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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-28
(45)【発行日】2023-03-08
(54)【発明の名称】疼痛治療のためのＡＮＧ（１－７）誘導体オリゴペプチド
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230301BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230301BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230301BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230301BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08 ZNA
A61P25/04
A61P19/02
A61P29/00 101
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019531939
(86)(22)【出願日】2018-01-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-05-21
(86)【国際出願番号】 US2018012893
(87)【国際公開番号】W WO2018129506
(87)【国際公開日】2018-07-12
【審査請求日】2021-01-12
(31)【優先権主張番号】15/401,944
(32)【優先日】2017-01-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】515358322
【氏名又は名称】アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ アリゾナ
(74)【代理人】
【識別番号】100073184
【弁理士】
【氏名又は名称】柳田 征史
(72)【発明者】
【氏名】ヘイ，メレディス
(72)【発明者】
【氏名】コニラス，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ポルト，ロビン エル
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンデラ，トッド
(72)【発明者】
【氏名】フォルテ，ブリタニー
(72)【発明者】
【氏名】ミルンズ，タリー
(72)【発明者】
【氏名】ジョーンズ，エヴァン
(72)【発明者】
【氏名】ザボー，ラヨシュ
【審査官】大島 彰公
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０１４３４２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１０／００９５２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０８７５９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における疼痛状態を治療するための医薬組成物であって、オリゴペプチド誘導体を含有し、前記オリゴペプチド誘導体を構成するオリゴペプチドがＰＮ－Ａ５（Ａｎｇ１－６－Ｓｅｒ（ＯＧｌｃ）－ＮＨ２；配列番号１３）であり、
前記疼痛状態が、急性炎症性疼痛であり、
投与される前記ＰＮ－Ａ５が、１～３ｍｇ／ｋｇである、医薬組成物。
【請求項2】
前記オリゴペプチドが少なくとも１個のＤ－アミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
各々のアミノ酸がＤ－アミノ酸である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、２０１７年１月９日に出願された米国特許出願第１５／４０１，９４４の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、ＡＮＧ（１－７）及び関連する誘導体オリゴペプチドのようなオリゴペプチド、ならびに様々な病因の疼痛の治療のためにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
骨痛は、後期転移性がん患者の７５～９０％が経験している。転移性がん誘発性骨痛（ＣＩＢＰ）は頻繁に報告されているが、管理は不十分である。世界保健機関は、がんが進行するにつれて軽度から強度までのオピオイドを推奨する、３段階除痛ラダーをがん性疼痛に対して実施した。それにもかかわらず、中等度から重度のがん性疼痛は、現在の鎮痛治療を受けている多くの患者において適切に管理されていない。処方されたオピオイドの流用が中毒の流行をもたらしているが、オピオイド療法はそれらの失敗に寄与する多くの課題となる副作用と関連している。最近の報告は、オピオイドがヒト及び実験動物モデルにおける骨量減少を悪化させる可能性があることを示唆しており、オピオイド療法が抗溶骨併用治療及びＣＩＢＰ管理にとって逆効果である可能性があることを示している。さらに、長期のオピオイド療法は、特定のがんの増殖／遊走を増加させる可能性がある。
【0004】
ＣＩＢＰの前臨床モデリングは、この複雑な疾患状態を促進するメカニズムを明らかにし、そして有望な治療標的の同定をもたらした。骨は交感神経線維と侵害受容神経線維の両方によって神経支配されているが、多くのヒトの骨の腫瘍は腫瘍自体及び隣接する末梢骨に検出可能な神経線維を欠いている。ＣＩＢＰに関連する侵害受容シグナル伝達に対して貢献するものには、酸性腫瘍環境、ならびに腫瘍及び腫瘍関連細胞からの増殖因子、サイトカイン、及びケモカインの分泌、ならびに局所環境における神経発芽の増強が含まれる。
【0005】
骨は、交感神経線維と侵害受容神経線維の両方によって神経支配されている。しかしながら、多くのヒト骨腫瘍は腫瘍自体及び隣接する末梢骨に検出可能な神経線維を欠いている。ＣＩＢＰに関連する侵害受容シグナル伝達に対して貢献するものには、酸性腫瘍環境、ならびに腫瘍及び腫瘍関連細胞からの増殖因子、サイトカイン、及びケモカインの分泌、ならびに局所環境における神経発芽の増強が含まれる。したがって、がん誘発性骨痛を含む疼痛の治療のための非オピオイド鎮痛薬を開発する必要性が存在する。
【0006】
本発明は、Ｍａｓ受容体に対して親和性及びアゴニスト効果を有する天然のＡｎｇ（１－７）、関連誘導体ポリペプチド、及び／または非ペプチドアゴニストが、様々な生物学的、生理学的、及び病理学的パラメーターを改善するという発見に基づく。具体的には、Ｍａｓ受容体活性化は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、がん誘発性骨痛を含む様々な病因の疼痛、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の神経学的後遺症によって引き起こされる空間記憶障害及び物体認識障害を軽減することが示される。
【発明の概要】
【0007】
本発明のいくつかの態様は、非天然のアンジオテンシン－（１－７）誘導体ポリペプチド、すなわち「Ａｎｇ－（１－７）誘導体」である、オリゴペプチドを提供する。本発明のオリゴペプチドは、Ａｎｇ－（１－７）よりも長いインビボ半減期及び／または増加した血液脳関門透過を有し得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、７または８個のアミノ酸を有し、Ｍａｓ受容体のアゴニストとしての生物活性を有する。
【0008】
本発明の一つの特定の態様は、式：Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８（配列番号１）のオリゴペプチド誘導体であって、式中、Ａ１が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ２が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ３が、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群より選択され；Ａ４が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ５が、イソロイシン、バリン、アラニン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ６が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ７が、プロリン、グリシン、セリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；Ａ８は存在しても不在でもよく、Ａ８が存在するとき、Ａ８が、セリン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され、但し、（ｉ）Ａ１～Ａ８のうちの少なくとも１個が、任意選択で、一糖または二糖で置換されているか；または（ｉｉ）Ａ８が不在であるとき、：（ａ）Ａ１～Ａ７のうちの少なくとも１個が、一糖または二糖で置換されているか、（ｂ）Ａ７はアミノ基で終端しているか、もしくは（ｃ）それらの組み合わせであるという条件である、オリゴペプチド誘導体を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態では、糖は、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコース、ラムノース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、Ａ８は、セリンもしくはそのグリコシル化形態であるか、またはＡ８は不在であり、かつＡ７がセリンもしくはそのグリコシル化形態である。いくつかの実施形態ではＣ末端のアミノ酸のみがグリコシル化されている（例えば、Ａ８、またはＡ８が不在のときのＡ７）。
【0010】
さらに他の実施形態では、（ｉ）Ａ８がアミノ基で終端しているか、または（ｉｉ）Ａ８が不在のとき、Ａ７がアミノ基で終端している。これらの実施形態内では、いくつかの場合に、（ｉ）Ａ８は、任意選択でグリコシル化（例えば、グルコースまたはラクトースによって）されているセリンであるか；または（ｉｉ）Ａ８が不在のとき、Ａ７が任意選択でグリコシル化（例えば、グルコースまたはラクトースによって）されているセリンである。さらに他の場合では、Ａ８が不在のとき、Ａ７がグルコースでグリコシル化されているセリンである。後者の場合、いくつかの場合では、Ａ７はアミノ基で終端している。いくつかの実施形態では、Ａｎｇ（１－７）誘導体がアミノ基で終端しているかどうかにかかわらず、Ｃ末端アミノ酸（Ａ８、またはＡ８が不在のときのＡ７）は、グリコシル化アミノ酸のみである。
【0011】
さらに他の実施形態では、Ａ１はアスパラギン酸であり；Ａ２はアルギニンであり；Ａ３はバリンであり；Ａ４はチロシンであり；Ａ５はイソロイシンであり；Ａ６はヒスチジンであり；（ｉ）Ａ８が不在であり、かつＡ７がアミノ基で終端しているか、もしくはＡ７がグリコシル化セリンであり、または（ｉｉ）Ａ８がアミノ基で終端しているセリンである。これらの実施形態内で、いくつかの場合には、Ａ８はグリコシル化セリンである。さらに他の場合では、Ａ８が不在であり、かつＡ７が、アミノ基で終端しているグリコシル化セリンである。
【0012】
本発明の別の態様は、８個以下のアミノ酸、典型的には７個または８個のアミノ酸（例えば、アミノ酸残基）のグリコシル化Ａｎｇ－（１－７）誘導体を提供する。いくつかの実施形態では、グリコシル化Ａｎｇ－（１－７）誘導体は、キシロース、フコース、ラムノース、グルコース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、またはそれらの組み合わせによってグリコシル化されている。さらに他の実施形態では、上記グリコシル化Ａｎｇ－（１－７）誘導体のカルボン酸末端はアミノ基で置換されている。
【0013】
本発明の他の態様は、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを投与することにより、対象における認知機能障害及び／または機能障害を治療する方法を提供する。一般に、本発明のオリゴペプチドは、Ａｎｇ－（１－７）で治療することができるあらゆる臨床状態を治療するために使用することができる。
【0014】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、任意の病因の疼痛（すなわち、疼痛状態）を治療（すなわち、軽減または排除）するために使用され得る。治療に適した特定の疼痛症候群及び疼痛状態には、例えば、急性疼痛（例えば、外傷による疼痛）、歯痛（例えば、抜歯または他の歯科処置の後）、原発性腫瘍または転移性腫瘍のいずれかに起因するがん誘発性骨痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、炎症性疼痛、脳卒中による疼痛、外傷性神経因性疼痛、多発性硬化症による疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、及び複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）が含まれる。本発明のオリゴペプチドはまた、ＨＩＶ誘導性ニューロパチー、糖尿病性ニューロパチー、及び化学療法的ニューロパチーに関連する疼痛ならびに他の症状及び症状を治療するために使用され得る。
【0015】
他の実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、一般に認知機能障害の１つ以上の症状、ならびに、例えば、注意力の低下、記憶喪失、精神運動性遅延、及び実行機能の低下を含む、認知機能障害及び認知症への血管の寄与（「ＶＣＩＤ」）によって引き起こされるかまたはそれに関連する症状を軽減または排除するために使用できる。認知障害及び／またはＶＣＩＤに関連し、本発明のオリゴペプチドを使用した治療に適した特定の症状には、例えば、うっ血性心不全、心血管疾患、高血圧、脳卒中、術後の認知障害及び／または欠乏症によって引き起こされるかまたはそれらに関連する認知障害、加齢性認知症を含む認知症、血管性認知症、アルツハイマー病、脳震盪及び貫通性脳損傷を含む外傷性脳損傷が含まれる。
【0016】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、少なくとも約０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０、１５、２０、２５、３０、または４０ｍｇ／ｋｇを含む投与量で投与される。オリゴペプチドは、所望の臨床成績を得るために必要に応じて、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、またはそれ以上投与され得る。オリゴペプチドは経口的にまたは注射（静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳室内、もしくは髄腔内）、または吸入によって投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】培養中のヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を活性化する本発明のオリゴペプチドのうちのいくつか及び天然のＡｎｇ－（１－７）を示すグラフである。
【図2】天然のＡｎｇ－（１－７）、ならびに本発明のオリゴペプチドＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、及びＰＮ－Ａ５についてのＮＯ産生アッセイの結果を示すグラフである。
【図3A】選択されたＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９が、本発明のオリゴペプチドＰＮ－Ａ５によって誘導されるＮＯ産生を阻止することを示すグラフである。
【図3B】オリゴペプチドＰＮ－Ａ５によって誘導されるＮＯ産生に対する選択されたＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による平均化した効果を示すグラフである。
【図4】心不全によって引き起こされる物体認識記憶障害に対する、オリゴペプチドＰＮ－Ａ５の効果を示すグラフである。
