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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-02-28
(45)【発行日】2023-03-08
(54)【発明の名称】ヒドロキシカルボン酸のグリセリドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07C 67/03 20060101AFI20230301BHJP
C07C 69/675 20060101ALI20230301BHJP
A23L 33/12 20160101ALI20230301BHJP
A61K 31/22 20060101ALI20230301BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20230301BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230301BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230301BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20230301BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230301BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230301BHJP
A61P 1/14 20060101ALI20230301BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230301BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20230301BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230301BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230301BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230301BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230301BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230301BHJP
C07B 61/00 20060101ALN20230301BHJP
【ＦＩ】
C07C67/03
C07C69/675
A23L33/12
A61K31/22
A61P3/00
A61P9/00
A61P9/10
A61P9/04
A61P21/00
A61P1/04
A61P1/14
A61P3/10
A61P3/06
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/16
A61P35/00
A61P29/00 101
A61P19/02
C07B61/00 300
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021540149
(86)(22)【出願日】2019-01-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-14
(86)【国際出願番号】 EP2019051539
(87)【国際公開番号】W WO2020147978
(87)【国際公開日】2020-07-23
【審査請求日】2021-10-21
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2019/051116
(32)【優先日】2019-01-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521302113
【氏名又は名称】アイオーアイ オレオ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100069073
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 和保
(72)【発明者】
【氏名】ロッホマン、ディルク
(72)【発明者】
【氏名】ライアー、セバスチャン
(72)【発明者】
【氏名】シュテーア、ミヒャエル
【審査官】奥谷 暢子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００８／００５８１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００４－５０７５７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９５／００９１４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１４１０４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｃ
Ａ２３Ｌ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ０７Ｂ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラジカルＲ１が、水素またはＣ１－Ｃ４アルキルを示す一般式（Ｉ）ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ （Ｉ）
で示される少なくとも１つの化合物が、
一般式（ＩＩ）
ＣＨ２（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２（ＯＨ） （ＩＩ）
のグリセロール（１，２，３－プロパントリオール）と反応すること、
前記反応は、触媒としての酵素の存在下で実行されること、そして
前記反応は、溶媒の非存在下で実行されること、
これによって、反応生成物として、
一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドの混合物が得られること、
一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただしラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さないこと、
前記反応生成物は、１０－８０／１０－７０／０．１－２０の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド（３－ＢＨＢ－ＭＧ）、３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリド（３－ＢＨＢ－ＤＧ）および３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリド（３－ＢＨＢ－ＴＧ）を含むこと、
前記反応の間、一般式（ＩＶ）
Ｒ１－ＯＨ （ＩＶ）
による化合物が同時に形成され、この一般式（ＩＶ）において、ラジカルＲ１が水素またはＣ１－Ｃ４アルキルを示すこと、一般式（ＩＶ）による化合物は、前記反応から継続的に回収されることを特徴とする３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドを製造する方法。
【請求項2】
一般式（Ｉ）の化合物として、式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５の３－ヒドロキシ酪酸エチルエステルが使用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記触媒は反応後に再利用されること；そして前記酵素は、シンテターゼ、カタラーゼ、エステラーゼ、リパーゼおよびそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
ここで、一般式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）のグリセロールは、１：１～１０：１の範囲内の一般式（Ｉ）／式（ＩＩ）のグリセロールの化合物のモル比において使用されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項5】
得られた反応生成物は、前記反応が実行された後、分画されること；第１の画分が、７０－９５／５－３０／０．０１－２の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比を有し、第２の画分が、５－３０／２０－８０／５－４０の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比を有することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項6】
一般式（ＩＩＩ）ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）-ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの混合物であって、
一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４が、それぞれお互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただしラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが水素を示さないこと、
前記混合物が、１０－８０／１０－７０／０．１－２０の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド（３－ＢＨＢ－ＭＧ）、３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリド（３－ＢＨＢ－ＤＧ）および３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリド（３－ＢＨＢ－ＴＧ）を含むことを特徴とする混合物。
【請求項7】
請求項６に記載の混合物を含む医薬組成物。
【請求項8】
医薬組成物は薬物または薬剤であることを特徴とする請求項７記載の医薬組成物。
【請求項9】
人体または動物の体の疾患の予防的または治療的治療に使用するための請求項７または８記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記疾患は、エネルギー代謝の障害に関連する疾患、ケトボディ代謝に関連する疾患、頭蓋脳外傷、脳卒中、低酸素症、心筋梗塞、リフィーディング症候群、食欲不振、てんかん、神経変性疾患、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脂肪代謝疾患、グルコーストランスポーター欠損症（ＧＬＵＴ１欠損症）、超長鎖脂肪酸酸化障害（ＶＬ－ＦＡＯＤ）、ミトコンドリア病、ミトコンドリアチオラーゼ欠損症、ハンチントン病、癌、T細胞リンパ腫、星状細胞腫、膠芽腫、ＨＩＶ、リウマチ性疾患、関節リウマチ、尿路関節炎、消化管疾患、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ライソゾーム病、スフィンゴリピドー症、ニーマンピック病、糖尿病、化学療法の効果または副作用から選択されることを特徴とする請求項９記載の医薬組成物。
【請求項11】
請求項６に記載の混合物を含むことを特徴とする食品生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ケト体および関連する代謝の分野ならびに関連する疾患の治療に関する。
【0002】
特に、本発明は、３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドを生成する方法、ならびにこのようにして得られる反応生成物またはこのように調製された反応生成物（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸のグリセリド）および、特に薬物または医薬品などの医薬組成物におけるそれらの使用、または食品および／または食品生成物、ならびにそれらのさらなる用途または用途に関する。
【0003】
さらに、本発明は、本発明の方法に従って得られるまたは生成される反応生成物（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸のグリセリド）を含む医薬組成物、特に薬物または薬剤、ならびにそれらの用途または使用に関する。
【0004】
最後に、本発明は、食品および／または食品生成物、特に食品サプリメント、機能性食品、新規食品、食品添加物、食品サプリメント、ダイエット食品、パワースナック、食欲抑制剤、ならびに強度および／または耐久性スポーツサプリメント、本発明の方法に従って入手可能または製造される反応生成物（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸のグリセリド）、ならびにそれらの用途または使用に関する。
【背景技術】
【0005】
人間のエネルギー代謝において、ブドウ糖は短期的に利用可能なエネルギー担体であり、水と二酸化炭素を放出することによってミトコンドリア内でエネルギーに代謝される。肝臓のグリコーゲン貯蔵は、夜の睡眠期間中にすでに空になる。しかしながら、特に人間の中枢神経系（ＣＮＳ）と心臓は、永続的なエネルギー供給を必要とする。
【0006】
主に中枢神経系で利用できるブドウ糖の生理学的代替物は、いわゆるケト体（同義語でケトン体とも呼ばれる）である。
【0007】
