートを気密性に密封し、その後培養物をＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋで３７℃でインキュベートした。培養物を３０分ごとに振盪させ、６００ｎｍでのＯＤを測定した。ＲＣＭ培地はＢＤ(ＢＤ／Ｄｉｆｃｏ カタログ番号２１８０８１)から入手した。ＰＹ培地は２％酵母抽出物(Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｙ１６２５－２５０Ｇ)および３％ペプトン(Ｓｉｇｍａ ７０１７２－５００Ｇ)のみから成るカスタム培地である。この培地はグルコースを含まず、それにより、ＲＣＭまたはＢＨＩのような高いグルコース含量を有する富培地よりも、脂腺においてアクネ菌により遭遇するグルコース環境を正確に反映する。
【0162】
図４は、接種５日後または６日後の混合物におけるＣ３菌株の相対量を示す。開始混合物中に高い割合のＣ３が存在するとき、Ｃ３は優占菌株のままである。驚くべきことに、より低いＣ３の開始濃度は、後期定常状態における全体的割合を減少させる。
【0163】
図５は、３７℃でのＲＣＭ培地Ｃ３、Ｆ４、Ｃ１およびＫ８株の増殖曲線を示す。
【0164】
図６は、３７℃でのグルコース無添加ＰＹ培地におけるＣ３、Ｆ４、Ｃ１、Ｋ８株、２種の菌株(Ｃ３株およびＫ８株)の混合物および４種の菌株(Ａ５、Ｃ３、Ｆ４およびＫ８)の混合物の増殖曲線を示す。
【0165】
実施例３：菌株の組合せを用いた競合実験
多様な細菌混合物の相乗効果を決定するために、インビトロ試験を実施した。新しい細菌培養物を－８０℃ストックから取り出し、ＲＣＭ寒天プレート上で増殖させた。寒天プレートから、ＢＨＩ液体培地に接種され、定常状態まで５日間増殖させた。その後培養物を遠心分離(４０００ｇ、４℃で１０分間)により回収し、１.４ｍｌの０.１％ペプトン(カゼイン由来トリプシン分解ペプトン)中に再懸濁した。ペプトン中の細菌懸濁液をその後、０．８のＯＤに対して標準化した。適用前の保存を模倣するために、菌株をペプトン溶液中で室温(ＲＴ)で一晩保存した。翌朝、全ての菌株を等モル濃度で混合し、この混合物をペプトン溶液でさらに１.６倍希釈した。従って、各菌株はストック溶液と比較して、混合物中で１：１０で希釈される。その後、種々の組合せを含む９６ウェルマスタープレートを作製した(表３)。
多様な細菌混合物の相乗効果を決定するために、インビトロ試験を実施した。新しい細菌培養物を－８０℃ストックから取り出し、ＲＣＭ寒天プレート上で増殖させた。寒天プレートから、ＢＨＩ液体培地に接種され、定常状態まで５日間増殖させた。その後培養物を遠心分離(４０００ｇ、４℃で１０分間)により回収し、１.４ｍｌの０.１％ペプトン(カゼイン由来トリプシン分解ペプトン)中に再懸濁した。ペプトン中の細菌懸濁液をその後、０．８のＯＤに対して標準化した。適用前の保存を模倣するために、菌株をペプトン溶液中で室温(ＲＴ)で一晩保存した。翌朝、全ての菌株を等モル濃度で混合し、この混合物をペプトン溶液でさらに１.６倍希釈した。従って、各菌株はストック溶液と比較して、混合物中で１：１０で希釈される。その後、種々の組合せを含む９６ウェルマスタープレートを作製した(表３)。
【表3】
【0166】
これは次の濃度をもたらす(表４)。
【表4】
【0167】
プレートを次のプロトコルに従い回収した。各ウェルについて、１０μｌの無菌ＰＢＳを添加した。短時間のインキュベート後、各ウェルの細菌を再懸濁し、新たなプレートへ移した。細胞を遠心分離によりペレット化し、ＭｉｌｌｉＱ 水で２回洗浄した。ペレットをその後９０μｌの新たに調製した０.０５Ｍ ＮａＯＨ(２０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に１００μｌの３０％ ＮａＯＨ)に再懸濁した。プレートをその後ＰＣＲ機で、６０℃で４５分間インキュベートした。その後、９.２μｌのＴｒｉｓ(ｐＨ ７)および５μｌの上清を添加することにより反応を中和し、２０μｌのＰＣＲ反応液におけるテンプレートとして使用した。ＰＣＲを、集団を特徴付けるためのＳＬＳＴ対立遺伝子を増幅するために行った。使用したプライマー配列は：
ＳＬＳＴ ＦＷ：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴ(配列番号：８１)および
ＳＬＳＴ－ＲＶ：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＧＣＡＴ(配列番号：８２) (Scholzら、2014)
であった。
ＳＬＳＴ ＦＷ：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＴ(配列番号：８１)および
ＳＬＳＴ－ＲＶ：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＧＧＣＡＴ(配列番号：８２) (Scholzら、2014)
であった。
【0168】
κポリメラーゼ(５分 ９５℃；３５サイクル：(９８℃ ２０秒、６２℃ ２５秒、７２℃ ３０秒)；１分 ７２℃)を用いてサンプルを増幅させた。２ラウンドのＰＣＲを用いて配列ライブラリを構築した。第一ラウンドでは、イルミナシーケンシングと適合する配列を含むＳＬＳＴプライマーを使用した。第二ラウンド(１０サイクル)は、単一のイルミナフローセルにおけるシーケンシングのために種々のサンプルをバーコード付けするために使用した。ＰＣＲ反応および３－Ｓ－Ｂｉｏｋｉｔ ＤＮＡ抽出物を、(RohlandおよびReich、2012)に従って製造された磁性粒子を用いて精製した。プロメガＷＩＺＡＲＤ(登録商標) ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップシステムを用いて、指標反応をプールし、アガロースゲルから精製した。その後、最終ライブラリをＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで品質管理し、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０でＫＡＰＡライブラリ定量キットＫＫ４８５４を用いて、ｑＰＣＲにより定量化した。２＊３００Ｂｐ読み取り(ＭＳ－１０２－３００３)を備えたＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３を用いて、イルミナＭｉＳｅｑシーケンシングを行った。
【0169】
社内開発されたコンピュータパイプライン(Ｓ－ジェノタイピング)を用いて、サンプルを分析した。品質フィルター；ｂｗａソフトウェアを用いてサンプルを内部データベースにマッピングし；Ｒ統計言語を用いてデータ処理および可視化を行った。アクネ菌ＳＬＳＴタイプの最新ライブラリをmedbac.dk/slst/pacnesからダウンロードした。
【0170】
本実験は個々の菌株の増殖行動は、混合物としてのそれらの増殖行動と異なることを示した。Ａ５のように単独での増殖が速い菌株が培養物中で優位になると予測されていた。驚くべきことに、他の菌の存在下で増殖させたならば、最終混合物に対して少量でのみ寄与すると予測されていた増殖が遅い菌株(Ｋ８)が、最終バイオマスに対する主な寄与者であった。図７は、ＣＭ寒天における増殖前および５日後の、配列読み取りにより決定された種々のアクネ菌の混合物の相対的な組成物の変化を示す。驚くべきことに、単離菌として使用したとき、増殖が極めて遅いＫ８株は、試験５日目で培養物の大部分を奪取した。試験前、全ての菌株を、それらのＯＤにより、開始培養物におけるバイオマスの１６％といなるように標準化した。試験後、Ｋ８は６９％で最も優勢な菌株であった。また、Ｅ３のみがまたバイオマスにおいてその占有率を増加させることができた。Ｃ３部分は８％まで減少し、一方でＡ５、Ｃ１およびＦ４は１％まで減少した。
【0171】
実施例４：化粧品に見られる一般的な防腐剤であるＤＭＤＭヒダントインおよび安息香酸を用いた単離菌株および菌株混合物についての最小細菌濃度(ＭＢＣ)および最小阻害濃度(ＭＩＣ)の決定
ヒト対象の皮膚における防腐剤を含む化粧品の適用を模倣するために、および対象の皮膚マイクロバイオームに対するそれらの防腐剤の効果を評価するために、実験を行った。単一の菌株または複数の菌株混合物に対する防腐剤の効果の間に何らかの差異があるかどうかを調査した。
ヒト対象の皮膚における防腐剤を含む化粧品の適用を模倣するために、および対象の皮膚マイクロバイオームに対するそれらの防腐剤の効果を評価するために、実験を行った。単一の菌株または複数の菌株混合物に対する防腐剤の効果の間に何らかの差異があるかどうかを調査した。
【0172】
４種の個々のアクネ菌株を、接種材料として別個の培養物中で増殖させた。その後、各培養物をそのＯＤにより標準化し、化粧品に一般的に使用される２つの防腐剤、ＤＭＤＭヒダントインまたは安息香酸を負荷した。各菌株を単独でおよび他の菌株と組合せて試験した。個々の菌株および菌株の組合せを、防腐剤に２４時間曝露させ、そしてその後、防腐剤の最小細菌濃度(ＭＢＣ)および最小阻害濃度(ＭＩＣ)を決定するために寒天上に蒔いた。
【0173】
Ａ５株、Ｃ３株、Ｆ４株およびＫ８株を強化クロストリジウム培地(ＲＣＭ)(Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号２１８０８１、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州)で－８０℃のストックから増殖させた。各菌株について、５０ｍｌのＲＣＭに０．５ｍｌのＯＤ １.０のストックを接種した。細菌を３７℃でインキュベートしながら、一定の間隔でＯＤを測定した。ＭＩＣ試験について、対数期に細菌を収集し、下記のとおり標準化した。ＭＢＣ試験について、細菌を定常期に達するまで増殖させ、次の試験に進める前に３７℃で２４時間さらにインキュベートした。その後、希釈剤としてＲＣＭ培地を用いて、サンプルをＯＤ ０.５に標準化した。
【0174】
ＤＭＤＭヒダントインの希釈標準溶液(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号ＰＨＲ１３５８－１ＭＬ)および安息香酸(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号２４２３８１－２５Ｇ)を、ＲＣＭ培地中でＤＭＤＭヒダントインについて１％、０.２５％、０.１２５％および０.１％、２.５％、０.６３％、０.３１％および０.２５％の濃度およびＲＣＭのみから成るブランク対照として調製した。これらの濃度は化粧品において一般的に使用される量に対応する希釈率を示す。ＤＭＤＭヒダントインはＥＵにより化粧品中に１％までの濃度に制限され、および安息香酸はＦＤＡにより「洗い流す製品」において２.５％および「洗い流さない製品」において０.５％に制限されている。９６ウェルプレート中で曝露させ、各条件を、トリプリケートで試験した。各サンプルについて、防腐剤を含む２００μｌの培地を２０μｌの標準化した細菌溶液とインキュベートした。
【0175】
負荷培地に菌株を別個にまたは混合物として添加した。各菌株について、菌株を別個に添加するときまたは菌株を混合物の成分として添加するとき、同一の全体細菌数(ＯＤ測定により決定される)を使用した。混合物は２種の菌株または４種の菌株で構成した。２種の菌株混合物は、Ｃ３株およびＫ８株を含み、各細菌は細菌重量の約５０％で存在した。４種の菌株混合物はＡ５株(約３５％)、Ｃ３株(約５５％)、Ｆ４株(約１０％)およびＫ８株(約５％)を含んでいた。ＭＢＣおよびＭＩＣ試験の両方を９６ウェルプレートにおいて設置した。プレート効果を避けるために、最も外側のウェルを水で満たした。ＭＩＣ試験について、細菌を嫌気性条件下で、液体培養中で５日間増殖させ、その後それらを分析した(表５)。
【0176】
ＭＢＣ試験について、細菌をＲＣＭ培地中で２４時間、嫌気性環境中で、３７℃で防腐剤に曝露させた。２４時間後、１０μｌの各試験ウェルを、２００μｌのＲＣＭ寒天(Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号９１３６５－５００ｇ)でそれぞれ満たされた寒天プレート(９６ウェルプレート)に移し、酸素の非存在下で、３７℃で４日間インキュベートした。４日後、ＭＢＣを決定するために、各プレートをコロニーの可視増殖について分析した(表６)。
【0177】
【表5】
【表6】
【0178】
結果
インビトロ試験は２つの状況を模倣した。ＭＩＣ試験は、アクネ菌が標準的な化粧品に混入する状況を表した。ＭＢＣ試験は、皮膚に生存細菌が局所適用された化粧品に由来する防腐剤に曝露される状況を表した。
インビトロ試験は２つの状況を模倣した。ＭＩＣ試験は、アクネ菌が標準的な化粧品に混入する状況を表した。ＭＢＣ試験は、皮膚に生存細菌が局所適用された化粧品に由来する防腐剤に曝露される状況を表した。
【0179】
予想されるように、ＭＩＣ試験において、液体増殖培地に存在するとき、両方の防腐剤は効果的に増殖を阻害した。化粧品において一般的に使用される濃度より顕著に低い濃度でさえ、個々のアクネ菌株または混合物の増殖は検出されなかった。
【0180】
ＭＢＣ試験において、驚くべきことに、結果はＭＩＣ試験と異なるものであった。一般的な防腐剤である安息香酸は、０.３１％ 体積／体積より高い濃度で全ての菌株の増殖に影響を与えた。しかしながら、種々の菌株間で差異が観察された。Ａ５株およびＣ３株は０.３１％ 安息香酸の曝露に対して２４時間生存したが、Ｆ４株およびＫ８株はこの曝露後に増殖できなかった。菌株混合物は、個々の菌株により耐容される安息香酸 ０.３１％の最大濃度までのみ増殖した。「洗い流さない」製品は、最大濃度０.５％の安息香酸を含む。データに基づいて、このような濃度は、アクネ菌の一部にしか影響を与えず、他のアクネ菌株はこのような濃度で生存する。
【0181】
