特許 7240679 多発性硬化症マーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-08

(45)【発行日】2023-03-16

(54)【発明の名称】多発性硬化症マーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20230309BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230309BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20230309BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20230309BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20230309BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/53 V

C12Q1/06

C12Q1/42

C12N9/16 B

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020501003

(86)(22)【出願日】2019-02-20

(86)【国際出願番号】 JP2019006365

(87)【国際公開番号】W WO2019163838

(87)【国際公開日】2019-08-29

【審査請求日】2021-12-02

(31)【優先権主張番号】P 2018028329

(32)【優先日】2018-02-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】509013703

【氏名又は名称】公立大学法人福島県立医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】北爪 しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】作田 香子

(72)【発明者】

【氏名】谷口 直之

(72)【発明者】

【氏名】橋本 康弘

(72)【発明者】

【氏名】本多 たかし

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 清

(72)【発明者】

【氏名】藤井 正純

【審査官】草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－１２２０７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１７８６９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】SAKUDA,K.,他１０名，Reactivity of anti-HNK-1 antibodies to branched O-mannose glycans associated with demyelination.，Biochem Biophys Res Commun.，2017年05月27日，Vol.487,No.2，Page.450-456，doi: 10.1016/j.bbrc.2017.04.085. Epub 2017 Apr 18.

【文献】作田香子、他９名，脱髄時に脳特異的な糖鎖を発現するアストロサイトの発現・性状解析，日本生化学会大会プログラム・講演要旨集，日本，2017年，90th巻号，ROMBUNNO.1AT26-02

【文献】藤川 顕寛、他２名，創薬標的としての受容体型プロテインチロシンホスファターゼ：その生理的役割とシグナリング機構，生化学，日本，2015年，Vol.87,No.5，Page.539-546

【文献】藤川 顕寛、他１名，受容体型チロシンホスファターゼζ(Ptprz)の関わる多様な生命現象，生化学，日本，2005年，Vol.77,No.10，Page.1255-1268

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０６

Ｃ１２Ｑ １／４２

Ｃ１２Ｎ ９／１６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脳の切片および／または脳脊髄液である被検体由来の試料中の分泌型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が多発性硬化症であることが示され、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、方法。

【請求項2】

前記分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２が、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺである、請求項１記載の方法。

【請求項3】

被検体由来の脊髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺの測定が、該タンパク質を特異的に認識する抗体または分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。

【請求項4】

分泌型ＰＴＰＲＺを特異的に認識する抗体を含む、多発性硬化症の診断用キットであって、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脱髄疾患（特に、多発性硬化症）の検査方法等に関し、詳細には、被検体由来の試料中の受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｔｙｐｅ Ｚ；ＰＴＰＲＺ）、より好ましくは分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺを測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＭＳ）は、中枢神経系の白質に多発性の脱髄病変が出現し、運動麻痺や知覚障害などの神経障害を引き起こす脱髄疾患の一つである。欧米の白人に多く、北ヨーロッパでは１０万人に５０人～１００人ほどの割合で発症する。また、日本では１０万人に１０人程度と少ない（非特許文献１）が、年々増加傾向にあり、患者数は世界では２５０万人以上にのぼる。

【0003】

多発性硬化症の臨床像は、大きく分けて、（１）再発寛解型（Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ＭＳ；ＲＲＭＳ）、（２）一次進行型（Ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ；ＰＰＭＳ）、（３）二次進行型（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ；ＳＰＭＳ）の３つに分類される。ＲＲＭＳは、症状の悪化（再発）と症状の安定（寛解）が交互に起こり、数カ月から数年間の寛解期間と再発が繰り返されることを特徴とする。ＰＰＭＳは、病状が進行しない一時的な停滞期間があるが、寛解せず徐々に病状が進行していくことを特徴とする。ＳＰＭＳは、発症初期は再発と寛解が繰り返されるが、緩やかに進行していくことを特徴とする。現時点において、多発性硬化症も根治療法は確立されておらず、患者の発病の時期や症状に応じた対症療法が行われている。

【0004】

多発性硬化症の治療を困難にする要因の一つとして、その診断の難しさが挙げられる。多発性硬化症は、症状が多様であり、該疾患に特異的なバイオマーカーも見いだされていないため、医師による診断が難しい。特に、病巣が単発性の場合、脳腫瘍や脳炎・脳症との鑑別が困難になる。現状、多発性硬化症の診断は、ＭＲＩ検査や髄液検査によって行われているが、ＭＲＩ検査が可能な施設は限られており、また髄液検査も多発性硬化症に特異的ではなく、場合によっては危険性の伴う患部の組織生検を試行することで（非特許文献７）他の疾患の可能性を排除してはじめて多発性硬化症との確定診断が可能となるものである。多発性硬化症に対しては免疫力を抑制するためにステロイド剤を投与するなどの治療を行うのに対し、脳腫瘍に対しては手術、放射線治療、薬物治療の３つを組み合わせた治療を行うなど、疾患ごとに治療アプローチが異なることからも的確な診断が重要である。それにもかかわらず、現状では多発性硬化症を早期に診断することは非常に難しく、実際に、多発性硬化症の最初の症状が現れてから多発性硬化症であると確定診断されるまでの期間は平均３年を超えるとの調査結果もある。