【図5】心不全によって引き起こされる空間記憶障害に対する、オリゴペプチドＰＮ－Ａ５の効果を示すグラフである。
【図6A】オリゴペプチドＰＮ－Ａ５がＣＩＢＰの自発疼痛を急速に軽減することを示すグラフである。
【図6B】ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメントを使用した触覚異痛試験の結果を示すグラフである。
【図7A】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢上げ（ｇｕａｒｄｉｎｇ））を示すグラフである。
【図7B】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢上げ）を示すグラフである。
【図7C】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢振り（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ））を示すグラフである。
【図7D】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢振り）を示すグラフである。
【図7E】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢上げ）を示すグラフである。
【図7F】単回投与治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢振り）を示すグラフである。
【図8A】慢性治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢上げ）を示すグラフである。
【図8B】慢性治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢振り）を示すグラフである。
【図8C】慢性治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢上げ）を示すグラフである。
【図8D】慢性治療レジメン及びＭａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９による阻止の下で、乳癌細胞株の骨内骨髄移植を受けたマウスの疼痛反応（肢振り）を示すグラフである。
【図9A】Ａｎｇ－（１－７）またはＡＴ１もしくはＡＴ２受容体のアンタゴニストのいずれかを使用した、慢性治療レジメン下での乳癌細胞株の髄内移植を有するマウスの疼痛反応を示すグラフである。
【図9B】Ａｎｇ－（１－７）またはＡＴ１もしくはＡＴ２受容体のアンタゴニストのいずれかを使用した、慢性治療レジメン下での乳癌細胞株の髄内移植を有するマウスの疼痛反応を示すグラフである。
【図9C】Ａｎｇ－（１－７）またはＡＴ１もしくはＡＴ２受容体のアンタゴニストのいずれかを使用した、慢性治療レジメン下での乳癌細胞株の髄内移植を有するマウスの疼痛反応を示すグラフである。
【図9D】Ａｎｇ－（１－７）またはＡＴ１もしくはＡＴ２受容体のアンタゴニストのいずれかを使用した、慢性治療レジメン下での乳癌細胞株の髄内移植を有するマウスの疼痛反応を示すグラフである。
【図10A】治療レジメンの下で骨癌を有するかまたは有さない実験用マウスの営巣行動を示すグラフである。
【図10B】治療レジメンの下で骨癌を有するかまたは有さない実験用マウスの営巣行動を示すグラフである。
【図11A】実験動物における侵害受容繊維の後根神経節におけるＭａｓ受容体の発現を示すウェスタンブロットである。
【図11B】実験動物における同側及び対側の後根神経節間のＭａｓ受容体の相対的発現を示す棒グラフである。
【図11C】実験動物の大腿滲出液におけるＭａｓ受容体の発現を示すウェスタンブロットである。
【図11D】実験動物における同側及び対側の大腿滲出液間のＭａｓ受容体の相対的発現を示す棒グラフである。
【図12A】様々な治療レジメン後の実験動物の大腿骨の一連の顕微鏡写真である。
【図12B】実験動物の大腿骨における腫瘍組織の定量化を示す棒グラフである。
【図13A】実験動物で撮影した一連のレントゲン写真である。
【図13B】実験動物における骨病変スコアを定量化するグラフである。
【図13C】実験動物における骨の完全性の尺度としてのカルボキシ末端コラーゲン架橋の量を示す棒グラフである。
【図14A】カラギーナン誘発疼痛の急性／炎症モデルにおけるＰＮ－Ａ５の抗侵害受容効果を示すグラフである。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメント試験からの生閾値データを示す折れ線グラフである。
【図15A】天然のＡｎｇ（１－７）の立体構造のモデルである。
【図15B】様々なグリコシル化Ａｎｇ（１－７）誘導体の計算モデルである。
【図16】天然のＡｎｇ（１－７）及び種々の誘導体のインビトロ血清半減期を示す折れ線グラフである。
【図17A】天然のＡｎｇ（１－７）及びＰＮ－Ａ５の血清中濃度を示す折れ線グラフである。
【図17B】天然のＡｎｇ（１－７）及びＰＮ－Ａ５のＣＳＦ濃度を示す折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
【0019】
「天然のＡｎｇ－（１－７）」という用語は、アミノ酸配列Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ（配列番号２）を有する、天然に存在するＡｎｇ（１－７）ポリペプチドを指す。
【0020】
「Ａｎｇ－（１－７）誘導体」という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、修飾されているか、または対応する天然のＡｎｇ－（１－７）のアミノ酸残基とは異なるかのいずれかである、オリゴペプチドを指す。「Ａｎｇ－（１－７）誘導体」という用語はまた、以下により詳細に論じられるように、８アミノ酸残基のオリゴペプチドをも含む。
【0021】
「ＰＮ－Ａ２」とは、Ｐｒｏ７がＣ末端アミド化（ＮＨ２）を含むことを除いて、天然のＡｎｇ（１－７）のアミノ酸配列を有する、配列番号３のＡｎｇ（１－７）誘導体を意味する。
【0022】
「ＰＮ－Ａ３」とは、Ｃ末端にセリンの付加（すなわち、Ｓｅｒ８）を有し、Ｓｅｒ８がグリコシル化され、Ｃ末端アミド化（ＮＨ２）を含む、天然のＡｎｇ（１－７）のアミノ酸配列を有する、配列番号９のＡｎｇ（１－７）誘導体を意味する。
【0023】
「ＰＮ－Ａ４」とは、Ｃ末端にセリンの付加（すなわち、Ｓｅｒ８）を有し、Ｓｅｒ８がラクトシル化され、Ｃ末端アミド化（ＮＨ２）を含む、天然のＡｎｇ（１－７）のアミノ酸配列を有する、配列番号９のＡｎｇ（１－７）誘導体を意味する。
【0024】
「ＰＮ－Ａ５」とは、Ｐｒｏ７がＳｅｒ７で置換され、Ｓｅｒ７がグリコシル化され、Ｃ末端アミド化（ＮＨ２）を含むことを除いて、天然のＡｎｇ（１－７）のアミノ酸配列を有する、配列番号１３のＡｎｇ（１－７）誘導体を意味する。
【0025】
「ＰＮ－Ａ６」とは、Ｐｒｏ７がＳｅｒ７で置換され、Ｓｅｒ７がラクトシル化され、Ｃ末端アミド化（ＮＨ２）を含むことを除いて、天然のＡｎｇ（１－７）のアミノ酸配列を有する、配列番号１３のＡｎｇ（１－７）誘導体を意味する。
【0026】
「糖」という用語は、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎのペントース及びヘキソースを意味し、式中、ｎはペントースでは５、ヘキソースでは６である。糖は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類（例えば、３～２０個、典型的には３～１０個、多くの場合、３～５個の単量体糖類が一緒に結合している）、または多糖類（例えば２０個を超える単量体糖単位）であり得る。さらに多くの場合、糖という用語は、単糖類及び／または二糖類を指す。しかしながら、本発明の範囲は単糖類または二糖類に限定されないことを理解されたい。多くの場合、「糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）」と「糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【0027】
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用されるとき、「オリゴペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を含むが、典型的には、約１５個以下、多くの場合、１０個以下、さらにより多くの場合、８個以下、もっとも多くの場合、７個以下のアミノ酸鎖を含むと理解されるべきである。
【0028】
Ａｎｇ－（１－７）のアミノ酸のうちの１つまたは複数を「等価アミノ酸」と置き換えることができ、例えば、Ｌ（ロイシン）を、イソロイシンまたは他のアラニン、バリン、メチオニンなどの疎水性側鎖アミノ酸と置き換えることができ、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸を、他の極性非荷電側鎖アミノ酸と置き換えることができることを理解されたい。Ａｎｇ－（１－７）は７個のアミノ酸を含むが、いくつかの実施形態において、本発明のオリゴペプチドは、８個以下のアミノ酸を有する。
【0029】
「グリコシル化」とは、単糖、二糖、または多糖のそのアミノ酸への共有結合を意味する。グリコシル化は、必要に応じて、Ｎ結合型またはＯ結合型であり得る。例えば、Ｎ結合型グリコシル化は、アスパラギンまたはアルギニン中のＲ基窒素で起こり得、そしてＯ結合型グリコシル化はセリン、トレオニン、及びチロシンのＲ基ヒドロキシルを通じて起こり得る。適切な糖には、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、マンノース、フコース、及びラムノースなどの単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、メリビオース、セロビオースなどの二糖類、ソルビトール、マンニトール、マルトデキストリン、及びファリノースなどの高次構造、ならびにガラクトサミン及びグルコサミンなどのアミノ糖が含まれる。いくつかの特定の実施形態では、ポリペプチドは、グルコース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－ラクトース、β－Ｄ－セロビオース、またはβ－Ｄ－メリビオースでグリコシル化されている。
【0030】
Ａｎｇ－（１－７）誘導体の任意の修飾（例えば、糖修飾）を指す「それらの組み合わせ」という用語は、個々のアミノ酸のうち２、３、４、５、６、７、または８個が糖の結合によって修飾されているオリゴペプチドを指す。複数の糖修飾を有するＡｎｇ－（１－７）誘導体について、修飾糖はすべての修飾アミノ酸で同一であってもよく、またはいくつかの修飾アミノ酸は異なる糖の混合物を含んでもよい。
【0031】
「治療有効量」とは、哺乳動物に投与するときに、疾患を治療するのに適切な間隔で十分な期間にわたって、その疾患に対してそのような治療をもたらすのに十分である化合物の量を意味する。「治療有効量」は、化合物、疾患及びその重症度、年齢、体重、及び体格指数を含むがこれらに限定されない個体に特有の生理学的因子、単位用量、累積用量、頻度、期間、ならびに選択される投与経路に応じて変動するであろう。
【0032】
「予防する」は、疾患、障害、及び／または状態の発生に関連して使用されるとき、対象が発症する危険性がある疾患、障害、及び／または状態を発症するリスクを低減することを指す。
【0033】
「治療する」とは、その疾患または障害を有すると診断された対象における特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または特徴の重症度を、部分的または完全に、緩和、改善、軽減、抑制、予防、軽減するために使用される任意の方法を指す。
【0034】
数に関して「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、一般に、特段他が明記されていない限り、または文脈から他が明らかな場合を除いて（このような数が０％未満または可能な値の１００％を超える場合を除く）、数のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）で５％、１０％、１５％、または２０％の範囲内にある数を含むと解釈される。
【0035】
「対象」または「患者」という用語は、例えば実験の、診断の、及び／または治療の目的のために本発明の組成物を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）が含まれる。
【0036】
「投与レジメン」とは、典型的には期間によって分けられる、対象に個々に投与される一組の単位用量（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上）を意味する。いくつかの実施形態では、投与レジメンは、それぞれが期間によって互いに分けられている１つまたは複数の用量を含む。個々の用量を分けている期間は、固定または可変期間を有してもよく、または治療薬は必要に応じて投与されてもよい。投与レジメンは、１日間、複数日間、数週間、数ヶ月間にわたるか、または対象の生涯にわたって投与され得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、もしくは２８日間、または１、２、３、４、５、６、９、もしくは１２か月間以上）。いくつかの実施形態では、治療薬は、１日１回（ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）、またはより少ない頻度（すなわち、２日もしくは３日ごと、毎週１回、または毎月１回））で投与される。
【0037】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。
【0038】
本発明のオリゴペプチド：
【0039】
血圧調節及び体液恒常性における役割についてよく知られているレニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）は、最近、炎症、血管形成、腫瘍細胞増殖、及び遊走を含む転移性骨疾患に関与すると考えられている。アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）による切断によるＲＡＳの主要な最終生成物である。このノナペプチドは、２つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、すなわちアンジオテンシンＩＩ受容体１型（ＡＴ１）及び２型（ＡＴ２）に結合してそれらを活性化する。血管収縮、炎症、線維症、細胞の増殖／遊走、体液貯留などの生理作用がＡＴ１とＡＴ２について報告されている。ＡｎｇＩＩはＡＣＥ２によって切断されて、生物学的に活性であるヘプタペプチドであるアンジオテンシン－（１－７）（Ａｎｇ－（１－７））を生じる。ＡｎｇＩＩとは対照的に、Ａｎｇ－（１－７）は、ＡＴ１及びＡＴ２受容体に対して６０～１００倍高い選択性でＧＰＣＲであるＭａｓ受容体に結合する（ＭａｓＲ；Ｋｄ＝０．８３ｎＭ）。ＭａｓＲの活性化は、抗炎症活性及び抗うつ活性を有することを含むＡｎｇＩＩ／ＡＴ１／ＡＴ２軸の作用とは反対の作用を発揮する。
【0040】
本発明のいくつかの態様は、Ａｎｇ－（１－７）の誘導体であるオリゴペプチドを提供する。上述のように、Ａｎｇ－（１－７）の「誘導体」という用語は、Ａｎｇ－（１－７）のいずれか１つ以上のアミノ酸配列が、修飾されている（例えば、メチル化、プロリン上のヒドロキシ基などの官能基の存在）、糖に結合している、対応するＤ－アミノ酸、または上に定義されるような「等価アミノ酸」と置き換えられているか、及び／または、Ａｎｇ－（１－７）の末端アミノ基末端またはカルボキシル末端は修飾されており、例えば、カルボン酸末端はアミド、アミン、チオール、またはアルコール官能基に修飾することができるか、または天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して追加のアミノ酸残基が存在する、オリゴペプチドを指す。「Ａｎｇ－（１－７）誘導体」という用語は、天然のＡｎｇ－（１－７）、すなわち、修飾を全く有さない内在性Ａｎｇ－（１－７）のアミノ酸配列を除外することを理解されたい。
