特許 7237064 単一免疫グロブリンインターロイキン－１受容体関連（ＳＩＧＩＲＲ）変異型及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-02

(45)【発行日】2023-03-10

(54)【発明の名称】単一免疫グロブリンインターロイキン－１受容体関連（ＳＩＧＩＲＲ）変異型及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6883 20180101AFI20230303BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20230303BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20230303BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230303BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230303BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230303BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230303BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230303BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230303BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230303BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6883 Z

C12Q1/6827 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/6844 Z

C12N15/12 ZNA

C07K14/705

C07K14/715

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

G01N33/68

G01N33/53 M

G01N33/53 D

【請求項の数】 51

(21)【出願番号】P 2020513609

(86)(22)【出願日】2018-09-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-24

(86)【国際出願番号】 US2018049478

(87)【国際公開番号】W WO2019050899

(87)【国際公開日】2019-03-14

【審査請求日】2021-09-03

(31)【優先権主張番号】62/554,857

(32)【優先日】2017-09-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザガ－ハウレギ、クラウディア ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ホロウィッツ、ジュリー

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特表２００１－５２６８９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Pediatrics，2015年，Vol.135, No.6，e1530-e1534

【文献】Cytokine，1999年，Vol.11, No.6，pp.389-399

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有するヒト対象を特定する試験管内の方法であって、
前記方法が、前記対象から得られた試料にて
配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有し、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質；及び／または
配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有し、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検出することを含み、
前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質及び／または前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸分子の存在は、前記対象が早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す、方法。

【請求項2】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれか１つで野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料における前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸分子の存在または非存在が、前記核酸分子において、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを生じるフレームシフト突然変異があるかどうかを判定することによって検出される請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記検出するステップが、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸分子の少なくとも一部を配列決定することを含み、前記配列決定される核酸分子が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

配列決定される前記核酸分子の前記一部が配列番号９に係る１８６位に相当する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記検出するステップが、前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸分子全体を配列決定することを含む請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記検出するステップが、
切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸分子の少なくとも一部を増幅することであって、前記増幅される核酸分子が配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてアミノ酸をコードするコドンを包含する、前記増幅することと；
前記増幅された核酸分子を検出可能な標識で標識することと；
プローブを含む支持体に前記標識された核酸分子を接触させることであって、前記プローブが配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、前記接触させることと；
前記検出可能な標識を検出することとを含む請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記試料における前記核酸分子がｍＲＮＡであり、前記検出するステップがさらに、前記増幅するステップに先立って前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含む請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記検出するステップが、
検出可能な標識を含むプローブに切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を接触させることであって、前記プローブが配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、
前記検出可能な標識を検出することとを含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ヒト対象が、クローン病を発症するリスクを有すると特定される請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

切り詰められたヒト単一免疫グロブリンインターロイキン－１受容体関連（ＳＩＧＩＲＲ）タンパク質をコードする核酸配列または前記核酸配列の相補体を含む単離された核酸分子であって、前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められている、単離された核酸分子。

【請求項13】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む請求項１２に記載の単離された核酸分子。

【請求項14】

前記核酸分子がｃＤＮＡである請求項１２または１３に記載の単離された核酸分子。

【請求項15】

前記核酸分子がゲノムＤＮＡであり、且つ配列番号２に係る９９６２位に相当する位置にてグアニンを含む請求項１２または１３に記載の単離された核酸分子。

【請求項16】

前記核酸分子が配列番号２を含む請求項１５に記載の単離された核酸分子。

【請求項17】

前記核酸分子がｍＲＮＡであり、且つ配列番号４に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む請求項１２または１３に記載の単離された核酸分子。

【請求項18】

前記核酸分子がｍＲＮＡであり、且つ配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含む請求項１２、１３及び１７のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。

【請求項19】

前記核酸分子が配列番号４を含む請求項１７に記載の単離された核酸分子。

【請求項20】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれか１つにて野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む請求項１２～１９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。

【請求項21】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項１２～２０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。

【請求項22】

請求項１２～２１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含むベクター。

【請求項23】

請求項１２～２１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項24】

請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項25】

前記核酸配列が前記宿主細胞にて活性があるプロモーターに操作可能に連結されている請求項２３または２４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含むｃＤＮＡであって、前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められている、ｃＤＮＡ。

【請求項27】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む請求項２６に記載のｃＤＮＡ。

【請求項28】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれかにて野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む請求項２６または２７に記載のｃＤＮＡ。

【請求項29】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項２６～２８のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。

【請求項30】

前記ｃＤＮＡが配列番号６に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む請求項２６～２９のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。

【請求項31】

前記ｃＤＮＡが、配列番号６に係るそれぞれ５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＴＡ及びＡＧＣを含む請求項２６～３０のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。

【請求項32】

前記ｃＤＮＡが配列番号６を含む請求項２６～３１のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。

【請求項33】

請求項２６～３２のいずれか１項に記載のｃＤＮＡを含むベクター。

【請求項34】

請求項２６～３２のいずれか１項に記載のｃＤＮＡを含む宿主細胞。

【請求項35】

請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項36】

前記ｃＤＮＡが前記宿主細胞にて活性があるプロモーターに操作可能に連結されている請求項３４または３５に記載の宿主細胞。

【請求項37】

切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質を含む単離されたまたは組換えのポリペプチドであって、前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められている、単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項38】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む請求項３７に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項39】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれか１つにて野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む請求項３７または３８に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項40】

前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質が、配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む請求項３７～３９のいずれか１項に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項41】

前記ポリペプチドが異種ポリペプチドに融合される請求項３７～４０のいずれか１項に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項42】

前記異種ポリペプチドが、ペプチド精製タグ、蛍光タンパク質、またはペプチド精製タグと蛍光タンパク質の双方を含む請求項４１に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチド。

【請求項43】

請求項３７～４２のいずれか１項に記載の単離されたまたは組換えのポリペプチドと担体とを含む組成物。

【請求項44】

少なくとも約１５のヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブまたはプライマーであって、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有し、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む切り詰められたヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子と特異的にハイブリッド形成する、または前記切り詰められたヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸配列の相補体と特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、プローブまたはプライマー。

【請求項45】

前記プローブまたはプライマーが、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸分子の一部と特異的にハイブリッド形成する請求項４４に記載のプローブまたはプライマー。

【請求項46】

前記プローブまたはプライマーが、ストリンジェントな条件下で、前記切り詰められたヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする前記核酸配列またはその相補体と特異的にハイブリッド形成する請求項４４または４５に記載のプローブまたはプライマー。

【請求項47】

前記プローブまたはプライマーが標識を含む請求項４４～４６のいずれか１項に記載のプローブまたはプライマー。

【請求項48】

請求項４４～４６のいずれか１項に記載のプローブが連結された基材を含む支持体。

【請求項49】

前記支持体がマイクロアレイである請求項４８に記載の支持体。

【請求項50】

変異特異的なプローブまたはプライマーであって、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の核酸配列と相補性である核酸配列を含み、前記変異特異的なプローブまたはプライマーが配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸分子の一部と相補性である核酸配列を含む、変異特異的なプローブまたはプライマー。

【請求項51】

前記変異特異的なプローブまたはプライマーが少なくとも約１５のヌクレオチドを含む請求項５０に記載の変異特異的なプローブまたはプライマー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１７年９月６日に出願された米国仮特許出願番号６２／５５４，８５７に対して優先権を主張する。

【0002】

配列表に対する言及
本出願には、５６キロバイトのサイズの２０１８年８月３０日に作成された１８９２３８００６０２ＳＥＱと名付けられたテキストファイルとして電子提出された配列表が含まれる。配列表は参照によって本明細書に組み入れられる。

【0003】

分野
本開示は一般に遺伝学の分野に関する。さらに詳しくは、本開示は、たとえば、早期発症型炎症性腸疾患（ＥＯ－ＩＢＤ）に関連する単一免疫グロブリンインターロイキン－１受容体関連（ＳＩＧＩＲＲ）における遺伝子変異及びポリペプチド変異型に関する。

【背景技術】

【0004】

特許、特許出願、受入番号、技術論文及び学術論文を含む種々の参考文献が本明細書全体を通して引用されている。各参考文献はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0005】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、消化管における片利共生微生物叢に対する不適当な免疫応答が発端となり、平均年齢３０代で発症する遺伝的に異質性の慢性炎症性疾病である。ＩＢＤの重度の単一遺伝子形態は小児年齢（１８歳未満）の発症を呈することができ、約５０の「メンデル性」遺伝子における稀な高度浸透性変異に起因している。しかしながら、早期発症型炎症性腸疾患（ＥＯ－ＩＢＤ）の遺伝的構造は不十分にしか理解されておらず、患者の大半は遺伝的には診断されていないままである。

【0006】

本開示は、ＳＩＧＩＲＲの生物学を理解するのに役立ち、早期発症型炎症性腸疾患の小児の診断及び治療を助けるであろう新規ＳＩＧＩＲＲの変異型を提供する。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、たとえば、早期発症型炎症性腸疾患のような炎症性腸疾患に関連すると本明細書で実証されているＳＩＧＩＲＲ変異型ポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ）、及びＳＩＧＩＲＲ変異型ポリペプチドを提供する。

【0008】

本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含む単離された核酸分子も提供し、その際、該タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置で切り詰められる。

【0009】

本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含むゲノムＤＮＡ分子も提供し、その際、該タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置で切り詰められる。

【0010】

本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含むｃＤＮＡ分子も提供し、その際、該タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置で切り詰められる。

【0011】

本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含むｍＲＮＡ分子も提供し、その際、タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置で切り詰められる。

【0012】

本開示はまた、本明細書で開示されている単離された核酸分子のいずれかを含むベクターも提供する。
本開示はまた、本明細書で開示されている単離された核酸分子またはベクターのいずれかと担体とを含む組成物も提供する。

【0013】

本開示はまた、本明細書で開示されている単離された核酸分子またはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。
本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質の少なくとも一部を含む単離されたまたは組換えのポリペプチドも提供し、その際、タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる。

【0014】

本開示はまた、本明細書で開示されている単離されたまたは組換えのポリペプチドのいずれかと担体とを含む組成物も提供する。
本開示はまた、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列とハイブリッド形成し、その際、該タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、またはヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列の相補体とハイブリッド形成し、その際、該タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、少なくとも約５のヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブまたはプライマーも提供する。

【0015】

本開示はまた、本明細書で開示されているプローブのいずれかがハイブリッド形成する基材を含む支持体も提供する。
本開示はまた、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列に対して相補性である核酸配列を含む変異特異的なプローブまたはプライマーも提供し、変異特異的なプローブまたはプライマーは配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する複数の位置をコードする核酸分子の一部に対して相補性である核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたはプライマーは配列番号９に係る１８６位に相当する位置をコードする核酸分子の一部と特異的にハイブリッド形成し、またはその相補体と特異的にハイブリッド形成する。変異特異的なプローブまたはプライマーは野生型のＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子とはハイブリッド形成しない。

【0016】

本開示はまた、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有するヒト対象を特定する方法も提供し、その際、方法は、対象から得られる試料にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質及び／または切り詰められたタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検出することを含み、切り詰められたタンパク質及び／または切り詰められたタンパク質をコードする核酸分子の存在は、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す。

【0017】

本開示はまた、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有するヒト対象を特定する方法も提供し、その際、方法は、対象から得られる試料にて配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質及び／または配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検出することを含み、切り詰められたタンパク質及び／または切り詰められたタンパク質をコードする核酸分子の存在は、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す。

【0018】

本開示はまた、ヒト対象から得られるＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子にて変異を検出することであって、変異は切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする、検出することと、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば、ヒト対象を早期発症型炎症性腸疾患であると診断すること、または対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さないのであれば、ヒト対象を炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクがあると診断することとを含む、ヒト対象にて炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを検出する方法も提供する。

【0019】

本開示はまた、ヒト対象から得られるＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子にて変異を検出することであって、変異は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする、検出することと、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば、ヒト対象を早期発症型炎症性腸疾患であると診断すること、または対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さないのであれば、ヒト対象を炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクがあると診断することとを含む、ヒト対象にて炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを検出する方法も提供する。

【0020】

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図は幾つかの態様を説明し、記載と一緒に本開示の原理を説明するのに役立つ。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1-1】パネルＡ、Ｂ及びＣはクローン病の家族において優性分離するＳＩＧＩＲＲでの切り詰め型変異型を示す。

【図1-2】同上。

【図2-1】未刺激のまたは２ｍｇ／ｍＬのＬＰＳで７２時間処理した、健常対照、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者及び内部にＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦを持っていない４人のＥＯ ＩＢＤ患者から生成したＬＣＬから採取した細胞培養上清で実施したＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの炎症誘発性サイトカインパネルの結果を示す図である。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【図2-5】同上。

【図3-1】未刺激のまたは２ｍｇ／ｍＬの抗ＩｇＭ／抗ＣＤ４０で１６時間処理した、健常対照、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者及び内部にＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦを持っていない４人のＥＯ ＩＢＤ患者から生成したＬＣＬから採取した細胞培養上清で実施したＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの炎症誘発性サイトカインパネルの結果を示す図である。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図3-5】同上。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本開示の追加の利点は、後に続く説明にてある程度述べられるであろうし、説明からある程度明らかであろう、または本明細書で開示されている実施形態の実践によって精通することができる。本開示の利点は、添付のクレームで特に指摘される要素及び組み合わせによって実現され、達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の双方は例示及び説明的なもののみであり、請求項に係るような実施形態の制約ではないことが理解されるべきである。

【0023】

説明
本開示の態様に関係する種々の用語が本明細書及びクレームの全体を通して使用されている。そのような用語は、特に指示されない限り、当該技術における普通の意味を与えられるものとする。他の特定的に定義された用語は本明細書で提供されている定義と一致するように解釈されるものとする。

【0024】

明示的に述べられない限り、本明細書に記述されているいかなる方法または態様も、そのステップが特定の順序で実施されることを必要とすると解釈されることを全く意図するものではない。従って、方法クレームがクレームまたは説明にてステップが特定の順序に限定されるべきであると具体的に述べていない場合、順序が推察されることはどんな点でも全く意図されるものではない。このことは、ステップもしくは操作上の流れの配置に関する論理の問題、文法構成もしくは句読点に由来する明白な意味、または本明細書に記載されている態様の数もしくは種類を含む、解釈についての考えられる不明確な基準に対して成り立つ。

【0025】

本明細書で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に指示しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用されるとき、「対象」及び「患者」という用語は相互交換可能に使用される。対象には哺乳類を含む任意の動物が含まれてもよい。哺乳類には限定しないで、家畜（たとえば、ウマ、ウシ、ブタ）、愛玩動物（たとえば、イヌ、ネコ）、実験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ）及び非ヒト霊長類が挙げられる。一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0026】