ＤＭＤＭヒダントインを用いて同様の試験を実施したとき、驚くべき結果が得られた。任意の個々の菌株単独により耐容される濃度(０.１％)より高い濃度(０.１３％)菌株混合物の予想外の増殖が観察された。これは皮膚に確立されたアクネ菌株の細菌群集が、皮膚に確立された単一細菌株と比較して、ＤＭＤＭヒダントインのような防腐剤を含む製品への曝露に対して改善した生存率を有することを示す。これはヒト対象の皮膚への確立および長期持続性について、個々の菌株と比較して細菌混合物についての予想外の利点を提供する。２種の菌株の組合せは、ＤＭＤＭヒダントインのようなホルムアルデヒド遊離物質に対して、試験されたあらゆる個々の菌株より優れた耐性を提供した。
【0182】
実施例５：ざ瘡患者における臨床試験(ＡＣＢＡＣ)
ざ瘡患者における臨床パイロット試験を実施した。パイロット試験では、マイクロバイオームの細菌生着ならびに安全性および有効性傾向を評価した。安全性、安定性および反応速度のような基準を含むパイロット試験に基づいて、パイロット試験において試験された混合物の１つをより規模の大きな臨床試験のために選択した。
ざ瘡患者における臨床パイロット試験を実施した。パイロット試験では、マイクロバイオームの細菌生着ならびに安全性および有効性傾向を評価した。安全性、安定性および反応速度のような基準を含むパイロット試験に基づいて、パイロット試験において試験された混合物の１つをより規模の大きな臨床試験のために選択した。
【0183】
パイロット試験スケジュール
１８～２３歳の１４名の対象で６週間、パイロット試験を実施した。第一エンドポイントは安全性および有効性傾向であった。２つの異なる細菌製剤：Ａ２(アクネ菌のＣ３株およびＫ８株を含む２種の菌株混合物)およびＢ４(アクネ菌のＣ３株、Ｋ８株、Ａ５株およびＦ４株を含む４種の菌株混合物)を試験した。実施例２に記載のデータと一致して、Ａ２製剤を与えられた対象はＣ３と比較して皮膚におけるＫ８より高いまたはそれと同等の相対的存在量を示し、これはＣ３株が増殖の遅いＫ８株が皮膚にコロニー形成するのを助けたことを示唆する(図２５)。
１８～２３歳の１４名の対象で６週間、パイロット試験を実施した。第一エンドポイントは安全性および有効性傾向であった。２つの異なる細菌製剤：Ａ２(アクネ菌のＣ３株およびＫ８株を含む２種の菌株混合物)およびＢ４(アクネ菌のＣ３株、Ｋ８株、Ａ５株およびＦ４株を含む４種の菌株混合物)を試験した。実施例２に記載のデータと一致して、Ａ２製剤を与えられた対象はＣ３と比較して皮膚におけるＫ８より高いまたはそれと同等の相対的存在量を示し、これはＣ３株が増殖の遅いＫ８株が皮膚にコロニー形成するのを助けたことを示唆する(図２５)。
【0184】
両方の製剤は、副作用を伴わない優れた安全性プロファイルを示した。非炎症性病変の顕著な減少および炎症性病変の軽減のわずかな傾向が観察された。さらに、一般に健全な皮膚への前向きな進展と考えられる皮膚ｐＨの低下が観察された。セブメーター測定値は雑音が多かったため、皮脂産生における変化の可能性はなお調査中である。より精密なセブテープの解析がなお継続中である。一部対象において、適用した菌株の増加が明確かつ顕著であった(例えば、２１日目とおよび４２日目の両方で、１日目と比較して少なくとも１５％まで増加)。菌の相対的存在量をＳＬＳＴのアンプリコンシーケンシング(ＮＧＳ)で測定した。これらの対象は、受容者として定義された。下記のとおり、受容対象は、例えば、例えば、非炎症性病変およびｐＨに対する効果を示した。従って、パイロット試験からの結果は肯定的なものであり、より大規模な臨床試験をもたらした。
【0185】
パイロット試験設計
対象を無作為に２群に分け、各群の対象に異なる細菌製剤を投与した。細菌製剤は二重盲検式であった：群１：ｎ＝８対象は製剤Ａ２を与えられた。群２：ｎ＝６対象は製剤Ｂ４を与えられた。１日目、７日目、２１日目および４２日目に対象を評価した。第一週、１日目～７日目に、全ての対象に過酸化ベンゾイル(ＢＰＯ)処置をした(１日に１回適用)。その後５週間、７日目～４２日目、全ての対象に細菌製剤を与えた(１日に２回ゲルを適用)。図８Ａはパイロット試験の設計を示す。
対象を無作為に２群に分け、各群の対象に異なる細菌製剤を投与した。細菌製剤は二重盲検式であった：群１：ｎ＝８対象は製剤Ａ２を与えられた。群２：ｎ＝６対象は製剤Ｂ４を与えられた。１日目、７日目、２１日目および４２日目に対象を評価した。第一週、１日目～７日目に、全ての対象に過酸化ベンゾイル(ＢＰＯ)処置をした(１日に１回適用)。その後５週間、７日目～４２日目、全ての対象に細菌製剤を与えた(１日に２回ゲルを適用)。図８Ａはパイロット試験の設計を示す。
【0186】
１日目、７日目、２１日目および４２日目の４回の来院時に対象を試験した。表７は各来院時に実施し、記録した測定値を示す。
【0187】
安全性
投与される製剤の安全性を、各回で、例えば発赤、炎症または他の何らかの皮膚の問題の視覚的評価により評価した。試験中、安全性問題は観察されなかった。７名の対象から、ＢＰＯの使用中(１日目～７日目)に皮膚の乾燥または発赤が報告された。しかしながら、生存細菌投与中、対象の皮膚は赤くならず、炎症を起こさずまたは他の問題も起こらなかった。生存細菌の投与に関連する副作用は観察されなかった。
投与される製剤の安全性を、各回で、例えば発赤、炎症または他の何らかの皮膚の問題の視覚的評価により評価した。試験中、安全性問題は観察されなかった。７名の対象から、ＢＰＯの使用中(１日目～７日目)に皮膚の乾燥または発赤が報告された。しかしながら、生存細菌投与中、対象の皮膚は赤くならず、炎症を起こさずまたは他の問題も起こらなかった。生存細菌の投与に関連する副作用は観察されなかった。
【表7】
【0188】
マイクロバイオームサンプル
細菌種分類(１６Ｓ)
マイクロバイオームサンプル中の細菌種(１６Ｓ)の組成を各来院時に解析した。図９は治験における全対象の皮膚マイクロバイオームに最も多く存在する９種の細菌の相対比を示す。ＢＰＯ適用後、総アクネ菌集団の減少が観察された(７日目)(図１１Ａ)。細菌適用２週間後、総アクネ菌集団の顕著な増加が観察された(２１日目)(図１１Ａ)。細菌適用５週間後(４２日目)、総アクネ菌集団のわずかな減少が観察された。いかなる理論にも縛られることを願わないが、この減少はマイクロバイオームの均衡状態および／または細菌集団の多様性の増加を表し得る。図１１Ｂは、アクネ菌の相対比を箱ひげ図として示す。これらの観察は本明細書に記載の製剤の投与後のマイクロバイオーム組成生育における肯定的な傾向を示す。
細菌種分類(１６Ｓ)
マイクロバイオームサンプル中の細菌種(１６Ｓ)の組成を各来院時に解析した。図９は治験における全対象の皮膚マイクロバイオームに最も多く存在する９種の細菌の相対比を示す。ＢＰＯ適用後、総アクネ菌集団の減少が観察された(７日目)(図１１Ａ)。細菌適用２週間後、総アクネ菌集団の顕著な増加が観察された(２１日目)(図１１Ａ)。細菌適用５週間後(４２日目)、総アクネ菌集団のわずかな減少が観察された。いかなる理論にも縛られることを願わないが、この減少はマイクロバイオームの均衡状態および／または細菌集団の多様性の増加を表し得る。図１１Ｂは、アクネ菌の相対比を箱ひげ図として示す。これらの観察は本明細書に記載の製剤の投与後のマイクロバイオーム組成生育における肯定的な傾向を示す。
【0189】
アクネ菌の菌株レベル解析(ＳＬＳＴ)
単一遺伝子座配列タイピング(ＳＬＳＴ)を用いて、各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)に採取したマイクロバイオームサンプルのアクネ菌株レベル組成を決定した。
単一遺伝子座配列タイピング(ＳＬＳＴ)を用いて、各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)に採取したマイクロバイオームサンプルのアクネ菌株レベル組成を決定した。
【0190】
一般的に見られる菌株は１日目の大部分のサンプルにおいて優勢であった(基底状態)。細菌製剤の投与後、大部分の対象において適用した菌株への皮膚マイクロバイオームの組成のシフトが観察された。一部対象において、適用した菌株の増加は明確かつ顕著であった(１日目と比較して、２１日目および４２日目の両方で少なくとも１５％の特定の菌株の増加)。これらの対象は、受容者として分類された。一部対象において、適用した菌株の増加はあまり顕著ではなかった。これらの対象は、非受容者として分類された。図１０は受容者および非受容者として分類された対象の相対比を示す。
【0191】
全体で、対象の４３％が受容者として分類され、５７％が非受容者として分類された。製剤で分けると、５０％の受容者および５０％の非受容者がＡ２製剤群で観察され、一方で３３％の受容者および６７％の非受容者がＢ４製剤群で観察された。両群とも小規模であるため、２つの群の間の差異は統計的に有意ではない。
【0192】
年齢、性別、抗菌製品の使用またはシャワーのパターン(showering pattern)のような受容者となる確率に顕著に影響する可能性のある他の交絡因子は観察されなかった。
【0193】
細菌種(１６Ｓ)および菌株レベル(ＳＬＳＴ)分析
細菌種(１６Ｓ)データとアクネ菌の菌株レベルデータ(ＳＬＳＴ)を比較したとき、１日目(基底状態)にアクネ菌の相対存在量が非受容者(４１％)と比較して受容者(３４％)で低かったことが観察された。治験中、受容者におけるアクネ菌の平均相対存在量は、４２日目(最終来院時)までにほぼ２倍(６０％)に増加した。相対存在量は、標準的な１６Ｓアンプリコンシーケンシングを用いて決定した。当分野で既知のこの方法において、１６Ｓリボソームサブユニットの特定部位がＰＣＲによりサンプル中の全ての細菌ＤＮＡから増幅される。サンプル中に存在する種々の細菌種は、アンプリコンを配列決定することにより同定される。次世代シーケンシングは、サンプル中の全ての配列／種の完全な相対分布を評価することを可能とする。
細菌種(１６Ｓ)データとアクネ菌の菌株レベルデータ(ＳＬＳＴ)を比較したとき、１日目(基底状態)にアクネ菌の相対存在量が非受容者(４１％)と比較して受容者(３４％)で低かったことが観察された。治験中、受容者におけるアクネ菌の平均相対存在量は、４２日目(最終来院時)までにほぼ２倍(６０％)に増加した。相対存在量は、標準的な１６Ｓアンプリコンシーケンシングを用いて決定した。当分野で既知のこの方法において、１６Ｓリボソームサブユニットの特定部位がＰＣＲによりサンプル中の全ての細菌ＤＮＡから増幅される。サンプル中に存在する種々の細菌種は、アンプリコンを配列決定することにより同定される。次世代シーケンシングは、サンプル中の全ての配列／種の完全な相対分布を評価することを可能とする。
【0194】
非受容者群は、ｔ検定で分析されたように、試験中にわずかな、かつ統計学的に有意でないアクネ菌の増加を示すのみであった(図１１)。
【0195】
マイクロバイオーム結果の概要
患者のサブセットにおいて、適用した細菌は投与後に効率的に確立された。この対象のサブセットは、治験開始時のアクネ菌の低い割合および治験終了時の顕著に増加したアクネ菌の割合により特徴付けられた。
患者のサブセットにおいて、適用した細菌は投与後に効率的に確立された。この対象のサブセットは、治験開始時のアクネ菌の低い割合および治験終了時の顕著に増加したアクネ菌の割合により特徴付けられた。
【0196】
ざ瘡病変数
１日目(基底状態)および４２日目(最終来院時)の来院時、皮膚科医が対象の顔の病変数をカウントした。病変数は炎症性および非炎症性病変に分けられた。
１日目(基底状態)および４２日目(最終来院時)の来院時、皮膚科医が対象の顔の病変数をカウントした。病変数は炎症性および非炎症性病変に分けられた。
【0197】
非炎症性病変
非炎症性病変は、面疱としても知られる。面皰は開放(黒色面皰)または閉鎖(白色面皰)であり得る。
非炎症性病変は、面疱としても知られる。面皰は開放(黒色面皰)または閉鎖(白色面皰)であり得る。
【0198】
両方の製剤において非炎症性病変の相当な減少(３７％、Ｐ＝０.００６)が観察された。減少は、Ａ２製剤においては５５％、Ｐ＝０.０５、およびＢ４製剤においては３５％、Ｐ＝０.０６に相当した(図１２)。
【0199】
受容者および非受容者(皮膚マイクロバイオーム組成が変化した／変化しなかった対象)間の非炎症性病変の減少を比較すると、病変減少の大部分は受容者群において観察された(図１３)。
【0200】
群を受容者および非受容者に層別化した後、効果は両群において統計的に有意であり、ｐ値は０.０３未満であった。非受容者は全体的に基底状態(１日目に)における非炎症性病変が少なかった；しかしながら、広がりが小さく、病変の減少が比較的顕著ではなかったため、結果は依然として極めて統計的に有意であった(図１３)。
【0201】
炎症性病変
炎症性病変は通常、閉鎖面皰(非炎症性病変)の壁面の破裂後に生じる。それはまた、正常に見える皮膚からもまた、生じ得る。ざ瘡における炎症性病変は、いくつかの実施態様において、小さな赤い隆起(丘疹)、膿疱、大きな赤い隆起(小結節)および仮性嚢胞(変動制結節)を含む。
炎症性病変は通常、閉鎖面皰(非炎症性病変)の壁面の破裂後に生じる。それはまた、正常に見える皮膚からもまた、生じ得る。ざ瘡における炎症性病変は、いくつかの実施態様において、小さな赤い隆起(丘疹)、膿疱、大きな赤い隆起(小結節)および仮性嚢胞(変動制結節)を含む。
【0202】
炎症性病変数の減少が、細菌製剤の投与後に観察された。全対象の平均(両方の製剤について)は処置前が１９の炎症性病変であり、処置後が１６であり、これは処置後約１５％の減少に相当した。Ａ２製剤は約２０％の減少(２０／１６)をもたらし、一方でＢ４製剤は約９％の減少(１７／１５.５)をもたらした(図１４)。この差異は統計的に有意ではなく、かつ受容者と非受容者の間に顕著な差異は見られなかったが(図１５)、統計的有意差がないことは、少なくとも一部は、高い標準偏差をもたらす、短い試験期間、サンプル規模の小ささおよび全病変数の少なさによると考えられた。いかなる理論にも縛られることを願わないが、非炎症性病変が炎症性病変に先行するため、生存細菌を用いた処置は、非炎症性病変と比較して炎症性病変に対する効果の発揮が遅い可能性がある。観察されたデータに基づいて、炎症性病変の減少に対する統計的に有意な効果は、より長期の治験で期待される。
【0203】
皮脂測定
