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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-28
(45)【発行日】2023-03-08
(54)【発明の名称】エプシロンリシン残基を含む抗菌ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/00 20060101AFI20230301BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230301BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230301BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230301BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230301BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230301BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230301BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230301BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20230301BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230301BHJP
【ＦＩ】
C07K7/00 ZNA
C07K14/00
C07K7/06
C12N1/20 E
A61K38/08
A61K38/10
A61K38/16
A61P27/02
A61P31/10
A61P31/04
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019523802
(86)(22)【出願日】2017-10-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-11-28
(86)【国際出願番号】 SG2017050548
(87)【国際公開番号】W WO2018084807
(87)【国際公開日】2018-05-11
【審査請求日】2020-09-08
(31)【優先権主張番号】10201609136R
(32)【優先日】2016-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】508320723
【氏名又は名称】シンガポール ヘルス サービシーズ ピーティーイー リミテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】504161939
【氏名又は名称】ナンヤン・テクノロジカル・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】ラジャマニ ラクシュミナラヤナン
(72)【発明者】
【氏名】マヤンディ ヴェンカテシュ
(72)【発明者】
【氏名】ゴー ツェ レン エウニス
(72)【発明者】
【氏名】ボイアーマン ロジャー ウィルマー
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルマ ナヴィン クマール
【審査官】高山 敏充
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００２／００４５７３６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０２３５０９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２００６－０５５１５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０３１６６４３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1986年，Vol. 83，pp.5708-5712
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、リシン残基（Ｋ）の少なくとも１つがエプシロン－リシン残基である、ペプチド。
【請求項2】
前記ペプチドが１個のエプシロン－リシン残基を含む場合、前記エプシロン－リシン残基が２位（配列番号７）または
４位（配列番号８）または
１１位（配列番号９）または
１２位（配列番号１０）に位置する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み、リシン残基の少なくとも１つがエプシロン－リシン残基である、ペプチド。
【請求項4】
前記ペプチドが（ｉ）１つのエプシロン－リシン残基を含有する場合、エプシロン－リシン残基は
７位（配列番号１３）、もしくは
２１位（配列番号１２）、もしくは
２３位（配列番号１１）
に位置し；
または
（ｉｉ）２つのエプシロン－リシン残基を含有する場合、エプシロン－リシン残基は
７位および２１位（配列番号１５）、もしくは
７位および２３位（配列番号１６）
に位置し；
または
（ｉｉｉ）３つのエプシロン－リシン残基を含有する場合、３つのエプシロン－リシン残基は、７位、２１位、および２３位に位置する（配列番号１４）、
請求項３に記載のペプチド。
【請求項5】
ＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み、リシン残基の少なくとも１個がエプシロン－リシン残基である、ペプチド。
【請求項6】
前記ペプチドが６つのエプシロン－リシン残基を含む場合、前記６つのエプシロン－リシン残基は、１位、３位、５位、７位、９位、および１１位（配列番号１７、または配列番号１８、または配列番号１９）に位置する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項7】
療法または医学における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載の１以上のペプチド（複数可）を含む、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか一項に記載の１以上のペプチド（複数可）および／または請求項８に記載の組成物を含む、キット。
【請求項10】
請求項１～６のいずれか一項に記載の１以上のペプチド（複数可）および／または請求項８に記載の組成物を含む、眼科用製剤。
【請求項11】
微生物の成長を阻害するかまたは微生物のコロニー形成を管理するための薬剤の製造における、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチドおよび／または請求項８に記載の組成物の使用。
【請求項12】
微生物の前記成長を阻害することが微生物感染を処置する、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記微生物が細菌、真菌、薬剤耐性細菌、または薬剤耐性真菌である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項14】
前記細菌が、アシネトバクター・バウマンニ、エンテロバクター・クロアカ、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、フェーカリス菌およびフェシウム菌からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
前記薬剤耐性細菌が、カルバペナム耐性エンテロバクター株（ＣＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ポリミキシンＢ耐性エンテロバクター・クロアカ、薬剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、および多発性バイオフィルム形成緑膿菌および表皮ブドウ球菌株からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項16】
前記真菌が、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パプシローシス、カンジダ・トロピカリス、フザリウム・ソラニ、フザリウム・オキシスポラム、およびアスペルギルス・フミガーツスからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項17】
前記薬剤耐性真菌が、フザリウム・ソラニ、フザリウム・オキシスポラム、およびアスペルギルス・フミガーツスからなる群から選択される、請求項１３または１６に記載の使用。
【請求項18】
前記微生物感染が、黄色ブドウ球菌角膜炎、緑膿菌角膜炎、真菌性角膜炎、カンジダ角膜炎、およびフサリウム角膜炎からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項19】
請求項１、３、または５に記載の単離したペプチドの治療指数（安全性）を改善する方法であって、前記方法は、エプシロン－リシンに対するリシン残基の少なくとも１つを修飾することを含む、前記方法。
【請求項20】
増殖性疾患および／または炎症を処置するための薬剤の製造における、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチドおよび／または請求項８に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、シンガポール仮出願第１０２０１６０９１３６Ｒ号、２０１６年１１月１日出願の優先権の利益を主張し、その内容を、あらゆる目的のためにその全体において参照により本明細書に組み込む。
本出願は、シンガポール仮出願第１０２０１６０９１３６Ｒ号、２０１６年１１月１日出願の優先権の利益を主張し、その内容を、あらゆる目的のためにその全体において参照により本明細書に組み込む。
【0002】
発明の分野
本発明は、一般に、ペプチドの設計およびそれらの使用方法に関する。
本発明は、一般に、ペプチドの設計およびそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
抗生物質耐性細菌／真菌の広範な進化によって、公衆衛生にかなりの脅威がもたらされ、抗生物質の開発で達成される何十年もの便益がむしばまれる。好ましくない経済的利益および承認を得る際の規制上の課題のために、新しい抗生物質の発見および開発における著しい減少があった。多くのカチオン性ポリマーまたは殺生物剤は、過去５０年間にわたって、医学的および非医学的用途の両方で使用されてきた。
抗生物質耐性細菌／真菌の広範な進化によって、公衆衛生にかなりの脅威がもたらされ、抗生物質の開発で達成される何十年もの便益がむしばまれる。好ましくない経済的利益および承認を得る際の規制上の課題のために、新しい抗生物質の発見および開発における著しい減少があった。多くのカチオン性ポリマーまたは殺生物剤は、過去５０年間にわたって、医学的および非医学的用途の両方で使用されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
細菌の広範な進化の観点から、代替の抗菌ペプチドを提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
一態様では、単離されたペプチドを提供する。少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチド、以下のものがある：Ｄ－エプシロン－リシン、Ｌ－エプシロン－リシン、Ｄ－デルタ－オルニチン、Ｌ－デルタ－オルニチン、Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸およびＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１個の他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較した場合、低下した細胞毒性を有するかまたは細胞毒性を有しない。１つの実施形態において、ペプチドは、エプシロン－ポリリシンを含まない。別の実施形態では、ペプチド中のリシン残基に関して、ペプチドは、エプシロン－リシンアミノ酸残基およびアルファ－リシンアミノ酸残基のいずれか、またはエプシロン－リシンアミノ酸残基のみを含む。さらに別の態様において、ペプチドは、５～１００個のアミノ酸を含む。
【0006】
なおもう１つの実施形態において、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を有し、ここで、リシン残基（Ｋ）の少なくとも１つは、エプシロン－リシン残基である。さらに別の態様において、ペプチドが１個のエプシロン－リシン残基を含む場合、エプシロン－リシン残基は、２位（配列番号７）、または４位（配列番号８）、または１１位（配列番号９）、または１２位（配列番号１０）に位置する。
【0007】
なおもう１つの実施形態において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、ここで、リシン残基の少なくとも１つは、エプシロン－リシン残基である。なおもう１つの実施形態において、ペプチドが、（ｉ）１個のエプシロン－リシン残基を含む場合、エプシロン－リシン残基は、７位（配列番号１３）、もしくは２１位（配列番号１２）、もしくは２３位（配列番号１１）に位置し；または（ｉｉ）２個のエプシロン－リシン残基を含む場合、エプシロン－リシン残基は、７位および２１位（配列番号１５）、もしくは７位および２３位（配列番号１６）に位置し；または（ｉｉｉ）３個のエプシロン－リシン残基を含む場合、３つのエプシロン－リシン残基は、７位、２１位および２３位（配列番号１４）に位置する。
【0008】
さらに別の態様において、ペプチドは、ＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を有し、ここで、リシン残基の少なくとも１つは、エプシロン－リシン残基である。さらに別の態様において、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含み、６個のエプシロン－リシン残基は、１位、３位、５位、７位、９位、および１１位に位置する（配列番号１７、または配列番号１８、または配列番号１９）。
【0009】
別の局面において、療法または医学における使用のための、本明細書中に記載するペプチドを提供する。
【0010】
なお別の局面において、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）を含む医薬組成物を提供する。
【0011】
さらに別の態様では、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）および／または本明細書中に記載する組成物を含むキットを提供する。
【0012】
さらに別の態様では、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）および／または本明細書中に記載する組成物を含む眼科用製剤を提供する。
【0013】
さらに別の態様では、本明細書中に記載するペプチドおよび／または本明細書中に記載する組成物の薬学的に有効な量の投与を含む、微生物の成長を阻害する方法、または微生物のコロニー形成を管理する方法を提供する。さらに別の態様において、微生物の成長を阻害することは、微生物感染を処置する。さらに別の態様において、微生物は、細菌、真菌、薬剤耐性細菌、または薬剤耐性真菌である。さらに別の実施形態では、細菌は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、フェーカリス菌およびフェシウム菌からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、薬剤耐性細菌は、カルバペナム耐性エンテロバクター株（ＣＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ポリミキシンＢ耐性エンテロバクター・クロアカ、薬剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、ならびに大量のバイオフィルム形成緑膿菌および表皮ブドウ球菌株からなる群から選択される。さらに別の態様において、真菌は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、およびアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）からなる群から選択される。さらに別の態様において、薬剤耐性菌は、フサリウム・ソラニ、フサリウム・オキシスポラム、およびアスペルギルス・フミガーツスからなる群から選択される。さらに別の態様において、微生物感染症は、黄色ブドウ球菌角膜炎、緑膿菌角膜炎、真菌性角膜炎、カンジダ角膜炎、およびフサリウム角膜炎からなる群から選択される。
【0014】
別の態様では、ペプチドの治療指数（安全性）を改善する方法であって、ペプチドが、Ｄ－エプシロン－リシン、Ｌ－エプシロン－リシン、Ｄ－デルタ－オルニチン、Ｌ－デルタ－オルニチン、Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸、およびＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基、ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１個の他のものを含む少なくとも５個のアミノ酸残基を含み、当該ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１つを有しない同等のペプチドと比較した場合に低下した細胞毒性を有し、当該方法は、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも１つに対するリシン残基の少なくとも１つを修飾することを含む、前記方法を提供する。
【0015】
別の態様では、本明細書中に記載するペプチドおよび／または本明細書中に記載する組成物の薬学的有効量の投与を含む、増殖性疾患および／または炎症を処置する方法を提供する。
【0016】
本発明は、非限定的な実施例および添付の図面と併せて考察される場合、詳細な説明を参照してより良好に理解される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】図１は、アルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの対比を示す。図１Ａは、アルファ－ポリリシンの化学構造を図形的に示したものである。図１Ｂは、エプシロン－ポリリシンの化学構造を図形的に示したものである。図１Ｃは、黄色ブドウ球菌、緑膿菌およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のそれぞれ５種類の異なる株に対するアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの総平均ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）値を相関させる散布図を示す。したがって、図１は、両ポリマーの総平均ＭＩＣ（ＧＭ－ＭＩＣ）がグラム陽性株およびグラム陰性株に対して同等であり、一方εＰＬはカンジダ・アルビカンス株に対してαＰＬよりも低いＭＩＣを示したことを例示する。
【図2】図２は、アルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの細胞毒性の対比を示す。図２Ａは、ＭＴＳ細胞増殖アッセイによって評価した初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するアルファ－ポリリシンの細胞毒性を表す散布図を示す。図２Ｂは、ＭＴＳ細胞増殖アッセイによって評価した初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するエプシロン－ポリリシンの細胞毒性を表す散布図を示す。したがって、図２は、アルファ－ポリリシンが初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）細胞に対してエプシロン－ポリリシンよりも細胞毒性が低いことを例示する。
【図3】図３は、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の健康に対するアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの効果の対比を示す。図３Ａは、種々の濃度の初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの細胞毒性を示す高含有量分析（ＨＣＡ）画像のセットを示す。図３Ｂは、種々の濃度のアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンへの曝露後の初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の細胞健康における濃度依存的変化を示すヒートマップを表す一組の画像を示す。細胞毒性薬物であるノコダゾール（５μｇ／ｍｌ）を、陰性対照として用いる。したがって、図３は、アルファ－ポリリシンに曝露した初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）が細胞形態のかなりの異常を示し、一方エプシロン－ポリリシンに曝露した細胞は処理していない対照と類似したままであることを例示し、それによってさらに、エプシロン－ポリリシンがアルファ－ポリリシンよりも細胞毒性が低いことを示す。
【図4】図４は、エプシロン－ポリリシンのバイオフィルムを形成する細胞への曝露の影響を示す。図４は、エプシロン－ポリリシンへの曝露後の生細胞／死細胞比の定量的推定を表す棒グラフを示す。多量のバイオフィルム形成性ＰＡ０１株を、用いた。ＰＡ０１に対するエプシロン－ポリリシンのＭＩＣは、１６ｍｇ／ｍｌであった。対比のため、カチオン性ペプチド抗生物質ポリミキシンＢのバイオフィルム根絶特性もまた、示す。したがって、図４は、エプシロン－ポリリシンがカチオン性環状リポペプチド、ポリミキシンＢと比較した場合バイオフィルムの還元においてより有効であることを例証する。
【図5】図５は、エプシロン－ポリリシンおよびナタマイシンの真菌菌糸生存率に対する効果の比較を示す。図５Ａは、種々の濃度のエプシロン－ポリリシンに１６時間曝露した後の真菌菌糸の生存（ＭＴＴアッセイにより決定した）の定量的推定を表す線グラフを示す。図５Ｂは、種々の濃度のナタマイシンに１６時間曝露した後の真菌菌糸の生存（ＭＴＴアッセイにより決定した）の定量的評価を表す線グラフを示す。したがって、図５は、エプシロン－ポリリシンが、ＦＤＡ承認の点眼用抗真菌薬であるナタマイシンと比較して、真菌菌糸の生存を減少させるのにより有効であることを例証する。
【図6-1】図６－１は、グラム陰性菌株およびグラム陽性菌株のパネルに対するエプシロン－ポリリシンの時間死滅動力学実験の結果を表す一組の線グラフを示す。このように、図６は、多様な疾患を引き起こす病原体および薬剤耐性病原体に対するエプシロン－ポリリシンの強力な殺菌特性を例証する。
【図6-2】図６－２は、グラム陰性菌株およびグラム陽性菌株のパネルに対するエプシロン－ポリリシンの時間死滅動力学実験の結果を表す一組の線グラフを示す。このように、図６は、多様な疾患を引き起こす病原体および薬剤耐性病原体に対するエプシロン－ポリリシンの強力な殺菌特性を例証する。
【図6-3】図６－３は、グラム陰性菌株およびグラム陽性菌株のパネルに対するエプシロン－ポリリシンの時間死滅動力学実験の結果を表す一組の線グラフを示す。このように、図６は、多様な疾患を引き起こす病原体および薬剤耐性病原体に対するエプシロン－ポリリシンの強力な殺菌特性を例証する。
【図6-4】図６－４は、グラム陰性菌株およびグラム陽性菌株のパネルに対するエプシロン－ポリリシンの時間死滅動力学実験の結果を表す一組の線グラフを示す。このように、図６は、多様な疾患を引き起こす病原体および薬剤耐性病原体に対するエプシロン－ポリリシンの強力な殺菌特性を例証する。
【図7】図７は、感染性角膜炎のウサギモデルにおける０．３％（ｗ／ｖ）エプシロン－ポリリシンの有効性を比較する一組の細隙灯生体顕微鏡画像を示す。５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ（５０μｌ）の最初の接種物を、創傷角膜に適用し、画像を、感染後２４時間（ｐ．ｉ．）に撮像した。処置を、この時点で、５０μｌのエプシロン－ポリリシンまたはジマー（０．３％ガチフロキサシン）を感染した眼に４回／日で３日間適用することによって開始した。画像を、処置後（ｐ．ｔ．）２４、４８、７２時間に撮影した。溶媒単独（１０ｍＭのＰＢＳ）を、対照として供した。したがって、図７は、エプシロン－ポリリシンで処置した眼が、他の群と比較して、結膜浮腫および分泌物、角膜混濁および結膜発赤の有意な減少を示したことを例証する。
【図8-1】図８－１は、ウサギ角膜におけるエプシロン－ポリリシンおよびザイマー処置の対比を示す。図８Ａは、感染した、および処置したウサギ角膜の前方セグメント光干渉断層撮影（ＡＳ－ＯＣＴ）試験の結果を表す一組の画像を示す。従って、図８は、エプシロン－ポリリシンで処置した眼が、Ｚｙｍａｒ（登録商標）またはＰＢＳで処置した眼と比較して、処置後２４時間で浮腫の有意な減少を示したことを例証する。さらに、エプシロン－ポリリシンおよびＺｙｍａｒで処置した角膜は共に、生菌の存在を示さず、一方ＰＢＳで処置した角膜は、４．１±０．１３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含んでいた。
【図8-2】図８－２は、ウサギ角膜におけるエプシロン－ポリリシンおよびザイマー処置の対比を示す。図８Ｂは、ＰＢＳ、エプシロン－ポリリシン、およびザイマーの適用後の中心角膜厚の漸進的変化を表すグラフを示す。合計６匹のウサギを、各適用について含めた。図８Ｃは、エプシロン－ポリリシンおよびザイマーの処置後（ｐ．ｔ．）７２時間での切除角膜における細菌生存率の微生物学的計数を表すグラフを示す。従って、図８は、エプシロン－ポリリシンで処置した眼が、Ｚｙｍａｒ（登録商標）またはＰＢＳで処置した眼と比較して、処置後２４時間で浮腫の有意な減少を示したことを例証する。さらに、エプシロン－ポリリシンおよびＺｙｍａｒで処置した角膜は共に、生菌の存在を示さず、一方ＰＢＳで処置した角膜は、４．１±０．１３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの細菌を含んでいた。
