(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-06
(45)【発行日】2023-03-14
(54)【発明の名称】パルスフィールド多重化キャピラリ電気泳動システム
(51)【国際特許分類】
G01N 27/447 20060101AFI20230307BHJP
【ＦＩ】
G01N27/447 315K
G01N27/447 325A
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019569967
(86)(22)【出願日】2018-06-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-08-27
(86)【国際出願番号】 US2018039668
(87)【国際公開番号】W WO2019005907
(87)【国際公開日】2019-01-03
【審査請求日】2021-06-18
(31)【優先権主張番号】15/634,846
(32)【優先日】2017-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100107319
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100170379
【弁理士】
【氏名又は名称】徳本 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(74)【代理人】
【識別番号】100096769
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】ヴァー・ミア，マーク・アール
(72)【発明者】
【氏名】ウテ，ジョリタ・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】フォスター，マーティン・クリス
(72)【発明者】
【氏名】ボエーク，ブルース・アール
【審査官】黒田 浩一
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１０９４０６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開平０５－１０７２２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０３－０４１３５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第０２／０４４７０８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開平０９－１２７０５７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２７／４４７
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の期間の間、媒体中にサンプルを含む２本のキャピラリのそれぞれにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波形を印加することと、前記第１の期間の直後に続く第２の期間の間、前記２本のキャピラリのそれぞれにわたって第２の周波数で異なる形状の少なくとも第２のパルスフィールド波形を印加することとによって波形のシーケンスを印加するステップと、
前記波形のシーケンスを印加するステップを少なくとも２回繰り返すステップと、
前記２本のキャピラリのそれぞれの内部で前記サンプルの誘発された分離から、前記２本のキャピラリのそれぞれで前記サンプルを検出するステップと
を含む、多重化キャピラリ電気泳動方法。
【請求項2】
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第１の期間及び前記第２の期間は、各々１０分未満、各々５分未満、各々１分未満の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
蛍光又は吸光検出によって、キャピラリアレイホルダの窓を通して前記２本のキャピラリのそれぞれで前記サンプルを検出するステップを含み、前記２本のキャピラリは前記キャピラリアレイホルダの窓に整列される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の周波数及び前記第２の周波数は、０．５Ｈｚ～１００Ｈｚ、０．５Ｈｚ～１５Ｈｚ、０．５Ｈｚ～３０Ｈｚ、２Ｈｚ～２０Ｈｚ、２Ｈｚ～１５Ｈｚの群から選択される範囲内で変動する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形は、前記キャピラリのアレイ中で１５０，０００塩基対（ｂｐ）より大きいフラグメントサイズを備える前記サンプルの核酸の電気泳動分離に有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形はサンプルを含む１２本のキャピラリそれぞれにわたって印加され、前記１２本のキャピラリのそれぞれでサンプルは検出されること、
前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形はサンプルを含む２４本のキャピラリそれぞれにわたって印加され、前記２４本のキャピラリのそれぞれでサンプルは検出されること、
の群から選択される特徴を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
第１の期間の間、媒体中にサンプルを含む２本のキャピラリのそれぞれにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波形を印加することと、前記第１の期間の直後に続く第２の期間の間、前記２本のキャピラリのそれぞれにわたって第２の周波数で異なる形状の第２のパルスフィールド波形を印加することと、第３の期間の間、前記２本のキャピラリのそれぞれにわたって第３の周波数で少なくとも前記第１のパルスフィールド波形又は前記第２のパルスフィールド波形とは異なる形状の第３のパルスフィールド波形を印加することとによって波形のシーケンスを印加するステップと、
前記波形のシーケンスを印加するステップを少なくとも２回繰り返すステップと、
前記２本のキャピラリのそれぞれの内部で前記サンプルの誘発された分離から、前記２本のキャピラリのそれぞれで前記サンプルを検出するステップと
を含む、多重化キャピラリ電気泳動方法。
【請求項10】
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動し、前記第３の周波数は前記第３の期間内で時間とともに変動する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
２本のキャピラリを備える置換可能なキャピラリアレイを収納するように構成されるコンソールと、
前記コンソール内に配置されたパルスフィールド電圧電源と、
第１の期間の間、少なくとも２本のキャピラリのそれぞれにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波形を印加することと、前記第１の期間の直後に続く第２の期間の間、前記２本のキャピラリのそれぞれにわたって第２の周波数で異なる形状の少なくとも第２のパルスフィールド波形を印加することとによって波形のシーケンスを印加することと、前記波形のシーケンスを印加することを少なくとも２回繰り返すこととを行う、前記パルスフィールド電圧電源を制御するように構成された制御デバイスと、
前記コンソール内に配置され、前記２本のキャピラリのそれぞれの中のサンプルを、前記２本のキャピラリのそれぞれの内部のサンプルの誘発された分離から検出するように構成される検出器と
を備える、多重化パルスフィールド電気泳動のための多重化キャピラリ電気泳動システム。
【請求項12】
前記コンソールは、その下に前記キャピラリアレイが受容される注入位置を備え、前記コンソールは、前記サンプルを含むように構成されるサンプルプレートを前記注入位置において受容するように構成され、
前記コンソールは、前記注入位置において前記サンプルを前記キャピラリアレイに注入するように構成され、
前記パルスフィールド電圧電源は、前記サンプルを注入した後に、前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形を印加するように構成され、前記サンプルの電気泳動による分離を達成するものである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記注入位置において、前記パルスフィールド電圧電源は、前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形を印加する前に、前記サンプルを前記キャピラリのアレイに注入するのに有効な電界を印加するように構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項14】
前記コンソールは、前記サンプルを流体力学的に注入するように構成される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項15】
前記コンソールに配置され、少なくともバッファプレート及びサンプルプレートを別々に含むように構成される、少なくとも２つの引き出しと、
前記コンソールに配置され、前記サンプルプレート又は前記バッファプレートの少なくとも１つを、少なくとも前記２つの引き出しの少なくとも１つから前記多重化キャピラリ電気泳動システムの注入位置に移動するように構成される、動作制御システムと
を備える、請求項１１に記載のシステム。
【請求項16】
前記パルスフィールド電圧電源は、第３の期間の間、２本のキャピラリのそれぞれにわたって第３の周波数で少なくとも第３のパルスフィールド波形を印加するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項17】
前記パルスフィールド電圧電源と通信する波形発生器であって、前記第１のパルスフィールド波形及び前記第２のパルスフィールド波形を作成するように構成される波形発生器を備える請求項１１に記載のシステム。
【請求項18】
前記パルスフィールド電圧電源と通信するキャピラリアレイ回路基板を備え、前記パルスフィールド電圧電源は前記キャピラリアレイ回路基板を介して前記第１のパルスフィールド波形及び第２のパルスフィールド波形を印加するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項19】
前記キャピラリアレイ回路基板と通信する電極アレイを備え、前記パルスフィールド電圧電源は前記電極アレイをさらに介して前記第１のパルスフィールド波形及び第２のパルスフィールド波形を印加するように構成される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項20】