対象の皮脂産生を評価するために、２つのタイプのアッセイを使用した。各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)にセブメーター測定を行い、一方でサンプリングに時間がかかるため、セブテープ測定を１日目(基底状態)および４２日目(最終来院時)のみ行った。セブメーターを用いた初期の読み取りからは、一般的傾向は明らかにならなかった。しかしながら、セブメーターは簡単に迅速な測定を提供するが、洗浄、発汗などのような外部因子に強く影響されるため、いくつかの他のアッセイより信頼性が低い。
対象の皮脂産生を評価するために、２つのタイプのアッセイを使用した。各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)にセブメーター測定を行い、一方でサンプリングに時間がかかるため、セブテープ測定を１日目(基底状態)および４２日目(最終来院時)のみ行った。セブメーターを用いた初期の読み取りからは、一般的傾向は明らかにならなかった。しかしながら、セブメーターは簡単に迅速な測定を提供するが、洗浄、発汗などのような外部因子に強く影響されるため、いくつかの他のアッセイより信頼性が低い。
【0204】
皮膚ｐＨ測定
ｐＨメーターを用いて、対象の皮膚のｐＨを各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)に測定した。対象の皮膚のｐＨにおける減少は１日目と４２日目の間で０.４ポイントまで観察された。ｐＨの減少は健全な皮膚の肯定的な進展であると考えられる。
ｐＨメーターを用いて、対象の皮膚のｐＨを各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)に測定した。対象の皮膚のｐＨにおける減少は１日目と４２日目の間で０.４ポイントまで観察された。ｐＨの減少は健全な皮膚の肯定的な進展であると考えられる。
【0205】
非炎症性病変と同様に、効果は受容者として分類された対象においてより顕著であり、非受容者として分類された対象においてあまり顕著でなかった(図１６)。投与される特定の製剤に基づく相関は観察されなかった。観察された効果は、Nodakeら(2015)により報告された効果と同程度であった。
【0206】
自己評価
各来院時、対象は問診に回答した。問診は、皮膚の自己評価および製品の使用に関するものであった。次の皮膚の状態：面皰の発生、面皰の数、面皰に関連する発赤の出現、面皰の大きさ、面皰の重篤度、皮膚の油分、皮膚のてかり、皮膚の乾燥、皮膚の剥離、皮膚の滑らかさおよび皮膚の全体的な外観を報告した。
各来院時、対象は問診に回答した。問診は、皮膚の自己評価および製品の使用に関するものであった。次の皮膚の状態：面皰の発生、面皰の数、面皰に関連する発赤の出現、面皰の大きさ、面皰の重篤度、皮膚の油分、皮膚のてかり、皮膚の乾燥、皮膚の剥離、皮膚の滑らかさおよび皮膚の全体的な外観を報告した。
【0207】
上記問診の平均を用いて、１日目と４２日目の間に対象の８５％が改善を報告し、対象の１５％が変化なしと報告した。全体の平均的な改善(１日目と４日目の対象の全ての問診の平均)は、１.６２点であった(スケール１～１０について)。Ａ２製剤使用者(２.０５点)および受容者(１.７５点)でより高い満足度が観察された。
【0208】
全対象で、最も改善が観察されたのは「皮膚の乾燥」(２.２１点)であり、続いて「皮膚の全体的な外観」(２.０７点)および「皮膚の滑らかさ」(２.００点)であった。
【0209】
トップボックス分析に基づいて、スケールを３つのボックス：下＝１～３点、中央＝４～７点および上＝８～１０点に分けた。図１７は、各来院時(１日目、７日目、２１日目および４２日目)での全回答の対象の平均値に基づく対象の分布を示す。試験を通してより高いスコアへのシフトが見られる。自己評価において対象から高い製品の受容率および全体的に肯定的なフィードバックが観察された。
【0210】
図１８は、１５種の最も一般的に見られるアクネ菌株の相対的存在量のヒートマップを示す。図１９は、写真に基づく比較からのデータを示す。図２０は、患者評価概要からのデータを示す。何名かの対象は、３回目の来院で初期の減少を示したが、４回目の来院までに全体的に改善した。いかなる理論にも縛られることを願わないが、新しく確立した菌株に適応することは、一時的な悪化に寄与し得る。試験の開始時および終了時に、病変カウントを実施した。大部分の対象はざ瘡病変の減少を示した。
【0211】
パイロット試験の概要
非炎症性病変における統計的に有意な減少が観察された。標準的な治療処置において非炎症性病変の減少は一般的に長期間かけてしか観察されないため、これは驚くべきことであった。ＢＰＯと他の技術常識の処置(SeidlerおよびKimball、2010)を比較したＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓにおいて、プラセボ群は非炎症性病変において６.７％までの減少を示した。本明細書に記載の試験において、受容者群は５０％近い減少を有し、これはプラセボを超える効果が観察され得ることを示す。効果の程度は、非炎症性病変を標的とする能力において現在の最先端処置より潜在的に優れている。
非炎症性病変における統計的に有意な減少が観察された。標準的な治療処置において非炎症性病変の減少は一般的に長期間かけてしか観察されないため、これは驚くべきことであった。ＢＰＯと他の技術常識の処置(SeidlerおよびKimball、2010)を比較したＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓにおいて、プラセボ群は非炎症性病変において６.７％までの減少を示した。本明細書に記載の試験において、受容者群は５０％近い減少を有し、これはプラセボを超える効果が観察され得ることを示す。効果の程度は、非炎症性病変を標的とする能力において現在の最先端処置より潜在的に優れている。
【0212】
１６Ｓマイクロバイオームデータの分析およびアクネ菌集団の菌株レベル分類との相関に基づいて、適用した細菌株を許容する対象(受容者として分類される)が他の全ての細菌と比較してアクネ菌の相対割合で増加を示したことは明らかであった。非受容者は試験を通じてアクネ菌の相対比を維持したが、ベースライン来院時(１日目)のアクネ菌の相対割合がより高いことにより特徴付けられた。いかなる理論にも縛られることを願わないが、非受容者は、細菌株が投与される前に施される殺菌処置が常在アクネ菌集団を排除するのに十分でなく、ろ胞中に隠れたままであり得るなどのように、既にアクネ菌により完全にコロニー形成されている可能性がある。対照的に、受容者は完全にコロニー形成されておらず、細菌株の投与前に殺菌処置により生息するアクネ菌集団を減少させるまたは排除することが可能である可能性がある。改良された殺菌性製品は、受容者率の増加を可能にし得る。
【0213】
皮膚ｐＨについて観察された効果は、皮膚細菌を用いた他の無作為二重盲検臨床試験により報告された効果(Nodakeら、2015)と同程度であった。試験を通じてｐＨが低下しただけでなく、対象の皮膚ｐＨの標準化を示すその変動の減少もまた励みとなる。
【0214】
パイロット試験における多数の対象が、より滑らかな皮膚を報告し、これはパイロット試験に参加した皮膚科医が記録した非炎症性病変の減少と相関する。さらに、多数の対象が減少した皮脂産生の指標となり得る脂の少ない皮膚を報告した。
【0215】
データは、菌株レベルでの皮膚マイクロバイオームの調節が十分に耐容性であったことを示す。対象の大部分は皮膚状態の全体的な改善を経験した。特に、掻痒の減少、目立つざ瘡病変の減少およびより良好な全体的な皮膚の外観が報告された。顕著な悪化または長期の炎症を経験した対象は存在しなかった。この臨床試験において脱落者は存在しなかった。
【0216】
材料および方法
アクネ菌産生のために使用された材料は、１Ｌのショットボトル；細胞培養フラスコ磁石；セロロジカルピペット；フィルター付きピペットチップ、１０００μｌ；ファルコン；大規模バッチを回転させるためのカップ；ペトリ皿；シリンジ ２.５ｍｌ；シリンジ用ストロー；シリンジ用キャップ；およびエッペンドルフを含んだ。
アクネ菌産生のために使用された材料は、１Ｌのショットボトル；細胞培養フラスコ磁石；セロロジカルピペット；フィルター付きピペットチップ、１０００μｌ；ファルコン；大規模バッチを回転させるためのカップ；ペトリ皿；シリンジ ２.５ｍｌ；シリンジ用ストロー；シリンジ用キャップ；およびエッペンドルフを含んだ。
【0217】
使用された化学物質は、ＮＡＴＲＯＳＯＬ(登録商標) ２５０ Ｈｘ Ｐｈａｒｍ.、ヒドロキシエチルセルロース；Ｋａｔ－Ｈｅｆｅ培地；デキストロース(α－Ｄ－グルコース)、無水９６％、Ａｌｄｒｉｃｈ、参照番号：１５８９６８；塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)；強化クロストリジウム寒天；およびカゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)を含む。
【0218】
細菌培地調製：各リットルを含めて、ＲＣＭ寒天を次の販売者の指示書に従って調製した：液体プログラム中の混合物をオートクレーブし；寒天を分配する前にそれぞれ１Ｌの最終体積に対して１００ｍｇ／ｍｌのフラジリドン(２００μｌ)を添加し；調製したＲＣＭ寒天をペトリ皿および平底９６ウェルプレート(各ウェル２００μｌ)に分配した。
【0219】
次の溶液を調製した：
１)１Ｌのショットボトル中に、２０ｇのＫａｔ－Ｈｅｆｅタンパク質；５ｇのＮａＣｌ；および９００ｍｌの水を含む培地ベース溶液混合物
２)１００ｍＬのショットボトル中に、３０ｇのデキストロース(α－Ｄ－グルコース)および１００ｍｌの水を含む１０ｘデキストロース溶液混合物。
１)１Ｌのショットボトル中に、２０ｇのＫａｔ－Ｈｅｆｅタンパク質；５ｇのＮａＣｌ；および９００ｍｌの水を含む培地ベース溶液混合物
２)１００ｍＬのショットボトル中に、３０ｇのデキストロース(α－Ｄ－グルコース)および１００ｍｌの水を含む１０ｘデキストロース溶液混合物。
【0220】
両方の溶液をオートクレーブした。無菌的に冷却した後、１００ｍｌの１０ｘデキストロース溶液を、最終培地を形成する培地ベース溶液(１Ｌボトル)に添加した。最終培地は次の濃度：２０ｇ／ＬのＫａｔ－Ｈｅｆｅタンパク質；５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ；および３０ｇ／Ｌのデキストロースを含んだ。
【0221】
２.５ｇのカゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)および１Ｌの水を含むペプトン溶液混合物を、１Ｌのショットボトルに調製した。この溶液を液体プログラム中でオートクレーブした。最終溶液は、０.２５％のペプトンを含んだ。
【0222】
細菌培養物
確認された純粋な菌株から、細菌前培養物の調製を開始した。各ファルコンを５０ｍｌのＲＣＭ培地で満たした。菌株に応じて、所望の菌を含むシリンジを室温で解凍し、０.５ｍｌのゲルを対応するファルコンに移した。細菌培養物を３７℃で増殖させた。
確認された純粋な菌株から、細菌前培養物の調製を開始した。各ファルコンを５０ｍｌのＲＣＭ培地で満たした。菌株に応じて、所望の菌を含むシリンジを室温で解凍し、０.５ｍｌのゲルを対応するファルコンに移した。細菌培養物を３７℃で増殖させた。
【0223】
細菌培養物を作製するための段階を下に概説する。
・５０ｍｌの前培養物を、７５０ｍｌの無菌細胞培養フラスコ(主培養)中の４５０ｍｌのＫａｔ－Ｈｅｆｅ培地に添加した。サンプルを３７℃でインキュベーターに入れて、定期的ＯＤ測定により増殖をモニタリングした。
・サンプルを１０分間沈降させ、上清を除去した。
・サンプルを５０ｍｌの０.２５％ カゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)で１回洗浄した。
・サンプルを１０分間沈降させ、上清を除去した。
・各ペレットを５０ｍｌの０.２５％ カゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)中で再懸濁した。
・細菌懸濁液を標準化した。
・所望の製剤に応じて細菌混合物を混合した。
・ゲルを調製するために無菌のＨｅｃ粉末を添加し、静置した。
・シリンジを満たした。
・５０ｍｌの前培養物を、７５０ｍｌの無菌細胞培養フラスコ(主培養)中の４５０ｍｌのＫａｔ－Ｈｅｆｅ培地に添加した。サンプルを３７℃でインキュベーターに入れて、定期的ＯＤ測定により増殖をモニタリングした。
・サンプルを１０分間沈降させ、上清を除去した。
・サンプルを５０ｍｌの０.２５％ カゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)で１回洗浄した。
・サンプルを１０分間沈降させ、上清を除去した。
・各ペレットを５０ｍｌの０.２５％ カゼイン由来ペプトン(トリプシン分解)中で再懸濁した。
・細菌懸濁液を標準化した。
・所望の製剤に応じて細菌混合物を混合した。
・ゲルを調製するために無菌のＨｅｃ粉末を添加し、静置した。
・シリンジを満たした。
【0224】
アクネ菌Ｃ３株およびアクネ菌Ｋ８株はそれぞれ２０１７年１０月１９日に、ＤＳＭＺ(Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ－Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ)、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ、３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツに寄託された。
【0225】
実施例６：大規模臨床試験のためのアクネ菌の産生
