特許 7236760 サケの精巣からのＰＤＲＮの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-02

(45)【発行日】2023-03-10

(54)【発明の名称】サケの精巣からのＰＤＲＮの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/04 20060101AFI20230303BHJP

【ＦＩ】

C07H21/04 A

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021133970

(22)【出願日】2021-08-19

(65)【公開番号】P2022044559

(43)【公開日】2022-03-17

【審査請求日】2021-08-19

(31)【優先権主張番号】10-2020-0113706

(32)【優先日】2020-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】521367558

【氏名又は名称】バイオ メディ ファーム カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯ ＭＥＤＩ ＰＨＡＲＭ ＣＯ．ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】クォン オ ナム

(72)【発明者】

【氏名】キム テ－ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】キム ソン－ヒ

【審査官】土橋 敬介

(56)【参考文献】

【文献】特開２００５－２４５３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０４９２９５４２（ＵＳ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７０９９５０１（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０７４７１９４（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２００４－１９６７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第２０１４－００１９６０９（ＫＲ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１４６７６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】HIGAKI Shogo, et. al，"In vitro differentiation of fertile sperm from cryopreserved spermatogonia of the endangered endemic cyprinid honmoroko (Gnathopogon caerulescens)"，Scientific Reports，2017年02月17日，Vol.7，pp.1-14

【文献】三浦猛，魚類精子形成の分子制御機構，日本水産学会誌，1996年07月15日，６２巻４号，ｐｐ．５４７－５５０

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ ２１／０４

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｐ

Ａ０１Ｋ

Ａ２３Ｌ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）河口から川の上流１０ｋｍまでの河川サケ科魚類の精巣から精液と未成熟な精巣部分とを分離するステップと、
２）前記未成熟な精巣部分を磨砕及び人工精漿液下で希釈するステップと、
３）前記精巣の細胞を人為的に精子に性成熟させるために、前記精巣の希釈液にｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）をｇ精巣当たり２５～２００ＩＵで処理するステップと、
４）１０分～２時間経過後、ｈＣＧ処理した精巣の希釈液を遠心分離して、活性を有することができる精子を回収するステップと、
５）前記回収された精子からＰＤＲＮ（Ｐｏｌｙ Ｄｅｏｘｙ Ｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抽出するステップと、を含み、
前記１）ステップの前記未成熟な精巣は、成熟の程度が異なる部分を区分して分離することによって、０．７％～１．３％の精子活性度を示す、成熟度が相対的に高い部位であることを特徴とする、サケの精巣からのＰＤＲＮの製造方法。

【請求項2】

前記サケ科魚類は、サケ亜科、カワヒメマス亜科及びシロマス亜科からなる群から選択される亜科に属する魚種であることを特徴とする、請求項１に記載のＰＤＲＮの製造方法。

【請求項3】

前記４）ステップの時間経過は１０分～１時間であることを特徴とする、請求項１に記載のＰＤＲＮの製造方法。

【請求項4】

前記未成熟な精巣は、精原細胞又は精細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＤＲＮの製造方法。

【請求項5】

前記５）ステップの前に精子を含む懸濁液に淡水を入れ、精子が有したＡＴＰを消尽させてＰＤＲＮの純度を高めるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＤＲＮの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サケの精巣からのＰＤＲＮの製造方法に関し、より詳細には、従来は他の用途に用いられていた未成熟な精巣にホルモンを処理することによってＰＤＲＮを製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＤＲＮ（Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、生物体内の組織再生（ａｎａｇｅｎｅｓｉｓ）活性物質に存在し、５０個～２０００個の間の塩基対で構成された鎖状のデオキシリボヌクレオチド重合体（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）で結合してなり、細胞成長活性剤であって、靭帯、腱、皮膚などの我々の体内組織の再生及び炎症の緩和に特別な効果を奏している。

【0003】

ＰＤＲＮは、ヒトの胎盤中に極少量入っている物質であり、倫理的な問題と医薬品の生産性などの困難があるので、魚類の中のＰＤＲＮが代案として提示された。核酸の含有量において、マス、サケの精液及び精巣は量的に優れてもいるが、これよりさらに重要なのは質的に優れていることである。ＤＮＡは、五炭糖、リン酸及び４種類の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）が含まれたヌクレオチドで構成されるが、マス及びサケは、この組み合わせのバランスがヒトのものと９６．５％一致する。このような類似性は、捨てられる核酸なしで全て使用できるという点に大きな意味がある。