【図9-1】図９－１は、シュードモナス角膜炎に感染したウサギ角膜におけるエプシロン－ポリリシンおよびザイマー処置の対比を示す。緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株。図９Ａは、シュードモナス角膜炎のウサギモデルにおける０．３％（ｗ／ｖ）エプシロン－ポリリシンの有効性を比較する一組の細隙灯生体顕微鏡画像を示す。緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株を用いて、角膜に感染させた。５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ（５０μｌ）の最初の接種物を、創傷した角膜に適用し、画像を、感染後（ｐ．ｉ．）２４時間に撮像した。処置を、この時点で、５０μｌのエプシロン－ポリリシンまたはＴｏｂｒｅｘ（０．３％トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｃｙｉｎ））を感染した眼に４回／日で３日間適用することによって開始した。画像を、処置後（ｐ．ｔ．）２４、４８、７２時間に撮影した。溶媒単独（１０ｍＭのＰＢＳ）を、対照として供した。計１０匹のウサギを、エプシロン－ポリリシン処理に、および各々４匹を、ＰＢＳおよびＴｏｂｒｅｘに用いた。図９Ｂは、感染／処置の前および後の角膜厚の漸進的変化を表すグラフを示す。したがって、図９は、エプシロン－ポリリシンが緑膿菌感染の除去に有効であり、エプシロン－ポリリシンが局所的適用に適した抗菌特性を有することを例示する。
【図9-2】図９－２は、シュードモナス角膜炎に感染したウサギ角膜におけるエプシロン－ポリリシンおよびザイマー処置の対比を示す。緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株。図９Ｃは、処置後（ｐ．ｔ．）７２時間における感染した角膜における細菌生存能の微生物学的計数を表すグラフを示す。したがって、図９は、エプシロン－ポリリシンが緑膿菌感染の除去に有効であり、エプシロン－ポリリシンが局所的適用に適した抗菌特性を有することを例示する。
【図10】図１０は、ペプチド中のエプシロン－リシン残基の抗菌効果を示す。図１０Ａは、エプシロン－リシンの数の増加に伴う最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値の変化を表す線グラフを示す。グラフについてのデータを、Ｓｈｉｍａ．ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）．１９８４ Ｎｏｖ；３７（１１）：１４４９－５５．）から得た。図１０Ｂは、トリプシンと１時間インキュベートした後のＨＣ１およびＨＣ２ペプチドの抗菌活性を表す棒グラフを示す。ＨＣ１についての活性の完全な喪失が観察され、一方ＨＣ２は、細菌生存率において６ｌｏｇ１０の低下（９９．９９９９％）を誘発した。したがって、図１０は、ペプチドＨＣ２（すなわち、１２個の残基（６つのリシンおよびアルギニン対）を有し、リシン残基がエプシロン結合を介して連結されているペプチド）が、トリプシンとの１時間のインキュベーション後でさえも保持される抗菌活性を有することを例示する。
【図11】図１１は、ＨＤＦに対する種々の数のエプシロン－リシン残基を担持する一連のメリチンペプチドアナログについてのＭＴＳ細胞毒性アッセイを示す。図１１Ａは、３つのアルファ－リシル残基がエプシロン－リシル残基で置き換えられているメリチンおよびメリチン類似体（ペプチド１、２、および３）の細胞毒性を示す。図１１Ｂは、１つより多いε－リシル残基を担持するメリチンおよびメリチン類似体（ペプチド４、５および６）の細胞毒性を示す。したがって、図１１は、メリチン中のアルファ－リシンのエプシロン－リシニル化によって孔を形成するメリチンの選択性がアミオレレートされ（ａｍｉｏｌｅｒａｔｅ）、それによって治療的可能性が増強され得ることを例示する。
【図12-1】図１２－１は、２４時間後にペプチド３および４に曝露したヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）からのサイトカインの定量的決定を表す一組の棒グラフを示す。定量するサイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２；図１２Ａに示す）、インターロイキン－４（ＩＬ－４；図１２Ｂに示す）である。分裂促進的植物レクチンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、正の対照として用いた。従って、図１２は、ヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）からのサイトカイン産生の明らかな誘発がないことを例示し、従って、ペプチドの非免疫原性の性質を確認する。
【図12-2】図１２－２は、２４時間後にペプチド３および４に曝露したヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）からのサイトカインの定量的決定を表す一組の棒グラフを示す。定量するサイトカインは、インターロイキン－５（ＩＬ－５；図１２Ｃに示す）、およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ；図１２Ｄに示す）である。分裂促進的植物レクチンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、正の対照として用いた。従って、図１２は、ヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）からのサイトカイン産生の明らかな誘発がないことを例示し、従って、ペプチドの非免疫原性の性質を確認する。
【図13-1】図１３－１は、ペプチドを微生物および哺乳動物モデルの大型単ラメラ小胞（ＬＵＶ）に添加した場合の蛍光カルセイン色素漏出の対比を示す。図１３ＡおよびＢは、ペプチドをＬＵＶに添加した場合の微生物モデル大型単ラメラ小胞（ＬＵＶ）からの蛍光カルセイン色素漏出の量を表す線グラフを示す。したがって、図１３は、メリチンのエプシロン－リシル化が、ペプチドの哺乳動物膜との相互作用を減弱したことを例示する。
【図13-2】図１３－２は、ペプチドを微生物および哺乳動物モデルの大型単ラメラ小胞（ＬＵＶ）に添加した場合の蛍光カルセイン色素漏出の対比を示す。図１３ＣおよびＤは、ペプチドをＬＵＶに添加した場合の哺乳動物モデル大型単ラメラ小胞（ＬＵＶ）からの蛍光カルセイン色素漏出の量を表す線グラフを示す。したがって、図１３は、メリチンのエプシロン－リシル化が、ペプチドの哺乳動物膜との相互作用を減弱したことを例示する。
【図14】図１４は、ＭＴＴアッセイにより評価した初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するマストパランＢ類似体ＭＢ－１～ＭＢ－４の細胞毒性を表す線グラフを示す。従って、図１４は、マストパランＢペプチドの種々の位置におけるエプシロン－リシン置換によってマストパランＢの細胞毒性が低下することを例示する。
【図15】図１５は、宿主細胞への緑膿菌感染の副作用を防止するエプシロン－ポリリシンの能力を確認する一組の共焦点画像を示す。図１５Ａは、未処理のｈＤＦの共焦点画像を示し、未変化の細胞骨格および核形態を示す。図１５Ｂは、ＰＡＯ１＿ｇｆｐ株に感染したｈＤＦ（感染多重度、ＭＯＩ＝２５）の共焦点画像を示し、変形した細胞形態を示す。ｈＤＦのアクチンフィラメントの近位にＰＡＯ１細胞（白矢印で示す）が顕著に存在することに注意されたい。図１５Ｃは、予防様式（すなわち、微生物感染前）におけるエプシロン－ポリリシン（１ｍｇ／ｍｌ）の効果を示す共焦点画像を示す。図１５Ｄは、回帰モード（すなわち、宿主細胞の感染の２時間後）におけるεＰＬ（１ｍｇ／ｍｌ）の効果を示す共焦点画像を示す。（図１５Ｃおよび１５Ｄに示す）両方の条件下では、いかなる細菌細胞も存在せず、ポリマーの強力な抗菌活性を示すことに注意されたい。拡大した領域を、白色枠内に表示する。したがって、図１５は、感染前（防止）または感染後（退行）に適用するエプシロン－ポリリシンによってヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）に対する緑膿菌および黄色ブドウ球菌の副作用が減弱されることを例示する。
【図16】図１６は、エプシロン－ポリリシンの抗炎症特性を示す棒グラフを示す。ＴＨＰ－１細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）によるＮＦ－κＢ活性化のエプシロン－ポリリシン濃度依存的減弱。１ｍｇ／ｍｌを超える濃度では、ＮＦ－κＢの活性化が大幅に低下することに注意されたい。したがって、図１６は、細菌の外膜の鍵となる成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）に結合するエプシロン－ポリリシンによってエンドトキシンの有害作用が減弱されることを例示する。
【図17-1】図１７－１は、引っかき創傷アッセイモデルにおける種々の条件下でのヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の細胞移動に対するエプシロン－ポリリシンの効果を示す。図１７Ａは、２つの異なる時点でのヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の細胞移動に対する１ｍｇ／ｍｌエプシロン－ポリリシンの効果を示す一組の写真である。エプシロン－ポリリシン添加の後、１４時間で処理しなかった場合と比較して、引っかいた領域でより高密度の細胞が存在することに注意されたい。したがって、図１７は、エプシロン－ポリリシンが生体適合性であり、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進し、細菌分泌産物の有害作用を回避することを例証する。
【図17-2】図１７－２は、引っかき創傷アッセイモデルにおける種々の条件下でのヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の細胞移動に対するエプシロン－ポリリシンの効果を示す。図１７Ｂは、処理していない、または線維芽細胞成長因子と比較した、細胞移動におけるエプシロン－ポリリシン濃度依存性の時間的変化を示す線グラフである。図１７Ｃは、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３株から収集した細菌セクレトームの阻害作用がエプシロン－ポリリシン（１ｍｇ／ｍｌ）によって無効にされることを示す線グラフである。２５％（ｖ／ｖ）では、黄色ブドウ球菌セクレトームによって、細胞移動が阻害された。結果はすべて、２回の独立した重複実験の平均である。したがって、図１７は、エプシロン－ポリリシンが生体適合性であり、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の移動をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進し、細菌分泌産物の有害作用を回避することを例証する。
【図18】図１８は、エプシロン－ポリリシン溶液（０．３％および１．５％）の損傷後のウサギ角膜創傷閉鎖に対する効果を示す。図１８Ａは、エプシロン－ポリリシンおよびビヒクルでの処置後の損傷した角膜の細隙灯試験結果を示す一組の写真を示す。創傷した面積を、フルオレセイン染色により決定した。図１８Ｂは、測定の各時点における平均創傷閉鎖を、平均±平均の標準誤差として表す線グラフである。したがって、図１８は、エプシロン－ポリリシンが損傷した角膜の創傷閉鎖を損なわず、したがってエプシロン－ポリリシンが生体適合性であることを例証する。
【図19】図１９は、Ｔ／Ｂ細胞リンパ腫および網膜芽細胞腫細胞株に対するεＰＬの抗がん特性を示す棒グラフを示す。図中の数字は、ポリマーの濃度を示す：１－処理していない対照（０μｇ／ｍｌ）；２－６２．５μｇ／ｍｌ；３－１２５μｇ／ｍｌ；４－１２５μｇ／ｍｌ；５－２５０μｇ／ｍｌ。水平の点線は、５０％の細胞生存率を表す。したがって、図１９は、エプシロン－ポリリシンがＴ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫および網膜芽細胞腫細胞株に対して強力な抗がん活性を示したことを例示する。
【図20-1】図２０－１は、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ取り込みアッセイの結果を示す組のデータを示す。図２０Ａは、種々の濃度のメリチンに曝露したときのＶＲＥ １００２細菌細胞の代表的なＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ（ＳＧ）取り込みアッセイを示す線グラフを示す。メリチンの濃度を、ＭＩＣ値の用語で表す。実質的なＳＧ取り込みがＭＩＣ値で、およびそれより高い値で観察されたことに注意されたい。図２０Ｂは、致死濃度のメリチンならびにペプチド５およびペプチド６に曝露したＶＲＥを示す一対の棒グラフである。実質的な殺菌特性（細菌生存率の９０～９９％の低下）がＳＧ取り込み値が低いにもかかわらず観察されたことに注意されたい。従って、図２０は、修飾されたメリチンペプチドがメリチンより孔形成特性が不良であったとしても、それらの細菌致死性はメリチンと同様であったことを例示する。
【図20-2】図２０－２は、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ取り込みアッセイの結果を示す組のデータを示す。図２０Ｃは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉ）株のＳＧ取り込み値の対比を示す一対の棒グラフである。図２０Ｄは、種々のペプチドについてのＳＧ取り込みと細菌致死性との間の関係を示す散布図である。実質的な殺菌特性（細菌生存率の９０～９９％の低下）がＳＧ取り込み値が低いにもかかわらず観察されたことに注意されたい。従って、図２０は、修飾されたメリチンペプチドがメリチンより孔形成特性が不良であったとしても、それらの細菌致死性はメリチンと同様であったことを例示する。
【図22-1】図２２－１は、Ｔ／Ｂ細胞リンパ腫細胞株に対する過剰に荷電したペプチドＨＣ１（図２２Ａ）、ＨＣ２（図２２Ｂ）の抗がん特性を示す一組の棒グラフを示す。図中の数字は、ポリマーの濃度を示す：１－処理していない対照（０μｇ／ｍｌ）；２－６２．５μｇ／ｍｌ；３－１２５μｇ／ｍｌ；４－２５０μｇ／ｍｌ；５－５００μｇ／ｍｌ。水平の点線は、５０％の細胞生存率を表す。したがって、図２２は、過剰に荷電したペプチド（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ４、およびＨＣ６）が、リンパ腫細胞株において様々な程度の細胞死滅を用量依存的方式において示したことを例示する。興味深いことに、ＰＢＬ Ｔ細胞（ＰＢＴＬ）は、リンパ腫細胞株（ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨＨ、Ｌｙ－４、およびＬｙ－１８）と比較して、これらのペプチドに対する感受性が低かった。
【図22-2】図２２－２は、Ｔ／Ｂ細胞リンパ腫細胞株に対する過剰に荷電したペプチドＨＣ４（図２２Ｃ）、およびＨＣ６（図２２Ｄ）の抗がん特性を示す一組の棒グラフを示す。図中の数字は、ポリマーの濃度を示す：１－処理していない対照（０μｇ／ｍｌ）；２－６２．５μｇ／ｍｌ；３－１２５μｇ／ｍｌ；４－２５０μｇ／ｍｌ；５－５００μｇ／ｍｌ。水平の点線は、５０％の細胞生存率を表す。したがって、図２２は、過剰に荷電したペプチド（ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ４、およびＨＣ６）が、リンパ腫細胞株において様々な程度の細胞死滅を用量依存的方式において示したことを例示する。興味深いことに、ＰＢＬ Ｔ細胞（ＰＢＴＬ）は、リンパ腫細胞株（ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨＨ、Ｌｙ－４、およびＬｙ－１８）と比較して、これらのペプチドに対する感受性が低かった。
【0018】
表の簡単な説明
表１は、細菌および酵母株のパネルに対するアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。
表１は、細菌および酵母株のパネルに対するアルファ－ポリリシンおよびエプシロン－ポリリシンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。
【0019】
表２は、薬剤耐性細菌および真菌のパネルに対するエプシロン－ポリリシンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。使用した菌株の数を、括弧内に示す。
【0020】
表３は、病原体のパネルに対するエプシロン－ポリリシン模倣ペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。使用した菌株数を、括弧内に示す。
【0021】
表４は、細菌および酵母株に対するメリチンおよび修飾ペプチド１～４のアミノ酸配列および最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）および平均治療指数値を示す。エプシロン－リシン残基を、イタリック体および下線付きで示す。
【0022】
表５は、薬剤耐性細菌のパネルに対する、および他の病原性酵母株に対するメリチン、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５およびペプチド６の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。
【0023】
表６は、膜選択性を改善するためのメリチンペプチドの種々の化学的修飾の対比を示す。
【0024】
表７は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、アシネトバクター・バウマンニおよび他の細菌および真菌株に対するマストパランペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す。ＭＩＣ値を、範囲で示す。ＭＩＣ５０は、５０％の菌株が感受性である濃度を示す。ε－リシル残基を、イタリック体および下線付きで示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
利用可能な抗生物質の無効性、これと組み合わせて新しい抗菌薬の数の絶え間ない減少は、多剤耐性および汎剤耐性（ｐａｎ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）微生物病原体に対する代替の治療的戦略を開発するための強い需要を形成している。ヒトの消費に使用される抗菌薬を別の用途に使用することは、抗生物質耐性微生物病原体に対抗するための代替の、しかし時間がかからず、費用対効果も低いアプローチである。したがって、代替の抗菌ペプチドを提供する緊急の必要性が存在する。
【0026】
エプシロン－ポリリシン（εＰＬ）は、天然に存在するホモポリアミドであり、その中で骨格アミド基は、アミノ酸リシンのアルファ－カルボキシル基とエプシロン－アミノ基との間に形成し、２５～３５個のＬ－リシン残基を含有することが、当該分野で公知である（図１）。エプシロン－ポリリシンは一般に、米国食品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ）によって食品消費のために承認された安全な物質（ＧＲＡＳ）とみなされている。
【0027】
理論によって束縛されることを望まずに、エプシロン－ポリリシンの抗菌特性およびバイオセーフティーは２つの特性の組み合わせに起因すると考えられており、それは、（１）反復されたリシン残基の伸長、および（２）１つのリシン残基を隣に結合させるエプシロン結合である。本開示の発明者らは、驚くべきことに、単離されたペプチドが、抗菌特性および／または抗がん特性を有するために、上記の当該２つの特性を必ずしも有する必要はないことを見出した。
【0028】
上記の知見に照らして、本開示の発明者らは、代替の抗菌ペプチドを提供した。本開示の発明者らは、抗菌特性を有するが、細胞毒性または哺乳動物細胞に対して毒性でもあるペプチドが存在することを見出した。ペプチドの細胞毒性をその抗菌特性を維持しながら減少させるために、本開示の発明者らは、エプシロンリシン残基および／またはデルタ－オルニチン残基および／またはガンマ－２，４－ジアミノ酪酸残基および／またはベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基を用いて、ペプチド中の少なくとも１つのリシン残基を置き換えた。理論によって束縛されることを望まずに、かかる置き換えによってまた、驚くべきことに、（１）抗菌ペプチドの細胞選択性が高まり、（２）良好な抗菌特性を有し、タンパク質分解抵抗性であるペプチドが提供され、（３）孔形成ペプチドの治療的能力が改善され、同時に薬剤耐性病原体に対する効能が保持され、（４）抗菌特性を損なうことなく孔形成細胞毒性ペプチドの治療的能力が高められる。したがって、当該アプローチ（すなわち、ペプチド中のリシン残基の置き換え）によってまた、抗がん剤および抗炎症薬の設計のための修飾ペプチドの応用のレパートリーが拡大されるであろう。
【0029】
したがって、一態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＤ－エプシロン－リシンアミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－エプシロン－リシンアミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0030】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＬ－エプシロン－リシンアミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－エプシロン－リシンアミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0031】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＤ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0032】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＬ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない同等のペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0033】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＤ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0034】
もう１つの態様において、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＬ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非β－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0035】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＤ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0036】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１つの他のアミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0037】
別の態様では、本開示は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む単離されたペプチドに関し、それに、以下のものが存在し：少なくとも１つのＤ－エプシロン－リシンアミノ酸残基および／または少なくとも１つのＬ－エプシロン－リシンアミノ酸残基および／または少なくとも１つのＤ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基および／または少なくとも１つのＬ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基および／または少なくとも１つのＤ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基および／または少なくとも１つのＬ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基および／または少なくとも１つのＤ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基および／または少なくとも１つのＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有するか、または細胞毒性を有しない。いくつかの例において、ペプチドは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個のアミノ酸残基；少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－エプシロン－リシンアミノ酸残基、および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－エプシロン－リシンアミノ酸残基、および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－デルタ－オルニチンアミノ酸残基および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸アミノ酸残基および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＤ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基および／または少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個のＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基；ならびに少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個の非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよく；ここで、ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較して、低下した細胞毒性を有し得るか、または細胞毒性を有しない場合がある。