本明細書で使用されるとき、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を含むことができ、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含んでもよく、一本鎖、二本鎖または多重鎖であることができる。核酸の一本鎖はその相補体も指す。

【0027】

本明細書で使用されるとき、「に相当する」という表現または文法的なその変形は、所与のアミノ酸配列または核酸配列または位置の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸配列または核酸配列が参照配列（たとえば、本明細書の参照配列は（野生型または完全長の）ＳＩＧＩＲＲの核酸分子またはポリペプチドである）と比較される場合の特定された参照配列の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基（たとえば、アミノ酸またはヌクレオチド）の数または残基（たとえば、アミノ酸またはヌクレオチド）の位置は、所与のアミノ酸または核酸の配列の範囲内での残基の実際の数的な位置によるのではなく参照配列に関して指定される。たとえば、所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間での残基の一致を最適化することによって参照配列に対してアラインメントを行うことができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸または核酸の配列における残基の番号付けはそれがアラインメントされている参照配列に関して行われる。

【0028】

たとえば、「配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質」という表現（及び類似の表現）は、ＳＩＧＩＲＲタンパク質のアミノ酸配列が配列番号９の配列に対してアラインメントされると、ＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰む（たとえば、ＳＩＧＩＲＲタンパク質の末端アミノ酸は２１５位のアミノ酸である）ことを意味する。または、言い換えれば、これらの表現は配列番号９の２１５位に相同である位置にて切り詰めを有するＳＩＧＩＲＲタンパク質を指す。本明細書では、そのようなタンパク質を「切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質」または「変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質」または「ｐ．ｋ１８６ｆｓ^＊３１変異型」とも呼ぶ。

【0029】

配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、所与のＳＩＧＩＲＲタンパク質と配列番号９のアミノ酸配列との間で配列アラインメントを行うことによって容易に同定することができる。同様に、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質は、所与のＳＩＧＩＲＲタンパク質と配列番号９のアミノ酸配列との間で配列アラインメントを行うことによって容易に同定することができる。配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰めを同定するために、または配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを同定するために配列アラインメントを行うのに使用することができる種々のコンピューターアルゴリズムが存在する。たとえば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９－３４０２）またはＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｓｉｅｖｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１０７９，１０５－１１６）を使用することによって配列比較を行ってもよい。しかしながら、配列は手作業でアラインメントすることもできる。

【0030】

ＳＩＧＩＲＲにおけるある特定の変異が早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクに関連することが本開示に従って観察されている。一般に、このタンパク質の機能は、特に１８歳未満の小児では完全に理解されているわけではない。いかなるＳＩＧＩＲＲの遺伝子またはタンパク質の変異型もヒトにおける早期発症型炎症性腸疾患との既知の関連を有さないと考えられる。さらに、いかなるＳＩＧＩＲＲの遺伝子またはタンパク質の変異型も、特に小児における早期発症型炎症性腸疾患との既知の関連を有さないと考えられる。罹患した家系員にて早期発症型炎症性腸疾患の表現型で分離するＳＩＧＩＲＲ遺伝子における稀な変異型が本開示に従って同定された。たとえば、ヒトＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（たとえば、それぞれ野生型の配列番号３及び配列番号５）の５５７位におけるアデニンの欠失を生じ、それが配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる（たとえば、末端アミノ酸は２１５位に位置する）ＳＩＧＩＲＲタンパク質を作り出すフレームシフトを生じる遺伝的変異は、そのような変異を有するヒトは早期発症型炎症性腸疾患を発症する可能性があることを示すことが観察されている。要するに、本明細書に記載されている遺伝的解析は、ＳＩＧＩＲＲ遺伝子、特にＳＩＧＩＲＲ遺伝子における切り詰め変異型または機能喪失変異型が早期発症型炎症性腸疾患を発症することに対する高い易罹患性に関連することを示唆している。従って、早期発症型炎症性腸疾患に関連するＳＩＧＩＲＲの変異を有するヒト対象は、早期発症型炎症性腸疾患が抑制され、その症状が軽減され、及び／または症状の発症が抑えられるように治療されてもよい。従って、本開示は、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡを含む単離されたまたは組換えのＳＩＧＩＲＲ変異型遺伝子、ならびに単離されたまたは組換えのＳＩＧＩＲＲ変異型ポリペプチドを提供する。さらに、本開示は対象にてそのような変異の同定を活用してそのような対象における炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを同定するもしくは階層化する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有すると対象を診断する方法を提供し、それによりリスクがある対象または疾患活動期の対象が治療され得る。

【0031】

２つの野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質のアミノ酸配列が配列番号７及び配列番号８に記述されている。配列番号７を有する野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質は４１０アミノ酸長であるのに対して配列番号８を有する野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質は５０４のアミノ酸長である。配列番号７及び配列番号８の双方を参照して、野生型タンパク質の１８６位～２１５位は以下示される順で以下のアミノ酸を含む：Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ（配列番号１０）。

【0032】

本開示は、炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患に関連するＳＩＧＩＲＲ変異型タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、核酸分子は切り詰められたＳＩＧＩＲＲ変異型タンパク質をコードする。たとえば、本開示は、ヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含む単離された核酸分子を提供し、タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる。

【0033】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。

【0034】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。

【0035】

一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヒトＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列または核酸配列の相補体を含む、またはそれから成る。本明細書では、配列同一性パーセントが参照される場合、高いパーセントの配列同一性が低いものより好ましい。

【0036】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成り、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列を含む。

【0037】

野生型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡの核酸配列は配列番号１に記述されている。配列番号１を含む野生型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡは１１，７３９のヌクレオチド長である。配列番号１を参照して、野生型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡの９９６２位はアデニンである。

【0038】

本開示は、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ分子は切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ分子は、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成り、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列を含む。

【0039】

一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２に係る９９６２位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成る。それに対して、野生型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡは、配列番号１に係る９９６２位に相当する位置にてアデニンを含む。変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡにおける変異はこのアデニンの欠失によるものであり、それは一ヌクレオチド塩基のフレームシフトを生じ、それによって配列番号２の９９６２位に相当する位置がグアニンとなる。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、配列番号２に係る核酸配列を含む、またはそれから成る。

【0040】

一部の実施形態では、単離された核酸分子はゲノムＤＮＡ全体の配列に満たないものを含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１１０００、または少なくとも約１１５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の少なくとも約１０００～少なくとも約２０００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。

【0041】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２の少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、または少なくとも約２５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、そのような連続するヌクレオチドは連続するヌクレオチドの他の核酸分子と組み合わせて本明細書に記載されているｃＤＮＡ分子を作り出してもよい。

【0042】

そのような単離された核酸分子を使用して、たとえば、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ及びタンパク質を、または外因性のドナー配列として発現させることができる。集団内での遺伝子配列は、たとえば、ＳＮＰのような遺伝子多型に起因して変化し得ることが理解される。本明細書で提供されている例は単に例となる配列であり、他の配列も可能である。

【0043】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、対応する野生型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡに関して配列番号９をコードする１以上の非必須のセグメントを欠失している変異型ＳＩＧＩＲＲのミニ遺伝子を含む。一部の実施形態では、欠失した非必須のセグメント（複数可）は１以上のイントロン配列を含む。一部の実施形態では、ＳＩＧＩＲＲのミニ遺伝子は配列番号２の一部に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有し、ミニ遺伝子は配列番号２に係る９９６２位に相当する位置にてグアニンを有する核酸配列を含む。

【0044】

野生型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡの核酸配列は配列番号３に記述されている。配列番号３を含む野生型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡは１２３０のヌクレオチド長である。配列番号３を参照して野生型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡの５５７位はアデニンである。

【0045】

本開示はまた、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子も提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成り、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列を含む。

【0046】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成る。それに対して、野生型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡは、配列番号３に係る５５７位に相当する位置にてアデニンを含む。変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡにおける変異はこのアデニンの欠失によるものであり、それは一ヌクレオチド塩基のフレームシフトを生じ、それによって配列番号４の５５７位に相当する位置がグアニンとなる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含む核酸配列を含む、またはそれから成る。それに対して、野生型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡは、配列番号３に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＡＧを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に係る核酸配列を含む、またはそれから成る。

【0047】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列全体に満たないヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約６００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の少なくとも約２００～少なくとも約５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。この点で、長いｍＲＮＡ分子が短いものより好ましい。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４の少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、または少なくとも約５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。この点で、長いｍＲＮＡ分子が短いものより好ましい。一部の実施形態では、そのようなｍＲＮＡ分子は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを含む。一部の実施形態では、そのようなｍＲＮＡ分子は配列番号４に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む。一部の実施形態では、そのようなｍＲＮＡ分子は配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含む。

【0048】

野生型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡの核酸配列は配列番号５に記述されている。配列番号５を含む野生型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡは停止コドンを含めて１２３３ヌクレオチド長である。配列番号５を参照して野生型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡの５５７位はアデニンである。

【0049】

本開示はまた、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子も提供する。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子は切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含む、またはそれから成り、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む。

【0050】

一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号６に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成る。それに対して、野生型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡは配列番号５に係る５５７位に相当する位置にてアデニンを含む。変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡにおける変異はこのアデニンの欠失によるものであり、それは一ヌクレオチド塩基のフレームシフトを生じ、それによって配列番号６の５５７位に相当する位置がグアニンとなる。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号６に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＴＡ及びＡＧＣを含む核酸配列を含む、またはそれから成る。それに対して、野生型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡは配列番号５に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＴＡ及びＡＡＧを含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡは配列番号６に係る核酸配列を含む、またはそれから成る。

【0051】

一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ分子の配列全体に満たないものを含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子は配列番号６の少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、または少なくとも約６００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子は配列番号６の少なくとも約２００～少なくとも約５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。この点で、長いｃＤＮＡ分子が短いものより好ましい。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子は配列番号６の少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、または少なくとも約５００の連続するヌクレオチドを含む、またはそれから成る。この点で、長いｃＤＮＡ分子が短いものより好ましい。一部の実施形態では、そのようなｃＤＮＡ分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを含む。一部の実施形態では、そのようなｃＤＮＡ分子は配列番号６に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む。一部の実施形態では、そのようなｃＤＮＡ分子は配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＴＡ及びＡＧＣを含む。

【0052】

本開示はまた、変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ（たとえば、配列番号２）、変異型ＳＩＧＩＲＲのミニ遺伝子、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ（たとえば、配列番号４）、及び／または変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ（たとえば、配列番号６）とハイブリッド形成する単離された核酸分子も提供する。一部の実施形態では、そのような単離された核酸分子は少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１１０００、または少なくとも約１１５００のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は少なくとも約１５のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は少なくとも約１５～少なくとも約３５のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、そのような単離された核酸分子はストリンジェントな条件下で変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ（たとえば、配列番号２）、変異型ＳＩＧＩＲＲのミニ遺伝子、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ（たとえば、配列番号４）、及び／または変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ（たとえば、配列番号６）とハイブリッド形成する。そのような単離された核酸分子は、本明細書に記載されているまたは例示されているようなプローブとして、プライマーとして、または変異特異的なプローブもしくはプライマーとして使用されてもよい。

【0053】

一部の実施形態では、単離された核酸分子は、変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ（たとえば、配列番号２）、変異型ＳＩＧＩＲＲのミニ遺伝子、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ（たとえば、配列番号４）、及び／または変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ（たとえば、配列番号６）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸分子の少なくとも約１５の連続するヌクレオチドとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、約１５～約１００のヌクレオチド、または約１５～約３５のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は約１５～約１００のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、単離された核酸分子は約１５～約３５のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。

【0054】

一部の実施形態では、本明細書で開示されている核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれも精製することができ、たとえば、少なくとも約９０％純粋である。一部の実施形態では、本明細書で開示されている核酸分子のいずれか、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子は精製することができ、たとえば、少なくとも約９５％純粋である。本明細書で開示されている核酸分子のいずれか、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子は精製することができ、たとえば、少なくとも約９９％純粋である。精製は人の手によるものであり、人工の精製技法による。

【0055】

本開示はまた、本明細書で開示されている単離された核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子のいずれかの断片も提供する。一部の実施形態では、断片は本明細書で開示されている核酸配列のいずれかの少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００の連続する残基またはその任意の相補体を含む、またはそれから成る。この点で、長い断片が短いものより好ましい。一部の実施形態では、断片は少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、または少なくとも約５０の連続する残基を含む、またはそれから成る。この点で、長い断片が短いものより好ましい。一部の実施形態では、断片は少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、または少なくとも約３５の連続する残基を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、断片は少なくとも約２０の連続する残基を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、断片は少なくとも約２５の連続する残基を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、断片は少なくとも約３０の連続する残基を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、断片は少なくとも約３５の連続する残基を含む、またはそれから成る。断片は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするまたは配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置をコードする核酸分子の一部を含む、またはそれから成ることが想定される。そのような断片は、本明細書に記載されているまたは例示されているようなプローブとして、プライマーとして、または対立遺伝子特異的なプライマーとして使用されてもよい。

【0056】

本開示はまた、プローブ及びプライマーも提供する。本開示のプローブまたはプライマーは、本明細書で開示されている核酸分子のいずれかと特異的にハイブリッド形成する核酸配列またはその相補体を有する。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーはストリンジェントな条件下にて本明細書で開示されている核酸分子のいずれかと特異的にハイブリッド形成する。本開示はまた、中度の条件下で、本明細書で開示されている核酸分子のいずれかとハイブリッド形成する核酸配列またはその相補体を有する核酸分子も提供する。本開示に係るプローブまたはプライマーは好ましくは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする核酸コドンまたはその相補体を包含する。従って、好ましい実施形態では、本開示は本明細書の上記及び以下でさらに詳細に定義されている変異特異的なプライマーを提供する。

【0057】

本開示に係るプローブを使用して、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質（たとえば、配列番号９に係る）をコードする変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡ）を検出してもよい。加えて、本開示に係るプライマーを使用して変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子またはその断片を増幅してもよい。本開示はまた、上記に記載されているプライマーの１つを含むプライマーの対も提供する。切り詰めに至るフレームシフト変異型を含有するＳＩＧＩＲＲの断片のゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅については、好適なプライマー配列には、順行プライマー（５’から３’）：ＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣ（配列番号１２）及び逆方向プライマー（５’から３’）：ＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号１３）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