前記キャピラリはそれぞれのキャピラリ先端を備え、前記電極アレイは前記それぞれのキャピラリ先端に隣接して配置される電極を備える、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マルチチャネルパルスフィールドキャピラリ電気泳動のシステム及びソフトウェアに関する。
【0002】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、２０１５年１２月３０日に出願された米国特許出願第１４／９８４，０３９号の一部継続出願である。
本出願は、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、２０１５年１２月３０日に出願された米国特許出願第１４／９８４，０３９号の一部継続出願である。
【背景技術】
【0003】
現在の次世代シーケンシング（ＮＧＳ：next-generation sequencing）プラットフォームは、パイロシーケンシング、イオンシーケンシング、合成によるシーケンシング、又はライゲーションによるシーケンシングを含む、シーケンシングのための種々の技術を使用する。これらの技術は、幾つかの軽微な変更を有するが、これらの技術は全て、全体的に共通のＤＮＡライブラリ調製プロシージャを有し、ＤＮＡライブラリ調製プロシージャは、ゲノムＤＮＡ品質＆品質評価、ＤＮＡ断片化及びサイジング（機械的せん断、音波処理、噴霧化、又は酵素消化を含む）、ＤＮＡ修復及び末端ポリッシング、並びに、最終的なプラットフォーム特有のアダプタライゲーションのステップを含む。ＤＮＡ配列情報についての急速に増大する需要によって、ＤＮＡライブラリの調製について必要とされる時間を低減する緊急の必要性が存在する。多くの商用ＮＧＳシステムは、長さが３０塩基対（ｂｐ）～２０００ｂｐに及ぶポリ（核酸）の比較的短いフラグメントのシーケンシングに基づく。ポア又はナノポアプラットフォームに基づくＮＧＳシステムは、５０００ｂｐ以上に及ぶより大きいフラグメントサイズを使用する。場合によっては、所望のフラグメントサイズは、２００００～５００００ｂｐより大きい。ロングレンジシーケンサのより新しい用途は、５００００ｂｐから１５００００ｂｐより多い値又はそれより大きいフラグメントサイズを狙う。
【0004】
ＤＮＡライブラリ調製における労働集約的なステップは、非せん断ゲノムＤＮＡと下流断片化ＤＮＡの両方の定性化（サイズ決定）及び定量化である。ＤＮＡフラグメント分析のための既存の方法は、アガロースゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、及びチップベース電気泳動を含む。アガロースゲル電気泳動は、労働集約的であり、ゲル調製、ピペッティングによるサンプル移送、及び画像解析を必要とする。アガロース電気泳動によって取得される画像は、しばしば歪まされ、疑わしい又は信頼性のないデータをもたらす。アガロースゲル電気泳動を使用して、ＤＮＡの正確な定量化を行うことは不可能であり、そのことは、別個の第２の方法（ＵＶ又は蛍光分光法）が定量化のために必要とされることを意味する。最後に、アガロースゲル電気泳動は自動化するのが難しい。チップ又はマイクロチップベース電気泳動は、アガロースゲル電気泳動に優るデータ品質の改善を提供するが、依然として労働集約的である。例えば、チップベース方法は、ゲル、マーカ、及びサンプルを装填する手作業のステップを必要とする。これらのマイクロチップ又はチップベース電気泳動ユニットが数秒又は数分で単一サンプルを処理できても、サンプル及びゲル装填は、特に、数百又は数千のサンプルを処理するときの、使用の容易さに対する障壁である。同様に、既存のチップベースシステムは、ゲノムＤＮＡを定量化することができない。キャピラリ電気泳動（ＣＥ：capillary electrophoresis）は、ゲル充填及びサンプル装填が自動化される点で、アガロース電気泳動とマイクロチップ電気泳動の両方に優る利点を提供する。
【0005】
標準的な一定電界マイクロチップ及びキャピラリ電気泳動システムは、ＤＮＡフラグメントがずっと大きい場合であっても、通常、５００００ｂｐ以下のＤＮＡサイズ値をレポートする。そのため、標準的なマイクロチップ及びキャピラリ電気泳動システムは、約５００００ｂｐを超えるＤＮＡフラグメントサイズを正確に測定するその能力が制限される。より新しいシーケンシング技術は、約５００００ｂｐより大きいサイズを有する入力ＤＮＡの分析を必要とする。
【0006】
ＤＮＡの大きいフラグメント又はスメアを分析する標準的な方法は、スラブ－ゲルパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ：Pulsed-Field Gel Electrophoresis）であり、この方法では、１０００塩基対（ｂｐ）未満から数百万ｂｐのサイズ範囲を有するＤＮＡが、分離され、正確にサイジングされ得る。ＰＦＧＥの主要な制限は、サンプル処理量であり、なぜならば、分析のために必要とされる時間が、対象のサイズ範囲及びサンプル調製の複雑度に応じて数時間から数日に及び得るからである。
【0007】
パルスフィールドを交替させる技術は、大きいＤＮＡフラグメントの分析時間をＰＦＧＥの数時間／数日から２時間未満まで減少させるという目標で、ＰＦＧＥから単一キャピラリ電気泳動に拡張された。例えば、Kargerは、特許文献１において、単一キャピラリパルスフィールドキャピラリ電気泳動システム（ＰＦＣＥ：pulsed field capillary electrophoresis system）を述べている。Magnusdottir等は、非特許文献１において、ＰＦＣＥシステムを述べている。これらのパルスフィールド単一キャピラリ電気泳動は、２０００００塩基対のサイズまでのＤＮＡフラグメントを測定することが示されたが、処理量は、１処理当たり１サンプルに制限される。パルスフィールドキャピラリ電気泳動の処理時間が２０分から１時間である可能性があっても、数百のサンプルのサンプル負荷は、単一キャピラリシステムの処理量制約のために処理するのに数時間から数日かかる場合がある。
【0008】
パルスフィールドキャピラリ電気泳動のために使用されてきた方法は、単純で単一の交流波形、例えば、固定の又は変動する周波数で若しくは異なるデューティサイクルで、フォワード電圧時間がリバース電圧時間と異なる状態で印加される矩形波又は正弦波の印加に一般に頼ってきた。固定の又は変動する周波数を有するこれらの単一波形方法は、鋭いエレクトロフェログラムピークを与える個々のＤＮＡフラグメントを分析するとき、しばしば、許容可能な結果を与えるが、これらの方法は、複雑なＤＮＡ集塊又はＤＮＡスメアが処理されるときに正確な結果を一般に与えない。ＤＮＡ集塊又はスメアは、利用されるパルス化法に非常に敏感である幅広い不明瞭なピークである。パルスフィールドキャピラリ電気泳動システムに関する単純で単一の波形によって取得されるサイジング結果は、標準的なパルスフィールドスラブゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用して取得される結果と大幅に異なる結果を与える場合がある。例えば、単一周波数矩形波キャピラリ電気泳動システムによって測定されるＤＮＡスメアについての平均スメアサイズは、通常、標準的なパルスフィールドスラブ電気泳動システムに関して測定されるものより少なくとも１０～２０％小さい。また、単純で単一の波形方法は、複雑なＤＮＡ混合物に適用されると、分析下のサンプルを正確に示さない異常なシステムピークをしばしばもたらす。
【0009】
したがって、複数のサンプルを同時に処理することができ、また、幅広のＤＮＡスメアを分析し、標準的なパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって取得されるものと同等であるゲル画像又はエレクトロフェログラムを生成することができるパルスフィールドキャピラリ電気泳動システムについての必要性が存在する。
【0010】
多重化キャピラリ電気泳動が知られている。例えば、Kennedy及びKurtは、特許文献２において、多重化吸収ベースキャピラリ電気泳動システム及び方法を述べている。Yeung等は、特許文献３において、多重化蛍光ベースキャピラリ電気泳動システムを述べている。これらのシステムは、複数のサンプルを同時に分析する利点を提供し、幾つかのプレートを順次処理し得るが、これらのシステムは、システムが処理を行っている間に、複数のサンプルプレートを装填又は変更する能力に欠け、また、効率的なサンプル分析のための単純なワークフローに欠ける。さらに、これらの多重化システムは、約５００００ｂｐを超える核酸フラグメントサイズを測定する能力に欠ける。
【0011】
従来技術のパルスフィールドキャピラリ電気泳動システムの制限は、環境温度制御のためのオプションの欠如である。温度は、処理間の性能及びキャピラリパルスフィールドシステムの長期信頼性に影響を及ぼし得る。そのため、注意深く制御された環境温度制御のためのオプションを有する多重化パルスフィールドキャピラリ電気泳動システムについての必要性が存在する。
【0012】
既存の商用ＣＥシステムは、ロボティックシステムによって自動化され得るが、独立型システムは、完全に自動化されていないか、又は、適切なＤＮＡライブラリ分析について必要とされる感度及びデータ品質に欠けている。ロボット対応インターフェースを有するＣＥ機器の一例は、特許文献４においてKurt等によって与えられる。ＤＮＡライブラリ、及び変異検出等の他のアプリケーションの構築のために、１日当たり数千のサンプルを処理することがしばしば必要であるが、サンプルハンドリングのためのロボティックシステムの実装は、法外に高価であり、多くの実験所は、精緻なロボティックシステムの維持及び運用のために必要な専門知識に欠ける。特許文献５に記載されるような、マイクロ－スラブ－ゲル電気泳動の自動化形態が開発されている。これらは、複数のサンプルの自動分析を可能にするが、その技法は、かなりの人間の介入を依然として必要とするか、又は、大容積用途のために必要とされる処理量を持たない。Amirkhanian等は、特許文献６において、多重化キャピラリ電気泳動を使用して、一度に１２個のサンプルまでを測定することが可能な１２チャネル多重化キャピラリ電気泳動システムを述べている。しかしながら、このシステムは、複数の９６ウェルプレートを測定することが可能でなく、１日当たり数千サンプルの分析を可能にするワークフローを持たない。
【0013】
見てわかるように、自動化キャピラリ電気泳動システムについての必要性が存在し、自動化キャピラリ電気泳動システムは、ａ）ロボティックシステムの複雑度、コスト、及び必要とされる専門知識を無くし、ｂ）ユーザが１日当たり１サンプルから数千サンプルを処理することを可能にし、ｃ）システムが他のサンプルを処理している間に、ユーザが、キャピラリ電気泳動システム上で幾つかのプレート又はサンプルを好都合に装填することを可能にし、ｄ）小さいサイズかつ小さいフットプリントの独立型キャピラリ電気泳動ユニットを有し、ｅ）ユーザが、５００００ｂｐより大きい、好ましくは、１０００００ｂｐより大きいＤＮＡフラグメントサイズを正確に決定することを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0014】
