特許 7238158 高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-03

(45)【発行日】2023-03-13

(54)【発明の名称】高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/56 20060101AFI20230306BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230306BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230306BHJP

   C12P 19/00 20060101ALI20230306BHJP

【ＦＩ】

C12N15/56

C12N9/26 A ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/21

C12N1/15

C12P19/00

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021557729

(86)(22)【出願日】2020-07-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-13

(86)【国際出願番号】 CN2020103021

(87)【国際公開番号】W WO2021243821

(87)【国際公開日】2021-12-09

【審査請求日】2021-12-21

(31)【優先権主張番号】202010507573.9

(32)【優先日】2020-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】呉敬

(72)【発明者】

【氏名】王蕾

(72)【発明者】

【氏名】胡凡

(72)【発明者】

【氏名】陳晟

(72)【発明者】

【氏名】宿玲恰

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／０７６６９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／０２３４１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２２２９９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／２００６５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Definition: Thermobifida fusca strain NTU22 alpha-amylase (amy13) gene, complete cds.，Database DDBJ/EMBL/GenBank [online]，Accession No. DQ473479，2009年，[retrieved on 2022-10-17]，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ473479

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４で示されるアミノ酸配列において、マルトトリオース生成アミラーゼを親とし、親の４７番目のロイシンがリジンに突然変異されていることを特徴とする、マルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体。

【請求項2】

配列番号４で示されるアミノ酸配列において、マルトトリオース生成アミラーゼを親とし、親の１０１番目、１０３番目、１５３番目のいずれか一つの位置にあるアミノ酸が突然変異されており、
下記（ａ）－（ｃ）のいずれか一つであることを特徴とする、マルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体：
（ａ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１０１番目のグリシンがセリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに突然変異されている；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１０３番目のグリシンがヒスチジンに突然変異されている；
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１５３番目のグリシンがセリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミンまたはヒスチジンに突然変異されている。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の突然変異体をコードする遺伝子。

【請求項4】

請求項３に記載の遺伝子を有している組換え発現ベクター。

【請求項5】

前記発現ベクターは、ｐＥＴシリーズ、Ｄｕｅｔシリーズ、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＨＹ３００シリーズ、ｐＨＹ３００ＰＬＫシリーズ、ｐＰＩＣ３Ｋシリーズ、又はｐＰＩＣ９Ｋシリーズのいずれか一つのシリーズであることを特徴とする、請求項４に記載の組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項３に記載の遺伝子を有している微生物細胞。

【請求項7】

デキストリンを基質とし、請求項１又は２に記載の突然変異体を触媒として、マルトトリオースを生産することを特徴とする、マルトトリオースの生産特異性を向上させる方法。

【請求項8】

前記デキストリンは米、トウモロコシ、小麦、水稲、ジャガイモ、サツマイモ、葛根及び／またはキャッサバを原料としていることを特徴とする、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項１又は２に記載の突然変異体、または請求項４もしくは５に記載の組換え発現ベクターの、マルトトリオースを調製するための使用。

【請求項10】

請求項７または８に記載の方法の、マルトトリオースを調製するための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体に関し、遺伝子工学および酵素工学の分野に属する。

【背景技術】

【0002】

マルトトリオース（Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ、α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１→４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｄ－Ｇｌｃ、Ｇ３と略称する。）は、α－（１→４）グリコシド結合を介して３つのグルコース単位が結合してなる機能性オリゴ糖に属する。その分子式はＣ１８Ｈ３２Ｏ１６であり、相対分子量は５０４．４３８であり、密度は１．８±０．１ｇ・ｃｍ^－３であり、融点は１３２－１３５℃であり、常温で白色固体粉末である。Ｇ３は、様々な優れた物理・化学的特性および生理学的特性を有し、また、虫歯を防ぐ特徴、低い甘味度、低い粘度、低いカロリー、結晶抵抗性、および低い浸透圧の特徴を有する消化可能な栄養甘味料であり、冷凍食品の冷凍温度を変化させるとともに、熱処理食品の中でメイラード反応によって引き起こされる褐変量を制御するために使用することができる。Ｇ３は、高い保湿能力を提供して、過度的な乾燥および低い水分活動度を防止し、微生物の汚染を制御しやすく、強い安定性を持っており、デンプンの老化（ｓｔａｒｃｈ ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対する強い阻害剤である。Ｇ３は、食品、飲料、化学工業、医薬等の産業において幅広く利用されている。市場上のＧ３製品はほとんど日本から来たものである。日本食品化工株式会社の「フジオリゴ＃３６０」、日本コーンスターチ（株）の「新型マルトオリゴ糖」、日本三菱ケミカルフーズ株式会社の「直鎖オリゴ糖ｏｒｉｇｏ」、群栄化学工業株式会社の「ピュアトース」は、いずれも主成分がＧ３である。