【0041】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、カルボン酸末端のアミノ基（すなわち、カルボン酸の－ＯＨ基が、－ＮＲａＲｂで置き換えられ、式中、Ｒａ及びＲｂの各々が、独立して水素またはＣ１～Ｃ６アルキルである）を有し、及び／または、（ｉ）対応するＤ－アミノ酸と置き換えられているか、（ｉｉ）グリコシル化されているか、（ｉｉｉ）別のアミノ酸と置き換えられているか、または（ｉｖ）それらの組み合わせである、１つ以上のアミノ酸残基を有する。
【0042】
一つの特定の実施形態では、本発明のオリゴペプチドは、式：Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８（配列番号１）のＡｎｇ－（１－７）誘導体であって、式中、Ａ１が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ２が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ３が、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びそれらの誘導体からなる群より選択され；Ａ４が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ５が、イソロイシン、バリン、アラニン、ロイシン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ６が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ７が、プロリン、グリシン、セリン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され；Ａ８は存在しても不在でもよく、Ａ８が存在するとき、Ａ８が、セリン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、及びそれらの誘導体からなる群から選択され、但し、（ｉ）Ａ１～Ａ８のうちの少なくとも１個が、任意選択で、一糖または二糖で置換されているか；または（ｉｉ）Ａ８が不在であるとき、：（ａ）Ａ１～Ａ７のうちの少なくとも１個が、一糖または二糖で置換されているか、（ｂ）Ａ７はアミノ基で終端しているか、もしくは（ｃ）それらの組み合わせであるという条件である。
【0043】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、オリゴペプチドのアミノ末端であり、Ａ８（または、Ａ８が不在のときにはＡ７）は、カルボキシル末端である。さらに他の実施形態では、Ａ１は、カルボキシル末端であり、Ａ８（または、Ａ８が不在のときにはＡ７）は、アミノ末端である。さらに他の実施形態では、カルボキシル末端のカルボン酸官能基は、アミド官能基、アミン官能基、ヒドロキシル官能基、またはチオール官能基として修飾されている。アミド官能基及びアミン官能基は、非アルキレート、モノアルキル化、またはジアルキル化とすることができる。
【0044】
さらに他の実施形態では、糖は、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコース、ラムノース、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、糖は一糖であり、他の例では糖は二糖である。
【0045】
他の実施形態では、Ａ１～Ａ８のうちの少なくとも１つは、一糖で置換されている。さらに他の実施形態では、Ａ１～Ａ８のうちの少なくとも１つは、二糖で置換されている。当然のことながら、本発明の範囲は、一糖と二糖との両方を有するオリゴペプチドも含む。
【0046】
本発明のオリゴペプチドにおいて使用され得る例示的な二糖には、ラクトース、セロビオース、メリビオース、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、本発明の範囲は当業者に公知の任意の二糖で置換されているオリゴペプチドを含むことを理解すべきである。
【0047】
一つの特定の実施形態では、Ａ８は、セリンまたはその誘導体である。いくつかの例では、セリンのカルボン酸部分はアミドまたはアミンとして修飾されている。一つの例では、セリンはアミノ基で終端している。さらに他の実施形態では、Ａ８のセリン残基は、グルコースまたはラクトースによってグリコシル化されている。
【0048】
さらに他の実施形態では、Ａ１～Ａ８のうちの、少なくとも１個が、典型的には少なくとも２個が、一般には少なくとも３個が、多くの場合には少なくとも４個が、さらにより多くの場合には少なくとも５個が、なおもさらにより多くの場合には少なくとも６個が、もっとも多くの場合には全てがＤ－アミノ酸である。
【0049】
本発明の別の態様は、８個以下のアミノ酸、典型的には７個または８個のアミノ酸残基を有する、Ａｎｇ－（１－７）誘導体のようなオリゴペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、１個以上のアミノ酸に糖群が結合している。多くの場合、糖群はグリコシル化を介してオリゴペプチドに結合している。糖は、アミノ酸の側鎖官能基またはアミド基のいずれかを介してオリゴペプチドに結合することができる。したがって、本発明の範囲には、Ｏ－グリコシレート、Ｎ－グリコシレート、Ｓ－グリコシル化オリゴペプチドが含まれるが、これらに限定されない。「Ｘ－グリコシル化」という用語は、アミノ酸のヘテロ原子「Ｘ」を介してオリゴペプチドに結合した糖を有することを指す。例えば、側鎖官能基がヒドロキシルであるセリンの場合、「Ｏ－グリコシル化」は、糖がセリンの側鎖官能基、すなわちヒドロキシル基に結合していることを意味する。同様に、ロイシンの「Ｎ－グリコシル化」は、ロイシンのアミノ側鎖官能基に糖が結合していることを指す。典型的には、グリコシル化はアミノ酸の側鎖官能基上にある。
【0050】
いくつかの実施形態では、Ａｎｇ－（１－７）誘導体は、キシロース、フコース、ラムノース、グルコース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、またはそれらの組み合わせによってグリコシル化されている。
【0051】
さらに他の実施形態では、上記グリコシル化Ａｎｇ－（１－７）誘導体のカルボン酸末端はアミノ基で置換されている。カルボン酸末端がアミノ基で置換されていることを指すとき、それはカルボン酸の－ＯＨ基が－ＮＨ２基で置き換えられていることを意味する。したがって、実際の末端官能基はアミドであり、すなわち、オリゴペプチドをカルボン酸末端において官能基－ＣＯ２Ｈで終端するのではなく、カルボン酸末端をアミド基（すなわち－ＣＯ２ＮＲ’２、式中、各々のＲ’は独立して水素またはＣ１～Ｃ１２アルキルである）で終端している。さらに他の実施形態では、カルボン酸末端基はヒドロキシル基またはチオール基で終端する。いくつかの実施形態では、修飾カルボン酸末端基は、例えばグリコシル化を介して糖を結合するために使用される。
【0052】
本発明の目的の１つは、作用の有効性、インビボでの安定化、及び／または血液脳関門の透過を増強するためにＡｎｇ－（１－７）誘導体を産生することであった。血液脳関門の透過が改善されることにより、本発明のＡｎｇ－（１－７）誘導体の脳への進入が促進され、その結果、Ｍａｓ活性化または固有の有効性が促進される。血液脳関門の透過を改善する（すなわち増加させる）ために、いくつかの実施形態では、Ａｎｇ－（１－７）誘導体は少なくとも１つの一糖または二糖に結合している。
【0053】
いかなる理論にも拘束されることなく、グリコシル化されている本発明のオリゴペプチドは、折り畳まれたＡｎｇ－（１－７）糖ペプチド（すなわち、本発明のグリコシル化オリゴペプチド）の固有の両親媒性及び「ｂｉｏｕｓｉａｎアプローチ」を利用して、血液脳関門を越えて本発明のグリコシル化オリゴペプチドを送達すると考えられる。いくつかの例において、本発明のオリゴペプチドによる血液脳関門の通過の増加量は、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して少なくとも６％、典型的には少なくとも１０％、そして多くの場合には少なくとも１５％である。場合によっては、脳脊髄液中の本発明のオリゴペプチドについてのＣｍａｘの増加量は、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して２～１０倍、３～８倍、または５～８倍である。いくつかの例において、脳脊髄液中の本発明のオリゴペプチドについてのＣｍａｘの増加量は、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍である。他の例において、本発明のオリゴペプチドは、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも６０分、または少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、または少なくとも６時間のインビボ半減期を有する。いくつかの例において、本発明のオリゴペプチドについてのインビボ半減期の増加量は、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して、２～３０倍、３～２５倍、４～２０倍、４～１０倍、１０～２５倍、１５～２５倍、または２０～２５倍である。代替的に、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較して、本発明のオリゴペプチドは、インビボ半減期において少なくとも５０倍、典型的には少なくとも７５倍、そして多くの場合には少なくとも１００倍の増加を示す。
【0054】
他の実施形態では、本発明のオリゴペプチドは増強した血管効果を示す。いかなる理論にも拘束されることなく、血液脳関門輸送は、脳毛細血管の内皮の血液側での吸収性エンドサイトーシスプロセスとそれに続く脳側でのエキソサイトーシスによって起こり、全体的なトランスサイトーシスをもたらすと一般に認識されている。このプロセスが効率的であるためには、オリゴペプチドはある期間、膜に結合する必要があり、そしてまたある期間水性状態で存在する必要がある（ｂｉｏｕｓｉａｎの性質）と考えられている。本発明者のうちの一人による以前の研究に基づいて、効果的な薬物送達及び血液脳関門輸送は、少なくとも２つの状態：（１）エンドサイトーシスを許容または促進する１つ以上の膜結合立体構造によって規定される状態；及び（２）水溶性によって規定される状態、または「膜ホッピング（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｏｐｐｉｎｇ）」やおそらくは血管効果を可能にするランダムコイル状態、を有するｂｉｏｕｓｉａｎ糖ペプチドを必要とすると考えられる。
【0055】
一般に、グリコシル化の程度は個々の微小状態の構造に大きな影響を及ぼさない。したがって、グリコシル化の程度を変えることにより、オリゴペプチドの全体的な構造に顕著な影響を及ぼすことなく、水性状態対膜結合状態の集団密度を調節することが可能になる。さらに、グリコシル化はペプチダーゼに対する安定性も促進し、それによってインビボでのＡｎｇ－（１－７）誘導体の半減期を増加させると考えられている。
【0056】
表１は、いくつかの特に有用なＡｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドを記載するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【表1】
【0057】
いくつかの実施形態ではＣ末端のアミノ酸のみがグリコシル化されている（すなわち、Ｘａａ８、またはＸａａ８が不在のときのＸａａ７）。いくつかの実施形態では、Ａｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドは、グルコース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－ラクトース、β－Ｄ－セロビオース、またはβ－Ｄ－メリビオースでグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは（例えば、セリンのＲ基上に）Ｏ結合型グリコシル化を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端セリンはグリコシル化されている。
【0058】
いくつかの実施形態では、非天然のアミノ酸及び／またはアミノ酸置換物（例えば、ジカルボン酸）は、例えば、表１のＡｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドのものを含む、Ａｎｇ（１－７）及びＡｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドのいずれかにおける天然アミノ酸を置換し得る。例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、Ｃ－α－メチルアミノ酸、β－アミノ酸、及びβ－メチルアミノ酸。本発明において有用なアミノ酸類似体には、β－アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４－アミノ酪酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２－アミノイソ酪酸、６－アミノヘキサン酸、ｔ－ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、及び他の非従来型アミノ酸が含まれ得るが、これらには限定されない。例えば、
Ｘａａ１は、Ａｃｐｃ（１－アミノシクロペンタンカルボン酸）、Ｍｅ２Ｇｌｙ（Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン）、Ｂｅｔ（ベタイン、ｌ－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルメタンアミニウムヒドロキシド）、Ｓａｒ（サルコシン）、またはＳｕｃ（コハク酸）であり得；
Ｘａａ２は、Ｃｉｔ（シトルリン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、アセチル化Ｓｅｒ、またはＳａｒであり得；
Ｘａａ３は、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、ヒドロキシプロリン、Ａｃｐｃ、またはＡｉｂ（２－アミノイソ酪酸）であり得；
Ｘａａ４は、Ｔｙｒ（ＰＯ３）、ホモセリン、ａｚａＴｙｒ（ａｚａ－α１－ホモ－Ｌ－チロシン）であり得；
Ｘａａ５は、Ｎｌｅ、ヒドロキシプロリン、Ａｃｐｃ、またはＡｉｂであり得；
Ｘａａ６は、６－ＮＨ２－Ｐｈｅ（６－アミノフェニルアラニン）であり得；及び
Ｘａａ８は、Ｐｈｅ（Ｂｒ）（ｐ－ブロモ－フェニルアラニン；Ｌ－フェニルアラニンまたはＤ－フェニルアラニンであり得る）であり得る。
Ｘａａ１は、Ａｃｐｃ（１－アミノシクロペンタンカルボン酸）、Ｍｅ２Ｇｌｙ（Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン）、Ｂｅｔ（ベタイン、ｌ－カルボキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルメタンアミニウムヒドロキシド）、Ｓａｒ（サルコシン）、またはＳｕｃ（コハク酸）であり得；
Ｘａａ２は、Ｃｉｔ（シトルリン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、アセチル化Ｓｅｒ、またはＳａｒであり得；
Ｘａａ３は、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、ヒドロキシプロリン、Ａｃｐｃ、またはＡｉｂ（２－アミノイソ酪酸）であり得；
Ｘａａ４は、Ｔｙｒ（ＰＯ３）、ホモセリン、ａｚａＴｙｒ（ａｚａ－α１－ホモ－Ｌ－チロシン）であり得；
Ｘａａ５は、Ｎｌｅ、ヒドロキシプロリン、Ａｃｐｃ、またはＡｉｂであり得；
Ｘａａ６は、６－ＮＨ２－Ｐｈｅ（６－アミノフェニルアラニン）であり得；及び
Ｘａａ８は、Ｐｈｅ（Ｂｒ）（ｐ－ブロモ－フェニルアラニン；Ｌ－フェニルアラニンまたはＤ－フェニルアラニンであり得る）であり得る。
【0059】
いくつかの実施形態では、Ａｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドは、配列番号２に記載される天然のＡｎｇ（１－７）の天然に存在するアミノ酸配列を含まない。
【0060】