【0038】
１つの例において、本開示のペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含まない等価なペプチドと比較した場合、低下した細胞毒性を有する。例えば表４および５に示すように、本開示のペプチド、例えば、ペプチド３（配列番号１３）、ペプチド４（配列番号１４）、ペプチド５（配列番号１５）、およびペプチド６（配列番号１６）は、高濃度（２５０μｇ／ｍＬまたは８７．８μＭのペプチド３、および１０００μｇ／ｍＬまたは３５１．３μＭのペプチド４～６）においてのみ、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対して細胞毒性になる。対照的に、例えば表６に示すように、当該分野で公知の他の修飾したペプチドによって、ヘモグロビンまたは赤血球の分解が引き起こされ（すなわち、溶血活性を有する）、比較的低濃度でさえ細胞毒性になる。従って、本開示の発明者らは、驚くべきことに、本開示のペプチドにおける細胞毒性の低下が、当該分野で公知の他の修飾したペプチドにおける細胞毒性の低下よりも明らかであることを見出した。
【0039】
本明細書中で使用する「Ｄ－エプシロン－リシン」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｄ－エプシロン－リシン」の化学構造における用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｄ－エプシロン－リシン」を含むと言われる場合、エプシロンアミノ基（または「ε」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化1】
【0040】
本明細書中で使用する「Ｌ－エプシロン－リシン」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｌ－エプシロン－リシン」の化学構造における用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｌ－エプシロン－リシン」を含むと言われる場合、エプシロンアミノ基（または「ε」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化2】
【0041】
本明細書中で使用する「Ｄ－デルタ－オルニチン」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｄ－デルタ－オルニチン」の化学構造に関する用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｄ－デルタ－オルニチン」を含むと言われる場合、デルタアミノ基（または「δ」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化3】
【0042】
本明細書中で使用する「Ｌ－デルタ－オルニチン」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｌ－デルタ－オルニチン」の化学構造における用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｌ－デルタ－オルニチン」を含むと言われる場合、デルタアミノ基（または「δ」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化4】
【0043】
本明細書中で使用する「Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」の化学構造に関する用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」を含むと言われる場合、ガンマアミノ基（または「γ」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化5】
【0044】
本明細書中で使用する「Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」の化学構造に関する用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸」を含むと言われる場合、ガンマアミノ基（または「γ」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化6】
【0045】
本明細書中で使用する「Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」の化学構造に関する用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」を含むと言われる場合、ベータアミノ基（または「β」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化7】
【0046】
本明細書中で使用する「Ｌ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」という用語は、以下の構造：
を有するアミノ酸残基を指す。「Ｌ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」の化学構造に関する用語「Ｒ１」および「Ｒ２」は、例えば、ペプチド中の他のアミノ酸残基を指す。１つの例において、ペプチドが「Ｌ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸」を含むと言われる場合、ベータアミノ基（または「β」で標識された炭素に結合したアミノ基）は、ペプチド結合形成に関与する。
【化8】
【0047】
本明細書中で用いる「ペプチド結合」という用語は、一方の分子のカルボキシル基（例えば－ＣＯＯＨ）が他方の分子のアミノ基（例えば－ＮＨ２）と反応し、水の分子（Ｈ２Ｏ）を放出するときに２つの分子間に形成する化学結合を指す。これは、脱水合成反応（縮合反応とも呼ばれる）であり、通常はアミノ酸間で起こる。
【0048】
本明細書中で使用する「単離された」という用語は、例えば、ペプチドが天然に会合しているタンパク質、脂質、核酸を含まない、または実質的に含まないペプチドを指す。用語「単離された」をまた、本明細書中では、ポリペプチドおよび他の細胞タンパク質から単離されたタンパク質を指すために用い、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態において、用語「単離された」は、通常天然に会合している細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片（複数可）が成分、細胞および他の成分から分離されていることを意味する。
【0049】
本明細書中で用いる「抗菌ペプチド」という用語は、微生物を死滅させるか、またはその成長を阻害するオリゴまたはポリペプチドを指す。本明細書中で使用する場合、用語「抗がんペプチド」は、がん細胞を死滅させるか、またはその増殖を阻害するオリゴまたはポリペプチドを指す。本明細書中で使用する「抗炎症ペプチド」という用語は、炎症を防止または停止するオリゴまたはポリペプチドを指す。「抗菌ペプチド」は、リボソーム的にまたは非リボソーム的に合成される、より大きなタンパク質またはペプチドの切断から生じるペプチドを含んでもよい。一般に、抗菌ペプチドは、疎水性領域および荷電領域が空間的に分離されたカチオン性分子である。例示的な抗菌ペプチドは、膜においてアルファ－ヘリックス構造を形成する直線状ペプチド、または膜においてジスルフィド架橋で任意に安定化されたベータ－シート構造を形成するペプチドを含む。代表的な抗菌ペプチドとしては、カテリシジン、デフェンシン、ダームシジン、およびより具体的にはマガイニン２、プロテグリン、タキプレシン、プロテグリン－１、メリチン、デルマセプチン０１、セクロピン、カエリン、オビスピリン、アラメチシン、パンジニン１、パンジニン２、およびマストパランスＢが挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
ペプチドは、植物、ヒト、真菌、微生物、および昆虫を含む脊椎動物および非脊椎動物からのペプチドを含むことが、当業者によって理解される。ペプチドには、例えば孔を膜中に形成することにより膜透過性を増加させる当該ペプチドが含まれる。いくつかの例において、ペプチドは、抗菌ペプチドである。
【0051】
用語「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「除去（ｒｅｍｏｖａｌ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」を、全て、統計的に有意な量だけの減少を意味するために、本明細書中で一般的に使用する。しかしながら、疑いを避けるために、「減少した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「除去（ｒｅｍｏｖａｌ）」、または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または１００％までの減少および１００％を含む減少（例えば、参照試料と比較して不在レベル）、または参照レベルと比較して最大で１０～１００％の減少（例えば、本明細書中に記載するペプチドの不在）を意味する。本明細書中で使用する「細胞毒性」という用語を、その最も広い意味で使用し、それは、本開示のペプチドを使用して処置する対象の細胞に対して毒性である品質を指す。「低下した細胞毒性」の基準は、親ペプチドと比較して細胞に最大の細胞毒性を付与するペプチド濃度の相対的増加に基づき得る。細胞毒性が低下したペプチドが、かかるペプチドを微生物の増殖を阻害するか、または対象に害を及ぼすかまたは対象の細胞に負の影響を及ぼすことなく微生物のコロニー形成を管理するのに必要な濃度で対象に投与することができるため、望ましい。対象には、哺乳動物（例えば、ヒト）が含まれるが、これらに限定されない。例えば表７および実施例１５に示すように、本開示の単離されたペプチドは、等価なペプチドよりも驚くほど細胞毒性が低い。１つの非限定的な例において、マストパランＢは、１２５μｇ／ｍｌで細胞毒性であり、一方本開示の例示的なペプチド（例えば、ＭＢ１（配列番号７）およびＭＢ２（配列番号８））は、２５０μｇ／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌで細胞毒性である。
【0052】
本明細書中で使用する「等価なペプチド」という用語は、本開示のペプチドと同一のアミノ酸配列を有するペプチドであって、等価なペプチドがエプシロン－リシンアミノ酸残基を含まず、本開示のペプチドがエプシロン－リシンアミノ酸残基を含むペプチドを指す。
【0053】
１つの例において、単離されたペプチドは、エプシロン－ポリリシンではない。本明細書中で用いる「エプシロン－ポリリシン」という用語は、骨格アミド基がアミノ酸リシンのα－カルボキシル基とε－アミノ基との間に形成する、天然に存在するかまたは合成的に製造されるホモポリアミドを指す。いくつかの例において、エプシロン－ポリリシンは、少なくとも４つの連続したエプシロン－リシン残基を含む。
【0054】
１つの例において、本開示のペプチドは、リシン残基を含み得、ここで、ペプチド中のリシン残基に関して、ペプチドは、エプシロン－リシンアミノ酸残基およびアルファ－リシンアミノ酸残基を含んでもよい。例えば表４に示すように、修飾したメリチン、例えば表４のペプチド１～３（配列番号１１、１２、および１３）は、各々、１つのエプシロンリシン残基および２つのアルファリシン残基を含む。別の例において、本開示のペプチドは、リシン残基を含み得、ここで、ペプチド中のリシン残基に関して、ペプチドは、エプシロン－リシンアミノ酸残基のみを含んでもよい。例えば表４に示すように、修飾したメリチン、例えば表４のペプチド４（配列番号１４）は、全てエプシロン－リシンである３つのリシン残基を含む。本明細書中で使用する「エプシロン－リシンアミノ酸残基」という用語は、主鎖アミド基がアミノ酸リシンのα－カルボキシル基とε－アミノ基との間に形成するペプチド中のリシン残基を指す。
【0055】
１つの例において、本開示のペプチドは、非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を含んでもよい。１つの例において、非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される他のアミノ酸残基を、正準アミノ酸残基および非正準アミノ酸残基から選択してもよい。
【0056】
本明細書中で用いる「正準アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するペプチドおよびタンパク質中に一般に包含され得、汎用遺伝暗号のコドンによって直接コードされ得る２０個のアミノ酸残基を指し、それは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のヌクレオチド配列をタンパク質のアミノ酸配列に翻訳するための、ほぼ全ての生物についての共通の言語である。１つの例において、「正準アミノ酸残基」は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）（例えばアルファ－リシン（アルファ－Ｋ））、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を含むが、これらに限定されない。
【0057】
本明細書中で用いる「非正準アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するタンパク質中に一般に組み込まれる２０個の正準アミノ酸の中にないＤまたはＬ形態のアミノ酸残基を指す。非正準アミノ酸には、天然に稀な（ペプチドもしくはタンパク質において）アミノ酸残基または非天然のアミノ酸残基が含まれる。非正準アミノ酸の例としては、限定されずにβ－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、α、α二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、および誘導体化側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。他の例としては、以下のものが含まれる（Ｌ形態またはＤ形態において）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎ－メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎ－メチルホモシトルリン（ＮＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（ＯｒｎまたはＯ）、Ｎ－メチルオルニチン（ＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリシン（ｈＫまたはＨｌｙｓ）、ホモアルギニン（ｈＲまたはｈＡｒｇ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎ－メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎ－メチルロイシン（ＮＭｅＬ）、Ｎ－メチルホモロイシン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎ－メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ－カルボキシグルタミン酸（γ－ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ－カルボキシル－フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，β－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ－ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、β－（１－ナフチル）－アラニン（１Ｎａ１）、β－（２－ナフチル）－アラニン（２Ｎａ１）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４－メチル－フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β－ジフェニル－アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－フェニル－フェニルアラニン（４Ｂｉｐ）、α－アミノ－イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ－アラニン、ベータ－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ－ヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、β－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、β－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、ω－メチルアルギニンおよび他の同様のアミノ酸、ならびにこれらのいずれかの誘導体化された形態。
【0058】
１つの例において、本開示のペプチドは、５～１００個のアミノ酸、または５～２０個のアミノ酸、または２０～３０個のアミノ酸、または３０～４０個のアミノ酸、または４０～５０個のアミノ酸、または５０～６０個のアミノ酸、または６０～７０個のアミノ酸、または７０～８０個のアミノ酸、または８０～９０個のアミノ酸、または９０～１００個のアミノ酸、または５～９０個のアミノ酸、または５～８０個のアミノ酸、または５～７０個のアミノ酸、または５～６０個のアミノ酸、または５～５０個のアミノ酸、または５～４０個のアミノ酸、または１０～９０個のアミノ酸、または１０～８０個のアミノ酸、または１０～７０個のアミノ酸、または１０～６０個のアミノ酸、または１０～５０個のアミノ酸、または１０～４０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの例において、本開示のペプチドは、５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個、または１１個、または１２個、または１３個、または１４個、または１５個、または１６個、または１７個、または１８個、または１９個、または２０個、または２１個、または２２個、または２３個、または２４個、または２５個、または２６個、または２７個、または２８個、または２９個、または３０個、または３１個、または３２個、または３３個、または３４個、または３５個、または３６個、または３７個、または３８個、または３９個、または４０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの例において、本開示のペプチドは、１２～３７個のアミノ酸を含み得る。例えば図２１に示すように、本開示のペプチドは、１２個の残基を含む。例えば表７に示すように、本開示のペプチドは、１４個の残基を含む。例えば表４に示すように、本開示のペプチドは、２６個の残基を含む。
【0059】
１つの理論によって束縛されることを望まずに、本明細書において提供するペプチドは、細胞の膜透過性を、膜中に孔を形成することによって、または膜を破壊することによって増加させると考えられる。孔は、１つのペプチドによって形成され得、または複数のペプチドが結合して多量体複合体を形成し得る。例えば、あるペプチドは、アルファヘリックス構造を生じて孔を形成することができる。あるいはまた、ペプチドは、膜においてベータ－プリーツ構造を採用することができ、それによって膜透過性が増加する。孔は、小さな有機分子またはタンパク質が膜を横断して移動するのを可能にするのに十分な大きさであり得る。１つの例において、本開示のペプチドは、微生物中に孔を形成する能力があり得る。上記で述べたように、例えば図２０に示すように、本発明者らは、エプシロン－リシル化が本開示のペプチドの孔形成特性に影響を及ぼす場合でさえ、修飾したペプチドの殺菌特性は影響を受けないことも見出した。
【0060】
１つの理論によって束縛されることを望まずに、微生物中の孔は、ペプチドの構造のために形成され得る。例えば、両親媒性のα－ヘリックス構造は、孔を形成するのに有用であり得る。従って、本開示のペプチドは、両親媒性α－ヘリックス構造を形成し得ると考えられる。抗菌ペプチドに関して本明細書中で使用する場合、用語「両親媒性α－ヘリックス構造」は、生理学的ｐＨでいくつかの極性残基を含む親水性面および無極性残基を含む疎水性面を有するα－ヘリックスを意味する。極性残基は、例えば、リシンまたはアルギニン残基であり得、一方、無極性残基は、例えば、ロイシンまたはアラニン残基であり得る。両親媒性α－ヘリックス構造を有する抗菌ペプチドは、一般的に、両親媒性ドメイン内の同数の極性および無極性残基、ならびにペプチドに中性ｐＨで全体的に正電荷を付与するのに十分な数の塩基性残基を有する。
【0061】
いくつかの例において、および例えば図２１に示すように、ペプチドは、１２個のアミノ酸残基（例えば、ＨＣ２）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であり得る。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで、３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで４個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで５個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、６個のリシン残基を含んでもよく、ここで６個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0062】
いくつかの例において、および例えば表７に示すように、ペプチドは、１４個のアミノ酸残基（例えば、マストパランＢ）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで４個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0063】
いくつかの例において、および例えば表４に示すように、ペプチドは、２６個のアミノ酸残基（例えば、メリチン）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、３個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、３個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、３個のリシン残基を含んでもよく、ここで３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0064】
いくつかの例において、ペプチドは、２３個のアミノ酸残基（例えば、マガイニン２）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで４個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0065】
いくつかの例において、ペプチドは、２４個のアミノ酸残基（例えば、パンジニン２）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、４個のリシン残基を含んでもよく、ここで４個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0066】
いくつかの例において、ペプチドは、３７個のアミノ酸残基（例えば、セクロピンＡ）を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで１個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで２個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで３個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで４個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで５個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで６個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。いくつかの例において、ペプチドは、７個のリシン残基を含んでもよく、ここで７個のリシン残基は、エプシロン－リシン残基であってもよい。
【0067】