【0004】

前記ＰＤＲＮは、欧州などで医薬品として許可されており、傷の治癒及び美容に用いられている。過去では、ＰＤＲＮは、主にサケ又はマスから精液の分離を経て、ＤＮＡの低分子量化過程を通じて製造されるものであり、このようなＰＤＲＮを取得するのに用いられたＤＮＡ分離法は、これまでに技術的に発展してきており、哺乳類及びその他の種に応用されてきた。具体的にいうと、過去では、魚類の組織からＤＮＡを分離するために、フェノール及びクロロホルムを用いていた。

【0005】

薬理作用に優れた様々な治療剤あるいは化粧品の素材として用いられているサケ科の魚類のＤＮＡ切片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）として知られているポリデオキシリボヌクレオチド（Ｐｏｌｙ Ｄｅｏｘｙ Ｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＰＤＲＮ）は、精子を含んでいる液状の精液から得ている。

【0006】

高純度のＤＮＡ切片であるＰＤＲＮを得るために、薬理用に精液（ｓｐｅｒｍ ｆｌｕｉｄまたはｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）を遠心分離して緩衝溶液で洗浄した後、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）あるいは酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）とイソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）との混合物を用いて抽出する方法は、多数の特許と製造メーカで用いている基本的な抽出方法に対する基本原理である。

【0007】

また、同じ方法で、精巣（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ）には、一般の配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）において精液に多量含まれている精子（ｓｐｅｒｍ）となる精細胞（ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）、精母細胞（Ｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅ）、精原細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉｕｍ）が全て含まれており、特に、これらの生殖細胞（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）に栄養を供給するための栄養細胞（ｎｕｒｓｅ ｃｅｌｌ）を、生殖細胞よりも多く含有している。

【0008】

一般の魚類の精巣は、図１に示すように、体腔の脊椎方向の体腔壁に付いて成熟し、性成熟過程で生殖細胞が大きくなるにつれ、生殖巣の熟度指数（Ｇｏｎａｄａｌ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ、ＧＳＩ）が高くなり、雌の場合に２０～５０％まで増加するが、雄の場合には１～５％程度で、雄から確保される精巣の量は多くない。

【0009】

反面、精液からＰＤＲＮを抽出するときは、遠心分離を行い、精子のみを濃縮した後、この集められた精子（あるいは精虫）のみを持って有機溶媒で分離させるが、この精子の構成は、本発明で得ようとするＤＮＡ、すなわち、ＰＤＲＮである遺伝体と共に、尾を動かすことができるようにするＡＴＰを含有する推進体と、卵膜を貫通できるようにする先体（Ａｃｒｏｓｏｍｅ）を有している。

【0010】

結果的に、精液及び精巣からそれぞれ有機溶媒で抽出した物質内のＰＤＲＮの含量は、根本的に差があり、精液から高い純度のＰＤＲＮを得ることができるが、栄養細胞などを含有している精巣から抽出する場合、有機溶媒に溶解される様々な物質が共に抽出されざるを得ない。

【0011】

中国特許（特許文献１）において、ＰＤＲＮは、精液として表現される“ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ”から確保しており、韓国の拒絶された特許（特許文献２）では、精巣を凍結乾燥して有機溶媒で抽出してＰＤＲＮを確保するとされているが、精液と精巣から得たＰＤＲＮにおいて純度の差があることは認識しており、高純度のＰＤＲＮを得るために精子（精液）から抽出することが最も効率が良いとしている。

【0012】

したがって、基本的な抽出方法は、洗浄及び有機溶媒で抽出するものと確立されているため、最近の特許と文献では、ＰＤＲＮの抽出方法ではなく、ＰＤＲＮの活用法、すなわち、薬理作用あるいは化粧品関連の効果に関する特許が登録され、論文が出されている。

【0013】

精巣で精子が作られると、精液が集められるが、開腹を行う場合、まだ未成熟な精巣は集められて凍結乾燥などの過程を経るようになるが、精巣の成熟の程度に応じて精漿液に希釈してホルモン（ｈＣＧ）処理して遥かに多くの精子（精液）を得ることができ、一匹のサケ科魚類から得られる精液を１００～２００倍さらに多く確保することができる。

