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特許7240733デュアル相互作用ヘアピンプローブを使用した標的媒介ｉｎ ｓｉｔｕシグナル増幅
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-08
(45)【発行日】2023-03-16
(54)【発明の名称】デュアル相互作用ヘアピンプローブを使用した標的媒介ｉｎ ｓｉｔｕシグナル増幅
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20230309BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20230309BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230309BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20230309BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALI20230309BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20230309BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230309BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230309BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
G01N33/53 M ZNA
G01N33/533
G01N33/48 M
G01N21/78 C
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6844 Z
C12N15/11 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2019564848
(86)(22)【出願日】2018-05-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-27
(86)【国際出願番号】 US2018034150
(87)【国際公開番号】W WO2018217905
(87)【国際公開日】2018-11-29
【審査請求日】2021-04-14
(31)【優先権主張番号】62/510,045
(32)【優先日】2017-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】510144959
【氏名又は名称】ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チャギ，サンジャイ
(72)【発明者】
【氏名】マラス，サルバトーレ，エー．イー．
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１１２９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０２２８７３３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０００９２７８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２２３５８５（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
固定および透過処理した細胞の核酸標的配列に隣接してハイブリダイズすることができ、相互作用してハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）増幅を開始できる一本鎖イニシエーター配列を生成することができる、相互作用ヘアピンオリゴヌクレオチドプローブペアであって、前記プローブペアは、
第１の、標的配列相補的な一本鎖ループ配列に隣接する２つの相補的アーム配列を含む二本鎖ステムを有するステムループオリゴヌクレオチドである、アーム供与（ａｒｍ－ｄｏｎａｔｉｎｇ）ヘアピンプローブ、この際前記アーム配列（供与アーム（ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｒｍ））の一つが一本鎖伸長を含む；および
第２の、一本鎖ループ配列に隣接する２つの相補的アーム配列を含む二本鎖ステムを有するステムループオリゴヌクレオチドである、アーム受容体（ａｒｍ－ａｃｃｅｐｔｏｒ）ヘアピンプローブ、ここで前記ループおよび一方のアームがＨＣＲまたはＲＣＡイニシエーター配列を含み、他方のアームが少なくとも末端の標的配列相補的な配列を含む一本鎖伸長を有し、前記第２のプローブが前記第１のプローブに隣接する前記標的配列にハイブリダイズすることができる、を含み、
この際、溶液中で遊離または非特異的に結合している場合、前記プローブは、それらのステムループ構造を維持することができ、
前記第１のプローブのループ配列の前記標的配列へのハイブリダイゼーションは、そのプローブのステムを開くが、第２のプローブの末端標的配列相補的な配列の前記標的配列へのハイブリダイゼーションは、そのプローブのステムを開かず、
前記第１および第２のプローブが前記標的配列に隣接して正しくハイブリダイズされる場合、前記第１のプローブの供与アームは、一本鎖であり、前記一本鎖伸長を有する前記第２のプローブのアームとハイブリダイズすることができ、それによりそのＨＣＲまたはＲＣＡイニシエーター配列を一本鎖にする、プローブペア。
【請求項2】
前記アーム受容体プローブの一本鎖伸長が前記アーム供与プローブの供与アームのステム形成（ｓｔｅｍ－ｆｏｒｍｉｎｇ）部分に相補的なトーホールド（ｔｏｅｈｏｌｄ）配列を含む、請求項１に記載のプローブペア。
【請求項3】
前記アーム受容体プローブの一本鎖伸長が前記末端標的配列相補的な配列のみを含む、請求項１に記載のプローブペア。
【請求項4】
前記プローブがＤＮＡプローブである、請求項１～３のいずれか１項に記載のプローブペア。
【請求項5】
各プローブペアが前記標的配列の異なる部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に隣接してハイブリダイズし、各プローブペアが相互作用して同じ一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生成する、複数の請求項１に記載のプローブペアのセット。
【請求項6】
標的配列の２つのアレル変異を検出するための２つの請求項１に記載のプローブペアのセットであって、第１のアレル変異のみにハイブリダイズするアーム供与プローブと前記アーム供与プローブがハイブリダイズする前記標的配列の３’へハイブリダイズするアーム受容体プローブとを含む第１のプローブペア、この際前記第１のプローブペアは、相互作用して、第１の一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生成する；および