食品グレード法を用いて、大規模臨床試験において使用される細菌株のサンプルを製造し、同様に細菌を含まないプラセボサンプルを製造した。製造されたサンプルは９０００個のラミネート加工されたアルミホイル小袋に無菌的に包装され、－８０℃で保存された一分量あたり少なくとも１ｘ１０７ ｃｆｕの濃度で２種のアクネ菌の１：１のブレンドを含む１ｍｌ分量のゲル培地、および５５００個の同様の小袋に包装され、－８０℃で保存された細菌を含まない１ｍｌ分量のゲル培地(ｐｌａｃｅｂｏ サンプル)を含んでいた。アクネ菌細菌株の産生に使用される方法および関連する結果は、本明細書に記載される。試験は２相に分けられた。パート１において、細菌の増殖、収集および保存が開発および評価された。パート２は細菌とプラセボサンプルのブレンド製造および包装から成った。
食品グレード法を用いて、大規模臨床試験において使用される細菌株のサンプルを製造し、同様に細菌を含まないプラセボサンプルを製造した。製造されたサンプルは９０００個のラミネート加工されたアルミホイル小袋に無菌的に包装され、－８０℃で保存された一分量あたり少なくとも１ｘ１０７ ｃｆｕの濃度で２種のアクネ菌の１：１のブレンドを含む１ｍｌ分量のゲル培地、および５５００個の同様の小袋に包装され、－８０℃で保存された細菌を含まない１ｍｌ分量のゲル培地(ｐｌａｃｅｂｏ サンプル)を含んでいた。アクネ菌細菌株の産生に使用される方法および関連する結果は、本明細書に記載される。試験は２相に分けられた。パート１において、細菌の増殖、収集および保存が開発および評価された。パート２は細菌とプラセボサンプルのブレンド製造および包装から成った。
【0226】
材料および方法
菌株、培地および培養条件
アクネ菌株Ｋ８およびＣ３を無菌の１ｍｌシリンジ中で２.５％ ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)に希釈した培養物として得た。シリンジを－８０℃で保存した。
菌株、培地および培養条件
アクネ菌株Ｋ８およびＣ３を無菌の１ｍｌシリンジ中で２.５％ ヒドロキシエチルセルロース(ＨＥＣ)に希釈した培養物として得た。シリンジを－８０℃で保存した。
【0227】
ストック培養物：Ｋ８株およびＣ３株を、ブレインハートインフュージョン寒天(ＢＨＩＡ；Ｔｒｉｔｉｕｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、オランダ)プレートにシリンジ培養物から約０.０５ｍｌ接種し、嫌気性容器中で一晩インキュベートすることにより調製した。インキュベート後のプレートからの細菌物質を希釈し、新しいＢＨＩＡプレートに広げて単一のコロニーを得た。３７℃で一晩嫌気的にインキュベートした後、各菌株由来の単一のコロニーをＢＨＩ培養液(Ｔｒｉｔｉｕｍ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ)に接種し、３７℃で嫌気的一晩インキュベートした。得られた培養物は無菌６０％ グリセロール溶液と最終グリセロール濃度１５％まで混合され、複数のサブサンプルに分配され、－８０℃で保存された。これらのストック培養物は、発酵実験１.１、１.２、１.３および２.１に使用されるＢＨＩ培地において前培養物に接種するために使用した。実験２.２の実施前に、シリンジ培養物から新しいストック培養物を調製した。
【0228】
試験に使用した培地は：ブレインハートインフュージョン培養液(ＢＨＩ)およびブレインハートインフュージョン寒天(ＢＨＩＡ)；培地Ａ：３％ デキストロース、０.５％塩化ナトリウム、２％酵母抽出物(Ｋａｔ、ドイツのみ)、ｐＨ ６.７；培地Ｂ：培地Ａと１％ ダイズペプトン(ＡＭ４１、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、Ｌａ Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ、フランス)、ｐＨ ６.７；培地Ｃ：３％ デキストロース、０.５％ 塩化ナトリウム、２％ 酵母抽出物(Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ０２５１／０－ＭＧ－Ｌ、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｉｓｏｎｓ－Ａｌｆｏｒｔ、フランス)、ｐＨ ６.７；培地Ｄ：培地Ｃと１％ ダイズペプトン、ｐＨ ６.７；および培地Ｅ：ｐＨ ６.３に調製した培地Ｄであった
【0229】
下に記載するように、全体で５回の発酵実験(パート１で３回、パート２で２回)を実施した。
【0230】
実験１.１：
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、１００ｍｌの培地Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを含む１００ｍｌフラスコで培養した。ＢＨＩ中の一夜培養物から培地を１０ｍｌ接種した。フラスコを嫌気性容器中で保存し、３７℃で２４時間、撹拌せずにインキュベートした。
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、１００ｍｌの培地Ａ、Ｂ、ＣまたはＤを含む１００ｍｌフラスコで培養した。ＢＨＩ中の一夜培養物から培地を１０ｍｌ接種した。フラスコを嫌気性容器中で保存し、３７℃で２４時間、撹拌せずにインキュベートした。
【0231】
実験１.２：
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、温度、撹拌およびｐＨを制御するためのユニットを備えた０.５Ｌ体積の発酵容器(Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｆｏｒｓ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ スイス)中の４００ｍｌの培地Ｄ中で培養した。ＢＨＩ中の一夜培養物から１ｍｌ接種することによって調製した培地Ｄの一夜培養物から培地を４０ｍｌ接種(１０％接種)した。培養条件は：温度３７℃；撹拌速度１５０ｒｐｍ；２.５Ｎ 水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ６.０に制御またはｐＨ制御なし；９５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２(流速１２５ｍｌ／分)を通気したヘッドスペースであった。
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、温度、撹拌およびｐＨを制御するためのユニットを備えた０.５Ｌ体積の発酵容器(Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ ２ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｆｏｒｓ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ スイス)中の４００ｍｌの培地Ｄ中で培養した。ＢＨＩ中の一夜培養物から１ｍｌ接種することによって調製した培地Ｄの一夜培養物から培地を４０ｍｌ接種(１０％接種)した。培養条件は：温度３７℃；撹拌速度１５０ｒｐｍ；２.５Ｎ 水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ６.０に制御またはｐＨ制御なし；９５％ Ｎ２／５％ ＣＯ２(流速１２５ｍｌ／分)を通気したヘッドスペースであった。
【0232】
実験１.３：
培地Ｄの一夜培養物から培地を８ｍｌ接種(２％接種)したことを除き、実験１.２について記載したものと同様の設定および培養条件である。
培地Ｄの一夜培養物から培地を８ｍｌ接種(２％接種)したことを除き、実験１.２について記載したものと同様の設定および培養条件である。
【0233】
実験２.１：
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、温度、撹拌およびｐＨを制御するためのユニットを備えた３Ｌ体積の発酵容器(Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｅｌｆｔ オランダ)中の２Ｌの培地Ｄ中で培養した。接種方法および培養条件は実験１.３に記載したものと同様であった。
アクネ菌Ｋ８およびＣ３を、温度、撹拌およびｐＨを制御するためのユニットを備えた３Ｌ体積の発酵容器(Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｅｌｆｔ オランダ)中の２Ｌの培地Ｄ中で培養した。接種方法および培養条件は実験１.３に記載したものと同様であった。
【0234】
実験２.２：
培地をｐＨ ６.０に調製し(培地Ｅ；段落２.１.２を参照)、撹拌速度を２５０ｒｐｍに増加させたことを除き、設定、接種方法および培養条件は実験２.１に記載したものと同様であった。
培地をｐＨ ６.０に調製し(培地Ｅ；段落２.１.２を参照)、撹拌速度を２５０ｒｐｍに増加させたことを除き、設定、接種方法および培養条件は実験２.１に記載したものと同様であった。
【0235】
収集
アクネ菌株を含む小袋の製造のために、実験２.２を使用した。両方の菌株について、２.０Ｌの体積の培養物を１Ｌの遠心分離容器中で、１６，０００ｘｇで１０分間、環境温度で遠心分離することにより収集した。ペレットを２００ｍｌの０.２５％ ダイズペプトン(ＡＭ４１、ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、Ｌａ Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ、フランス)溶液に再懸濁し、もう一度遠心分離した。細菌を環境温度の２００ｍｌの０.２５％ ダイズペプトン溶液に再懸濁し、３０分以内で処理した。これらの濃縮懸濁液の６００ｎｍでの光学密度は、アクネ菌Ｃ３については５４.３であり、アクネ菌Ｋ８については４８.４であった。
アクネ菌株を含む小袋の製造のために、実験２.２を使用した。両方の菌株について、２.０Ｌの体積の培養物を１Ｌの遠心分離容器中で、１６，０００ｘｇで１０分間、環境温度で遠心分離することにより収集した。ペレットを２００ｍｌの０.２５％ ダイズペプトン(ＡＭ４１、ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、Ｌａ Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ、フランス)溶液に再懸濁し、もう一度遠心分離した。細菌を環境温度の２００ｍｌの０.２５％ ダイズペプトン溶液に再懸濁し、３０分以内で処理した。これらの濃縮懸濁液の６００ｎｍでの光学密度は、アクネ菌Ｃ３については５４.３であり、アクネ菌Ｋ８については４８.４であった。
【0236】
アクネ菌を含むゲル培地およびプラセボゲル培地
アクネ菌Ｃ３およびＫ８の濃縮懸濁液(それぞれ１９ｍｌおよび２１ｍｌ)を０.２５％ ダイズペプトン溶液中に最終体積２.０Ｌまで希釈した。この懸濁液のＯＤ６００は１.１であり、菌株間の比はＯＤ６００基準で１：１であった。無菌ＨＥＣを激しく混合しながらこの溶液に最終濃度１.５％(ｗ／ｖ)まで溶解した。これを全体で９回繰り返した。バッチを混合し、総体積１８Ｌのアクネ菌Ｋ８およびＣ３を含むゲル培地を得た。ゲル培地を環境温度で１時間保持し、ホイル小袋への包装を開始した。プラセボゲル培地は、イソ吉草酸を含む０.２５％ ペプトン溶液中に１.５％ ＨＥＣが最終濃度１０μｌ／Ｌとなるように構成された。全体積１０Ｌを製造した。ＨＥＣを溶解する方法は、アクネ菌を含むゲル培地について記載したものと同様である。
アクネ菌Ｃ３およびＫ８の濃縮懸濁液(それぞれ１９ｍｌおよび２１ｍｌ)を０.２５％ ダイズペプトン溶液中に最終体積２.０Ｌまで希釈した。この懸濁液のＯＤ６００は１.１であり、菌株間の比はＯＤ６００基準で１：１であった。無菌ＨＥＣを激しく混合しながらこの溶液に最終濃度１.５％(ｗ／ｖ)まで溶解した。これを全体で９回繰り返した。バッチを混合し、総体積１８Ｌのアクネ菌Ｋ８およびＣ３を含むゲル培地を得た。ゲル培地を環境温度で１時間保持し、ホイル小袋への包装を開始した。プラセボゲル培地は、イソ吉草酸を含む０.２５％ ペプトン溶液中に１.５％ ＨＥＣが最終濃度１０μｌ／Ｌとなるように構成された。全体積１０Ｌを製造した。ＨＥＣを溶解する方法は、アクネ菌を含むゲル培地について記載したものと同様である。
【0237】
袋詰め(sacheting)、包装および保存
アクネ菌を含むゲル培地またはプラセボゲル培地を含む小袋は、小袋包装機を用いて独立した実施で製造した。機械はポンプ、袋詰め部位および熱伝導式印刷ユニットから成るものであった。ゲル培地を溶液から袋詰め部位へポンプ輸送した。袋詰め部位は、周囲で小袋が折りたたまれる無菌ステンレス鋼チューブ(ゲル培地用に１本および窒素ガス用に１本)ならびに１３０℃の温度で動く垂直および水平のシーリング部材から成るものであった。袋詰め部分の前に位置する印刷ユニットを、小袋にラベル付けするために使用した。６５ｘ６５ｍｍのラミネート加工されたアルミホイルのシートから小袋を製造し、折りたたんで３方向を熱で封をした(とじ幅約１２ｍｍ)。最終的な小袋は６５ｘ３０ｍｍの大きさであり、約２ｍｌの体積を有していた。１分あたり２８個の小袋の製造速度および小袋１個あたり１.２(±０.１５)グラムのゲル培地の量で機械を作動させ；小袋の残りの体積はＮ２ヘッドスペースである。充填中、小袋の上部に無菌窒素ガスを流した。充填作業の開始時および中断後、１０～２０個の小袋を廃棄した。充填作業の最後に、ゲル培地のサンプルを微生物学的分析(アクネ菌生存数および病原体分析)のために取った。アクネ菌を含むゲル培地を含む小袋をビニール袋(袋１個あたり小袋１８個)に包装した。充填作業の過程で、小袋を連続１０００～１５００個の小袋で－８０℃の冷凍庫に移した。出荷まで小袋を－８０℃で保存した。アクネ菌を含む小袋またはプラセボ小袋を含む小袋は、独立した処理で製造した。