いくつかの例において、および例えば表７に示すように、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬ（配列番号１）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、マストパランＢ）。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、２位、または４位、または１１位、または１２位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、２位および４位、または２位および１１位、または２位および１２位、または４位および１１位、または４位および１２位、または１１位および１２位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、２、４および１１位、または２、４および１２位、または２、１１および１２位、または４、１１および１２位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、４個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、２、４、１１および１２位に位置し得る。１つの例、例えば表７におけるペプチドＭＢ１において、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、２位に位置する（配列番号７）。１つの例、例えば表７におけるペプチドＭＢ２において、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、４位に位置する（配列番号８）。１つの例、例えば表７におけるペプチドＭＢ３において、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、１１位に位置する（配列番号９）。１つの例、例えば表７におけるペプチドＭＢ４において、ペプチドは、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、１２位に位置する（配列番号１０）。
【0068】
いくつかの例において、および例えば表４に示すように、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、メリチン）。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７位、または２１位、または２３位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく、エプシロン－リシン残基は、７位および２１位、または７位および２３位、または２１位および２３位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７、２１、および２３位に位置し得る。１つの例、例えば表４のペプチド１において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、２３位に位置する（配列番号１１）。１つの例、例えば表４のペプチド２において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、２１位に位置する（配列番号１２）。１つの例、例えば表４のペプチド３において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、７位に位置する（配列番号１３）。１つの例、例えば表４のペプチド４において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、７、２１、および２３位に位置する（配列番号１４）。１つの例、例えば表５のペプチド５において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、７位および２１位に位置する（配列番号１５）。１つの例、例えば表５におけるペプチド５において、ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、７位および２３位に位置する（配列番号１６）。
【0069】
いくつかの例において、および例えば図２１に示すように、ペプチドは、ＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、ＨＣ１）。配列番号３のペプチドを、以下の構造：
によって表すことができる。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１位、または３位、または５位、または７位、または９位、または１１位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく、エプシロン－リシン残基は、１位および３位、または１位および５位、または１位および７位、または１位および９位、または１位および１１位、または３位および５位、または３位および７位、または３位および９位、または３位および１１位、または５位および７位、または５位および９位、または５位および１１位、または７位および９位、または７位および１１位、または９位および１１位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３および５位、または１、５および７位、または１、７および９位、または１、９および１１位、または３、５および７位、または３、７および９位、または３、９および１１位、または５、７および９位、または５、９および１１位、または７、９および１１位、または１、３および７位、または１、３および９位、または１、３および１１位、または１、５および９位、または１、５および１１位、または１、７および１１位、または３、５および９位、または３、５および１１位、または３、７および１１位、または５、７および１１位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、４個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、５および７位、または１、３、５および９位、または１、５、７および９位、または１、７、９および１１位、または１、３、７および９位、または１、３、５および１１位、または１、３、７および１１位、または１、３、９および１１位、または１、５、９および１１位、または１、５、７および１１位、または３、５、７および１１位、または３、５、７および９位、または３、７、９および１１位、または３、５、９および１１位、または５、７、９および１１位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、５個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、５、７および９位、または１、５、７、９および１１位、または１、３、５、７および１１位、または１、３、５、９および１１位、または１、３、７、９および１１位、または３、５、７、９および１１位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく、エプシロン－リシン残基は、１、３、５、７、９、および１１位に位置し得る。１つの例、例えば図２１におけるペプチドＨＣ２において、ペプチドは、ＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲＫＲのアミノ酸配列を有し、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、１、３、５、７、９、および１１位に位置する（配列番号１７）。配列番号１７のペプチドを、以下の構造：
によって表すことができる。１つの例、例えば図２１におけるペプチドＨＣ４において、ペプチドは、ＫｒＫｒＫｒＫｒＫｒＫｒ（ここで「ｒ」はＤ－アルギニルまたはＤ－アルギニン残基を表す）のアミノ酸配列を有し、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、１、３、５、７、９および１１位に位置する（配列番号１８）。配列番号１８のペプチドを、以下の構造：
によって表すことができる。１つの例、例えば図２１におけるペプチドＨＣ６において、ペプチドは、ｋＲｋＲｋＲｋＲｋＲｋＲ（ここで「ｋ」はＤ－リシルまたはＤ－リシン残基を表す）のアミノ酸配列を有し、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含み、エプシロン－リシン残基は、１、３、５、７、９および１１位に位置する（配列番号１９）。配列番号１９のペプチドを、以下の構造：
によって表すことができる。
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【0070】
いくつかの例において、ペプチドは、ＧＩＧＫＦＬＨＳＡＫＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＮＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、マガイニン２）。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、４位、または１０位、または１１位、または１４位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、４および１０位、または４および１１位、または４および１４位、または１０および１１位、または１０および１４位、または１１および１４位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、４、１０、および１１位、または４、１１、および１４位、または１０、１１、および１４位、または４、１０、および１４位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、４個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、４、１０、１１および１４位に位置し得る。
【0071】
いくつかの例において、ペプチドは、ＦＷＧＡＬＡＫＧＡＬＫＬＩＰＳＬＦＳＳＦＳＫＫＤ（配列番号５）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、パンジニン２）。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７位、または１１位、または２２位、または２３位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７および１１位、または７および２２位、または７および２３位、または１１および２２位、または１１および２３位、または２２および２３位、または２２および２３位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７、１１、および２２位、または７、１１、および２３位、または１１、２２、および２３位、または７、２２、および２３位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、４個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、７、１１、２２、および２３位に位置し得る。
【0072】
いくつかの例において、ペプチドは、ＫＷＫＬＦＫＫＩＥＫＶＧＱＮＩＲＤＧＩＩＫＡＧＰＡＶＡＶＶＧＱＡＴＱＩＡＫ－ＮＨ２（配列番号６）のアミノ酸配列を有してもよい（例えば、セクロピンＡ）。いくつかの例において、ペプチドは、１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のリシン残基を含んでもよい。いくつかの例において、ペプチドは、１個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１位、または３位、または６位、または７位、または１０位、または２１位、または３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、２個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１および３位、または１および６位、または１および７位、または１および１０位、または１および２１位、または１および３７位、または３および６位、または３および７位、または３および１０位、または３および２１位、または３および３７位、または６および７位、または６および１０位、または６および２１位、または６および３７位、または７および１０位、または７および２１位、または７および３７位、または１０および２１位、または１０および３７位、または２１および３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、３個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、および６位、または１、３、および７位、または１、３、および１０位、または１、３、および２１位、または１、３、および３７位、または１、６、および７位、または１、６、および１０位、または１、６、および２１位、または１、６、および３７位、または１、７、および１０位、または１、７、および２１位、または１、７、および３７位、または１、１０、および２１位、または１、１０、および３７位、または１、２１、および３７位、または３、６、および７位、または３、６、および１０位、または３、６、および２１位、または３、６、および３７位、または３、７、および１０位、または３、７、および２１位、または３、７、および３７位、または３、１０、および２１位、または３、１０、および３７位、または３、２１、および３７位、または６、７、および１０位、または６、７、および２１位、または６、７、および３７位、または６、１０、および２１位、または６、１０、および３７位、または６、２１、および３７位、または７、１０、および２１位、または７、１０、および３７位、または７、２１、および３７位、または１０、２１、および３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、４個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、６および７位、または１、３、６および１０位、または１、３、６および２１位、または１、３、６および３７位、または１、３、７および１０位、または１、３、７および２１位、または１、３、７および３７位、または１、３、１０および２１位、または１、３、１０および３７位、または１、３、２１および３７位、または１、６、７および１０位、または１、６、７および２１位、または１、６、７および３７位、または１、６、１０および２１位、または１、６、１０および３７位、または１、６、２１および３７位、または１、７、１０および２１位、または１、７、１０および３７位、または１、７、２１および３７位、または１、１０、２１および３７位、または３、６、７および１０位、または３、６、７および２１位、または３、６、７および３７位、または３、６、１０および２１位、または３、６、１０および３７位、または３、６、２１および３７位、または３、７、１０および２１位、または３、７、１０および３７位、または３、７、２１および３７位、または３、１０、２１および３７位、または６、７、１０および２１位、または６、７、１０および３７位、または６、７、２１および３７位、または６、１０、２１および３７位、または７、１０、２１および３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、５個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、６、７、および１０位、または１、３、６、７、および２１位、または１、３、６、７、および３７位、または１、３、６、１０、および２１位、または１、３、６、１０、および３７位、または１、３、６、２１、および３７位、または１、３、７、１０、および２１位、または１、３、７、１０、および３７位、または１、３、７、２１、および３７位、または１、３、１０、２１、および３７位、または１、６、７、１０、および２１位、または１、６、７、１０、および３７位、または１、６、７、２１、および３７位、または１、６、１０、２１、および３７位、または１、７、１０、２１、および３７位、または３、６、７、１０、および２１位、または３、６、７、１０、および３７位、または３、６、７、２１、および３７位、または３、６、１０、２１、および３７位、または３、７、１０、２１、および３７位、または６、７、１０、２１、および３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、６個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、６、７、１０、および２１位、または１、３、６、７、１０、および３７位、または１、３、６、７、２１、および３７位、または１、３、６、１０、２１、および３７位、または１、３、７、１０、２１、および３７位、または１、６、７、１０、２１、および３７位、または３、６、７、１０、２１、および３７位に位置し得る。いくつかの例において、ペプチドは、７個のエプシロン－リシン残基を含んでもよく；エプシロン－リシン残基は、１、３、６、７、１０、２１、および３７位に位置し得る。
【0073】
本開示のペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗菌効力は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバペナム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、ポリミキシンＢ耐性エンテロバクター・クロアカ、カンジダ・アルビカンスおよびフサリウム株を含むがこれらに限定されない広範囲の病原体に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定することによって確立された。ｉｎ ｖｉｖｏでの抗菌効果は、シュードモナスおよびスタフィロコッカス角膜炎のウサギモデルで例証されている。本開示はまた、哺乳動物細胞よりも微生物細胞を標的とするための、タンパク質分解安定性および選択性が増強されたペプチドの合理的設計にも関する。従って、実験の節（例えば、図６および図２０）において例示するように、本開示のペプチドを、成長を阻害するために使用してもよい。従って、また本開示の別の態様は、療法または医学で使用するための本開示のペプチドを提供することである。さらに、また本開示の別の態様は、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）を含む医薬組成物を提供することである。
【0074】
本開示の別の態様は、微生物の成長を阻害する方法を提供することである。いくつかの例において、および例えば図１５に示すように、微生物の成長を阻害する方法によってまた、微生物感染が処置され得る。いくつかの例において、当該方法は、本明細書中に記載するペプチドおよび／または本明細書中に記載する組成物の薬学的に有効な量の投与を含んでもよい。いくつかの例において、本明細書中に記載する微生物の成長を阻害する方法は、微生物の成長を、微生物感染を処置することによって阻害し得る。
【0075】
本明細書において使用する場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」およびその文法的変化形は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、ここで、目的は、所望されない生理学的状態、障害もしくは疾患を防止するかもしくは低速化させること（軽減すること）、または有益な、もしくは所望される臨床的結果を得ることである。かかる有益な、または所望される臨床的結果は、症状の緩和；状態、障害もしくは疾患の程度の低下；状態、障害もしくは疾患の安定化した（すなわち、悪化していない）状態；状態、障害もしくは疾患の進行の遅延もしくは低速化；状態、障害もしくは疾患状態の改善；検出可能もしくは検出不能を問わない寛解（部分的もしくは全体的を問わない）；または状態、障害もしくは疾患のエンハンスメントもしくは改善を含むが、これらに限定されない。処置には、過剰なレベルの副作用なしに、臨床的に重要である細胞応答を誘発することが含まれる。処置には、処置を受けない場合の予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも含まれる。
【0076】
本明細書中で使用する場合、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」を、その最も広い意味で用い、従って、範囲が原核生物に限定されない。むしろ、「微生物」という用語は、その範囲内に細菌、古細菌、酵母、真菌、原生動物および藻類を含む。１つの例において、本開示のペプチドの薬学的に有効な量の投与を含む、微生物感染を処置する方法または微生物を除去する方法を、提供する。１つの例において、微生物は、細菌または真菌を含むが、これらに限定されない。従って、１つの例において、微生物感染は、細菌感染または真菌感染を含むが、これらに限定されない。
【0077】
１つの例において、細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。本明細書中で使用する「グラム陽性細菌」という用語は、グラム染色においてクリスタルバイオレット染色の色を保持する細菌を指し得る。当該細菌は、ペプチドログリカンの厚い層から構成される細胞壁を有し得る。本明細書中で使用する「グラム陰性細菌」という用語は、グラム染色においてクリスタルバイオレット染色の色を保持しない場合がある細菌を指し得る。当該細菌は、ペプチドログリカンの薄い層から構成される細胞壁を有し得る。
【0078】
従って、処置され得る細菌感染は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｏｉｄｅｓ）種、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）種、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌種、大腸菌類、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、メタノバクテリウム・エクストロクエンス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ）、マイクロバクテリウム・マルチフォルメ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、ルテウス菌、カタル球菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス、根粒菌、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）種、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、サルモネラ種、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌、ブドウ球菌種、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種、ボルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種の属からの細菌によって引き起こされるものを含むが、これらに限定されない。１つの例において、細菌は、アセトバクター オウランティウス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒａｎｔｉｕｓ）、アシネトバクター・バウマンニ、アクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ Ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アゾリゾビウム・カウリノダンス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アナプラズマ・マジナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ）、炭疽菌、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、セレウス菌、バチルス・フシフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ジンジバリス菌、バクテロイデス・メラニノゲニカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）（プレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃａ））、ヘンセラ菌、塹壕熱菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、百日咳菌、ライム病ボレリア、ウシ流産菌、ヤギ流産菌、ブタ流産菌、鼻疽菌、類鼻疽菌、セパシア菌複合体、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、肉芽腫カリマトバクテリウム、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、トラコーマクラミジア、クラミドフィラ（例えば肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌、破傷風菌）、ジフテリア菌、コリネバクテリウム・フシフォルメ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）、Ｑ熱コクシエラ、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｊｆｅｅｎｓｉｓ）、エンテロバクター・クロアカ、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス‐デューランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）、フェーカリス菌、フェシウム菌、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・マロラツス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｌｏｒａｔｕｓ）、大腸菌、野兎病菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ガードネレラ菌、軟性下疳菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パーツッシス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ピロリ菌、肺炎桿菌、アシドフィルス菌、カゼイ菌、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、在郷軍人病菌、リステリア菌、メタノバクテリウム・エクストロクエンス、マイクロバクテリウム・マルチフォルメ、ルテウス菌、カタル球菌、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ジフセリエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌、マイコプラズマ・レプラムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ）、スメグマ菌、結核菌、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ペネトランス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、野兎病菌 ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジンジバリス菌、緑膿菌、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ Ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、発疹チフスリケッチア、リケッチア・シタッシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、リケッチア・クインターナ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチア・トラコーマ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｅ）、ロシャリメア・ヘンセラ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、ロチア・デントカリオーサ（Ｒｏｔｈｉａ ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ）、腸炎菌、チフス菌、ネズミチフス菌、霊菌、志賀赤痢菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アビウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ａｖｉｕｍ）、ウシ連鎖球菌、ストレプトコッカス・クリセツス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、フェシウム菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｅｉｕｍ）、フェカリス菌、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ガリナルム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ミチオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｏｒ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｏｒａｌｉｓ）、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、ミュータンス群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、サンギス菌、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、コレラ菌、ビブリオ・コンマ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｍｍａ）、腸炎ビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ボルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エンテロコリチカ菌、ペスト菌および仮性結核菌を含むが、これらに限定されない。