ケト体という用語は、特に３つの化合物の総称であり、主に異化代謝状態（空腹、減量食、低炭水化物食など）で形成され、ケトーシス（ケトン症）を生じるものである。ケト体という用語には、特に３つの化合物、アセトアセテート（同義語でアセタセテートとも呼ばれる）およびアセトン並びに３－ヒドロキシ酪酸（以下、ベータ－ヒドロキシ酪酸またはＢＨＢまたは３－ＢＨＢとも呼ばれる）またはその塩（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸またはベータヒドロキシ酪酸）を含むものであり、後者は前述の３つの化合物の中で最も重要である。３－ヒドロキシ酪酸またはその塩は、生理学的に（Ｒ）－エナンチオマーとして、すなわち（Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸（同義語として、３位のキラリティーの中心を強調するために（３Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸とも呼ばれる）またはその塩を生じる。
【0008】
これらのケト体はまた、断食時または飢餓の間に脂肪分解によって体内に蓄積された脂質から生理学的に大量に提供され、エネルギー源のグルコースとほぼ完全に置き換えられる。
【0009】
ケト体は、ベータ酸化に由来するアセチル補酵素Ａ（＝アセチル－ＣｏＡ）から肝臓において形成される；それらは、人体においてアセチル補酵素Ａの輸送可能な形を示している。しかし、ケト体を利用するためには、脳と筋肉は、ケト体をアセチル補酵素Ａに戻すために要求される酵素を発現させることに最初に適応する必要がある。特に空腹時には、ケト体は、著しい量のエネルギー生産に貢献する。たとえば、しばらくすると、脳は１日のブドウ糖量の３分の１しか摂取できなくなる。
【0010】
生理学的に、ケト体は、脂肪酸分解の通常の中間生成物であるアセチル補酵素Ａの形の活性化酢酸の２つの分子から合成され、前記中間生成物は、アセチル補酵素Ａ単体と酵素ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼを使用して、中間生成物３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）に延出し、最後にＨＭＧ－ＣｏＡ－リアーゼがアセト酢酸を切断する。これらの３つのステップは、肝臓のミトコンドリア（リネンサイクル）でのみ行われ、３－ヒドロキシ酪酸は最終的にＤ－ベータ－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼによってサイトゾルにおいて形成される。ＨＭＧ－ＣｏＡは、アミノ酸ロイシンの分解の最終生成物でもあると同時に、アセトアセテートは、アミノ酸フェニルアラニンとチロシンの分解中に形成される。
【0011】
自発的な脱炭酸は、アセトアセテートをアセトンに変化させる；それは、糖尿病患者や食事制限者の呼吸の中で時々知覚される。それは、身体においてさらに使用されることはできない。しかしながら、ケト体内のアセトンの割合は、非常に少ない。
【0012】
したがって、アセトアセテートは、生理学的に適切な形態の３ヒドロキシ酪酸または３－ヒドロキシ酪酸に還元的に変換されるが、二酸化炭素の放出を伴う生理学的に使用できないアセトンに分解することもでき、これは、重度のケトーシス、ケトアシドーシスにおいて（例えば、インスリン置換のない１型糖尿病患者において）、尿中、および呼気中で検出可能であり、嗅覚的に知覚可能である。
【0013】
３－ヒドロキシ酪酸は、現在、ナトリウム、マグネシウム、またはカルシウム塩としてウエイトトレーニング部門で使用され、市販されている。
【0014】
しかしながら、植物が３－ヒドロキシ酪酸を生成せず、動物の組織における３－ヒドロキシ酪酸が、ケトーシスにおいて死んで衰弱した動物でのみ発生するため、３－ヒドロキシ酪酸は知られていないか、進化の観点から人間にはごく少量しか存在しないことから、３－ヒドロキシ酪酸は、経口投与すると吐き気を引き起こす。遊離酸とその塩の形の３－ヒドロキシ酪酸も非常に苦味があり、重度の嘔吐や吐き気を引き起こす可能性がある。
【0015】
さらに、患者、特に新生児だけでなく、成人でさえも、これらの化合物が腎臓に損傷を与える可能性があるため、３－ドロキシ酪酸の大量の塩に恒久的に耐えることができない。
【0016】
さらに、３－ヒドロキシ酪酸とその塩の血漿半減期は、たとえ数グラムを摂取したとしても、ケトーシスが約３～４時間の間でしか持続しないため、非常に短いこと、つまり患者が、特に夜間において、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩による治療の恩恵を継続的に受けることができないものである。代謝性疾患の場合、これは生命を脅かす状況につながる可能性がある。
【0017】
したがって、そのような代謝性疾患の場合、いわゆる中鎖トリグリセリド、いわゆるＭＣＴが、現在ケト原性療法について使用される。すなわちカプロン酸、カプリル酸、およびカプリン酸の（すなわち飽和線状Ｃ６－，Ｃ８－，Ｃ１０－脂肪酸の）代謝変換が意図される。
【0018】
しかし、基本的には、製薬および臨床の観点から、３－ヒドロキシ酪酸はより効果的な医薬品－薬理学的目標分子であり、先行技術によれば、原則として多数の疾患の治療に使用できるが、生理的適合性がないため使用できない（例えば、エネルギー代謝の機能不全に関連する疾患、特にケト体代謝、または認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、脂肪代謝性疾患など）。
【0019】
次の表は、純粋に例示的なものを示しているが、有効成分３－ヒドロキシ酪酸の潜在的な治療オプションまたは可能な症状を限定するものではない。
【0020】
【表1】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0021】
したがって、特に人体または動物の身体の生理学的代謝において、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩への直接的または間接的なアクセスを生理学的に可能にする効果的な前駆体または代謝物を見つけることができることが、製薬および臨床の観点から望ましい。
【0022】
その結果、従来技術は、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩の生理学的に適切な前駆体または代謝産物を見つけるという試みを欠いてはいない。しかしながら、これまでのところ、従来技術において効率的な化合物は見出されていない。また、そのような化合物へのアクセスは、先行技術によれば可能ではなく、または容易に可能ではない。
【0023】
したがって、本発明の根底にある課題は、３－ヒドロキシ酪酸（すなわち、ベータ－ヒドロキシ酪酸またはＢＨＢまたは３－ＢＨＢ）またはそれらの塩の生理学的に適切なまたは生理学的に適合性のある前駆体および／または代謝産物を生成するための効率的な方法の提供である。
【0024】
そのような方法は、特に、効率的な方法でアクセス可能な、特に大量に、そして大量の有毒な副産物なしに、それぞれのＢＨＢ前駆体および／またはＢＨＢ代謝物を製造しなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【0025】
完全に驚くべき方法で、出願人は、３－ヒドロキシ酪酸（ベータ－ヒドロキシ酪酸またはＢＨＢまたは３－ＢＨＢ）のグリセリドが、ケト体、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩のための効率的かつ生理学的に有効なまたは生理学的に適合性のある前駆体および／または代謝物を示すことを発見し、これに関して、これらの化合物に直接的かつ効果的に、特に経済的並びに工業的に実現可能なアクセスを可能にするこれら化合物の効果的な製造方法を見いだしまたは開発することができた。
【0026】
したがって、上記の問題を解決するために、本発明は、本発明の第１の態様によれば、請求項１に記載の３－ヒドロキシ酪酸（ベータ－ヒドロキシ酪酸またはＢＨＢまたは３－ＢＨＢ）のグリセリドを製造する方法を提案する；さらに、本発明の方法の特に特別なおよび／または有利な実施形態は、関連する従属請求項の主題である。
【0027】
さらに、本発明は、本発明の第２の態様によれば、独立請求項（請求項１５）による本発明の方法に従って得られる反応生成物、または独立請求項（請求項１７）による本発明の方法による前記３－ヒドロキシ酪酸の少なくとも２つのグリセリドの混合物に関する； さらに、本発明のこの態様の特に特別なおよび／または有利な実施形態は、関連する従属請求項の主題である。
【0028】
同様に、本発明は、本発明の第３の態様によれば、それぞれの独立請求項（請求項２２）による医薬組成物、特に薬物または薬剤に関する；さらに、本発明のこの態様の特に特別なおよび／または有利な実施形態は、関連する従属請求項の主題である。
【0029】
さらに、本発明は、本発明の第４の態様によれば、それぞれの独立請求項（請求項２４）による人体または動物体予防的および／または治療的処置のための、または疾患の予防的および／または治療的処置における使用のための本発明による反応生成物または混合物に関する。
【0030】
さらに、本発明は、本発明の第５の態様によれば、関連した独立請求項（請求項５）による予防的および／または治療的処置のため、または、人体または動物の身体の疾患の予防的および／または治療的処置のために医薬品を製造するための本発明による反応生成物または混合物の使用に関する。
【0031】
さらに、本発明は、本発明の第６の態様によれば、関連する独立請求項（請求項２６）による反応生成物または混合物の使用に関する。
【0032】
さらに、本発明は、本発明の第７の態様によれば、関連する独立請求項（請求項２７）による食品および／または食品に関する；さらに、本発明による食品および／または食品の特に特別なおよび／または有利な実施形態は、関連する従属請求項の主題である。
【0033】
最後に、本発明は、本発明の第８の態様によれば、関連する独立請求項（請求項２９）による食品および／または食品における本発明による反応生成物または混合物の使用に関する；さらに、本発明による使用の特に特別なおよび／または有利な実施形態は、使用のための関連する従属請求項の主題である。
【0034】
繰り返しを回避する目的で、本発明の１つの態様に関してのみ以下に列挙される特徴、実施形態、利点などは、別の言及を要求することなしに、本発明の他の態様にも適用されることは言うまでもない。
【0035】
さらに、本発明の個々の態様および実施形態はまた、本発明の他の態様および実施形態との任意の組み合わせ、特に、すべての後方参照から生じるため、特徴および実施形態の任意の組み合わせで開示されると見なされ、特許請求の範囲は、結果として生じるすべての組み合わせの可能性に関しても広範囲に開示されていると見なされることは言うまでもない。
【0036】
以下に提供されるすべての相対的または百分率の重量ベースのデータ、特に相対的な量または重量データに関して、本発明の範囲内において、これらは、特に以下に定義するように、すべての成分または含有物を含めて、それぞれ合計が最大１００％または１００重量％となるように、常に当業者によって選択されるべきであることにさらに留意されたい；しかしながら、これは当業者にとって自明である。
【0037】
また、当業者は、本発明の範囲を離れることなく、必要に応じて、下記する範囲指定から逸脱することができる。
【0038】
さらに、以下に指定されるすべての値またはパラメータなどは、原則として、標準化または明示的に指定された測定方法、または当業者によく知られている決定または測定方法を使用して決定または識別できることが適用される。
【0039】
これを述べた上で、本発明を以下により詳細に説明する。
【0040】
したがって、本発明の主題は、本発明の第１の態様によれば、３－ヒドロキシ酪酸（ベータ－ヒドロキシ酪酸、ＢＨＢまたは３－ＢＨＢ）のグリセリドを製造するための方法であって、
ここで、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物
ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ （Ｉ）
ここで、一般式（Ｉ）において、ラジカルＲ１は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキル、特にＣ１～Ｃ４アルキル、好ましくはメチルまたはエチル、より好ましくはエチルであり、
一般式（ＩＩ）のグリセロール（１，２，３－プロパントリオール）
ＣＨ２（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２（ＯＨ） （ＩＩ）
と反応するため、
反応生成物として、一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の１つまたは複数のグリセリド
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
が得られ、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または一般式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、ラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さない。
ここで、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物
ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＲ１ （Ｉ）