【文献】米国特許第５，１２２，２４８号
【文献】米国特許第６，８３３，０６２号
【文献】米国特許第５，３２４，４０１号
【文献】米国特許第７，１１８，６５９号
【文献】米国特許出願第２０１００１２６８５７号
【文献】米国特許第６，８２８，５６７号
【非特許文献】
【0015】
【文献】「Electrohydrodynamically Induced Aggregation During Constant and Pulsed Field Capillary Electrophoresis of DNA」Biopolymers, Vol 49,385-401,1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明は、上記で述べた必要性の達成を主要な目的として有する。
【課題を解決するための手段】
【0017】
本発明は、少なくとも２本、好ましくは、少なくとも１２本のキャピラリに、変動する又はパルス状の電界を同時に印加する能力を有するパルスフィールドキャピラリ電気泳動システムである。
【0018】
本発明は、分析処理の継続時間の間に反復される複数の単純波形の複数のシーケンスの印加として規定される複合波形の印加も含む。
【0019】
多重化パルスフィールド並列キャピラリ電気泳動を使用して複雑なＤＮＡスメアの高品質分離を取得する好ましい方法は、異なる可変電圧波形パターンを、シーケンスで、所定の期間にわたって、反復して印加することである。例えば、好ましい分離方法は、或る期間の間に矩形波を、それに続いて、或る期間の間に三角波を、その後、数回の反復について矩形波及び三角波を繰り返して印加することである。これは図１８Ａに示され、或る期間Ｔ１の間に印加される矩形波、それに続く、或る期間Ｔ２の間に印加される三角波を有する。図１８Ａに示す事例において、印加される矩形波の周波数は、低速から高速まで変動し、一方、三角波の周波数は一定である。図１８Ｂは、或る期間Ｔ１の間に印加される正弦波（固定周波数）、それに続く、或る期間Ｔ２の間の、変動する周波数の矩形波を示す。Ｔ１＋Ｔ２シーケンスは、「Ｉ」回、反復されて、Ｉ（Ｔ１＋Ｔ２）分の総処理時間が取得される。別の例は、或る期間の間に矩形波を、それに続いて、或る期間の間に一定電圧を、その後、数回の反復について矩形波及び一定電圧シーケンスを繰り返して印加することである。本発明の別の好ましい態様は、電気泳動分離期間にわたって少なくとも３つの異なる波形を印加することである。例えば、三角波、それに続く矩形波、それに続く正弦波の印加であって、３つの波形のシーケンスが複数回反復される、印加である。本発明の別の好ましい態様は、２つの異なる波形と、それに続く第３の波形とを反復することである。例えば、三角波、それに続く矩形波の印加であって、そのシーケンスが数回反復され、それに続いて、固定期間の間の矩形波が印加される、印加である。別の例は、順次セグメントで、第１の期間の間に矩形波を、第２の期間の間に一定電圧を、第３の期間の間に三角波を印加し、電気泳動が終了するまで、複数回、シーケンスを反復することである。
【0020】
本発明の別の態様は、少なくとも２本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、第１の期間の間にキャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、第２の期間の間にキャピラリにわたって第２の周波数で少なくとも異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加することと、その後、上記第１のパルスフィールド波及び少なくとも上記第２のパルスフィールド波を少なくとも２回繰り返すこととを含み、上記第１の周波数は上記第１の期間内で時間とともに変動し、上記第２の周波数は上記第２の期間内で時間とともに変動する、方法である。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】サンプルプレート及びバッファプレートを保持するための６つの引き出しを有する機器の左前図である。
【図2】１つの引き出しがバッファプレートの設置のために引っ張り出され、上部ドア区画及び側面ドア区画が開放している状態の、機器の右前図である。
【図3】ｘ－ｚステージ組み立て体を示す図である。
【図4】引き出し、ステージ組み立て体、トレイホルダ、及びサンプルプレートを示す図である。
【図5】トレイホルダの底部を示す図である。
【図6】カバーなしの機器の右側面図である。
【図7】カバーなしの機器の左側面図である。
【図8】キャピラリアレイカートリッジを示す図である。
【図9】ジョブのキューを作成するソフトウェア制御プログラムのフローチャートである。
【図10】コンピュータソフトウェアのコンピュータスクリーン画像を示す図である。
【図11】ステージによるアレイの下でのサンプルプレートの位置決めを示す図である。
【図12A】キャピラリ電気泳動リザーバシステムの図である。
【図12B】キャピラリ電気泳動リザーバシステムの図である。
【図13A】引き出しに対するｘ－ｚステージの図である。
【図13B】サンプルトレイが持ち上げられた状態のｘ－ｚステージの図である。
【図14】パルスフィールド電源を有する機器の背面図である。
【図15A】温度制御チャンバを有する機器の上面図である。
【図15B】温度制御チャンバの切り欠き図である。
【図16A】マーカ７ＧＴの従来技術のスラブ－ゲル分離を示す図である。
【図16B】一定印加電界を用いる従来のキャピラリ電気泳動を使用したマーカ７ＧＴの分離を示す図である。
【図16C】パルス状印加電界を用いる本発明のキャピラリ電気泳動システムを使用したマーカ７ＧＴの分離を示す図である。
【図17A】純粋な矩形波（底部トレース）と混合式矩形／三角波（上部トレース）との両方を使用したマーカ７ＧＴの分離を示す図である。
【図17B】純粋な矩形波によって分析された同じＤＮＡスメアのエレクトロフェログラムと比較した、反復式で混合式の波シーケンスによって分析されたＤＮＡスメアのエレクトロフェログラムである。
【図18A】或る期間Ｔ１の間に印加された矩形波と、それに続く、時間Ｔ２の間に印加された三角波との一例を示す図である。
【図18B】或る期間Ｔ１の間に印加された正弦波と、それに続く、時間Ｔ２の間に印加された矩形波との一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明は、向上したワークフローを有する多重化パルスフィールドキャピラリ電気泳動システムである。本発明のキャピラリ電気泳動システム及び装置は、光源を有する吸光又は蛍光ベースキャピラリ電気泳動サブシステム、光源から、少なくとも１２本のキャピラリ（好ましくは、９６本のキャピラリ）を含む多重化キャピラリのサンプル窓まで光を運ぶ方法、及び、多重化アレイのサンプル窓から放出光（蛍光）又は吸収光（吸光）を検出する方法を含む。サブシステムは、キャピラリを通してバッファ及びゲルを圧送する方法並びに電気泳動分離のために電界を印加する方法も含む。本発明の蛍光ベースサブシステムの光学部品は、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、米国特許出願公開第２００７０１３１８７０号及び同第２０１００１４０５０５号においてPangによって述べられている。該当する吸光ベースシステムの光学部品、並びに、流体ハンドリング、リザーバベンティング、電界の印加、並びに、シリンジポンプ及び６方分配弁による流体の選択は、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、米国第７，５３４，３３５号及び第６，８３３，０６２号においてKennedy等によって論じられている。
【0023】
図１を参照すると、向上したワークフローを有する多重化キャピラリシステム（又はユニット、又は機器）及び／又はコンソール１６は、ゲルの装填に対する容易なアクセスのためのドア１０、バッファトレイ及び廃棄物トレイの容易な装填のための２つの引き出し１１を有する。引き出し１２は、９６ウェルＰＣＲプレート、チューブストリップ、バイアル、又は他のサンプルコンテナの容易な装填のために開放され得る。上部ドア１３は、置換可能なキャピラリアレイ、アレイ窓、及びキャピラリリザーバにアクセスするために開放され得る。インジケータ光１４は、電気泳動のための高電圧の印加がアクティブであることをユーザに通知するのに使用される。取り外し可能なバックパネル１５は、高電圧電源、電気通信パネル、ポンプ基板、圧力変換器基板及びステージドライバ電子部品等の電子部品に対するアクセスを可能にする。バックパネル１５は、引き出し１１及び１２からキャピラリアレイにサンプルトレイを移動させるのに使用されるｘ－ｚステージに対するメンテナンスアクセスも可能にする。
【0024】
図２は、上部ドア及び側部ドアが開放した状態の、向上したワークフローコンソール１６とともに使用される多重化キャピラリシステムを示す。置換可能なキャピラリアレイ（カートリッジ）１７は、多重化キャピラリ電気泳動のために１２本又は９６本のキャピラリを保持する。ＬＥＤ光ガイド６７は、背面区画内に位置するＬＥＤエンジンから、アレイ窓ホルダ１９とＬＥＤ光ガイド及び窓ホルダ１８との間に挿入されるアレイ窓ブロック２２まで光を誘導する。この図において、アレイ窓ブロック２２は、表示のためにキャピラリアレイ１７に取り付けられる。キャピラリアレイ１７がシステム１６から取り外されると、アレイ窓ブロック２２は、（図示するように）キャピラリアレイ１７に取り付けられ得る。キャピラリアレイ１７が完全に設置されると、アレイ窓ブロック２２は目に見えなくなる。なぜならば、アレイ窓ブロック２２が、アレイ窓ホルダ１９とＬＥＤ光ガイド及び窓ホルダ１８との間に挟まれるからである。ベント弁２１は、キャピラリリザーバ２０の上部に接続される。６方分配弁２９に結合されたシリンジポンプ２３は、流体及び電気泳動ゲルを、流体コンテナ２４及び２５から、キャピラリリザーバ２０、廃棄物コンテナ２６、又はキャピラリアレイ１７内のキャピラリに送出する。ファン２７は、冷却空気を、強制的に、背面区画からキャピラリアレイ１７を通し、キャピラリリザーバ２０の外側を通過させ、下方に流体コンテナ２４及び２５を通過させ、最後に機器の底部から外に出すのに使用される。ＬＥＤインジケータ光１２０は、引き出し内のトレイの存在又は非存在を示すのに使用される。バッファトレイ２８は引き出し（１１、図１）内に示される。キャピラリアレイリザーバ先端９１は、キャピラリリザーバ２０内に挿入されて示される。
【0025】