本明細書で開示されている核酸分子は天然に存在するＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ転写物の核酸配列を含むことができ、または天然に存在しない配列を含むことができる。一部の実施形態では、天然に存在する配列は同義突然変異またはコードされているＳＩＧＩＲＲのポリペプチドに影響を与えない突然変異に起因して天然に存在しない配列とは異なることができる。たとえば、配列は同義突然変異またはコードされているＳＩＧＩＲＲのポリペプチドに影響を与えない突然変異を除いて同一であることができる。同義突然変異または同義置換は、生じるアミノ酸配列が修飾されないようにタンパク質をコードする遺伝子のエクソンにて１つのヌクレオチドを別のものに置換することである。これは、一部のアミノ酸が１を超える３塩基対コドンによってコードされる、遺伝子コードの縮重のゆえに可能である。同義置換は、たとえば、コドンの最適化の過程で使用される。本明細書で開示されている核酸分子はコドンで最適化することができる。

【0059】

開示されている核酸分子と相互作用することができる機能性ポリヌクレオチドも、本明細書で提供される。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子と結合すること、または特定の反応を触媒することなどの特定の機能を有する核酸分子である。機能性ポリヌクレオチドの例には、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられるが、これらに限定されない。機能性ポリヌクレオチドは、標的分子が持つ特定の活性のエフェクター、阻害剤、調節剤及び刺激剤として作用することができ、または機能性ポリヌクレオチドは任意の他の分子と独立したデノボ活性を持つことができる。

【0060】

アンチセンス分子は、標準的なまたは非標準的な塩基対合を介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、たとえば、ＲＮＡ分解酵素Ｈが介在するＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッド分解を介した標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、正常では標的分子で行われる処理機能、たとえば、転写または複製を妨害するように設計される。アンチセンス分子は標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスできる領域を特定することによってアンチセンスの効率を最適化する多数の方法が存在する。例となる方法には、試験管内選択実験及びＤＭＳやＤＥＰＣを用いたＤＮＡ修飾試験が挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンス分子は一般に、約１０^－６以下、約１０^－８以下、約１０^－１０以下または約１０^－１２以下の解離定数（ｋ_ｄ）で標的分子と結合する。アンチセンス分子の設計及び使用に役立つ方法及び技法の代表的な例は、以下に非限定で列挙する米国特許にて見いだすことができる：５，１３５，９１７；５，２９４，５３３；５，６２７，１５８；５，６４１，７５４；５，６９１，３１７；５，７８０，６０７；５，７８６，１３８；５，８４９，９０３；５，８５６，１０３；５，９１９，７７２；５，９５５，５９０；５，９９０，０８８；５，９９４，３２０；５，９９８，６０２；６，００５，０９５；６，００７，９９５；６，０１３，５２２；６，０１７，８９８；６，０１８，０４２；６，０２５，１９８；６，０３３，９１０；６，０４０，２９６；６，０４６，００４；６，０４６，３１９；及び６，０５７，４３７。アンチセンス分子の例には、アンチセンスＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

本明細書で開示されている単離された核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの双方を含むことができる。単離された核酸分子は、たとえば、ベクターにおける異種核酸配列、または異種標識に連結する、または融合することができる。たとえば、本明細書で開示されている単離された核酸分子は、単離された核酸分子及び異種核酸分子を含むベクターまたは外因性ドナー配列に存在することができる。単離された核酸分子はまた、異種標識、たとえば、蛍光標識に連結する、または融合することもできる。標識の他の例は本明細書の別の部分で開示されている。

【0062】

標識は直接検出可能であることができ（たとえば、蛍光色素分子）、または間接的に検出可能であることができる（たとえば、ハプテン、酵素または蛍光消光剤）。そのような標識は、分光分析、光化学、生化学、免疫化学または化学の手段によって検出可能であることができる。そのような標識には、たとえば、放射線計数装置で測定することができる放射性標識；視覚的に観察するまたは分光光度計で測定することができる色素、染料または他の色原体；スピン標識分析器で測定することができるスピン標識；及び出力シグナルが好適な分子付加体の励起によって生成され、染料によって吸収される光による励起によって視覚化することができる、または標準の蛍光計もしくは画像化システムで測定することができる蛍光標識（たとえば、蛍光色素分子）が挙げられる。標識は、たとえば、出力シグナルがシグナル化合物の化学修飾によって生成される化学発光物質；金属含有物質；または、たとえば、無色の基質からの着色した生成物の形成のようなシグナルの酵素依存性の二次生成が発生する酵素であることができる。「標識」という用語は、続いて基質と共に加えられるとコンジュゲートされた分子を用いて検出可能なシグナルを生成するようにコンジュゲートされた分子に選択的に結合することができる「タグ」またはハプテンを指すこともできる。たとえば、ビオチンをタグとして用い、次いで西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジンまたはストレプトアビジンのコンジュゲートを用いてタグに結合し、次いで比色基質（たとえば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）または蛍光発生基質を用いてＨＲＰの存在を検出することができる。タグとして使用されて精製を助けることができる例となる標識には、ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧまたは３×ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓまたはポリヒスチジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、エピトープタグ、または免疫グロブリンのＦｃ部分が挙げられるが、これらに限定されない。多数の標識が知られており、それらには、たとえば、粒子、蛍光色素分子、ハプテン、酵素及びその比色性、蛍光性及び化学発光性の基質及び他の標識が挙げられる。

【0063】

開示されている核酸分子は、たとえば、ヌクレオチド、非天然のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチド、たとえば、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド置換体を含むことができる。そのようなヌクレオチドには、修飾された塩基、糖もしくはリン酸基を含有する、またはその構造に非天然の部分を組み込んでいるヌクレオチドが挙げられる。非天然のヌクレオチドには、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化された、アミノ化された、脱アミノ化された、アルキル化された、ベンジル化された、及び蛍光標識されたヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

本明細書で開示されている核酸分子はまた、１以上のヌクレオチドの類似体または置換体も含むことができる。ヌクレオチド類似体は塩基、糖またはリン酸の部分のいずれかに修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分への修飾には、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ／Ｕの天然の及び合成の修飾、ならびに、たとえば、シュードウリジン、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、及び２－アミノアデニン－９－イルのような様々なプリン塩基またはピリミジン塩基が挙げられるが、これらに限定されない。修飾された塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン及び６－メチルグアニン及びアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルアデニン及び２－プロピルグアニン及びアデニン及びグアニン他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン及び６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換されたアデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換されたウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、５－置換されたピリミジン、６－アザピリミジン、及び２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン及び５－メチルシトシンを含むが、これらに限定されないＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換されたプリンのような、ある特定のヌクレオチド類似体は二本鎖形成の安定性を高めることができる。塩基修飾は、たとえば、糖修飾、たとえば、２’－Ｏ－メトキシエチルと組み合わせて、たとえば、高い二本鎖安定性のような独特の特性を達成できることが多い。

【0065】

ヌクレオチド類似体は糖部分の修飾も含むことができる。糖部分に対する修飾には、リボース及びデオキシリボースの天然の修飾ならびに合成の修飾が挙げられるが、これらに限定されない。糖部分の修飾には、２’位での以下の修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルが挙げられるが、これらに限定されず、その際、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されたまたは非置換のＣ_１－１０アルキルまたはＣ_２－１０アルケニル、及びＣ_２－１０アルキニルであってもよい。例となる２’糖修飾には、－Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＮＨ_２、及び－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２も挙げられるが、これらに限定されず、その際、ｎ及びｍは１～約１０である。

【0066】

２’位における他の修飾には、Ｃ_１－１０アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び類似の特性を有する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない。同様の修飾は、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’連結したオリゴヌクレオチドの糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行われてもよい。修飾された糖には架橋環の酸素での修飾、たとえば、ＣＨ_２及びＳを含有するものが挙げることもできる。ヌクレオチドの糖類似体は、たとえば、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分のような糖模倣体を有することもできる。

【0067】

ヌクレオチド類似体はリン酸部分でも修飾することができる。修飾されたリン酸部分には、２つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル，及びボラノホスフェートを含有するように修飾することができるものが挙げられるが、これらに限定されない。２つのヌクレオチド間のこれらのリン酸結合または修飾されたリン酸結合は３’－５’結合または２’－５’結合を介することができ、結合は、たとえば、３’－５’から５’－３’にまたは２’－５’から５’－２’に反転した極性を含有することができる。種々の塩、混合塩及び遊離酸の形態も含まれる。

【0068】

ヌクレオチド置換体には、ヌクレオチドと類似の官能特性を有するが、リン酸部分、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含有しない分子が含まれる。ヌクレオチド置換体には、Ｗａｔｓｏｎ・ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの方法で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結される分子が含まれる。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に従うことができる。

【0069】

ヌクレオチド置換体には、リン酸部分または糖部分が置き換えられているヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体も含まれる。一部の実施形態では、ヌクレオチド置換体は標準のリン原子を含有しなくてもよい。リン酸に対する置換体は、たとえば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオチド間結合であることができる。これらには、モルフォリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホンの主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；アルケン含有主鎖；スルファミン酸主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノの主鎖；スルホネート及びスルホンアミドの主鎖；アミド主鎖；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２の成分部分を有するその他を有するものが挙げられる。

【0070】

ヌクレオチド置換体では、ヌクレオチドの糖部分及びリン酸部分の双方が、たとえば、アミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも理解される。

【0071】

分子の他の型（コンジュゲート）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に連結して、たとえば、細胞の取り込みを高めることも可能である。コンジュゲートはヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲートには、たとえば、コレステロール部分のような脂質部分、コール酸、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオールのようなチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオールまたはウンデシルの残基のような脂肪族鎖、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたは１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホン酸トリエチルアンモニウムのようなリン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が挙げられる。

【0072】

本開示はまた、本明細書で開示されている１以上の核酸分子を含むベクターも提供する。一部の実施形態では、ベクターは本明細書で開示されている１以上の核酸分子と異種核酸とを含む。ベクターは核酸分子を輸送することができるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであることができる。一部の実施形態では、ベクターはプラスミドまたはコスミド（たとえば、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。一部の実施形態では、ベクターはそれが導入される宿主細胞にて自己複製することができる（たとえば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。一部の実施形態では、ベクター（たとえば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」と呼ばれる。そのようなベクターはターゲティングベクター（すなわち、外来性ドナー配列）であることもできる。

【0073】

一部の実施形態では、本明細書で開示されている種々の遺伝子変異型によってコードされるタンパク質は、開示されている種々の遺伝子変異型をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することによって発現され、それにより遺伝子は発現制御配列、たとえば、転写及び翻訳の制御配列に操作可能に連結される。発現ベクターには、プラスミド、コスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルス、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、エプステイン・バー（ＥＢＶ）由来のエピソーム、及び当該技術で既知の他の発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ベクター内の転写及び翻訳の制御配列が遺伝子変異型の転写及び翻訳を調節するその意図される機能を果たすように、開示されている遺伝子変異型を含む核酸分子をベクターにライゲーションすることができる。発現ベクター及び発現制御配列は使用される発現宿主細胞と適合性であるように選択される。開示されている遺伝子変異型を含む核酸配列を、変異型の遺伝情報として別のベクターにまたは同じ発現ベクターに挿入することができる。開示されている遺伝子変異型を含む核酸配列を常法（たとえば、開示されている遺伝子変異型を含む核酸とベクターにおける相補性制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入することができる。

【0074】

開示されている遺伝子変異型を含む核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは宿主細胞における遺伝子変異型の発現を制御する調節配列を保有することができる。発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含めて、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、等のような要因に依存し得る。哺乳類宿主細胞の発現にとって望ましい調節配列には、たとえば、哺乳類細胞でのタンパク質発現の高いレベルを誘導するウイルス要素、たとえば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（たとえば、ＣＭＶのプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（たとえば、ＳＶ４０のプロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびに、たとえば、天然の免疫グロブリン及びアクチンのプロモーターのような強力な哺乳類プロモーターを挙げることができる。細菌細胞または真菌細胞（たとえば、酵母細胞）にてポリペプチドを発現させる方法も周知である。

【0075】

プロモーターは、たとえば、構成的に活性があるプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制約されるプロモーター（たとえば、発生上調節されるプロモーター）、または空間的に制約されるプロモーター（たとえば、細胞特異的なまたは組織特異的なプロモーター）であることができる。プロモーターの例は、たとえば、ＷＯ２０１３／１７６７７２にて見いだすことができる。

【0076】

誘導性プロモーターの例には、たとえば、化学的に調節されるプロモーター及び物理的に調節されるプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターには、たとえば、アルコール調節プロモーター（たとえば、アルコール脱水素酵素（ａｌｃＡ）遺伝子のプロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（たとえば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、またはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（たとえば、ラットのグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、またはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（たとえば、メタロプロテイン受容体）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターには、たとえば、温度で調節されるプロモーター（たとえば、熱ショックプロモーター）及び光で調節されるプロモーター（たとえば、光誘導性のプロモーター、または光抑制性プロモーター）が挙げられる。

【0077】

組織特異的なプロモーターは、たとえば、ニューロン特異的なプロモーター、グリア特異的なプロモーター、筋肉細胞特異的なプロモーター、心臓細胞特異的なプロモーター、腎臓細胞特異的なプロモーター、骨細胞特異的なプロモーター、内皮細胞特異的なプロモーター、または免疫細胞特異的なプロモーター（たとえば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であることができる。

【0078】

発生上調節されるプロモーターには、たとえば、発生の胚形成期の間のみ、または成人細胞でのみ活性があるプロモーターが挙げられる。
開示されている遺伝子変異型を含む核酸配列及び調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加の配列、たとえば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば、複製開始点）及び選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞の選択を助けることができる（たとえば、米国特許４，３９９，２１６；４，６３４，６６５；及び５，１７９，０１７を参照のこと）。たとえば、選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入されている宿主細胞にて、たとえば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメソトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与することができる。例となる選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メソトレキセート選択／増幅によりｄｈｆｒ－宿主細胞で使用するための）、ネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のために）、及びグルタミン酸合成酵素（ＧＳ）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

追加のベクターは、たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年７月２８日に出願された米国仮特許出願番号６２／３６７，９７３に記載されている。
本開示はまた、本明細書で開示されている単離された核酸分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の１以上を含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物である。

【0080】

本開示はまた、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドも提供する。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは切り詰められる。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて複数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係るアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドは配列番号９に係るアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９に係るアミノ酸配列、または配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。

【0081】

本開示はまた、本明細書で開示されているポリペプチドのいずれかの断片も提供する。一部の実施形態では、断片は、コードされているポリペプチド（たとえば、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、または少なくとも約２００の連続するアミノ酸残基を含む。この点で、長い断片が短いものより好ましい。一部の実施形態では、断片はコードされているポリペプチドの少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００の連続するアミノ酸残基を含む。この点で、長い断片が短いものより好ましい。