ここで、一般式（Ｉ）において、ラジカルＲ１は、水素またはＣ１～Ｃ４アルキル、特にＣ１～Ｃ４アルキル、好ましくはメチルまたはエチル、より好ましくはエチルであり、
一般式（ＩＩ）のグリセロール（１，２，３－プロパントリオール）
ＣＨ２（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２（ＯＨ） （ＩＩ）
と反応するため、
反応生成物として、一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の１つまたは複数のグリセリド
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
が得られ、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または一般式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、ラジカルＲ２，Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さない。
【0041】
上記のように、出願人は、非常に驚くべきことに、このように生成された３－ヒドロキシ酪酸のグリセリド（以下、略して「ＢＨＢグリセリド」／「３－ＢＨＢグリセリド」または略して「ＢＨＢエステル」／「３－ＢＨＢエステル」と呼ぶ）が効果的であることを発見したことであり、３－ヒドロキシ酪酸またはそれらの塩の生理学的に適合性のある前駆体および／または代謝物は、それらが生理学的に適合性を有することから、製薬または臨床用途で大量に使用することもできるものである。
【0042】
本発明による製造方法を通じて効率的な方法で初めて入手可能である上記の３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドは、遊離の３－ヒドロキシ酪酸またはその塩に対する生理学的および薬理学的に適切な代替物を表す。
【0043】
従来の有機合成による３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドの製造は、３－ヒドロキシ酪酸が重合し、他の望ましくない副反応（例えば、脱水、分解など）を受ける傾向が高まるため、複雑で費用がかかる。本発明の範囲内で、特に単一のステップにおいて、望ましくない副反応なしに３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドを製造することができる効率的に機能する製造方法を初めて提供することが可能であった。
【0044】
したがって、本発明の方法は、既知の市販の、とりわけ生理学的に無害な成分または抽出物（出発化合物）から、３－ヒドロキシ酪酸の非毒性エステルを提供することを初めて可能にする。結果として得られたグリセリドは、特に胃および／または腸で生理学的に分解され、有効含有物または有効成分として目標分子「３－ヒドロキシ酪酸」またはその塩を放出または生成することができる。
【0045】
さらに、前述の３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドは、また、長期間にわたって大量に経口投与された場合（例えば、１日量５０ｇ以上の投与）でも適合性を確保するための許容可能な味を含む。
【0046】
同様に、本発明による製造方法は、有毒な不純物を含まない３－ヒドロキシ酪酸のグリセリドを提供することを可能にする。
【0047】
さらに、適切な開始材料を使用して、この方法をエナンチオ選択的に実行することもできる。例えば、本発明によれば、製造方法は、経口投与されたとき（すなわち、腎臓を介しての排除）に、患者の腎系に負担をかけないように、生物学的に関連する形態、すなわち（Ｒ）－エナンチオマーを、特に酵素触媒作用によって濃縮されることを可能にする。ただし、原則として、特定の条件下で使用されて、（Ｓ）－エナンチオマーを濃縮することも可能である。
【0048】
さらに、任意のさらなる処理または精製工程を含む本発明による製造方法は、経済的に操作され、また大規模に実行されるものである。
【0049】
特に、本発明の製造方法は、市販の開始化合物を使用し、さらに、大規模な実行の場合でさえ、比較的単純なプロセス管理を可能にする。
【0050】
例えばジケテン（例えば、ＷＯ９５／０９１４４Ａ１又はＷＯ９０／０２５４９Ａ１）、または複雑な多段階合成（例えば、ＵＳ６３０６８２１８Ｂ１）を使用する複雑な開始化合物および対応する保護基化学を使用する従来の従来技術の製造方法とは対照的に、本発明による製造方法は、そのような複雑な開始材料を使用せず、ただ１つのステップのみを使用する。それにもかかわらず、優れた生産量が本発明によって達成され、副生成物の形成が最小化または回避される。
【0051】
さらに、本発明の方法は単純で経済的である。特に、本発明による方法は、通常、溶媒の非存在下および／または溶媒なしで（すなわち、質量反応として、または物質内の反応として、またはいわゆるバルク反応として）実行される；その結果、得られた反応生成物は、溶媒で汚染されておらず、方法または反応が実行された後、費用がかかり且つエネルギーを消費する方法において、溶媒を除去して廃棄したり、再利用したりする必要はない。さらに、有毒な副産物は形成されない。
【0052】
本発明による製造方法は、通常、３－ヒドロキシ酪酸の異なるグリセリドの混合物、すなわち、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの少なくとも２つの混合物を生じる。結果として生じる生の反応生成物または生のグリセリド混合物は、公知の方法によって、特に残存する開始化合物および／または存在する副生成物を除去することによって精製され、必要に応じて公知の方法によって、特に蒸留および／またはクロマトグラフィーによって分離されるものである（例えば、個々のグリセリド、すなわち３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドへの分別、または個々のグリセリドの濃縮且つ消耗部分を有する画分への分別、または一方でモノグリセリドとジグリセリド、他方でトリグリセリドの混合物への分別、あるいは一方でモノグリセリド、他方ではジグリセリドとトリグリセリドへの混合物への分別、など）。
【0053】
本発明の特定の実施形態によれば、一般式（Ｉ）の化合物は、ラセミ形態または（Ｒ）エナンチオマーの形態のいずれかで使用することができる。（Ｒ）－配置は、一般式（Ｉ）の化合物の３位にあるキラル炭素原子を参照する。
【0054】
本発明によれば、一般式（Ｉ）において、ラジカルＲ１がエチルを表す場合が好ましい。
【0055】
換言すれば、本発明によれば、一般式（Ｉ）の化合物として、式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５の３－ヒドロキシ酪酸エチルエステル（３－ヒドロキシ酪酸エチル）が好ましい。
【0056】
これにより、特に効率的なプロセス制御と高生産性が可能になり、副生成物の形成が最小限に抑えられる。さらに、３－ヒドロキシ酪酸エチルエステルも大量に市販されており、遊離酸（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸）よりも効率的に変換することもできる。特に、３－ヒドロキシ酪酸エチルエステルは、開始化合物として酢酸エチルのクライゼン縮合によって、大規模に得ることができる。
【0057】
特に、本発明の方法において、反応は、溶媒の非存在下および／または溶媒なしで実行される。これは、反応が質量の反応として、または物質の反応として、またはいわゆるバルク反応として実行されることを意味する。これは、得られた反応生成物が溶媒で汚染されておらず、方法または反応が実行された後、費用がかかり、エネルギーを消費する方法において溶媒を除去して廃棄または再利用する必要がないという利点を有する。驚くべきことに、それにもかかわらず、この方法または反応は、著しい副生成物の形なしに、高い変換率および生産性で実行される。
【0058】
本発明の特定の実施形態によれば、前記反応は、触媒、特に酵素および／または金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で、優先的には酵素の存在下で実行されるものである。この特定の実施形態では、触媒は反応後に再利用されることが好ましい。
【0059】
しかしながら、この特定の実施形態の代替として、自己触媒的にまたは触媒の非存在下で反応を実行することも可能である。しかしながら、触媒の使用が好ましい。
【0060】
上記のように、本発明によれば、反応は、触媒としての酵素の存在下で実行することができる。
【0061】
これに関連して、酵素は、特に、シンテターゼ（リガーゼ）、カタラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、およびそれらの組み合わせから選択することができる。
本発明によれば、シンテターゼ（同義リガーゼ）は、特にリガーゼのクラスからの酵素である；リガーゼは、共有結合による２つ以上の分子の結合を触媒する酵素である。本発明の意味でのカタラーゼは、特に、過酸化水素を酸素および水に変換することができる酵素である。エステラーゼという用語は、特に、エステルをアルコールと酸に加水分解的に分解することができる酵素を示す（鹸化）；したがって、これらは特に加水分解酵素であり、脂肪分解エステラーゼはリパーゼとも呼ばれる。本発明の意味でのリパーゼは、特に、グリセリドなどの脂質から遊離脂肪酸を分解することができる酵素である（脂肪分解）。
本発明によれば、シンテターゼ（同義リガーゼ）は、特にリガーゼのクラスからの酵素である；リガーゼは、共有結合による２つ以上の分子の結合を触媒する酵素である。本発明の意味でのカタラーゼは、特に、過酸化水素を酸素および水に変換することができる酵素である。エステラーゼという用語は、特に、エステルをアルコールと酸に加水分解的に分解することができる酵素を示す（鹸化）；したがって、これらは特に加水分解酵素であり、脂肪分解エステラーゼはリパーゼとも呼ばれる。本発明の意味でのリパーゼは、特に、グリセリドなどの脂質から遊離脂肪酸を分解することができる酵素である（脂肪分解）。
【0062】
本発明の範囲内で、触媒として使用される酵素は、特にカンジダアンタルクティカ、ムコールミエヘイ（リゾムコールミエヘイ）、サーモマイセスランギノサス、カンジダルゴーサ、ニホンコウジカビ、シュードモナスフルオレッセンス、リゾープスデレマおよびシュードモナス属細菌およびそれらの組み合わせに由来することが可能であり、好ましくはカンジダアンタルクティカ、ムコールミエヘイ（リゾムコールミエヘイ）およびサーモマイセスランギノサスに由来するものである。
【0063】
特定の実施形態によれば、前記酵素は、固定化形態で、担体上に、特にポリマー担体上に、好ましくはポリマー有機担体上に、より好ましくは疎水性を有して、さらにより好ましくはポリ（メタ）アクリル樹脂系の担体上に固定化して使用することができる。
【0064】
一般的な触媒の使用に関して上で説明したように、酵素が触媒として使用される場合、反応後に酵素を再利用することが好ましい。
【0065】
本発明の製造方法の枠内で、触媒としての酵素の存在下で反応を実行する場合、１０℃～８０℃の範囲内、特に２０℃～８０℃の範囲、好ましくは２５℃～７５℃の範囲内、より好ましくは４５℃～７５℃の範囲内、さらにより好ましくは５０℃～７０℃の範囲内の温度で反応を実行することが好ましい。
【0066】
酵素を触媒として使用する場合、使用される酵素の量は広範囲で変動する可能性がある。特に、酵素は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の開始化合物の総量に基づいて、０．００１～２０重量％の範囲内、特に０．０１～１５重量％の範囲内、好ましくは０．１～１５重量％の範囲内、好ましくは０．５～１０重量％の範囲内の量で使用することができる。それにもかかわらず、本発明の範囲を離れることなく、個々の場合または特定の用途のために、上記の量から逸脱する場合もある。
【0067】
本発明の特定の実施形態によれば、反応が触媒としての酵素の存在下で実施される場合、加えられる圧力範囲は、また広い範囲内で変化し得る。特に、反応が触媒としての酵素の存在下で行われる場合、前記反応は、触媒としての酵素の存在下で、０．０００１バール～１０バールの範囲内、特に０．００１バール～５バールの範囲内、好ましくは０．０１バール～２バールの範囲内、より好ましくは０．０５バール～１バールの範囲内の圧力で、さらにより好ましくは約１バールの圧力で実行される。
【0068】
本発明の代替の実施形態によれば、反応は、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で実行することができる。
【0069】
金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で、反応が行われる本発明のこの代替実施形態によれば、触媒は、特に（ｉ）例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、ＮａＯＭｅ、ＫＯＭｅおよびＮａ（ＯＢｕ－ｔｅｒｔ．）のような塩基性触媒、特にアルカリまたはアルカリ土類水酸化物およびアルカリまたはアルカリ土類アルコール酸塩、（ｉｉ）例えば硫酸、塩酸、リン酸、硝酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸およびカルボン酸のような酸性触媒、特に鉱酸および有機酸、（ｉｉｉ）テトラブチレートチタン、スズ酸、酢酸亜鉛、三塩化アルミニウムおよびトリイソプロピルアルミニウムなどのルイス酸、特にチタン、スズ、亜鉛およびアルミニウム化合物に基づくルイス酸、および（ｉｖ）特にゼオライト、モンモリロナイト、モルデナイト、ハイドロタルサイト、アルミナなどのケイ酸鉱物、ゲルマネート、炭酸塩、酸化アルミニウム、およびそれらの組み合わせに基づく不均一系触媒、から選択することができる。