【0003】

マルトトリオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１１６、ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ ｆｏｒｍｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ、ＡｍｙＡと略称される）は、遺伝子ｔｆａによりコードされ、マルトトリオース生成能を有するα－アミラーゼである。ＡｍｙＡは、デンプンやデキストリンを基質として、糖鎖中のα－（１→４）グリコシド結合をエンドカッティングまたはエキソカッティングにより加水分解し、マルトトリオースと少量の副生物を生成する。この酵素を発見することは、Ｇ３の調製のための新規な知見を提供する。

【0004】

現在、Ｇ３の製造プロセスは化学法と酵素法の２つに分けられている。化学法はプルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）を出発原料とし、アセチル化、脱アセチル化の二つのステップによりＧ３を調製することができる。この二つのステップの反応では、濃硫酸、石油エーテル、メタノール及びナトリウムメトキシド等のハイリスクな試薬が必要であり、ステップが短く、操作が簡単であるが、基質のコストが高く、環境に対する害が大きい。酵素法は、環境に優しく、省エネで、かつ効率的・安全的な代替法としては、生産コストを著しく低減し、製品品質を向上させ、消費者の需要を満たすことができ、マルトトリオース産業の持続可能な発展を推進する原動力である。酵素法による調製は使用される酵素の違いによって、２種類に分けられている。第一種の酵素法はプルランをプルラナーゼにより加水分解し、医薬グレードのＧ３（純度９９％以上）を連続的かつ自動化で調製できるが、この方法には基質のコストが高いという問題がある。デンプンは、プルランと比較して、豊富で天然の再生可能な資源であり、米、トウモロコシ、小麦、水稲、ジャガイモ及びキャッサバなどの多くの重要な食用作物の種子、根、または塊茎の主な貯蔵炭水化物であり、より経済的である。マルトデキストリンは、デンプンを糊化させた後にα－アミラーゼを添加して液化させた生成物である。α－アミラーゼの作用により、マルトデキストリンは重合度が低く、溶解度が大きく、他の酵素が働くことに有利である。第二種の方法はＡｍｙＡを主な酵素とし、デンプンやマルトデキストリンなどの安価な原料を基質としてＧ３を生成する方法である。一般的に、脱分枝のために反応系にプルラナーゼを添加する必要がある。しかし、現在、ＡｍｙＡには、副生物であるグルコースやマルトースが多く、分離精製の難しさやコストが増加する問題がある。従って、分子修飾等の手段によりＧ３特異性の高いＡｍｙＡを取得することで、Ｇ３の生産量を向上させ、生産プロセスを簡略化し、生産コストを低減することができる。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、上記従来の問題点を解決するために、マルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体を提供する。本発明で使用される、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ） ＮＴＵ２２由来のマルトトリオース生成アミラーゼＴｆＡｍｙＡは、酵素変換反応の初期段階でＧ１－Ｇ３の生成物を生成して一種のエンドヌクレアーゼに属しているので、ＴｆＡｍｙＡがＧ３を生産する際の、基質に対する収率を低下させるとともに、分離精製の難しさも増加させる。したがって、該酵素のＧ３生産能と特異性をさらに高めることは、Ｇ３の生産コストの低減と生産の大規模化に有利である。

【0006】

本発明は、高い特異性でマルトトリオースを生産するマルトトリオース生成アミラーゼの突然変異体であって、親ＴｆＡｍｙＡに対してカルボキシル基末端がトランケートされたか、又はトランケートされた突然変異体であるアミノ酸の４７番目、１０１番目、１０３番目、１５３番目のいずれか一つの位置にあるアミノ酸を突然変異させてなる突然変異体を提供する。