運動制御システムの概念及び実用的な実装態様が知られている。例えば、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、Sabonovic及びOhnishi「Motion control」John Wiley and Sons,2011は、運動制御の設計及び実装のための実用的な方法を論じている。しかしながら、それは、本明細書で述べる、向上したＣＥワークフローコンソール１６を示していない。
【0026】
図３は、ｘ－ｚステージ組み立て体４８を示し、ｘ－ｚステージ組み立て体４８は、サンプルプレート又はトレイ（５０、図４）及び関連するトレイホルダ（５１、図４）を、引き出し（１２、図１）から、キャピラリアレイ（１７、図８）の注入キャピラリ（７２、図８）及び注入電極（７１、図８）まで輸送するのに使用される。ｘ－ｚステージ組み立て体４８は、バッファトレイ又は廃棄物トレイ（２８、図２）を、引き出し（１１、図１）から、キャピラリアレイ１７の注入キャピラリ７２及び注入電極７１（図８）に位置決めするのにも使用される。ｘ－ｚステージ組み立て体４８は、アライメントピン３２を有するトレイキャリア３１を有し、アライメントピン３２は、トレイホルダ（５１、図４）の底部上の穴（５７、図５）に整列して、輸送中のトレイホルダ５１の後続の摺動又は移動を防止する。金属又はプラスチックで作られた保護カバー３４は、ゲル又は他の液体が、ｘ－ｚステージ組み立て体４８のｘ方向ガイドレール３８及びｘ方向ドライブベルト３７上にこぼれることを防止するのに使用される。ｘドライブステッパモータ３５は、ｘ方向への運動のための電気機械ドライバとして使用される。ドライブプーリ３６は、ステッパモータ３５及びｘ方向ドライブベルト３７に取り付けられ、ステージキャリア３９をガイドバー３８に沿って前後に駆動する。第２のドライブプーリ（図示せず）は、ステージの後端に向かうベルト３７上で使用され、ベルト３７が、ステージキャリア３９に固着されると、完全なループを作ることを可能にする。ベルト３７のいずれのモータ誘発移動も、ガイドレール３８上でステージキャリア３９のｘ方向移動を誘発する。ｚ位置のためのステッパモータは、４１に位置し、ｘ方向で示した構成と同様のドライブプーリ／ベルト構成に取り付けられる。ｚ方向ドライブベルトは４３として示される。ｚ位置モータ／プーリ／ベルトは、トレイキャリア３１をガイドバー４０の上下に移動させるのに使用される。上部プレート３３は、ガイドバー４０の構造支持体として役立つ。電気通信ストリップ４４は、電気モータ制御基板４６とステッパモータ４１及び３５との間で通信するのに使用される。ｘ方向膜ポテンショメータストリップ４９は、適切な制御電子部品とともに、ｘ方向におけるステージキャリア３９の絶対位置を決定し制御するのに使用される。ｚ方向膜ポテンショメータストリップ４２は、適切な制御電子部品とともに、ｚ方向におけるトレイキャリア３１の絶対位置を決定するのに使用される。リニアエンコーダ又はロータリエンコーダ（ステッパモータ３５、４１上）は、位置測定及び制御の代替の形態である。軸受け４５は、各ガイドバー４０及びガイドレール３８上に位置して、トレイキャリア３１とステージキャリア３９との両方の摩擦なしの移動を可能にする。１つの軸について２つのガイドバー４０又はガイドレール３８が存在することに留意されたい。電気コードガイドストラップ４７は、背面支持体に取り付けられ、背面支持体は、ｘ－ｚステージ組み立て体４８用の電気制御基板４６も保持する。
【0027】
図４は、ｘ－ｚステージ組み立て体４８、トレイホルダ５１、及び９６ウェルサンプルトレイ５０の画像上に重ね合された引き出し１２を示す。トレイホルダ５１は、５０としてここで示す９６ウェルプレートを特に保持するように成形される。トレイホルダ５１の代替の成形は、３８４ウェルプレートを含む異なるサンプルプレートを可能にする。トレイホルダ５１の底部上の穴（５７、図５）は、トレイキャリア（３１、図４）のアライメントピン３２に整列する。トレイホルダ５１内のノッチ５３は、引き出し１２上のアライメントピン５２に整列して、トレイホルダ５１が、サンプル引き出し１２内に、緊密で再現性のある方法で嵌合することを可能にする。
【0028】
図６は、電気泳動システムの右側面図であり、電気泳動システムは、シャシ６６、ポンプモータ及び制御システム６１、ポンプ制御基板６２、ＬＥＤ光エンジン６９、ＬＥＤ光ライン６７、キャピラリアレイ１７の電極にわたって０．０ｋＶ～１５ｋＶを印加することが可能な高電圧電源基板６５、ＣＣＤカメラ６４、キャピラリアレイカートリッジ１７、アレイ窓ホルダ１９、キャピラリリザーバ２０、引き出し１１、引き出し１２、流体ライン６８、廃棄物コンテナ２６、ゲルコンテナ２５、及びシリンジ２３を有する。ＵＳＢ電子分配基板は６３として示される。
【0029】
図７は、電気泳動ユニット１６の左側面図を示し、トレイホルダ５１及びサンプルトレイ又はプレート５０を引き出し１２又は１１からキャピラリアレイ１７の底部まで移動させるｘ－ｚステージ組み立て体４８を示す。ステージユニット４８は、サンプルトレイホルダ５１及びサンプルトレイ５０をｚ方向に上方に移動させて、トレイホルダ／サンプルトレイを引き出し１２（又は１１）から外して持上げ、サンプル引き出し１２から外方にｘ方向に後ろに下がり、その後、サンプルプレート５０をキャピラリアレイ１７の底部までｚ方向に上に移動させ得る。動電学的又は流体力学的注入後、ステージユニット４８は、サンプルトレイホルダ／サンプルトレイをターゲット引き出し位置まで下に（ｚ方向に下に）下げ、サンプルプレート５０の真上にｘ方向に前進させ、その後、ｚ方向に下に落として、サンプルトレイホルダ／サンプルトレイを引き出し１２上にセットし得る。サンプルトレイホルダ５１が引き出し１２内に載置されると、サンプルトレイホルダ５１及びサンプルトレイ５０の背面エッジは、背面エッジが、キャピラリアレイ１７のすぐ下に存在しないように整列する。これは、サンプルステージトレイキャリア（３１、図３）が、引き出し内の他のトレイホルダ／サンプルトレイに衝突することなく、トレイホルダ／サンプルトレイとともに、ｚ軸全体に沿って上下に移動することを可能にする。キャピラリアレイ１７の底部上のアライメントピン（７０、図８）は、トレイホルダ５１をサンプルトレイ５０に整列させるのに使用され、キャピラリ及び電極の先端（注入キャピラリ７２及び注入電極７１の先端）は、サンプルプレート５０の各サンプルウェルに浸かり、サンプルプレート５０の他のエリアと衝突しないようになっている。これは、図１１により詳細に示され、図１１は、サンプルトレイ５０がキャピラリアレイ１７の下に整列した状態のサンプルトレイホルダ５１を示す。トレイホルダ５１上のアライメント穴５６は、トレイホルダ５１とキャピラリアレイアライメントピン７０とのアライメントを強制する。
【0030】
図７は、高電圧電源基板６５及び（キャピラリアレイ１７への）高電圧電源ケーブル７５も示す。
【0031】
図８は、キャピラリアレイカートリッジ１７を示し、アレイカートリッジ１７は、硬質プラスチック支持構造体７７、窓格納及び輸送ねじ８０、キャピラリ支持カード７６、高電圧電源ケーブル７５、及び、電気回路基板７４が上に設置される絶縁支持構造体７３を有する。電極７１は、電気回路基板７４を貫通し、絶縁支持構造体７３を貫通して突出し、キャピラリアレイ１７の底部を貫通して突出する。電極材料は、ステンレス鋼又はタングステンである。電極寸法（本発明の重要な態様でない）は、５０ｍｍ直径×２９ｍｍ長である。カートリッジベースの底部からの突出は２０．０ｍｍである。電極７１は回路基板７４にはんだ付けされる。高電圧電源ケーブル７５も、電気回路基板７４の同じ回路にはんだ付けされ、電極７１と高電圧電源（６５、図６）との接触を可能にする。キャピラリ先端（注入キャピラリ７２の先端）は、電気回路基板７４及び絶縁支持構造体７３を通してねじ込まれ、電極先端（注入電極７１の先端）のすぐ隣でかつそれに平行に整列する。キャピラリ先端と電極先端との間の距離は、０．１ｍｍ～４ｍｍである。キャピラリ先端の端及び電極先端の端は、単一平面内に存在し（すなわち、キャピラリ先端及び電極先端は、実質的に同じ長さであり、約＋/－１ｍｍ以下の長さ変動を有する）。好ましくは、キャピラリ先端及び電極先端の長さ変動は０．５ｍｍ未満である。キャピラリ７２は、キャピラリアレイ１７の底部を通り、絶縁支持構造体すなわちロードヘッダ７３を通り、電気回路基板７４を通り、キャピラリ支持カード７６（硬質プラスチック支持構造体７７によって支持される）を通り、窓ホルダ７８の開口に中心があるキャピラリ窓７９を有するキャピラリ窓ホルダ７８を通り、そして最終的に、キャピラリリザーバ９１を通ってねじ込まれ、（この場合、１２本の）全てのキャピラリ７２は、単一穴を通してねじ込まれる。９６キャピラリアレイ１７の場合、キャピラリ７２はキャピラリリザーバ先端９１内に１２本からなる群で、又は好ましくは、４本からなる群でねじ込まれる。キャピラリ７２は、リザーバ先端９１内の所定の場所で、熱硬化又はＵＶ硬化エポキシ等の接着剤によって保持される。
【0032】
図１２Ａは、キャピラリリザーバ２０を示し、リザーバは、リザーバ本体（矢印２０によって示される）、キャピラリリザーバ先端９１、（キャピラリリザーバ先端９１及びスライダバー１３０上のノッチのアライメントを通して、キャピラリリザーバ先端９１をキャピラリリザーバ２０内に係止する）スライダバー１３０、ベントブロック弁２１、廃棄物チューブ出力１３８、廃棄物ブロック弁１３２、及び圧力変換器キャビティ１３３を有する。
【0033】
図１２Ｂはキャピラリリザーバ２０の代替の切り欠き図であり、リザーバは、リザーバ本体、キャピラリリザーバ先端９１、スライダバー１３０、ベントブロック弁２１、廃棄物チューブ出力１３８、廃棄物ブロック弁１３２、グラウンドに取り付けるための電極１３５、圧力変換器キャビティ１３３、圧力変換器１３６、アナログ／デジタル基板に取り付けるための圧力変換器ケーブル１３７、及び流体チューブ入力１３４（図２のシリンジポンプ２３からの）を有する。
【0034】
キャピラリリザーバ２０のリザーバ本体は、アクリル、テフロン、ＰＥＴＥ、アルミニウム、ポリエチレン、ＡＢＳ、又は他の一般的な金属若しくはプラスチック等の任意の中実材料で作られ得る。重要な基準は、材料が、耐久性があり、使用される材料に対して化学的に耐性があることである。好ましい材料はアクリル又はテフロンである。
【0035】
図１３Ａは、引き出し１１及び１２に対するｘ－ｚステージユニット４８を示す。ｘ－ｚステージは、引き出し１１及び１２のすぐ後ろに位置し、ｘ位置用のステッパモータ（３５、図３）を使用してｘ方向に前後にステージキャリア（３９、図１３Ｂ）を移動させ得る。サンプルトレイ５０は、最初に、ステージを、ｘ方向に引き出しに向かって前進させることによって引き出し１２（又は１１）から取り外される。トレイキャリア（３１、図３）は、ｚ方向ステッパモータ４１（図３も参照）を使用して、トレイホルダ５１をｚ方向に上にかつ引き出し１２から離れるように持ち上げる。ステージキャリア３９は、その後、図１３Ｂに示すように、引き出し１１及び１２から外方にｘ方向に後ろに下がる。ステージキャリア３９は、その後、ｚ方向に上に移動して、トレイホルダ５１及びサンプルトレイ５０をキャピラリアレイ１７（図１１）の注入位置まで移動させる。