【0070】
この実施形態によれば、特にアルカリまたはアルカリ土類アルコール酸塩を触媒として使用することができる。
【0071】
特に、また、この実施形態によれば、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒に基づく触媒は、反応後に再利用されることが好ましい。
【0072】
本発明の特定の実施形態によれば、反応が、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で実行される場合、温度は、広い範囲内で変化させることができる。特に、反応は、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で、２０℃～１５０℃の範囲内、特に５０℃～１４０℃の範囲内、好ましくは７０℃～１３０℃の範囲内、より好ましくは８０℃～１２５℃の範囲内、さらにより好ましくは１００℃～１２０℃の範囲内の温度で実行することができる。
【0073】
さらに、またこの実施形態によれば、触媒（すなわち、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒）もまた、広い量範囲内で変化させることができる：例えば、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒に基づく触媒は、式（Ｉ）および（ＩＩ）の出発化合物の総量に基づいて、０．０１～３０重量％の範囲内、特に０．０５～１５重量％の範囲内、好ましくは０．１～１５重量％の範囲内、好ましくは０．２～１０重量％の範囲内の量で使用することができる。それにもかかわらず、本発明の範囲を離れることなく、特定の用途または個々の場合について上記の量から逸脱することも可能である。
【0074】
本発明のこの特定の実施形態によれば、反応が、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で実行される場合、圧力範囲は、広い範囲内で等しく変化し得る。特に、反応は、金属含有および／または金属ベースの酸性または塩基性触媒の存在下で、０．０００１バール～１０バールの範囲内、特に０．００１バール～５バールの範囲内、好ましくは０．０１バール～２バールの範囲内、より好ましくは０．０５バール～１バールの範囲内、さらにより好ましくは約１バールの圧力で実行することができる。
【0075】
開始材料または開始化合物の量に関する限り、これはまた、広い範囲内で変化させることができる。
【0076】
特に副生成物の最小化に関して、プロセスの経済性および方法の過程の最適化を考慮すると、一般式（ＩＩ）のグリセロールのヒドロキシル基に基づく一般式（Ｉ）の化合物が、等モル量から２００モル％のモル過剰までのモル量で、特に等モル量から１５０モル％のモル過剰までのモル量で、好ましくは等モル量から１００モル％のモル過剰までのモル量で使用されることが有利である。
【0077】
同様に、プロセスの経済性および方法の過程の最適化を考慮すると、特に副生成物を最小化することに関して、一般式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）のグリセロールが、１：１～１０：１の範囲内、特に２：１～８：１の範囲内、好ましくは３：１～６：１の範囲内において、一般式（Ｉ）の化合物／一般式（ＩＩ）のグリセロールのモル比で使用される場合が利益的である。
【0078】
本発明のより好ましい実施形態によれば、本発明は、３－ヒドロキシ酪酸（ベータ－ヒドロキシ酪酸、ＢＨＢまたは３－ＢＨＢ）のグリセリドを製造するための方法、特に上記で定義された方法に関するもので、
ここで、式（Ｉａ）
ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５ （ｉａ）
の少なくとも１つの化合物は、一般式（ＩＩ）
ＣＨ２（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２（ＯＨ） （ＩＩ）
のグリセロール（１，２，３－プロパトリオールと反応し、これによって、
一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つ又は複数のグリセリドが、反応生成物として得られ、そこで、一般式（ＩＩＩ）において、それぞれ互いに独立したラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４が、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さないものである。
ここで、式（Ｉａ）
ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）ＯＣ２Ｈ５ （ｉａ）
の少なくとも１つの化合物は、一般式（ＩＩ）
ＣＨ２（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２（ＯＨ） （ＩＩ）
のグリセロール（１，２，３－プロパトリオールと反応し、これによって、
一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つ又は複数のグリセリドが、反応生成物として得られ、そこで、一般式（ＩＩＩ）において、それぞれ互いに独立したラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４が、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さないものである。
【0079】
これに関連して、反応は、特に触媒、特に酵素の存在下で、特に上記で定義され、特に上述されたようにおよび／または特に上述された条件下で実行することができる。
【0080】
この手順は、特に高い生産性と副生成物形成の最小化に関連して、特に優れたプロセス効率とプロセス経済性を生じるものである。
【0081】
本発明に従って特に好ましい方法は、下記する反応または合成スキームによって示される（この反応または合成スキームにおいて、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが水素を示さないという条件付きである。
【0082】
【化1】
【0083】
本発明の製造方法に関して、反応中、一般式（ＩＶ）による化合物
Ｒ１－ＯＨ （ＩＶ）
が形成され、一般式（ＩＶ）において、ラジカルＲ１は、水素またはＣ１－Ｃ４アルキル、特にＣ１－Ｃ４アルキル、好ましくはメチルまたはエチル、より好ましくはエチルを示すものである。言い換えれば、水またはＣ１－Ｃ４アルコールは、一般式（Ｉ）の開始化合物に応じて、反応の過程で形成される。
Ｒ１－ＯＨ （ＩＶ）
が形成され、一般式（ＩＶ）において、ラジカルＲ１は、水素またはＣ１－Ｃ４アルキル、特にＣ１－Ｃ４アルキル、好ましくはメチルまたはエチル、より好ましくはエチルを示すものである。言い換えれば、水またはＣ１－Ｃ４アルコールは、一般式（Ｉ）の開始化合物に応じて、反応の過程で形成される。
【0084】
これに関して、一般式（ＩＶ）による化合物（すなわち、特に水またはＣ１－Ｃ４アルコール）が、特に蒸留による優先的に連続的な除去によって、特に連続的に回収される場合、好ましいまたは有利である。このようにして、反応平衡は効率的に反応生成物側にシフトする。それはまた、副産物形成の最小化または防止を含む。
【0085】
本発明によれば、反応生成物として、一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つ又は複数のグリセリドが得られ、
一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただしラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが水素を示さないのが条件である。
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つ又は複数のグリセリドが得られ、
一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただしラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが水素を示さないのが条件である。
【0086】
特に、本発明による製造方法では、上記で定義した一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の２つまたは３つの異なるグリセリドが得られる。
【0087】
特に、本発明の枠組みの中で、上記で定義された一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の少なくとも２つの異なるグリセリドの混合物が得られる。
【0088】
本発明の特定の実施形態によれば、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、および／またはトリグリセリドの混合物が、本発明による製造方法の範囲内で得られる。
【0089】
本発明によれば、反応生成物として、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物が、本発明の製造方法の範囲内で得られる。特に、前記混合物は、３－ヒドロキシ酪酸（３－ＢＨＢ－ＭＧ）のモノグリセリド、３－ヒドロキシ酪酸（３－ＢＨＢ－ＤＧ）のジグリセリドおよび３－ヒドロキシ酪酸（３－ＢＨＢ－ＴＧ）のトリグリセリドを、１０－８０／１０－７０／０．１－２０の範囲内、特に２０－７０／２０－６０／０．５－１５の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比において、具備することが好ましいものである。
【0090】
さらに、任意の所望の混合物を調製することができ、またはそれぞれの純粋なグリセリド（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸の純粋なモノグリセリドまたは３－ヒドロキシ酪酸の純粋なジグリセリドまたは３－ヒドロキシ酪酸の純粋なトリグリセリド）を、一般的な後処理および／または分離方法（例えば、クロマトグラフィー、蒸留など）によって得ることができる。また、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドと３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとの純粋な混合物をこのようにして得ることができる。
【0091】
本発明の製造方法の範囲内で、反応生成物の組成、特に一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の様々なグリセリドの存在およびその比率は、反応条件によって制御されおよび／または調節されることができる。特に、これは、反応温度（変換温度）を選択することによって、および／または、反応圧力（変換圧力）を選択することによって、および／または、タイプおよび／または、量に関してそのような触媒を提供することによって、および／または、開始化合物（抽出物）の量を選択することによって、および／または、上記で定義された一般式（ＩＶ）に従って化合物の除去を提供することによって、達成することができる。
【0092】
反応後、得られた反応生成物は、さらなる精製または後処理ステップに供することができる。
【0093】
これに関連して、得られた反応生成物は、反応が実行された後に分別することができ、特に蒸留によって分別することができる。特に、この実施形態では、反応生成物は、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの比率が高く、３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの比率が低い第１の低沸点画分、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドの割合が低く、３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとトリグリセリドの割合が高い第２の高沸点画分に少なくとも分離することができる。
【0094】
この点で、最初の、特に第１の低沸点留分は、特に、７０～９５／５～３０／０．０１～２の範囲内、特に７５－８５／１０－２５／０－１の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比を有し得る；特に、第２の高沸点留分は、特に５－３０／２０－８０／５－４０の範囲内、特に５－２０／４０－７５／１０－３０の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比を有し得る。
【0095】
本発明の特定の実施形態によれば、式（Ｉ）および／または（ＩＩ）の未反応の開始化合物は、反応生成物から分離することができ、その後、再利用することができる。
【0096】
前述のように、本発明による方法は、通常、溶媒の非存在下および／または溶媒なしで（すなわち、質量反応として、または物質内の反応としてまたはいわゆるバルク反応として）実行される。これには、得られた反応生成物が溶媒で汚染されておらず、方法または反応が実行された後、溶媒を除去して廃棄したり、費用とエネルギーを消費する方法で再利用したりする必要がないという利点がある。驚くべきことに、それにもかかわらず、この方法または反応は、高い変換率および生産性で進行し、少なくとも本質的に、著しい副生成物の形成はない。
【0097】
本発明の第２の態様によるさらなる主題は、本発明による方法によって得られる反応生成物である。
【0098】