【0005】

かかる背景から、多発性硬化症をより簡便に診断できる検査方法の確立が強く求められている。

【0006】

受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、構造的な類似性から８つのサブファミリーに分類される（非特許文献２）。その細胞外領域は、免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン、フィブロネクチン様（ＦＮ）ドメイン、炭酸脱水酵素様（ＣＡＨ）ドメイン、Ｍｅｐｒｉｎ－Ａ５－ＰＴＰμ（ＭＡＭ）ドメインなどの、多彩なドメインで構成されており、細胞内には１つまたは２つのチロシンフォスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインが存在する。タンデム型の受容体型プロテインチロシンホスファターゼでは細胞膜近位側のＤ１のみがホスファターゼ活性を有しており、Ｄ２には酵素活性がない（例外的にＲ４ ＲＰＴＰサブファミリーのＤ２には若干の活性が認められる）。

【0007】

受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｔｙｐｅ Ｚ１；ＰＴＰＲＺ、ＰＴＰＲＺ１、或いはＰｔｐｒｚ、ＰＴＰζ又はＲＰＴＰβ等とも称される）は、Ｒ５サブファミリーに属する。哺乳類のＰＴＰＲＺにはスプライシングバリアントが存在し、例えばマウスにおいては、これにより３種のアイソフォーム（受容体型であるＰＴＰＲＺ－ＡおよびＰＴＰＲＺ－Ｂ、ならびに分泌型であるＰＴＰＲＺ－Ｓ）が存在する。ＰＴＰＲＺは、細胞外のＣＡＨドメイン、ＦＮタイプＩＩＩ様ドメイン、コンドロイチン硫酸鎖結合領域（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ／Ｇｌｙ－Ｓｅｒに富む）と、細胞内の２つのＰＴＰドメイン（Ｄ１およびＤ２）で構成されている。ＰＴＰＲＺは、他のＲＰＴＰと異なり、細胞外領域にコンドロイチン硫酸やケラタン硫酸などの硫酸化グリコサミノグリカンと呼ばれる硫酸化多糖修飾を有する。ＰＴＰＲＺの主要発現部位である脳組織では、すべてのアイソフォームがコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして発現している（非特許文献３～５）。ＰＴＰＲＺは、中枢神経系における神経細胞およびグリア細胞（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）の両方に発現している。ＰＴＰＲＺは、脱髄刺激に応答して、Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素ＧｎＴ－ＩＸ（ＭＧＡＴ５Ｂ、Ｍａｎｎｏｓｙｌ（Ａｌｐｈａ－１，６－）－Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｅｔａ－１，６－Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ－Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， Ｉｓｏｚｙｍｅ Ｂとも称される）を介しての分岐型Ｏ－マンノース修飾を受けることが報告されている（非特許文献６）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Kinoshita M. et al., Neurol Sci. 2015;36(7):1147-51.

【文献】Tonks NK, Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Nov;7(11):833-46.

【文献】Nishiwaki T. et al., J Biochem. 1998 Mar;123(3):458-67.

【文献】Chow JP. et al., J Biol Chem. 2008 Nov 7;283(45):30879-89.

【文献】Chow JP. et al., Neurosci Lett. 2008 Sep 19;442(3):208-12.

【文献】Kanekiyo K. et al., J Neurosci. 2013 Jun 12;33(24):10037-47.

【文献】Nakazawa Y. et al., Jpn. J. Cli. Immunol.2013;36(3):175-9

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、脱髄疾患（特には多発性硬化症）の新規検査方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、脱髄疾患の患者の脳脊髄液中の、ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の細胞外領域に相当する分泌型（遊離型）のＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の含有量が、対照群のそれと比較して減少していることを見出した。特に、多発性硬化症患者の脳脊髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の含有量が顕著に減少していることを見出した。さらに驚くべきことに糖転移酵素ＧｎＴ－ＩＸによってＰＴＰＲＺが糖鎖修飾されることによって生じる、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量も脳脊髄液中において対象群より減少していることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。