いくつかの実施形態では、表１に具体的に定義されるものを含む、Ａｎｇ（１－７）及びＡｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドのいずれかは、完全にＬ－アミノ酸、完全にＤ－アミノ酸、またはＬ－アミノ酸とＤ－アミノ酸との混合物（例えば、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個のＤ－アミノ酸を有する）を含み得る。
【0061】
Ａｎｇ（１－７）及びＡｎｇ（１－７）誘導体ポリペプチドは、非限定的に、独占的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的溶液合成、ネイティブケミカルライゲーション、及び組換え技術などのペプチド合成方法を含む任意の適切な方法によって産生され得る。
【0062】
認知機能障害
【0063】
認知機能障害または機能障害は、うっ血性心不全（「ＣＨＦ」）及び心臓手術後の一般的な神経学的合併症であり、退院時の患者の約５０～７０％及び手術後６ヶ月の患者の２０～４０％に影響を及ぼす。ＣＨＦ及び術後の認知機能障害の発生は、入院期間の延長及び長期的な生活の質の低下に関連している。いかなる理論にも拘束されることなく、一般に、炎症性サイトカインの増加及び／または中枢神経系、特に脳内の活性酸素種の増加に関連するあらゆる臨床状態は、認知機能障害を引き起こし得ると考えられている。
【0064】
本発明の他の態様は、本発明のオリゴペプチドを使用して、患者における認知機能障害及び／または機能障害を治療する方法を提供する。典型的には、本発明の方法は、そのような治療を必要とする患者に治療有効量の本発明のオリゴペプチドを投与することを含む。本発明のオリゴペプチドは、Ａｎｇ－（１－７）を使用して治療可能であることが知られているかまたは治療可能であると思われる任意の臨床状態を治療するために使用することができることは、認識されよう。しかしながら、明瞭さと簡潔さのために、患者における認知機能障害及び／または機能障害の治療に関して本発明を説明する。
【0065】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）患者に起こる認知機能障害には、注意力の低下、記憶喪失、精神運動性遅延、及び実行機能の低下が含まれ、それらの全ては、複雑な医療計画を順守し、食事制限を厳守し、セルフケアの決定を下す患者の能力を損なう。ＣＨＦ患者の認知障害に寄与すると考えられている機序には、脳血流の変化、脳血管自己調節の変化、及び微小塞栓症が含まれる。ある研究では、脳血流は単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）で測定され、重度の心不全患者では３０％減少することがわかった。ＣＨＦにおける脳灌流の減少の原因は、低心拍出量、低血圧、及び脳血管反応性の変化に起因する。いくつかの場合では、ＣＨＦに見られる認知機能障害は、心臓移植またはＣＨＦの最適管理による脳血流の改善のいずれかの後に改善される。しかしながら、ＣＨＦを有する多くの患者にとって、管理が最適であることはめったになく、認知機能障害は持続する。興味深いことに、長期追跡調査では、認知機能が正常なＣＨＦ患者は、年齢が一致する非ＣＨＦ対照と比較して顕著に高い認知症またはアルツハイマー病のリスクがあることが明らかとなり、ＣＨＦ及び心血管疾患が、患者にさらなる認知機能障害及び認知症を起こしやすくさせることを示唆する。
【0066】
ＣＨＦの間、循環神経化学的環境におけるよく特徴付けられた変化及び炎症性因子の増加もまた脳において見られる。炎症性サイトカイン及びＲＯＳにおけるＣＨＦ誘発性変化に関する研究のほとんどは、交感神経流出制御に関与する脳領域に焦点を当てており、認知には焦点を当てていない。ＣＨＦは交感神経緊張を高め、異常な心臓及び交感神経反射機能を引き起こす。ラットでは、虚血誘発性ＣＨＦは視床下部の室傍核（ＰＶＮ）中の炎症誘発性サイトカイン及び１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）を顕著に増加させる。さらに、ＣＨＦウサギでは、交感神経流出の増加は、スーパーオキシドジムスタターゼ（ＳＯＤ）模倣剤テンポールのＩＣＶ注射により、おそらくＲＯＳの阻害によって、阻止される。このモデルにおけるＣＨＦは、延髄吻側腹外側部（ＲＶＬＭ）におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼサブユニットの発現増加及びＲＯＳ産生ならびにＮＯの増加と関連する。
【0067】
学習及び記憶におけるＲＯＳの役割は、広く研究されてきた。ＮＯＸ２及びＮＯＸ４を含むすべてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼサブユニットは、細胞体及びマウス海馬及び末梢皮質のニューロンの樹状突起内に局在しており、シナプス部位に共局在している。これらは、学習と記憶における脳の重要な領域である。脳において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの作用によるスーパーオキシド産生は、神経毒性、加齢性認知症、脳卒中、及び神経変性疾患に関与することが知られており、海馬、視床、小脳、及び扁桃体を含む脳の至る所で同定されている。より若く健康な動物において、ＲＯＳとＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、正常な学習と海馬の長期増強（ＬＴＰ）に必要であることが示されている。Ｍａｓを欠くマウスにおける最近の研究は、Ａｎｇ－（１－７）及びＭａｓが正常な物体認識処理に必須であり、海馬におけるＭａｓの遮断は物体認識を損なうことを示した。さらに、Ａｎｇ－（１－７）はＣＡ１細胞におけるＬＴＰを促進し、この効果はＭａｓの拮抗作用によって阻止される。高齢の動物やＣＨＦの動物では、ＲＯＳの増加はＬＴＰと記憶障害に関連している。
【0068】
過去１０年間にわたり、レニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）は、異なる受容体に作用する２つの関連するペプチドの生理学的平衡をもたらす２つの別々の酵素経路を含むことが認識されるようになった。十分に記載されたＡＣＥ－ＡｎｇＩＩ－ＡＴ１受容体系は、ＡＣＥ２－Ａｎｇ－（１－７）－Ｍａｓ系と生理学的に対立し、それによって均衡が保たれていると考えられる。機能的には、ＲＡＳのこれら２つの別々の酵素経路は、脳、微小血管系、及び末梢組織におけるＲＯＳ産生と一酸化窒素（ＮＯ）の均衡を保つことに関与していると考えられている。ＡＴ１受容体活性化の増加は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ及びＲＯＳ産生を増加させることが知られており、これらは両方ともＣＨＦ及び高血圧において観察される交感神経活動の異常な増加に寄与することが知られている。ＡＴ１受容体誘導性のＲＯＳ形成のこの増加には、ＡＣＥ２－Ａｎｇ－（１－７）－ＭａｓによるＲＯＳ形成の阻害が対立すると考えられている。その大部分がＡｎｇＩＩのＡＣＥ２切断から産生されるＡｎｇ－（１－７）は、活性化Ｍａｓを介して、そしておそらくＡＴ２受容体を介して、脳内のＲＯＳ産生を減少させ、ＮＯＳを増加させる。
【0069】
脳内では、Ｍａｓ受容体はニューロン、ミクログリア及び血管内皮細胞上で発現することが知られている。さらに、「神経血管単位」を構成するこれら３つの重要な要素（ニューロン、ミクログリア及び内皮細胞）の全てが、神経性高血圧症及びＣＨＦ誘発性の脳の炎症及びＲＯＳ産生の増加における中心的な役割を果たす。ＣＨＦと高血圧との両方は、「神経血管単位」内で循環サイトカインを増加させてＲＯＳ産生を促進する。このフィードフォワードカスケードの最終結果は、神経機能障害と認知機能障害である。認知障害を治療するための理想的な治療候補は、血液脳関門の両側、脳血管内皮細胞、及び神経細胞で作用することによってこのカスケードを妨害するように設計されるであろう。Ｍａｓ受容体に作用するＡｎｇ－（１－７）は、内皮細胞とニューロンの両方に作用を及ぼすことが知られている。しかしながら、認識機能障害及び／または機能障害を治療するために天然のＡｎｇ－（１－７）を使用することは、天然のＡｎｇ－（１－７）が酵素分解を受けやすいので適切ではない。さらに、天然のＡｎｇ－（１－７）は、治療薬として適しているものとなるための血液脳関門を容易に通過するということがない。
【0070】
いかなる理論にも拘束されることなく、本発明のオリゴペプチドを認知機能障害及び／または機能障害の治療に使用することの利点の１つは、本発明のオリゴペプチドが内皮の「相互作用」及び脳透過を増強したことであると考えられている。本発明のオリゴペプチドは、内皮細胞とニューロンとの両方に作用し、それによって、とりわけ神経血管系ＲＯＳ産生を阻害し、そして脳の炎症性カスケードを軽減すると考えられている。
【0071】
したがって、本発明のオリゴペプチドは、（１）術前及び／または術後の認知症に関連するか、または（２）うっ血性心不全、心血管疾患、または高血圧症の患者において観察される、認知機能障害及び／または機能不全を治療するために使用することができる。より一般的には、本発明のオリゴペプチドは、認知機能障害及び／または障害が、中枢神経系、特に脳における炎症性サイトカインの増加及び／または活性酸素種（「ＲＯＳ」）の増加と臨床的に関連する対象における認知機能障害及び／または障害を治療するのに有用である。本明細書中で使用されるとき、「臨床的に関連する」という用語は、改善されると認知機能障害及び／または機能障害の低下、予防、治療、または回復をもたらす、認知機能障害及び／または障害（記憶喪失などであるが、これには限定されない）の根本的原因または根柢の原因を指す。認知機能障害及び／または機能障害を引き起こす可能性がある炎症性サイトカインの増加及び／または活性酸素種の増加に関連する例示的な臨床状態には、循環障害、心血管疾患、高血圧、低血圧、うっ血性心不全、脳卒中、塞栓症、手術（例えば、術後回復状態）、認知症、アルツハイマー病、疾患関連認知障害、外傷関連認知障害、加齢関連認知症、術後関連せん妄、及び／または、上記対象の中枢神経系内における、炎症性サイトカインの増加及び／または活性酸素種の増加、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらには限定されない。
【0072】
抗侵害受容と鎮痛
【0073】
本明細書中に記載される発明は、原型である天然のＡｎｇ（１－７）ポリペプチドを含むＭａｓ受容体アゴニストが鎮痛をもたらすという発見に部分的に基づく。本明細書に記載されるように、Ａｎｇ－（１－７）及びＡｎｇ（１－７）誘導体の鎮痛特性は、がん誘発性骨痛（ＣＩＢＰ）及び炎症性疼痛を含む侵害受容の動物モデルにおいて評価された。Ａｎｇ－（１－７）及び／またはＡｎｇ（１－７）誘導体の急性及び慢性の全身投与は、いくつかの種類／様相の疼痛の行動徴候を顕著に減少させたことが実証されている。重要なことに、これらのＭａｓ受容体アゴニストの反復投与は、７日後に効力を失うことなくＣＩＢＰを減弱させた。しかしながら、治療の有無にかかわらず、営巣行動に有意な変化は観察されず、営巣がＣＩＢＰを有するマウスにおいて起こりうる不安または鬱病を表すものではないことを示唆している。
【0074】
Ａｎｇ（１－７）及びＡｎｇ（１－７）誘導体の効果がＭａｓ受容体によって媒介されることを確認するために、Ｍａｓ受容体アンタゴニスト、Ａ－７７９を使用した対照実験を実施した。Ａｎｇ（１－７）による肢上げ及び肢振りの阻害は、Ａ－７７９の投与によって顕著に防止された。
【0075】
Ａｎｇ－（１－７）の反復投与はＤＲＧまたは大腿骨押出物中のＭａｓＲの発現を顕著には変化させず、Ａｎｇ－（１－７）の反復投与は骨－腫瘍の微小環境を神経支配する線維の体細胞を含むＤＲＧ中のＭａｓＲの発現を顕著に変化させないことを実証する。これらの知見と一致して、鎮痛薬耐性は治療パラダイムにわたって観察されなかった。
【0076】
ＡＴ１受容体アンタゴニスト、ロサルタンカリウムの前投与は、がん誘発性骨痛をさらに軽減するが、それ自体は顕著な効果を有さないこともまた発見された。ＡＴ１拮抗作用が、Ａｎｇ－（１－７）がＡＴ１でのＡｎｇＩＩと同様に作用することを阻害し、それによってＡｎｇ－（１－７）がＭａｓＲに主に結合して鎮痛をもたらすことを可能にするので、ロサルタンはＣＩＢＰにおけるＡｎｇ－（１－７）に対する効果を増強すると仮定される。ＡＴ２拮抗薬、ＰＤ１２３３１９は、Ａｎｇ－（１－７）の効果を減弱させず、疼痛緩和の増強ももたらさず、ＡＴ２受容体がＣＩＢＰにおいて役割を果たしていないことを示している。さらに、Ａｎｇ－（１－７）は、Ａｎｇ－（１－７）を受けた動物がゆっくりと回転する棒の上を歩き続ける時間の長さを測定することによる運動活性のいかなる変化も示さなかった。
【0077】
まとめると、これらのデータは、Ｍａｓ受容体におけるＡｎｇ－（１－７）が、腫瘍侵害受容器微小環境における疼痛を阻害するためのものであることを実証している。Ａｎｇ－（１－７）は、腫瘍誘発性の骨の分解を顕著に変化させず、腫瘍増殖を顕著に変化させもせず、鎮痛効果が侵害受容活性化の阻害に直接向けられ、腫瘍量の変化に起因していないことをさらに示唆する。したがって、Ａｎｇ（１－７）などのＭａｓ受容体アゴニストは、骨組織への影響または抗新生物活性を介する二次的なものではなく、薬理学的な機序を介して一次的な鎮痛をもたらす。
【0078】
投与方法
【0079】
本発明のオリゴペプチドは、所望の生理学的効果を達成するために患者に投与することができる。好ましくは、患者は動物、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。オリゴペプチドは、選択された投与経路、すなわち経口的または非経口的に適合させた様々な形態で投与することができる。これに関する非経口投与は、以下の経路による投与を含む：静脈内；筋肉内；皮下；眼内；滑液内；経皮、眼、舌下、及び頬側を含む経上皮；眼、経皮、眼、直腸、ならびに吸入及びエアロゾルによる経鼻吸入を含む局所；腹腔内；ならびに直腸全身。
【0080】
活性オリゴペプチドは、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができ、あるいは硬ゼラチンまたは軟ゼラチンのカプセルに封入することができ、あるいは錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の場合、活性オリゴペプチドを賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる。そのような組成物及び製剤は、少なくとも０．１％の活性オリゴペプチドを含み得る。組成物及び製剤のパーセンテージは、当然に変動し得、都合よくは、単位の重量の約１～約１０％の間であり得る。そのような治療上有用な組成物中の活性オリゴペプチドの量は、適切な投与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または製剤は、経口投与単位剤形が約１～約１０００ｍｇの活性オリゴペプチドを含むように調製される。
【0081】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは以下のものも含むことができる：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、スクロース、ラクトース、またはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香味料などの香味剤を添加することができる。投薬単位形態がカプセル剤である場合、それは上述の種類の物質に加えて、液体担体を含むことができる。コーティングとして、または投与単位の物理的形態を変更するために、他の様々な物質が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性オリゴペプチド、甘味剤としてのスクロース、保存料としてのメチル及びプロピルパラベン、染料、及びチェリーまたはオレンジの風味のような香味剤を含み得る。当然に、任意の投薬単位形態を調製するのに使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、そして使用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性オリゴペプチドは持続放出の製剤及び製剤に組み込むことができる。
【0082】