アクネ菌を含むゲル培地またはプラセボゲル培地を含む小袋は、小袋包装機を用いて独立した実施で製造した。機械はポンプ、袋詰め部位および熱伝導式印刷ユニットから成るものであった。ゲル培地を溶液から袋詰め部位へポンプ輸送した。袋詰め部位は、周囲で小袋が折りたたまれる無菌ステンレス鋼チューブ(ゲル培地用に１本および窒素ガス用に１本)ならびに１３０℃の温度で動く垂直および水平のシーリング部材から成るものであった。袋詰め部分の前に位置する印刷ユニットを、小袋にラベル付けするために使用した。６５ｘ６５ｍｍのラミネート加工されたアルミホイルのシートから小袋を製造し、折りたたんで３方向を熱で封をした(とじ幅約１２ｍｍ)。最終的な小袋は６５ｘ３０ｍｍの大きさであり、約２ｍｌの体積を有していた。１分あたり２８個の小袋の製造速度および小袋１個あたり１.２(±０.１５)グラムのゲル培地の量で機械を作動させ；小袋の残りの体積はＮ２ヘッドスペースである。充填中、小袋の上部に無菌窒素ガスを流した。充填作業の開始時および中断後、１０～２０個の小袋を廃棄した。充填作業の最後に、ゲル培地のサンプルを微生物学的分析(アクネ菌生存数および病原体分析)のために取った。アクネ菌を含むゲル培地を含む小袋をビニール袋(袋１個あたり小袋１８個)に包装した。充填作業の過程で、小袋を連続１０００～１５００個の小袋で－８０℃の冷凍庫に移した。出荷まで小袋を－８０℃で保存した。アクネ菌を含む小袋またはプラセボ小袋を含む小袋は、独立した処理で製造した。
【0238】
分析
増殖測定および微生物学的解析
ＯＤ６００の測定により、培養物中の細菌量を決定した。寒天における段階希釈液のプレート化し、３７℃で２４～３０時間嫌気的にインキュベートすることにより、培養物およびゲル培地中のアクネ菌の生存数を決定した。アクネ菌を含むゲル培地およびプラセボゲル培地に病原体が存在しないことを確認するために、外部施設(Ｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｔｒｉＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｄｅ、オランダ)により、表９に挙げる次の病原体についてゲル培地サンプルを分析した。
増殖測定および微生物学的解析
ＯＤ６００の測定により、培養物中の細菌量を決定した。寒天における段階希釈液のプレート化し、３７℃で２４～３０時間嫌気的にインキュベートすることにより、培養物およびゲル培地中のアクネ菌の生存数を決定した。アクネ菌を含むゲル培地およびプラセボゲル培地に病原体が存在しないことを確認するために、外部施設(Ｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｔｒｉＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｄｅ、オランダ)により、表９に挙げる次の病原体についてゲル培地サンプルを分析した。
【表8】
【0239】
ＦＡＣＳフローサイトメトリー
ＦＡＣＳフローサイトメトリーを用いて、培養物の全体の数および生存率を決定した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭＢＡＣＬＩＧＨＴＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ｌ３４８５６)を用いて、２つの核酸染色液(緑色－蛍光ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ９染色液および赤色－蛍光ヨウ化プロピジウム)の混合物で細菌を染色した後、生存率を決定した。
ＦＡＣＳフローサイトメトリーを用いて、培養物の全体の数および生存率を決定した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭＢＡＣＬＩＧＨＴＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ｌ３４８５６)を用いて、２つの核酸染色液(緑色－蛍光ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭ９染色液および赤色－蛍光ヨウ化プロピジウム)の混合物で細菌を染色した後、生存率を決定した。
【0240】
結果
パート１
パート１の主な目的は、アクネ菌株の増殖についてのプロトコルを評価および改善することであった。プロトコルは２～３日のフラスコ内での嫌気培養から成り、ＯＤ６００ ０.６～１.２のバイオマス収量を与えるものであった。試験は、収量の増加、培養時間の短縮およびスケールアップ可能な培養系の使用を目的とした。
パート１
パート１の主な目的は、アクネ菌株の増殖についてのプロトコルを評価および改善することであった。プロトコルは２～３日のフラスコ内での嫌気培養から成り、ＯＤ６００ ０.６～１.２のバイオマス収量を与えるものであった。試験は、収量の増加、培養時間の短縮およびスケールアップ可能な培養系の使用を目的とした。
【0241】
実験１.１：
収量についての培地組成を最適化するために、実験１.１を行った。酵母抽出物の二つの供給源を比較し、ダイズペプトンの培地への添加の効果を決定した。細菌をフラスコで培養した。表１０は培養物の生存数およびＯＤ６００を示す。データは、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物がＫａｔ酵母抽出物より高いＯＤ６００値および生存数を達成したことを示した。さらに、ＯＤ６００に対する、およびそれより程度は少ないが、生存数に対するダイズペプトンの有益な効果が検出された。Ｃ３株よりＫ８株でより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ペプトンおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物を含む培地を用いて後の実験を行った。
収量についての培地組成を最適化するために、実験１.１を行った。酵母抽出物の二つの供給源を比較し、ダイズペプトンの培地への添加の効果を決定した。細菌をフラスコで培養した。表１０は培養物の生存数およびＯＤ６００を示す。データは、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物がＫａｔ酵母抽出物より高いＯＤ６００値および生存数を達成したことを示した。さらに、ＯＤ６００に対する、およびそれより程度は少ないが、生存数に対するダイズペプトンの有益な効果が検出された。Ｃ３株よりＫ８株でより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ペプトンおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物を含む培地を用いて後の実験を行った。
【表9】
【0242】
実験１.２：
発酵槽中での培養中の菌株の増殖特性を試験するために、および一定のｐＨ ６.０での培養の効果を決定するために実験１.２を行った。ＯＤ６００および生存数測定の結果を、表２２および２３にそれぞれ示す。ｐＨ制御した培養物は、ｐＨ非制御培養物より顕著に高いＯＤ６００および生存数を有した。ｐＨ非制御培養物の生存数は、４時間のインキュベート後より２１時間のインキュベート後が約２５倍低かった。この発見は、この実施態様において、恐らくｐＨ非制御培養物の低いｐＨ(ｐＨ ５.２５)により細菌が死滅したことを示す。この結果は、図２２はまた、２１時間培養のうちに最大ＯＤ６００値に達することも示した。ｐＨ制御発酵槽での培養中の塩基滴定の記録(示していない)は、接種後約１４時間で、すでに定常期に達したことを示した。実験１.１の結果とは対照的に、Ｋ８よりＣ３株についてより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ｐＨ制御をｐＨ ６.０に設定して後の発酵を行った。
発酵槽中での培養中の菌株の増殖特性を試験するために、および一定のｐＨ ６.０での培養の効果を決定するために実験１.２を行った。ＯＤ６００および生存数測定の結果を、表２２および２３にそれぞれ示す。ｐＨ制御した培養物は、ｐＨ非制御培養物より顕著に高いＯＤ６００および生存数を有した。ｐＨ非制御培養物の生存数は、４時間のインキュベート後より２１時間のインキュベート後が約２５倍低かった。この発見は、この実施態様において、恐らくｐＨ非制御培養物の低いｐＨ(ｐＨ ５.２５)により細菌が死滅したことを示す。この結果は、図２２はまた、２１時間培養のうちに最大ＯＤ６００値に達することも示した。ｐＨ制御発酵槽での培養中の塩基滴定の記録(示していない)は、接種後約１４時間で、すでに定常期に達したことを示した。実験１.１の結果とは対照的に、Ｋ８よりＣ３株についてより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ｐＨ制御をｐＨ ６.０に設定して後の発酵を行った。
【0243】
保存前および保存３週間後の生存数を測定することにより、－８０℃で保存中のゲル培地におけるアクネ菌Ｃ３およびＫ８の安定性を試験した。細菌を収集し、ゲル培地(２.５％ ＨＥＣ)中に懸濁した。ｐＨ制御したＫ８の培養物ならびにｐＨ制御していないＣ３およびＫ８の培養物は、保存中に生存数の減少を全く示さないか、少し示したのみであった。対照的に、ｐＨ制御したＣ３の培養物の生存数は、約６０％まで減少した(表１１)。
【表10】
【0244】
実験１.３：
実験１.２の観察を確認するために、および接種レベルが１０％から２％に減少し得るかどうかを試験するために実験１.３を行った。培養中のＯＤ６００を図２４に示す。実験１.２の結果と一致して、Ｋ８株よりＣ３株についてより高いＯＤ６００が観察された結果はまた、Ｃ３菌株がＫ８よりわずかに速く増殖することを示した。さらに、この結果は、接種レベルを２％に減少させることができたことを確認した。ＯＤ６００測定は、Ｃ３株およびＫ８株についての接種後、それぞれ約１４時間および約１８時間で定常期に達したことを示した。
実験１.２の観察を確認するために、および接種レベルが１０％から２％に減少し得るかどうかを試験するために実験１.３を行った。培養中のＯＤ６００を図２４に示す。実験１.２の結果と一致して、Ｋ８株よりＣ３株についてより高いＯＤ６００が観察された結果はまた、Ｃ３菌株がＫ８よりわずかに速く増殖することを示した。さらに、この結果は、接種レベルを２％に減少させることができたことを確認した。ＯＤ６００測定は、Ｃ３株およびＫ８株についての接種後、それぞれ約１４時間および約１８時間で定常期に達したことを示した。
【0245】
パート２
プラセボ小袋の製造
プラセボゲル培地を含む約６０００個の小袋を製造した。小袋１個当たりの平均量は１.２５ｇ(１.１０～１.４０ｇの範囲)であった。微生物学的分析は、材料がサルモネラ菌、リステリア・モノサイトゲネス、腸内細菌、亜硫酸塩還元クロストリジウムおよびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含まないことを示した(表１２)。
プラセボ小袋の製造
プラセボゲル培地を含む約６０００個の小袋を製造した。小袋１個当たりの平均量は１.２５ｇ(１.１０～１.４０ｇの範囲)であった。微生物学的分析は、材料がサルモネラ菌、リステリア・モノサイトゲネス、腸内細菌、亜硫酸塩還元クロストリジウムおよびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含まないことを示した(表１２)。
【表11】
【0246】
アクネ菌を含む小袋の製造
Ｃ３株およびＫ８株を培養した。発酵期間は１４時間であった。実験１.２および１.３と一致して、Ｋ８株よりＣ３株についてわずかに高いＯＤ６００および生存数が観察された。ＯＤ６００値に基づいて、Ｃ３およびＫ８の濃縮培地を４７：５３の比で混合し、混合物中の最終比を１：１とし、それに１.５％ ＨＥＣを添加して小袋に包装した。表１３にその結果を要約する。細菌の顕微鏡写真(図２４)はアクネ菌の典型的な形態学を示した。生存数の測定に加えて、細菌の濃度もまた、ＦＡＣＳフローサイトメトリーにより決定した(表４)。この方法は、２つの異なるＤＮＡ染色により、生存している、損傷したおよび死滅した細胞を識別できる。生存数およびＦＡＣＳ生存細胞についての結果は、両菌株について同様であった。Ｃ３株およびＫ８株の培養物におけるＦＡＣＳ死滅細胞の割合(全体の割合)は、１８％および４０％であった。予想外に、濃縮細胞懸濁液におけるＦＡＣＳ死滅細胞は、培養物における割合より低く、Ｃ３およびＫ８について、それぞれ８％および１６％であった。
Ｃ３株およびＫ８株を培養した。発酵期間は１４時間であった。実験１.２および１.３と一致して、Ｋ８株よりＣ３株についてわずかに高いＯＤ６００および生存数が観察された。ＯＤ６００値に基づいて、Ｃ３およびＫ８の濃縮培地を４７：５３の比で混合し、混合物中の最終比を１：１とし、それに１.５％ ＨＥＣを添加して小袋に包装した。表１３にその結果を要約する。細菌の顕微鏡写真(図２４)はアクネ菌の典型的な形態学を示した。生存数の測定に加えて、細菌の濃度もまた、ＦＡＣＳフローサイトメトリーにより決定した(表４)。この方法は、２つの異なるＤＮＡ染色により、生存している、損傷したおよび死滅した細胞を識別できる。生存数およびＦＡＣＳ生存細胞についての結果は、両菌株について同様であった。Ｃ３株およびＫ８株の培養物におけるＦＡＣＳ死滅細胞の割合(全体の割合)は、１８％および４０％であった。予想外に、濃縮細胞懸濁液におけるＦＡＣＳ死滅細胞は、培養物における割合より低く、Ｃ３およびＫ８について、それぞれ８％および１６％であった。
【表12】
【0247】
合計約１０,０００個の小袋を製造し、そのうち９０００個の小袋をビニール袋(袋１個あたり小袋１８個)に包装した。小袋１個あたりのゲル培地の量を、小袋１個あたり１.２ｇに調製した。この量は通常開封し、絞り出すことにより、小袋から少なくとも１ｍｌ取り出すことを可能にする。小袋１個あたりのゲル培地の量を、小袋５００～１０００個ごとに(各時点で６個)測定した。小袋１個あたりの量は１.１７ｇ～１.３８ｇまで変化し、平均は１.２８ｇであった。小袋の製造の総稼働時間は７時間であった。小袋におけるゲル培地の生存数を製造作業中に４回決定し、それらは３.８ｘ１０７～４.３ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌの間で変化し、平均は４.０ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌであった(表１３)。これらの結果に基づいて、－８０℃で保存する前の小袋１個あたりの平均生存数は５.１ｘ１０７ｃｆｕであった。－８０℃で７日間保存後の小袋１個あたりのゲル培地の生存数は、２.９ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌであり(表４)、小袋１個あたり３.７ｘ１０７ｃｆｕに対応する。微生物学的分析は、アクネ菌細菌のブレンドを含むゲル培地はサルモネラ菌、リステリア・モノサイトゲネス、腸内細菌、亜硫酸塩還元クロストリジウムおよびコアグラーゼ陽性ブドウ球菌を含まないことを示した(表１２)。表１４は小袋製造に使用されるラミネート加工したアルミホイルの規格を示す。