【0011】

［１］被検体由来の試料中の分泌型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が多発性硬化症であることが示され、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、方法。
［２］前記分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２が、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺである、［１］記載の方法。
［３］被検体由来の試料が、脳脊髄液または血液である、［１］または［２］記載の方法。
［４］被検体由来の脊髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺの測定が、該タンパク質を特異的に認識する抗体または分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体を用いて行われることを特徴とする、［１］～［３］のいずれか記載の方法。
［５］分泌型ＰＴＰＲＺを特異的に認識する抗体および分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体のいずれかまたは両方を含む、多発性硬化症の診断用キットであって、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、キット。
［６］被検体由来の試料中の分泌型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、脱髄状態の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が脱髄を起こしていることが示され、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、方法。
［７］被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、脱髄状態の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が脱髄を起こしていることが示され、該分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺが、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、方法。

【0012】

また、別の一態様において、本発明は以下の通りである。
［１Ａ］被検体由来の試料中の受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中のＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が多発性硬化症であることが示される、方法。
［２Ａ］ＰＴＰＲＺが、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺである、［１Ａ］記載の方法。
［３Ａ］被検体由来の試料が、脳脊髄液または血液である、［１Ａ］または［２Ａ］記載の方法。
［４Ａ］被検体由来の脊髄液中のＰＴＰＲＺの測定が、該タンパク質を特異的に認識する抗体または分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体を用いて行われることを特徴とする、［１Ａ］～［３Ａ］のいずれか記載の方法。
［５Ａ］ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２、および分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム３からなる群から選択されるいずれか１つまたは２種以上である、［１Ａ］～［４Ａ］のいずれか記載の方法。
［６Ａ］ＰＴＰＲＺを特異的に認識する抗体および分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体のいずれかまたは両方を含む、多発性硬化症の診断用キット。
［７Ａ］被検体由来の試料中の受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、脱髄状態の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中のＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が脱髄を起こしていることが示される、方法。
［８Ａ］被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、脱髄状態の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が脱髄を起こしていることが示される、方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明により、多発性硬化症の確定診断に有用な新たな客観的指標が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ヒトＰＴＰＲＺの３種類のアイソフォームの構造を示す概念図である。Ａはアイソフォーム１を、Ｂはアイソフォーム２を、Ｃはアイソフォーム３を示す。図中、ＣＡはカルボニックアンヒドラーゼ様ドメインを、ＦＮはタイプＩＩＩフィブロネクチン様ドメインを、ＣＳはコンドロイチン硫酸鎖結合領域を、ＴＭは膜貫通ドメインを、Ｄ１とＤ２はいずれもＰＴＰドメインを表す。

【図2】図２は、多発性硬化症患者脳切片におけるＣａｔ－３１５抗体、または抗ＰＴＰＲＺ抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す。

【図3】図３は、多発性硬化症罹患患者では髄液中の分泌型（遊離型）ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および分泌型（遊離型）ＰＴＰＲＺアイソフォーム２の量が突発性正常圧水頭症罹患患者（対照群）のそれと比較して顕著に減少していることを示すグラフである。なお、データは平均値＋標準誤差（ＳＥ）で示した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0016】

１．多発性硬化症の検査方法
本発明は、被検体由来の試料中の分泌型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）アイソフォーム１および２のいずれかまたは両方を測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法（以下、「本発明の検査方法」と称することがある。）を提供する。

【0017】

本発明の検査方法により罹患の有無を検査し得る多発性硬化症は、上述した通り３つの型に分類され得る。本発明によれば、再発寛解型（ＲＲＭＳ）、一次進行型（ＰＰＭＳ）、（３）二次進行型（ＳＰＭＳ）のいずれの型も検査可能である。

【0018】

本発明の検査方法の一態様において、被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２のいずれかまたは両方の含有量を指標として測定し、対照群の対応する値と比較することにより、被検体における多発性硬化症の罹患の有無を検査することができる。ＰＴＰＲＺは、ヒトにおいては、細胞外領域の長さが異なる３種類のスプライシングバリアントが存在し、長いものからアイソフォーム１（配列番号１）、アイソフォーム２（配列番号２）、アイソフォーム３(配列番号３)となっている。さらにそれぞれの各アイソフォームの細胞外領域がプロテアーゼによって切断されて生じる分泌型（或いは「遊離型」ともいう）ＰＴＰＲＺが知られている。齧歯類では膜貫通領域以降のＣ末領域を欠失しているスプライシングバリアントも報告されているが、ヒトでは相当するバリアントは未同定である。従って、本発明の検査方法においては、被検体由来の試料中の分泌型（遊離型）ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の含有量を測定し、対照群（健常者または多発性硬化症を罹患していない対象者）の対応する値と比較することにより、被検体における多発性硬化症の罹患の有無を検査することができる。以下、ヒトのＰＴＰＲＺの各アイソフォームおよびそれらの分泌型について詳述する。尚、本明細書において「分泌型（遊離型）ＰＴＰＲＺ」とは、ヒトＰＴＰＲＺにおける各アイソフォームの細胞外領域に由来するポリペプチド断片をいう。ＰＴＰＲＺには、細胞外領域のＣ末端側にプロテアーゼに対し感受性の高い部位が存在する。この部位がメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼの分解により切断され、分泌型（遊離型）ＰＴＰＲＺとなる。本明細書において、「分泌型」ＰＴＰＲアイソフォームは、「遊離型」ＰＴＰＲＺアイソフォームと言い換えることができる。