【0014】

本発明に使用される精漿液は、Ｒｏｓｅｎｇｒａｖｅ Ｐ，Ｔａｙｌｏｒ Ｈ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｉｅ Ｒ，Ｍｅｔｃａｌｆ Ｖ，ＭｃＢｒｉｄｅ Ｋ ａｎｄ Ｇｅｍｍｅｌｌ ＮＪ，２００８．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｍｉｎａｌ ａｎｄ ｏｖａｒｉａｎ ｆｌｕｉｄｓ ｏｆ ｃｈｉｎｏｏｋ ｓａｌｍｏｎ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｔｓｈａｗｙｔｓｃｈａ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｔｒａｉｔｓ．ＣＢＰ Ａ １５２，１２３－１２９に記載された精液の無機質の濃度に関する情報、及びＢａｒｔｌｅｔｔ ＭＪ，Ｓｔｅｅｖｅｓ ＴＥ，Ｇｅｍｍｅｌｌ ＮＪ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｇｒａｖｅ ＰＣ，２０１７．Ｓｐｅｒｍ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｒｉｓｋ ｄｒｉｖｅｓ ｒａｐｉｄ ｅｊａｃｕｌａｔｅ ａｄｊｅｃｔｍｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ．ｅＬＩＦＥ６：ｅ２８８１１．に記載された人工精漿液の情報に基づいて定められた（８０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）。

【0015】

中国特許で言及しているＰＤＲＮの原料であるｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄは、サケ科魚類の精液を意味するもので、精巣に基づいて抽出することを意味するものではなかった。

【0016】

また、欧州特許（特許文献３）は、胎盤をベースとして抽出するものとして方法が確立されているが、他の動物の他の組織にも適用可能であることを言及しているだけで、事例は紹介していない。しかし、本発明では、生きている或いは新鮮なサケの精巣の採取及び血流洗浄から始まるため、本発明で得ようとする精巣にて活力を有する精子を作り、その精子からＰＤＲＮを得る方法とは根本的に異なる。

【0017】

そこで、本発明者らは、従来から広く活用されてきた精液や成熟した精巣ではなく、未成熟な精巣からＰＤＲＮを抽出するために努力する中で、様々なホルモンのうちｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を処理する場合、未成熟な精巣で精子に成熟させて高純度のＰＤＲＮを抽出できることを確認することによって本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【文献】中国特許出願公開第１０７２８７１８６号明細書

【文献】韓国公開特許第１０－２０１９－０１３９６３３号公報

【文献】欧州特許第０２２６２５４号明細書

【非特許文献】

【0019】

【文献】キム・ヒョウォン、キム・ジョンヒョン、キム・デグン、ジョン・ミンファン、チ・スンチョル、ヤン・サングン、アン・チョルミン、ミョン・ジョンイン、キム・デジュン、２０１８、「ｈＣＧの濃度及び投与間隔による養殖産の雄ウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の性成熟誘導効果」、水産海洋教育研究、３０，１５７８－１５８６

【文献】Ｏｈｔａ Ｈ．およびＴａｎａｋａ Ｈ．、１９９７、「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ（ｈＣＧ） ａｎｄ １１－ｋｅｔｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ａｆｔｅｒ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈＣＧ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｔｕｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｅｌ」、Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ、１５３，１２３－１３４

【文献】キム・ダルヨン、キム・ソンゴン、キム・トンス、２０１６、「コウライケツギョ配合飼料馴致研究－コウライケツギョ（１年モノ）配合飼料馴致個体の成長度試験。ｉｎ ２０１６年度の始業研究事業報告書」、京畿道海洋水産資源研究所、８４－９１

【文献】順天郷大学校、２０１１、「絶滅危機の淡水魚類の人工増殖マニュアル」、環境部、ｐｐ９３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

本発明の目的は、精子から大量のＰＤＲＮを得るために、精巣にｈＣＧを処理することによって、人工的に精子を製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0021】

上記目的を達成するために、本発明の一態様は、１）サケ科魚類の精巣から精液と未成熟な精巣部分とを分離するステップと；２）前記未成熟な精巣部分をやんわりと磨砕及び人工精漿液下で希釈するステップと；３）前記精巣の細胞を人為的に精子に性成熟させるために、前記精巣の希釈液にｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ；ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を一定の濃度で処理するステップと；４）一定時間経過後、ｈＣＧ処理した精巣の希釈液を遠心分離して、活性を有することができる精子を回収するステップと；５）前記回収された精子からＰＤＲＮ（Ｐｏｌｙ Ｄｅｏｘｙ Ｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抽出するステップと；を含むサケの精巣からの高純度ＰＤＲＮの抽出方法を提供する。