【表13】
【0248】
要約
酵母抽出物の代替源およびペプトンの添加を用いることにより、アクネ菌Ｃ３およびＫ８の培養ついての培地組成を変更した。酵母抽出物の二つの供給源を比較し、ダイズペプトンの培地への添加の効果を決定した。細菌をフラスコで培養した。表１０は培養物の生存数およびＯＤ６００を示す。データは、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物はＫａｔ酵母抽出物より高いＯＤ６００値および生存数を達成した。さらに、ＯＤ６００、およびそれより少ない程度に、生存数に対するダイズペプトンの有益な効果が検出された。Ｃ３株よりＫ８株でより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ペプトンおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物を含む培地を用いて後の実験を行った。アクネ菌株はｐＨ制御発酵槽において、１４時間で約５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌに対応するＯＤ６００ ４.０～５.０の最終バイオマス量まで増殖した。全体で９０００個を超える５.１ｘ１０７ｃｆｕ／小袋のアクネ菌Ｃ３株とＫ８株の１：１のブレンドを含む小袋を製造し、－８０℃で保存した。
酵母抽出物の代替源およびペプトンの添加を用いることにより、アクネ菌Ｃ３およびＫ８の培養ついての培地組成を変更した。酵母抽出物の二つの供給源を比較し、ダイズペプトンの培地への添加の効果を決定した。細菌をフラスコで培養した。表１０は培養物の生存数およびＯＤ６００を示す。データは、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物はＫａｔ酵母抽出物より高いＯＤ６００値および生存数を達成した。さらに、ＯＤ６００、およびそれより少ない程度に、生存数に対するダイズペプトンの有益な効果が検出された。Ｃ３株よりＫ８株でより高いＯＤ６００および生存数が得られた。これらの結果に基づいて、ペプトンおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ酵母抽出物を含む培地を用いて後の実験を行った。アクネ菌株はｐＨ制御発酵槽において、１４時間で約５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌに対応するＯＤ６００ ４.０～５.０の最終バイオマス量まで増殖した。全体で９０００個を超える５.１ｘ１０７ｃｆｕ／小袋のアクネ菌Ｃ３株とＫ８株の１：１のブレンドを含む小袋を製造し、－８０℃で保存した。
【0249】
培養方法の変更(別の酵母抽出物源、ペプトン含有培地およびｐＨ制御発酵槽における培養)は、５～１０倍高いアクネ菌Ｃ３およびＫ８の収量をもたらした。
【0250】
生存数とＯＤ６００の間の比は、試験を通じて完全に一定であり：ＯＤ６００ １.０の培養物または懸濁液について５ｘ１０７～１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ懸濁液であった。この細胞濃度は他の多くの細菌、例えばラクトバチルス種および大腸菌と比較して低い。これはアクネ菌細胞がこれらの種より大型であることを示す。
【0251】
－８０℃で１週間保存した小袋中のアクネ菌の濃度は、冷凍前よりわずかに低く(それぞれ４.０ｘ１０７および２.９ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌ)(表４)、これは細菌が冷凍作業で十分に生存したことを示す。
【0252】
実施例７：大規模臨床試験
パイロット試験の解析に基づいて、次の態様を大規模臨床試験に包含させた：製剤Ａ２が試験に選択され；２３名の対象が活性群に割り当てられ、２３名の対象がプラセボ群に割り当てられ；マイクロバイオームにおいていくつかの種の菌株レベル分析が包含され；そして受容者の割合を増加させるために最適化された殺菌プロトコルが包含される。ざ瘡患者は、少なくとも一部は多い病変数およびより高いざ瘡グレード、および対象が尋常性ざ瘡(pure teenage acne)(ホルモン性ざ瘡、成人性ざ瘡などを除く)を有する対象であるかどうかに基づいて選択される。
パイロット試験の解析に基づいて、次の態様を大規模臨床試験に包含させた：製剤Ａ２が試験に選択され；２３名の対象が活性群に割り当てられ、２３名の対象がプラセボ群に割り当てられ；マイクロバイオームにおいていくつかの種の菌株レベル分析が包含され；そして受容者の割合を増加させるために最適化された殺菌プロトコルが包含される。ざ瘡患者は、少なくとも一部は多い病変数およびより高いざ瘡グレード、および対象が尋常性ざ瘡(pure teenage acne)(ホルモン性ざ瘡、成人性ざ瘡などを除く)を有する対象であるかどうかに基づいて選択される。
【0253】
対象は顔の尋常性ざ瘡グレード１.５～４(リード規模)を有する個体である。対象は、１６～２３歳の男女両方を含む。
【0254】
１日目に、全ての対象は過酸化ベンゾイル製品(Ａｋｎｅｒｏｘｉｄ ｇｅｌ ５０ｍｇ／ｇ、Ａｌｍｉｒａｌｌ社)を受け取り、１日１回、７日間(１日目～７日目)顔に適用した。８日目に、対象は試験製品(細菌製品またはプラセボ)を受け取った。対象は顔に試験製品を１日２回(朝晩)、洗顔後に適用する。対象は製品を１１週間(８日目～８４日目)適用し続ける。この期間後、あらゆる適用なしに２週間経過観察する。測定およびサンプリングを１日目、７日目、２８日目、５６日目、８４日目、９１日目および９８日目に実施する(表８、図８Ｂ)。表８において、「Ｘ」は試験のそれぞれ指定された日にどの解析法が行われるかを示す。
【表14】
【0255】
測定方法
病変カウントは熟練された研究者により視覚的に行われた。安全性評価は治験担当医または治験担当看護師により、発赤、炎症または何らかの他の皮膚の問題の視覚的評価により評価される。各来院時に画像を撮影する。実施例５で検討されたパイロット期間試験中は通常のカメラを使用したが、大規模臨床試験において、イメージングは、皮膚の状態を記録するために熟練治験担当医または治験担当看護師によって撮影された可視光線、交差偏光または青色蛍光灯によって行われる。
病変カウントは熟練された研究者により視覚的に行われた。安全性評価は治験担当医または治験担当看護師により、発赤、炎症または何らかの他の皮膚の問題の視覚的評価により評価される。各来院時に画像を撮影する。実施例５で検討されたパイロット期間試験中は通常のカメラを使用したが、大規模臨床試験において、イメージングは、皮膚の状態を記録するために熟練治験担当医または治験担当看護師によって撮影された可視光線、交差偏光または青色蛍光灯によって行われる。
【0256】
治験担当看護師により、セブメーターを使用した脂質分析が行われる。セブテープを使用した脂質分析は、皮膚における皮脂の内容物および量に関して詳細を提供する。測定のために、被験者の皮膚を、７０％イソプロパノールを浸透させた綿棒または同様の製品で試験領域を脱脂することにより準備する。その後セブテープを対象の皮膚(額)に３０分間置き、測定する。
【0257】
皮膚ｐＨメーターを使用することにより、ｐＨ分析を実施した。それは皮膚の調製を何ら伴わない非観血的即時的方法である
【0258】
無菌綿棒を用いたマイクロバイオーム分析は、綿棒を回転させながら３０秒間皮膚上を移動させ、皮膚表面に生息している細菌群集を収集する非観血的即時的方法である。
【0259】
ストリップ３－Ｓ－Ｂｉｏｋｉｔ(Ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)を用いたマイクロバイオーム分析により、ろ胞中の細菌群集に到達することが可能となる。それは皮膚に優しい１滴のシアノアクリレートを有するプラスチック製ストリップを優しく皮膚に押し付け、１分間乾燥させる非観血的方法である。反応性の皮膚では、ストリップの除去後数分間、発赤が観察される。しかしながら、長期のまたは顕著な刺激は予想されない。
【0260】
統計的方法
継続的な変数について、数値、平均値、中央値、標準誤差、最小値および最大値を評価する。有意閾値は５％である。
継続的な変数について、数値、平均値、中央値、標準誤差、最小値および最大値を評価する。有意閾値は５％である。
【0261】
包含データについて記述的解析を実施する。包含および非包含基準を記載し(数値および割合)、偏差を挙げる。脱落した患者もまた記載し(数値および割合)、中断の理由を挙げる。
【0262】
一次解析は、無作為化され少なくとも１回のベースライン後の来院歴を有する全ての患者を含む治療企図集団で実施される。完全なデータを有し、重大なプロトコル違反を有さない全ての患者を含むパープロトコル集団において、感度解析を実施する。少なくとも１回の微生物での処置(実験的または対照)を受けた全ての患者を包含する安全性集団において、安全性解析を実施する。
【0263】
サンプル規模計算：細菌集団において予想される変化についてのデータが入手できないため、サンプル規模計算は全病変における有効性エンドポイントに基づく。University Clinic of Dermatology in Magdeburg (Thielitzら、2015)での先のざ瘡試験において、３つの異なるゲル剤が比較された。３回の処置にわたって平均化した１２週間の処置期間にわたって、４０％±３２％(平均±標準偏差)の全病変数の減少が観察された。本明細書に記載される大規模臨床試験の活性処置において同様の効果が予想される。対照群において、残存効果(試験での測定およびプラセボ効果による)の最大１５％の減少が観察され得る。したがって、試験群ごとの少なくとも２７名のサンプル規模が、誤差レベル０.０５および８０％の検出力を有する２つのｔ検定における差異を検出するために含まれる。脱落の希釈効果を相殺するためのさらなる１０％の対象を含めて、処置群ごとに３０名の患者が含まれる。１つのコホートで６０人の患者全員を勧誘できないならば、中間解析を用いた適応的デザインが実行される。第一のコホートを実行し、このコホートが完了した後、マイクロバイオーム組成物の変化の解析を行う。既にマイクロバイオーム組成物の変化についての明確かつ統計的に有意なシグナルが観察されるならば、その後臨床パラメーターを評価する。臨床パラメーターもまた統計的に有意な結果を示すならば、その後試験を終了し、全体の解析を開始する。結果が統計的に有意でないならば、または結果の統計的有意差が不明確であるならば、その後第二の患者のコホートを試験する。
【0264】
効果解析：細菌の組成物および臨床的パラメーター(主要：全病変数、副次：皮脂産生)における変化の２つの異なるレベルでの効果が考えられる。
【0265】
記述的解析：処置されたまたは処置されていない対象の両方について、各評価時(パイロット：１日目、７日目、２１日目および４２日目；大規模臨床試験：１日目、７日目、２８日目、５６日目、８４日目および１１２日目)および差異（評価の日 － Ｄ０）についてに記述的解析を実施する。数値、平均、中央値、標準誤差、最小値および最大値が得られる。
【0266】
主要臨床エンドポイントの解析：全病変数を各患者のベースライン測定の割合(または分布が歪んでいるならば、その対数)とみなす。ベースラインから１２週目までの差異を、ベースライン後１２週目までの全ての来院を含む反復測定についての線形混合モデルにおいて両方の試験群を比較し、これは明確な補完技術を用いず、数来院の数値を欠く患者を含んでよい。固定因子は処置群および性別および全病変の絶対ベースライン数および共変数としての年齢である。処置効果についての検定が有意である(ｐ＜０.０５)ならば、その後レベル０.０５でベースラインから１６日目までの数における差異についてもまた検定を実施する。この階層的な方法は、両方の段階にわたる誤差レベルを明確にする。二次解析として、全ての方法をパープロトコル集団において実施する。
【0267】
副次臨床エンドポイント：副次臨床エンドポイントは、主要臨床エンドポイントと同様に処理される。
【0268】
細菌組成解析：細菌組成物の一次分析は、活性処置の化合物である４種の細菌株の相対存在量を含む。解析は、主要エンドポイントに類似するが、４種の菌株の並行評価について０.０５／４＝０.０１２５のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正された有意差レベルで行われる。
【0269】
二次多変量解析について、マイクロバイオームの差異を、マイクロバイオームを記載するベクターとコンピューターで比較する。ベクターの各位置は、特定の菌株が検出された回数を示す数字を含む。種々のマイクロバイオーム間の差異を測定するために、相関距離を使用する。さらに、適用される混合物の組成についてのアクネ菌マイクロバイオームの距離を、上と同様の方法を用いて計算する。単純なスピアマン相関が使用され得るが、他の統計的方法もまた、適用され得る。さらなる解析は、両方の試験群間の経時的な種々の細菌の分布の比較(例えば、Ｓｈａｎｎｏｎ指数として表される)およびその安定性の比較を含む。
【0270】
引用文献
Allgaier, H., Jung, G., Werner, R.G., Schneider, U., and Zahner, H. (1986). Epidermin: sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. Eur. J. Biochem. FEBS 160, 9-22.