【0019】

ＰＴＰＲＺアイソフォーム１は、配列番号１で示す２３１５アミノ酸からなる。ＰＴＰＲＺアイソフォーム１は、１～２４位にシグナルペプチドを、４５～２９８位にＣＡドメインを、３１３～４０１位にＦＮドメインを、１６３７～１６６２位に膜貫通ドメインを、１７１７～１９９２位にＤ１ドメインを、そして２０２３～２２８２位にＤ２ドメインを有する。また、ＣＳ結合領域は、前記ＦＮドメインと膜貫通ドメイン間でＣＳ鎖結合している領域が該当する。ＰＴＰＲＺアイソフォーム１の細胞外領域は、配列番号１で示すアミノ酸配列において２５～１６３６位に相当する配列番号４で示すアミノ酸配列からなる。配列番号４の全長または部分断片のポリペプチドが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１に相当する。

【0020】

ＰＴＰＲＺアイソフォーム２は、配列番号２で示す２３０８アミノ酸残基からなる。ＰＴＰＲＺアイソフォーム２は、ＰＴＰＲＺアイソフォーム１におけるＤ１ドメインの１７２３～１７２９位に相当する７アミノ酸残基が欠失したアイソフォームである。したがって、アイソフォーム２の細胞外領域は、アイソフォーム１のそれと一致し、配列番号４で示すアミノ酸配列からなる。従って、配列番号４の全長または部分断片のポリペプチドが分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２に相当する。

【0021】

ＰＴＰＲＺアイソフォーム３は、配列番号３で示す１４４８アミノ酸残基からなる。ＰＴＰＲＺアイソフォーム３は、ＰＴＰＲＺアイソフォーム１におけるＣＳ結合領域の大部分に相当し得る７５５～１６１４位の８６０アミノ酸残基と、１７２３～１７２９位に相当する７アミノ酸残基が欠失したアイソフォームである。したがって、アイソフォーム３の細胞外領域は、アイソフォーム１及び２のそれよりも短く、配列番号１で示すアミノ酸配列において２５～７５４位及び１６１５～１６３６位に相当するアミノ酸配列からなる。

【0022】

分泌型ＰＴＰＲＺには、ＰＴＰＲＺアイソフォーム１およびＰＴＰＲＺアイソフォーム２の細胞外ドメインに由来する約３５０ｋＤａのｌｏｎｇ－ｆｏｒｍと、ＰＴＰＲＺアイソフォーム３の細胞外ドメインに由来する約１８０ｋＤａのｓｈｏｒｔ－ｆｏｒｍの２種類が存在するが、このうち、ｌｏｎｇ－ｆｏｒｍ（及びこの断片ポリペプチド）が多発性硬化症の検出用マーカーとなり得る。尚、本発明において実際に検出対象となるアミノ酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列（１６１２アミノ酸）の全長ポリペプチドおよび／またはその一部分からなる部分ペプチドである。かかる部分ペプチドとしては、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸の、連続する１１２９アミノ酸以上のアミノ酸を含むペプチド、連続する１２０９アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、連続する１２９０アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、連続する１３７１アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、連続する１４５１アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、連続する１５３２アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、連続する１５８０アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド、および、連続する１５９６アミノ酸以上のアミノ酸配列を含むペプチド等が例示されるが、これらに限定されない。

【0023】

また、本発明の方法の別の一態様としては、被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノースの含有量を測定し、対照群の対応する値と比較することにより、被検体における多発性硬化症の罹患の有無を検査することができる。ＰＴＰＲＺは、脱髄刺激に応答して、Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素ＧｎＴ－ＩＸを介しての分岐型Ｏ－マンノース修飾を受ける。従って、被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノースの含有量は、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の存在量を反映していると考えられる。従って、被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノースの含有量を測定し、対照群の対応する値と比較することによっても、多発性硬化症の罹患の有無を検出することができる。

【0024】

被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の測定方法は、当該タンパク質量が定量できる方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、質量分析、クロマトグラフィー法（液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー等）、電気泳動法、抗体を用いた免疫測定法などが挙げられるが、これらに限定されない。特に免疫測定法が簡便で好ましい。免疫測定法の場合、反応形式に基づいて分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウエスタンブロット法等があり、また、標識に基づいて分類すると、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ビオチンイムノアッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