１つの例において、細菌は、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス種、エンテロバクター、腸球菌種、大腸菌類、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、シュードモナス、およびブドウ球菌種の属を含むが、これらに限定されない。１つの例において、および例えば表５および表７に示すように、細菌は、アシネトバクター・バウマンニ、エンテロバクター・クロアカ、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、フェーカリス菌およびフェシウム菌を含むが、これらに限定されない。
【0079】
一例では、細菌感染は、症状、例えば、しかし限定されずに肺炎、結核、髄膜炎、下痢性疾患、バイオフィルムの形成、敗血症、リステリア症、胃腸炎、毒素性ショック症候群、出血性大腸炎；溶血性尿毒症症候群、ライム病、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、ヒトエーリキア症、偽膜性大腸炎、コレラ、サルモネラ症、ネコ引っかき熱、壊死性筋膜炎（ＧＡＳ）、連鎖球菌毒素ショック症候群、院内感染および地域社会関連感染、アテローム性動脈硬化症、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、耳の感染症、気道感染症、尿路感染症、皮膚および軟部組織感染、爪床感染症、創傷感染、敗血症、胃腸疾患、院内心内膜炎および血流感染症を引き起こし得る。１つの例において、細菌感染は、症状、例えば、しかし限定されずに眼瞼炎、麦粒腫、Ｐｒｅｓｅｐｔａｌ Ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ、涙のう炎、眼窩蜂巣炎、丹毒、春季角結膜炎、細菌性結膜炎、結膜裂傷、上方輪部角結膜炎、偽膜での結膜炎、流行性角結膜炎、細菌性角膜炎、角膜潰瘍、Ｐｈｌｙｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ、前部ぶどう膜炎、眼内炎、細菌性膿瘍、急性敗血症性網膜炎、慢性細菌性網膜炎、乳頭炎、視神経炎、および眼窩蜂巣炎を引き起こし得る。１つの例において、ならびに例えば図７および図９に示すように、細菌感染は、症状、例えば、しかし限定されずに黄色ブドウ球菌角膜炎、および緑膿菌角膜炎を引き起こす。
【0080】
１つの例において、細菌は、薬剤耐性細菌であり得る。１つの例において、ならびに例えば表５および表７に示すように、薬剤耐性細菌には、カルバペナム耐性エンテロバクター株（ＣＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ポリミキシンＢ耐性エンテロバクター・クロアカ、薬剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、ならびに多産のバイオフィルム形成緑膿菌および表皮ブドウ球菌株が含まれるが、これらに限定されない。従って、本明細書中で使用する場合、用語「薬剤耐性細菌」は、一般的に細菌を死滅させるかまたは成長を制限し得る化学物質（薬物）中で成長する能力を有し得る細菌を指す。
【0081】
１つの例において、処置され得る真菌感染には、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）、アジェロミセス属、アントロデルマ科、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ、クラドフィアロフォラ属、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）、表皮菌、エクソフィアラ属、フィロバジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）、フォンセケア属、フサリウム、ゲオトリクム属、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ホルタエア（Ｈｏｒｔａｅａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ）、マヅレラ属、マラセチア属、小胞子菌、微胞子虫、ケカビ、ネクトリア属、ペシロマイセス属、パラコクシジオイデス属、アオカビ類、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、シュードアレシェリア属、クモノスカビ属、ロドトルラ属、スケドスポリウム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スエヒロタケ属、スポロトリクス属、白癬菌および毛芽胞菌の属からの真菌によって引き起こされたものが含まれるが、これらに限定されない。１つの例において、真菌には、アブシディア・コリンビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アジェロミセス・カプスラーツス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、アジェロミセス・デルマティティジス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、アルソダーマ・ベンハミエ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅ）、アルソダーマ・フルバム（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｆｕｌｖｕｍ）、アルソダーマ・ジプセム（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｇｙｐｓｅｕｍ）、アルソダーマ・インカーバタム（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｉｎｃｕｒｖａｔｕｍ）、アルソダーマ・オタエ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｏｔａｅ）、アルソダーマ・バンブレウセゲミ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ クルーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ペレクローサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）、クラドフィアロフォラ・カリオニー（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、コクシジオイデス・ポサダシ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クスダマカビ種、鼠径表皮菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、エクソフィアラ・デルマチチヂス（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、フィロバジエラ・ネオフォルマンス（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、フォンセカエ・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、フサリウム・ソラニ、ジェオトリクム カンディデュム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ホルタエア・ウェルネキイ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マズレラ・グリセア（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ ｇｒｉｓａｅ）、癜風菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ）、マラセチア・グロボサ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ）、マラセチア・オブツサ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ）、マラセチア・パキダーマティス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）、マラセチア・レストリクタ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）、マラセチア・スロフィエ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、マラセチア・シンポジアリス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）、イヌ小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・フルバム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｆｕｌｖｕｍ）、ミクロスポルム・ジプセウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ）、微胞子虫、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）、ペシロマイセス・バリオチ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ）、南アメリカ分芽菌、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ピキア・アノマーラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、ピキア・グリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、シュードアレシェリア・ボイジイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ）、リゾプス・ オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、スケドスポリウム・アピオスペルムム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スエヒロタケ、スポロトリックス・ シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｎｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・ルブラム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・ベルコーズム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、トリコスポロン・アサヒ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｉｎｋｉｎ）およびトリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｍｕｃｏｉｄｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。１つの例において、真菌は、カンジダ属、フザリウム属、およびアスペルギルス属を含むが、これらに限定されない。１つの例において、ならびに例えば表５および表７に示すように、真菌は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パプシローシス、カンジダ・トロピカリス、フサリウム・ソラニ、フサリウム・オキシスポラム、およびアスペルギルス・フミガーツスを含むが、これらに限定されない。
【0082】
１つの例において、真菌感染によって、状態、例えば、しかし限定されずに輪虫、真菌性結膜炎、角膜真菌症、ぶどう膜炎、膿瘍、カンジダ網膜炎、真菌性乳頭炎および視神経炎、侵襲性アスペルギルス症、ムコール症、真菌性角膜炎、カンジダ角膜炎、およびフザリウム角膜炎が引き起こされ得る。
【0083】
１つの例において、真菌は、薬剤耐性真菌であり得る。１つの例において、薬剤耐性真菌は、フサリウム・ソラニ、フサリウム・オキシスポラム、およびアスペルギルス・フミガーツスを含むが、これらに限定されない。従って、本明細書中で使用する用語「薬剤耐性真菌」は、一般に真菌を死滅させるかまたは成長を制限し得る化学物質（薬物）中で成長する能力を有し得る真菌を指す。
【0084】
別の態様では、単離したペプチドの治療指数（安全性）を改善する方法であって、ペプチドが、Ｄ－エプシロン－リシン、Ｌ－エプシロン－リシン、Ｄ－デルタ－オルニチン、Ｌ－デルタ－オルニチン、Ｄ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｌ－ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、Ｄ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸、およびＬ－ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基、ならびに非エプシロン－リシン、非デルタ－オルニチン、非ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸および非ベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも１個の他のものを含む少なくとも５個のアミノ酸残基を含み、当該ペプチドは、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１つを有しない同等のペプチドと比較した場合に低下した細胞毒性を有し、当該方法は、エプシロン－リシン、デルタ－オルニチン、ガンマ－２，４－ジアミノ酪酸、およびベータ－２，３－ジアミノプロピオン酸残基からなる群から選択される少なくとも１つに対するリシン残基の少なくとも１つを修飾することを含む、前記方法を提供する。例えば図１１に示すように、メリチン中のアルファ－リシン残基をエプシロン－リシン残基で置換すると、メリチンの細胞毒性が減少し、それによってその治療指数または安全性が増加し得る。
【0085】
別の態様では、増殖性疾患を処置する方法であって、本明細書中に記載するペプチドおよび／または本明細書中に記載する組成物の薬学的に有効な量の投与を含む、前記方法を提供する。１つの例において、増殖性疾患は、がんおよび腫瘍を含むが、これらに限定されない。例えば図２２に示すように、本開示のペプチドによって、種々のＴ細胞およびＢ細胞リンパ腫細胞株の生存率が低下する。
【0086】
従って、本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、異常な細胞が、制御されずに分裂し、近傍の組織に浸潤し得る疾患を指す。がん細胞はまた、血液およびリンパ系を介して身体の他の部位に伝播し得る。主な種類のがんには、がん腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、および中枢神経系がんが含まれるが、これらに限定されない。がんとは、皮膚において、または内臓を補強するかもしくは覆う組織において開始するがんであう。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織において開始するがんである。白血病は、造血組織、例えば骨髄において開始し、多数の異常な血液細胞の産生が生じ、血液に入るがんである。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞において開始するがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織において開始するがんである。本明細書中で使用する「腫瘍」という用語は、細胞増殖が制御されず、進行性である組織の新しい増殖を指す。腫瘍組織の成長は、正常組織の成長よりも速く、成長を誘発した刺激の停止後にも継続し、有用な生理学的目的には役立たない。腫瘍は、良性（がんではない）または悪性（がん）であり得る。
【0087】
別の例において、増殖性疾患は、結腸直腸がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、胃がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部の扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん腫、皮脂腺がん腫、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝がん、肝転移、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、甲状腺がん、例えば組織非形成性甲状腺がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、肺の小細胞がん、肺の非小細胞がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない。
【0088】
例えば図１６に示すように、本開示のペプチドは、細胞の脂肪多糖で誘導された炎症を実質的に阻害する。したがって、別の態様では、炎症を処置する方法であって、本明細書中に記載するペプチドおよび／または本明細書中に記載する組成物の薬学的に有効な量の投与を含む、前記方法を提供する。１つの例において、炎症は、ざ瘡、神経炎症、アテローム性動脈硬化症、エンドトキシン血症性ショック、角膜炎症、および結膜炎を含むが、これらに限定されない。
【0089】
本明細書中で使用する「最小発育阻止濃度」（ＭＩＣ）という用語は、特定の条件下で、例えば液体ブロス培地において微生物の成長を防止するか、または他の方法でその機能を修正するのに必要な抗菌剤（例えば、本明細書中に記載するペプチド）の最低濃度を指し、当該分野で周知の標準的技法に従って、多くの異なる微生物について決定することができる。
【0090】
本明細書中で用いる「治療指数」という用語は、本明細書中に記載するペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）に対する、細胞代謝活性の完全な喪失または完全な細胞毒性を引き起こすペプチドの最小濃度の比を指す。細胞代謝活性または細胞毒性の損失を、当該分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。１つの例において、細胞代謝活性または細胞毒性の損失を、ＭＴＳ細胞増殖アッセイによって決定することができる。
【0091】
本明細書中で用いる「最小発育阻止濃度」という用語は、細菌、酵母または真菌の成長を完全に阻止するのに必要なペプチドおよび／またはポリマーの最小濃度を指す。
【0092】
本明細書中で使用する「タンパク質分解安定性」安定性という用語は、酵素媒介加工に耐えるペプチドの能力を指す。典型的な酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、およびペプシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0093】
別の態様では、微生物コロニー形成を管理する方法であって、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）を含む剤および／または本明細書中に記載する組成物の投与を含む、前記方法を提供する。１つの例において、剤は、消毒剤、保存料、防腐剤、および殺生物剤を含むが、これらに限定されない。１つの例において、消毒剤は、臨床的（病院）消毒剤、家庭消毒剤、多目的消毒剤、および高度な創傷被覆のための殺生物剤を含むが、これらに限定されない。
【0094】
本明細書中で使用する「消毒剤」という用語は、微生物を含まない製品を滅菌または維持することができる薬剤を指す。本質的に、微生物の成長が望ましくないあらゆる製品、例えば動物およびヒトと接触する物質を、微生物の成長を防止するために本明細書中で提供するペプチドで処理することができる。かかる製品としては、例えば、おしり拭き、おむつ、バンドエイド（ｂａｎｄａｉｄ）、タオル、化粧製品、手術用品、創傷包帯、洗眼剤およびコンタクトレンズ溶液が挙げられ得る。本明細書中で用いる「保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）」または「保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」または「消毒剤（ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃ）」という用語は、食品、飲料、調合薬、塗料、生物学的試料、化粧品、および木材を含むがこれらに限定されない製品に添加して、微生物の成長による、または所望されない化学的変化による分解を防止することができる、本明細書中で開示するペプチドを指す。
【0095】
例えば図１８に示すように、本開示のペプチドは、損傷した角膜の創傷閉鎖を損なわず、従って、本開示のペプチドは、生体適合性であり、眼科用調製に好適である。さらに、本開示は、グラム陽性、グラム陰性および真菌感染に対する広範囲の眼科用点眼製剤としてカチオン性抗菌ポリマーを含む特定の組成物に関する。本開示はまた、本開示のペプチドの、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびＦ．ｓｏｌａｎｉによって引き起こされる感染に対抗するための強力な広範囲の眼科用抗生物質としての使用に関する。本開示はまた、ポリマーの構造に基づく高められたタンパク質分解安定性および高い治療指数を有するペプチドの合理的な設計、ならびに、感染性疾患、多目的消毒液、保存剤および消毒剤を含むがこれらに限定されない微生物コロニー形成の管理におけるそれらの適用に関する。従って、別の局面において、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）および／または本明細書中に記載する組成物を含む眼科用製剤を、提供する。本明細書中で使用する「眼科用製剤」を、眼科用溶液、眼科用懸濁液、眼科用ゲル、眼科用軟膏、または眼科用ストリップ／インサートの形態で包含させることができる。眼科用溶液は、点眼剤として使用するために処方した水溶液または有機溶液である。眼科用懸濁剤は、ペプチドを含有する小さな粒子、例えば、超微粒ナノ粒子を水溶液または有機溶液中に添加することである。眼科用ゲルは、涙液膜中に分散し、眼表面を横断して本質的に透明な膜を形成する特殊なポリマーである。眼科用軟膏は、ワセリン基剤の羊毛脂肪との混合物である。眼科用ストリップ／インサートは、ペプチドを含浸させることができる濾紙または不溶性コンタクトレンズ様物体を指す。含浸された眼科用ストリップ／インサートを、次いで眼の表面上に配置するか、または下部結膜嚢中に挿入することができる。いくつかの例において、本明細書中に記載する眼科用製剤は、眼科用溶液、点眼薬、レンズケア溶液、多目的保存剤、眼組織保存剤、高度な創傷被覆のための消毒剤、ならびに医療機器および表面のためのコーティング材料を含むが、これらに限定されない。