特に、本発明の主題は、一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つまたは複数のグリセリドを含む反応生成物（すなわち、（化学）生成物または生成物混合物）であり、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、 ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つは水素を示さないことが条件である。
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の１つまたは複数のグリセリドを含む反応生成物（すなわち、（化学）生成物または生成物混合物）であり、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すが、ただし、 ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも１つは水素を示さないことが条件である。
【0099】
本発明の主題は、特に、本発明の方法によって得られる一般式（ＩＩＩ）
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の少なくとも２つのグリセリドの混合物であり、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すがただし、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さないことが条件である。
ＣＨ２（ＯＲ２）－ＣＨ（ＯＲ３）－ＣＨ２（ＯＲ４） （ＩＩＩ）
の３－ヒドロキシ酪酸の少なくとも２つのグリセリドの混合物であり、一般式（ＩＩＩ）において、ラジカルＲ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ互いに独立して、水素または式ＣＨ３－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－のラジカルを示すがただし、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つは水素を示さないことが条件である。
【0100】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法によって得られる、上記で定義された一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の２つまたは３つの異なるグリセリドを含む混合物である。
【0101】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法によって得られる、上記で定義された一般式（ＩＩＩ）の３－ヒドロキシ酪酸の少なくとも２つの異なるグリセリドを含む混合物である。
【0102】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法によって得られる３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物を含む混合物である。
【0103】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明による方法によって得られる３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物である。特に、前記混合物は、１０－８０／１０－７０／０．１－２０の範囲内、特に２０－７０／２０－６０／０．５－１５の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比において、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド（３－ＢＨＢ－ＭＧ）、３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリド（３－ＢＨＢ－ＤＧ）および３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリド（３－ＢＨＢ－ＴＧ）を含むことが好ましい。
【0104】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法に従って得られる３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物であり、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物は、７０－９５／５－３０／０．０１－２の範囲内、特に７５－８５／１０－２５／０－１の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比において、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドを含むものである。この特別な混合物は、特に画分蒸留によって、反応生成物混合物からの低沸点画分として得ることができる。
【0105】
さらに、本発明の別の特別な実施形態によれば、本発明の主題は、本発明の方法に従って得られる混合物であり、前記混合物は、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物を含み、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物は、５－３０／２０－８０／５－４０の範囲内、特に５－２０／４０－７５／１０－３０の範囲内の３－ＢＨＢ－ＭＧ／３－ＢＨＢ－ＤＧ／３－ＢＨＢ－ＴＧの重量比において、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドを含むものである。この特別な混合物は、特に画分蒸留によって、反応生成物混合物からの重沸点留分として得ることができる。
【0106】
上記のように、任意の混合物は、通常の後処理および／または分離方法（例えば、クロマトグラフィー、蒸留など）によって調製されるか、またはそれぞれの純粋なグリセリド（すなわち、３－ヒドロキシ酪酸の純粋なモノグリセリドまたは３－ヒドロキシ酪酸の純粋なジグリセリドまたは３－ヒドロキシ酪酸の純粋なトリグリセリド）を得ることができる。また、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドと３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとの純粋な混合物は、このようにして得られる。
【0107】
したがって、本発明のさらなる特別な実施形態による本発明の主題は、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドと３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとの混合物でもある。
【0108】
別の特別な実施形態によれば、３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドもまた、本発明の主題である。
【0109】
本発明によって得られたグリセリドの反応生成物または混合物は、従来技術と比較して、いくつかの利点および特別な特徴を含む。
【0110】
一方で、特に胃腸管において生理学的に３－ヒドロキシ酪酸またはその塩に変換され、他方で、それは、特に非毒性および許容可能な感覚刺激性特性に関して、良好な生理学的適合性または忍容性を同時に含むことから、本発明によって得られる反応生成物またはグリセリド混合物が、３－ヒドロキシ酪酸またはその塩の前駆体または代謝産物として適切であることを、出願人が見いだしたことは驚くべきことである。
【0111】
さらに、本発明による反応生成物またはグリセリド混合物は、商業的規模においてですら、合成ベースで大規模で、必要な医薬的または薬理学的品質で、容易に入手可能であるかまたは入手可能である。
【0112】
さらに、本発明による反応生成物またはグリセリド混合物は、必要に応じて、鏡像異性的に純粋なまたは鏡像異性的に濃縮された形態で提供することができる。
【0113】
したがって、本発明による反応生成物またはグリセリド混合物は、人体または動物体のケト体療法に関して、効率的な薬理学的薬物目標を示すものである。
【0114】
本発明のさらなる主題は、本発明の第３の態様によれば、本発明の製造方法に従って得られる、上記で定義された反応生成物を含む医薬組成物、特に薬物または薬剤であり、および／または、本発明の製造方法に従って入手可能な、上記で定義された混合物である。
【0115】
特に、本発明のこの態様によれば、本発明は、人体または動物体の疾患の予防的および／または治療的処置のための、または予防的および／または治療的処置における使用のための医薬組成物に関する。これは、特にエネルギー代謝の障害に関連する病気、特に頭蓋脳外傷、脳卒中、低酸素症などのケトボディ代謝、心筋梗塞、リフィーディング症候群、食欲不振、てんかんなどの心血管疾患、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、グルコーストランスポーター欠損症（ＧＬＵＴ１欠損症）、超長鎖脂肪酸酸化障害（ＶＬ－ＦＡＯＤ：Very Long chain Fatty Acid Oxidation Disorder）などの脂肪代謝性疾患、およびミトコンドリアチオラーゼ欠損症、ハンチントン病などのミトコンドリア病、Ｔ細胞リンパ腫、星状細胞腫、膠芽腫などの癌、ＨＩＶ、リウマチ性関節炎や尿路関節炎などのリウマチ性疾患、慢性炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病などの消化管の疾患、スフィンゴリピドー症などのライソゾーム病、特にニーマンピック病、糖尿病、そして化学療法の効果または副作用と関連している。
【0116】
この場合も、本発明のさらなる主題は、本発明の第４の態様によれば、特にエネルギー代謝の障害に関連する病気、特に頭蓋脳外傷、脳卒中、低酸素症などのケトボディ代謝、心筋梗塞、リフィーディング症候群、食欲不振、てんかんなどの心血管疾患、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、グルコーストランスポーター欠損症（ＧＬＵＴ１欠損症）、ＶＬ－ＦＡＯＤなどの脂肪代謝性疾患、およびミトコンドリアチオラーゼ欠損症、ハンチントン病などのミトコンドリア病、Ｔ細胞リンパ腫、星状細胞腫、膠芽腫などの癌、ＨＩＶ、リウマチ性関節炎や尿路関節炎などのリウマチ性疾患、慢性炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病などの消化管の疾患、スフィンゴリピドー症などのライソゾーム病、特にニーマンピック病、糖尿病、そして化学療法の効果または副作用と関連している疾患に関する予防的および／または治療的処置のための本発明の製造方法によって取得可能な上記に定義する反応生成物、および／または、本発明の製造方法によって取得可能な上記に定義する混合物である。
【0117】
同様に、本発明のさらなる主題は、本発明の第５の態様によれば、本発明の製造方法によって取得可能な上記に定義される反応生成物、および／または、予防的および／または治療的処置のためのまたは人体または動物体の疾患の予防的および／または治療的処置のために薬剤を製造するための本発明の製造方法によって取得可能な上記に定義される混合物の使用であり、特に疾患は、特にエネルギー代謝の障害に関連する病気、特に頭蓋脳外傷、脳卒中、低酸素症などのケトボディ代謝、心筋梗塞、リフィーディング症候群、食欲不振、てんかんなどの心血管疾患、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、グルコーストランスポーター欠損症（ＧＬＵＴ１欠損症）、ＶＬ－ＦＡＯＤなどの脂肪代謝性疾患、および、ミトコンドリアチオラーゼ欠損症、ハンチントン病などのミトコンドリア病、Ｔ細胞リンパ腫、星状細胞腫、膠芽腫などの癌、ＨＩＶ、リウマチ性関節炎や尿路関節炎などのリウマチ性疾患、慢性炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病などの消化管の疾患、スフィンゴリピドー症などのライソゾーム病、特にニーマンピック病、糖尿病、そして化学療法の効果または副作用に関連するものである。
【0118】
同様に、本発明のさらなる主題は、本発明の第６の態様によれば、予防的および／または治療的処置のために、または、予防的および／または治療的処置のための薬剤を製造するために、または、飢餓、食事療法または低炭水化物栄養のような異化代謝状態のための適用のために、本発明の製造方法によって得られる上記で定義されるような反応生成物、および／または、本発明の製造方法によって得られる上記で定義されるような混合物の使用である。
【0119】
同様に、本発明のさらなる主題は、本発明の第７の態様によれば、本発明の製造方法によって得られる、上記で定義された反応生成物および／または本発明の製造方法によって得られる、上記で定義された混合物を含む食品および／または食品生成物である。
【0120】
特定の実施形態によれば、食品および／または食品生成物は、本質的に、栄養補助食品、機能性食品、新規食品、食品添加物、食品サプリメント、栄養補助食品、パワースナック、食欲抑制剤または強度および／または耐久性のスポーツサプリメントであることが好ましい。
【0121】
最後に、本発明のさらに別の主題は、本発明の第８の態様によれば、本発明の製造方法によって得られる上記で定義された反応生成物および／または本発明の製造方法によって得られる上記で定義された混合物の食品および／または食品生成物における使用である。
【0122】
本発明のこの態様によれば、食品および／または食品生成物は、特に、栄養補助食品、機能性食品、新規食品、食品添加物、食品サプリメント、栄養補助食品、パワースナック、食欲抑制剤、または、強度および／または耐久性のスポーツサプリメントであることが好ましい。