免疫測定に用いる抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、再現性の観点からはモノクローナル抗体が好ましい。本発明の検査方法を実施するに際して、市販の抗体を用いてもよく、また、自体公知の方法により分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２、または分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２を特異的に認識する抗体を作製して用いてもよい。

【0026】

なお、本明細書における用語「抗体」は、「抗原結合断片」をも含む概念である。「抗原結合断片」とは、もとの抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。かかる抗原結合断片の一例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ等が挙げられるがこれらに限定されない。かかる抗原結合断片は、自体公知の方法により調製することができる。本発明の検査方法に用いられる市販抗体としては、例えば、マウスモノクローナルＣａｔ－３１５ ＩｇＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）やマウス抗ＰＴＰＲＺ ＩｇＭκ（１２２．２）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0027】

本明細書において、抗体が抗原を「特異的に認識する」とは、抗原抗体反応における抗体の抗原に対する結合親和性についてのＫ_Ｄ値が、１×１０^－５Ｍ以下（好ましくは、１×１０^－６Ｍ以下、１×１０^－７Ｍ以下、１×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０^－９Ｍ以下、最も好ましくは１×１０^－１０Ｍ以下）であることを意味する。

【0028】

分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の測定に用いられる抗体は、例えば、以下の抗体が例示される：
（１）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１を特異的に認識する抗体
（２）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２を特異的に認識する抗体
（３）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２を特異的に認識する抗体。
また、ＰＴＰＲＺは、生体内において糖転移酵素であるＧｎＴ－ＩＸにより、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖により修飾される。以下の実施例で詳述するように、本発明者らは、脳脊髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２もまた、分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾されていることを明らかにしている。従って、抗ＰＴＰＲＺ抗体の代わりに、ＰＴＰＲＺ上の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識するＣａｔ－３１５抗体等の抗体も本発明の検査方法に用いることができる。これらの抗体は、自体公知の方法により調製できるほか、市販されているものを用いてもよい。このような観点によれば、本発明の検査方法を次のように定義することもできる：被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程を含む、多発性硬化症の検査方法であって、該被検体由来の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が多発性硬化症であることが示される、方法。

【0029】

本発明の検査方法においては、被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の量を測定する。以下の実施例においては脳脊髄液を試料として用いているが、脳脊髄液は静脈に流入することが知られているため、血液も用い得る。好ましい態様において、被検体由来の試料は脳脊髄液である。

【0030】

本発明の検査方法において、被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の測定値が、対照群の試料中の該タンパク質量と比較して、有意に低い場合に多発性硬化症であることが示される。なお、測定値の比較においては、予めカットオフ値を設定しておき、当該カットオフ値と被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の量の測定値を対比してもよい。測定値がカットオフ値より低い場合に、被検体が多発性硬化症を罹患していることが示される。

【0031】

カットオフ値の設定は、当業者であれば自体公知の方法を用いて設定することができる。例えば、既知の患者群および対照群（健常者または多発性硬化症を罹患していない対象者）から複数の試料を得て、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の量を測定し、望ましい感度および／または特異度で両群を判別できる値をカットオフ値として設定すればよい。

【0032】

本発明の検査方法が適用される被検体としては、ヒト、サル、ラット、イヌ、ネコ等の哺乳動物が例示され、特にヒトが好ましい。

【0033】

２．多発性硬化症の検査用キット
本発明はまた、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２のいずれかまたは両方を特異的に認識する抗体および分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体のいずれかまたは両方を含む、多発性硬化症の診断用キット（以下、「本発明のキット」と称することがある）を提供する。本発明のキットを用いて、被検体由来の試料中における分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２の量を測定し、対照群の試料中の対応する量と比較することで、被検体が多発性硬化症に罹患しているか否かを簡便に検査することができる。

【0034】

本発明のキットに含まれる分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および／または２を特異的に認識する抗体は、以下の抗体が例示される：
（１）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１を特異的に認識する抗体
（２）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２を特異的に認識する抗体
（３）分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２を特異的に認識する抗体
（４）分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体。
尚、（４）分岐型Ｏ－マンノース糖鎖を特異的に認識する抗体は、自体公知の方法を用いて調製することができるほか、上述した通り、Ｃａｔ－３１５抗体などの市販抗体を用いてもよい。一態様において、本発明のキットは、上記（１）～（４）の抗体の１つ以上を構成成分として含む。また、本発明のキットは、取扱説明書や判定基準等をはじめとする、抗体以外の他の構成成分を含んでいてよい。