【0096】
１つの理論によって束縛されることを望まずに、本開示のペプチドを、当該分野で公知の任意の方法を用いて合成してもよい。本開示のペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ化学を介して、または固相ペプチド合成を介してであり得る。
【0097】
別の態様では、本明細書中に記載する１以上のペプチド（複数可）および／または本明細書中に記載する組成物を含むキットを提供する。
【0098】
本出願において使用する単数形、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、文脈が別段明らかに指示しない限り、複数の言及が含まれる。例えば、用語「単離されたペプチド」は、複数の単離されたペプチドを包含し、それらの混合物および組合せを含む。
【0099】
本明細書中で使用する場合、用語「増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」および「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」は、集団全体中に存在するものと同じ特質または特性と比較しての、集団のサブセットにおいて選択された特質または特性の相対的変化を指す。増加は、したがって正の尺度での変化を示し、一方減少は、負の尺度での変化を示す。本明細書中で使用する「変化」という用語はまた、単離された集団サブセットの選択された特質または特徴の、全体としての集団における同じ特質または特徴と比較しての差も指す。しかし、この用語は、認められた差の評価を伴わない。
【0100】
本明細書中で使用する用語「約」は、特定の明記した値の文脈において、明記した値の±５％、または明記した値の±４％、または明記した値の±３％、または明記した値の±２％、または明記した値の±１％、または明記した値の±０．５％を意味する。
【0101】
本開示全体を通じて、特定の実施形態は、範囲の様式で開示され得る。範囲の様式での説明は、単に便宜上および簡潔さのためであり、開示した範囲の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈するべきではないことを理解すべきである。従って、範囲の説明を、全ての可能な下位範囲および当該範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなすべきである。例えば、１～６などの範囲の説明を、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示した下位範囲、ならびに当該範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有するとみなすべきである。これは、範囲の幅に関係なく該当する。
【0102】
本明細書中に例示的に記載する本発明は、本明細書中に特に開示していないいかなる要素（単数）または要素（複数）、制限（単数）または制限（複数）の非存在下でも好適に実施され得る。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、広範に、かつ限定されずに読まれるものとする。さらに、本明細書中で使用する用語および表現を、説明の用語として用い、限定の用語として用いておらず、かかる用語および表現の使用において、示し、説明した特徴の任意の等価物またはその一部を除外する意図はなく、様々な修正が特許請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明を、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書中に開示したその中に例示した本発明の修正および変形は、当業者に頼ることができ、かかる修正および変形は、本発明の範囲内にあると考えられることを理解するべきである。
【0103】
本発明を、本明細書中で広範かつ包括的に記載した。一般的な開示内にあるより狭い種および亜属的分類の各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、切除した材料が本明細書中で具体的に列挙されているか否かにかかわらず、属からいかなる主題も除去する、ただし書きまたは否定的な限定を伴う本発明の一般的説明を含む。
【0104】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲および非限定的な例の範囲内にある。さらに、本発明の特徴または局面をマーカッシュ群の観点において記載する場合、当業者は、本発明がまたそれによって、マーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の下位集団の観点において記載されることを認識する。
【実施例】
【0105】
実験の章
材料および方法
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）決定。
カチオン性ポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、臨床検査標準研究所（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従って、抗生物質感受性／耐性細菌、酵母および真菌株のパネルに対して試験した。細菌および酵母株を、それぞれ、トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）およびＳａｂａｒｏｕｄデキストロース寒天（ＳＤＡ）プレート（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＩ，ＵＳＡ）上で一晩培養した。細菌のためのＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）およびカンジダ・アルビカンスのためのＳＤブロス（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）中の接種液を、０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄで調製した。懸濁液を、次いで９６ウェルマイクロタイタープレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｋｏｒｅａ）中で１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度に希釈した。ポリマーおよびポリペプチドを、２倍連続希釈で接種物に添加して、２～１０２４μｇ／ｍｌの濃度の範囲を得た。ポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いてＯＤ６００を測定するとともに、目視により３５℃での２４時間のインキュベーションの後に決定した。抗菌活性を、局所消毒剤、ＢＡＫおよびＣＨＸと比較した。同様のプロトコルを用いて、抗生物質耐性病原体に対するεＰＬのＭＩＣを決定した。フサリウム株に対するポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、完全強度のＲＰＭＩ－１６４０緩衝液中で決定した。真菌胞子を、ジャガイモデキストロース寒天上での５日齢の培養から回収し、０．９％生理食塩水で１０５胞子／ｍｌの濃度に希釈した。さらなる５０倍希釈を、ＲＰＭＩ－１６４０緩衝液中で行い、１００μｌの接種物を、等容量の試験ペプチドを含む９６ウェルプレートに２倍連続希釈で添加した。いかなる添加剤をも含まない接種物および緩衝液単独２００μｌを、それぞれ正の、および負の対照として供した。プレートを、次いで３０℃で４８時間インキュベートした。吸光度値を、前述のように６００ｎｍで測定し、９０％成長を阻害するペプチドの最低濃度を、報告した。すべてのＭＩＣ決定を、２つ１組で行った。
材料および方法
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）決定。
カチオン性ポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、臨床検査標準研究所（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従って、抗生物質感受性／耐性細菌、酵母および真菌株のパネルに対して試験した。細菌および酵母株を、それぞれ、トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）およびＳａｂａｒｏｕｄデキストロース寒天（ＳＤＡ）プレート（Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＩ，ＵＳＡ）上で一晩培養した。細菌のためのＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢ）およびカンジダ・アルビカンスのためのＳＤブロス（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）中の接種液を、０．５ ＭｃＦａｒｌａｎｄで調製した。懸濁液を、次いで９６ウェルマイクロタイタープレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｋｏｒｅａ）中で１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度に希釈した。ポリマーおよびポリペプチドを、２倍連続希釈で接種物に添加して、２～１０２４μｇ／ｍｌの濃度の範囲を得た。ポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いてＯＤ６００を測定するとともに、目視により３５℃での２４時間のインキュベーションの後に決定した。抗菌活性を、局所消毒剤、ＢＡＫおよびＣＨＸと比較した。同様のプロトコルを用いて、抗生物質耐性病原体に対するεＰＬのＭＩＣを決定した。フサリウム株に対するポリマーおよびポリペプチドのＭＩＣを、完全強度のＲＰＭＩ－１６４０緩衝液中で決定した。真菌胞子を、ジャガイモデキストロース寒天上での５日齢の培養から回収し、０．９％生理食塩水で１０５胞子／ｍｌの濃度に希釈した。さらなる５０倍希釈を、ＲＰＭＩ－１６４０緩衝液中で行い、１００μｌの接種物を、等容量の試験ペプチドを含む９６ウェルプレートに２倍連続希釈で添加した。いかなる添加剤をも含まない接種物および緩衝液単独２００μｌを、それぞれ正の、および負の対照として供した。プレートを、次いで３０℃で４８時間インキュベートした。吸光度値を、前述のように６００ｎｍで測定し、９０％成長を阻害するペプチドの最低濃度を、報告した。すべてのＭＩＣ決定を、２つ１組で行った。
【0106】
ポリマーおよびポリペプチドの細胞適合性評価
ＭＴＳ（（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム））アッセイおよび高含有量分析（ＨＣＡ）を実施して、培養したヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の代謝活性および形態学的パラメーターに対する種々のポリマーの効果を、それぞれ前に記載したように解明した。抗腫瘍薬ノコダゾール（５μｇ／ｍｌ）を負の対照として供し、一方ＰＢＳで処理した細胞を正の対照として供した。３回の独立した３つ１組の実験からの平均値を、報告する。細胞を、９６ウェルプレートで培養し、自動顕微鏡ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて走査した（１６の無作為に選択した場／ウェル）。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の多パラメーター細胞毒性生物学的応用モジュールを、得た画像の定量的推定および形態型的（ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｉｃ）解析に使用し、それを、Ｓｐｏｔｒｆｉｒｅ（登録商標）ソフトウェアを用いて色分けされたヒートマップに自動的に変換した。
ＭＴＳ（（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム））アッセイおよび高含有量分析（ＨＣＡ）を実施して、培養したヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）の代謝活性および形態学的パラメーターに対する種々のポリマーの効果を、それぞれ前に記載したように解明した。抗腫瘍薬ノコダゾール（５μｇ／ｍｌ）を負の対照として供し、一方ＰＢＳで処理した細胞を正の対照として供した。３回の独立した３つ１組の実験からの平均値を、報告する。細胞を、９６ウェルプレートで培養し、自動顕微鏡ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて走査した（１６の無作為に選択した場／ウェル）。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の多パラメーター細胞毒性生物学的応用モジュールを、得た画像の定量的推定および形態型的（ｍｏｒｐｈｏｔｙｐｉｃ）解析に使用し、それを、Ｓｐｏｔｒｆｉｒｅ（登録商標）ソフトウェアを用いて色分けされたヒートマップに自動的に変換した。
【0107】
角膜上皮創傷治癒のウサギモデルにおけるεＰＬのｉｎ ｖｉｖｏ生体適合性
本研究で使用したすべての動物を、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）記述の原則に従って処置し、プロトコルは、ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ；ＡＡＬＡＣ ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＃２０１２／ＳＨＳ／７７５、創傷治癒について、＃２０１４／ＳＨＳ／１０１０、細菌性角膜炎について）によって承認されている。５ヶ月齢のニュージーランド白色ウサギ（体重３～３．５ｋｇ）８匹を、研究のために用い、２つの群に分けた。創傷に先立ち、すべてのウサギの眼を、細隙灯写真術によって、角膜異常、例えば血管新生またはあらゆる他の眼表面欠損の不存在について試験した。角膜表面の直径６ｍｍの円形領域を、ウサギを麻酔した後に、滅菌ミニブレード（ＢＤ Ｂｅａｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で脱上皮した。２つの群のウサギに、０．３％のεＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ、ｐＨ７．０）またはＰＢＳの５０μｌの局所的滴下注入を１日４回、完全な創傷の閉鎖が観察されるまで施与した。角膜上皮創傷治癒を、２％ ｗ／ｖのフルオレセインナトリウム（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ）の滴の添加により可視化し、それによって、コバルトブルーフィルターで照射すると上皮欠損が明らかになり、創傷直後ならびに損傷後１、２、３および４日後に写真撮影した。上皮欠損の領域を、次いでＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いることによって推定した。
本研究で使用したすべての動物を、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（ＡＲＶＯ）記述の原則に従って処置し、プロトコルは、ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ；ＡＡＬＡＣ ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＃２０１２／ＳＨＳ／７７５、創傷治癒について、＃２０１４／ＳＨＳ／１０１０、細菌性角膜炎について）によって承認されている。５ヶ月齢のニュージーランド白色ウサギ（体重３～３．５ｋｇ）８匹を、研究のために用い、２つの群に分けた。創傷に先立ち、すべてのウサギの眼を、細隙灯写真術によって、角膜異常、例えば血管新生またはあらゆる他の眼表面欠損の不存在について試験した。角膜表面の直径６ｍｍの円形領域を、ウサギを麻酔した後に、滅菌ミニブレード（ＢＤ Ｂｅａｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で脱上皮した。２つの群のウサギに、０．３％のεＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ、ｐＨ７．０）またはＰＢＳの５０μｌの局所的滴下注入を１日４回、完全な創傷の閉鎖が観察されるまで施与した。角膜上皮創傷治癒を、２％ ｗ／ｖのフルオレセインナトリウム（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ）の滴の添加により可視化し、それによって、コバルトブルーフィルターで照射すると上皮欠損が明らかになり、創傷直後ならびに損傷後１、２、３および４日後に写真撮影した。上皮欠損の領域を、次いでＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いることによって推定した。
【0108】
感染性角膜炎の緑膿菌および黄色ブドウ球菌モデルにおけるεＰＬのｉｎ ｖｉｖｏの効能
体重２～２．５ｋｇのニュージーランド白色ウサギを、本試験のために使用した。ウサギを麻酔し、角膜表面を滅菌ミニブレード（ＢＤ Ｂｅａｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で脱上皮した。角膜感染を、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３または緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株５０μｌを表面を傷つけた角膜に塗布することにより誘発した。感染後２４時間後、５０μＬの０．３％εＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ、ｐＨ７．０）またはＰＢＳを、感染した眼に４回／日で局所的に適用した。０．３％トブラマイシンを含有するＴｏｂｒｅｘ（登録商標）点眼薬（Ａｌｃｏｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、緑膿菌角膜炎についての正の対照として供し、一方Ｚｙｍａｒ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，ＵＳＡ）点眼薬を、黄色ブドウ球菌角膜炎についての正の対照として使用した。細隙灯写真および前部光干渉断層撮影（ＡＳ－ＯＣＴ）走査を、感染の前および後ならびに処置の経過中に撮影した。接種前および接種後の角膜厚（ＣＴ）を角膜前面に対して垂直に測定し、平均ＣＴを報告した。
体重２～２．５ｋｇのニュージーランド白色ウサギを、本試験のために使用した。ウサギを麻酔し、角膜表面を滅菌ミニブレード（ＢＤ Ｂｅａｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）で脱上皮した。角膜感染を、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３または緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株５０μｌを表面を傷つけた角膜に塗布することにより誘発した。感染後２４時間後、５０μＬの０．３％εＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ、ｐＨ７．０）またはＰＢＳを、感染した眼に４回／日で局所的に適用した。０．３％トブラマイシンを含有するＴｏｂｒｅｘ（登録商標）点眼薬（Ａｌｃｏｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を、緑膿菌角膜炎についての正の対照として供し、一方Ｚｙｍａｒ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，ＵＳＡ）点眼薬を、黄色ブドウ球菌角膜炎についての正の対照として使用した。細隙灯写真および前部光干渉断層撮影（ＡＳ－ＯＣＴ）走査を、感染の前および後ならびに処置の経過中に撮影した。接種前および接種後の角膜厚（ＣＴ）を角膜前面に対して垂直に測定し、平均ＣＴを報告した。
【0109】
生菌の定量
εＰＬまたは眼科用抗生物質点眼剤またはＰＢＳでの処置の３日後に、ウサギ角膜を穿孔により除去し、プラスチック乳棒を用いて滅菌ＰＢＳ中で個別にホモジナイズし、続いて滅菌２ｍｍ直径ガラスビーズを用いてビーズ叩打でより微細にホモジナイズした。細菌計数を、ホモジネート（１０１～１０２連続希釈）をＴＳＡプレートに広げ、３７℃で４８時間インキュベートすることによって行った。
εＰＬまたは眼科用抗生物質点眼剤またはＰＢＳでの処置の３日後に、ウサギ角膜を穿孔により除去し、プラスチック乳棒を用いて滅菌ＰＢＳ中で個別にホモジナイズし、続いて滅菌２ｍｍ直径ガラスビーズを用いてビーズ叩打でより微細にホモジナイズした。細菌計数を、ホモジネート（１０１～１０２連続希釈）をＴＳＡプレートに広げ、３７℃で４８時間インキュベートすることによって行った。
【0110】
結果
実施例１：アルファ－（αＰＬ）およびエプシロン－ポリ－Ｌ－リシン（εＰＬ）の抗菌特性および細胞毒性
εＰＬおよびポリ－ガンマ－Ｌ－ジアミノブタン酸（γＰＡＢ）は、これまでに報告された唯一の天然に存在し、微生物により産生されたカチオン性アミノ酸ホモポリマーであった。アルファ－ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）とは異なり、εＰＬは、それぞれモノマーのアルファ－カルボキシル基およびエプシロン－アミノ基によって結合している２５～３５個のＬ－リシン残基からなっていた（図１ＡおよびＢ）。εＰＬは、グラム陽性、グラム陰性、酵母および真菌病原体に対して広範囲の抗菌活性を示すことが示されており、当該活性は、γＰＡＢよりも優れていた。εＰＬは、ＵＳ ＦＤＡにより「一般に安全とみなされる」（ＧＲＡＳ）として分類され、米国、韓国および日本で食品保存剤として使用されている。しかし、この多用途のＵＳ ＦＤＡが承認したポリマーの抗菌特性は、薬剤耐性病原体に対してはあまり詳細には調査されていなかった。同様の化学組成を考慮して、グラム陽性（黄色ブドウ球菌）、グラム陰性（緑膿菌）および酵母（カンジダ・アルビカンス株、表１）の５種類の異なる株に対するαＰＬおよびεＰＬの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、決定した。図１に示すように、両ポリマーの総平均ＭＩＣ（ＧＭ－ＭＩＣ）は、グラム陽性およびグラム陰性株に対して類似しており、一方εＰＬは、カンジダ・アルビカンス株に対してαＰＬよりも低いＭＩＣを示した。
実施例１：アルファ－（αＰＬ）およびエプシロン－ポリ－Ｌ－リシン（εＰＬ）の抗菌特性および細胞毒性
εＰＬおよびポリ－ガンマ－Ｌ－ジアミノブタン酸（γＰＡＢ）は、これまでに報告された唯一の天然に存在し、微生物により産生されたカチオン性アミノ酸ホモポリマーであった。アルファ－ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）とは異なり、εＰＬは、それぞれモノマーのアルファ－カルボキシル基およびエプシロン－アミノ基によって結合している２５～３５個のＬ－リシン残基からなっていた（図１ＡおよびＢ）。εＰＬは、グラム陽性、グラム陰性、酵母および真菌病原体に対して広範囲の抗菌活性を示すことが示されており、当該活性は、γＰＡＢよりも優れていた。εＰＬは、ＵＳ ＦＤＡにより「一般に安全とみなされる」（ＧＲＡＳ）として分類され、米国、韓国および日本で食品保存剤として使用されている。しかし、この多用途のＵＳ ＦＤＡが承認したポリマーの抗菌特性は、薬剤耐性病原体に対してはあまり詳細には調査されていなかった。同様の化学組成を考慮して、グラム陽性（黄色ブドウ球菌）、グラム陰性（緑膿菌）および酵母（カンジダ・アルビカンス株、表１）の５種類の異なる株に対するαＰＬおよびεＰＬの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、決定した。図１に示すように、両ポリマーの総平均ＭＩＣ（ＧＭ－ＭＩＣ）は、グラム陽性およびグラム陰性株に対して類似しており、一方εＰＬは、カンジダ・アルビカンス株に対してαＰＬよりも低いＭＩＣを示した。
【0111】
表１ 細菌および酵母株のパネルに対するαＰＬおよびεＰＬの最小発育阻止濃度
【表1】
【0112】
実施例２：ＭＴＴおよび高含有量分析（ＨＣＡ）により評価したαＰＬおよびεＰＬの細胞毒性
初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するカチオン性ポリマーの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイにより評価した。図２ＡおよびＢは、種々の濃度のαＰＬおよびεＰＬで処理したＨＤＦの代謝活性を比較した。低濃度では、αＰＬはＨＤＦの代謝活性を阻害し、一方εＰＬは試験した最高濃度（２ｍｇ／ｍＬ）でも特性を変化させなかった。これらの結果と整合して、ＨＣＡ解析から、αＰＬに曝露したＨＤＦは細胞形態のかなりの異常を示し、一方εＰＬに曝露した細胞は処理していない対照と類似したままであることが示された（図３）。形態学的解析から、εＰＬに曝露したＨＤＦは、４種類の定量的パラメーター：平均細胞／場、細胞形状係数、細胞面積および核面積に明らかな変化を示さないことが示され、それは、高ポリマー濃度でも細胞健康の状態を表した。アルファＰＬに曝露した細胞は、しかしながら１２５μｇ／ｍｌでも細胞形態の著しい変化および細胞骨格成分の欠如を示し、従って、ポリマーの細胞毒性効果を示唆した。
初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対するカチオン性ポリマーの細胞毒性を、ＭＴＴアッセイにより評価した。図２ＡおよびＢは、種々の濃度のαＰＬおよびεＰＬで処理したＨＤＦの代謝活性を比較した。低濃度では、αＰＬはＨＤＦの代謝活性を阻害し、一方εＰＬは試験した最高濃度（２ｍｇ／ｍＬ）でも特性を変化させなかった。これらの結果と整合して、ＨＣＡ解析から、αＰＬに曝露したＨＤＦは細胞形態のかなりの異常を示し、一方εＰＬに曝露した細胞は処理していない対照と類似したままであることが示された（図３）。形態学的解析から、εＰＬに曝露したＨＤＦは、４種類の定量的パラメーター：平均細胞／場、細胞形状係数、細胞面積および核面積に明らかな変化を示さないことが示され、それは、高ポリマー濃度でも細胞健康の状態を表した。アルファＰＬに曝露した細胞は、しかしながら１２５μｇ／ｍｌでも細胞形態の著しい変化および細胞骨格成分の欠如を示し、従って、ポリマーの細胞毒性効果を示唆した。