【0007】

本発明の一実施態様において、前記親ＴｆＡｍｙＡのアミノ酸配列は、配列番号１で示されるものである。

【0008】

本発明の一実施態様は、以下の（ａ）－（ｅ）のいずれかに示す突然変異体である：
（ａ）親の４５１－５７２番目のアミノ酸がトランケートされ、アミノ酸配列が配列番号４で示された突然変異体；
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、４７番目のロイシンをリジンまたはアルギニンに突然変異させて得られ、それぞれＬ４７Ｋ、Ｌ４７Ｒと命名された突然変異体；
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１０１番目のグリシンをセリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンに突然変異させて得られ、それぞれＧ１０１Ｓ、Ｇ１０１Ｔ、Ｇ１０１Ｄ、Ｇ１０１Ｎ、Ｇ１０１Ｅ、Ｇ１０１Ｑと命名された突然変異体；
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１０３番目のグリシンをヒスチジンに突然変異させて得られ、Ｇ１０３Ｈと命名された突然変異体；
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１５３番目のグリシンをセリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、またはヒスチジンに突然変異させて得られた突然変異体をそれぞれＧ１５３Ｓ、Ｇ１５３Ｄ、Ｇ１５３Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｇ１５３Ｑ、Ｇ１５３Ｈと命名された突然変異体。

【0009】

本発明は、前記突然変異体をコードする遺伝子を提供する。

【0010】

本発明は、前記遺伝子を有している、ｐＥＴシリーズ、Ｄｕｅｔシリーズ、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＨＹ３００シリーズ、ｐＨＹ３００ＰＬＫシリーズ、ｐＰＩＣ３Ｋシリーズ又はｐＰＩＣ９Ｋシリーズのいずれか一つである組換え発現ベクターを提供する。

【0011】

本発明は、前記突然変異体を発現するか、又は前記遺伝子を有する微生物細胞を提供する。

【0012】

本発明の一実施形態において、前記微生物細胞は、原核細胞または真核細胞である。

【0013】

本発明は、マルトトリオースの生産特異性を向上させる方法であって、デキストリンを基質とし、前記突然変異体を触媒として、マルトトリオースを生産する方法を提供する。

【0014】

本発明の一実施形態において、前記デキストリンは米、トウモロコシ、小麦、水稲、ジャガイモ、サツマイモ、葛根及び／またはキャッサバを原料としている。

【0015】

本発明はさらに、前記突然変異体、前記遺伝子、前記組換え発現ベクター、前記微生物細胞、又はマルトトリオースの生産特異性を高める方法を用いて、マルトトリオースを調製するための使用を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、ＴｆＡｍｙＡに対してトランケーション突然変異と部位特異的突然変異を行ったことにより、様々な突然変異体が得られて、マルトトリオース生成アミラーゼの活性が増加し、生成物中のマルトトリオースの割合が向上し、マルトトリオースの後続の精製プロセスの簡略化、及び生産の大規模化を実現するために有利であり、しかもマルトトリオースの生産コストを著しく低減でき、広い工業的応用の見込みがある。

【図面の簡単な説明】

【0017】

図１はトランケートされる前及びトランケートされた後のＳＤＳ－ＰＡＧＥの図であり、図ａは野生型であり、図ｂはトランケートされた後の突然変異体である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本開示に係る発明について、具体的な実施形態をもとに説明する。本開示に係る発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

【0019】

実施例に記載する培地配合は、以下の通りである。
ＬＢ培地（ｇ／Ｌ）：ペプトン １０、酵母エキス ５、ＮａＣｌ １０。
ＴＢ培地（ｇ／Ｌ）：ペプトン １０、酵母粉末 ２４、グリセロール ５、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １６．４３、ＫＨ２ＰＯ４ ２．３１。

【0020】

実施例に記載のプルラナーゼは、デンプンの脱分枝効果を有する、脱分枝酵素の一種である。

【0021】

実施例中のＧ３含有量の測定方法：
酵素変換した試料を沸騰している水浴に１０分間、置いて、１２０００ｒ・ｍｉｎ^－１で１０分間、遠心分離し、さらに最終濃度５０％（体積比）のアセトニトリルで共沈殿させ、２時間放置した後、１２０００ｒ・ｍｉｎ^－１で１０分間、遠心分離し、上清を取り、シリンジで０．２２μＭ濾過膜を通した。移動相を、アセトニトリル：水（７４：２６）の割合にて調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびＨＹＰＥＲＳＩＬ ＡＰＳ２ アミノカラムを用いて、カラム温度を４０℃、流速を０．８ｍＬ・ｍｉｎ^－１に設定して、試料を測定した。吸収ピーク面積とマルトトリオース標準品のピーク面積からマルトトリオースの生成量を算出した。