活性オリゴペプチドは非経口投与することもできる。活性オリゴペプチドの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製できる。通常の保存及び使用条件下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【0083】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は、滅菌されていなければならず、かつ容易に注射が可能である程度まで流体でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下で安定であり得、そして細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む分散媒体の溶媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの注射用組成物の持続的吸収。
【0084】
滅菌されている注射用溶液は、活性オリゴペプチドを、上に列挙される様々な他の成分と共に必要量で適切な溶媒に混合し、必要に応じて、その後のろ過滅菌によって調製される。一般的に、分散剤は様々な滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【0085】
本発明の治療用オリゴペプチドは、上述のように、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて哺乳動物に投与することができ、その割合は、オリゴペプチドの溶解度及び化学的性質、選択された投与経路及び標準的な薬務によって決定される。
【0086】
医師は、予防または治療に最も適した本治療薬の投与量を決定し、それは投与形態及び選択された特定のオリゴペプチドに応じて変動し、また治療中の特定の患者によっても変動するであろう。医師は一般に、状況下で最適な効果が得られるまで、少量の投与量でわずかに増量しつつ、治療を開始することを望むであろう。治療用量は、一般に、１日当たり約０．１～約１０００ｍｇ／日、そして好ましくは約１０～約１００ｍｇ／日、または約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得、好ましくは１日当たり約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重で、いくつかの異なる投与単位で投与することができる。約２倍～約４倍程度のより高い投与量が経口投与に必要とされ得る。
【0087】
本発明のさらなる目的、利点、及び新規の特徴は、限定することを意図しない以下のそれらの実施例を検討することにより当業者には明らかになるであろう。実施例において、実施するために構造的に簡潔にされる手順は現在時制で記載されており、そして実験室で行われた手順は過去時制で示されている。
【実施例】
【0088】
実施例１：Ａｎｇ－（１－７）誘導体のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）：
【0089】
ＨＴＳのために、２つの別個の細胞株、初代ＣＡ１海馬ニューロン及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における、一酸化窒素（ＮＯ）産生の高感度で直接的な測定を利用した。初代ＣＡ１細胞の使用は、中枢効果の研究にとって自明である。さらに、ＣＨＦの進行及び認知機能障害の誘発に対する内皮機能不全の寄与は臨床的に認められている。Ａｎｇ－（１－７）シングリング軸が内皮機能不全の治療標的として有望であるという新たな事実は、機序としてのＣＨＦ誘発内皮機能不全の回復を除外できないことを強く示唆している。ＨＵＶＥＣはヒト臍静脈から単離され、初代培養後に凍結保存される。これらの細胞は内皮細胞機能の研究のためのモデルインビトロ系であり、Ｍａｓ依存性ＮＯ産生を直接測定するために使用され得るので、ＨＵＶＥＣは一次スクリーニングのための第二のラインとして含まれる。
【0090】
細胞培養：初代海馬ＣＡ１神経細胞を単離するために、全脳を新生仔ラットの子（１～２日齢）から取り出し、皮質を切除した。海馬を単離し、そしてＣＡ１視野を切除し、そして緩衝液中に置いた。消化緩衝液中で穏やかに破砕した後、細胞を計数し、培地中に置き、そしてポリ－ｄ－リジンでコートした９６ウェルフォーマット中に播種した。播種時に、細胞は約５０％の密度であり、アッセイの開始前に７０～８０％の密度になるまで培養した。市販のＨＵＶＥＣ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を解凍し、ゼラチンでコート下９６ウェルフォーマット中に播種した（５０００～１０，０００細胞／ウェル）。アッセイの開始前に、ＨＵＶＥＣ細胞を一晩培養した。
【0091】
細胞活性化：Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅが開発したｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムリアルタイムセルアナライザー（ＲＴＣＡ）は、マイクロエレクトロニクスバイオセンサー技術を使用して、細胞のＧタンパク質受容体活性化を含む細胞イベントの動的、リアルタイム、無標識、及び非侵襲的分析を実施する。ＲＴＣＡ分析を利用して、培養中のヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を活性化する本発明のオリゴペプチド及び天然のＡｎｇ－（１－７）の効力及び相対的能力を測定した。細胞インピーダンス（ＣＩ）の直線的増加に基づく均一な細胞接着に続いて、ＨＵＶＥＣをＡｎｇ－（１－７）及び本発明のオリゴペプチドで処理した。図１における経時的なＣＩの各軌跡は、化合物添加時にＣＩに対して標準化した４つのウェルの平均を表す。図１は、ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、ＰＮ－Ａ５、及び天然のＡｎｇ－（１－７）の相対効力を測定するためにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを使用して得られたデータからの結果を示す。ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、及びＰＮ－Ａ５の１００ｎＭの投与ならびにＰＮ－Ａ３及びＰＮ－Ａ５の１０ｎＭの投与は、天然のＡｎｇ－（１－７）よりも顕著な（約２倍）ＣＩの増加をもたらし、本発明のオリゴペプチドが天然のＡｎｇ－（１－７）よりも細胞活性化に対してより高い効力を有することを実証する。
【0092】
ＮＯ産生アッセイ。本発明のオリゴペプチドの作用機序のスクリーニングとして、本発明の３つのオリゴペプチド（ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、及びＰＮ－Ａ５）のＮＯ産生を増加させる能力を特徴付けし、天然のＡｎｇ－（１－７）と比較した。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養プレートは、ジアミノフルオレセイン－ＦＭジアセテート（ＤＡＦ－ＦＭ、１μＭ）を含む蛍光反応緩衝液（０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％グルコース）を添加され、リアルタイムＮＯ産生を測定した。４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの発光を伴うＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マイクロプレートリーダーを使用して、時間分解（１０分）蛍光強度を検出した。ＤＡＦ－ＦＭは、生細胞中のＮＯを選択的に検出するための高感度の蛍光誘導体である。
【0093】
図２は、天然のＡｎｇ－（１－７）及び本発明の３つのオリゴペプチドに５分間暴露した後の相対ピーク蛍光強度を示す。値を対照蛍光に対して標準化した。予想通り、天然のＡｎｇ－（１－７）は、対照レベルに対して顕著なＮＯの上昇を誘導した。より重要なことには、図２に示すように、本発明のオリゴペプチド（すなわち、ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、及びＰＮ－Ａ５）はまた、対照レベルを超える顕著なＮＯの上昇を誘発し、ＰＮ－Ａ５は天然のＡｎｇ－（１－７）で見られるよりも顕著にＮＯ産生を増強した。＊＝ｐ＜０．０５。これらの結果は、本発明のオリゴペプチドが、ＮＯ産生を、天然のＡｎｇ－（１－７）のそれと同等またはそれ以上に、増加させることを実証している。
【0094】
図３Ａは、天然のＡｎｇ－（１－７）によるＮＯ産生を阻止することが知られている選択的Ｍａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９（Ｃ３９Ｈ６０Ｎ１２Ｏ１１）の、本発明のオリゴペプチド、すなわちＰＮ－Ａ５によって誘発されるＮＯ産生をも同様に阻止する能力を示す。これらの研究では、ＨＵＶＥＣ細胞を１μＭのＤＡＦ－ＦＭと共にインキュベートして、リアルタイムＮＯ産生を測定した。細胞は、ＰＮ－Ａ５単独（１．０ｍＭ、ｎ＝１０）またはＰＮ－Ａ５＋Ａ７７９（ｎ＝６）のいずれかによって処理された。測定は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ５５０共焦点顕微鏡を用いてなされ、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して分析された。画像は１０秒毎に得られた。これらの結果は、オリゴペプチドＰＮ－Ａ５の作用がＭａｓ受容体の活性化によるものであることを示している。
【0095】
図３Ｂは、天然のＡｎｇ－（１－７）によるＮＯ産生を阻止することが知られている選択的Ｍａｓ受容体アンタゴニストＡ７７９の、本発明のオリゴペプチドであるＰＮ－Ａ５によって誘発されるＮＯ産生をも同様に阻止する平均効果を示す。これらの研究では、ＨＵＶＥＣ細胞を１μＭのＤＡＦ－ＦＭと共にインキュベートして、リアルタイムＮＯ産生を測定した。細胞は、ＰＮ－Ａ５単独（１．０ｍＭ、ｎ＝１０）、ＰＮ－Ａ５＋Ａ７７９（ｎ＝６）、またはＮＯ供与体Ｓ－ニトロソ－Ｎ－アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）のいずれかによって処理された。蛍光測定は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ５５０共焦点顕微鏡を用いてなされ、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して分析された。画像は１０秒毎に得られた。ＰＮ－Ａ５によって生成されたＮＯ応答は、Ａ７７９によって完全に阻止され、ＰＮ－Ａ５のＮＯを増加させる能力は、Ｍａｓ受容体に対するＰＮ－Ａ５の作用によるものであることが実証された。
【0096】
実施例２：心不全（ＨＦ）誘発性認知障害に対するＡｎｇ－（１－７）誘導体の効果：
【0097】
全部で３３匹のオスのＣ５７Ｂｌ／６Ｊ成体マウス（Ｈａｒｌａｎ、８～１０週齢）を使用した。マウスを無作為に偽（ｎ＝１２）またはうっ血性心不全（ＣＨＦ）群（ｎ＝２１）のいずれかに割り当てた。実験群は以下のように記載される：偽＋生理食塩水、ＣＨＦ＋生理食塩水、ＣＨＦ＋ＰＮ－Ａ５。手術前の全てのマウスの体重を量り、麻酔をかけた。ＣＨＦマウスについては、ＭＩを左冠状動脈（ＬＣＡ）の結紮によって誘導した。麻酔下（空気とＯ２の混合物中２．５％イソフルラン）、開胸術を左第４肋間隙で行い、ＬＣＡを永久的に結紮して心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。ＬＣＡの閉塞は、白化、結紮糸の下流の左心室の前壁の色のわずかな変化を観察することによって確認された。ＬＣＡを結紮することを除いて、偽マウスに同一の処置を施した。
【0098】
ＭＩ手術から８週間後、ＣＨＦマウスを、Ａｎｇ－（１－７）誘導体ＰＮ－Ａ５（１ｍｇ／ｋｇ／日）の２８日間毎日の皮下注射または生理食塩水のいずれかで処理した。２１日後、下記のように標準的なＮＯＲテストを使用して動物を物体認識について試験した。約２５日間の処理後、下記のように標準的なモーリスの水課題を使用して動物を空間記憶について試験した。
【0099】
新規物体認識（ＮＯＲ）：装置は、隔離された観察室の内側のテーブル上に置かれた均一に照らされたプレキシグラス箱（１２ｃｍ×１２ｃｍ×１２ｃｍ）からなっていた。装置のすべての壁は黒色のプラスチックで覆われており、床は、物体の習熟と試験段階の間に物体の位置が変わらないことを保証するために使用されたグリッドで灰色であった。マウスの行動と物体の探索はデジタルカメラで記録された。カメラからのデジタル画像は隣接する部屋のコンピューターに送られた。２つのデジタルストップウォッチを使用して、マウスが試験の物体と相互作用するのに費やした時間を追跡した。全てのデータは分析のためにエクセルファイルにダウンロードされた。試験には、まったく異なる３つの組の物体を使用した。
【0100】
新規物体認識課題は、馴化段階、習熟段階、及び試験段階の３段階を含んでいた。馴化段階については、１日目及び２日目に、マウスを観察室に運び、１日１０分間空の箱に馴化させた。３日目に、各マウスは、２つの同一の物体による「習熟」試行とそれに続く所定の遅延期間、次いで１つの物体が習熟段階のものと同一であり、他のものが新規である「試験」試行を受けた。全ての刺激は、互いに三重のコピーで利用可能であり、そのため、物体を二度提示する必要はない。物体は、形、色、及びサイズがさまざまなガラス、プラスチック、または木材で作製されていた。したがって、異なる組の物体は、テクスチャ的にも視覚的に独自のものであった。各マウスを各段階について同一の方法で箱の中に入れ、物体の反対側の壁の中心に向けた。嗅覚的手がかりの存在を排除するために、各試行後及びマウス間で、箱全体及び物体を常に７０％エタノールで完全に洗浄した。習熟段階の間、マウスは２つの同一の物体を４分間探索することを許され、次いで彼らのホームケージに戻った。２時間の遅延の後、「試験段階」を開始した。マウスを同一のボックスに戻し、そこで習熟段階で提示された２つの同一の物体のうちの１つを新規の物体に切り替え、マウスにこれらの物体をさらに４分間探索させた。マウスの「探索行動」とは、動物がその鼻を約２ｃｍ以下の距離で物体に向けることと定義した。物体にもたれかかること、または物体の上にまっすぐに立つことなどの任意の他の行動は探索とは見なされなかった。探索は、マウスの手術群（ＣＨＦ対偽）を、盲検化された観察者によって採点された。最後に、試験段階での物体の位置、及び新規または習熟のものとして使用された物体は、２つの群のマウス間で相殺された。
【0101】
識別率は、試験段階中の、新規の物体を探索するのに費やした時間から習熟した物体を探索するのに費やした時間を差し引いて、合計探索時間で割ったものから計算した。Ｄ比率＝（ｔ新規－ｔ習熟）／（ｔ新規＋ｔ習熟）。データは「試験段階」の最初の２分間から分析された。正のスコアは新規の物体に費やしたより多くの時間を示し、負のスコアは習熟した物体に費やしたより多くの時間を示し、ゼロのスコアはゼロの選好性を示す。対象間の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、全てのＮＯＲデータを調べた。個々の群の違いは、事後Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ検定を使用して検定した。異なる標本サイズの群間の比較では、修正Ｌｅｖｅｎｅ検定を使用して等分散を検定した。すべての統計的検定及びｐ値は、ＤａｎｉｅｌのＸＬｔｏｏｌｂｏｘによってＭＳ Ｅｘｃｅｌを使用して計算され、アルファは０．０５レベルに設定された。エラーバーはＳＥＭを表す。
【0102】
モーリスの水課題：空間学習と記憶／視覚試験を試験する：使用した装置は、毒性のない白色のＣｒａｙｏｌａ塗料を添加して不透明にした２５℃の水を含む直径約１．５メートルの大きな円形プールであった。避難台は水面のすぐ下に隠れていた。視覚的でコントラストの高い合図を試験室の壁に置いた。隣接する部屋のコンピューターに接続されたデジタルカメラは、課題の進行状況を記録するために水槽の上に吊り下げられる。ＭＩ前、ＭＩまたは偽手術の４及び８週間後の空間試験のために、台はプール内の異なる位置に配置された。
【0103】