Azoulay, L., Oraichi, D., and Berard, A. (2007). Isotretinoin therapy and the incidence of acne relapse: a nested case-control study. Br. J. Dermatol. 157, 1240-1248.
Barnard, E., Liu, J., Yankova, E., Cavalcanti, S.M., Magalhaes, M., Li, H., Patrick, S., and McDowell, A. (2016). Strains of the Propionibacterium acnes type III lineage are associated with the skin condition progressive macular hypomelanosis. Sci. Rep. 6, 31968.Bek-Thomsen, M., Lomholt, H.B., and Kilian, M. (2008). Acne is not associated with yet-uncultured bacteria. J. Clin. Microbiol. 46, 3355-3360.
Belkaid, Y., and Segre, J.A. (2014). Dialogue between skin microbiota and immunity. Science 346, 954-959.
Berson, D.S., Chalker, D.K., Harper, J.C., Leyden, J.J., Shalita, A.R., and Webster, G.F. (2003). Current concepts in the treatment of acne: report from a clinical roundtable. Cutis 72, 5-13.
Brueggemann, H., Lomholt, H.B., Tettelin, H., and Kilian, M. (2012). CRISPR/cas loci of type II Propionibacterium acnes confer immunity against acquisition of mobile elements present in type I P. acnes. PloS One 7, e34171.
Churruca, I., Fernandez-Quintela, A., and Portillo, M.P. (2009). Conjugated linoleic acid isomers: differences in metabolism and biological effects. BioFactors Oxf. Engl. 35, 105-111.
Clavaud, C., Jourdain, R., Bar-Hen, A., Tichit, M., Bouchier, C., Pouradier, F., El Rawadi, C., Guillot, J., Menard-Szczebara, F., Breton, L., et al. (2013). Dandruff Is Associated with Disequilibrium in the Proportion of the Major Bacterial and Fungal Populations Colonizing the Scalp. PLoS ONE 8, e58203.
Consortium, T.H.M.P. (2012). Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214.
Allgaier, H., Jung, G., Werner, R.G., Schneider, U., and Zahner, H. (1986). Epidermin: sequencing of a heterodetic tetracyclic 21-peptide amide antibiotic. Eur. J. Biochem. FEBS 160, 9-22.
Azoulay, L., Oraichi, D., and Berard, A. (2007). Isotretinoin therapy and the incidence of acne relapse: a nested case-control study. Br. J. Dermatol. 157, 1240-1248.
Barnard, E., Liu, J., Yankova, E., Cavalcanti, S.M., Magalhaes, M., Li, H., Patrick, S., and McDowell, A. (2016). Strains of the Propionibacterium acnes type III lineage are associated with the skin condition progressive macular hypomelanosis. Sci. Rep. 6, 31968.Bek-Thomsen, M., Lomholt, H.B., and Kilian, M. (2008). Acne is not associated with yet-uncultured bacteria. J. Clin. Microbiol. 46, 3355-3360.
Belkaid, Y., and Segre, J.A. (2014). Dialogue between skin microbiota and immunity. Science 346, 954-959.
Berson, D.S., Chalker, D.K., Harper, J.C., Leyden, J.J., Shalita, A.R., and Webster, G.F. (2003). Current concepts in the treatment of acne: report from a clinical roundtable. Cutis 72, 5-13.
Brueggemann, H., Lomholt, H.B., Tettelin, H., and Kilian, M. (2012). CRISPR/cas loci of type II Propionibacterium acnes confer immunity against acquisition of mobile elements present in type I P. acnes. PloS One 7, e34171.
Churruca, I., Fernandez-Quintela, A., and Portillo, M.P. (2009). Conjugated linoleic acid isomers: differences in metabolism and biological effects. BioFactors Oxf. Engl. 35, 105-111.
Clavaud, C., Jourdain, R., Bar-Hen, A., Tichit, M., Bouchier, C., Pouradier, F., El Rawadi, C., Guillot, J., Menard-Szczebara, F., Breton, L., et al. (2013). Dandruff Is Associated with Disequilibrium in the Proportion of the Major Bacterial and Fungal Populations Colonizing the Scalp. PLoS ONE 8, e58203.
Consortium, T.H.M.P. (2012). Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214.
【0271】
Dore, J., and Blottiere, H. (2015). The influence of diet on the gut microbiota and its consequences for health. Curr. Opin. Biotechnol. 32C, 195-199.
Downing, D.T., Stewart, M.E., Wertz, P.W., and Strauss, J.S. (1986). Essential fatty acids and acne. J. Am. Acad. Dermatol. 14, 221-225.
Draelos, Z.D. (2009). Cosmeceuticals: undefined, unclassified, and unregulated. Clin. Dermatol. 27, 431-434.
Fitz-Gibbon, S., Tomida, S., Chiu, B.-H., Nguyen, L., Du, C., Liu, M., Elashoff, D., Erfe, M.C., Loncaric, A., Kim, J., et al. (2013). Propionibacterium acnes strain populations in the human skin microbiome associated with acne. J. Invest. Dermatol. 133, 2152-2160.
Flores, G.E., Henley, J.B., and Fierer, N. (2012). A Direct PCR Approach to Accelerate Analyses of Human-Associated Microbial Communities. PLoS ONE 7.
Goetz, F., Perconti, S., Popella, P., Werner, R., and Schlag, M. (2014). Epidermin and gallidermin: Staphylococcal lantibiotics. Int. J. Med. Microbiol. IJMM 304, 63-71.Grice, E.A., and Segre, J.A. (2011). The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253.
Holmes, A.D. (2013). Potential role of microorganisms in the pathogenesis of rosacea. J. Am. Acad. Dermatol. 69, 1025-1032.
Hong Lioe Ko, S., Heczko, P.B., and Pulverer, G. (1978). Differential Susceptibility of Propionibacterium acnes, P. granulosum and P. avidum to Free Fatty Acids. J. Invest. Dermatol. 71, 363-365.
Hunyadkuerti, J., Feltoti, Z., Horvath, B., Nagymihaly, M., Voeroes, A., McDowell, A., Patrick, S., Urban, E., and Nagy, I. (2011). Complete Genome Sequence of Propionibacterium acnesType IB Strain 6609. J. Bacteriol. 193, 4561-4562.
Iinuma, K., Sato, T., Akimoto, N., Noguchi, N., Sasatsu, M., Nishijima, S., Kurokawa, I., and Ito, A. (2009). Involvement of Propionibacterium acnes in the Augmentation of Lipogenesis in Hamster Sebaceous Glands In Vivo and In Vitro. J. Invest. Dermatol. 129, 2113-2119.
Downing, D.T., Stewart, M.E., Wertz, P.W., and Strauss, J.S. (1986). Essential fatty acids and acne. J. Am. Acad. Dermatol. 14, 221-225.
Draelos, Z.D. (2009). Cosmeceuticals: undefined, unclassified, and unregulated. Clin. Dermatol. 27, 431-434.
Fitz-Gibbon, S., Tomida, S., Chiu, B.-H., Nguyen, L., Du, C., Liu, M., Elashoff, D., Erfe, M.C., Loncaric, A., Kim, J., et al. (2013). Propionibacterium acnes strain populations in the human skin microbiome associated with acne. J. Invest. Dermatol. 133, 2152-2160.
Flores, G.E., Henley, J.B., and Fierer, N. (2012). A Direct PCR Approach to Accelerate Analyses of Human-Associated Microbial Communities. PLoS ONE 7.
Goetz, F., Perconti, S., Popella, P., Werner, R., and Schlag, M. (2014). Epidermin and gallidermin: Staphylococcal lantibiotics. Int. J. Med. Microbiol. IJMM 304, 63-71.Grice, E.A., and Segre, J.A. (2011). The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253.
Holmes, A.D. (2013). Potential role of microorganisms in the pathogenesis of rosacea. J. Am. Acad. Dermatol. 69, 1025-1032.
Hong Lioe Ko, S., Heczko, P.B., and Pulverer, G. (1978). Differential Susceptibility of Propionibacterium acnes, P. granulosum and P. avidum to Free Fatty Acids. J. Invest. Dermatol. 71, 363-365.
Hunyadkuerti, J., Feltoti, Z., Horvath, B., Nagymihaly, M., Voeroes, A., McDowell, A., Patrick, S., Urban, E., and Nagy, I. (2011). Complete Genome Sequence of Propionibacterium acnesType IB Strain 6609. J. Bacteriol. 193, 4561-4562.
Iinuma, K., Sato, T., Akimoto, N., Noguchi, N., Sasatsu, M., Nishijima, S., Kurokawa, I., and Ito, A. (2009). Involvement of Propionibacterium acnes in the Augmentation of Lipogenesis in Hamster Sebaceous Glands In Vivo and In Vitro. J. Invest. Dermatol. 129, 2113-2119.
【0272】
Kasimatis, G., Fitz-Gibbon, S., Tomida, S., Wong, M., and Li, H. (2013). Analysis of complete genomes of Propionibacterium acnes reveals a novel plasmid and increased pseudogenes in an acne associated strain. BioMed Res. Int. 2013, 918320.
Kearney, J.N., Ingham, E., Cunliffe, W.J., and Holland, K.T. (1984). Correlations between human skin bacteria and skin lipids. Br. J. Dermatol. 110, 593-599.
King, K., Jones, D.H., Daltrey, D.C., and Cunliffe, W.J. (1982). A double-blind study of the effects of 13-cis-retinoic acid on acne, sebum excretion rate and microbial population. Br. J. Dermatol. 107, 583-590.
Kong, H.H., Oh, J., Deming, C., Conlan, S., Grice, E.A., Beatson, M.A., Nomicos, E., Polley, E.C., Komarow, H.D., Murray, P.R., et al. (2012). Temporal shifts in the skin microbiome associated with disease flares and treatment in children with atopic dermatitis. Genome Res. 22, 850-859.
Letawe, C., Boone, M., and Pierard, G.E. (1998). Digital image analysis of the effect of topically applied linoleic acid on acne microcomedones. Clin. Exp. Dermatol. 23, 56-58.
Leyden, J. (2001). Current issues in antimicrobial therapy for the treatment of acne. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 15, 51-55.
Lomholt, H.B., and Kilian, M. (2010). Population Genetic Analysis of Propionibacterium acnes Identifies a Subpopulation and Epidemic Clones Associated with Acne. PLoS ONE 5.
Kearney, J.N., Ingham, E., Cunliffe, W.J., and Holland, K.T. (1984). Correlations between human skin bacteria and skin lipids. Br. J. Dermatol. 110, 593-599.