【0035】

本発明の一態様において、本発明の多発性硬化症の検査方法は、多発性硬化症の治療方法と組み合わせてもよい。従って、本発明は、以下の工程を含む、多発性硬化症の検査及び治療方法を提供する：
（１）被検体由来の試料中の分泌型受容体型タンパク質チロシンフォスファターゼＺ（ＰＴＰＲＺ）を測定する工程であって、ここで、該被検体由来の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量の測定値が、対照群の試料中の分泌型ＰＴＰＲＺ量と比較して低い場合に、該被検体が多発性硬化症であることが示され、該分泌型ＰＴＰＲＺが、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１及び分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム２のいずれかまたは両方である、工程；および
（２）工程（１）で多発性硬化症に罹患すると判定された被検体に対し、治療有効量の多発性硬化症の治療剤を投与する工程。

【0036】

本発明に用いられる多発性硬化症の治療剤としては、例えば、ステロイド、インターフェロンβ、Ｓ１Ｐ受容体調節薬、免疫抑制薬、アルキル化薬、抗癌性抗生物質、抗ＣＤ５２抗体、および抗α４インテグリン抗体等の多発性硬化症の治療剤の投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

ステロイドとしては、例えば、アムシノニド、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、メチルコハク酸プレドニゾロンナトリウム、シクレソニド、ジフルプレドナート、プロピオン酸ベタメタゾン、デキサメタゾン、デフラザコート、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ハルシノニド、パルミチン酸デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、ブチル酢酸プレドニゾロン、ブデソニド、硫酸プラステロン、フロ酸モメタゾン、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルドロキシコルチド、フルニソリド、プレドニゾロン、プロピロン酸アルクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸デキサメタゾン、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンスレプタネート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネート、リン酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、吉草酸ジフルコルトロン、吉草酸デキサメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、酢酸コルチゾン、酢酸ジフロラゾン、酢酸デキサメタゾン、酢酸トリアムシノロン、酢酸パラメサゾン、酢酸ハロプレドン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸プレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、酪酸クロベタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾンが挙げられる。

【0038】

Ｓ１Ｐ受容体調節薬としては、例えば、フィンゴリモド（fingolimod）、シポニモド（siponimod）、ポネシモド（ponesimod）、セラリフィモド（ceralifimod）、オザニモド（ozanimod）が挙げられる。

【0039】

免疫抑制薬としては、例えば、アザチオプリン、アスコマイシン、エベロリムス、サラゾスルファピリジン、シクロスポリン、シクロホスファミド、シロリムス、タクロリムス、ブシラミン、メトトレキサート、レフルノミド、テリフルノミドが挙げられる。

【0040】

アルキル化薬としては、例えば、塩酸ナイトロジェンマスタード－Ｎ－オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、チオテパ、カルボコン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ダカルバジン、ラニムスチン、カルムスチン、クロラムブシル、ベンダムスチン、メクロエタナミンが挙げられる。

【0041】

抗癌性抗生物質としては、例えば、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、ネオカルチノスタチン、塩酸ピラルビシン、（塩酸）エピルビシン、塩酸イダルビシン、クロモマイシンＡ３、（塩酸）ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、テラルビシン、ジノスタチン・スチマラマー、ゲムツズマブオゾガマイシン、塩酸ミトキサントロンが挙げられる。

【0042】

抗ＣＤ５２抗体としては、例えば、アレムツズマブ（alemtuzumab）が挙げられる。また、抗α４インテグリン抗体としては、例えば、ナタリズマブ（natalizumab）が挙げられる。

【0043】

多発性硬化症の治療剤の治療有効量は、有効成分の種類、治療対象の体重および性別、または投与経路等によって異なり得るが、適切な投与量や投与方法は、当業者であれば適宜選択することができる。尚、治療剤の投与経路は、有効成分の種類によって経口または非経口的のいずれかを選択することができる。非経口投与には、例えば、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等が含まれるがこれらに限定されない。

【0044】

なお、本明細書における疾患の「治療」には、疾患の治癒のみならず、疾患の寛解および疾患の程度の改善も含まれ得る。

【0045】

以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

【実施例】

【0046】

全ての動物実験は、理化学研究所の動物実験実施規定に従って行った。ヒトの脳脊髄液および脳の免疫組織学的解析は福島県立医科大学で同大学の計画書に沿って行った。通常、脳脊髄液の採取するために腰椎穿刺を施行する場合、穿刺後に頭痛が起きることがあり、症状が強い場合は微熱、頭痛、嘔吐を伴うこともあるため、神経疾患が疑われる患者に対してのみ脳脊髄液を採取する。

【0047】

［実施例１］免疫組織化学染色
多発性硬化症患者脳のパラフィン包埋切片の脱パラフィン処理を次の通り行った。キシレンに３回、９９.５％エタノールに３回、９０％エタノールに１回、８０％エタノールに１回、７０％エタノールに１回、５分間ずつ浸し、流水中に５分間浸した。０.０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、１２１℃で５分間オートクレーブを行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．８）に浸した。