【0022】

実施例１：トランケート体酵素の調製
１）トランケート体ベクターと野生型ベクターの構築
１.Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＮＴＵ２２由来のマルトトリオース生成アミラーゼのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は配列番号２で示される）に基づき、トランケートされた後の遺伝子断片Ｔｆｔｆａ－ΔＭＬ（ヌクレオチド配列は配列番号３で示される）と、ベクターｐＥＴ２０ｂ（＋）（発現ベクター上に、遺伝子発現を開始させるシグナルペプチドを有する）とを、シームレスクローニング酵素Ｅｘｎａｓｅ ＩＩ（Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）により連結し、組換えプラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）－Ｔｆｔｆａ－ΔＭＬが構築された。
２.ヌクレオチド配列が配列番号２で示される遺伝子断片を上記同様の方法でベクターｐＥＴ２０ｂ（＋）と連結し、組換えプラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）－Ｔｆｔｆａが構築された。

【0023】

２）トランケート体酵素と野生型酵素の発現及び精製
１.組換えプラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）－Ｔｆｔｆａ－ΔＭＬを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに転換し、３７℃で１２時間～１４時間培養してシングルコロニーを増殖させてから、シングルコロニーを抽出し、配列決定の検証を行った；正しいと検証された陽性転換体をＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む）に接種し、３７℃、２００ｒｐｍで８－１０時間培養し、シード発酵ブロスを５％接種量でＴＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びグリシン７．５ｇ／Ｌを含む）に接種した；大腸菌を３７℃のシェーカーでＯＤ６００＝０．６－０．８まで培養し、最終濃度０．１３４ｍＭのＩＰＴＧを添加して細胞外発現を誘導し、さらに２５℃のシェーカーで発酵培養を４８時間続けた後、発酵ブロスを４℃で、１００００ｇで１５分間、遠心分離し、菌体を除去し、上清を採集し、精製して、精製されたトランケート体酵素を得た。
２.組換えプラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）－Ｔｆｔｆａを、ステップ１.と同様の方法で宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに転換し、かつ培養、誘導して、精製された野生型酵素を得た。

【0024】

実施例２：突然変異体酵素の調製
１）部位特異的突然変異
プラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）－Ｔｆｔｆａ－ΔＭＬを鋳型として、合成した突然変異プライマーを用いてＰＣＲを行い、突然変異体を構築する。

【0025】

【0026】

ＰＣＲ系：２×Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２５μＬ、鋳型 １μＬ、上流プライマー ２μＬ、下流プライマー ２μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２０μＬ。ＰＣＲパラメーターは以下の通りである。すなわち、９４℃で４分間の予備変性；ＰＣＲサイクルに入った：９８℃で１０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニール、７２℃での伸長（時間の長さは増幅断片の長さから計算して、１０００ｂｐ・ｍｉｎ^－１）、２５－３０回サイクルした；最後に７２℃で１０分間の保温、４℃での保温。ＰＣＲ産物をＤｐｎ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）で消化し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに転換し、転換されたコンピテントセルをＬＢ固体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む）で一晩培養した後、シングルコロニーを抽出してＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む）で培養し、その後、プラスミドを抽出し、配列決定を行った。

【0027】

２）突然変異体酵素の発現及び精製
正しく突然変異したと配列決定されたプラスミドを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに転換し、転換された宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のシングルコロニーを抽出してＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む）において３７℃、２００ｒｐｍで８～１０時間培養し、シード発酵ブロスを５％接種量でＴＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びグリシン７．５ｇ／Ｌを含む）に接種した；大腸菌を３７℃のシェーカーでＯＤ６００＝０．６－０．８まで培養し、最終濃度０．１３４ｍＭのＩＰＴＧを添加して細胞外発現を誘導し、さらに２５℃のシェーカーで発酵培養を４８時間続けた後、発酵ブロスを４℃で、１００００ｇで１５分間、遠心分離し、菌体を除去し、上清を採集し、かつ精製して、精製された突然変異体酵素を得た。

【0028】

実施例３：マルトトリオース生成アミラーゼの酵素活性測定
酵素活性測定はＤＮＳ法を用い、系は次の通りである。
基質調製：１質量％濃度で可溶性澱粉を相応なバッファに懸濁させて、加熱撹拌し、糊化させた。
反応系： ブランク組：基質 １ｍＬ（２ｇ／１００ｍＬ可溶性澱粉）＋バッファ １ｍＬ。
対照組：基質 １ｍＬ＋バッファ ０．９ｍＬ＋適当な倍率に希釈した酵素液 ０．１ｍＬ。