King, K., Jones, D.H., Daltrey, D.C., and Cunliffe, W.J. (1982). A double-blind study of the effects of 13-cis-retinoic acid on acne, sebum excretion rate and microbial population. Br. J. Dermatol. 107, 583-590.
Kong, H.H., Oh, J., Deming, C., Conlan, S., Grice, E.A., Beatson, M.A., Nomicos, E., Polley, E.C., Komarow, H.D., Murray, P.R., et al. (2012). Temporal shifts in the skin microbiome associated with disease flares and treatment in children with atopic dermatitis. Genome Res. 22, 850-859.
Letawe, C., Boone, M., and Pierard, G.E. (1998). Digital image analysis of the effect of topically applied linoleic acid on acne microcomedones. Clin. Exp. Dermatol. 23, 56-58.
Leyden, J. (2001). Current issues in antimicrobial therapy for the treatment of acne. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 15, 51-55.
Lomholt, H.B., and Kilian, M. (2010). Population Genetic Analysis of Propionibacterium acnes Identifies a Subpopulation and Epidemic Clones Associated with Acne. PLoS ONE 5.
【0273】
Madli Puhvel, S., and Reisner, R.M. (1970). Effect of Fatty Acids on the Growth of Corynebacterium Acnes in Vitro. J. Invest. Dermatol. 54, 48-52.
Makrantonaki, E., Ganceviciene, R., and Zouboulis, C. (2011). An update on the role of the sebaceous gland in the pathogenesis of acne. Dermatoendocrinol. 3, 41-49.
McDowell, A., Barnard, E., Nagy, I., Gao, A., Tomida, S., Li, H., Eady, A., Cove, J., Nord, C.E., and Patrick, S. (2012). An Expanded Multilocus Sequence Typing Scheme for Propionibacterium acnes: Investigation of "Pathogenic", "Commensal" and Antibiotic Resistant Strains. PLoS ONE 7, e41480.
McLane, J. (2001). Analysis of common side effects of isotretinoin. J. Am. Acad. Dermatol. 45, S188-194.
Mourelatos, K., Eady, E. a., Cunliffe, W. j., Clark, S. m., and Cove, J. h. (2007). Temporal changes in sebum excretion and propionibacterial colonization in preadolescent children with and without acne. Br. J. Dermatol. 156, 22-31.
Moya-Camarena, S.Y., Heuvel, J.P.V., Blanchard, S.G., Leesnitzer, L.A., and Belury, M.A. (1999). Conjugated linoleic acid is a potent naturally occurring ligand and activator of PPARα. J. Lipid Res. 40, 1426-1433.
NIH HMP Working Group, Peterson, J., Garges, S., Giovanni, M., McInnes, P., Wang, L., Schloss, J.A., Bonazzi, V., McEwen, J.E., Wetterstrand, K.A., et al. (2009). The NIH Human Microbiome Project. Genome Res. 19, 2317-2323.
van Nood, E., Vrieze, A., Nieuwdorp, M., Fuentes, S., Zoetendal, E.G., de Vos, W.M., Visser, C.E., Kuijper, E.J., Bartelsman, J.F.W.M., Tijssen, J.G.P., et al. (2013). Duodenal Infusion of Donor Feces for Recurrent Clostridium difficile. N. Engl. J. Med. 368, 407-415.
Oh, J., Byrd, A.L., Deming, C., Conlan, S., NISC Comparative Sequencing Program, Kong, H.H., and Segre, J.A. (2014). Biogeography and individuality shape function in the human skin metagenome. Nature 514, 59-64.
Olle, B. (2013). Medicines from microbiota. Nat. Biotechnol. 31, 309-315.
Makrantonaki, E., Ganceviciene, R., and Zouboulis, C. (2011). An update on the role of the sebaceous gland in the pathogenesis of acne. Dermatoendocrinol. 3, 41-49.
McDowell, A., Barnard, E., Nagy, I., Gao, A., Tomida, S., Li, H., Eady, A., Cove, J., Nord, C.E., and Patrick, S. (2012). An Expanded Multilocus Sequence Typing Scheme for Propionibacterium acnes: Investigation of "Pathogenic", "Commensal" and Antibiotic Resistant Strains. PLoS ONE 7, e41480.
McLane, J. (2001). Analysis of common side effects of isotretinoin. J. Am. Acad. Dermatol. 45, S188-194.
Mourelatos, K., Eady, E. a., Cunliffe, W. j., Clark, S. m., and Cove, J. h. (2007). Temporal changes in sebum excretion and propionibacterial colonization in preadolescent children with and without acne. Br. J. Dermatol. 156, 22-31.
Moya-Camarena, S.Y., Heuvel, J.P.V., Blanchard, S.G., Leesnitzer, L.A., and Belury, M.A. (1999). Conjugated linoleic acid is a potent naturally occurring ligand and activator of PPARα. J. Lipid Res. 40, 1426-1433.
NIH HMP Working Group, Peterson, J., Garges, S., Giovanni, M., McInnes, P., Wang, L., Schloss, J.A., Bonazzi, V., McEwen, J.E., Wetterstrand, K.A., et al. (2009). The NIH Human Microbiome Project. Genome Res. 19, 2317-2323.
van Nood, E., Vrieze, A., Nieuwdorp, M., Fuentes, S., Zoetendal, E.G., de Vos, W.M., Visser, C.E., Kuijper, E.J., Bartelsman, J.F.W.M., Tijssen, J.G.P., et al. (2013). Duodenal Infusion of Donor Feces for Recurrent Clostridium difficile. N. Engl. J. Med. 368, 407-415.
Oh, J., Byrd, A.L., Deming, C., Conlan, S., NISC Comparative Sequencing Program, Kong, H.H., and Segre, J.A. (2014). Biogeography and individuality shape function in the human skin metagenome. Nature 514, 59-64.
Olle, B. (2013). Medicines from microbiota. Nat. Biotechnol. 31, 309-315.
【0274】
Pappas, A., Johnsen, S., Liu, J.-C., and Eisinger, M. (2009). Sebum analysis of individuals with and without acne. Dermatoendocrinol. 1, 157-161.
Pierre, A.-S., Minville-Walz, M., Fevre, C., Hichami, A., Gresti, J., Pichon, L., Bellenger, S., Bellenger, J., Ghiringhelli, F., Narce, M., et al. (2013). Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid induced cell death in human colon cancer cells through reactive oxygen species-mediated ER stress. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Biol. Lipids 1831, 759-768.
Rivier, M., Castiel, I., Safonova, I., Ailhaud, G., and Michel, S. (2000). Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha enhances lipid metabolism in a skin equivalent model. J. Invest. Dermatol. 114, 681-687.
Rohland, N., and Reich, D. (2012). Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22, 939-946.
Ross, J.I., Snelling, A.M., Eady, E.A., Cove, J.H., Cunliffe, W.J., Leyden, J.J., Collignon, P., Dreno, B., Reynaud, A., Fluhr, J., et al. (2001). Phenotypic and genotypic characterization of antibiotic-resistant Propionibacterium acnes isolated from acne patients attending dermatology clinics in Europe, the U.S.A., Japan and Australia. Br. J. Dermatol. 144, 339-346.
Rosson, R.A., Grund, A.D., Deng, M.-D., and Sanchez-Riera, F. (2004). Linoleate isomerase.
Schnell, N., Entian, K.D., Schneider, U., Goetz, F., Zahner, H., Kellner, R., and Jung, G. (1988). Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulphide-rings. Nature 333, 276-278.
Scholz, C.F.P., Jensen, A., Lomholt, H.B., Brueggemann, H., and Kilian, M. (2014). A Novel High-Resolution Single Locus Sequence Typing Scheme for Mixed Populations of Propionibacterium acnes In Vivo. PLoS ONE 9, e104199.
Sorensen, M., Mak, T.N., Hurwitz, R., Ogilvie, L.A., Mollenkopf, H.J., Meyer, T.F., and Brueggemann, H. (2010). Mutagenesis of Propionibacterium acnes and analysis of two CAMP factor knock-out mutants. J. Microbiol. Methods 83, 211-216.
Pierre, A.-S., Minville-Walz, M., Fevre, C., Hichami, A., Gresti, J., Pichon, L., Bellenger, S., Bellenger, J., Ghiringhelli, F., Narce, M., et al. (2013). Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid induced cell death in human colon cancer cells through reactive oxygen species-mediated ER stress. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Biol. Lipids 1831, 759-768.
Rivier, M., Castiel, I., Safonova, I., Ailhaud, G., and Michel, S. (2000). Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha enhances lipid metabolism in a skin equivalent model. J. Invest. Dermatol. 114, 681-687.
Rohland, N., and Reich, D. (2012). Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22, 939-946.
Ross, J.I., Snelling, A.M., Eady, E.A., Cove, J.H., Cunliffe, W.J., Leyden, J.J., Collignon, P., Dreno, B., Reynaud, A., Fluhr, J., et al. (2001). Phenotypic and genotypic characterization of antibiotic-resistant Propionibacterium acnes isolated from acne patients attending dermatology clinics in Europe, the U.S.A., Japan and Australia. Br. J. Dermatol. 144, 339-346.
Rosson, R.A., Grund, A.D., Deng, M.-D., and Sanchez-Riera, F. (2004). Linoleate isomerase.
Schnell, N., Entian, K.D., Schneider, U., Goetz, F., Zahner, H., Kellner, R., and Jung, G. (1988). Prepeptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulphide-rings. Nature 333, 276-278.
Scholz, C.F.P., Jensen, A., Lomholt, H.B., Brueggemann, H., and Kilian, M. (2014). A Novel High-Resolution Single Locus Sequence Typing Scheme for Mixed Populations of Propionibacterium acnes In Vivo. PLoS ONE 9, e104199.
Sorensen, M., Mak, T.N., Hurwitz, R., Ogilvie, L.A., Mollenkopf, H.J., Meyer, T.F., and Brueggemann, H. (2010). Mutagenesis of Propionibacterium acnes and analysis of two CAMP factor knock-out mutants. J. Microbiol. Methods 83, 211-216.
【0275】
Tripathi, S.V., Gustafson, C.J., Huang, K.E., and Feldman, S.R. (2013). Side effects of common acne treatments. Expert Opin. Drug Saf. 12, 39-51.
Wang, Y., Kuo, S., Shu, M., Yu, J., Huang, S., Dai, A., Two, A., Gallo, R.L., and Huang, C.-M. (2014). Staphylococcus epidermidis in the human skin microbiome mediates fermentation to inhibit the growth of Propionibacterium acnes: implications of probiotics in acne vulgaris. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 411-424.
Wang, L., Clavaud, C., Bar-Hen, A., Cui, M., Gao, J., Liu, Y., Liu, C., Shibagaki, N., Gueniche, A., Jourdain, R., et al. (2015). Characterization of the major bacterial-fungal populations colonizing dandruff scalps in Shanghai, China, shows microbial disequilibrium. Exp. Dermatol. 24, 398-400.
Westerhof, W., Relyveld, G.N., Kingswijk, M.M., de Man, P., and Menke, H.E. (2004). Propionibacterium acnes and the pathogenesis of progressive macular hypomelanosis. Arch. Dermatol. 140, 210-214.
Zhao, L. (2010). Genomics: The tale of our other genome. Nature 465, 879-880.
Zouboulis, C.C. (2004). Acne and sebaceous gland function. Clin. Dermatol. 22, 360-366.
(2012). Special human Microbiota issue. Nature 486.
Wang, Y., Kuo, S., Shu, M., Yu, J., Huang, S., Dai, A., Two, A., Gallo, R.L., and Huang, C.-M. (2014). Staphylococcus epidermidis in the human skin microbiome mediates fermentation to inhibit the growth of Propionibacterium acnes: implications of probiotics in acne vulgaris. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 411-424.
Wang, L., Clavaud, C., Bar-Hen, A., Cui, M., Gao, J., Liu, Y., Liu, C., Shibagaki, N., Gueniche, A., Jourdain, R., et al. (2015). Characterization of the major bacterial-fungal populations colonizing dandruff scalps in Shanghai, China, shows microbial disequilibrium. Exp. Dermatol. 24, 398-400.
Westerhof, W., Relyveld, G.N., Kingswijk, M.M., de Man, P., and Menke, H.E. (2004). Propionibacterium acnes and the pathogenesis of progressive macular hypomelanosis. Arch. Dermatol. 140, 210-214.
Zhao, L. (2010). Genomics: The tale of our other genome. Nature 465, 879-880.
Zouboulis, C.C. (2004). Acne and sebaceous gland function. Clin. Dermatol. 22, 360-366.
(2012). Special human Microbiota issue. Nature 486.
【0276】
等価物
通常の範囲内の実験を用いることにより、当業者は本明細書に記載の本発明の特定の実施態様についての多数の等価物を認識するか、または確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲により包含されることを意図される。
通常の範囲内の実験を用いることにより、当業者は本明細書に記載の本発明の特定の実施態様についての多数の等価物を認識するか、または確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲により包含されることを意図される。
【0277】
本明細書に開示される、特許文書を含む全ての引例はそれらの全体の参照により包含させる。「Methods and Compositions for Changing the Composition of the Skin Microbiome Using Complex Mixtures of Bacterial Strains」と題された、２０１６年４月２０日に出願された国際公開第２０１６／１７２１９６号の全体の開示はその全体を参照により包含させる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】