【0082】

本開示はまた、本明細書で開示されているポリペプチドのいずれかから選択される、変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを含む二量体も提供する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている単離されたポリペプチドは異種ポリペプチドまたは異種分子または標識に連結され、または融合され、その多数の例は本明細書の別の部分で開示されている。たとえば、タンパク質は高い安定性または低い安定性を提供する異種ポリペプチドに融合することができる。融合されたドメインまたは異種ポリペプチドはポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはポリペプチド内の内部に位置することができる。融合相手は、たとえば、Ｔヘルパーエピトープを提供するのを助けてもよく（免疫的融合相手）、またはネイティブの組換えポリペプチドよりも高い収率でタンパク質を発現するのを助けてもよい（発現増強剤）。ある特定の融合相手は免疫的融合相手及び発現増強融合相手の双方である。他の融合相手を選択してポリペプチドの溶解性を高めてもよく、または細胞内の所望の区画にポリペプチドを向けるのを促してもよい。一部の融合相手には、ポリペプチドの精製を円滑にする親和性タグが含まれる。

【0083】

一部の実施形態では、融合タンパク質は異種分子に直接融合される、またはペプチドリンカーのようなリンカーを介して異種分子に連結される。好適なリンカー配列は、たとえば、以下の要因に基づいて選択されてもよい：（１）柔軟性の拡張する構成を採用する能力；（２）第１及び第２のポリペプチドにおける機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採用することに対する抵抗性；及び（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如。たとえば、ペプチドリンカー配列はＧｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒの残基を含有してもよい。たとえば、Ｔｈｒ及びＡｌａのような他の中性に近いアミノ酸もリンカー配列で使用されてもよい。リンカーとして有用に採用されてもよいアミノ酸配列には、たとえば、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９８５，４０，３９－４６；Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３，８２５８－８２６２；及び米国特許４，９３５，２３３及び４，７５１，１８０で開示されているものが挙げられる。リンカー配列は一般に、たとえば、長さ１～約５０のアミノ酸であってもよい。第１及び第２のポリペプチドが、機能的なドメインを分離し、立体干渉を阻止するのに使用することができる非必須のＮ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は一般に必要とされない。

【0084】

一部の実施形態では、ポリペプチドは細胞膜透過性ドメインに操作可能に連結される。たとえば、細胞膜透過性ドメインはＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞膜透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞膜透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列から得ることができる。たとえば、ＷＯ２０１４／０８９２９０を参照のこと。細胞膜透過性ドメインは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはタンパク質内のどこでも位置することができる。

【0085】

一部の実施形態では、ポリペプチドは追跡または精製の容易さのために異種ポリペプチド、たとえば、蛍光タンパク質、精製タグまたはエピトープタグに操作可能に連結される。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（たとえば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（たとえば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（たとえば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（たとえば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（たとえば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（たとえば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、異種分子は免疫グロブリンＦｃドメイン、ペプチドタグ、形質導入ドメイン、ポリ（エチレングリコール）、ポリシアル酸、またはグリコール酸である。

【0086】

一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは非天然のまたは修飾されたアミノ酸またはペプチドの類似体を含む。たとえば、Ｄ－アミノ酸または天然に存在するアミノ酸とは異なる機能性置換基を有するアミノ酸が多数存在する。天然に存在するペプチドの対向する立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示されている。最適なアミノ酸をｔＲＮＡ分子に委ね、たとえば、アンバーコドンを利用して部位特異的な方法で類似体のアミノ酸をペプチド鎖に挿入する遺伝子構築物を操作することによって、これらのアミノ酸をポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる。

【0087】

一部の実施形態では、単離されたポリペプチドは、ペプチド模倣体であり、これらはペプチドに類似するように作ることができるが、天然のペプチド結合を介して接続されない。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸類似体のための結合には、－ＣＨ_２ＮＨ－、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シス及びトランス）、－ＣＯＣＨ_２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－、及び－ＣＨＨ_２ＳＯ－が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド類似体は、たとえばｂ－アラニン、ｇ－アミノ酪酸等のような結合原子間で１を超える原子を有することができる。アミノ酸類似体及びペプチド類似体は、増強された特性または望ましい特性、たとえば、さらに経済的な製造、さらに大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性、等）、変化した特異性（たとえば、生物活性の広いスペクトル）、低下した抗原性、及び他の望ましい特性を有することが多い。

【0088】

一部の実施形態では、単離されたポリペプチドはＤ－アミノ酸を含み、Ｄ－アミノ酸はペプチダーゼによって認識されないので、さらに安定したペプチドを生成するのにそれを使用することができる。コンセンサス配列の１以上のアミノ酸を同じ種類のＤ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシンの代わりにＤ－リシン）で系統的に置換することを用いてさらに安定なペプチドを生成することができる。システイン残基を用いて２以上のペプチドを一緒に環化するまたは連結することができる。これはペプチドを特定の構造に制約するのに有益である（たとえば、Ｒｉｚｏ及びＧｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，６１，３８７を参照のこと）。

【0089】

本開示はまた、本明細書で開示されているポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も提供する。これには、特定のポリペプチドに関する縮重配列すべて（特定のポリペプチド１つをコードする配列を有する核酸すべて、ならびにタンパク質配列の開示されている変異型及び誘導体をコードする縮重核酸を含む核酸すべて）が含まれる。従って、各特定の核酸配列が本明細書で列挙していないかもしれないが、各配列及びあらゆる配列が開示されているポリペプチド配列を介して実際、本明細書で開示され、記載されている。

【0090】

核酸内の核酸配列またはポリペプチド内のアミノ酸配列の特定の区間の間での同一性パーセント（または相補性パーセント）は、ＢＬＡＳＴプログラム（基礎的な局所配列比較検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を用いて、またはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを使用する初期設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって日常的に決定することができる。本明細書では、配列同一性パーセントが言及される場合、配列同一性の高いパーセントが低いものより好ましい。

【0091】

本開示はまた、本明細書で開示されている核酸分子の１以上及び／またはポリペプチドの１以上と、担体及び／または賦形剤とを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、担体は核酸分子及び／またはポリペプチドの安定性を高める（たとえば、保存の所与の条件下（たとえば、－２０℃、４℃または常温）で分解産物が閾値を下回る、たとえば、出発核酸もしくは出発タンパク質の０．５重量％を下回ったままである期間を延長する、または生体内での安定性を高める）。担体の例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート及び脂質微小管が挙げられるが、これらに限定されない。担体は、たとえば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、等のような緩衝化塩溶液を含んでもよい。

【0092】

本開示はまた、本明細書で開示されているポリペプチドまたはその断片を製造する方法も提供する。そのようなポリペプチドまたはその断片は好適な方法によって製造することができる。たとえば、ポリペプチドまたはその断片は、そのようなポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（たとえば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞から製造することができる。そのような方法は、ポリペプチドまたはその断片を製造するのに十分な条件下でポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子（たとえば、組換え発現ベクター）を含む宿主細胞を培養し、それによってポリペプチドまたはその断片を産生させることを含む。核酸は宿主細胞で活性があるプロモーターに操作可能に連結することができ、培養はそれによって核酸が発現される条件下で実施することができる。そのような方法はさらに、発現されたポリペプチドまたはその断片を回収することを含むことができる。回収することはポリペプチドまたはその断片を精製することをさらに含むことができる。

【0093】

タンパク質発現のための好適な系の例には、宿主細胞、たとえば、細菌細胞発現系（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、酵母細胞発現系（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞発現系（たとえば、バキュロウイルスが介在するタンパク質発現）及び哺乳類細胞発現系が挙げられる。

【0094】

ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子の例は本明細書の別の部分でさらに詳細に開示されている。一部の実施形態では、核酸分子は宿主細胞での発現についてコドンで最適化される。一部の実施形態では、核酸分子は宿主細胞にて活性があるプロモーターに操作可能に連結される。プロモーターは異種プロモーター（天然に存在するプロモーターではないプロモーター）であることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにとって好適なプロモーターの例には、アラビノースプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びＴ７プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓにとって好適なプロモーターの例には、Ｐ１７０プロモーター及びナイシンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとって好適なプロモーターの例には、たとえば、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）もしくはエノラーゼ（ＥＮＯ）のプロモーターのような構成的なプロモーター、または、たとえば、ＰＨＯ、ＣＵＰ１、ＧＡＬ１及びＧ１０のような誘導性のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにとって好適なプロモーターの例には、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）のプロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）のプロモーター、及びグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＦＬＤＩ）のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウイルス介在系にとって好適なプロモーターの例は、後期ウイルス強力ポリヘドリンのプロモーターである。

【0095】

一部の実施形態では、核酸分子はポリペプチドまたはその断片と共にインフレームでタグをコードしてタンパク質精製を助ける。タグの例は本明細書の別の部分で開示されている。そのようなタグは、たとえば、タグ付けされたタンパク質が他のタンパク質（たとえば、宿主細胞のタンパク質）から単離され得るように（たとえば、樹脂上に不動化された）相手リガンドに結合することができる。アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は発現されたタンパク質の純度を改善するのに使用することができる方法の例である。

【0096】

他の方法を用いてポリペプチドまたはその断片を製造することもできる。たとえば、タンパク質化学の技法によって２以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することができる。たとえば、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル）の化学的性質を用いてペプチドまたはポリペプチドを化学的に合成することができる。そのようなペプチドまたはポリペプチドは標準の化学反応によって合成することができる。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドが合成され、その合成樹脂から切断できないのに対して、ペプチドまたはタンパク質の他の断片は合成され、その後、樹脂から切断することができ、それによって、他の断片で機能的に遮断されている末端基を曝露する。ペプチド縮合反応によって、これら２つの断片をそれぞれそのカルボキシル末端及びアミノ末端にてペプチド結合を介して共有結合することができる。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは本明細書に記載されているように生体内で独立して合成することができる。いったん単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは類似のペプチド縮合反応を介して連結されてペプチドまたはその断片を形成し得る。

【0097】

一部の実施形態では、クローニングしたまたは合成のペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、相対的に短いペプチド断片が連結されてさらに大きなペプチド断片、ポリペプチド、またはタンパク質全体のドメインを作り出せるようにする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，４１５１）。あるいは、合成ペプチドの天然の化学的ライゲーションを利用して短いペプチド断片から大きいペプチドまたはポリペプチドを合成で構築することができる。この方法は２ステップの化学反応から成り得る（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６６，７７６－７７９）。最初のステップは、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結の中間体を得るための保護されていない合成ペプチド－チオエステルのアミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の保護されていないペプチドセグメントとの化学選択反応であることができる。反応条件を変えないで、この中間体は自然発生する迅速な分子内反応を受けてライゲーション部位で天然のペプチド結合を形成することができる。

【0098】

一部の実施形態では、保護されていないペプチドセグメントを化学的に連結することができ、その際、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間で形成される結合は非天然の（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５６，２２１）。

【0099】

一部の実施形態では、ポリペプチドは、たとえば、グリコシル化、アセチル化及びリン酸化のような発現後修飾、ならびに天然に存在する及び天然に存在しないの双方での当該技術で既知の他の修飾を持つことができる。ポリペプチドはタンパク質全体またはその部分配列であってもよい。

【0100】

本開示はまた、本明細書で開示されているポリペプチドの１以上をコードすることができるポリヌクレオチドを含む核酸分子またはその相補体を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、それによってポリペプチドを産生させることを含む、本明細書で開示されているポリペプチドのいずれかを製造する方法も提供する。

【0101】

本開示はまた、本明細書で開示されている核酸分子を含むベクターを含む核酸分子のいずれか１以上及び／または本明細書で開示されているポリペプチドのいずれか１以上を含む細胞（たとえば、組換え宿主細胞）も提供する。細胞は試験管内、生体外または生体内にあることができる。核酸分子はプロモーター及び他の調節配列に連結することができる、それにより、それらが発現されてコードされたタンパク質を生じる。そのような細胞の細胞株がさらに提供される。

【0102】

一部の実施形態では、細胞は分化全能細胞または多能性細胞（たとえば、胚性幹（ＥＳ）細胞、たとえば、齧歯類のＥＳ細胞、マウスのＥＳ細胞またはラットのＥＳ細胞）である。分化全能細胞はどんな細胞型も生じることができる未分化の細胞を含み、多能性細胞は１を超える分化した細胞型に発生する能力を持つ未分化の細胞を含む。そのような多能性細胞及び／または分化全能細胞は、たとえば、ＥＳ細胞、またはＥＳ様細胞、たとえば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であることができる。ＥＳ細胞には、胚に導入された際、発生している胚のどんな組織にも寄与することができる、胚に由来する分化全能性細胞または多能性細胞が挙げられる。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得ることができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）のいずれかの細胞に分化することが可能である。本開示によれば、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞であってもよい。

【0103】

一部の実施形態では、細胞は初代体細胞である、または初代体細胞ではない細胞である。体細胞には、配偶子、生殖細胞、母細胞、または未分化の幹細胞ではない任意の細胞を挙げることができる。一部の実施形態では、細胞は初代細胞であることもできる。初代細胞には、生物、臓器または組織から直接単離されている細胞または細胞の培養物が挙げられる。初代細胞は形質転換されず、不死でもない細胞を含む。初代細胞は、組織培養で以前継代されなかった、または組織培養で以前継代されたことがあるが、組織培養で無限に継代できない生物、臓器または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は従来の技法によって単離することができ、それらには、たとえば、体細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、間葉細胞、角化細胞、メラニン細胞、単球、単核細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、骨格筋芽細胞、及び平滑筋細胞が挙げられる。たとえば、初代細胞は結合組織、筋組織、神経系組織または上皮組織から得ることができる。

【0104】

一部の実施形態では、細胞は、普通は無限に増殖し得ないが、突然変異または変異に起因して正常な細胞老化を回避している場合があり、代わりに細胞分裂を繰り返し受け続けることができる。そのような突然変異または変異は自然に発生することができ、または意図的に誘導することができる。不死化細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞）、及びマウス胚性線維芽細胞（たとえば、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。多数の種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞には、組換えの遺伝子またはタンパク質を培養するために、または発現させるために通常使用される細胞が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、たとえば、肝臓細胞（たとえば、ヒト肝臓細胞）のような分化した細胞である。