【0048】

多発性硬化症患者脳の切片をＰＢＳで洗浄した後、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００－ＰＢＳに１５分間浸漬し、透過処理を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０－ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）中で５分間ずつ３回振とうして洗浄した後、５％正常ヤギ血清PBS中で３０分間振とうした。ＰＢＳ－Ｔ中で５分間ずつ２回洗浄後、Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）で希釈した一次抗体（マウスモノクローナルＣａｔ－３１５ ＩｇＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＰＴＰＲＺ ＩｇＭκ（１２２．２）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に室温で２時間または４℃で一晩浸漬した。希釈倍率ＰＢＳ－Ｔ中で５分間ずつ３回洗浄した後、ＤＡＫＯ ＲＥＡＬ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｅｎｔで希釈したＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５４６－または４８８－標識二次抗体およびＤＡＰＩに室温で４５分間浸漬した。ＰＢＳ－Ｔ中で５分間ずつ３回洗浄後、ＣＣ/Ｍｏｕｎｔ中で封入し、ＦＶ１０００－Ｄ共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。得られた染色図のシグナル強度の解析を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）により行った（図１）。その結果、Ｃａｔ－３１５陽性細胞とＰＴＰＲＺ陽性細胞が一致しており、Ｃａｔ－３１５陽性細胞はＰＴＰＲＺ陽性であることが明らかとなった。

【0049】

［実施例２］
多発性硬化症患者由来の脳脊髄液に対し、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｔｉｃａ、ＮＭＯ）患者由来の脳脊髄液、および特発性正常圧水頭症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｎｏｒｍａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ、ｉＮＰＨ）の疑いがあったが診断の結果ｉＮＰＨではないと判断された被検体（ｎｏｎ－ｉＮＰＨ、対照群として使用）を、多発性硬化症の疾患コントロールとして用いた。これらの脳脊髄液は、福島県立医科大学附属病院を中心とした医療機関で得られた患者試料であり、全患者からインフォームドコンセントを取得した。使用した抗体は、マウスモノクローナルＣａｔ－３１５ ＩｇＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＰＴＰＲＺ ＩｇＭκ（１２２．２）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギポリクローナル抗Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ（ＴＴＲ）抗体（Ａｂｃａｍ）を用いた。その他の試薬は主にＷａｋｏより購入した。

【0050】

ＭＳ患者（ｎ＝３）、ＮＭＯ患者（ｎ＝３）、ｎｏｎ－ｉＮＰＨ患者（ｎ＝３、コントロール）由来の脳脊髄液１０μＬにコンドロイチナーゼ消化を行い、ウェスタンブロッティングを行った。なお、コンドロイチナーゼ消化の詳細は次の通りである。試料溶液に、終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００Ｕ／Ｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎａｓｅ ＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）を加え、３７℃で１時間攪拌した。

【0051】

ウェスタンブロッティングは以下の手順にて行った。試料溶液にＬａｅｍｍｌｉのＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（終濃度２０．８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、８．３％グリセロール、１％ＳＤＳ、１％βメルカプトエタノール）を加え、９９℃で５分加熱した。３－１０％グラジエントポリアクリルアミドゲル（Ａｔｔｏ）を用いてゲル１枚あたり２０－２５ｍＡの定電流で６０－７０分間泳動した。セミドライ式の転写装置を用いて、ニトロセルロース膜に１５０ｍＡの定電流で９０分間転写を行った。５％スキムミルク－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＴＢＳ（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ－Ｔ）に３０分間浸漬してブロッキングを行った後、ＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体中で室温で２時間または４℃で一晩振とうした。ＴＢＳ－Ｔ中に５分間ずつ３回浸漬して洗浄したのち、ＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ標識二次抗体と室温で４０分間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発光させ、シグナルをＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。なお、バンドのシグナル強度の定量は、ＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ付属の定量ソフトを用いて行った。結果を表１に示す。表１は、ＭＳ患者由来、ＭＮＯ患者由来、ｎｏｎ－ｉＮＰＨ由来の試料において、脳脊髄液の内部標準として検出したＴＴＲのシグナル強度に対する分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の上段のバンドのシグナル強度あるいはＣａｔ－３１５抗体で検出される上部のバンドのシグナル強度の相対値として示したものである。