【0022】

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様のＰＤＲＮの抽出方法において、前記サケ科魚類は、サケ亜科、カワヒメマス亜科及びシロマス亜科からなる群から選択される亜科に属する魚種であることが好ましく、前記サケ科魚類は、河口から川の上流１０ｋｍまでの河川サケであることが好ましい。

【0023】

また、本発明の一態様のＰＤＲＮの抽出方法において、前記１）ステップにおいて、前記未成熟な精巣は、成熟の程度が異なる部分を区分して分離することによって、０．７％以上の精子活性度を示す、成熟度が相対的に高い部位であることが好ましく、前記３）ステップにおいて、前記ｈＣＧ処理は、精巣１ｇ当たり２５～２００ＩＵを使用することが好ましい。

【0024】

また、本発明の一態様のＰＤＲＮの抽出方法において、前記４）ステップの一定時間経過は１０分～１時間であることが好ましく、前記未成熟な精巣は、精原細胞又は精細胞を含むことが好ましく、前記５）ステップの前に精子を含む懸濁液に淡水を入れ、精子が有したＡＴＰを消尽させてＰＤＲＮの純度を高めるステップをさらに含むことが好ましい。

【0025】

ｈＣＧ（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンであって、妊婦の尿に混じって出てくるホルモンである。
コイ、フナあるいは金魚は、年中１２℃以下で飼育する場合、いつでも、受精卵が必要とする１２～１８時間以前にｈＣＧ５００ＩＵ／ｋｇあるいは５００ＩＵ／個体を注射して、注射した翌日の夜明けから朝に自然に受精卵を得ることができるように雌と雄の生殖巣が成熟することを確認した。また、ウナギの場合、雌は、サケ脳下垂体抽出物（ｓａｌｍｏｎ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ）を注射して配偶子（卵）を性成熟させるが、雄の場合、ｈＣＧを５００ＩＵ／ｋｇの濃度で毎週注射して、３ヶ月で成熟した精子を得ることができ、雌の成熟した成熟卵との混合で受精卵を得ることができる。

【0026】

本発明の一実施例は、精巣から精液と未成熟な精巣部分とを区分し、未成熟な精巣部分において成熟の程度が異なる部分を区分して分離させた後、成熟度が相対的に高い部位を集めて、人工精漿液下でやんわりと磨砕／希釈し、希釈された活性度が高い部位の精巣の希釈液にｈＣＧを一定の濃度で処理し、１０～３０分経過後、遠心分離して、活性を有することができる精子を回収してＰＤＲＮの原料として使用することである。

【0027】

すなわち、本発明は、新鮮なサケ科魚類の精巣で活性を有する精子を人為的に作って高純度のＰＤＲＮを製造することに関する。新鮮な精巣は成熟度が部位別に異なるが、生殖孔に近いほど、ｈＣＧによる成熟で精原細胞１個から減数分裂によって精細胞と精子が４個まで作られるため、使用された精巣の総重量（ｗｅｔ ｗｅｉｇｈｔ）を超えて収率が得られるので、総確保率が増加する。結果的に、沈殿物を除いて精細胞から精子に変わった状態の乾燥重量が、ｈＣＧ処理を施したときに１．６倍増加し、最終８２％以上のＰＤＲＮ抽出物が、ｈＣＧ処理された処理区において、未処理区に比べて、純粋ＰＤＲＮを基準として２．３倍～３．９倍まで多く得ることができる。そして、一匹の雄から一度に採取可能な精液から得られた純粋ＰＤＲＮを基準として、平均４０．１倍多い高純度のＰＤＲＮを確保することができる。また、成熟した精子に環境水を接触させることで、ＡＴＰの消尽によるさらに高い高純度のＰＤＲＮを作り出すことができる。

【発明の効果】

【0028】

サケ科魚類の一匹の雄から得られる精液は約３０～５０ｍＬで、現在、韓国では、受精作業に使用して残った精液を使用するため、１０～２０ｍＬ程度しか得られないことが限界である。