第２のアレル変異のみにハイブリダイズするアーム供与プローブと前記アーム供与プローブがハイブリダイズする前記標的配列の５’へハイブリダイズするアーム受容体プローブとを含む第２のプローブペア、この際前記第２のプローブペアは、相互作用して、前記第１の一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列とは異なる第２の一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生成する、を含む、セット。
【請求項7】
同一のアーム供与の第１のプローブを共有する２つの請求項１に記載のプローブペアのセットであって、両方のアーム配列は、一本鎖伸長を含む供与アームであり、
前記第１のプローブおよび両方の第２のプローブが前記標的配列に隣接して正しくハイブリダイズする場合、前記第１のプローブの各供与アームは、一本鎖であり、前記一本鎖伸長を有する一方の第２のプローブのアームとハイブリダイズすることができ、それによりそのＨＣＲまたはＲＣＡイニシエーター配列を一本鎖にし、
各プローブペアは、相互作用して、ＨＣＲモノマーの同じペアのために一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生成する、セット。
【請求項8】
選択標的配列のための少なくとも１つの請求項１に記載のプローブペアおよび共に同じ蛍光色素分子でラベルされ、溶液中で遊離している場合、それらのヘアピン構造を維持することができるＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーペアを含み、前記少なくとも１つのプローブペアのそれぞれにより生成された前記イニシエーター配列が前記モノマーペアでＨＣＲ増幅を開始することができる、オリゴヌクレオチドセット。
【請求項9】
２つの請求項３に記載のプローブペアを含む、オリゴヌクレオチドセットであって、第１の色の第１の蛍光色素分子で両方ともラベルされた、第１のペアのＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマー、および異なる色の第２の蛍光色素分子で両方ともラベルされた、第２のペアのＨＣＲヘアピンヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーを含み、
溶液中で遊離している場合、モノマーペアは共に、それらのヘアピン構造を維持することができ、
前記第１の一本鎖イニシエーター配列は、前記第１のペアのＨＣＲヘアピンモノマーでＨＣＲ増幅を開始することができるが、前記第２のペアでは開始できず、前記第２の一本鎖イニシエーター配列は、前記第２のペアのＨＣＲヘアピンモノマーでＨＣＲ増幅を開始することができるが、前記第１のペアでは開始できない、オリゴヌクレオチドセット。
【請求項10】
標的配列を含む核酸標的分子を含む、または含むと疑われる細胞のサンプル中の前記標的配列を検出するためのｓｍ－ＦＩＳＨ方法であって、ａ）前記サンプル中の細胞を固定および透過処理すること；
ｂ）前記固定および透過処理した細胞を洗浄すること；
ｃ）前記洗浄した細胞を含むサンプルを請求項１に記載の相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブペアの少なくとも一つとインキュベートして、ＨＣＲポリメリゼーション用またはＲＣＡポリメリゼーション用の一本鎖イニシエーター配列を生成すること；
ｄ）必須ではないが好ましくは、前記インキュベートした細胞を洗浄して、ハイブリダイゼーションしなかったプローブを除去すること；
ｅ）ｃ）工程後または、もし含む場合、ｄ）工程後、重合試薬を添加し、インキュベートして、増幅産物を生成すること、ここで前記重合試薬は、ＨＣＲシグナル増幅用として、少なくとも１つのペアの蛍光色素分子標識ＨＣＲモノマー、またはＲＣＡシグナル増幅用として、少なくとも１つの環状ＤＮＡテンプレートおよびＤＮＡポリメラーゼを含み；
ｆ）過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーまたは過剰（未使用）ＲＣＡ環状テンプレートを洗い流すこと；
ｇ）ＲＣＡシグナル増幅用として、各標識配列用の蛍光色素分子標識検出プローブを添加し、インキュベートすること；および
ｈ）顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより前記細胞における蛍光を検出すること、を含む、方法。
【請求項11】
前記相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブペアの少なくとも一つが単一ペアからなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞が標的配列の２つの密接に関連する変異体の一方または両方を含む、または含むと疑われ、この際前記相互作用ヘアピンプローブペアの少なくとも一つが請求項６に記載の相互作用ヘアピンプローブの２つのペアを含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２３日に出願された米国仮出願第６２／５１０，０４５号の優先権を主張する。当該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年５月２３日に出願された米国仮出願第６２／５１０，０４５号の優先権を主張する。当該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、一般にハイブリダイゼーションプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕでの核酸配列の検出および増幅されたハイブリダイゼーションシグナルの生成に関する。
本発明は、一般にハイブリダイゼーションプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕでの核酸配列の検出および増幅されたハイブリダイゼーションシグナルの生成に関する。
【背景技術】
【0003】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、例えば、固定され透過処理された個別の細胞のＲＮＡを検出する際に使用される周知技術である。低コピー数のＲＮＡ標的を持つ細胞を検出するＦＩＳＨ法、すなわち細胞レベルでの検出は、通常検出可能な蛍光を生成するためのシグナル増幅を含む。そのような方法は、Ｍｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．４１：８５－１１２で概説されている。例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブは、ＤＩＧラベルとアルカリホスファターゼに結合した抗ＤＩＧ抗体との反応、続いて発色反応でのアルカリホスファターゼと基質との反応により検出することができる。特定のＦＩＳＨ法では、単一のＲＮＡ分子を検出できることが示されている（ｓｍ－ＦＩＳＨ）。ｓｍ－ＦＩＳＨでは、検出可能な蛍光スポットとして単一のＲＮＡ分子を検出できるように、十分に強く、十分にバックグラウンドを超える、十分に高い局所的な蛍光シグナルの生成を必要とする。ｓｍ－ＦＩＳＨの２つの成功している方法は、ターゲット配列のための複数の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、少数（５または６）の長い多重標識プローブ（Ｆｅｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：５８５－５９０）または多数（例えば、４８）の標的配列に沿ってタイルされ、同じ蛍光色素分子ですべて単一標識された、短いプローブ（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７－８７９）のセットを利用する。