【0105】

細胞はどんな供給源に由来することもできる。たとえば、細胞は真核細胞、動物細胞、植物細胞または真菌（たとえば、酵母）細胞であることができる。そのような細胞は魚細胞または鳥細胞であることができ、またはそのような細胞は、たとえば、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、齧歯類細胞、マウス細胞またはラット細胞のような哺乳類細胞であることができる。哺乳類には、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、オスウシ、シカ、野牛、ヒツジ、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（たとえば、乳牛、去勢オス牛のようなウシ種；羊、山羊等のようなヒツジ種；ならびに豚及びオス豚のようなブタ種）が挙げられるが、これらに限定されない。鳥類には、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒル、等が挙げられるが、これらに限定されない。家畜化された動物及び農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを除外する。

【0106】

追加の宿主細胞は、たとえば、全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号ＵＳ２０１８／００３０１１４に記載されている。
本明細書で開示されている核酸分子及びポリペプチドは任意の手段によって細胞に導入することができる。形質移入のプロトコール、ならびに細胞に核酸またはタンパク質を導入するためのプロトコールは様々であり得る。非限定の形質移入法には、リポソーム、ナノ粒子、カルシウム、デンドリマー、及びたとえば、ＤＥＡＥ－デキストランまたはポリエチレンイミンのようなカチオン性ポリマーを用いた化学作用に基づいた形質移入法が挙げられる。非化学的方法には、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学形質移入が挙げられる。粒子に基づく形質移入には、遺伝子銃の使用、または磁石支援の形質移入が挙げられる。形質移入にはウイルス法も使用することができる。

【0107】

核酸またはタンパク質の細胞への導入は、エレクトロポレーション、細胞質内注入、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、形質移入、脂質介在性の形質移入、またはヌクレオフェクションを介して行うこともできる。ヌクレオフェクションは、核酸基質が細胞質だけでなく、核膜を介して及び核に送達されるのを可能にする改善されたエレクトロポレーション法である。加えて、本明細書で開示されている方法におけるヌクレオフェクションの使用は通常、普通のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞しか必要としない（たとえば、普通のエレクトロポレーションによる７００万個と比べて約２００万個のみ）。一部の実施形態では、ヌクレオフェクションはＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを用いて実施される。

【0108】

核酸またはタンパク質の細胞への導入は微量注入によっても達成することができる。ｍＲＮＡの微量注入は普通、細胞質の中に注入する（たとえば、ｍＲＮＡを翻訳装置に直接送達する）が、タンパク質またはＤＮＡの微量注入は普通、核の中に注入する。あるいは、微量注入は核及び細胞質双方の中への注入によって実施することができる。すなわち針を先ず核に導入することができ、第１の量を注入し、針を核から取り出しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。ヌクレアーゼ剤タンパク質が細胞質に注入される場合、タンパク質は核局在シグナルを含んで核／前核への送達を確保してもよい。

【0109】

核酸またはタンパク質を細胞に導入する他の方法には、たとえば、ベクター送達、粒子介在送達、エクソーム介在送達、脂質・ナノ粒子介在送達、細胞膜透過性ペプチド介在送達、または埋め込み可能な装置が介在する送達を挙げることができる。核酸またはタンパク質を対象に投与して生体内で細胞を修飾する方法は本明細書の別の部分で開示されている。核酸及びタンパク質の細胞への導入は流体力学的送達（ＨＤＤ）によっても達成することができる。

【0110】

核酸またはタンパク質を細胞に導入する他の方法には、たとえば、ベクター送達、粒子介在送達、エクソーム介在送達、脂質・ナノ粒子介在送達、細胞膜透過性ペプチド介在送達、または埋め込み可能な装置が介在する送達を挙げることができる。一部の実施形態では、核酸またはタンパク質は、担体、たとえば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエートまたは脂質微小管にて細胞に導入することができる。

【0111】

本開示はまた、プローブ及びプライマーも提供する。プローブ及びプライマーの例は、たとえば、上記に記載されている。本開示は、本明細書で開示されている核酸分子のいずれかと特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含むプローブ及びプライマーを提供する。たとえば、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする本明細書に記載されている核酸分子のいずれかとハイブリッド形成する、またはその核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて複数のアミノ酸を含む変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係るアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係るアミノ酸配列を含む、またはそれから成る変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成する、またはこの核酸分子の相補体とハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸分子の一部と特異的にハイブリッド形成する。

【0112】

プローブまたはプライマーは任意の好適な長さを含んでもよく、その非限定例には、少なくとも約５、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、または少なくとも約２５のヌクレオチド長が挙げられる。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは少なくとも約１８ヌクレオチド長を含む。プローブまたはプライマーは、約１０～約３５、約１０～約３０、約１０～約２５、約１２～約３０、約１２～約２８、約１２～約２４、約１５～約３０、約１５～約２５、約１８～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、または約１８～約２２のヌクレオチド長を含んでもよい。好まれる実施形態では、プローブまたはプライマーは約１８～約３０のヌクレオチド長である。

【0113】

本開示はまた、変異特異的なプローブ及び変異特異的なプライマーも提供する。変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列と、またはその相補体と相補性である及び／またはハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。本開示の文脈では、「特異的にハイブリッド形成する」は、プローブまたはプライマー（たとえば、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマー）が野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子とハイブリッド形成しないことを意味する。一部の実施形態では、変異特異的なプローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする核酸コドンと、またはその相補体と特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、変異特異的なプライマーまたはプライマー対は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンがそれから作り出される転写物内に包含されるように、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の領域（複数可）と特異的にハイブリッド形成する。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸分子の一部と特異的にハイブリッド形成する。

【0114】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列と、またはその相補体と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含み、タンパク質は配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰めを含む。

【0115】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子と、またはその相補体と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含するゲノムＤＮＡの一部と特異的にハイブリッド形成する。

【0116】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号２に係る９９６２位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号２に係る核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。

【0117】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含するｍＲＮＡ分子の一部と特異的にハイブリッド形成する。

【0118】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号４に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含むｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号４に係る核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。

【0119】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含するｃＤＮＡ分子の一部と特異的にハイブリッド形成する。

【0120】

一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号６に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号６に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含むｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーは、配列番号６に係る核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子と相補性である及び／またはそれとハイブリッド形成するまたは特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。

【0121】

本開示のプローブまたはプライマーに関して上記に記載されている長さは本開示の変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーにも必要な変更を加えて適用される。
本開示はまた、上記に記載されているような変異特異的なプライマーの２つを含む変異特異的なプライマーの対も提供する。

【0122】

一部の実施形態では、プローブまたはプライマー（たとえば、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマー）はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマー（たとえば、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマー）はＲＮＡを含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマー（たとえば、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマー）は、たとえば、高ストリンジェントな条件のようなストリンジェントな条件下で変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列とハイブリッド形成する。

【0123】

一部の実施形態では、プローブは標識を含む。一部の実施形態では、標識は蛍光標識、放射性標識、またはビオチンである。一部の実施形態では、プローブの長さは上記に記載されている。あるいは、一部の実施形態では、プローブは、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のヌクレオチドを含む、またはそれから成る。プローブ（たとえば、対立遺伝子特異的なプローブ）は、たとえば、本明細書で開示されている核酸分子のいずれかを検出するのに使用されてもよい。好まれる実施形態では、プローブは長さ少なくとも約１８のヌクレオチドを含む。プローブは、長さ約１０～約３５、約１０～約３０、約１０～約２５、約１２～約３０、約１２～約２８、約１２～約２４、約１５～約３０、約１５～約２５、約１８～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、または約１８～約２２のヌクレオチドを含んでもよい。好ましい実施形態では、プローブは長さ約１８～約３０のヌクレオチドである。

【0124】

本開示はまた、本明細書で開示されているプローブのいずれか１以上が連結される基材を含む支持体も提供する。固体支持体は、たとえば、本明細書で開示されているプローブのいずれかような分子が会合することができる固体状態の基材または支持体である。固体支持体の一形態はアレイである。固体支持体の別の形態はアレイ検出器である。アレイ検出器は複数の異なるプローブがアレイ、格子または他の組織化されたパターンで連結されている固体支持体である。

【0125】

固体支持体で使用するための固体状態の基材には、分子を連結することができる固体物質を挙げることができる。これには、たとえば、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、酸化ポリエチレン、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルソエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸のような物質が挙げられる。固体状態の基材は、薄膜、膜、ビン、皿、繊維、織り繊維、成形ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子または組み合わせを含む任意の有用な形態を有することができる。固体状態の基材及び固体の支持体は多孔性または非多孔性であることができる。固体状態の基材の一形態は、たとえば、標準の９６穴型のようなマイクロタイターディッシュである。一部の実施形態では、通常ウェル当たりアレイ１つを含有するマルチウェルのガラススライドを採用することができる。この特長は、アッセイ再現性のさらに大きな制御、高いスループット及び試料取り扱い、ならびに自動化の容易さを可能にする。一部の実施形態では、支持体はマイクロアレイである。

【0126】

本明細書で開示されているポリペプチドのいずれも１以上の置換（たとえば、保存的なアミノ酸置換）、挿入または欠失をさらに有することができる。挿入には、たとえば、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。既知の配列を有するＤＮＡにて所定の部位で置換を行う技法は周知であり、たとえば、Ｍ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発である。アミノ酸置換は通常、単一残基であるが、同時に多数の異なる位置で生じることができ、挿入は普通、約１～１０アミノ酸残基の桁であろうし、欠失は約１から３０残基に及ぶであろう。欠失または挿入は隣接する対で行うことができ、すなわち、２つの残基の欠失または２つの残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせを組み合わせて最終構築物に達してもよい。一部の実施形態では、突然変異は配列をリーディングフレームの外に配置せず、二次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補性領域を作り出さない。

【0127】

本開示はまた、組成物を作り、本明細書に記載されている方法を利用するためのキットも提供する。本明細書に記載されているキットは対象の試料にて１以上の遺伝子変異型を検出するためのアッセイ（単数）またはアッセイ（複数）を含むことができる。

【0128】

一部の実施形態では、ＳＩＧＩＲＲ変異型のヒトでの同定用のキットは上記に記載されている組成物及び方法を利用する。一部の実施形態では、基本的キットは、本明細書で開示されている核酸分子（たとえば、配列番号２、配列番号４、及び／または配列番号６）のいずれかにおける遺伝子座についての少なくとも一対のオリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブ、たとえば、変異特異的なプローブまたは変異特異的なプライマーを有する容器を含むことができる。キットはまた、任意で使用のための説明書も含むことができる。キットはまた、他の任意のキット成分、たとえば、増幅される遺伝子座のそれぞれに向けられた対立遺伝子ラダー、増幅用の十分な量の酵素、増幅を助けるための増幅緩衝液、酵素活性を促進するための二価カチオンの溶液、増幅中の鎖の伸長のためのｄＮＴＰ、増幅した物質の電気泳動用の調製のための負荷溶液、鋳型対照としてのゲノムＤＮＡ、分離媒体にて物質が予想どおりに移動するのを確保するためのサイズマーカー、及びユーザーに情報を与え、使用中の誤りを限定するためのプロトコールやマニュアルの１以上も含むことができる。キットにおける種々の試薬の量は、たとえば、処理の最適感度のような多数の要因に応じて変化し得る。手動適用で使用するための検査キットまたは自動化された試料調製、反応の設定、検出器または分析器で使用するための検査キットを提供することはこれらの教示の範囲内にある。

【0129】

一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子またはその相補体の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）、または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）、または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）、または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）、または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）、または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0130】

一部の実施形態では、キットは、配列番号２に係る９９６２位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号２に係る核酸配列を含む、またはそれから成るゲノムＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0131】

一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0132】

一部の実施形態では、キットは、配列番号４に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号４に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＵＡ及びＡＧＣを含むｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号４に係る核酸配列を含む、またはそれから成るｍＲＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0133】

一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて以下のアミノ酸配列、Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ（配列番号１１）を含む変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号９を有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0134】

一部の実施形態では、キットは、配列番号６に係る５５７位に相当する位置にてグアニンを含む核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号６に係る５５３位～５５５位及び５５６位～５５８位に相当する位置にてそれぞれコドンＣＴＡ及びＡＧＣを含むｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。一部の実施形態では、キットは、配列番号６に係る核酸配列を含む、またはそれから成るｃＤＮＡ分子の増幅用の少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、変異特異的なプライマー）または検出用の少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（たとえば、変異特異的なプローブ）を含む。

【0135】

一部の実施形態では、本明細書で開示されているキットのいずれかはさらに、ヌクレオチドラダー、プロトコール、酵素（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅に使用される酵素）、ｄＮＴＰ、緩衝剤、塩（単数）または塩（複数）、及び対照核酸試料のいずれか１以上を含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されているキットのいずれかはさらに、検出可能な標識、アニーリング反応を行うのに必要とされる製品や試薬、及び説明書のいずれか１以上を含んでもよい。

【0136】

一部の実施形態では、本明細書で開示されているキットは、配列番号２の９９６２位に相当する位置にて、または配列番号４及び／または配列番号６の５５７位に相当する位置にてグアニンと直接ハイブリッド形成する３’末端ヌクレオチドを含むプライマーまたはプローブまたは変異特異的なプライマーまたは変異特異的なプローブを含むことができる。

【0137】

当業者は採用される検出法が一般に限定的ではないことを理解する。むしろ、それらでアンプリコンの存在または非存在を判定できるという条件で、多種多様な検出手段は開示されている方法及びキットの範囲内である。

【0138】

一部の態様では、キットは本明細書で開示されているプライマーまたはプローブの１以上を含むことができる。たとえば、キットは開示されている遺伝子変異型の１以上とハイブリッド形成する１以上のプローブを含むことができる。

【0139】

一部の態様では、キットは開示されている細胞または細胞株の１つを含むことができる。一部の態様では、キットはトランスジェニックな細胞または細胞株を作成するのに必要な物質を含むことができる。たとえば、一部の態様では、キットは、細胞と、開示されている遺伝子変異型の１以上を含む核酸配列を含むベクターとを含むことができる。キットはさらに細胞培養用の培地を含むことができる。

【0140】

本開示はまた、対象ヒトに由来する生体試料にてＳＩＧＩＲＲ変異型のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び／またはポリペプチドの存在を検出する方法も提供する。集団内の遺伝子配列及びｍＲＮＡ及びそのような遺伝子によってコードされるタンパク質は一塩基多型のような遺伝子多型に起因して変化することができることが理解される。ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びポリペプチドについて本明細書で提供されている配列は単に例となる配列である。ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びポリペプチドについての他の配列も可能である。