【0113】
実施例３：εＰＬの広範囲の抗菌特性
哺乳動物細胞に対する細胞毒性の欠如を推奨して、グラム陽性およびグラム陰性細菌および糸状菌の抗生物質耐性株のパネルに対するεＰＬの抗菌特性を、試験した。表２は、病原性グラム陽性、グラム陰性および真菌株のパネルに対するεＰＬのＭＩＣ値の範囲を列挙した。値を、広範囲の点眼抗菌／抗真菌薬と比較した。結果によって、εＰＬのＭＩＣは様々な抗生物質耐性株について有意に変化せず、一方多くの株はトブラマイシンに対して顕著な耐性を示したことが示された。静的バイオフィルムモデルにおいて、εＰＬによって１０×ＭＩＣでＰＡ０１株のバイオフィルム負荷のかなりの減少（＞９０％）が生じ（図４）、活性は、カチオン性環状リポペプチドであるポリミキシンＢよりも優れていた。当該ポリマーによってまた、真菌菌糸細胞の生存率が減少し、ＩＣ５０は、３０．８±３．８μｇ／ｍｌであり（図５Ａ）、当該値は、ＦＤＡが承認した眼科用抗真菌薬ナタマイシンよりも高かった（図５Ｂ）。
哺乳動物細胞に対する細胞毒性の欠如を推奨して、グラム陽性およびグラム陰性細菌および糸状菌の抗生物質耐性株のパネルに対するεＰＬの抗菌特性を、試験した。表２は、病原性グラム陽性、グラム陰性および真菌株のパネルに対するεＰＬのＭＩＣ値の範囲を列挙した。値を、広範囲の点眼抗菌／抗真菌薬と比較した。結果によって、εＰＬのＭＩＣは様々な抗生物質耐性株について有意に変化せず、一方多くの株はトブラマイシンに対して顕著な耐性を示したことが示された。静的バイオフィルムモデルにおいて、εＰＬによって１０×ＭＩＣでＰＡ０１株のバイオフィルム負荷のかなりの減少（＞９０％）が生じ（図４）、活性は、カチオン性環状リポペプチドであるポリミキシンＢよりも優れていた。当該ポリマーによってまた、真菌菌糸細胞の生存率が減少し、ＩＣ５０は、３０．８±３．８μｇ／ｍｌであり（図５Ａ）、当該値は、ＦＤＡが承認した眼科用抗真菌薬ナタマイシンよりも高かった（図５Ｂ）。
【0114】
表２：薬剤耐性細菌および真菌のパネルに対するεＰＬのＭＩＣ。使用した菌株数を括弧内に示す。
【表2】
【0115】
実施例４：グラム陽性およびグラム陰性細菌に対するεＰＬの時間死滅動態
各種グラム陰性菌に対するεＰＬの用量依存的死滅動態を、図６に示す。εＰＬの殺菌活性は、アミノグリコシド系抗生物質に対する増強された耐性を示した菌株に対して迅速であった。ＣＲＥ株大腸菌１９２１１およびエンテロバクター・クロアカ６７８０は、１００μｇ／ｍｌでトブラマイシンに対する増強された耐性を示し、一方εＰＬへの曝露で急速に死滅した。生存率における３ｌｏｇ１０単位以上の低下は、ポリマーの２×ＭＩＣで４時間で達成できた。同様に、より速い殺菌効果が、ゲンタマイシンに対する増強された耐性を示したアシネトバクター・バウマンニ１００１株に対して観察された。グラム陰性菌株と比較した場合、εＰＬは、全ての黄色ブドウ球菌およびＭＲＳＡ株に対して殺菌活性のより遅い動態を示した。全体として、微生物学的研究により、多様な疾患原因病原体および薬剤耐性病原体に対するεＰＬの強力な抗菌特性が確立された。
各種グラム陰性菌に対するεＰＬの用量依存的死滅動態を、図６に示す。εＰＬの殺菌活性は、アミノグリコシド系抗生物質に対する増強された耐性を示した菌株に対して迅速であった。ＣＲＥ株大腸菌１９２１１およびエンテロバクター・クロアカ６７８０は、１００μｇ／ｍｌでトブラマイシンに対する増強された耐性を示し、一方εＰＬへの曝露で急速に死滅した。生存率における３ｌｏｇ１０単位以上の低下は、ポリマーの２×ＭＩＣで４時間で達成できた。同様に、より速い殺菌効果が、ゲンタマイシンに対する増強された耐性を示したアシネトバクター・バウマンニ１００１株に対して観察された。グラム陰性菌株と比較した場合、εＰＬは、全ての黄色ブドウ球菌およびＭＲＳＡ株に対して殺菌活性のより遅い動態を示した。全体として、微生物学的研究により、多様な疾患原因病原体および薬剤耐性病原体に対するεＰＬの強力な抗菌特性が確立された。
【0116】
実施例５：感染性角膜炎のウサギモデルにおけるεＰＬの抗菌効力
黄色ブドウ球菌角膜炎のウサギモデルにおけるＰＢＳ中のεＰＬ（０．３％ｗ／ｖ）のｉｎ ｖｉｖｏ効能を、試験した。ウサギを、先に麻酔し、角膜感染を、５０ｍｌの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３（５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）株を適用することによって誘発した。感染後２４時間後、５０μＬのポリマーまたはＰＢＳを、感染した眼に４回／日で局所的に適用した。比較のため、Ｚｙｍａｒ（登録商標）点眼剤を、正の対照として用いた。眼を、感染および治療後の角膜厚の変化をモニタリングする細隙灯生体顕微鏡検査および前部光干渉断層撮影により試験した。εＰＬで処置した眼のＳＬ試験では、他の群と比較して、結膜浮腫および排泄物、角膜混濁および結膜発赤の有意な減少が認められた（図７）。前部ＯＣＴ（ＡＳ－ＯＣＴ）試験を行って、感染／処置の前および後の角膜の形態変化を推論した。ＡＳ－ＯＣＴ画像は、ｐ．ｉ．２４時間で角膜浮腫および不規則表面の有意な増加および角膜上皮下の過反射領域を例証した。感染眼を０．３％εＰＬ局所処置すると、ｐ．ｔ．２４時間の角膜厚および反射亢進領域の有意な減少がもたらされた。４８時間後、角膜浮腫の大幅な減少が観察され、ｐ．ｔ．４８時間のベースライン値に近づいた。ベースラインの角膜厚の完全な回復は、７２時間ｐ．ｔ．に達成され得た。ＡＳ－ＯＣＴ画像はまた、εＰＬで処置した眼がＺｙｍａｒ（登録商標）またはＰＢＳで処置した眼と比較して、２４時間ｐ．ｔ．で浮腫の有意な減少を示したことを示した（図８ＡおよびＢ）。３日ｐ．ｔ．の終了時に、細菌生存を計数した。εＰＬおよびＺｙｍａｒで処置した角膜は共に生菌の存在を示さず、一方ＰＢＳで処置した角膜は、４．１±０．１３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌを含んでいた（図８Ｃ）。
黄色ブドウ球菌角膜炎のウサギモデルにおけるＰＢＳ中のεＰＬ（０．３％ｗ／ｖ）のｉｎ ｖｉｖｏ効能を、試験した。ウサギを、先に麻酔し、角膜感染を、５０ｍｌの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３（５×１０６ＣＦＵ／ｍｌ）株を適用することによって誘発した。感染後２４時間後、５０μＬのポリマーまたはＰＢＳを、感染した眼に４回／日で局所的に適用した。比較のため、Ｚｙｍａｒ（登録商標）点眼剤を、正の対照として用いた。眼を、感染および治療後の角膜厚の変化をモニタリングする細隙灯生体顕微鏡検査および前部光干渉断層撮影により試験した。εＰＬで処置した眼のＳＬ試験では、他の群と比較して、結膜浮腫および排泄物、角膜混濁および結膜発赤の有意な減少が認められた（図７）。前部ＯＣＴ（ＡＳ－ＯＣＴ）試験を行って、感染／処置の前および後の角膜の形態変化を推論した。ＡＳ－ＯＣＴ画像は、ｐ．ｉ．２４時間で角膜浮腫および不規則表面の有意な増加および角膜上皮下の過反射領域を例証した。感染眼を０．３％εＰＬ局所処置すると、ｐ．ｔ．２４時間の角膜厚および反射亢進領域の有意な減少がもたらされた。４８時間後、角膜浮腫の大幅な減少が観察され、ｐ．ｔ．４８時間のベースライン値に近づいた。ベースラインの角膜厚の完全な回復は、７２時間ｐ．ｔ．に達成され得た。ＡＳ－ＯＣＴ画像はまた、εＰＬで処置した眼がＺｙｍａｒ（登録商標）またはＰＢＳで処置した眼と比較して、２４時間ｐ．ｔ．で浮腫の有意な減少を示したことを示した（図８ＡおよびＢ）。３日ｐ．ｔ．の終了時に、細菌生存を計数した。εＰＬおよびＺｙｍａｒで処置した角膜は共に生菌の存在を示さず、一方ＰＢＳで処置した角膜は、４．１±０．１３ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌを含んでいた（図８Ｃ）。
【0117】
次に、緑膿菌角膜炎のウサギモデルにおけるεＰＬの効能を、試験した。感染および処置プロトコルを、黄色ブドウ球菌角膜炎モデルについて以前と同様に維持した。２４時間ｐ．ｉ．後、緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７株で感染した角膜は、浸潤の濁った、浮腫性の、および有意な存在の外見を呈した。結膜浮腫および濁りの顕著な減少が、０．３％εＰＬの局所適用後、２４時間ｐ．ｔ．で観察された。結膜発赤、結膜浮腫および濁りの次第の減少は、処置レジメンの増加に伴い観察された（図９Ａ）。ＡＳ－ＯＣＴ画像はさらに、術前角膜厚が２４時間ｐ．ｉ．で３７０±８μｍから５７０±４９に増加したことを例証した。εＰＬでの処置の１～３日後に、角膜厚の次第の減少が観察された（図９Ｂ）。εＰＬでの３日ｐ．ｔ．後に、過剰反射（ｈｙｐｅｒｒｅｆｅｌｅｃｔｉｖｅ）領域の実質的な減少および角膜粗さが観察され、緑膿菌感染の除去におけるεＰＬの効力が確認された。細菌生存率の微生物学的計数は、εＰＬ処置後の５／６角膜において生存細菌の検出を示さず、一方１つの角膜において、３．４±０．１２ｌｏｇ１０ＣＦＵの生存率が観察された（図９Ｃ）。しかし、ＰＢＳで処置した角膜は、５．１±０．７ｌｏｇ１０ＣＦＵを含んでおり、εＰＬ処置後の細菌負荷の実質的な減少を示唆した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの微生物学的研究と共に、これらの結果は、局所的適用のためのεＰＬの優れた抗菌特性を例証した。
【0118】
例６：εＰＬは、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）に対する緑膿菌および黄色ブドウ球菌の有害作用を減弱する。
緑膿菌は、全身および慢性創傷を有する患者の死亡率の増加の原因である。日和見病原体は、非食細胞に侵入し、細菌によって産生される酵素のタンパク質分解活性は、組織侵入において重要な役割を果たす。ｈＤＦの形態変化を決定するために、細胞を、緑色蛍光タンパク質標識ＰＡＯ１（ＰＡＯ１＿ｇｆｐ）株に４時間曝露した。宿主細胞の表現型の顕著な変化が、感染４時間後（ｐ．ｉ．、図１５ＡおよびＢ）に細胞円形化およびアクチンフィラメントの有意な損失として明らかであった。感染前（防止）または感染２時間後（退行）にεＰＬ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したｈＤＦは、細胞内細菌が観察されなかったことと同様に、細菌の有害作用および侵入能を防止した（図１５ＣおよびＤ）。同様の効果が黄色ブドウ球菌感染に対しても観察され、哺乳動物細胞に対する病原性細菌の副作用を回避するポリマーの強力な抗菌特性が確立された。
緑膿菌は、全身および慢性創傷を有する患者の死亡率の増加の原因である。日和見病原体は、非食細胞に侵入し、細菌によって産生される酵素のタンパク質分解活性は、組織侵入において重要な役割を果たす。ｈＤＦの形態変化を決定するために、細胞を、緑色蛍光タンパク質標識ＰＡＯ１（ＰＡＯ１＿ｇｆｐ）株に４時間曝露した。宿主細胞の表現型の顕著な変化が、感染４時間後（ｐ．ｉ．、図１５ＡおよびＢ）に細胞円形化およびアクチンフィラメントの有意な損失として明らかであった。感染前（防止）または感染２時間後（退行）にεＰＬ（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したｈＤＦは、細胞内細菌が観察されなかったことと同様に、細菌の有害作用および侵入能を防止した（図１５ＣおよびＤ）。同様の効果が黄色ブドウ球菌感染に対しても観察され、哺乳動物細胞に対する病原性細菌の副作用を回避するポリマーの強力な抗菌特性が確立された。
【0119】
例７：εＰＬはＬＰＳ誘発炎症を軽減する。
εＰＬが細菌の外膜の重要な構成要素であるリポ多糖（ＬＰＳ）に結合するか否かを決定するために、ＴＨＰ１－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ－κＢレポーターアッセイを実施した。結果は、１ｍｇ／ｍｌで単球細胞のＬＰＳで誘導された炎症の実質的な阻害を示し、ＬＰＳへのポリマー結合がエンドトキシンの有害作用を減弱することを確認した（図１６）。
εＰＬが細菌の外膜の重要な構成要素であるリポ多糖（ＬＰＳ）に結合するか否かを決定するために、ＴＨＰ１－Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ－κＢレポーターアッセイを実施した。結果は、１ｍｇ／ｍｌで単球細胞のＬＰＳで誘導された炎症の実質的な阻害を示し、ＬＰＳへのポリマー結合がエンドトキシンの有害作用を減弱することを確認した（図１６）。
【0120】
実施例８：εＰＬはｈＤＦｓ細胞移動を促進し、細菌セクレトームの阻害作用を無効にする。
日和見性眼病原体セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｅｓ）、緑膿菌および黄色ブドウ球菌から由来する因子（セクレトーム）は、上皮細胞の移動を阻害し、したがって角膜創傷治癒の遅延に寄与することが示されている。εＰＬは、角膜炎のウサギモデルで細菌のバイオバーデンおよび角膜浮腫を減少させ、高濃度のポリマーでもｈＤＦｓに対して非細胞毒性であったため、ポリマーが線維芽細胞の移動に干渉するか否かの事実を、調査した。ｈＤＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞移動アッセイ（引っかき傷）を用いて、ポリマーが細胞移動に干渉するか否かを評価した。結果は、１ｍｇ／ｍｌのポリマーによって相対的創傷閉鎖（ＲＷＣ）が増加し、初期速度は組換え線維芽細胞成長因子のものと類似していたことを示唆する（図１７ＡおよびＢ）。
日和見性眼病原体セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｅｓ）、緑膿菌および黄色ブドウ球菌から由来する因子（セクレトーム）は、上皮細胞の移動を阻害し、したがって角膜創傷治癒の遅延に寄与することが示されている。εＰＬは、角膜炎のウサギモデルで細菌のバイオバーデンおよび角膜浮腫を減少させ、高濃度のポリマーでもｈＤＦｓに対して非細胞毒性であったため、ポリマーが線維芽細胞の移動に干渉するか否かの事実を、調査した。ｈＤＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞移動アッセイ（引っかき傷）を用いて、ポリマーが細胞移動に干渉するか否かを評価した。結果は、１ｍｇ／ｍｌのポリマーによって相対的創傷閉鎖（ＲＷＣ）が増加し、初期速度は組換え線維芽細胞成長因子のものと類似していたことを示唆する（図１７ＡおよびＢ）。
【0121】
次に、分泌および細断された分子を含む細菌セクレトームがｈＤＦ移動を阻害するか否かを、評価した。黄色ブドウ球菌セクレトームの２５～５０％（ｖ／ｖ）の添加はｈＤＦｓに対して非細胞毒性であったが、ｈＤＦｓの移動を阻害した（データは示していない）。しかし、εＰＬ（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下では、自発的な回収が観察され、当該ポリマーが細菌セクレトームの有害な作用を無効にすることが示唆された（図１７Ｃ）。商業的に入手できる創傷洗浄剤および局所消毒剤は、線維芽細胞の移動および増殖を防止することが報告されている。まとめると、これらの観察は、εＰＬが生体適合性であり、インビトロでｈＤＦの移動を促進し、細菌分泌産物の有害作用を回避することを実証する。
【0122】
実施例９：εＰＬの眼毒性
高濃度（ＰＢＳ中１．５％、ｗ／ｖ）でのεＰＬの眼毒性を、決定した。結果は、ポリマーが、ＰＢＳまたは０．３％εＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ）で処置した損傷した角膜と比較して、損傷後３日後にわずかな遅れが観察されたが、ポリマーは、損傷した角膜の創傷閉鎖を損なわないことを示した（図１８ＡおよびＢ）。これらの結果は、ポリマーの優れた生体適合性を確立する。
高濃度（ＰＢＳ中１．５％、ｗ／ｖ）でのεＰＬの眼毒性を、決定した。結果は、ポリマーが、ＰＢＳまたは０．３％εＰＬ（ＰＢＳ中ｗ／ｖ）で処置した損傷した角膜と比較して、損傷後３日後にわずかな遅れが観察されたが、ポリマーは、損傷した角膜の創傷閉鎖を損なわないことを示した（図１８ＡおよびＢ）。これらの結果は、ポリマーの優れた生体適合性を確立する。
【0123】
実施例１０：εＰＬの抗がん特性
εＰＬは、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫および網膜芽細胞腫細胞株に対して強力な抗がん活性を示した（図１９）。末梢血液Ｔ細胞（ＰＢＴＬ）または網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ １９）と比較した場合、生存能のより高い喪失が、様々な濃度のポリマーに曝露したがん細胞について観察された。
εＰＬは、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫および網膜芽細胞腫細胞株に対して強力な抗がん活性を示した（図１９）。末梢血液Ｔ細胞（ＰＢＴＬ）または網膜色素上皮細胞株（ＡＲＰＥ １９）と比較した場合、生存能のより高い喪失が、様々な濃度のポリマーに曝露したがん細胞について観察された。
【0124】
実施例１１：εＰＬ模倣ペプチドの設計
以上の結果から、エプシロン－リシル結合の存在はアルファ－リシル結合よりも原核細胞を標的とする選択性に優れていると仮定した。さらに、エプシロン－リシル結合の存在によって、同様にペプチドのタンパク質分解安定性が増加し得る。系統的研究において、Ｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌは、最小限の９個のイソペプチド結合が最小限の抗菌活性を付与するために必要であることを示した。反復の数が１２以上に増加すると、プラトーが観察された。これらの結果は、最低１２個のカチオン性残基がＭＩＣ値に基づいて合理的に良好な抗菌活性を得るために必要であることを示唆した（図１０Ａ）。これに基づいて、６つのリシンおよびアルギニンの対を連続において含む１２個の残基のペプチドを、合成した。使用したアミノ酸残基のタイプ（Ｄ－またはＬアミノ酸のいずれか）および各アミノ酸残基間の結合（アルファまたはエプシロン結合のいずれか）を、図２１に示す。ペプチドは、広範囲の病原体に対して広範囲の抗菌性を示した（表３）。ペプチドが抗菌活性を保持したか否かをチェックするために、トリプシンの存在下でのそれらの抗菌特性を、評価した。図１０Ｂに示すように、活性の完全な喪失が、ＨＣ１について観察され、一方ＨＣ２は、トリプシンと共に１時間インキュベートした後でさえ抗菌活性を維持した。
以上の結果から、エプシロン－リシル結合の存在はアルファ－リシル結合よりも原核細胞を標的とする選択性に優れていると仮定した。さらに、エプシロン－リシル結合の存在によって、同様にペプチドのタンパク質分解安定性が増加し得る。系統的研究において、Ｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌは、最小限の９個のイソペプチド結合が最小限の抗菌活性を付与するために必要であることを示した。反復の数が１２以上に増加すると、プラトーが観察された。これらの結果は、最低１２個のカチオン性残基がＭＩＣ値に基づいて合理的に良好な抗菌活性を得るために必要であることを示唆した（図１０Ａ）。これに基づいて、６つのリシンおよびアルギニンの対を連続において含む１２個の残基のペプチドを、合成した。使用したアミノ酸残基のタイプ（Ｄ－またはＬアミノ酸のいずれか）および各アミノ酸残基間の結合（アルファまたはエプシロン結合のいずれか）を、図２１に示す。ペプチドは、広範囲の病原体に対して広範囲の抗菌性を示した（表３）。ペプチドが抗菌活性を保持したか否かをチェックするために、トリプシンの存在下でのそれらの抗菌特性を、評価した。図１０Ｂに示すように、活性の完全な喪失が、ＨＣ１について観察され、一方ＨＣ２は、トリプシンと共に１時間インキュベートした後でさえ抗菌活性を維持した。
【0125】
表３：病原体のパネルに対するεＰＬ模倣ペプチドのＭＩＣ。使用した菌株の数を、括弧内に示す。ｎ．ｄ．は、決定せずを示す。
【表3】
【0126】
ε－リシルペプチド結合（複数可）の存在が選択性を改善するという全体的な目的を確認するために、メリチンを選択した。メリチンは、ハチ毒（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）からの天然に存在する宿主防御ペプチドであり、哺乳動物細胞および微生物細胞の両方において周知の孔形成特性を有する。当該ペプチドは、強力な抗菌、抗腫瘍および溶血活性を示し、従って、その治療的可能性を低下させた。メリチンはアルファ－ペプチド結合によって結合している３個のリシン残基（７番目、２１番目、２３番目）を含む。各アルファ－リシン残基を個別に、および３個の残基全部を同時に、エプシロン－リシン残基によって置き換え、設計したペプチドの抗菌活性および細胞毒性を試験した（表４）。Ｌｙｓ２３（ペプチド１）およびＬｙｓ２１（ペプチド２）を置換することによって、黄色ブドウ球菌、緑膿菌およびカンジダ・アルビカンス株に対するペプチドのＭＩＣ値は変化しなかった。表４に示すように、Ｌｙｓ２１およびＬｙｓ２３を置き換えても、総平均ＭＩＣ（ＧＭ－ＭＩＣ）値の明らかな増加は観察されなかった。しかしながら、Ｌｙｓ７のε－リシンへの変換（ペプチド３）によって、黄色ブドウ球菌株に対するＧＭ－ＭＩＣ値の有意な増加、緑膿菌に対する値の中程度の増加がもたらされ、カンジダ・アルビカンスに対する有意な増加または減少はもたらされなかった。３個の残基すべての置換（ペプチド４）によって、しかしながら、ＭＩＣ値の４～３２倍の増加、緑膿菌株に対するＧＭ－ＭＩＣの３倍の増加によって示されるように、抗黄色ブドウ球菌活性が完全に無効になり、カンジダ・アルビカンス株に対するＧＭ－ＭＩＣは変化しなかった。これらの結果は、７番目の位置のα－リシン残基がメリチンの抗菌特性に対する鍵であることを強調した。ペプチド３および４は、微生物細胞よりも優れた選択性を示したため（下記を参照）、他のグラム陽性菌株および薬剤耐性病原体のパネル、例えばカルバペナム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、ポリミキシンＢ耐性Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ複合体に対するそれらの抗菌活性を、比較した。表５に示すように、ＭＩＣ値の中程度の増加が、メリチンと比較して、薬剤耐性株に対するペプチド３および４について観察された。
【0127】
表４ 細菌および酵母株に対するメリチンおよび修飾ペプチド１～４のアミノ酸配列および治療指数値。ε－リシル残基をイタリック体で示し、下線を付す。
【表4】
【0128】
ＭＴＳアッセイにより、ペプチド１および２はメリチンよりもＨＤＦに対する細胞毒性作用が低いことが確認された。興味深いことに、ペプチド３の細胞毒性の著しい低下が、ＨＤＦについて観察され、このことは、Ｌｙｓ７のε－リシンへの変換によって選択性が増強されることを示唆している（図１１）。細胞毒性のより顕著な低下が、３個のα－リシンをすべてε－リシンに置き換えた際に観察された。興味深いことに、ペプチド５および６もまた、メリチンまたはペプチド３よりも低い細胞毒性を示し、ペプチド５および６のより大きな細胞選択性を示唆した。ＨＣＡからの重要な細胞健康パラメーターの分析によって、さらに、ペプチド４～６（図１１）が細胞形態、細胞骨格および核成分を変化させないことが確認された。したがって、メリチン中のα－リシンのε－リシン化によって、孔形成メリチンの選択性がアミオレレートされ（ａｍｉｏｌｅｒａｔｅ）、それによって治療的可能性が高められると結論づけられた。
【0129】
２つのε－リシル残基を有する２つの新たなペプチドの細胞選択性もまた、Ｎ末端リシン（Ｌｙｓ７）を置き換えるとＣ末端α－リシン残基（Ｌｙｓ２１およびＬｙｓ２３）よりも治療指数が有意に改善されるという上記の観察に基づいて評価した。新たに設計したペプチドの抗菌性および細胞毒性を、表５に示す。
【0130】
表５ メリチン、ペプチド３、４、５および６のＭＩＣ（または抗菌特性）を、薬剤耐性細菌のパネルに対して、および他の病原性酵母株に対して決定した。結果は、ペプチド４および６が他のペプチドの中でも強力であることを示した。
【表5】
【0131】
表６ 膜選択性を改善するためのメリチンペプチドの種々の化学的修飾の比較。
［ａ］ 入手可能であれば、修飾していない親ペプチドのＭＩＣおよび溶血データを、比較の基礎として提供する。
［ｂ］ 突然変異ペプチドに対して行った関連する修飾を、太字とし、下線を付す。
［ｃ］ 試験した多くの微生物に対する最小発育阻止濃度の範囲
［ｄ］ 修飾していない親ペプチドに対応するデータは、入手可能でない。
参考文献：
４－Ｄ．Ｗａｄｅ，Ａ．Ｂｏｍａｎ，Ｂ．Ｗａｈｌｉｎ，Ｃ．Ｄｒａｉｎ，Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ，Ｈ．Ｇ．Ｂｏｍａｎ，Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，４７６１－４７６５．
５－Ｚ．Ｏｒｅｎ，Ｙ．Ｓｈａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１８２６－１８３５．
６－Ｗ．Ｌ．Ｚｈｕ，Ｙ．Ｍ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｓ．－Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｉｍ，Ｉ．－Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｋ．－Ｓ．Ｈａｈｍ，Ｓ．Ｙ．Ｓｈｉｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００７，１７６８，１５０６－１５１７．
７－Ｔ．Ｕｎｇｅｒ，Ｚ．Ｏｒｅｎ，Ｙ．Ｓｈａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，６３８８－６３９７．