【0123】
本発明のさらなる実施形態、修正および変形は、本発明の範囲を離れることなく明細書を読む場合に、当業者によって容易に認識または実現可能である。
【発明を実施するための形態】
【0124】
本発明は、本発明を限定することを意図するものではなく、本発明の例示的かつ非限定的な実施および構成を説明することのみを意図する以下の実施例によって説明されるものである。
【実施例】
【0125】
使用される略語
・３－ＢＨＢ－エチル＝３－ヒドロキシ酪酸エチルエステル（開始化合物）
・Ｇｌｙｃ．＝グリセロール（開始化合物）
・３－ＢＨＢ－ＭＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ＤＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ＴＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＭＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマーのモノグリセリド（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＤＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマーのジグリセリド（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ＦＳ＝３－ヒドロキシ酪酸（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＦＳ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマー（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマー（反応副産物）
・ｎ．ｄ．＝未定
・３－ＢＨＢ－エチル＝３－ヒドロキシ酪酸エチルエステル（開始化合物）
・Ｇｌｙｃ．＝グリセロール（開始化合物）
・３－ＢＨＢ－ＭＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ＤＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ＴＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリド（本発明による反応生成物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＭＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマーのモノグリセリド（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＤＧ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマーのジグリセリド（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ＦＳ＝３－ヒドロキシ酪酸（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー－ＦＳ＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマー（反応副産物）
・３－ＢＨＢ－ダイマー＝３－ヒドロキシ酪酸のダイマー（反応副産物）
・ｎ．ｄ．＝未定
【0126】
製造例
本発明による製造方法は、以下の実施例によって説明される。
本発明による製造方法は、以下の実施例によって説明される。
【0127】
３－ＢＨＢモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド混合物の製造
デフレグメーター（部分コンデンサー）と蒸留ブリッジを備えた５００ｍｌマルチネックフラスコに、３００ｇ（Ｒ）／（Ｓ）－３－ヒドロキシ酪酸エチルエステル（すなわちラセミエステル）、５０ｇグリセロール、３．３ｇ固定化酵素（カンジダアンタルクティカに由来するポリマー支持体上のＣＡＬＢリパーゼ、例えばシグマアルドリッチ社またはメルクグループ製のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５またはストレムケミカルズ社製のＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５）が提供される。反応混合物を７０℃で、真空下（＜５００ミリバール）において３６時間撹拌する。次に、酵素を濾別して再利用し、過剰の３－ヒドロキシ酪酸エチルを真空下で蒸留除去する。必要に応じて、得られた残留物を高真空で２～４時間蒸気（蒸気温度：１６０℃）処理する。
デフレグメーター（部分コンデンサー）と蒸留ブリッジを備えた５００ｍｌマルチネックフラスコに、３００ｇ（Ｒ）／（Ｓ）－３－ヒドロキシ酪酸エチルエステル（すなわちラセミエステル）、５０ｇグリセロール、３．３ｇ固定化酵素（カンジダアンタルクティカに由来するポリマー支持体上のＣＡＬＢリパーゼ、例えばシグマアルドリッチ社またはメルクグループ製のＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５またはストレムケミカルズ社製のＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５）が提供される。反応混合物を７０℃で、真空下（＜５００ミリバール）において３６時間撹拌する。次に、酵素を濾別して再利用し、過剰の３－ヒドロキシ酪酸エチルを真空下で蒸留除去する。必要に応じて、得られた残留物を高真空で２～４時間蒸気（蒸気温度：１６０℃）処理する。
【0128】
下記する組成の３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの混合物に基づく反応生成物が得られる：１６％３－ＢＨＢモノグリセリド、５８．５％－ＢＨＢジグリセリドおよび２５％－ＢＨＢトリグリセリド、さらに副生成物として０．５％３－ヒドロキシ酪酸を含む。特性評価は、ＧＣ、ＧＣ－ＭＳおよびＮＭＲを使用して実行される。
【0129】
精製プロセス中に、３－ヒドロキシ酪酸が除去され、純粋な混合物が得られる。混合物の一部はクロマトグラフィーによって分離され、さまざまなグリセリドが純粋な物質（すなわち、純粋な３－ＢＨＢ－モノグリセリド、純粋な３－ＢＨＢ－ジグリセリド、および純粋な３－ＢＨＢ－トリグリセリド）として得られる。
混合物の別の部分は、分別蒸留による分離に供され、その結果、一方で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの高い比率および３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの低い比率を有する第１の低沸点画分が得られ、他方で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドの低い比率および３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドおよびトリグリセリドの高い比率を有する第２の高沸点画分が得られるものである。
混合物の別の部分は、分別蒸留による分離に供され、その結果、一方で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの高い比率および３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの低い比率を有する第１の低沸点画分が得られ、他方で、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドの低い比率および３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドおよびトリグリセリドの高い比率を有する第２の高沸点画分が得られるものである。
【0130】
分別の結果は次の表にまとめられる（ショートパス蒸留、０．０１ミリバールの圧力、レシーバー容器の温度：２０℃、ジャケット温度８３℃）：
【0131】
【表2】
【0132】
酵素を触媒とする合成
一般に、酵素は、本発明による３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成に非常に適している。それらは非常に選択的であり、穏やかな反応条件下で使用することができる。さらに、酵素はしばしばエナンチオ選択的である。３－ＢＨＢ－ＦＳとそのエステルが、二官能性分子（ＯＨ基とカルボキシル基またはエステル基の存在）であるため、従来の化学的エステル化またはエステル交換条件は、増加した望ましくない副生成物の形成（いわゆるオリゴ－またはポリマー、除去反応等。）を生じる。
一般に、酵素は、本発明による３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成に非常に適している。それらは非常に選択的であり、穏やかな反応条件下で使用することができる。さらに、酵素はしばしばエナンチオ選択的である。３－ＢＨＢ－ＦＳとそのエステルが、二官能性分子（ＯＨ基とカルボキシル基またはエステル基の存在）であるため、従来の化学的エステル化またはエステル交換条件は、増加した望ましくない副生成物の形成（いわゆるオリゴ－またはポリマー、除去反応等。）を生じる。
【0133】
次に示されるものは、本発明による酵素的エステル化の反応スキームの例（すなわち、酵素触媒作用による３－ＢＨＢ－ＭＧ、３－ＢＨＢ－ＤＧおよび３－ＢＨＢ－ＴＧ混合物の生成）を示している。
【0134】
【化2】
【0135】
ただし、酵素を使用した場合でも、副産物や二次生成物の形成が少ししかない可能性がある。次の図は、酵素触媒作用中に形成される典型的な副産物を示している。
【0136】
【化3】
【0137】
上図の副産物は主に二次生成物である。理論に拘束されることなく、それぞれのダイマーグリセリドの形成は、それぞれのダイマーグリセリドが、ダイマーエチルエステルから形成されるという事実、または３－ＢＨＢモノグリセリドおよび３－ＢＨＢジグリセリドがＯＨ基でさらにエステル交換されるという事実によって説明される。３－ＢＨＢダイマー酸（３－ＢＨＢ－ダイマー－ＦＳ）は、水の存在下でのみ発生し、例えば、可能な真空プロセス制御により、３－ＢＨＢエチルによるエステル交換生成プロセスのために、わずかな役割しか果たさない。
【0138】
酵素を使ったテストシリーズ
最初に、酵素を用いた一連の試験は、本発明による３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成に適した酵素または適切な酵素変異体を見つけるために実行される。この目的のために、５０ｇ～１００ｇのスケールで最大４つのアプローチを並行して検査するための一連のテストが最初に実行される。テストシリーズの実験は、三角フラスコで行われる。これらは、所望の温度で２４時間水浴に保持される。その後、酵素はろ過され、必要に応じて再利用される。実験は、各酵素の蓋がある場合とない場合で実行される。目的は、化学平衡での副産物エタノールの影響を示すことである。
最初に、酵素を用いた一連の試験は、本発明による３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成に適した酵素または適切な酵素変異体を見つけるために実行される。この目的のために、５０ｇ～１００ｇのスケールで最大４つのアプローチを並行して検査するための一連のテストが最初に実行される。テストシリーズの実験は、三角フラスコで行われる。これらは、所望の温度で２４時間水浴に保持される。その後、酵素はろ過され、必要に応じて再利用される。実験は、各酵素の蓋がある場合とない場合で実行される。目的は、化学平衡での副産物エタノールの影響を示すことである。
【0139】
次の表は、一連の酵素テストの結果を示している。
【0140】
【表3】
【0141】
この表は、２４時間後の反応混合物の組成を示している。この表は、まだ含まれている可能性のある抽出物を考慮しない場合のパーセンテージ構成を示している。使用される酵素は、高分子担体物質に固定化された酵素である。
【0142】
上記の酵素テストシリーズの結果は、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５が高生産性の３－ＢＨＢ－ＭＧ、３－ＢＨＢ－ＤＧおよび３－ＢＨＢ－ＴＧを提供することを示している。
【0143】
開放系での実験は、３－ＢＨＢ－ＦＳまたは３－ＢＨＢダイマー－ＦＳの増加した形成を示している。これは、主に蒸発水浴によって生じる、不要な水が反応混合物に存在するという事実によるものである。しかしながら、生成形成によるこれは、真空下で実行できるので、この副生成物の形成は、例えば、３－ＢＨＢエチルを用いたエステル交換生成法にとってはそれほど重要ではない。
【0144】
加水分解副反応の結果に基づいて、ＣａＣｌ２ドライチューブを使用してさらに一連のテスト実験が行われる。これらの実験の結果は、次の表にまとめる。
【0145】
【表4】
【0146】
ドライチューブを使用した２つの酵素、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５とＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の比較は、加水分解がごくわずかしか起こらないことを示している。ただし、生産性と選択性の点では、結果は閉鎖系での同等の実験とほとんど変わりません。ただし、乾燥剤ＣａＣｌ２全体の圧力降下が大きすぎるため、エタノールがほとんど逃げることができない。ただし、水の侵入は避けることができる。酵素なしの結果は、反応が自己触媒的にも実行できることを示している。少量のＢＨＢ－ＭＧもここで形成される。