【0141】

生体試料は対象由来の細胞、組織または生体液から得ることができる。試料は、任意の臨床的に関連する組織、たとえば、骨髄試料、腫瘍生検、微細針吸引物、または、たとえば、血液、歯肉溝滲出液、血漿、血清、リンパ液、腹水、嚢胞液または尿のような体液の試料を含んでもよい。場合によっては、試料は頬内スワブを含む。本明細書で開示されている方法で使用される試料は、アッセイ構成、検出方法の性質、及び試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて変化するであろう。生体試料は採用されるアッセイに応じて異なって処理することができる。たとえば、変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子を検出する場合、ゲノムＤＮＡについて試料を単離するまたは濃縮するように考案された予備処理を採用することができる。種々の既知の技法がこの目的に使用されてもよい。変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡのレベルを検出する場合、様々な技法を用いてｍＲＮＡを伴う生体試料を濃縮することができる。ｍＲＮＡの存在もしくはレベルまたは特定の変異型ゲノムＤＮＡ遺伝子座の存在を検出する種々の方法を使用することができる。

【0142】

一部の実施形態では、本開示は、生体試料におけるタンパク質の少なくとも一部を配列決定して、タンパク質が切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするアミノ酸配列を含むかどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料におけるタンパク質の少なくとも一部を配列決定して、タンパク質が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするアミノ酸配列を含むかどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料におけるタンパク質の少なくとも一部を配列決定して、タンパク質が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするアミノ酸配列を含むかどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在を検出する方法を提供する。

【0143】

一部の実施形態では、本開示は、生体試料における核酸の少なくとも一部を配列決定して、核酸が切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含むどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子の存在または非存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料における核酸の少なくとも一部を配列決定して、核酸が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含むどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子の存在または非存在を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、生体試料における核酸の少なくとも一部を配列決定して、核酸が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列を含むどうかを判定することを含む、変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子の存在または非存在を検出する方法を提供する。本明細書で開示されている変異型核酸分子のいずれも本明細書に記載されているプローブまたはプライマーのいずれかを用いて検出することができる。

【0144】

一部の実施形態では、対象にて炎症性腸疾患に関連する変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子または早期発症型炎症性腸疾患に関連する変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸分子（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の存在または非存在を検出する方法は、対象から得られる生体試料にてアッセイを実施することを含み、そのアッセイは生体試料における核酸分子が本明細書で開示されている変異型ＳＩＧＩＲＲの核酸配列のいずれか（たとえば、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子）を含むかどうかを判定する。一部の実施形態では、生体試料は細胞または細胞溶解物を含む。そのような方法はさらに、たとえば、ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む、対象由来の生体試料を得ることと、ｍＲＮＡであれば任意でｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することと、生体試料にてＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの位置が切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを実施することとを含むことができる。そのような方法はさらに、たとえば、ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む、対象由来の生体試料を得ることと、ｍＲＮＡであれば任意でｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することと、生体試料にてＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの位置が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを実施すること、または生体試料にてＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの位置が配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められた、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードするかどうかを判定するアッセイを実施することとを含むことができる。そのようなアッセイは、たとえば、特定のＳＩＧＩＲＲの核酸分子のこれらの位置の同一性を判定することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はヒトである。

【0145】

一部の実施形態では、アッセイは、対象に由来する生体試料における核酸分子のＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一部を配列決定することであって、配列決定される一部が配列番号９に係るＳＩＧＩＲＲタンパク質における１８６位にてセリンをコードする位置に相当する位置を含む配列決定すること；対象に由来する生体試料における核酸分子のＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列の少なくとも一部を配列決定することであって、配列決定される一部が配列番号９に係るＳＩＧＩＲＲタンパク質における１８６位にてセリンをコードする位置に相当する位置を含む、配列決定すること；または対象に由来する生体試料における核酸分子のＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列の少なくとも一部を配列決定することであって、配列決定される一部が配列番号９に係るＳＩＧＩＲＲタンパク質における１８６位にてセリンをコードする位置に相当する位置を含む、配列決定することを含む。

【0146】

一部の実施形態では、アッセイは、（ａ）（ｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードする位置に相当する位置でのＳＩＧＩＲＲのゲノム配列の位置に最も近いＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ配列の一部；（ｉｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードする位置に相当する位置でのＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列の位置に最も近いＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列の一部；または（ｉｉｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードする位置に相当する位置でのＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列の位置に最も近いＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列の一部とハイブリッド形成するプライマーに生体試料を接触させることと；（ｂ）（ｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードするコドンを越えたヌクレオチドの位置に相当するＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ配列の位置；（ｉｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードするコドンを越えたヌクレオチドの位置に相当するＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列の位置；または（ｉｉｉ）配列番号９に係る１８６位でセリンをコードするコドンを越えたヌクレオチドの位置に相当するＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列の位置を少なくとも介してプライマーを伸長させることと；（ｃ）プライマーの伸長産物が配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするヌクレオチドを含むかどうかを判定することとを含む。一部の実施形態では、ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡだけが解析される。一部の実施形態では、ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡだけが解析される。一部の実施形態では、ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡから得られるＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡだけが解析される。

【0147】

一部の実施形態では、アッセイは、（ａ）（ｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするヌクレオチドを含むＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ配列の一部；（ｉｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするヌクレオチドを含むＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡ配列の一部；または（ｉｉｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするヌクレオチドを含むＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ配列の一部とハイブリッド形成する変異特異的なプライマーに生体試料を接触させることと；（ｂ）変異特異的なポリメラーゼ連鎖反応法を用いてプライマーを伸長させることと；（ｃ）伸長が生じたかどうかを判定することとを含む。変異特異的なポリメラーゼ連鎖反応法を用いて核酸配列における欠失のような突然変異を検出することができる。鋳型とのミスマッチが存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼは伸長しないので変異特異的なプライマーが使用される。技量のある熟練者は、基本的な変異特異的ポリメラーゼ連鎖反応法の多数の変形を自由に使用することができる。

【0148】

変異特異的なプライマーは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列またはその核酸配列に対する相補体と相補性である核酸配列を含んでもよい。たとえば、変異特異的なプライマーは配列番号９をコードする核酸配列またはこの核酸配列に対する相補体と相補性である核酸配列を含んでもよい。変異特異的なプライマーは好ましくは、核酸配列が配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする場合、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列と特異的にハイブリッド形成する。

【0149】

一部の実施形態では、アッセイは、ストリンジェントな条件下で変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリッド形成し、且つ対応する野生型ＳＩＧＩＲＲの配列とは特異的にハイブリッド形成しないプライマーまたはプローブに生体試料を接触させることと、ハイブリッド形成が生じているかどうか判定することとを含む。

【0150】

一部の実施形態では、アッセイはＲＮＡの配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を含む。一部の実施形態では、アッセイは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を介してｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することも含む。

【0151】

一部の実施形態では、方法は、標的核酸配列に結合し、変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドを特異的に検出する及び／または同定するのに十分なヌクレオチド長さのプローブ及びプライマーを利用する。ハイブリッド形成の条件または反応条件はこの結果を達成するように操作者が決定することができる。このヌクレオチド長は、本明細書に記載されているまたは例示されているアッセイを含めて最適な検出方法で使用するのに十分である任意の長さであってもよい。一般に、たとえば、約８、約１０、約１１、約１２、約１４、約１５、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、または約７００のヌクレオチド以上、または約１１～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、または約７００～約８００以上のヌクレオチド長を有するプライマーまたはプローブが使用される。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは少なくとも約１８ヌクレオチド長を含む。プローブまたはプライマーは約１０～約３５、約１０～約３０、約１０～約２５、約１２～約３０、約１２～約２８、約１２～約２４、約１５～約３０、約１５～約２５、約１８～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、または約１８～約２２のヌクレオチド長を含んでもよい。好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーは約１８～約３０のヌクレオチド長である。

【0152】

そのようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列と特異的にハイブリッド形成することができる。プローブ及びプライマーは連続するヌクレオチドの標的配列との完全な核酸配列同一性を有し得るが、標的核酸配列とは異なり、標的核酸配列を特異的に検出する及び／または同定する能力を保持するプローブが従来の方法で設計されてもよい。従って、プローブ及びプライマーは標的核酸分子に対して約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％の配列同一性または相補性を共有することができる。

【0153】

一部の実施形態では、変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座及び／またはＳＩＧＩＲＲ変異型のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅するのに特異的なプライマーを使用して、特異的なプローブとして使用することができる、または生体試料にて変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座を同定するために、もしくは特異的なＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡのレベルを測定するためにそれ自体検出され得るアンプリコンを作り出すことができる。ＳＩＧＩＲＲ変異型の遺伝子座を用いて配列番号９に係る１８６位にてセリンをコードする位置に相当する位置を含むゲノム核酸配列を示すことができる。核酸分子へのプローブの結合を可能にする条件下でプローブが生体試料における核酸分子とハイブリッド形成する場合、この結合を検出することができ、生体試料にて変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座の存在または変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの存在もしくはレベルを示すことを可能にする。結合されたプローブのそのような同定が記載されている。特異的なプローブは、変異型ＳＩＧＩＲＲ遺伝子の特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、及び約９５％～約１００％同一の（または相補性の）配列を含んでもよい。特異的なプローブは、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡの特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、及び約９５％～約１００％同一の（または相補性の）配列を含んでもよい。特異的なプローブは、変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡの特定の領域と少なくとも約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、及び約９５％～約１００％同一の（または相補性の）配列を含んでもよい。

【0154】

一部の実施形態では、生体試料の核酸相補体が変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする（たとえば、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質、または配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質）核酸配列を含むかどうかを判定するために、生体試料を、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする位置に隣接する５’隣接配列に由来する第１のプライマーと、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする位置に隣接する３’隣接配列に由来する第２のプライマーとを含むプライマー対を用いた核酸増幅法に供し、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする位置でのヌクレオチドの存在について診断に用いるアンプリコンを作成する。一部の実施形態では、アンプリコンの長さの範囲は、プライマー対にヌクレオチド塩基対１つを加えて合わせた長さからＤＮＡ増幅プロトコールによって生産可能なアンプリコンの任意の長さに及んでもよい。この距離はヌクレオシド塩基対１つから増幅反応の限界まで、または約２０，０００のヌクレオシド塩基対まで及ぶことができる。任意で、プライマー対は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする位置及び配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする位置の各側での少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドを含む領域に隣接する。類似のアンプリコンはｍＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡの配列から生成することができる。

【0155】

プローブ及びプライマーを調製し、使用する代表的な方法は、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１－３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以後，“Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９”）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的更新で）（以後，“Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２”）、及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０）に記載されている。ＰＣＲのプライマー対は、その目的を対象とするコンピュータープログラム、たとえば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ バージョン１０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びＰｒｉｍｅｒ３（バージョン０．４．０．ＣＯＰＹＲＧＴ．，１９９１，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー解析ツールを使用することによって既知の配列から導き出すことができる。さらに、配列は視覚的に走査することができ、プライマーは既知のガイドラインを用いて手作業で同定することができる。

【0156】

核酸のハイブリッド形成または増幅または配列決定の方法を用いて、変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座の存在及び／または変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡから生産されるｃＤＮＡのレベルを特異的に検出することができる。一部の実施形態では、核酸分子をプライマーとして用いてＳＩＧＩＲＲの核酸の領域を増幅することができるか、または核酸分子を、たとえば、ストリンジェントな条件下で変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座を含む核酸分子または変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡから作られるｃＤＮＡを含む核酸分子と特異的にハイブリッド形成するプローブとして使用することができる。

【0157】

たとえば、核酸の配列決定、核酸のハイブリッド形成、及び核酸の増幅を含む種々の技法が当該技術で利用できる。核酸の配列決定法の説明に役立つ例には、連鎖停止剤（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定及びダイターミネーター配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

他の方法には、精製したＤＮＡ、増幅したＤＮＡ及び固定細胞調製物（蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ））に対して向けられた標識したプライマーまたはプローブを使用することが含まれる、配列決定以外の核酸ハイブリッド形成法が含まれる。一部の方法では、検出に先立って、または検出と同時に標的核酸が増幅されてもよい。核酸増幅法の説明に役立つ例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の方法には、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅及び好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0159】

たとえば、ハイブリッド形成保護アッセイ（ＨＰＡ）、リアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価、及び試料に当初存在するが、リアルタイム増幅に基づかない標的配列の量を決定することを含む任意の方法を、増幅されなかったまたは増幅されたポリヌクレオチドを検出するのに使用することができる。

【0160】

必ずしも配列の増幅を必要とせず、たとえば、染色体物質のサザン（ＤＮＡ：ＤＮＡ）ブロットハイブリッド形成、原位置ハイブリッド形成（ＩＳＨ）、及び蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）の既知の方法に基づく核酸を同定する方法も提供される。サザンブロッティングを用いて特定の核酸配列を検出することができる。そのような方法では、試料から抽出された核酸を断片化し、マトリクスゲル上で電気泳動にて分離し、膜フィルターに移す。フィルターに結合した核酸を、対象とする配列と相補性の標識されたプローブとのハイブリッド形成に供する。フィルターに結合したハイブリッド形成したプローブが検出される。そのような方法では、プロセスは本明細書で記載されているまたは例示されているプローブのいずれかを使用するハイブリッド形成を含むことができる。

【0161】

ハイブリッド形成法では、プローブまたはプライマーがその標的と特異的にハイブリッド形成するようにストリンジェントな条件を採用することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、ストリンジェントな条件下で、他の配列（たとえば、対応する野生型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座、野生型ｍＲＮＡまたは野生型ｃＤＮＡ）よりも、たとえば、バックグラウンドより１０倍超を含めて、バックグラウンドより少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍以上検出可能に高い程度にその標的配列（たとえば、変異型ＳＩＧＩＲＲの遺伝子座、変異型ＳＩＧＩＲＲのｍＲＮＡまたは変異型ＳＩＧＩＲＲのｃＤＮＡ）とハイブリッド形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、ストリンジェントな条件下で、他の配列よりも少なくとも２倍検出可能に高い程度にその標的配列とハイブリッド形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、ストリンジェントな条件下で、他の配列よりも少なくとも３倍検出可能に高い程度にその標的配列とハイブリッド形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、ストリンジェントな条件下で、他の配列よりも少なくとも４倍検出可能に高い程度にその標的配列とハイブリッド形成する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、ストリンジェントな条件下で、他の配列よりもバックグラウンドより１０倍を超えて検出可能に高い程度にその標的配列とハイブリッド形成する。ストリンジェントな条件は配列に依存し、様々な状況で異なる。ハイブリッド形成のストリンジェントな条件及び／または洗浄条件を制御することによって、プローブと１００％相補性である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、ストリンジェントな条件を調整して低い程度の同一性が検出される（非相同プロービング）ように配列における幾つかのミスマッチを許すことができる。