８－Ｅ．Ｊａｍａｓｂｉ，Ｓ．Ｂａｔｉｎｏｖｉｃ，Ｒ．Ａ．Ｓｈａｒｐｌｅｓ，Ｍ．－Ａ．Ｓａｎｉ，Ｒ．Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓ－Ｂｒｏｗｎｅ，Ｊ．Ｄ．Ｗａｄｅ，Ｆ．Ｓｅｐａｒｏｖｉｃ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｓｓａｉｎ，Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ２０１４，４６，２７５９－２７６６．
９－Ｒ．Ｋｉｎｉ，Ｈ．Ｊ．ＥＶＡＮＳ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９８９，３４，２７７－２８６．
【表6】
［ｂ］ 突然変異ペプチドに対して行った関連する修飾を、太字とし、下線を付す。
［ｃ］ 試験した多くの微生物に対する最小発育阻止濃度の範囲
［ｄ］ 修飾していない親ペプチドに対応するデータは、入手可能でない。
参考文献：
４－Ｄ．Ｗａｄｅ，Ａ．Ｂｏｍａｎ，Ｂ．Ｗａｈｌｉｎ，Ｃ．Ｄｒａｉｎ，Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ，Ｈ．Ｇ．Ｂｏｍａｎ，Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９０，８７，４７６１－４７６５．
５－Ｚ．Ｏｒｅｎ，Ｙ．Ｓｈａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，３６，１８２６－１８３５．
６－Ｗ．Ｌ．Ｚｈｕ，Ｙ．Ｍ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｓ．－Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｉｍ，Ｉ．－Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｋ．－Ｓ．Ｈａｈｍ，Ｓ．Ｙ．Ｓｈｉｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００７，１７６８，１５０６－１５１７．
７－Ｔ．Ｕｎｇｅｒ，Ｚ．Ｏｒｅｎ，Ｙ．Ｓｈａｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，４０，６３８８－６３９７．
８－Ｅ．Ｊａｍａｓｂｉ，Ｓ．Ｂａｔｉｎｏｖｉｃ，Ｒ．Ａ．Ｓｈａｒｐｌｅｓ，Ｍ．－Ａ．Ｓａｎｉ，Ｒ．Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓ－Ｂｒｏｗｎｅ，Ｊ．Ｄ．Ｗａｄｅ，Ｆ．Ｓｅｐａｒｏｖｉｃ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｓｓａｉｎ，Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ２０１４，４６，２７５９－２７６６．
９－Ｒ．Ｋｉｎｉ，Ｈ．Ｊ．ＥＶＡＮＳ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９８９，３４，２７７－２８６．
【0132】
実施例１２：ペプチド３および４の免疫原性
ペプチド３および４が哺乳動物細胞への曝露時に有害な免疫原性反応を引き起こさないか否かを理解するために、ヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）に対するそれらの免疫原性を決定した。細胞を、ペプチド（６２．５および１２５μｇ／ｍｌ）に曝露し、インターロイキン－２、－４および５（ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－５）ならびにインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の量を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量的に決定した。有糸分裂誘発性植物レクチンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、正の対照として用いた。図１２Ａ～Ｄは、ペプチド３および４の添加後のＰＢＴＬからのサイトカインの定量的決定を示した。結果は、ＰＢＴＬからのサイトカイン産生の明らかな誘導がないことを示し、従って、ペプチドの非免疫原性の性質を確認した。
ペプチド３および４が哺乳動物細胞への曝露時に有害な免疫原性反応を引き起こさないか否かを理解するために、ヒト一次血液Ｔ細胞リンパ球（ＰＢＴＬ）に対するそれらの免疫原性を決定した。細胞を、ペプチド（６２．５および１２５μｇ／ｍｌ）に曝露し、インターロイキン－２、－４および５（ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－５）ならびにインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の量を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量的に決定した。有糸分裂誘発性植物レクチンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、正の対照として用いた。図１２Ａ～Ｄは、ペプチド３および４の添加後のＰＢＴＬからのサイトカインの定量的決定を示した。結果は、ＰＢＴＬからのサイトカイン産生の明らかな誘導がないことを示し、従って、ペプチドの非免疫原性の性質を確認した。
【0133】
実施例１３：エプシロン－リシル化によって哺乳動物膜との相互作用が減弱された
膜識別の機構への洞察を得るために、哺乳動物（ＰＣ／コレステロール）および微生物（ＰＥ：ＰＧ）細胞の細胞質膜を模倣する大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を、使用した。メリチン、ペプチド１およびペプチド２は、負に荷電したＰＥ：ＰＧ ＬＵＶからの蛍光プローブの急速かつ濃度依存性の放出（９０％超）を示し、一方ペプチド３は、色素漏出の中程度の増加のみを示し、約４０％の色素放出を達成した（図１３Ａ）。ペプチド４～６は、しかしながら約７０％超の色素放出を示し、ペプチド５および６は、メリチンと類似の膜透過特性を示し、一方、より弱いものが、ペプチド４について観察された（図１３Ｂ）。より劇的な結果が、実験をＰＣ／コレステロールＬＵＶで実施した場合に観察された。メリチン、ペプチド１およびペプチド２は、哺乳動物モデルＬＵＶＳからの最大色素放出を示し、低い（０．０６２５）ペプチド：脂質比でさえ約７０％の色素漏出を達成した（図１３Ｃ）。しかし、ペプチド３は、最も高い（０．５）ペプチド：脂質比でさえも有意な色素漏出（２０％未満）を示さなかった。これらの結果は、メリチン配列中のε－リシンによるＮ末端α－リシン（Ｌｙｓ７）の置換によって膜選択性が増大することを明らかに証明した。複数のε－リシン残基を有するペプチドの中で、ペプチド４は、ペプチド５および６よりも哺乳動物モデル膜との弱い相互作用を示した。
膜識別の機構への洞察を得るために、哺乳動物（ＰＣ／コレステロール）および微生物（ＰＥ：ＰＧ）細胞の細胞質膜を模倣する大きな単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を、使用した。メリチン、ペプチド１およびペプチド２は、負に荷電したＰＥ：ＰＧ ＬＵＶからの蛍光プローブの急速かつ濃度依存性の放出（９０％超）を示し、一方ペプチド３は、色素漏出の中程度の増加のみを示し、約４０％の色素放出を達成した（図１３Ａ）。ペプチド４～６は、しかしながら約７０％超の色素放出を示し、ペプチド５および６は、メリチンと類似の膜透過特性を示し、一方、より弱いものが、ペプチド４について観察された（図１３Ｂ）。より劇的な結果が、実験をＰＣ／コレステロールＬＵＶで実施した場合に観察された。メリチン、ペプチド１およびペプチド２は、哺乳動物モデルＬＵＶＳからの最大色素放出を示し、低い（０．０６２５）ペプチド：脂質比でさえ約７０％の色素漏出を達成した（図１３Ｃ）。しかし、ペプチド３は、最も高い（０．５）ペプチド：脂質比でさえも有意な色素漏出（２０％未満）を示さなかった。これらの結果は、メリチン配列中のε－リシンによるＮ末端α－リシン（Ｌｙｓ７）の置換によって膜選択性が増大することを明らかに証明した。複数のε－リシン残基を有するペプチドの中で、ペプチド４は、ペプチド５および６よりも哺乳動物モデル膜との弱い相互作用を示した。
【0134】
例１４：複数のε－リシル化によって孔形成特性が修正されるが、殺菌特性には影響しなかった
メリチンと比較して修飾ペプチドの孔形成能を識別するために、ＳＹＴＯＸグリーン（ＳＧ）取り込みアッセイを、ペプチドの曝露時に行い、それらの殺菌特性を決定した。ＳＧは、細胞膜の完全性が損なわれ、ＤＮＡ－ＳＧ複合体が蛍光強度の有意な増加を示す場合に、ゲノム核酸に結合する膜不透過性色素である。したがって、蛍光強度は、試験ペプチドによって引き起こされる細胞膜破壊の程度に比例すると考えられる。図２０Ａは、メリチンをＶＲＥ １００２株に添加した場合の代表的なＳＧ取り込み曲線を示す。１×および２×ＭＩＣ値でメリチンに曝露した細菌細胞の結果、破裂およびＳＧ取り込みの有意な増加がもたらされた（１×ＭＩＣで７９．２％および２×ＭＩＣで８９．７％）。しかしながら、同じ条件下でペプチド５およびペプチド６について、ＳＧ取り込みの減少が観察された（図２０Ｂ）。同様に、アシネトバクター・バウマンニ株に対して、メリチンは、２×ＭＩＣでペプチド５およびペプチド６ペプチドよりも高いＳＧ取り込みを示した（図２０Ｃ）。これらの結果は、ε－リシル化によってメリチンの孔形成特性が低下することを確認する。ＳＧ取り込み結果を細菌生存率アッセイと比較すると、しかしながら、明らかな相関は示されず、孔形成（すなわち、ＳＧ取り込み）および殺菌特性が共役していないことが示唆された（図２０Ｄ）。これらの結果は、修飾ペプチドはメリチンよりも孔形成特性が不良であるが、それらの細菌致死性はメリチンと類似していることを強調している。
メリチンと比較して修飾ペプチドの孔形成能を識別するために、ＳＹＴＯＸグリーン（ＳＧ）取り込みアッセイを、ペプチドの曝露時に行い、それらの殺菌特性を決定した。ＳＧは、細胞膜の完全性が損なわれ、ＤＮＡ－ＳＧ複合体が蛍光強度の有意な増加を示す場合に、ゲノム核酸に結合する膜不透過性色素である。したがって、蛍光強度は、試験ペプチドによって引き起こされる細胞膜破壊の程度に比例すると考えられる。図２０Ａは、メリチンをＶＲＥ １００２株に添加した場合の代表的なＳＧ取り込み曲線を示す。１×および２×ＭＩＣ値でメリチンに曝露した細菌細胞の結果、破裂およびＳＧ取り込みの有意な増加がもたらされた（１×ＭＩＣで７９．２％および２×ＭＩＣで８９．７％）。しかしながら、同じ条件下でペプチド５およびペプチド６について、ＳＧ取り込みの減少が観察された（図２０Ｂ）。同様に、アシネトバクター・バウマンニ株に対して、メリチンは、２×ＭＩＣでペプチド５およびペプチド６ペプチドよりも高いＳＧ取り込みを示した（図２０Ｃ）。これらの結果は、ε－リシル化によってメリチンの孔形成特性が低下することを確認する。ＳＧ取り込み結果を細菌生存率アッセイと比較すると、しかしながら、明らかな相関は示されず、孔形成（すなわち、ＳＧ取り込み）および殺菌特性が共役していないことが示唆された（図２０Ｄ）。これらの結果は、修飾ペプチドはメリチンよりも孔形成特性が不良であるが、それらの細菌致死性はメリチンと類似していることを強調している。
【0135】
実施例１５：マストパランペプチドの抗菌活性および細胞毒性
マストパランは、ハチ毒からの孔形成ペプチドのファミリーであり、それはまた、膜様環境において両親媒性らせん構造を形成した。本研究について、４つのリシン残基を含むマストパランＢ（ＭＢ、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬ）を調査し、各α－リシン残基がε－リシン残基で置換された４つの類似体（ＭＢ－１～ＭＢ－４）を合成した。様々なＶＲＥおよびＣＲＥに対するＭＩＣおよび細胞毒性を、決定した。結果は、両方の薬剤耐性株に対する抗菌活性の位置感受性変化を示した。ＶＲＥに対して、Ｎ末端α－リシンの置換によって、ＭＩＣ５０値が変化せず、一方Ｃ末端リシンを置き換えた結果、ＭＩＣ５０値の１６倍の増加がもたらされた（表７）。同様に、ＭＩＣ５０値の８～１６倍の増加が、ＣＲＥ株に対してＮ末端α－リシンをε－リシンに置換した際に観察された（表７）。ペプチドＭＢ３およびＭＢ４は、１４株および１１株に対してのみ明らかなＭＩＣ値を示し、他のＣＲＥについては２５６を超える値まで増加した。
マストパランは、ハチ毒からの孔形成ペプチドのファミリーであり、それはまた、膜様環境において両親媒性らせん構造を形成した。本研究について、４つのリシン残基を含むマストパランＢ（ＭＢ、ＬＫＬＫＳＩＶＳＷＡＫＫＶＬ）を調査し、各α－リシン残基がε－リシン残基で置換された４つの類似体（ＭＢ－１～ＭＢ－４）を合成した。様々なＶＲＥおよびＣＲＥに対するＭＩＣおよび細胞毒性を、決定した。結果は、両方の薬剤耐性株に対する抗菌活性の位置感受性変化を示した。ＶＲＥに対して、Ｎ末端α－リシンの置換によって、ＭＩＣ５０値が変化せず、一方Ｃ末端リシンを置き換えた結果、ＭＩＣ５０値の１６倍の増加がもたらされた（表７）。同様に、ＭＩＣ５０値の８～１６倍の増加が、ＣＲＥ株に対してＮ末端α－リシンをε－リシンに置換した際に観察された（表７）。ペプチドＭＢ３およびＭＢ４は、１４株および１１株に対してのみ明らかなＭＩＣ値を示し、他のＣＲＥについては２５６を超える値まで増加した。
【0136】
表７ バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）、アシネトバクター・バウマンニならびに他の薬剤耐性細菌および真菌に対するマストパランペプチドのＭＩＣ。使用した菌株の数を、括弧内に示す。ｎ．ｄ．は、決定せずを示す。ＭＩＣ値を、範囲で示す。ＭＩＣ５０は、５０％の菌株が感受性である濃度を示す。ε－リシル残基を、イタリック体で示し、下線を付す。
【0137】
【表7】
【0138】
ＭＴＳアッセイは、濃度が６２．５μｇ／ｍｌを超えたため、マストパランＢが初代ヒト線維芽細胞に対して細胞毒性であることを示した（図１４）。それぞれ２５０および１０００μｇ／ｍｌのペプチド濃度が、細胞毒性効果を付与するために、ＭＢ１およびＭＢ２／ＭＢ３に必要であった。ペプチドＭＢ４は、１０００μｇ／ｍでもいかなる細胞毒性作用をも示さなかった。抗菌アッセイと共に、これらの結果は、ε－リシン置換が、メリチンペプチドについて観察されたように、マストパランＢペプチドにおいて位置感受性であることを例証した。
【0139】
実施例１６：ＭＴＳアッセイによる細胞毒性を評価するためのプロトコル。
ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルプレート（２×１０３細胞／ウェル）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を、次に種々の濃度のポリマーまたはペプチド（６２．５μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ）で処理した。処理時間の終了時（２４時間後）に、２０または５０μｌのＭＴＳテトラゾリウム溶液を、９６ウェルまたは１２ウェルプレート中に添加し、３７℃で２時間さらにインキュベートした。その後、吸光度を、４９０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定し、相対的な細胞生存率を計算した。各処理を、２つの３回１組で実施し、報告した。
ヒト皮膚線維芽細胞を、９６ウェルプレート（２×１０３細胞／ウェル）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を、次に種々の濃度のポリマーまたはペプチド（６２．５μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ）で処理した。処理時間の終了時（２４時間後）に、２０または５０μｌのＭＴＳテトラゾリウム溶液を、９６ウェルまたは１２ウェルプレート中に添加し、３７℃で２時間さらにインキュベートした。その後、吸光度を、４９０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定し、相対的な細胞生存率を計算した。各処理を、２つの３回１組で実施し、報告した。
【0140】
実施例１７：カチオン性ペプチドおよびポリマーの細胞毒性の評価。
ペプチドおよびポリマーの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液細胞増殖アッセイキットを用い、製造元の取扱説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って決定した。このアッセイは、ミトコンドリア機能を、ＭＴＳ（（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム））を定量可能な青色の不溶性ホルマザン生成物に還元する生存細胞の能力を測定することによって評価する。ＨＤＦを、９６ウェルプレート（２×１０３個の細胞／ウェル）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を、次いでポリマー（ウェル中の最終濃度６２．５～２０００μｇ／ｍｌ）またはペプチド（ウェル中の最終濃度４～１０００μｇ／ｍｌ）の濃縮保存溶液で処理した。２４時間後、２０μＬのＭＴＳテトラゾリウム溶液を、９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２時間さらにインキュベートした。その後、吸光度を、４９０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定し、相対的細胞生存率を、未処理対照（１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）に相対させて算出した。各処理を、２つの３回１組で実施し、報告した。治療指数を計算するために、ＨＤＦの生存能の完全な喪失が観察されたペプチドまたはポリマー濃度を、ＭＩＣ値で除した。
ペプチドおよびポリマーの細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液細胞増殖アッセイキットを用い、製造元の取扱説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従って決定した。このアッセイは、ミトコンドリア機能を、ＭＴＳ（（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム））を定量可能な青色の不溶性ホルマザン生成物に還元する生存細胞の能力を測定することによって評価する。ＨＤＦを、９６ウェルプレート（２×１０３個の細胞／ウェル）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞を、次いでポリマー（ウェル中の最終濃度６２．５～２０００μｇ／ｍｌ）またはペプチド（ウェル中の最終濃度４～１０００μｇ／ｍｌ）の濃縮保存溶液で処理した。２４時間後、２０μＬのＭＴＳテトラゾリウム溶液を、９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２時間さらにインキュベートした。その後、吸光度を、４９０ｎｍにおいて、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定し、相対的細胞生存率を、未処理対照（１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．０）に相対させて算出した。各処理を、２つの３回１組で実施し、報告した。治療指数を計算するために、ＨＤＦの生存能の完全な喪失が観察されたペプチドまたはポリマー濃度を、ＭＩＣ値で除した。
【0141】
実施例１８：抗菌薬感受性試験。
ポリマー／抗生物質のＭＩＣを、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｋｏｒｅａ）で微量希釈法を用いて、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）文献Ｍ１００－Ｓ１８のガイドラインに従って決定した。簡単に、ポリマー（１～５１２μｇ／ｍｌ）または抗生物質を、適切な培地（細菌についてＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ，ＭＨＢ；酵母についてＳａｂａｒｏｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロスおよびフサリウム染色についてＲＰＭＩ緩衝液）に溶解し、この１００μｌを、次いで同じ培地中で等容量の微生物接種物（ＯＤ６００＝約０．０８）と混合し、密閉したインキュベーター中で振盪した。２４時間後（細菌について）または４８時間後（真菌について）に、ＭＩＣを、完全な阻害（視覚的観察およびＯＤ６００読み取り値による）が観察された濃度として決定した。ペプチドについては、ＭｉｌｌｉＱ水中の２×濃度のペプチド（２～２５６μｇ／ｍｌ）を、微生物接種物と混合し、ＭＩＣを、前述のように決定した。
ポリマー／抗生物質のＭＩＣを、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｋｏｒｅａ）で微量希釈法を用いて、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）文献Ｍ１００－Ｓ１８のガイドラインに従って決定した。簡単に、ポリマー（１～５１２μｇ／ｍｌ）または抗生物質を、適切な培地（細菌についてＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ，ＭＨＢ；酵母についてＳａｂａｒｏｕｄ’ｓ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロスおよびフサリウム染色についてＲＰＭＩ緩衝液）に溶解し、この１００μｌを、次いで同じ培地中で等容量の微生物接種物（ＯＤ６００＝約０．０８）と混合し、密閉したインキュベーター中で振盪した。２４時間後（細菌について）または４８時間後（真菌について）に、ＭＩＣを、完全な阻害（視覚的観察およびＯＤ６００読み取り値による）が観察された濃度として決定した。ペプチドについては、ＭｉｌｌｉＱ水中の２×濃度のペプチド（２～２５６μｇ／ｍｌ）を、微生物接種物と混合し、ＭＩＣを、前述のように決定した。
【0142】
実施例１９：治療指数。
ＭＴＳおよび抗菌薬アッセイから誘導された実験データを用いて、ＴＩ値を決定し、それは、完全な細胞毒性が最小発育阻止濃度に対して観察された最低濃度の比として定義される。ＴＩを計算した各株の平均値を、表４に報告した。
ＭＴＳおよび抗菌薬アッセイから誘導された実験データを用いて、ＴＩ値を決定し、それは、完全な細胞毒性が最小発育阻止濃度に対して観察された最低濃度の比として定義される。ＴＩを計算した各株の平均値を、表４に報告した。
【0143】
実施例２０：トリプシン中のペプチドの抗菌活性。
プロテアーゼの存在下でペプチドの抗菌活性を測定するために、１ｍｇ／ｍｌのＨＣ１およびＨＣ２を、トリプシン酵素：ペプチドの重量比１：１００）と共に３７℃で１時間インキュベートした。この後、この溶液の２０μｌアリコートを、１８０μｌの細菌接種物（緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７、ＭＨＢ中１０５ＣＦＵ／ｍｌ）と混合し、室温で６時間インキュベートした。懸濁液の１００μＬアリコートを、１０ｍＭのＰＢＳ溶液中で連続的に（１０倍）希釈し、ＭＨ寒天プレート上に注いでプレートにし、３７℃で４８時間インキュベートし、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を計数した。
プロテアーゼの存在下でペプチドの抗菌活性を測定するために、１ｍｇ／ｍｌのＨＣ１およびＨＣ２を、トリプシン酵素：ペプチドの重量比１：１００）と共に３７℃で１時間インキュベートした。この後、この溶液の２０μｌアリコートを、１８０μｌの細菌接種物（緑膿菌ＡＴＣＣ ９０２７、ＭＨＢ中１０５ＣＦＵ／ｍｌ）と混合し、室温で６時間インキュベートした。懸濁液の１００μＬアリコートを、１０ｍＭのＰＢＳ溶液中で連続的に（１０倍）希釈し、ＭＨ寒天プレート上に注いでプレートにし、３７℃で４８時間インキュベートし、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を計数した。
【0144】
実施例２１：過剰に荷電したペプチドの抗がん特性
過剰に荷電したペプチドを、それらの抗がん特性について、Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨＨ）およびＢ細胞リンパ腫（Ｌｙ－４およびＬｙ－１８）を含む様々な形態の皮膚リンパ腫を有する患者から誘導された細胞株を用いてスクリーニングした。これらのペプチドの相対的細胞毒性をまた、健常な一次末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞において評価した。細胞毒性を、ＭＴＳの代謝減少によるミトコンドリア機能として測定した。この目的のために、細胞を、４つの異なる濃度（６２．５、１２５、２５０または５００μｇ／ｍｌ）のペプチドで処理し；処理していない細胞を、対照として用いた。細胞生存率データは、すべての修飾したペプチドおよびεＰＬが、様々な程度の細胞死滅をリンパ腫細胞株において用量依存的方式で示すことを示した（図２２）。興味深いことに、ＰＢＬ Ｔ細胞は、リンパ腫細胞株と比較してこれらのペプチドに対する感受性が低かった。
過剰に荷電したペプチドを、それらの抗がん特性について、Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨＨ）およびＢ細胞リンパ腫（Ｌｙ－４およびＬｙ－１８）を含む様々な形態の皮膚リンパ腫を有する患者から誘導された細胞株を用いてスクリーニングした。これらのペプチドの相対的細胞毒性をまた、健常な一次末梢血リンパ球（ＰＢＬ）Ｔ細胞において評価した。細胞毒性を、ＭＴＳの代謝減少によるミトコンドリア機能として測定した。この目的のために、細胞を、４つの異なる濃度（６２．５、１２５、２５０または５００μｇ／ｍｌ）のペプチドで処理し；処理していない細胞を、対照として用いた。細胞生存率データは、すべての修飾したペプチドおよびεＰＬが、様々な程度の細胞死滅をリンパ腫細胞株において用量依存的方式で示すことを示した（図２２）。興味深いことに、ＰＢＬ Ｔ細胞は、リンパ腫細胞株と比較してこれらのペプチドに対する感受性が低かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【配列表】