モーリスの水課題の空間版では、すべての動物に４日連続で１日６回の訓練試行が実施された。これらの試行の間、逃避台は水面下に隠されていた。マウスを、水槽の周囲にある７つの異なる開始位置から解放し、次のマウスを試験する前に各動物を２回連続した試行を実施した。２つの連続した試行で同一の場所からマウスが解放されないように、解放位置の順序を各マウスについて擬似ランダム化した。水泳課題の成績は、市販のソフトウェアアプリケーション（ＡＮＹ－ｍａｚｅ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）によって分析した。放出位置が異なり、水泳速度が異なると、逃避台に到達するまでの待ち時間に変動が生じるため、異なる放出位置にわたるマウスの性能の比較可能性を保証するために修正積分経路長（ＣＩＰＬ）を計算した。ＣＩＰＬ値は、動物の水泳速度によって補正された避難台からの経時的な累積距離を測定し、これは累積探索誤りに相当する。したがって、放出位置に関係なく、マウスが主に逃避台に向かって泳ぐ場合、ＣＩＰＬ値は低くなる。対照的に、マウスが台から離れる方向に泳ぐのにより長い時間を費やすほど、ＣＩＰＬ値は高くなる。
【0104】
オリゴペプチドＰＮ－Ａ５による治療の約２１日後に、ＣＨＦマウスは物体認識記憶の改善を示した。図４は、新規物体認識試験（ＮＯＲ）によって決定された、物体認識記憶に対するオリゴペプチドＰＮ－Ａ５による３週間の処理の効果を示す。オリゴペプチドＰＮ－Ａ５による処理を有するＣＨＦマウス（ｎ＝１１）の平均成績は、生理食塩水を有する偽マウス（ｎ＝６）と同様であり、（ＣＨＦ－Ａｎｇ－（１－７）誘導体ＰＮ－Ａ５Ｍ＝＋０．３８、ＳＥ ．１１対偽－生理食塩水Ｍ＝＋０．５２、ＳＥ ．０６）、生理食塩水で処置したＣＨＦマウス（ｎ＝１０）と比較して顕著に大きい（Ｍ＝－．０５、ＳＥ ．０９、＊＝ｐ＝０．００９）。これらの結果は、オリゴペプチドＰＮ－Ａ５がＣＨＦを有するマウスにおける物体認識記憶障害を軽減し、さらには救済するように作用することを実証する。
【0105】
オリゴペプチドＰＮ－Ａ５による治療の約２５日後に、ＣＨＦマウスは空間記憶の改善を示した。図５は、ＣＨＦ＋オリゴペプチドＰＮ－Ａ５マウス（ｎ＝１１）、ＣＨＦ－生理食塩水処理マウス（ｎ＝１０）、及び偽＋生理食塩水マウス（ｎ＝６）の平均ＣＩＰＬを示す。ＣＨＦ＋オリゴペプチドＰＮ－Ａ５マウスは、ＣＨＦ－生理食塩水マウスと比較して、モーリス水泳課題の３日目の空間記憶において顕著な改善を示した。生理食塩水で処理したＣＨＦマウスは、ＣＨＦ－オリゴペプチドＰＮ－Ａ５で処理したマウスと比較して顕著に高いＣＩＰＬスコアを有した（ＣＨＦ－生理食塩水Ｍ＝３２．５、ＳＥ＝２．１対ＣＨＦ－オリゴペプチドＰＮ－Ａ５ Ｍ＝２３．５、ＳＥ ２．２、＊＝ｐ＝０．００３）。これらの結果は、オリゴペプチドＰＮ－Ａ５が空間記憶を改善することを実証している。
【0106】
実施例３：がん誘発性骨痛に対するＡｎｇ（１－７）誘導体の効果：
【0107】
ＢＡＬＢ／ｃｆＣ３Ｈマウス（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ，ＵＳＡ）は研究開始前に１５～２０ｇであった（処理群あたりｎ＝５匹の動物）。罹患率の臨床的徴候を観察し、選択パラメーター（例えば、麻痺、１週間で２０％を超える急速な体重減少）を満たさなかったマウスを試験から除外した。
【0108】
マウスをケタミン：キシラジン（８０ｍｇ：１２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｌ／ｋｇ注射容量；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔した。関節切開術を実施した。右大腿骨遠位部の顆を露出させ、マウスの大腿骨の髄内間隙内へと、５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中の４×１０４の６６．１細胞または対照動物での細胞なしの５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを注射するための間隙作るために穿孔した。プラスチックチューブを介して１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（ＣＩ３１，Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ）に固定された注射カニューレを用いて注射を実施した。注射器の適切な配置は、Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ線イメージングの使用によって確認された。穴を骨セメントで密封した。
【0109】
７日目に単回用量の薬物を盲検様式で投与した０、１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に、自発痛（肢振り及び肢上げ）ならびに触覚異痛を測定した。乳癌による過敏症は、薬物投与後２時間でベースラインレベルに戻った。肢振り及び肢上げは、安静時の状態で２分間観察された。肢振りは、歩行または運動と関連していないときの右後肢の持ち上げ及び急速な屈曲によって特徴付けられた。肢振りは５チャンネルカウンターで記録された。肢上げは、右後肢を胴体の下の完全に引き込まれた位置に持ち上げることによって特徴付けられた。２分間にわたって肢上げに費やした時間を記録した。
【0110】
触覚異痛の評価は、処理群を盲検化した実験者によって、Ｃｈａｐｌａｎアップ－ダウン法を使用した一連の較正済みｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメントによるプロービングに応答して腫瘍接種部位と同側の肢の引き込み閾値を測定することからなった。５０％の肢の引き込み閾値は、Ｄｉｘｏｎのノンパラメトリック法によって決定した。
【0111】
７日目に、マウスに生理食塩水または０．８μｇ／μＬ（２００μＬ）のいずれかを、８００μｇ／ｋｇの総用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。ＰＮ－Ａ５のインビボ効力を、合計２時間測定した。
【0112】
群内データは、ノンパラメトリック一元配置分散分析によって分析した。Ｐ≦０．０５の場合、差異は有意であると見なされた。すべてのデータはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６でプロットされた。
【0113】
図６は、がん誘発性骨痛（ＣＩＢＰ）に対するオリゴペプチドＰＮ－Ａ５の効果に関する結果を示す。マウスの大腿骨遠位部に移植されたがんは、７日後に自発的肢振りの数（図６Ａ）及び肢上げに費やす時間（図６Ｂ）の有意な増加を誘導した。ＰＮ－Ａ５のボーラス投与（８００μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、持続時間のほぼ１時間の間、がん誘発自発痛を有意に逆転させた（肢振り：６０分；肢上げ：３０分；ｐ＜０．００１）。同様に、がん誘発触覚過敏は注射後３０分で有意に減弱した（ｐ＜０．０１）。全ての測定について、ピーク効果の時間は１５～３０分であった。行動は注射後９０分で手術後の値に戻った。培地を接種した偽対照動物は、時間的経過の間のいずれの時点においても手術前のベースラインと統計的に差がなかった。
【0114】
実施例４：がん誘発性骨痛に対するＡｎｇ（１－７）誘導体の効果：
【0115】
原型的なＭａｓ受容体アゴニストである天然のＡｎｇ（１－７）のがん誘発性骨痛に対する効果を調べた。Ａｎｇ－（１－７）は鎮痛をもたらしたが腫瘍誘発性の骨の分解を顕著に変化させることも骨量減少を減少させることもなかったので、Ｍａｓ受容体におけるＡｎｇ－（１－７）の作用が腫瘍－侵害受容微小環境を介する疼痛を抑制し、腫瘍－骨環境は抑制しないことが発見された。Ａｎｇ－（１－７）による慢性的な治療は腫瘍増殖を顕著に変えることがなく、さらに鎮痛効果が侵害受容活性化を直接的に阻害し、それが腫瘍量の変化によるものではないことをさらに示唆している。
【0116】
細胞培養：マウス乳腺癌細胞株６６．１を、１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ－１ペニシリン、及び１００μｇｍＬ－１ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むＥａｇｌｅの最小必須培地中で培養した。６６．１細胞をＴ－７５組織培養フラスコに播種し、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で指数増殖させた。後述の処理で培養した細胞の生存率は、ＸＴＴアッセイ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して測定した。
【0117】
動物：１５～２０ｇのメスのＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ，ＵＳＡ）をこの試験に使用した。マウスを１２時間の明／暗周期で気候制御室に収容し、食物と水を自由に摂取させた。動物を試験の０、７、１０、及び１４日目に急速な体重減少の臨床的徴候及び苦痛の徴候について観察した。
【0118】
薬物処理：動物に、０．９％食塩水に溶解した、アンジオテンシン－（１－７）（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）、ＭａｓＲアンタゴニストＡ－７７９（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＡＴ１アンタゴニストロサルタンカリウム（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、またはＡＴ２アンタゴニストＰＤ１２３３１９ジトリフルオロ酢酸（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を投与した。全ての腹腔内（ｉ．ｐ．）注射は１０ｍＬ／ｋｇの容量で実施された。全身投与量は以下のようである：Ａｎｇ－（１－７）＝０～１００μｇ／ｋｇ、Ａ－７７９＝０．１９μｇ／ｋｇ、ロサルタンカリウム＝０．４ｍｇ／ｋｇ、ＰＤ１２３３１９ジトリフルオロ酢酸塩＝０．４ｍｇ／ｋｇ。アンタゴニスト試験では、Ａ－７７９、ロサルタンカリウム、またはＰＤ１２３３１９ジトリフルオロ酢酸をＡｎｇ－（１－７）の３０分前に投与した。
【0119】
尾フリック：急性侵害受容に対するＡｎｇ－（１－７）の効果を決定するために温水（５２℃）尾フリック試験を使用した。ナイーブマウスの尾の遠位３分の１を水浴に浸した。尾が水浴から引き出される時間として定義される、引き込み待ち時間を記録した。組織損傷を防ぐために、１０秒のカットオフタイムを実施した。ベースライン待ち時間を薬物投与前に記録した。動物にＡｎｇ－（１－７）（０～１００μｇ／ｋｇ）を投与した（ｉ．ｐ．）。尾フリック待ち時間は、治療後１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、及び１８０分後に再評価した。
【0120】
ロータロッド：ロータロッド性能試験を使用して、Ａｎｇ－（１－７）の運動及び／または鎮静作用を決定した（Ｒｏｔａｍｅｘ ４／８，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）。試験の３日前に、ナイーブマウスを５回試行して、回転するロッドに順応させることができた（１０回転／分）。試験当日、動物に１回試行させ、次いでベースライン化した。消耗を防ぐために１２０秒のカットオフ時間を伴う、動物がロッド上に留まった時間の長さを記録した。上述のように動物に投与し（ｉ．ｐ．）、投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に再評価した。
【0121】
関節切開術－６６．１細胞の骨髄内移植：ＣＩＢＰを誘発するために、関節切開術を実施した。手短に、動物を８０ｍｇ／ｋｇのケタミン－１２ｍｇ／ｋｇのキシラジン（１０ｍＬ／ｋｇの容量中）で麻酔した。手術部位を剃毛し、７０％エタノール及びベタジンで洗浄した。右大腿骨の顆を露出させ、穿孔（０．６６ｍｍ）を穿孔して６６．１細胞接種用の間隙を作った。ＭＥＭ中の５μｌ容量の６６．１細胞（１μｌ当たり８，０００細胞）（または偽動物に細胞を含まない５μｌのＭＥＭ）をマウス大腿骨の髄内間隙に注射した。注射器の適切な配置は、ラジオグラフ（Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ線イメージング）によって確認された。穴を骨セメントで密封し、膝蓋骨を元に戻した。筋肉及び皮膚を、それぞれ５－０ビクリル縫合糸及び創傷オートクリップを用いて別々の層で閉鎖した。感染を防ぐために、動物に８ｍｇ／ｋｇ（１０ｍＬ／ｋｇ容量）のゲンタマイシンを与えた。手術後７日目にステープルを外した。
【0122】
急性行動テスト：手術後１４日目に、自発的肢振り／肢上げのベースライン行動を記録した。肢振りは、歩行または他の運動と関連していないときの大腿骨接種と同側の後肢の持ち上げ及び急速な屈曲によって特徴付けられた。肢上げは、接種した後肢を胴体の下の完全に引き込まれた位置に持ち上げることによって特徴付けられた。肢振りの総数及び２分の持続時間のうちの肢上げに費やした時間を記録した。次いで、マウスを処理群に分け、Ａｎｇ－（１－７）（０～１０μｇ／ｋｇ）、Ａ－７７９（０．１９μｇ／ｋｇ）、ロサルタンカリウム（０．４ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ１２３３１９（０．４ｍｇ／ｋｇ）、ビヒクル（０．９％生理食塩水）、またはＡｎｇ（１－７）と各アンタゴニストの組み合わせを全身投与した。Ａｎｇ－（１－７）の３０分前にアンタゴニストを投与した。投与後、疼痛行動がベースラインに戻るまで、動物を３時間の時間経過にわたって試験した。
【0123】
慢性行動試験：手術後７日目に、上述のように、自発的疼痛のベースライン行動を記録した。マウスをＡｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ）、Ａ－７７９（０．１９μｇ／ｋｇ）、ビヒクル（０．９％食塩水）、またはそれらの組み合わせで処理した（ｉ．ｐ．）。Ａｎｇ－（１－７）の３０分前にアンタゴニストを投与した。手術後７～１４日に、毎日、同じ時間に、動物に投与した。１０日目に、急性試験によって決定されたピーク効果の時間に基づいて、疼痛行動を治療の１５分後に評価した。手術後１４日目に、治療前後の行動を再度記録した。手術後１４日目の処理及び試験の後に動物を屠殺し、生化学的分析のために以下の組織を採取した：血清、大腿骨押出物、及び腰椎後根神経節。
【0124】
営巣：ナイーブマウス、培地マウス、及びがん接種マウスの営巣行動を、Ｎｅｇｕｓらによって記載されたプロトコールを使用して評価した。薬物投与の前の３０分間、動物を、既存の巣のない個々のケージに慣れさせた。綿繊維巣材を６つの等しい小片に切断し、そして各小片を、薬物投与後に上述した方法で６つのゾーンでケージに入れた。１００分の時間経過を通して、クリアゾーンの数が記録され、完了時に、それぞれの膨らませた巣材の高さ（ｍｍ）を測定した。
【0125】