【0147】
さらなる調査は、酵素が立体選択的であることを示している。特に、ダイマーのさらなる分析から、開始化合物からの１つのエナンチオマー、おそらく（Ｒ）－エナンチオマーが変換され留ことが好ましく、その結果、（Ｒ）－３－ヒドロキシ酪酸または（Ｒ）－３－ＢＨＢは形成された製品に存在する。
【0148】
３－ＢＨＢダイマーのＮＭＲスペクトル（カラムクロマトグラフィーで９０％以上に精製）により、酵素プロセスのエナンチオ選択性が確認される。ＮＭＲスペクトルによれば、５６：４４のジアステレオマー比が測定される；ＧＣ分析によると、この比率は５９：４１である。
【0149】
開始化合物の余剰を伴うテストシリーズ
異なる３－ＢＨＢ－エチルエステル余剰で、選択した２つの酵素、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の活性をテストするために、両酵素は、５０℃で、２４時間等モルで、１００モル％の過剰でエステル交換される。下記する表は、結果をまとめたものである。
異なる３－ＢＨＢ－エチルエステル余剰で、選択した２つの酵素、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の活性をテストするために、両酵素は、５０℃で、２４時間等モルで、１００モル％の過剰でエステル交換される。下記する表は、結果をまとめたものである。
【0150】
【表5】
【0151】
結果は、開放形での実験、すなわちエタノールを蒸留除去する場合の実験が、３－ＢＨＢ－ＤＧまたは３－ＢＨＢ－ＴＧへのより高い変換を示すことを示している。さらに、この一連の実験は、開放反応容器（すなわち、開放系）での加水分解の増加も示している。Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５は、同一の反応条件下で同様の結果を示す。Ｌｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５は、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５よりもわずかに活性が高いようにみえる。
【0152】
グリセロール変換は、１００モル％の余剰バッチで最も高くなる。ただし、３－ＢＨＢダイマーとそれに続く生成物（つまり、３－ＢＨＢ－ダイマー－ＭＧおよび３－ＢＨＢ－ダイマー－ＤＧ）の形成における影響が明確に見える。１００モル％の余剰がある場合、これらの生成物は２～４倍の量で形成されると同時に、３－ＢＨＢ－ＴＧの割合は約２倍である。
【0153】
要約すると、選択された反応条件下では、１００モル％を超えると、主生成物の形成に比べて副生成物の形成に強い影響を与えると言える。
【0154】
温度と基質の効果を調査するための一連のテスト
温度の影響、および製品形成に対する基質の影響の最初の推定も、一連のテスト実験で調査される。
温度の影響、および製品形成に対する基質の影響の最初の推定も、一連のテスト実験で調査される。
【0155】
反応温度は７０℃に設定される。さらに、ＫＤ蒸留（上記も参照）からの１ｇの高沸点画分が、生成物形成における基質の影響の最初の推定を調査するために、いくつかの準備または実験に追加される。
【0156】
高沸点画分と混合されたこれらのアプローチの反応混合物は、以下の初期組成を有する：
【0157】
【表6】
【0158】
次の表は、一連の基質テストの結果を示している。
【0159】
【表7】
【0160】
最初に、開放系における実験中の湿度とその結果生じる加水分解の影響を測定するべきである。結果として生じるエタノールを蒸留して平衡をシフトすることの利点が明らかになる。Ｌｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５と、Ｎｏｂｏｚｙｍ（登録商標）４３５は、非常に類似した結果をもたらすが、Ｌｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の活性は、わずかに高くなる。
【0161】
生成物の添加量（ショートパス蒸留からの１ｇの高沸点留分）の影響は認識できない。その量は、形成された生成物の量にほぼ完全に加算される。たとえば、３－ＢＨＢ－ＤＧは、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（開放系）で、生成物に追加されない３５％と、生成物に付加される３６．７％で、形成される。この増加は、測定精度の範囲内で１．６％の３－ＢＨＢ－ＤＧの追加量に正確に対応する。
【0162】
副生成物の合計パラメータには、すべてのダイマーまたはダイマーグリセリドが含まれる（上の図も参照）。加水分解は製造プロセスにおいてわずかな役割しか果たさないため、遊離脂肪酸またはそれらのダイマーは合成の観点からは無関係である。
【0163】
しかしながら、結果はまた、製造プロセスに由来する蒸留された抽出物画分（３－ＢＨＢエチルエステル画分）が、反応に重大な影響を与えることなくプロセスに戻すことができることを示している。
【0164】
温度変化下でのさらなる一連のテストでは、生成物形成における温度の影響を測定することができる。たとえば、５０℃の反応温度と比較して、約４％～５％以上の３－ＢＨＢ－ＴＧが形成される（同時に約２５％のグリセロール変換が増加する）。
【0165】
閉鎖系と比較した開放系の影響も明らかである；閉鎖系では、３－ＢＨＢ－ＭＧの形成が３－ＢＨＢ－ＤＧよりも好ましいが、開放系では、これは多かれ少なかれ逆転する。３－ＢＨＢ－ＴＧと副産物の形成は、一方で、多かれ少なかれ影響を受けない。
【0166】
酵素再利用のテストシリーズ
さらなる一連のテストでは、酵素Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の再利用可能性が調査される。この目的のために、それぞれの酵素は前の実験からろ過され、生成物の付着とともにフィルター残留物は、さらなる実験に使用される。
さらなる一連のテストでは、酵素Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５およびＬｉｐｏｚｙｍ（登録商標）４３５の再利用可能性が調査される。この目的のために、それぞれの酵素は前の実験からろ過され、生成物の付着とともにフィルター残留物は、さらなる実験に使用される。
【0167】
両方の酵素が７０℃で２４時間後に再利用できることが示されている。最初の再利用循環の後、活性はほとんど低下せず、ほぼ同じ組成が得られる。
ただし、両方の酵素が再利用後に低いグリセロール変換を示すが、同時により少ないダイマーを形成することは注目に値する。
ただし、両方の酵素が再利用後に低いグリセロール変換を示すが、同時により少ないダイマーを形成することは注目に値する。
【0168】
下記する表は、得られた結果を示すものである。
【0169】
【表8】
【0170】
酵素濃度を調査した一連のテスト
酵素濃度の影響は、さらなる一連のテストでも調査される。この目的のために、０．１重量％、１重量％、５重量％および１０重量％の酵素を含む調製物が用意される。次の表は、その結果をまとめたものである。実験はそれぞれＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（開放系）で実行された。
酵素濃度の影響は、さらなる一連のテストでも調査される。この目的のために、０．１重量％、１重量％、５重量％および１０重量％の酵素を含む調製物が用意される。次の表は、その結果をまとめたものである。実験はそれぞれＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４３５（開放系）で実行された。
【0171】
その結果は、最適濃度が、７０℃で約１重量％の範囲内の酵素であることを示している。これは、最も高いグリセロール変換が達成されるところである。より高い酵素濃度では、グリセロール変換は再び減少する。さらに、酵素量が５％以上の場合、ダイマーＤＧおよびより高次のダイマー化合物の増加した形成を生じる。すべての実験において、ＢＨＢ－ＦＳとＢＨＢ－ダイマー－ＦＳの増加した比率は、水浴でのオープン実験法（つまり開放系）によるものである。
【0172】
【表9】
【0173】
塩基性金属触媒による合成
３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成の別の可能性は、金属触媒、酸または塩基を使用した化学合成である。この目的のために、水を除去しながら遊離脂肪酸から開始してエステル化を実行するか、または３－ＢＨＢエチルエステルを使用する場合、エタノールを（触媒の存在下で）分離して、エステル交換を実行する。本発明の範囲内で、従来技術で通常発生する副反応、特にオリゴ反応および重合反応は、適切な反応制御によって効率的に最小化または回避することができる。
３－ＢＨＢグリセリド混合物の合成の別の可能性は、金属触媒、酸または塩基を使用した化学合成である。この目的のために、水を除去しながら遊離脂肪酸から開始してエステル化を実行するか、または３－ＢＨＢエチルエステルを使用する場合、エタノールを（触媒の存在下で）分離して、エステル交換を実行する。本発明の範囲内で、従来技術で通常発生する副反応、特にオリゴ反応および重合反応は、適切な反応制御によって効率的に最小化または回避することができる。
【0174】
以下の反応スキームは、本発明による塩基性触媒とのエステル交換による３－ＢＨＢ－グリセリド混合物の可能な化学合成を示している。
【0175】
【化4】
【0176】
次の表は、３－ＢＨＢエチルエステルとナトリウムメチラート（ＮａＯＭｅ）およびグリセロールとの反応の結果を示すものである。
【0177】
【表10】
【0178】
重合が起こらないことがわかる。モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、および少量のダイマーが形成される。ＮａＯＭｅのさらなる付加および／または低真空の実施は、平衡状態または動力学的限界に達したように見えるので、反応の進行をそれ以上増加させることができないが、３－ＢＨＢメチルエステルの量のみを選択的に増加させ手、触媒がまだ活性であり、反応がこの方法において制御されると推定することができる。
【0179】
生理学的応用試験：試験管内消化試験
本発明の３－ＢＨＢグリセリド混合物の消化実験（分割または切断実験）
切断実験により、本発明によって生成されたダイマーなどの反応副生成物を含む３－ＢＨＢエステルまたはそれらの混合物が、ヒトの胃腸管で切断されることが示されている。使用される開始混合物は、さらに精製されていない、本発明の方法によって得られる画分蒸留からの粗高沸点画分である。この画分は、本発明によって得られた３－ＢＨＢ－ＭＧ、３－ＢＨＢ－ＤＧおよび３－ＢＨＢ－ＴＧの三元混合物を含む。
本発明の３－ＢＨＢグリセリド混合物の消化実験（分割または切断実験）
切断実験により、本発明によって生成されたダイマーなどの反応副生成物を含む３－ＢＨＢエステルまたはそれらの混合物が、ヒトの胃腸管で切断されることが示されている。使用される開始混合物は、さらに精製されていない、本発明の方法によって得られる画分蒸留からの粗高沸点画分である。この画分は、本発明によって得られた３－ＢＨＢ－ＭＧ、３－ＢＨＢ－ＤＧおよび３－ＢＨＢ－ＴＧの三元混合物を含む。
【0180】
体に近い条件下での切断実験では、２つの媒体が調査される。
・胃をシミュレートするＦＡＳＳＧＦ
・腸管をシミュレートするＦＡＳＳＩＦ
どちらの媒体も、英国のＢｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ（登録商標）社からのものである。 さらに、いくつかの実験では、ブタの膵臓が追加される（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００，Ｆａ、Ａｌｌｅｒｇａｎ社）。
・胃をシミュレートするＦＡＳＳＧＦ
・腸管をシミュレートするＦＡＳＳＩＦ
どちらの媒体も、英国のＢｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ（登録商標）社からのものである。 さらに、いくつかの実験では、ブタの膵臓が追加される（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００，Ｆａ、Ａｌｌｅｒｇａｎ社）。
【0181】
実験の結果は次の表にまとめられる（クロマトグラフで測定、パーセンテージはクロマトグラムの面積％として測定）。
【0182】
【表11】
【0183】
サンプルは、ＦａＳＳＧＦ条件下で加水分解することが示されている。これは主に低いｐＨ値（ｐＨ＝１．６）によるものである。
【0184】
ＦａＳＳＩＦ条件下では、Ｐａｎｚｙｔａｔ（登録商標）を使用して小さな変換または切断（２．６％の３－ＢＨＢ－ＦＳ）が発生する。
【0185】
すべての実験は、カスケード反応（３－ＢＨＢ－ＴＧが３－ＢＨＢ－ＤＧになり、３－ＢＨＢ－ＤＧが３－ＢＨＢ－ＭＧになり、３－ＢＨＢ－ＭＧが遊離酸とグリセロールになる）が続くことを示している。さらに、ダイマー酸（３－ＢＨＢ－ダイマー－ＦＳ）も形成される。このことから、ダイマーグリセリドも分解されていることがわかる。したがって、これは、可能性のある薬学的または薬理学的遅延効果のために使用することができる。
【0186】
本発明のさらなる消化実験（切断実験）
３－ＢＨＢグリセリド混合物
１． パンクレアチンによる切断実験
３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドに基づいて上記のように調製された２ｇのグリセリド混合物は、５０ｇの水に溶解され、０．５ｇ（１重量％）のパンクレアチンを加える。