【0029】

しかし、上述したように、本発明の一態様は、精巣から高純度のＰＤＲＮを抽出する方法であり、既存のサケ科魚類から自然に作られて一度に採取可能な２０ｍＬ（最大５０ｍＬ）の精子（精液）から、純度の高いＰＤＲＮの原料を１００倍～２００倍以上確保することができる。すなわち、活性が高い精液から得ることができるＰＤＲＮよりも非常に高い高濃度で、高純度のＰＤＲＮを精巣から得ることができる。本発明に係るＰＤＲＮの製造方法によれば、マス又はサケの精液及び精巣から高収率でＰＤＲＮを製造することができ、それのみならず、従来の他社の方法よりも、コスト及び手順の面において経済的な方法でＰＤＲＮを抽出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】一般的な魚類の体腔内の未成熟生殖巣（雌雄共通）の空間的位置を示す断面図（横断面及び縦断面）である。

【図2】一般的な魚類の体腔内の未成熟生殖巣（雌雄共通）の縦断面の拡大図である。

【図3】一般的な魚類の精液中の精子の様子を示す断面図（左側）及び顕微鏡写真（右側）である。

【図4】サケ科魚類の成熟した雄の精巣の位置別の等級の区分を示した簡略図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下、本発明を各ステップ別に説明する。
第１ステップ：精液と未成熟な精巣部分とを分離
サケ科魚類の精巣から精液と未成熟な精巣部分とを分離する。図４のＤ部分から流れる精液を集めて原料として使用し、Ｃ部分を、Ｄ部位から精液を全て抜き取った後、所定の位置で切断する。

【0032】

図４によれば、精巣は、精液が出る部分Ｄと、その残りの未成熟な精巣Ａ，Ｂ，Ｃとに分けられる。特に、ホルモン（ｈＣＧ）の未処理時に、Ａ及びＢ部位では精子の活性がほとんど現れず、Ｃの場合にも１％前後の低い活性を示す。成熟した精液Ｄでは、１００％の精子活性を示す。

【0033】

第２ステップ：未成熟な精巣の磨砕及び希釈
未成熟な精巣（図４のＡ、Ｂ、Ｃ）を磨砕し、下記の精漿液（ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ）を用いて希釈する。磨砕の過程は、精巣をはさみで細かく切ると、精巣の精細胞などを包んでいる膜を剥ぎ取ることができるが、この膜を剥ぎ取った後、手袋をはめた手で優しく潰す方法を用いる。

【0034】

このとき、精漿液の組成は、８０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ_２、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌからなり、具体的には、ナトリウム（Ｎａ）１５９．２６±８．８４ｍＭ、カリウム（Ｋ）３３．７２±２．０１ｍＭ、塩素（ｃｈｌｏｒｉｎｅ；Ｃｌ）１３３．０４±５．９６ｍＭ、カルシウム（Ｃａ）１．６８±０．２ｍＭ、及びマグネシウム（Ｍｇ）０．９８８±０．１３ｍＭを含有する（Ｈａｔｅｆ Ａら、２００７、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３８，１１７５－１１８１参照）。有機成分は、総タンパク質０．７５±０．１４ｍｇ・１００ｍＬ^－１、コレステロール２．８６±０．５８ｍｇ・Ｌ^－１、及びブドウ糖３．８１±１．０４ｍＭ・Ｌ^－１である。

【0035】

第３ステップ：ｈＣＧの処理
ｈＣＧは、ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎの略字であって、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン２５～２００ＩＵ／ｇで１０分～１時間処理して、未成熟な精巣の細胞を人為的に精子に性成熟させる。具体的には、前記潰された精巣に精漿液を入れ、希釈した後、インペラが装着された低速撹拌機を用いてゆっくり撹拌しながら、ｈＣＧを定量処理する。ただし、インペラの速度が速いと、細胞が破壊されてしまい、ＰＤＲＮとして不純物が増加する可能性が高くなるので注意しなければならない。

【0036】

ｈＣＧ処理した場合、精巣のＡ部位は３％前後に向上するが、Ｂ部位は３５％、Ｃ部位は８９％の高い活性を示すので、全重量の４５％に該当するＣ部位の精巣を用いて成熟した精子を作り出せば、不純物の少ない高純度のＰＤＲＮを作り出すことができる（図４、表１参照）。

【0037】

第４ステップ：遠心分離
ｈＣＧ処理した精巣希釈液を１，０００～１０，０００ＲＣＦ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｏｒｃｅ）の速度で２０分以上遠心分離して、沈殿した、活性を有し得る精子を回収する。