【0162】

ＤＮＡのハイブリッド形成を促進する適当なストリンジェントな条件、たとえば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）とそれに続く５０℃での２×ＳＳＣの洗浄が既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６にて見いだすことができる。通常、ハイブリッド形成及び検出のためのストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０～８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、通常、約０．０１～１．０ＭのＮａ（または他の塩）イオン濃度及び温度が短いプローブ（たとえば、１０～５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃及び長いプローブ（５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、たとえば、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成されてもよい。例となる低ストリンジェントの条件は、３７℃での３０～３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液におけるハイブリッド形成、及び５０～５５℃での１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸ナトリウム）における洗浄が挙げられる。例となる中程度のストリンジェントの条件には、３７℃での４０～４５％のホルムアミド、１.０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリッド形成、及び５５～６０℃での０．５×～１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。例となる高ストリンジェントの条件には、３７℃での５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリッド形成、及び６０～６５℃での０．１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。任意で、洗浄緩衝液は約０．１％～約１％のＳＤＳを含んでもよい。ハイブリッド形成の持続時間は一般に約２４時間未満であり、普通、約４～約１２時間である。洗浄時間の継続は平衡に達するのに少なくとも十分な時間の長さであろう。

【0163】

ハイブリッド形成反応では、特異性は通常、ハイブリッド形成後の洗浄の関数であり、決定的な要因は最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ・ＤＮＡのハイブリッドについては、Ｔ_ｍはＭｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，２６７－２８４の方程式、すなわちＴ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ホルム）－５００／Ｌから近似させることができ、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡにおけるグアノシンとシトシンのヌクレオチドの割合（％）であり、％ホルムはハイブリッド形成溶液におけるホルムアミドの割合（％）であり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔ_ｍは、相補性の標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリッド形成する温度（定義されたイオン強度及びｐＨのもとでの）である。Ｔ_ｍは各１％のミスマッチについて約１℃低下する。従って、Ｔ_ｍ、ハイブリッド形成及び／または洗浄の条件を調整して所望の同一性の配列とハイブリッド形成させることができる。たとえば、９０％以上の同一性の配列が求められる場合、Ｔ_ｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにて特定の配列とその相補体について熱融点（Ｔ_ｍ）より約５℃低いように選択される。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件は熱融点（Ｔ_ｍ）より１℃、２℃、３℃または４℃低いハイブリッド形成及び洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件は熱融点（Ｔ_ｍ）より６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃低いハイブリッド形成及び洗浄を利用することができ、低ストリンジェントの条件は熱融点（Ｔ_ｍ）より１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃低いハイブリッド形成及び洗浄を利用することができる。方程式、ハイブリッド形成及び洗浄の組成及び所望のＴ_ｍを用いて、当業者は、ハイブリッド形成及び／または洗浄溶液のストリンジェントな条件での変動が本質的に記載されていることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）に満たないＴ_ｍを生じる場合、さらに高い温度が使用できるようにＳＳＣの濃度を上げることが最適である。

【0164】

提供されるのはまた、たとえば、タンパク質の配列決定及び免疫アッセイを含む、生体試料にて変異型ＳＩＧＩＲＲポリペプチドの存在を検出する、またはそのレベルを定量する方法である。一部の実施形態では、ヒト対象にて変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質（たとえば、配列番号９）の存在を検出する方法は、ヒト対象から得られる生体試料にて生体試料における変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質（たとえば、配列番号４）の存在を検出するアッセイを実施することを含む。

【0165】

タンパク質の配列決定法の説明に役立つ非限定例には、質量分光分析及びＥｄｍａｎ分解が挙げられるが、これらに限定されない。免疫アッセイの説明に役立つ例には、免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、及び免疫ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。種々の既知の技法（たとえば、比色性、蛍光性、化学発光性または放射性）を用いて検出可能に標識したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は免疫アッセイでの使用に好適である。免疫アッセイに関して、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質は野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるサイズを有するので、タンパク質ゲル上にて異なる分子量で流れる。従って、同一抗体を使用することによって、たとえば、ウエスタンブロットアッセイにて野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質を変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質から区別することができる。

【0166】

本開示はまた、ヒト対象から得られる核酸分子にて本明細書に記載されているＳＩＧＩＲＲの核酸分子のいずれかにおける変異のいずれかを検出することと、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患であるとヒト対象を診断すること、または対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さなければ、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクがあるとヒト対象を診断することとを含む、ヒト対象にて炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを検出する方法も提供する。一部の実施形態では、ヒト対象はそのような診断を必要としている。一部の実施形態では、ヒト対象は炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患であると診断されている血縁者を有し得る。

【0167】

炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患の症状には、下痢、発熱、倦怠感、腹痛、腹部けいれん、吐き気、嘔吐、血便の存在、貧血、食欲減退、及び意図せぬ体重減少、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0168】

一部の実施形態では、方法は、対象から得られた生体試料から得られる変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡの存在を検出することを含む。集団内での遺伝子配列及びそのような遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、たとえば、一塩基多型（ＳＮＰ）のような遺伝子多型に起因して変化し得ることが理解される。変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びポリペプチドについて本明細書で提供されている配列は単に例となる配列であって、追加のＳＩＧＩＲＲの対立遺伝子を含む他のそのような配列も可能である。

【0169】

一部の実施形態では、検出するステップは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を配列決定することを含む。一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を配列決定することを含み、その際、配列決定される核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置を含むアミノ酸配列をコードする。本明細書で開示されている核酸分子（たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）のいずれも配列決定することができる。一部の実施形態では、検出するステップは核酸分子全体を配列決定することを含む。

【0170】

一部の実施形態では、検出するステップは、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することと、検出可能な標識で核酸分子を標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸を接触させることであって、プローブは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することであって、増幅された核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置を含むアミノ酸配列をコードする、増幅することと、検出可能な標識で核酸分子を標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてアスパラギン酸をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。本明細書で開示されている核酸分子のいずれも増幅することができる。たとえば、本明細書で開示されているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの分子のいずれも増幅することができる。一部の実施形態では、核酸分子はｍＲＮＡであり、方法はさらに、増幅するステップに先立ってｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含む。

【0171】

一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を検出可能な標識を含むプローブに接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含み、その際、プローブは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を検出可能な標識を含むプローブに接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含み、その際、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子はヒト対象から得られる細胞内に存在するので、検出は原位置ハイブリッド形成法に従う。

【0172】

一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を変異特異的なプライマーに接触させることと、変異特異的なＰＣＲ法を用いて核酸分子を増幅することとを含む。変異特異的なプライマーは本明細書に記載されているそのようなプライマーであってもよく、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質に対して特異的であってもよい。

【0173】

本明細書で開示されている方法にて使用することができる他のアッセイには、たとえば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）または定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられる。本明細書で開示されている方法にて使用することができるさらに他のアッセイには、たとえば、ＲＮＡの配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）とその後の生体試料における変異型のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの存在及び量の検出が挙げられる。

【0174】

本開示はまた、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有するヒト対象を特定する方法も提供する。方法は一般に、対象から得られる試料にて、変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在、及び／または変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする本明細書に記載されている核酸分子のいずれかの存在または非存在を検出することを含む。切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在は、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す。それぞれ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰めを生じる、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質をもたらす、配列番号２（たとえば、ゲノムＤＮＡ）に係る９９６２位に相当する位置における、または配列番号４（たとえば、ｍＲＮＡ）に係る５５７位に相当する位置における、または配列番号６（たとえば、ｃＤＮＡ）に係る５５７位に相当する位置におけるグアニン（アデニンの欠失による）の存在は、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す。方法はインビトロ、原位置、または生体内で実施されてもよい。

【0175】

本開示はまた、炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を有する、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有するヒト対象を特定する方法も提供し、方法は、対象から得られる試料にて配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有する、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められるＳＩＧＩＲＲタンパク質；及び／または配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有する、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められるＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在を検出することを含み、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質及び／または切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の存在は、患者が早期発症型炎症性腸疾患を有する、または早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを有することを示す。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれか１つで野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0176】

一部の実施形態では、試料における切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在は切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体によって検出される。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体は、（ｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置でのセリン；または（ｉｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置がセリンとなるフレームシフト突然変異のためにＳＩＧＩＲＲタンパク質にて生じるエピトープに対して特異的である。一部の実施形態では、検出はさらに、切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体の反応を野生型ＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体の反応と比べることを含む。一部の実施形態では、前記試料における前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質の存在または非存在は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出される。一部の実施形態では、試料における前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の存在または非存在は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを生じるフレームシフト突然変異が核酸分子に存在するかどうかを判定することによって検出される。一部の実施形態では、配列決定される核酸分子の一部は、配列番号９に係る１８６位に相当する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む。

【0177】

方法の一部の実施形態では、検出するステップはＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を配列決定することを含む。方法の一部の実施形態では、検出するステップは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を配列決定することを含む。配列決定される核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置を含むアミノ酸配列をコードしてもよい。配列番号２（たとえば、ゲノムＤＮＡ）に係る９９６２位に相当する位置における、または配列番号４（たとえば、ｍＲＮＡ）に係る５５７位に相当する位置における、または配列番号６（たとえば、ｃＤＮＡ）に係る５５７位に相当する位置におけるグアニン（アデニンの欠失による）の存在は、それぞれ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含有する変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質を生じる。検出するステップはＳＩＧＩＲＲタンパク質全体をコードする核酸分子を配列決定することを含んでもよい。

【0178】

方法の一部の実施形態では、検出するステップは、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することと、増幅された核酸分子を検出可能な標識で標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸分子を接触させることであって、プローブは切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸配列と、たとえば、ストリンジェントな条件下を含めて特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。方法の一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することと、増幅された核酸分子を検出可能な標識で標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸分子を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードする核酸配列（または、それぞれ、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含有する変異体ＳＩＧＩＲＲタンパク質を生じる、配列番号２（たとえば、ゲノムＤＮＡ）に係る９９６２位に相当する位置にて、または配列番号４（たとえば、ｍＲＮＡ）に係る５５７位に相当する位置にて、または配列番号６（たとえば、ｃＤＮＡ）に係る５５７位に相当する位置にてグアニン（アデニンの欠失による）を有する核酸配列）と、たとえば、ストリンジェントな条件下を含めて特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。増幅される核酸分子は好ましくは配列番号９に係る１８６位に相当する位置を含むアミノ酸配列をコードする。核酸がｍＲＮＡを含むのであれば、方法はさらに、増幅するステップに先立ってｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含んでもよい。一部の実施形態では、判定するステップは、検出可能な標識を含むプローブにＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。プローブは好ましくは、配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列（または、それぞれ、配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められ、且つ配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを含有する変異体ＳＩＧＩＲＲタンパク質を生じる、配列番号２（たとえば、ゲノムＤＮＡ）に係る９９６２位に相当する位置にて、または配列番号４（たとえば、ｍＲＮＡ）に係る５５７位に相当する位置にて、または配列番号６（たとえば、ｃＤＮＡ）に係る５５７位に相当する位置にてグアニン（アデニンの欠失による）を有する核酸配列）と、たとえば、ストリンジェントな条件下を含めて特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む。核酸分子はヒト対象から得られる細胞内に存在してもよい。

【0179】

一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することであって、増幅される核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてアミノ酸をコードするコドンを包含する、増幅することと、増幅された核酸分子を検出可能な標識で標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸分子を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。

【0180】

一部の実施形態では、検出するステップは、検出可能な標識を含むプローブにＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。一部の実施形態では、ヒト対象は１８歳未満である。一部の実施形態では、ヒト対象はクローン病を有するまたはクローン病を発症するリスクを有すると特定される。

【0181】

本開示はまた、ヒト対象から得られる切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質を検出することと、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患であるとヒト対象を診断すること、または対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さなければ炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクがあるとヒト対象を診断することとを含む、ヒト対象にて炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを検出する方法も提供する。一部の実施形態では、ヒト対象はそのような診断を必要としている。本開示はまた、ヒト対象から得られる、配列番号９を含むタンパク質のような変異型ＳＩＧＩＲＲタンパク質を検出することと、対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患であるとヒト対象を診断すること、または対象が炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さなければ炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクがあるとヒト対象を診断することとを含む、ヒト対象にて炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または炎症性腸疾患もしくは早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを検出する方法も提供する。一部の実施形態では、ヒト対象はそのような診断を必要としている。一部の実施形態では、ヒト対象は炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患であると診断されている血縁者を有し得る。

【0182】

本開示はまた、対象から得られるＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を検出することであって、ＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有し、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、検出すること及び／またはヒト対象から得られるＳＩＧＩＲＲタンパク質を検出することであって、ＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンを有し、且つ配列番号９に係る２１５位に相当する位置にて切り詰められる、検出することと、対象が早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有するのであれば早期発症型炎症性腸疾患であるとヒト対象を診断すること、または対象が早期発症型炎症性腸疾患の１以上の症状を有さなければ早期発症型炎症性腸疾患のリスクがあるとヒト対象を診断することとを含む、ヒト対象にて早期発症型炎症性腸疾患を診断する方法、または早期発症型炎症性腸疾患のリスクを検出する方法も提供する。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は、配列番号９に係る１８６位～２０９位及び２１１位～２１５位に相当する位置のいずれか１つで野生型ＳＩＧＩＲＲタンパク質と比べて異なるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は配列番号９に係る１８６位～２１５位に相当する位置にて配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体によって検出される。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体は、（ｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置におけるセリン；または（ｉｉ）配列番号９に係る１８６位に相当する位置がセリンとなるフレームシフト突然変異のためにＳＩＧＩＲＲタンパク質にて生じるエピトープに対して特異的である。一部の実施形態では、検出はさらに、切り詰められたＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体の反応を野生型ＳＩＧＩＲＲに対して特異的である抗体の反応と比べることを含む。一部の実施形態では、切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出される。一部の実施形態では、前記切り詰められたＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを生じる前記核酸分子におけるフレームシフト突然変異を検出することによって検出される。一部の実施形態では、配列決定される核酸分子の一部は配列番号９に係る１８６位に相当する位置をコードするコドンを包含する複数の位置を含む。

【0183】

一部の実施形態では、検出するステップは、ＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を増幅することであって、増幅される核酸分子は配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてアミノ酸をコードするコドンを包含する、増幅することと、増幅された核酸分子を検出可能な標識で標識することと、プローブを含む支持体に標識された核酸分子を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。

【0184】

一部の実施形態では、検出するステップは、検出可能な標識を含むプローブにＳＩＧＩＲＲタンパク質をコードする核酸分子を接触させることであって、プローブは配列番号９に係る１８６位に相当する位置にてセリンをコードするコドンを包含する核酸配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成する核酸配列を含む、接触させることと、検出可能な標識を検出することとを含む。