【0036】
キャピラリ電気泳動のために流体を圧送するための典型的な方策は、次の通りである。シリンジポンプ２３上の６方分配弁（２９、図２）の以下の６つの位置を考える。位置１は、キャピラリリザーバ２０（流体チューブ入力１３４、図１２Ｂ）の底部に接続され、位置２は、チューブを通して、調節流体（キャピラリ７２の壁を調節するための流体）のボトルに接続され、位置３は、ゲノムＤＮＡの分析のために使用される「ゲル１」に接続され、位置４は、断片化ＤＮＡの分析のために使用される「ゲル２」に接続され、位置５は、使用されないか、又は任意選択で、ベント弁を通した廃棄物ボトルへの空気の圧送によってベント弁を清浄化するのに使用され、位置６は、廃棄物ボトル２６に接続される。
【0037】
ステップＡ：キャピラリリザーバ２０は、位置１（リザーバ）を開放し、キャピラリリザーバ２０内にある流体でシリンジ２３を充填し、位置１を閉鎖し、位置６を開放し、流体を廃棄物ボトル（廃棄物コンテナ２６）に出すことによって、最初に空にされる。これは、キャピラリリザーバ２０が空になるまで繰り返される。ブロック弁２１及び１３２は、このプロセス中、開放したまま維持されて、キャピラリリザーバ２０の効率的な排出を可能にする。
【0038】
ステップＢ：キャピラリリザーバ２０は、その後、位置２を開放し、調節溶液でシリンジ２３を充填し、位置２を閉鎖し、位置１を開放し、キャピラリリザーバ２０を調節溶液で充填することによって、調節溶液で充填される。ブロック弁２１は閉鎖されるが、廃棄物ボトル（廃棄物コンテナ２６）へのブロック弁１３２は開放され、調節溶液によるキャピラリリザーバ２０の過剰充填を可能にする。
【0039】
ステップＣ：キャピラリ７２は、ベントブロック弁２１及び廃棄物ベント弁１３２をともに閉鎖することによって充填される。シリンジ２３は、キャピラリ調節溶液で充填される。位置１は、開放され、流体は、１分～２０分に及ぶ場合がある所定の時間の間、最小限１００ｐｓｉでキャピラリ７２を通して圧力充填される。
【0040】
ステップＤ：キャピラリリザーバ２０は、ステップＡによって空にされ、その後、ステップＢの場合と同じプロセスを使用して、ゲルで再充填される。ただし、ゲル用の位置３は６方分配弁２９上で使用される。
【0041】
ステップＥ：キャピラリ７２は、ステップＣに類似するプロセスを使用して、ゲルで充填される。
【0042】
ステップＡ～Ｅの後に、キャピラリ７２は、電気泳動の準備ができている。
【0043】
電気泳動を使用してサンプルを分析する一般的な方策及びプロセスは、次の通りである。
【0044】
サンプルは、分析のために９６ウェルプレート（サンプルトレイ又はプレート５０）内に設置される。ユーザは、サンプルプレート５０をサンプル引き出し（１２、図１）内に設置し、その後、引き出し１２内の特定の列又はサンプルプレート５０全体の分析に対応するジョブをコンピュータベースのキューに追加する。機器の制御システムであるコンピュータは、関心の行又はサンプルトレイ５０全体の分析を実行する。
【0045】
本発明の重要な実施形態は、キャピラリ電気泳動システムのワークフローである。引き出し（１１、図１）は、バッファ及び廃棄物トレイ２８のシステム１６内への容易な設置を可能にする。引き出し（１２、図１）は、サンプルトレイのシステム１６内への容易な設置を可能にする。システム１６がキャピラリ電気泳動を実施している間に、引き出し（１２、図１）からサンプルトレイ５０を設置する又は取り外す能力が特に重要である。インジケータ光（１２０、図１）は、トレイ２８、５０が引き出し１１、１２内に存在するか存在しないかを示し、引き出し１１、１２が所定の場所にあるか否かをユーザに知らせる。１２本のキャピラリ多重化システムについての典型的なワークフローは、次の通りである。ユーザＡは、サンプルトレイ１を持って機械まで歩み寄り、一番上から３番目の引き出し（引き出し１２のうちの１つ、図１）内にサンプルトレイ１を設置する。ユーザ「Ａ」は、その後、３つのジョブでキューを埋める。３つのジョブは、サンプルの３つの列、すなわち、サンプルトレイ１列Ａ、サンプルトレイ１列Ｂ、及びサンプルトレイ１列Ｃに対してキャピラリ電気泳動を実施することに対応する。ユーザ「Ａ」は、その後、キューを実施するようにコンピュータに指令し、結果として、システムは、サンプルトレイ１列Ａのキャピラリ電気泳動を始め、それ以上ジョブが存在しなくなるまで、キュー内のジョブを実行し続けることになる。ユーザ「Ｂ」は、その後、やって来て、サンプルトレイ２を一番上から４番目の引き出し（引き出し１２のうちの１つ、図１）内にサンプルトレイ２を設置する。ユーザ「Ｂ」は、その後、サンプルの８つの列、すなわち、サンプルトレイ２列Ａ～Ｈに対してキャピラリ電気泳動を実施することに対応する８つのジョブをキューに追加する。コンピュータは、ユーザ「Ａ」サンプルが終了するまで、ユーザ「Ａ」サンプルを分析し続け、その後、引き続きユーザ「Ｂ」サンプルの分析を行うことになる。その間、ユーザ「Ｃ」は、歩み寄り、サンプルトレイ３を一番上から５番目の引き出し（引き出し１２のうちの１つ、図１）内に装填する。ユーザ「Ｃ」は、その後、サンプルの１つの列、すなわち、サンプルトレイ３列Ａの分析に対応する１つのジョブをキューに追加する。このプロセスは、ゲルコンテナ（図２の２５）内の十分なゲルが存在する限り、又は、一番上の引き出し（１１、図１）内に位置するバッファトレイ（２８、図２）内に十分な処理バッファが存在する場合、無限に継続し得る。ＣＥワークフローについて本発明を従来技術のシステムと区別するのは、とりわけ、引き出し１１及び１２、サンプルステージ（ｘ－ｚステージ組み立て体４８）、及びジョブをロードするためのキューを有するコンピュータプログラムによってこのワークフローを使用可能にすることである。
【0046】
本発明の重要な実施形態は、ユーザが、サンプルプレート５０を所望の垂直引き出し（１２、図１）内に装填し、システム１６が他のサンプルを処理している間に、所望の列又はサンプルプレート５０全体をシステム１６が処理するようにシステムに指令することを可能にするコンピュータプログラムである。これは、他のサンプルの電気泳動が終了するのを最初に待つ必要なしで、複数人のユーザが複数のサンプル及び／又は複数のサンプルプレート５０を装填すること、又は、単一ユーザが複数のサンプル及び／又は複数のサンプルプレート５０を装填することを可能にする。
【0047】
図９は、作業プロセス及びコンピュータプログラムの全体的なフロー図を示す。ユーザは、サンプルトレイ５０をシステム１６の引き出し（１２、図１）内に装填する。コンピュータ上で、ユーザは、その後、サンプルトレイ５０を選択し、サンプル名及び／又はトレイ名を編集する。ユーザは、方法（分離の時間、分離のために使用される電界、ゲル選択等）を更に選択又は規定する。この選択されたサンプルトレイ５０は、関連する方法とともに、「ジョブ（job）」として規定され、そのジョブは、その後、キュー内に配置される。機器制御デバイスとしてのコンピュータは、キューからジョブをフェッチし、シリンジポンプ２３の動作、高電圧電源６５の動作、及び運動制御ステージ（４８、図３）を含む、全てのタスクについて機器（システム１６）を制御する。各処理（又はジョブ）について、種々のタスクが存在する場合があり、各タスクは、システム１６のサブユニットのダイレクトコマンド及び制御を必要とする。シリンジポンプ２３の制御に関連するタスクは、キャピラリリザーバ２０を空にすること／調節流体で充填すること、及び調節流体を、キャピラリ７２を通して強制的に流すこと、キャピラリリザーバ２０を空にすること／ゲルで充填すること、及びゲルを、キャピラリ７２を通して強制的に流すことを含む。ｘ－ｚステージ組み立て体４８の制御に関連するタスクは、廃棄物トレイを、キャピラリアレイ１７の入口キャピラリ７２及び電極７１まで移動させること若しくはキャピラリアレイ１７の入口キャピラリ７２及び電極７１から取り外すこと、バッファトレイ２８を、キャピラリアレイの入口キャピラリ及び電極まで移動させること若しくはキャピラリアレイの入口キャピラリ及び電極から取り外すこと、又は、サンプルトレイを、キャピラリアレイ１７の入口キャピラリ７２若しくは電極７１まで移動させること／キャピラリアレイ１７の入口キャピラリ７２及び電極７１から取り外すことを含むことができる。高電圧電源６５の制御に関連するタスクは、キャピラリ電気泳動分離のために高電圧をターンオフ／オンすることを含む。他のタスクは、カメラ６４（データの収集）及びブロック弁２１及び１３２に関連する。サンプルの各セットについて、プログラムは、エレクトロフェログラムのセットを取得するために必要とされる全てのタスクを終了することになる。これらのタスクが終了すると、プログラムは別のジョブをキューからフェッチする。キューが空である場合、全てのサンプル処理が（ユーザが別のキューを始動するまで）終了する。
【0048】
このコンピュータプログラムのグラフィカル結果は、図１０に示され、図１０は、キュー１０１内の分析されるサンプルのリスト、行又はサンプルトレイ５０をキューに追加するオプション１０２、及び分析のためにトレイ番号を選択するオプション１０３を示す。本発明のソフトウェア部分にとって重要であるのは、３つの態様、すなわち、ａ）（引き出し１１に対応する、図１）トレイの選択１０３、ｂ）キューにサンプルセットを追加すること（１０２、図１０）、及びｃ）全てのジョブが終了するまでシーケンスで実行される分析のためのアクティブなサンプルのキュー（１０１、図１０）である。別の重要な態様は、機器（システム１６）が他のサンプルを処理している間にサンプルを機器引き出し（１１、１２、図１）及びキュー（１０１、図１０）に追加する能力である。
【0049】
図１４は、機器の背面図を示し、機器は、パルスフィールド高電圧（ＨＶ：high voltage）電源１４１、制御電子部品１４３、及び、電源１４１が発生する熱を除去する冷却用ファン１４２を有する。冷却用ファン１４２を有するパルスフィールド電圧電源１４１は、図６に示す一定フィールド電源６５から置き換えられたものである。好ましいパルスフィールド電源は、Ｕｌｔｒａｖｏｌｔ（商標）２０ＨＶＡ２４－ＢＰ２、１５ＨＶＡ２４－ＢＰ２、又は１０ＨＶＡ２４－ＢＰ２である。電源１４１の出力は、可変制御電圧を有する制御基板１４３によって制御される。非制限的な例は、＋１０Ｖ～－１０Ｖの可変制御電圧範囲である。＋１０Ｖ及び－１０Ｖは、電源１４１の出力にスケーリングされる。１０ｋＶ電源１４１の場合、＋１０Ｖ制御電圧の印加は、電源１４１から＋１０ｋＶを送出し、一方、－１０Ｖ制御電圧の印加は、電源１４１から－１０ｋＶを送出する。この同じ１０ｋＶ電源１４１に対する＋５Ｖの印加は、＋５ｋＶの出力電圧をもたらす。２０ｋＶ電源１４１の場合、＋１０Ｖ制御電圧の印加は、電源１４１から＋２０ｋＶを送出し、一方、＋５Ｖの印加は、電源１４１から＋１０ｋＶをもたらす。パルスフィールド電源１４１の出力にリンクした制御電圧及び関連するスケーリングファクタは、上記で述べた例と異なる場合があり、本発明の重要なコンポーネントではない。同様に制御基板１４３の一部である波形発生器は、パルスフィールド電源１４１の可変電圧出力をもたらす複合波形を作成する。例えば、制御電圧に関する＋７Ｖ／－４Ｖ １０Ｈｚ矩形波は、ＨＶパルス電源１４１の＋７ｋＶ／－４ｋＶ １０Ｈｚ（パルス電力）出力をもたらす。パルスＨＶ電源１４１の１つの出力端は、図８に示すように、ＨＶ電源ケーブル７５を通して多重化キャピラリアレイ回路基板７４に取り付けられる。パルスＨＶ電源１４１のリターン経路の出力は、グラウンドにも接続される出口電極（１３５、図１２Ｂ）（キャピラリのリザーバ側の電極）に取り付けられる。