【0038】

第５ステップ：ＰＤＲＮの抽出
前記回収された精子から通常の方法でＰＤＲＮ（ＰｏｌｙＤｅｏｘｙＲｉｂｏＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抽出する。この抽出過程は、様々な方法が可能であるので、省略する。本発明の特徴は、ＰＤＲＮの抽出方法ではなく、前記に記載したように、高純度のＰＤＲＮを抽出できる人工精液の製造にあるためである。

【0039】

ＰＤＲＮの抽出過程は、例えば、精子を溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で処理した後、冷凍させて粉末化し、遠心分離でＤＮＡを分離した後、タンパク質などを除去してＤＮＡを浄化した後、遠心分離してＤＮＡを沈殿させ、これを洗浄してＤＮＡを精製する。最終的に、１．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ、２．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｅｎｅｒｇｙ、３．Ｎｅｕｂｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅｓ、４．Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ、５．Ｎｅｅｄｌｅ ｓｈｅａｒｉｎｇなどのうちの一つの方法でＤＮＡを分節化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）する。

【実施例】

【0040】

以下、本発明に係る好ましい実施例をより具体的に提示して詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、この技術分野における通常の知識を有する者に本発明が十分に理解されるように提供されるものであって、様々な他の形態に変形可能であり、前記のような実施例によって本発明が限定されるものではない。

【0041】

＜実施例１＞ｈＣＧ処理の有無によるサケの精巣の部位別の精子の活性度（％）
本発明では、雄サケから、精液が出るＤ部分（図４参照）を除いて未成熟状態の精巣を採取した。ホルモン（ｈＣＧ）の未処理時に、ＡとＢ部位では精子の活性がほとんど現れず、Ｃの場合にも１％前後の低い活性を示し、成熟した精液では１００％の精子活性を示した。しかし、ｈＣＧ処理した場合、精巣のＡ部位は３％前後に向上するが、Ｂ部位は３５％、Ｃ部位は８９％の高い活性を示しており、全重量の４５％に該当するＣ部位の精巣を用いて成熟した精子を作り出せば、不純物の少ない高純度のＰＤＲＮを作り出すことができるものと判断した（図４、表１）。

【0042】

【表1】

【0043】

１０月に河川で捕獲された雄の精巣のＣ部位に３種類のホルモンを処理したとき、ＬｈＲＨ（黄体形成ホルモン分泌ホルモン；ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）及びＤＨＰにおいて、それぞれ５％と４％の低い精子活性を示したが、ｈＣＧ処理された実験区では８０％の高い精子活性を示し、不純物の少ない精液の製造が可能になった（表２）。

【0044】

【表2】

【0045】

海面サケの場合には、ｈＣＧ処理を施しても、ほとんど精子活性を示しておらず（表３）、９～１２月の間に河川に上がってきた河川サケを対象として精巣のＣ部位にｈＣＧ処理を施した場合、河川サケは成熟個体であるため、精子活性の差は大きくなかった（表４）。そして、河川の河口堰からの距離による精子の活性は、河口堰（距離０ｍ）で捕獲された雄サケの場合に６５％、１ｋｍの地点で捕獲された雄の場合に８５％の精子活性を示したが、２ｋｍ及び３ｋｍの地点で捕獲された雄サケの場合に９７～９８％の高い精子活性を示した（表５）。

【0046】

【表3】

【0047】

【表4】

【0048】

【表5】

【0049】

前記河川サケの捕獲河口との距離は、河口から河川に上がってきた距離を意味する。すなわち、海の海面サケにはｈＣＧがほとんど作用しないが、サケが河川に上がってきたとすれば、性成熟が始まったものであるため、ｈＣＧが作用し始める。前記表５によれば、海の近くよりも川の上流側に行くほど、ｈＣＧがよく作用することを確認することができる。

【0050】

＜実施例２＞ｈＣＧの処理条件によるサケの精巣の“Ｃ”部位で作られた精子の活性度（％）
河川に上がってきた雄サケの精巣のＣ部位を緩衝溶液で希釈した後、ｈＣＧの処理濃度による精子の活性は、処理しなかった場合に２％と非常に低く、５０ＩＵ／ｇ精巣の処理濃度まで継続して精子活性が増加し、５０～２００ＩＵ／ｇ精巣の処理濃度で８２％以上の精子活性を示した（表６）。