【0185】

一部の実施形態では、試料が得られる、本明細書に記載されているヒト対象（たとえば、診断される及び／または治療されるヒト対象）は成人ではない。一部の実施形態では、試料が得られる、本明細書に記載されているヒト対象１８歳以下である。一部の実施形態では、試料が得られる、本明細書に記載されているヒト対象は１５歳以下である。一部の実施形態では、試料が得られる、本明細書に記載されているヒト対象は１３歳以下である。一部の実施形態では、試料が得られる、本明細書に記載されているヒト対象は１０歳以下である。一部の実施形態では、６歳以下のヒト対象は超早期発症型炎症性腸疾患を有してもよい。一部の実施形態では、ヒト対象は壊死性腸炎を有さない。

【0186】

一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法のいずれも、さらに、炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患を治療するのに有効な作用物質で対象を治療することを含むことができる。一部の実施形態では、方法はさらに、対象にて変異が検出され、且つ対象が炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患を有すると診断されている場合、炎症性腸疾患または早期発症型炎症性腸疾患を治療するのに有効な作用物質で対象を治療することを含む。

【0187】

本開示はまた、早期発症型炎症性腸疾患の診断または早期発症型炎症性腸疾患を発症するリスクを診断することにおける変異型ＳＩＧＩＲＲのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチドのいずれかの使用、または本明細書で開示されている核酸分子をハイブリッド形成することも提供する。

【0188】

上記または以下で引用されている特許文書、ウエブサイト、他の出版物、受入番号等はすべて、各個々の項目が具体的に且つ個々に参照によってそのように組み入れられるように指示されたかのようにと同じ程度にあらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み入れられる。異なる時点で配列の異なるバージョンが受入番号に関連する場合、本出願の有効出願日での受入番号に関連したバージョンが意図される。有効出願日は実際の出願日、または該当する場合、受入番号に言及する優先出願の出願日のうちの早い方を意味する。同様に、出版物、ウエブサイト等の異なるバージョンが異なる時点で公開される場合、指示されない限り、出願の優先出願日で最も新しく公開されたバージョンが意図される。本開示のいかなる特長、ステップ、要素、実施形態または態様も、別様に指示されていない限り、いかなる他の特長、ステップ、要素、実施形態または態様とも組み合わせて使用することができる。本開示は明瞭さ及び理解の目的で説明及び例示を手段として多少詳細に記載されているが、ある特定の変更及び修正が添付のクレームの範囲内で実践されてもよいことが明らかであろう。

【0189】

本明細書で列挙されているヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はヌクレオチド塩基については標準の文字略記及びアミノ酸については一文字コードを用いて示される。ヌクレオチド配列は配列の５’末端で開始して３’末端に向かって進む（すなわち、各列で左から右へ）標準の慣例に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は示された鎖を参照することにより含められていると理解される。アミノ酸配列は配列のアミノ末端で開始してカルボキシ末端に向かって進む（すなわち、各列で左から右へ）標準の慣例に従う。

【0190】

以下の実施例を提供して実施形態をさらに詳細に説明する。それらは請求項に係る実施形態を説明するように意図され、限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0191】

以下の実施例は本明細書で請求項に係る化合物、組成物、物品、装置及び／または方法がどのように為され、評価されるかの完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示され、純粋な例示であることが意図され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定するようには意図されない。数（たとえば、量、温度、等）に関して正確さを確保するように努力されているが、若干の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別様に指示されない限り、部分は重量部であり、温度は℃であり、または周囲温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

【0192】

実施例１：患者の募集及び表現型決定
１３歳のＥＯ－ＩＢＤ患者、ＩＢＤに罹患している彼の母親及び罹患していない父親にて全エクソーム配列決定及びトリオベースの変異型解析を行った。この家族は患者におけるＥＯ－ＩＢＤの遺伝的評価について解明されている。

【0193】

実施例２：ゲノム試料
ゲノムＤＮＡを末梢血試料から抽出し、全エクソーム配列決定のためにＲｅｇｅｎｅｒｏｎ遺伝学センター（ＲＧＣ）に転送し、自動化バイオタンクにて－８０℃で保存した。蛍光に基づく定量を行って、配列決定目的のための適切なＤＮＡの量と質を確保した。

【0194】

１μｇのＤＮＡを１５０塩基対の平均断片長さに切断し（ＣｏｖａｒｉｓＬＥ２２０）、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの特注の試薬キットでエクソーム捕捉用に調製した。ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ ＳｅｑＣａｐ ＶＣＲｏｍｅ ２．１またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｘＧｅｎのエクソーム標的設計を用いて試料を捕捉した。試料をバーコード化し、プールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ ｗｉｔｈ ｖ４ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにて７５ｂｐペアエンド配列決定を用いて配列決定するために多重化した。捕捉した断片を配列決定し、２０×以上の網羅度で網羅した最低８５％の標的塩基を獲得した。配列決定に続いて、ＤＮＡｎｅｘｕｓ及びＡＷＳを使用するＲＧＣで開発されたクラウドベースのパイプラインを用いてデータを処理し、試料レベルのデータの生成及び解析のための標準的なツールを実行した。手短には、配列データを生成し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＣＡＳＡＶＡソフトウェアを用いて脱多重化した。配列リードマッピングし、ＢＷＡ－ｍｅｍを用いてＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒトゲノム参照アセンブリに対してアラインメントを行った。アラインメントの後、重複リードをマークし、Ｐｉｃａｒｄツールを用いてフラグを付け、ＧＡＴＫを用いてインデルを再アラインメントして変異型コールの質を改善した。ＧＡＴＫのＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを用いてＳＮＰ及びインデルの変異型及び遺伝子型をコールし、ＧＡＴＫの変異型品質スコア再較正（ＶＱＳＲ）を適用して変異型品質スコア全体に注釈をつけた。各試料について配列決定及びデータの品質のメトリック統計を取得し、取得性能、アラインメント性能及び変異型コールを評価した。

【0195】

実施例３：ゲノムデータの解析
最小読み取り深度（１０超）、遺伝子型品質（３０超）及び対立遺伝子バランス（２０％超）に対する標準の品質管理フィルターをコールした変異型に適用した。ＲＧＣが開発した注釈及び解析パイプラインを用いて、合格した変異型を分類し、それらの潜在的な機能的効果（同義、非同義、スプライス、フレームシフトまたは非フレームシフトの変異型であるかどうか）に基づいて注釈をつけた。遺伝子データからの家系同一性に由来する測定基準を介して家族関係を検証し、ＰＲＩＭＵＳ（Ｓｔａｐｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．，２０１４，９５，５５３－５６４）及びこの家族について報告された家系図との相互参照を用いてコホートにおける近縁性及び関係性を推測した。

【0196】

家系に基づいた変異型の解析及び分離を行って、報告された家族歴を前提として常染色体優性遺伝パターンのもとでの候補疾患遺伝子を同定した。罹患した発端者と罹患した彼の母親との間で共有されたが、罹患していない父親とは共有されていない変異型をその後アノテーションし、人口抑制データベース、たとえば、ｄｂＳＮＰ、１０００ゲノムプロジェクト、ＮＨＬＢＩエクソーム配列決定プロジェクト、エクソーム凝集コンソーシアムデータベース（ＥｘＡＣ）及び内部ＲＧＣデータベースにおける観察されたそれらの頻度によってフィルターにかけて、共通する多型及び高頻度の、おそらく良性変異型をフィルターで除いた。変異型の機能的効果の生物情報での予測のためのアルゴリズム、たとえば、ＬＲＴ、Ｐｏｌｙ－ｐｈｅｎ２、ＳＩＦＴ、ＣＡＤＤ、及びＭｕｔａｔｉｏｎ Ｔａｓｔｅｒを、複数種の配列比較に基づく保存スコア（すなわち、ＧＥＲＰ、ＰｈａｓｔＣｏｎｓ、ＰｈｙｌｏＰ）と共に変異型のアノテーション過程の一部として組み込み、それを用いて、特定された候補変異型の潜在的な有害性について情報を提供した。

【0197】

１３歳の患者にて早期発症型炎症性腸疾患と共に分離し、ＩＢＤに罹患した彼の母親から遺伝しているＳＩＧＩＲＲ遺伝子にて稀少な切り詰めインデル変異型（ＳＩＧＩＲＲ：ｃ．５５７ｄｅｌＡ；ｐ．Ｋ１８６ｆｓ^＊３１）を同定した。図１（パネルＡ、Ｂ及びＣ）を参照して、クローン病（ＣＤ）の家族における優性分離によるＳＩＧＩＲＲ遺伝子での切り詰め変異型の同定を示す。パネルＡは母系遺伝によるｃ．５５７ｄｅｌＡ／ｐ．Ｋ１８６ｆｓ^＊３１におけるＳＩＧＩＲＲでの切り詰め変異型を記載している表を示し；変異部位は種にわたって中立の保存スコアを有し、タンパク質機能に対する損傷が予測され；この変異型はＥｘＡＣブラウザーにて０．０００４７１の変異対立遺伝子頻度を有する。パネルＢはＥＯ－ＩＢＤに罹患した患者（Ｕｔａｈ８１４２７）とクローン病に罹患した彼の母親（Ｕｔａｈ８１４２８）と罹患していない父親（Ｕｔａｈ８１４２９）の家系図を示し；黒記号はＣＤに罹患した人を示し、白記号は罹患していない人を示し；丸は女性、四角は男性を示す。パネルＣはＣＤに罹患したＵｔａｈ８１４２７及びＣＤに罹患した彼の母親にて分離するが、罹患していない父親では観察されない同定されたＳＩＧＩＲＲ切り詰め変異型の見て分かる確認を示す。

【0198】

実施例４：検出
対象におけるある特定の遺伝子変異型の存在は、対象が早期発症型炎症性腸疾患を有するまたは発症する高いリスクを有することを示すことができる。血液試料のような試料を対象から得ることができる。一般的な核酸抽出キットを用いて試料から核酸を単離することができる。対象から得られた試料から核酸を単離した後、遺伝子変異型が存在するかどうかを判定するために核酸を配列決定する。核酸の配列を対照配列（野生型配列）と比べることができる。対象から得られた試料から得られた核酸と対照配列との間で差異を見いだされることは、遺伝子変異型の存在を示す。これらのステップは上記の実施例にて及び本開示の全体を通して記載されているように実施することができる。１以上の遺伝子変異型の存在は、早期発症型炎症性腸疾患を有するまたは発症する対象の高いリスクを示すものである。

【0199】

実施例５：試験
材料及び方法
細胞株及び培養条件
エプスタイン・バーウイルスで形質転換したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒにおいて、ＩＲＢにより承認された小児ＩＢＤ患者から生成した。健常ＬＣＬはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ製品ＩＤ：１２６３３）、１×Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ製品ＩＤ：１５１４０１２２）及び１×Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ製品ＩＤ：２５０３００８１）で補完したＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ製品ＩＤ：１０４３８０２６）にて培養した。

【0200】

刺激条件
健常対照、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者から生成したＬＣＬ及びＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦを内部に持たない４人のＥＯ－ＩＢＤ患者由来のＬＣＬを２ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で７２時間、または２ｍｇ／ｍｌのαＩｇＭ／αＣＤ４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）で１６時間刺激した。刺激に続いて、細胞培養上清を回収し、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＶ－Ｐｌｅｘヒト炎症誘発性サイトカインパネル（Ｋ１５０４９Ｄ）を用いて炎症誘発性サイトカインの分泌を定量するのに上清を使用し、及びＭｅｓｏｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＱｕｉｃｋＰｌｅｘＳＱ１２０を用いてそれを定量し、その後、ＲＮＡの配列決定によって補完した。

【0201】

統計
二元配置分散分析検定を用いて有意性を決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて３つの独立した実験からの結果を用い標準誤差を算出した。

【0202】

結果
図２を参照して、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者から生成したＬＣＬは健常なＬＣＬまたはＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦを内部に持たないＥＯ－ＩＢＤ患者由来のＬＣＬよりも多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、及びＴＮＦ－αを産生した。さらに、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者から生成した未刺激のＬＣＬは、健常なＬＣＬまたはＥＯ－ＩＢＤ患者由来の一部のＬＣＬよりも高レベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、及びＴＮＦ－αを分泌した。これはＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦのＬＣＬは構成的に活性があり、ＬＰＳ刺激に対して不応性であることを示している。図２を参照して、青色のバーは未刺激細胞から単離された上清を示し、赤色のバーはＬＰＳ刺激した細胞から単離された上清を示す。「^＊」は二元配置分散分析によるｐ＜０．０５を示し；エラーバーは３つの独立した実験からの標準誤差を示す。

【0203】

図３を参照して、αＩｇＭ／αＣＤ４０による刺激に続いて、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者から生成されたＬＣＬは健常ＬＣＬまたはＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦを内部に持たないＥＯ－ＩＢＤ患者由来の一部のＬＣＬよりも多くのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、及びＴＮＦ－αを産生した。さらに、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦ患者から生成された未刺激のＬＣＬが健常ＬＣＬまたはＥＯ－ＩＢＤ患者由来の一部のＬＣＬよりも高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、及びＴＮＦ－αを分泌したということは、ＳＩＧＩＲＲ ＬｏＦのＬＣＬは構成的に活性があり、抗ＩｇＭ／抗ＣＤ４０の刺激に対して不応性であることを示している。図３を参照して、青色のバーは未刺激の細胞から単離された上清を示し、赤色のバーは抗ＩｇＭ／抗ＣＤ４０で刺激した細胞から単離された上清を示す。「^＊」は二元配置分散分析によるｐ＜０．０５を示し；エラーバーは３つの独立した実験からの標準誤差を示す。

【0204】

未刺激の細胞では、健常対照から生成されたＬＣＬ及びＳＩＧＩＲＲの機能喪失（ＬｏＦ）変異型を内部に持たないＥＯ－ＩＢＤ患者から生成されたＬＣＬの双方と比べて切り詰められた（ｃ．５５７ｄｅｌＡ；ｐ．Ｋ１８６ｆｓ^＊３１）ＳＩＧＩＲＲのＥＯ－ＩＢＤ患者のＬＣＬにおけるＩＬ－１β、ＩＬ－８、及びＩＬ－６を含む重要な免疫修飾因子の上方調節が認められた。この所見はＳＩＧＩＲＲのＬｏＦ変異型を保有するＩＢＤ患者における独特の炎症特性を支持している。さらに、ＳＩＧＩＲＲ ＥＯ－ＩＢＤ患者に由来するＬＣＬがＩＬ－１βまたはＴＬＲの刺激による刺激に対して不応性であると認められたということは、ＳＩＧＩＲＲの非存在下でのこれら炎症誘発性経路の構成的な活性化を支持している。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【配列表】

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