【0050】
本発明の一実施形態は、多重化キャピラリアレイ１７の全てのキャピラリ７２がほぼ同じパルス状電界を受信するような、少なくとも２本の、好ましくは、１２本のキャピラリ７２を含む多重化キャピラリ電気泳動システム１６に対するパルスフィールド電源１４１の適用である。別の実施形態は、少なくとも２４本のキャピラリ７２を含むキャピラリ電気泳動システム１６に対するパルスフィールド電源１４１の適用を含む。オンボードプロセッサは、任意の所望の形状（矩形、正弦、三角、鋸歯状等）の制御電圧のための波形を発生させるために使用される。波形の周波数は、１Ｈｚ未満～１００Ｈｚのどこにでも変動し得る。好ましい周波数範囲は１Ｈｚ～５０Ｈｚである。別の好ましい範囲は１Ｈｚ～２０Ｈｚである。特に好ましい範囲は２Ｈｚ～１０Ｈｚである。また、制御基板１４３は、電圧及び電流モニタリング回路要素を有するため、キャピラリ電位泳動システム１６に印加される電圧はアクティブにモニターされるようになっている。
【0051】
図１５Ａは、ペルチエクーラ１５１と、このペルチエクーラ１５１が発生した外部熱を除去するファン１５２とを有する温度制御チャンバ１５０を有する機器（システム１６）の上面図を示す。本発明の例のペルチエクーラ１５１は、Lair Technologies社によって作られたＣＰ１４、１２７－０４５（部品番号６６１０１－５００）である。
【0052】
図１５Ｂは、温度制御チャンバ１５０を有する機器（システム１６）の上面図を示し、切り欠き図は、キャピラリアレイ１５４、内部加熱要素、及び空気ファン１５３であって、ペルチエクーラ１５１と組み合わされると、１０℃～２５℃の温度の精密な制御を可能にする、空気ファン１５３を示す。
【0053】
反復（iterated）波形
本明細書において、用語「印加波形（applied waveforms）」は、「印加電界（applied electric fields）」と等価である。少なくとも２つのキャピラリにわたって変動するパルスフィールド波形を印加することは、少なくとも２つのキャピラリにわたってパルス電界を印加することと同一である。
本明細書において、用語「印加波形（applied waveforms）」は、「印加電界（applied electric fields）」と等価である。少なくとも２つのキャピラリにわたって変動するパルスフィールド波形を印加することは、少なくとも２つのキャピラリにわたってパルス電界を印加することと同一である。
【0054】
変動するフィールド波形をよりよく述べるために、以下の用語が本明細書で使用される。
【0055】
一般的な波形は、矩形、三角、正弦、及び鋸歯状、又は波形の任意の組み合わせ又はブレンドである。
【0056】
アノード：カソードに対して正に帯電した電極。アノードは、グラウンド電圧であるが、カソードに対して正とすることができる。
【0057】
カソード：アノードに対して負に帯電した電極。カソードは、任意選択で、グラウンド電圧であるが、アノードに対して負とすることができる。
【0058】
高側パルス電圧：印加電圧の単一サイクルにわたる交流又は変動電圧の最大印加電圧。
【0059】
低側パルス電圧：印加電圧の単一サイクルにわたる交流又は変動電圧の最小印加電圧。
【0060】
単純な単一波形は、固定周波数及び電圧、又は任意選択で変動周波数及び電圧で印加される単一波形形状である。例えば、単純波形は、６０分期間にわたって５０Ｈｚから１０Ｈｚまで変動する周波数を有する純粋な正弦波で構成することができる。また、単純波形は、非対称印加電圧を有することができる。一例は、＋３ｋＶ～－７ｋＶの印加電圧を有する矩形波である。また、単純波形は、所定の期間にわたる変動する電圧を有することができる。例えば、正弦波は、期間Ｔにわたって＋１０ｋＶから－３ｋＶまで線形的に変化（ramp）することができる高側パルス電圧を有することができ、一方、低側パルス電圧は、同じ期間にわたって－５ｋＶから－１ＫＶまで線形的に変化することができる。そのため、印加される正弦波の振幅は時間とともに変動する。また、単純波形は、逆方向パルスと時間的に同一である前方向パルスを有することができる。例えば、１秒の＋５ｋＶ前パルス及び１秒の－６ｋＶ逆パルスを有する矩形波である。また、単純波形は、逆方向パルスと時間的に異なる前方向パルスを有することができる。例えば、２秒の＋５ｋＶ前パルス及び１秒の－６ｋＶ逆パルスを有する矩形波である。
【0061】
単純な単一波形は、特有の形状の波形をもたらすために、互いの上に重ね合わされた２つの波形の組み合わせとすることもできる。
【0062】
単純波形は、低側パルス電圧の継続時間より長い又はより短い高側パルス電圧の継続時間を有することができる。パーセントで表される、パルスサイクルの総時間に対するパルスの一方の側の長さの比は、しばしば、パルスの「デューティサイクル（duty cycle）」と呼ばれるか、又は表現される。例えば、５０％デューティサイクルは、低側パルス電圧時間（Ｔ２）に等しい高側パルス電圧時間（Ｔ１）を規定することになる。正パルスの相対的デューティは、（Ｔ１＊１００／（Ｔ１＋Ｔ２））である。Ｔ１＝Ｔ２の場合、デューティサイクルは５０％である。Ｔ１がＴ２の１／３倍である場合、デューティサイクルは（１＊１００／（１＋３））＝２５％である。低側パルス電圧より長い高側パルス電圧（又はその逆）を印加することによって、電気泳動において指向性を有する流れ（directional flow）が達成される。例えば、電気泳動カラムに印加される＋／－５ｋＶ １Ｈｚ矩形波は、６６％デューティサイクルの場合、＋５ｋＶで０．６６秒及び－５ｋＶで０．３３秒を有することができる。
【0063】
本発明の１つの態様は、分析処理の継続時間の間、反復される複数の単純波形の複数のシーケンスの印加として規定される複合波形の印加である。
【0064】
多重化パルスフィールド並列キャピラリ電気泳動を使用して複雑なＤＮＡスメアの高品質分離を取得する好ましい方法は、異なる可変電圧波形パターン又は単純波形を、シーケンスで、所定の期間にわたって、反復して印加することである。例えば、好ましい分離方法は、或る期間の間に矩形波を、それに続いて、或る期間の間に三角波を、その後、数回の反復について矩形波及び三角波シーケンスを繰り返して印加することである。これは図１８Ａに示され、或る期間Ｔ１の間に印加される矩形波、それに続く、或る期間Ｔ２の間に印加される三角波を有する。図１８Ａに示す事例において、印加される矩形波の周波数は、低速から高速まで変動し、一方、三角波の周波数は一定である。図１８Ｂは、或る期間Ｔ１の間に印加される正弦波（固定周波数）、それに続く、或る期間Ｔ２の間の、変動する周波数の矩形波を示す。Ｔ１＋Ｔ２シーケンスは、「Ｉ」回、反復されて、Ｉ（Ｔ１＋Ｔ２）分の総処理時間が取得される。別の例は、或る期間の間に矩形波を、それに続いて、或る期間の間に一定電圧を、その後、数回の反復について矩形波及び一定電圧シーケンスを繰り返して印加することである。本発明の別の好ましい態様は、電気泳動分離期間にわたって少なくとも３つの異なる波形を印加することである。例えば、三角波、それに続く矩形波、それに続く正弦波の印加であって、３つの波形のシーケンスが複数回反復される、印加である。本発明の別の好ましい態様は、２つの異なる波形と、それに続く第３の波形とを反復することである。例えば、三角波、それに続く矩形波の印加であって、そのシーケンスが数回反復され、それに続いて、固定期間の間の矩形波が印加される、印加である。別の例は、順次セグメントで、第１の期間の間、矩形波を、第２の期間の間、一定電圧を、第３の期間の間、三角波を印加し、電気泳動処理が終了するまで、複数回、シーケンスを反復することである。
【0065】
高品質分離を取得する別の好ましい方法は、所定の期間にわたって異なる波形パターンを印加し、電気泳動分離に対して、変動する周波数又は変動する電圧ランプ又は両方の組み合わせを印加することである。
【0066】
別の好ましい方法は、周波数ランプについてより短い期間を使用する。例えば、３０秒の期間にわたって１５Ｈｚから０．５Ｈｚまで下がる周波数ランプを有する、＋２５０Ｖ／ｃｍから－１００Ｖ／ｃｍまで変動する矩形波、及びそれに続く、３０秒の期間にわたって１０Ｈｚから５Ｈｚへの周波数ランプを有する、＋２５０Ｖ／ｃｍから－１００Ｖ／ｃｍまで変動する三角波であり、この矩形波／三角波シーケンスは、９０分の総処理時間の間で９０回反復される。
【0067】
印加される各波形についての時間範囲は、０．５秒から２０分まで変動する。好ましい範囲は１５秒～１０分である。更に一層好ましい時間枠は、１０秒～１２０秒である。
【0068】
印加される各波形についての周波数範囲は、１００Ｈｚから０．５Ｈｚまで変動する。好ましい周波数範囲は３０Ｈｚ～０．５Ｈｚである。別の好ましい範囲は２０Ｈｚ～２Ｈｚである。印加される各波形の期間にわたって周波数を変化させることが好ましい。例えば、矩形波が１分の間印加される場合、周波数は、同じ１分時間枠にわたって２Ｈｚから１５Ｈｚまで又は１５Ｈｚから２Ｈｚまで変化する。パルスフィールドＨＶ電源の出力は、図８に示すように、回路基板７４を通して入口電極（キャピラリアレイのサンプル又はバッファトレイ側の電極のセット）に接続され、一方、出口電極（１３５、図１２Ｂ）（キャピラリのリザーバ側の電極）は、パルスフィールドＨＶ電源のリターン経路でもあるグラウンドに接続される。
【0069】
本発明の多重化キャピラリ電気泳動を実施する好ましいプロセスは、ふるい分けマトリクスを含む伝導性媒体で少なくとも２つのキャピラリ７２を充填し、動電学的注入又は流体力学的注入を通して（すなわち、サンプルをキャピラリ７２内に真空注入又は圧力注入することによって）キャピラリ７２にサンプルを導入し、パルスフィールド電源を介してキャピラリ７２にわたって本発明の変動する電圧を印加して、サンプルの分離を誘発し、その後、キャピラリ７２の窓７９を通過するサンプルを蛍光又は吸光検出によって検出することである。
【0070】
少なくとも２つのキャピラリにわたって変動する電界を印加する１つの好ましい方法は、第１の期間の間、上記キャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、第２の期間の間、上記キャピラリにわたって第２の周波数で少なくとも異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加し、その後、上記第１のパルスフィールド波及び少なくとも上記第２のパルスフィールド波を少なくとも２回繰り返すこととを含み、上記第１の周波数は上記第１の期間内で時間とともに変動し、上記第２の周波数は上記第２の期間内で時間とともに変動する。