ウェスタンブロット解析：行動試験に使用したマウスからの後根神経節（ＤＲＧ）及び大腿骨押出物を、ＭａｓＲの発現について分析した。超音波処理によって、プロテアーゼインヒビターカクテル及びＥＤＴＡを含む改変放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）中でＤＲＧをホモジナイズした。各試料１０μｇを１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ＴＧＸ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で展開し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン（ＰＶＤＦ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移した。同側及び対側大腿骨を各動物から取り出した。各大腿骨について、近位端及び遠位端をクリップで留め、そして髄内押出し物を、プロテアーゼインヒビターカクテル及びＥＤＴＡを含む７００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で６回フラッシュした。５匹の動物からの大腿骨髄を試料毎にプールし、１５μｇの試料を展開し、ＤＲＧと同じ方法で移した。ブロットをポンソーＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色することによりタンパク質の転移を確認し、ＰＶＤＦ膜を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳で、室温で１時間ブロッキングした。次いで、膜を一次抗体：ＴＢＳＴ中の１％ミルク中の、ウサギポリクローナル抗アンジオテンシン－（１－７）Ｍａｓ受容体（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ ＡＡＲ－０１３；ＤＲＧについては１：２００希釈、もしくは大腿骨については１：８００希釈）またはマウスモノクローナル抗アクチンＡＣ４０（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７６Ｓ；１：４，０００希釈）と共に、４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、適切な二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７４ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ、１：１０，０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７６ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ、１：５０００希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を再度洗浄し、増強化学発光（Ｃｌａｒｉｔｙ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して現像し、バンドをＧｅｎｅＭａｔｅ Ｂｌｕｅ－Ｕｌｔｒａ Ａｕｔｏｒａｄフィルム（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）を使用して検出した。ＩｍａｇｅＪデンシトメトリーソフトウェア（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して、バンドを定量し、バックグラウンドを補正した。全てのデータを各レーンのアクチンに対して標準化し、未処理対照に対する倍数変化として報告した。
【0126】
確立されたＣＩＢＰにおけるＡｎｇ－（１－７）投与は、ＭａｓＲ依存的に自発的疼痛を軽減する。
【0127】
６６．１腫瘍細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウスの右大腿骨に注射した確立されたＣＩＢＰのモデルにおいて、Ａｎｇ－（１－７）の抗侵害受容効果を調べた。手術前、マウスは疼痛の行動的徴候を示さなかった（データは示さず）。動物は、培地処理対照と比較して有意な量の肢振り（図７Ａの「ポストＳｘ」）及び肢上げ（図７Ｂの「ポストＳｘ」）を示した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝８）。Ａｎｇ－（１－７）（０．０３６、０．３６０、１、及び１０μｇ／ｋｇ）またはビヒクルの単回全身注射を投与し、疼痛行動を評価した。Ａｎｇ－（１－７）を急性ｉ．ｐ．投与された動物は、０．３６または１μｇ／ｋｇのいずれかの注射後１５分で開始し、ほぼ２時間持続した自発的疼痛行動の有意な（ｐ＜０．０１、ｎ＝８）減少を示した（図７Ａ及び７Ｃ）。
【0128】
用量反応曲線は、肢上げ行動及び肢振り行動について、ピーク効果の１５分の時点で収集したデータから作成した（それぞれ図７Ｂ及び７Ｄ）。１５分では、肢上げ行動の低下におけるＡｎｇ－（１－７）の最大効果は５２．７５％（ｐ＜０．０１、ｎ＝８）であり、対応するＡ９０用量は０．０５８μｇ／ｋｇであった（図１Ｂ）。肢振りは、より低い用量（０．０３６μｇ／ｋｇ）でより少ない用量依存性及びより顕著な阻害を示した。したがって、Ａｎｇ－（１－７）の単回注射は、確立されたＣＩＢＰを有する動物において自発的疼痛行動を５０％を超えて減少させるのに有効である。
【0129】
観察されたＡｎｇ－（１－７）効果がＭａｓ受容体によって媒介されることを確認するために、大腿骨接種の１４日後に、Ａ－７７９（０．１９μｇ／ｋｇ）、選択的ＭａｓＲアンタゴニスト、またはビヒクルをＡｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ）の３０分前に投与した。Ａ－７７９単独でＭａｓＲを阻害しても、自発的または誘発疼痛閾値は変化しなかったが、Ａ－７７９による前処理は、肢上げ（図７Ｅ、ｐ＜０．０１）及び肢振り（図７Ｆ、ｐ＜０．００１）の、Ａｎｇ－（１－７）による減衰を有意に阻害した。これらのデータは、Ａｎｇ－（１－７）がＭａｓＲでの作用を通じて確立されたＣＩＢＰにおいて抗侵害受容を誘発することを実証する。
【0130】
ＭａｓＲによるＡｎｇ－（１－７）の抗侵害受容作用は、反復投与後も維持される。
【0131】
反復Ａｎｇ－（１－７）の抗侵害受容活性を調べて、他の鎮痛薬と同様に、慢性投与が耐性をもたらすかどうかを判定した。Ａｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を、大腿骨への６６．１細胞の移植の７日後から開始して毎日投与した。薬物投与の７日前、ならびに手術後１０日目及び１４日目に、マウスを処理後１５分のＣＩＢＰ自発疼痛行動について評価した。がん接種は、手術後７日の肢上げに費やされた時間及び肢振りの数を有意に増加させた（ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）。動物は、手術後１０日目及び１４日目にＡｎｇ－（１－７）処理後に肢上げ（図８Ａ）及び肢振り（図８Ｂ）の有意な（ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）減少を経験した。ビヒクル処理は顕著な効果を有さなかった。
【0132】
Ａ－７７９を再び使用して、Ａｎｇ－（１－７）の抗侵害受容作用がＭａｓ受容体によって媒介されることを確認した。Ａ－７７９（０．１９μｇ／ｋｇ）を、がん接種後７～１４日に毎日、Ａｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ）の３０分前に投与した（図８Ｃ及び８Ｄ）。Ａ－７７９単独の投与はマウスに対して侵害受容促進効果も抗侵害受容効果も有さず、単回注射後の以前の観察と同様に、Ａｎｇ－（１－７）前のＡ７７９による慢性前処理は、後者によるＣＩＢＰの減弱を防止した。
【0133】
確立されたＣＩＢＰにおけるＡｎｇ－（１－７）／ＭａｓＲを介した抗侵害受容に対するＡＴ１／ＡＴ２アンタゴニストの効果。
【0134】
ＡｎｇＩＩは、Ａｎｇ－（１－７）の前駆体分子である。従って、Ａｎｇ－（１－７）抗侵害受容の媒介におけるＡｎｇＩＩ受容体の役割を、ＡＴ１またはＡＴ２選択的アンタゴニスト、ロサルタンカリウム（Ｋｉ＝１０ｎＭ）及びＰＤ１２３３１９（ＥＭＡ２００としても知られる）（ＩＣ５０＝３４ｎＭ）のそれぞれによる前処理を使用して調べた。上述のように、動物に６６．１細胞または培地を接種し、大腿骨接種の１４日後に疼痛行動を評価した。マウスに、Ａｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）、またはビヒクル（０．９％生理食塩水）の３０分前に、ＡＴ１またはＡＴ２アンタゴニスト（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のいずれかを投与した。肢振り及び肢上げの自発的疼痛行動を、投与後１５、３０、６０、９０、１２０、及び１５０分に記録した。以前の結果を確認すると、Ａｎｇ－（１－７）投与単独は疼痛行動を減少させた（ｐ＜０．０１、ｎ＝７）が、一方で、ロサルタンカリウムもＰＤ１２３３１９も単独投与では疼痛行動を有意に変化させなかった。興味深いことに、Ａｎｇ－（１－７）の前にＡＴ１受容体拮抗薬、ロサルタンカリウムを投与すると、投与３０分後に肢上げの低減において７７．５２７％の最大可能有効性（ＭＰＥ）（ｐ＜０．０００１、ｎ＝７）（図９Ａ）が、投与後１５分で、肢振りの減少における８０．５６％のＭＰＥ（ｐ＜０．０００１、ｎ＝７）（図９Ｂ）が得られた。しかしながら、Ａｎｇ－（１－７）の前にＡＴ２拮抗薬、ＰＤ１２３３１９を使用しても、Ａｎｇ－（１－７）単独で処理した動物群と比較して、確立されたＣＩＢＰを有する動物の肢上げまたは肢振りをさらに増加または減少させることはなかった（図９Ｃ及び９Ｄ）。ロサルタンカリウムのＡｎｇ－（１－７）誘発抗侵害受容作用を増強する相加効果はさらに研究されていないが、ＡＴ１受容体へのＡｎｇ－（１－７）の結合を阻止し、それによってＭａｓ受容体に結合するためのＡｎｇ－（１－７）の遊離濃度を増加させるロサルタンの能力から生じる可能性がある。
【0135】
確立されたＣＩＢＰにおけるＡｎｇ－（１－７）投与は営巣行動を変えない。
【0136】
営巣は、マウスの先天的な行動であり、さまざまな疼痛の状態によって妨げられる。関節切開術とＡｎｇ－（１－７）投与の両方が営巣行動に及ぼす効果を評価した。動物の個々のケージの６つのゾーンに６つの同じ大きさの巣材の小片を入れた。動物が巣材の小片を一掃したゾーンの数を１００分の時間経過にわたって記録した（図１０Ａ）。手術後６日目の試験の最初の１時間の間に、６６．１接種動物はナイーブ動物より有意に少ないゾーンを一掃した（ｐ＜０．０５）。研究の２時間後、培地動物は、ナイーブ動物と６６．１接種動物の両方よりも少ないゾーンを一掃した（ｐ＜０．０５）。手術後１５日目に、Ａｎｇ－（１－７）（０．０５８μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはビヒクル（０．９％食塩水）で処理した６６．１接種動物に対し、第２の試験を実施した（図１０Ｂ）。両方の処理されたがん群の営巣行動はナイーブ群と有意に異ならなかった。しかしながら、７５分と９０分の両方の時点で、培地動物は他の群よりも少ないゾーンを一掃した（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、確立されたＣＩＢＰを有する動物の営巣はマウスの営巣行動を変えるが、Ａｎｇ－（１－７）投与はこれらの複雑な行動をさらに変えないことを実証する。
【0137】
ナイーブマウスにおいてＡｎｇ－（１－７）投与は抗侵害受容を引き起こすが運動障害は引き起こさない
【0138】
Ａｎｇ－（１－７）をナイーブマウスに全身投与した（０．３６０、１、１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。サーマル尾フリック待ち時間のわずかではあるが有意な増加が観察された（データ示さず）。Ａｎｇ－（１－７）の効果は、１μｇ／ｋｇのＡｎｇ－（１－７）（ＭＰＥ＝２７．８％、ｐ＜０．００１）及び１０μｇ／ｋｇのＡｎｇ－（１－７）（ＭＰＥ＝２０．２％、ｐ＜０．０１）による投与後１５～３０分でピークに達し、それは９０～１２０分の間にベースラインに戻った。
【0139】
Ａｎｇ－（１－７）投与が尾引き込み待ち時間を増加させるために運動性を低下させる可能性を排除するために、ロータロッド試験を実施した。ナイーブ動物は回転するロッドの上を２分間歩くように訓練された。訓練後、Ａｎｇ（１－７）を、脊髄（０．３ｐｍｏｌ／５μＬ）または全身経路（０．０５８及び１０μｇ／ｋｇ）のいずれかで動物に注射した。ビヒクルマウスとＡｎｇ－（１－７）処理マウスとの間でロータロッド待ち時間の有意差は観察されなかった（結果は示されていない；ｐ＝０．９９ ｉ．ｔ．；ｐ＝０．１８ ｉ．ｐ．）。まとめると、これらのデータは、全身性Ａｎｇ－（１－７）が単回投与後に運動性に顕著な影響を与えることなく抗侵害受容性であることを示唆している。
【0140】
ＭａｓＲは、後根神経節及び大腿骨押出物において発現する。
【0141】
同側腰椎後根神経節（ＤＲＧ）及び大腿骨押出物を、ナイーブ、偽、がん（６６．１）、及び６６．１ Ａｎｇ－（１－７）処理マウスから採取した。ナイーブマウスでは、ＭａｓＲは後根神経節で発現し（図１１Ａ）、ＭａｓＲバンドは、約５０ｋＤａ及び約４０ｋＤａで観察された。偽手術（すなわち、培地のみ）または大腿骨髄内間隙へのマウス乳腺癌株６６．１の導入は、反対側の対照ＤＲＧと比較して同側ＤＲＧにおけるＭａｓＲ発現レベルを顕著には変化させなかった（図１１Ｂ）。ＭａｓＲはまた、同じマウスの大腿骨押出物において発現することが見出された（図１１Ｃ）。６６．１細胞の接種は、約５０ｋＤａと約４０ｋＤａの両方で大腿骨押出物中のＭａｓＲの発現を有意に増加させた（偽群と比較してｐ＜０．００１）が、偽手術は大腿骨押出物中のＭａｓＲの発現をナイーブ動物群と比較して有意に変えなかった（図１１Ｄ）。
【0142】
Ａｎｇ－（１－７）の反復投与は、確立されたＣＩＢＰを有するマウスの腫瘍量を変えることも、インビトロで細胞生存率を変えることもない。
【0143】
Ａｎｇ－（１－７）の反復投与による抗侵害受容効果が抗新生物活性に起因するかどうかを判定するために腫瘍量を評価した。慢性投与試験の後、大腿骨を動物から採取し、脱灰し、そして切片化（５ミクロン）及びヘモトキシリン／エオシン染色の前にパラフィンブロックに包埋した（図１２Ａ）。がん細胞を含む骨の領域は、全骨髄内含有量として定量化され、骨内の全細胞のパーセンテージとして表された。Ａｎｇ－（１－７）の反復投与は、生理食塩水処理群と比較して、骨の腫瘍パーセントを有意に増加も減少もさせなかった（ｐ＝０．３、ｎ＝３～５）（図１２Ｂ）。したがって、Ａｎｇ－（１－７）の反復投与は大腿骨内の腫瘍量に有意な影響を及ぼさず、抗侵害受容作用が抗新生物活性の二次的なものである可能性は低い。
【0144】
インビボでの知見を検証するために、６６．１細胞生存率に対するＡｎｇ－（１－７）の効果をインビトロで評価した。６６．１細胞をビヒクルまたは漸増濃度のＡｎｇ－（１－７）（１、１０、１００、または１０００ｎｇ）で２４時間処理し、ＸＴＴ細胞生存率アッセイを実施した。ビヒクル処理細胞と比較して（相対吸光度（ＲＡ±ＳＤ）＝１．０２±０．０９）、４つのＡｎｇ－（１－７）処理の各々は細胞生存率を顕著には変化させなかった（１ｎｇ：０．９３±０．１１；１０ｎｇ：０．９３±０．０７；１００ｎｇ：０．７８±０．１１、１０００ｎｇ：０．９３±０．１３）。まとめると、これらのデータは、試験した用量／濃度でのＡｎｇ－（１－７）がインビボとインビトロの両方で腫瘍細胞増殖を促進せず、腫瘍細胞死も引き起こさないことを示している。
【0145】
Ａｎｇ－（１－７）の反復投与は、確立されたＣＩＢＰを有するマウスの骨リモデリングに影響を及ぼさない。
【0146】
手術後０、７、１０、及び１４日目に慢性処理動物すべてのＸ線画像を撮影して、確立されたＣＩＢＰを有するマウスの骨リモデリングに対してＡｎｇ－（１－７）の反復投与が影響するかどうかを判定した（図１３Ａ）。１４日目の画像は、３人の盲検化観察者により、以下のスケールで採点された：０－健康な骨、１－１～３の病巣；２－４～６の病変；３－単皮質骨折；４－両皮質骨折（図１３Ｂ）。健康な骨は目に見える病変または骨折のないものとして定義され、そして病変は骨端板の下の暗い穴のようなスポットとして定義された。いずれの動物も両皮質骨折を経験しなかったが、食塩水とＡｎｇ－（１－７）とで処理したがん接種動物の両方は、単皮質骨折を経験した。偽処理（培地）動物（１６匹中７匹）は０のスコアを受けた。骨リモデリングの別のマーカーとして、血清中のカルボキシ末端コラーゲン架橋（ＣＴＸ）のレベルを定量した（図１３Ｃ）。がん接種は両方の培地対照と比較して骨におけるＣＴＸレベルを有意に増加させた（ｐ＜０．０５、ｎ＝３～４）が、Ａｎｇ－（１－７）反復投与は６６．１食塩水処理群と比較してＣＴＸレベルを有意に変化させなかった。全体として、確立されたＣＩＢＰを有するマウスにおける毎日のＡｎｇ－（１－７）投与は、同側大腿骨の骨リモデリングに有意な影響を及ぼさなかった。
【0147】
実施例５：Ａｎｇ（１－７）誘導体は急性及び炎症性疼痛を軽減する
【0148】
Ｍａｓ受容体アゴニストの効果を急性炎症性疼痛のモデルで調べた。低用量のＰＮ－Ａ５が、天然のＡｎｇ（１－７）及び高用量のＰＮ－Ａ５よりも炎症誘発性異痛を軽減するのにより効果的であることが発見された。
【0149】