【0029】

基質及びバッファ成分を事前に栓付き試験管に投入し、恒温水槽に入れて１０分間インキュベートした。酵素を適当な倍率に希釈し、対照ペアへ添加して、反応を行った。１０分間を正確にカウントした。１０分間後、３ｍＬのＤＮＳを添加し、すべての栓付き試験管を、沸騰水を持っている鍋に同時に置いて、７分間を正確にカウントし、素早く取り出して氷浴槽に入れて冷却した。低温に下げた後、１０ｍＬのＨ２Ｏを加えてよく混合した。酵素活性は、５４０ｎｍ分光光度計を用いて相応的にブランクを除いた吸光値Ａｂｓ５４０を測定し、検量線に代入して算出したものである。

【0030】

検量線：上記の系により、異なるグルコース濃度でＡｂｓ５４０と還元糖濃度との関係を測定して、その線形回帰式を検量線とする。

【0031】

酵素活性は、１分間当たり１μｍｏｌの還元糖を放出するのに必要な酵素量を酵素活性単位（Ｕ）と定義する。

【0032】

２５℃のシェーカーで発酵培養を４８時間続けた後、上清を採集し、野生型酵素及び突然変異体酵素のシェーカーでの酵素活性を測定した。その結果を表１に示す。トランケート体ＴｆＡｍｙＡ－ΔＭＬの酵素活性は大きく変化せず、Ｌ４７、Ｇ１０３の突然変異の酵素活性が向上した以外に、Ｇ１０１番目およびＧ１５３番目の突然変異は、多くの酵素活性が減少しているか、わずかに減少している。

【0033】

【0034】

実施例４：ＨＰＬＣ法によるマルトトリオース生成量の分析
ＤＥ値５－７の５質量％濃度のマルトデキストリン溶液（ｐＨ５．５）を調製し、それぞれ一定量のマルトトリオース生成アミラーゼの野生酵素及び突然変異酵素を加え、それらのエンザイム量は６０Ｕ・ｇ^－１基質であり、プルラナーゼをエンザイム量３２Ｕ・ｇ^－１基質で反応系に添加し、回転数１５０ｒｐｍ、温度５５℃の水浴のシェーカーに置いて、１１時間反応させた。試料を採取し、沸騰した水浴で１０分間煮て、酵素を失活させ、遠心分離により上清を取り、生成物溶液が得られた。生成物溶液５００μＬをアセトニトリルと１：１にて混合し、室温で２時間放置して、高分子量のデキストリン又は限界デキストリンを沈殿させ、次いで１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清をシリンジで０．２２μＭ濾過膜を通して、ＨＰＬＣ分析が可能な試料を得た。移動相を、アセトニトリル：水（７４：２６）の割合で調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ ＨＰＬＣクロマトグラフィーおよびＨＹＰＥＲＳＩＬ ＡＰＳ２ アミノカラムを用いて、カラム温度４０℃および流速０．８ｍＬ・ｍｉｎ^－１に設定して、試料を測定した。吸収ピーク面積とＧ３標準品のピーク面積とからＧ３の生成量を算出した。

【0035】

野生型酵素及び突然変異体酵素の酵素変換分析結果を表２に示す。トランケート体ＴｆＡｍｙＡ－ΔＭＬは、Ｇ３の収率を向上させ、Ｇ３の比率もわずかに向上した。Ｇ１０３の突然変異Ｇ１０３ＶおよびＧ１０３Ｐ以外に、その他のＬ４７、Ｇ１０１、Ｇ１０３およびＧ１５３の突然変異は、酵素変換産物のＧ３の比率を顕著に向上させた。単一突然変異体はＧ３の特異性を高め、生成物中の他の糖を減少させ、主生成物Ｇ３を増加させた。ここで、比率とは、生成物中のＧ３の質量濃度と生成物全体の質量濃度との比をいう。収率とは、生成物のＧ３の質量濃度と基質の質量濃度との比を指す。

【0036】

【0037】

本発明の好ましい実施例が前述のように開示されているが、これに限定されることはない。本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、当業者による様々な設計変更及び改変は本発明の権利範囲に含まれる。したがって、本発明の権利範囲は、当該特許請求の範囲で定義した内容主旨に基づくものである。

【図1a】

【図1b】

【配列表】

0007238158000001.app