【実施例】
【0071】
実施例１：
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「９３０ゲル」（Advanced Analytical Technology社から入手可能）を使用した。「９３０ゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、２２ｃｍの有効長及び４０ｃｍの全体長（５０μｍＩ．Ｄ．）を有する、複数の１２本のキャピラリ内に圧送した。１０．０６ｋＢ、１７．７ｋＢ、２１．２ｋＢ、２３．４５ｋＢ、４１．７７ｋＢ、５０．３１ｋＢ、及び１６５．６５ｋＢのサイズを有するＤＮＡフラグメントから構成される７ＧＴ ＤＮＡサイジングラダー（Wako Chemical Company社から入手可能）（図１６Ａ）を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。１Ｘ ＴＥバッファ内の７ＧＴラダーの１５０ｐｇ／μＬのサンプルを、分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、１秒間、２．０ｋＶを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。７ＧＴラダーサンプルを、５秒間の５ｋＶの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム（本発明）に注入した。この直後に、３６００秒間の７．２ｋＶの一定印加電圧を使用した電気泳動処理を行った。結果として得られるエレクトロフェログラムが図１６Ｂに示される。これは、従来技術の一定フィールドキャピラリ電気泳動システムについての最良事例の分離を示す。次に、本発明のキャピラリ電気泳動システムを使用するが、５Ｈｚ矩形波を有する＋１．８ｋＶ／－７．２ｋＶのパルスフィールド印加電圧によって、同じサンプル（同じ注入、同じ濃度）を再分析した。１２本のキャピラリシステムについての結果として得られるエレクトロフェログラムのセットは図１６Ｃに示される。全ての分析（一定フィールド及びパルスフィールドの両方）についての周囲温度は約２３℃であった。パルスフィールドによる分離（図１６Ｃ）は、遥かに良好なベースライン分解されたエレクトロフェログラムを示し、ラダー要素の７つ全てが、単一の融合したピークを示す、従来技術の一定フィールドを使用する分離（図１５）に比べて明瞭に見ることができる。
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「９３０ゲル」（Advanced Analytical Technology社から入手可能）を使用した。「９３０ゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、２２ｃｍの有効長及び４０ｃｍの全体長（５０μｍＩ．Ｄ．）を有する、複数の１２本のキャピラリ内に圧送した。１０．０６ｋＢ、１７．７ｋＢ、２１．２ｋＢ、２３．４５ｋＢ、４１．７７ｋＢ、５０．３１ｋＢ、及び１６５．６５ｋＢのサイズを有するＤＮＡフラグメントから構成される７ＧＴ ＤＮＡサイジングラダー（Wako Chemical Company社から入手可能）（図１６Ａ）を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。１Ｘ ＴＥバッファ内の７ＧＴラダーの１５０ｐｇ／μＬのサンプルを、分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、１秒間、２．０ｋＶを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。７ＧＴラダーサンプルを、５秒間の５ｋＶの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム（本発明）に注入した。この直後に、３６００秒間の７．２ｋＶの一定印加電圧を使用した電気泳動処理を行った。結果として得られるエレクトロフェログラムが図１６Ｂに示される。これは、従来技術の一定フィールドキャピラリ電気泳動システムについての最良事例の分離を示す。次に、本発明のキャピラリ電気泳動システムを使用するが、５Ｈｚ矩形波を有する＋１．８ｋＶ／－７．２ｋＶのパルスフィールド印加電圧によって、同じサンプル（同じ注入、同じ濃度）を再分析した。１２本のキャピラリシステムについての結果として得られるエレクトロフェログラムのセットは図１６Ｃに示される。全ての分析（一定フィールド及びパルスフィールドの両方）についての周囲温度は約２３℃であった。パルスフィールドによる分離（図１６Ｃ）は、遥かに良好なベースライン分解されたエレクトロフェログラムを示し、ラダー要素の７つ全てが、単一の融合したピークを示す、従来技術の一定フィールドを使用する分離（図１５）に比べて明瞭に見ることができる。
【0072】
この実施例の場合、１２本のキャピラリを、同じ印加される一定フィールド又はパルスフィールドによって同時に処理した。
【0073】
実施例２：
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「ＦＰ５００１ Ｌａｒｇｅ ＤＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎゲル」（Advanced Analytical Technology社から入手可能）を使用した。「ＦＰ５００１ Ｌａｒｇｅ ＤＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、２２ｃｍの有効長及び４０ｃｍの全体長（５０μｍＩ．Ｄ．）を有する、複数の１２のキャピラリ内に圧送した。１０．０６ｋＢ、１７．７ｋＢ、２１．２ｋＢ、２３．４５ｋＢ、４１．７７ｋＢ、５０．３１ｋＢ、及び１６５．６５ｋＢのサイズを有するＤＮＡフラグメントから構成される７ＧＴ ＤＮＡサイジングラダー（Wako Chemical Company社から入手可能）（図１６Ａ）を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。１Ｘ ＴＥバッファ内の７ＧＴラダーの１５０ｐｇ／μＬのサンプルを、０．２５Ｘ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファによる分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、１秒間、２．０ｋＶを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。７ＧＴラダーサンプルを、５秒間の－５ｋＶの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム（本発明）に注入した。この直後に、２つの異なる条件を使用した電気泳動処理を行った。図１７Ａ（上部トレース１７０４）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する三角波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）と、それに続く、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）とで構成される印加電圧を使用して取得された。三角波（３０秒）と、それに続く矩形波（３０秒）とを、１００分の総処理時間の間、１００回反復した。図１７Ａ（下部トレース１７０５）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）で構成される印加電圧を使用して取得された。矩形波（３０秒）を、１００分の総処理時間の間、２００回反復した。７ＧＴラダートレースの場合、フラグメント分離は、上部トレース及び下部トレースの両方について同様であった。これは、反復した三角／矩形波の印加（図１７Ａ上部トレース）が、反復なしの純粋な矩形波方法（図１７Ａ下部トレース）と比較して７ＧＴフラグメントの分離に実質的に影響を及ぼさなかったことを示している。
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「ＦＰ５００１ Ｌａｒｇｅ ＤＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎゲル」（Advanced Analytical Technology社から入手可能）を使用した。「ＦＰ５００１ Ｌａｒｇｅ ＤＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、２２ｃｍの有効長及び４０ｃｍの全体長（５０μｍＩ．Ｄ．）を有する、複数の１２のキャピラリ内に圧送した。１０．０６ｋＢ、１７．７ｋＢ、２１．２ｋＢ、２３．４５ｋＢ、４１．７７ｋＢ、５０．３１ｋＢ、及び１６５．６５ｋＢのサイズを有するＤＮＡフラグメントから構成される７ＧＴ ＤＮＡサイジングラダー（Wako Chemical Company社から入手可能）（図１６Ａ）を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。１Ｘ ＴＥバッファ内の７ＧＴラダーの１５０ｐｇ／μＬのサンプルを、０．２５Ｘ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファによる分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、１秒間、２．０ｋＶを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。７ＧＴラダーサンプルを、５秒間の－５ｋＶの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム（本発明）に注入した。この直後に、２つの異なる条件を使用した電気泳動処理を行った。図１７Ａ（上部トレース１７０４）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する三角波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）と、それに続く、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）とで構成される印加電圧を使用して取得された。三角波（３０秒）と、それに続く矩形波（３０秒）とを、１００分の総処理時間の間、１００回反復した。図１７Ａ（下部トレース１７０５）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）で構成される印加電圧を使用して取得された。矩形波（３０秒）を、１００分の総処理時間の間、２００回反復した。７ＧＴラダートレースの場合、フラグメント分離は、上部トレース及び下部トレースの両方について同様であった。これは、反復した三角／矩形波の印加（図１７Ａ上部トレース）が、反復なしの純粋な矩形波方法（図１７Ａ下部トレース）と比較して７ＧＴフラグメントの分離に実質的に影響を及ぼさなかったことを示している。