パンクレアチンは、アラガン社から市販されている製品Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００の形で使用される。
混合物全体は、５０℃の加熱プレート上で攪拌され、反応の過程は、酸価を経時的に連続的に記録することによって測定され、監視される。
酸価は、元からある０．２００ｍｇＫＯＨ／ｇ～２，２００ｍｇＫＯＨ／ｇを超えるまで１，２５０分の期間にわたって増加する（遊離酸を形成するための３－ＢＨＢグリセリドの切断）。
経時的な酸価の増加を含む、パンクレアチンによる本発明によるグリセリド混合物の水性開裂の変換／時間経過は、遊離体混合物（グリセリド混合物）の遊離酸への所望の分解を証明する。これはその後、適切な分析によって確認される。
前記実験は、本発明による３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドのグリセリド混合物が、対応するケト体療法のための３－ヒドロキシ酪酸の適切な生理学的前駆体であることを証明している。
前記テストは繰り返され、個々のグリセリドに基づいて検証される。相当する結果が得られ、つまり、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドとジグリセリドの両方並びにトリグリセリドが、パンクレアインによって遊離３－ヒドロキシ酪酸に切断される。
３－ＢＨＢグリセリド混合物
１． パンクレアチンによる切断実験
３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドに基づいて上記のように調製された２ｇのグリセリド混合物は、５０ｇの水に溶解され、０．５ｇ（１重量％）のパンクレアチンを加える。
パンクレアチンは、アラガン社から市販されている製品Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００の形で使用される。
混合物全体は、５０℃の加熱プレート上で攪拌され、反応の過程は、酸価を経時的に連続的に記録することによって測定され、監視される。
酸価は、元からある０．２００ｍｇＫＯＨ／ｇ～２，２００ｍｇＫＯＨ／ｇを超えるまで１，２５０分の期間にわたって増加する（遊離酸を形成するための３－ＢＨＢグリセリドの切断）。
経時的な酸価の増加を含む、パンクレアチンによる本発明によるグリセリド混合物の水性開裂の変換／時間経過は、遊離体混合物（グリセリド混合物）の遊離酸への所望の分解を証明する。これはその後、適切な分析によって確認される。
前記実験は、本発明による３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドのグリセリド混合物が、対応するケト体療法のための３－ヒドロキシ酪酸の適切な生理学的前駆体であることを証明している。
前記テストは繰り返され、個々のグリセリドに基づいて検証される。相当する結果が得られ、つまり、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリドとジグリセリドの両方並びにトリグリセリドが、パンクレアインによって遊離３－ヒドロキシ酪酸に切断される。
【0187】
２． 胃媒体による切断：ＦａＳＳＧＦ媒体
いわゆるＦａＳＳＧＦ媒体は、市販の対応する組成物（Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ社、英国から入手可能）から製造業者の仕様によって調製される。
得られたサンプルは、同じサイズの２つのバッチに分割される。上記のように、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドに基づく１０重量％の三成分グリセリド混合物は、各ＦａＳＳＧＦ媒体に溶解し、３５℃水浴に２４時間放置される。さらに、２つのバッチの１つに、１重量％のパンクレアチン（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００）が、それに先立って追加される。
分析を目的として、サンプル溶液は、吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）－Ｘｔｒカラムに加え、５分以上作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ（ジクロロメタン）／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＧＦ媒体にパンクレアチンがある場合とない場合の両方での切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸における強い増加と、ＦａＳＳＧＦ媒体にパンクレアチンがある場合とない場合の両方での３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとトリグリセリドにおける意味のある減少を示している。さらなる分析は、サンプルが媒体によって望まれるように分割または分解されたことを示している（媒体のｐＨ値：１．６）。
次の表は、ＦａＳＳＧＦ媒体におけるＰａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００がある場合とない場合の切断実験の結果を示している。
いわゆるＦａＳＳＧＦ媒体は、市販の対応する組成物（Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ社、英国から入手可能）から製造業者の仕様によって調製される。
得られたサンプルは、同じサイズの２つのバッチに分割される。上記のように、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドに基づく１０重量％の三成分グリセリド混合物は、各ＦａＳＳＧＦ媒体に溶解し、３５℃水浴に２４時間放置される。さらに、２つのバッチの１つに、１重量％のパンクレアチン（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００）が、それに先立って追加される。
分析を目的として、サンプル溶液は、吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）－Ｘｔｒカラムに加え、５分以上作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ（ジクロロメタン）／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＧＦ媒体にパンクレアチンがある場合とない場合の両方での切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸における強い増加と、ＦａＳＳＧＦ媒体にパンクレアチンがある場合とない場合の両方での３－ヒドロキシ酪酸のジグリセリドとトリグリセリドにおける意味のある減少を示している。さらなる分析は、サンプルが媒体によって望まれるように分割または分解されたことを示している（媒体のｐＨ値：１．６）。
次の表は、ＦａＳＳＧＦ媒体におけるＰａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００がある場合とない場合の切断実験の結果を示している。
【0188】
【表12】
【0189】
３． 腸媒体での切断：ＦａＳＳＩＦ媒体
ＦａＳＳＩＦ媒体は、製造者（Ｆａ．Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ社、英国）の指示によって調製される。
得られたサンプルは、２つの同じサイズの製剤に分けられる。３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの混合物に基づく前述のグリセリド混合物の１０重量％が、各ＦａＳＳＩＦ媒体に溶解し、３５℃の水浴に２４時間放置される。追加の１重量％のパンクレアチン（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００）が２つの製剤の１つに事前に追加される。
分析の目的で、０．５ｍｌのサンプル溶液が、それぞれ吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）Ｘｔｒカラムに添加され、５分間作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＩＦ媒体におけるパンクレアチンがある場合とない場合の切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸のわずかな増加と、それに対応する開始混合物の３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの含有量のわずかな減少を示し、それはサンプルの減成と分解を証明し。さらなる分析によって確認される。
ＦａＳＳＩＦ媒体のｐＨ値は６．５ｄである。ＦＡＳＳＩＦ媒体自体は、切断を支持するようには見えない。
次の表は、ＦａＳＳＩＦ媒体での切断実験の結果を示している。
ＦａＳＳＩＦ媒体は、製造者（Ｆａ．Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ社、英国）の指示によって調製される。
得られたサンプルは、２つの同じサイズの製剤に分けられる。３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの混合物に基づく前述のグリセリド混合物の１０重量％が、各ＦａＳＳＩＦ媒体に溶解し、３５℃の水浴に２４時間放置される。追加の１重量％のパンクレアチン（Ｐａｎｚｙｔｒａｔ（登録商標）４０，０００）が２つの製剤の１つに事前に追加される。
分析の目的で、０．５ｍｌのサンプル溶液が、それぞれ吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）Ｘｔｒカラムに添加され、５分間作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＩＦ媒体におけるパンクレアチンがある場合とない場合の切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸のわずかな増加と、それに対応する開始混合物の３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの含有量のわずかな減少を示し、それはサンプルの減成と分解を証明し。さらなる分析によって確認される。
ＦａＳＳＩＦ媒体のｐＨ値は６．５ｄである。ＦＡＳＳＩＦ媒体自体は、切断を支持するようには見えない。
次の表は、ＦａＳＳＩＦ媒体での切断実験の結果を示している。
【0190】
【表13】
【0191】
４．腸媒体によるさらなる切断：ＦａＳＳＩＦ媒体
ＦａＳＳＩＦ媒体は、製造者の指示によって、前のテストと同様に準備される。
得られたサンプルは、同じサイズの２つのバッチに分割される。本発明による３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの３成分グリセリド混合物の１０重量％が、各ＦａＳＳＩＦ媒体に溶解し、３５℃の水浴に２４時間放置される。
１つのバッチに、１重量％のブタの膵リパーゼＩＩ型（ＰＰＬＩＩ型）が事前に添加される。
分析の目的で、０．５ｍｌのサンプル溶液が、吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）Ｘｔｒカラムに添加し、５分以上作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＩＦ媒体でのブタ膵リパーゼによる切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸のわずかな増加とそれに対応する３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの含有量のわずかな減少を示し、これは、サンプルの酵素分解または分解を示しており、さらなる分析によって確認される。
ＦａＳＳＩＦ媒体のｐＨ値は６．５であり、ＦＡＳＳＩＦ媒体自体は、切断を支持するようには見えない。
次の表は、ＦａＳＳＩＦ媒体に膵リパーゼＩＩ型がある場合とない場合の卵割実験の結果を示している。
ＦａＳＳＩＦ媒体は、製造者の指示によって、前のテストと同様に準備される。
得られたサンプルは、同じサイズの２つのバッチに分割される。本発明による３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの３成分グリセリド混合物の１０重量％が、各ＦａＳＳＩＦ媒体に溶解し、３５℃の水浴に２４時間放置される。
１つのバッチに、１重量％のブタの膵リパーゼＩＩ型（ＰＰＬＩＩ型）が事前に添加される。
分析の目的で、０．５ｍｌのサンプル溶液が、吸着のためにＣＨＲＯＭＡＢＯＮＤ（登録商標）Ｘｔｒカラムに添加し、５分以上作用させた後、６ｍｌのＤＣＭ／イソプロパノール（４：１）で溶出する。
ＦａＳＳＩＦ媒体でのブタ膵リパーゼによる切断実験の結果は、遊離３－ヒドロキシ酪酸のわずかな増加とそれに対応する３－ヒドロキシ酪酸のトリグリセリドの含有量のわずかな減少を示し、これは、サンプルの酵素分解または分解を示しており、さらなる分析によって確認される。
ＦａＳＳＩＦ媒体のｐＨ値は６．５であり、ＦＡＳＳＩＦ媒体自体は、切断を支持するようには見えない。
次の表は、ＦａＳＳＩＦ媒体に膵リパーゼＩＩ型がある場合とない場合の卵割実験の結果を示している。
【0192】
【表14】
【0193】
前述の切断実験は、３－ヒドロキシ酪酸のモノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドが、特に生理学的に適合性または生理学的に互換性のあるフォームにおいて存在する意図された効果に関して、遊離ヒドロキシ酪酸またはその塩の効率的な前駆体または代謝物であることを証明する。