１５～２０ｇの間のメスのＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ，ＵＳＡ）を、各動物についてのベースライン応答（「Ｐｒｅ－Ｃａｒ ＢＬ」）を確立するために、最初に上述のようなｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメント触覚異痛試験に供した。各試験対象の右後肢に、５０μｌのカラギーナンを皮下注射した。カラギーナンの３時間後、各動物について未処理のベースライン応答（「ＢＬ」）を確立するために、対象を再びｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメントを用いて評価した。動物に、１、３、もしくは１０ｍｇ／ｋｇのＰＮ－Ａ５、１０ｍｇ／ｋｇの天然のＡｎｇ（１～７）、または生理食塩水ビヒクルのいずれかを腹腔内注射によって直ちに投与した（ｎ＝１０）。カラギーナン注射の１５、３０、４５、６０、９０、１２０、及び１８０分後に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメント試験を各動物に実施した。
【0150】
図１４Ａは、フィラメントに対する応答がカラギーナン注射後に増加することを示すｖｏｎ Ｆｒｅｙ応答（閾値）についての生データを提供する。図１４Ｂは、抗異痛％として表されるカラギーナン前ベースライン応答を使用して標準化されたｖｏｎ Ｆｒｅｙ閾値データを示し、０％は治療効果がないことを表し、１００％はカラギーナン誘発異痛の完全な回復を表す。図１４Ｃは、図１４Ｂに示すデータの曲線下面積（ＡＵＣ）のグラフ表示を提供する。これらのデータを総合すると、低用量のＰＮ－Ａ５（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）はカラギーナン誘発性異痛の実質的かつ統計的に有意な回復をもたらすのに対して、高用量のＰＮ－Ａ５及び天然のＡｎｇ（１－７）（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで投与）はそうならなかったことを示す。したがって、ＰＮ－Ａ５は炎症によって引き起こされる疼痛及び異痛を軽減する。
【0151】
実施例７：Ａｎｇ（１－７）とその誘導体のグリコシル化は薬物動態特性を改善する
【0152】
天然のＡｎｇ（１～７）を治療的に投与することの１つの既知の制限は、その比較的短い半減期及び比較的低い血液脳関門透過性である。以下の実験は合理的なドラッグデザインアプローチを使用して、血清半減期及びＢＢＢ透過性に対するＡｎｇ（１－７）及びその誘導体への様々なグリコシドの付加の効果を評価した。インビボでの安定性は、ペプチダーゼ及びグリコシダーゼに対する感受性、ならびに溶液中での凝集現象、ならびに膜吸収を含む広範な結合事象を含む、いくつかの要因によって影響を受ける。糖ペプチド薬物と生体膜との相互作用は、幾何学的形状とグリコシル化の程度の両方によって大きく影響される。同様のサイズの糖ペプチドＧＰＣＲアゴニストを用いた我々の以前の経験は、グリコシル化の程度（単糖対二糖）がＭＡＳ受容体との相互作用またはその活性化に大きな影響を与えないことを示している。
【0153】
Ａｎｇ（１－７）ベースの糖ペプチドの膜結合立体配座は、ｄ２５－ＳＤＳミセルの存在下での１Ｈ－ＮＭＲ ＮＯＥＳＹ測定によってインシリコでモデル化された。導出されたＨ－Ｈ距離制約を使用して、高度に両親媒性の折り畳み構造が特徴付けられた。図１５Ａに示すように、ＡＭＢＥＲ－９９力場を有するＭＯＥ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して溶媒接近可能表面積を構築し、得られたＵ字型折り畳み構造の両親媒性を示した。非荷電の親油性残基Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅは「Ｕ」の底にあって膜に挿入され、一方で荷電している「末端」が水性区画に突き出している。「両親媒性のモーメント」は矢印で示唆されている。
【0154】
図１５Ｂは、ＭｏＥ（登録商標）計算を示し、サッカリド及びペプチド鎖の結合幾何学形状が、Ｍａｓ受容体との「ドッキング」の前に、得られる両親媒性糖ペプチドと生体膜との相互作用を改変し得ることを示す。Ｄ－セリンまたはＬ－セリン、Ｄ－トレオニンまたはＬ－トレオニン、及びＤ－アロ－トレオニンまたはＬ－アロ－トレオニン、ならびにＤ－システインまたはＬ－システインは、グリコシドを膜の表面に対して異なる角度で配向させる。
【0155】
これらの計算に基づいて、天然のＡｎｇ（１－７）、Ｃ－末端アミノ基を有するＡｎｇ（１－７）（Ａｎｇ１－７－ＮＨ２；配列番号３；「ＰＮ－Ａ２」）、ＰＮ－Ａ５（Ａｎｇ１－６－Ｓｅｒ（ＯＧｌｃ）－ＮＨ２；配列番号１３）、及びＡｎｇ１－６－Ｓｅｒ（ＯＬａｃ）－ＮＨ２（Ａｎｇ１－６－Ｓｅｒ（ＯＬａｃ）－ＮＨ２；配列番号１３）を産生して血清半減期を試験した。血清半減期は、マウス血清中の１００μＭの各ペプチドを８時間インキュベートすることによって評価した。アリコートを示された時間間隔で取り出し、そしてペプチド濃度をＨＰＬＣ－ＭＳを使用して決定し、初期濃度のパーセンテージとして表した。図１６及び表２に示すように、グリコシル化は、Ａｎｇ（１－７）誘導体の血清半減期を有意に改善した。
【表2】
【0156】
これらの知見に基づいて、インビボでの血清安定性及びＢＢＢ透過を、Ａｎｇ（１－７）及びＰＮ－Ａ５についてインビボで評価した。ペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を個々にナイーブマウスに皮下注射した。血清濃度は、２０～３０μｌの血液サンプルを使用してＨＰＬＣ－ＭＳにより１０分毎に決定した。Ａｎｇ（１－７）及びＰＮ－Ａ５は、それぞれ約２００ｎＭ及び約３，５００ｎＭの最大血清濃度に達することが見出された（図１７Ａ）。微小透析プローブを介してＣＳＦ試料を同じ動物から同時に採取し、ペプチド濃度についてアッセイし、そして基準ＣＳＦレベルについて補正した。Ａｎｇ（１－７）及びＰＮ－Ａ５は、それぞれ約５０ｎＭ及び約４００ｎＭの最大ＣＳＦ濃度に達することが見出された（図１７Ｂ）。
【0157】
上述の本発明の議論は、例示及び説明を目的として提示されている。上述は、本発明を本明細書に開示された形態または複数の形態に限定することを意図したものではない。本発明の説明は、１つ以上の実施形態ならびに特定の変形形態及び修正形態の説明を含んでいるが、他の変形形態及び修正形態は、例えば、本開示の理解後に当業者の技術及び知識の範囲内であり得るように本発明の範囲内である。特許請求の範囲に記載されたものに対する、代替の、交換可能な、及び／または同等の構造、機能、範囲、またはステップを含む、許される範囲までの代替の実施形態を含む権利を得ることが、そのような代替の、交換可能な、及び／または同等の構造、機能、範囲、またはステップが本明細書に開示されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲に記載された主題を公に捧げることを意図せずに、意図されている。本明細書で引用される全ての参照文献は、参照により、その全ての内容が本明細書に組み込まれる。
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
実施形態１
対象における疼痛状態を治療するための方法であって、治療有効量の、式：Ａ １ －Ａ ２ －Ａ ３ －Ａ ４ －Ａ ５ －Ａ ６ －Ａ ７ －Ａ ８ （配列番号１）を有するオリゴペプチドを投与することを含み、
式中、
Ａ １ が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ２ が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ３ が、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群より選択され；
Ａ ４ が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ５ が、イソロイシン、バリン、アラニン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ６ が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ７ が、プロリン、グリシン、セリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ８ は存在しても不在でもよく、Ａ ８ 存在するとき、Ａ ８ が、セリン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択される、
前記方法。
実施形態２
前記疼痛状態が、急性疼痛、外傷による疼痛、歯痛、原発性腫瘍または転移性腫瘍のいずれかに起因するがん誘発性骨痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、炎症性疼痛、脳卒中による疼痛、外傷性神経因性疼痛、多発性硬化症による疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、及び複合性局所疼痛症候群からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記疼痛状態が、がん誘発性骨痛である、実施形態１に記載の方法。
実施形態４
Ａ １ ～Ａ ８ のうちの少なくとも１個が、単糖類または二糖類によってグリコシル化されている、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
実施形態５
Ａ ８ が単糖類または二糖類によってグリコシル化されているか、またはＡ ８ が不在であり、かつＡ ７ 単糖類または二糖類によってグリコシル化されている、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態６
単糖類または二糖類のうちの少なくとも１つが、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコース、ラムノース、ラクトース、セロビオース、及びメリビオースからなる群から選択される、実施形態４～５のいずれかに記載の方法。
実施形態７
（ａ）Ａ ７ がセリンもしくはそのグリコシル化形態であり、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ８がセリンもしくはそのグリコシル化形態である、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
実施形態８
（ａ）Ａ ７ がグルコースもしくはラクトースによってグリコシル化され、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ ８ がグルコースもしくはラクトースによってグリコシル化されている、実施形態７に記載の方法。
実施形態
（ａ）Ａ ７ がアミノ基で終端し、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ ８ がアミノ基で終端している、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。
実施形態１０
前記オリゴペプチドが、ＰＮ－Ａ２、ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、ＰＮ－Ａ５、及びＰＮ－Ａ６からなる群から選択される、実施形態１～９のいずれかに記載の方法。
実施形態１１
前記オリゴペプチドがＰＮ－Ａ５である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記オリゴペプチドがＰＮ－Ａ６である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１３
前記オリゴペプチドが少なくとも１個のＤ－アミノ酸を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
実施形態１４
各々のアミノ酸がＤ－アミノ酸である、実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
実施形態１
対象における疼痛状態を治療するための方法であって、治療有効量の、式：Ａ １ －Ａ ２ －Ａ ３ －Ａ ４ －Ａ ５ －Ａ ６ －Ａ ７ －Ａ ８ （配列番号１）を有するオリゴペプチドを投与することを含み、
式中、
Ａ １ が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ２ が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ３ が、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群より選択され；
Ａ ４ が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ５ が、イソロイシン、バリン、アラニン、ロイシン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ６ が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ７ が、プロリン、グリシン、セリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択され；
Ａ ８ は存在しても不在でもよく、Ａ ８ 存在するとき、Ａ ８ が、セリン、トレオニン、ヒドロキシプロリン、及びそれらのグリコシル化形態からなる群から選択される、
前記方法。
実施形態２
前記疼痛状態が、急性疼痛、外傷による疼痛、歯痛、原発性腫瘍または転移性腫瘍のいずれかに起因するがん誘発性骨痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、炎症性疼痛、脳卒中による疼痛、外傷性神経因性疼痛、多発性硬化症による疼痛、関節リウマチ、変形性関節症、及び複合性局所疼痛症候群からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３
前記疼痛状態が、がん誘発性骨痛である、実施形態１に記載の方法。
実施形態４
Ａ １ ～Ａ ８ のうちの少なくとも１個が、単糖類または二糖類によってグリコシル化されている、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
実施形態５
Ａ ８ が単糖類または二糖類によってグリコシル化されているか、またはＡ ８ が不在であり、かつＡ ７ 単糖類または二糖類によってグリコシル化されている、実施形態１～４のいずれかに記載の方法。
実施形態６
単糖類または二糖類のうちの少なくとも１つが、グルコース、ガラクトース、キシロース、フコース、ラムノース、ラクトース、セロビオース、及びメリビオースからなる群から選択される、実施形態４～５のいずれかに記載の方法。
実施形態７
（ａ）Ａ ７ がセリンもしくはそのグリコシル化形態であり、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ８がセリンもしくはそのグリコシル化形態である、実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
実施形態８
（ａ）Ａ ７ がグルコースもしくはラクトースによってグリコシル化され、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ ８ がグルコースもしくはラクトースによってグリコシル化されている、実施形態７に記載の方法。
実施形態
（ａ）Ａ ７ がアミノ基で終端し、かつＡ ８ が不在であるか、または（ｂ）Ａ ８ がアミノ基で終端している、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。
実施形態１０
前記オリゴペプチドが、ＰＮ－Ａ２、ＰＮ－Ａ３、ＰＮ－Ａ４、ＰＮ－Ａ５、及びＰＮ－Ａ６からなる群から選択される、実施形態１～９のいずれかに記載の方法。
実施形態１１
前記オリゴペプチドがＰＮ－Ａ５である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２
前記オリゴペプチドがＰＮ－Ａ６である、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１３
前記オリゴペプチドが少なくとも１個のＤ－アミノ酸を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
実施形態１４
各々のアミノ酸がＤ－アミノ酸である、実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】