【0051】

【表6】

【0052】

表６のような実験環境で、ｈＣＧの処理濃度別の経過時間による精子の活力を比較した。処理しなかった対照区では、活力の差がなく、２５ＩＵ／ｇ精巣の処理区では、最大７３％まで処理１時間経過時に増加し、５０ＩＵ／ｇ精巣の処理区では、処理１０分頃から８５％の高い精子活性を示し、２０～３０分経過時には９４％以上の高い精子活性を示した。しかし、６０分経過時には８３％に減少し、１２０分経過時には３２％に急激に低くなる精子活性を示した。そして、１００ＩＵ／ｇ精巣の処理区では３０分後、２００ＩＵ／ｇ精巣の処理区では処理２０分経過後に、高くなった精子の活力が低くなることが確認され、５０～２００ＩＵ／ｇ精巣の処理区において、処理後２０分を超える処理時間では、精子の活性がむしろ低下することが確認された（表７）。

【0053】

【表7】

【0054】

＜実施例３＞精巣の“Ｃ”部位のｈＣＧの処理条件によるＰＤＲＮ抽出収率（％）
本発明に用いられた精巣は、河川に上がってきた雄サケの精巣のＣ部位を１０ｇずつ用い、比較のために、正常に採取された精液３０ｍＬを用いた（表８）。そして、５０ＩＵ／ｇ及び１００ＩＵ／ｇ精巣の濃度でｈＣＧ処理した場合、精巣全体と上層液８０％以上を使用した結果とに区分して導出した。

【0055】

処理しなかった場合、乾燥重量は５．１０ｇで、ｈＣＧの処理区に比べて低い乾燥重量を示し、精液を用いた場合の２．８９ｇよりも高かった。これは、処理しない場合に精液よりも重量が重いのは、栄養細胞の重量が重いためであり、ｈＣＧの処理区で乾燥重量が高いのは、ｈＣＧの処理によって精原細胞が精細胞に減数分裂することによって、細胞の数が増加したためと判断される。そして、ｈＣＧの処理区において上層液の乾燥重量が低いのは、栄養細胞などの精細胞に分化しない成分が２０％程度存在するので、上層液において低い乾燥重量が示されるものと判断される。

【0056】

そして、これらのそれぞれの抽出効率は、未処理及びｈＣＧ処理した全精巣を使用した場合にそれぞれ１０．２％と１４．７％前後を示し、上層液のみを使用した場合に７．０～７．２％の抽出効率を示し、１００％精液を使用した場合に６．１％の抽出効率を示した。これらのＰＤＲＮの含量（又は純度）は、精巣１０ｇを使用した場合に、未処理区で１０％、ｈＣＧ処理し、全体を使用した場合に４５～５２％であった。しかし、上層液と精液を使用したものは、いずれも９２％以上のＰＤＲＮ純度を示すことが確認された。

【0057】

これに基づいて、雄サケ１匹から得ることができるＰＤＲＮの量を計算した結果、１匹の雄の精液全体を使用した場合に０．２６ｇのＰＤＲＮを得ることができ、未処理の精巣では０．１６ｇを得たが、ｈＣＧ処理区では、精巣を使用した場合に５．７７～７．６３ｇのＰＤＲＮを得、上層液を使用した場合、ｈＣＧの濃度に関係なく１０．５１ｇ以上のＰＤＲＮを得た。このＰＤＲＮの確保率は、精液を介して確保したものと比較したとき、未処理の場合は０．６倍、５０ＩＵ処理した全精巣を用いた場合に２１．８倍であったが、ｈＣＧ処理後に上層液を選択して使用した場合に３９．７～４０．１倍のＰＤＲＮの確保率を示した。

【0058】

また、ここで得られた上層液は、精子の比率が非常に高い懸濁液であるため、環境水（淡水）に露出させて精子を動くようにして、精子の推進体にあるＡＴＰを消尽させる効果があるため、より高い純度のＰＤＲＮを得ることができると判断される。しかし、この過程で活性を有さない精子の場合、沈殿物として除去されるため、効率の面で考慮する必要があると判断される。しかし、精子から抽出したＰＤＲＮの含量が９２％以上であるため、向上の効果は大きくないと判断される。

【0059】

【表8】

【0060】

以上、好ましい実施例を挙げて本発明を詳細に説明したが、本発明は、前記の実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で当分野における通常の知識を有する者によって様々な変形が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】