【0074】
これらの同じセットの波形を、ＤＮＡスメアの分離に適用した。ｇＤＮＡサンプル（サンプルＡ）を、０．２５Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファ内で１５０ｐｇ／μＬまで希釈した。サンプルの注入前に、１秒間、２．０ｋＶを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。サンプルＡを、５秒間の－５ｋＶの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム（本発明）に注入した。この直後に、２つの異なる条件を使用した電気泳動処理を行った。図１７Ｂ（トレース１７０１）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する三角波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）と、それに続く、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）とで構成される印加電圧を使用して取得された。三角波（３０秒）と、それに続く矩形波（３０秒）とを、１００分の総処理時間の間、１００回反復した。図１７Ｂ（トレース１７０２）は、３０秒の期間にわたって線形的に変動した、２Ｈｚ～７Ｈｚの周波数を有する矩形波（＋２．０ｋＶ～－７．２ｋＶ）で構成される印加電圧を使用して取得された。矩形波（３０秒）を、１００分の総処理時間の間、２００回反復した。トレース１７０１が、５３４７８ｂｐの平均スメアサイズを有するトレース１７０２に対して、７３６９２ｂｐの遥かに高い平均スメアサイズを有したことに留意されたい。また、三角／矩形反復式ブレンドによって取得されたトレース１７０１（図１７Ｂ）は、異常なシステムピーク１７０３（図１７Ｂ）を示さない。サンプルＡの実際のサイズは、通常のパルスフィールドスラブゲル電気泳動によって決定されるように約７０ｋｐｂであり、これは、本発明のパルスフィールドキャピラリシステムによって取得される結果に一致する。
【0075】
上記説明から見られるように、本発明のパルスフィールド多重化キャピラリ電気泳動システムは、従来技術の一定フィールド多重化キャピラリ電気泳動システムと比較して、最大で１５０ｋＢを超えるサイズを有するフラグメントの多重化された向上した分離を可能にする。
なお、出願当初の特許請求の範囲の記載は以下の通りである。
請求項１：
少なくとも２本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第１の期間の間、前記キャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、
第２の期間の間、前記キャピラリにわたって第２の周波数で少なくとも異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第１のパルスフィールド波及び少なくとも前記第２のパルスフィールド波を少なくとも２回繰り返すことと、
を含む、方法。
請求項２：
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動する、請求項１に記載の方法。
請求項３：
前記第１のパルスフィールド波及び前記第２のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項１に記載の方法。
請求項４：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１０分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項５：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々５分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項６：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項７：
蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
請求項８：
２本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第１の期間の間、前記キャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、
第２の期間の間、前記キャピラリにわたって第２の周波数で異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加することと、
第３の期間の間、第３の周波数で少なくとも異なる形状の第３のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第１のパルスフィールド波、前記第２のパルスフィールド波、及び少なくとも前記第３のパルスフィールド波の印加を繰り返すことと、
を含む、方法。
請求項９：
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動し、前記第３の周波数は前記第３の期間内で時間とともに変動する、請求項８に記載の方法。
請求項１０：
前記第１のパルスフィールド波及び前記第２のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項８に記載の方法。
請求項１１：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１０分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１２：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々５分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１３：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１４：
前記第１の周波数、前記第２の周波数、及び前記第３の周波数は、２Ｈｚ～１５Ｈｚの範囲内で変動する、請求項８に記載の方法。
請求項１５：
蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項８に記載の方法。
なお、出願当初の特許請求の範囲の記載は以下の通りである。
請求項１：
少なくとも２本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第１の期間の間、前記キャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、
第２の期間の間、前記キャピラリにわたって第２の周波数で少なくとも異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第１のパルスフィールド波及び少なくとも前記第２のパルスフィールド波を少なくとも２回繰り返すことと、
を含む、方法。
請求項２：
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動する、請求項１に記載の方法。
請求項３：
前記第１のパルスフィールド波及び前記第２のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項１に記載の方法。
請求項４：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１０分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項５：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々５分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項６：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１分未満である、請求項１に記載の方法。
請求項７：
蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
請求項８：
２本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第１の期間の間、前記キャピラリにわたって第１の周波数で第１のパルスフィールド波を印加することと、
第２の期間の間、前記キャピラリにわたって第２の周波数で異なる形状の第２のパルスフィールド波を印加することと、
第３の期間の間、第３の周波数で少なくとも異なる形状の第３のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第１のパルスフィールド波、前記第２のパルスフィールド波、及び少なくとも前記第３のパルスフィールド波の印加を繰り返すことと、
を含む、方法。
請求項９：
前記第１の周波数は前記第１の期間内で時間とともに変動し、前記第２の周波数は前記第２の期間内で時間とともに変動し、前記第３の周波数は前記第３の期間内で時間とともに変動する、請求項８に記載の方法。
請求項１０：
前記第１のパルスフィールド波及び前記第２のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項８に記載の方法。
請求項１１：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１０分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１２：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々５分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１３：
前記第１の期間及び前記第２の期間は各々１分未満である、請求項８に記載の方法。
請求項１４：
前記第１の周波数、前記第２の周波数、及び前記第３の周波数は、２Ｈｚ～１５Ｈｚの範囲内で変動する、請求項８に記載の方法。
請求項１５：
蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項８に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