【0052】

表１に示される通り、多発性硬化症患者由来の脳脊髄液においては、ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の細胞外領域に由来すると考えられる上段バンド（ＰＴＰＲＺアイソフォーム２全長はＰＴＰＲＺアイソフォーム１全長と７アミノ酸の違いしかなく、また、両者の細胞外領域のアミノ酸配列は同一であるため、同じバンドとして検出される。約３５０ｋＤａ）および分泌型ＰＴＰＺアイソフォーム３の細胞外領域に由来すると考えられる下段バンド（約１８０ｋＤａ）のシグナルが検出された。このうち、多発性硬化症患者由来の脳脊髄液では、対照と比較して、上段のバンドのシグナル量が著しく減少していることが分かった。また、対応する分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺのシグナル量も同様に減少していた。興味深いことに、ＮＭＯ患者の検体でもＭＳ患者の検体と同レベルまで低下している検体があった。ＮＭＯはアストロサイトのアクアポリン４が自己抗体によって攻撃されることで炎症が起こる疾患だが、炎症が進むことで脱髄を起こすと考えられている。従って、一部のＮＭＯ患者の検体において分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺの減少がみられたことは、当該患者においてＭＳと同様に脱髄が起こっていることを示している可能性が考えられる。以上より、脳脊髄液中の分岐型Ｏ－マンノース糖鎖修飾型ＰＴＰＲＺの量は脱髄の程度を反映するバイオマーカーとして利用し得ることが示された。

【0053】

【表1】

【0054】

［実施例３］髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２のＭＳ検出用マーカーとしての検証
以下の実験を通じて、分泌型ＰＴＰＲＺ（分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２（即ち、分泌型ＰＴＰＲＺ ｌｏｎｇ－ｆｏｒｍ））がＭＳ検出用マーカーとして機能し得ることを検証した。

【0055】

多発性硬化症（ＭＳ）患者群（２４名）、および特発性正常圧水頭症（ｉＮＰＨ）患者（疑い例含む）群（２５名）のそれぞれに由来する髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２の量をウェスタンブロッティングで測定した。

【0056】

抗体は、抗ＰＴＰＲＺ抗体であるマウス抗ＰＴＰζ ＩｇＭκ (ｓｃ―３３６６４、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ)、及びヤギ抗マウスＩｇＭ抗体-ＨＲＰ(ＳＡＢ－１１０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ)を使用した。マウス抗ＰＴＰＺ ＩｇＭκはラット胎児脳からプロテオグリカン画分を調製して作製されたＰＴＰＲＺ特異的モノクローナル抗体である。その他の試薬は、主にＷａｋｏ社より購入した。

【0057】

上記各患者から採取した１０μＬの髄液を、まずコンドロイチナーゼ消化に供した。具体的には、試料溶液に、終濃度１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、６０ｍＭ 酢酸ナトリウム、４ｍＵコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ、２９０５）を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。

【0058】

その後、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングは以下の手順で行った。コンドロイチナーゼ処理した試料溶液にＬａｅｍｍｌｉのＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（終濃度２０．８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、８．３％グリセロール、１％ＳＤＳ、１％βメルカプトエタノール）を加え、９９℃で５分間加熱した。３～１０％グラジエントポリアクリルアミドゲル（Ａｔｔｏ社、ＮＰＧ－３１０Ｌ）を用いてゲル１枚あたり２０ｍＡ～２５ｍＡの定電流で６０分間～７０分間泳動した。ウェット式の転写装置を用いて、ニトロセルロース膜に３５０ｍＡの定電流で４５分間転写を行った。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に４℃で１晩浸漬してブロッキングを行った後、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ－Ｔ）で２００倍希釈したマウス抗ＰＴＰＲＺ ＩｇＭκ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、ｓｃ－３３６６４）を一次抗体として含む１．５ｍＬのＰＢＳ－Ｔ中で室温にて２時間振とうした。続いて、ＰＢＳ－Ｔ中に５分間ずつ３回浸漬して洗浄した後、二次抗体として１０，０００倍希釈したＨＲＰ標識化ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（ＳＡＢ－１１０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を含むＰＢＳ－Ｔと室温で２時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、 ３４０９６）を用いて発色させて、得られたシグナルをＡＴＴＯ Ｅｚ－Ｃａｐｔｕｒｅ ＭＧ（ＡＴＴＯ）で検出した。なお、バンドのシグナル強度の定量は、付属の定量ソフトＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。結果を図３に示す。

【0059】

図３に示される通り、ＭＳ患者由来の髄液中の分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２のシグナル強度は、コントロール群（特発性正常圧水頭症患者（疑い例を含む）群）由来の髄液中のそれと比較して、有意に低かった。この結果から、分泌型ＰＴＰＲＺアイソフォーム１および２がＭＳ検出用マーカーとなり得ることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明によれば、脱髄疾患（特には多発性硬化症）の確定診断に有用な新たな客観的指標が提供される。従って、本発明は医療分野において極めて有益である。

【0061】

本出願は、日本で出願された特願２０１８－０２８３２９（出願日：２０１８年２月２０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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