後者のプローブのセットは、ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＳｔｅｌｌａｒｉｓ ＦＩＳＨプローブセットとして市販されている。十分にｓｍ－ＦＩＳＨを可能にするための感度を向上させる別の周知技術は、カリフォルニア工科大学、カリフォルニア州パサデナ（米国）のＤｒ．Ｎｉｌｅｓ Ａ．Ｐｉｅｒｃｅとその同僚らによって開発された蛍光シグナル増幅法であるハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）によるシグナル増幅である。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応のシグナル強度を改善する別の技術は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅である（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５－２３２；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ （２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：９９５－１０００；およびＬａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５： ３９５－７）。
【0004】
ＨＣＲによるシグナル増幅において、「イニシエーター配列」と呼ばれる伸長を含む（またはタグが付けられた）リニア（またはランダムコイル）ハイブリダイゼーションプローブにより、２つの蛍光標識ヘアピンオリゴヌクレオチド（モノマー）がハイブリダイゼーションによって重合し、そのハイブリダイゼーションを介してハイブリダイゼーションプローブと相補的な標的配列につながれた、多様な蛍光色素分子標識の二本鎖ポリマーを生成する。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が、ハイブリダイゼーションプローブおよびＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドの構築に使用される。ＨＣＲのより詳細な説明は、図１の説明に関連して以下に登場する。
【0005】
単一の標的配列に対する基本的なＨＣＲ法のバリエーションは、同じイニシエーター配列を保持し、標的配列に沿ってハイブリダイズする複数のプローブのセット；一方の端に第１のＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドのためのイニシエーター、他方の端に他のヘアピンオリゴヌクレオチドのためのイニシエーターである２つのイニシエーター配列を有するプローブ；または両方の使用を含む（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＡＣＳ ＮＡＮＯ ８：４２８４－４２９４、４２８８の右欄）。Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．は、両方を使用した：ＲＮＡ標的配列ごとに５つの２－イニシエーターＤＮＡプローブ。別のバリエーションは、プローブのセットおよび各ターゲット配列に対して、異なった異なる色のペアのＨＣＲモノマーを用いる複数の標的配列の多重検出である。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．は、各標的配列に対して、５つの２－イニシエータープローブのセットと、スペクトル的に異なるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ蛍光色素分子を保持するＨＣＲモノマーのユニークなペアを用いる５つの標的の多重検出を記載している。
【0006】
ＨＣＲ増幅を利用する固定、透過処理した細胞（ゼブラフィッシュ胚）におけるＲＮＡ検出の例は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）により報告されている。第１の方法は、ＲＮＡプローブ（８１ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド（５０ｎｔ）の標的相補配列または「認識」配列、５ｎｔスペーサー、および２６ｎｔイニシエーター配列を含む）およびＲＮＡ ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマー（５２ヌクレオチド長、それぞれが１０ｎｔのトーホールド（ｔｏｅｈｏｌｄ）配列、１６ｂｐステム、および１０ｎｔループを含む）を使用した。第２の「次世代」の方法は、ＤＮＡプローブ（９１ヌクレオチド長、５０ｎｔの標的相補配列、５ｎｔスペーサー、および３６ｎｔイニシエーター配列（１２ｎｔのトーホールド相補配列を含む）；または１３２ヌクレオチド長、標的相補配列の各末端にスペーサーおよびイニシエーターを有する）、およびＤＮＡ ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマー（７２ヌクレオチド長、１２ｎｔトーホールド配列、２４塩基対（２４ｂｐ）ステム、および１２ｎｔループ）を使用した。全載ゼブラフィッシュ胚とのハイブリダイゼーションのために、胚を１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、一連のメタノール洗浄で透過処理した。ＲＮＡプローブのために、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミドを含むバッファー中で５５℃で一晩行われた。ＲＮＡヘアピンモノマーのために、ＨＣＲ増幅は、４０％ホルムアミドを含むバッファー中で４５℃で一晩行われた。ＤＮＡプローブのために、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミドを含むバッファー中で一晩行われた。ＤＮＡヘアピンモノマーのために、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含まないバッファー（塩化ナトリウムクエン酸（ＳＳＣ）、Ｔｗｅｅｎ２０および硫酸デキストランのみ）中で室温で一晩行われた。
【0007】
Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）によるＨＣＲ増幅を用いる固定および透過処理した培養細胞、ゼブラフィッシュ胚、およびマウス脳スライスにおけるＲＮＡ検出はまた、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）により報告された。胚とのハイブリダイゼーションのために、彼らは、３０ｎｔの標的相補配列、５ｎｔのスペーサー、および３６ｎｔのイニシエーター配列を含む３９の１－イニシエーターＤＮＡ ｓｍ－Ｆｉｓｈプローブ（プローブ間に≧５ｎｔのギャップ）のセットを使用した；培養細胞および脳スライスのために、彼らは、２０ｎｔの標的相補配列、４ｎｔのスペーサー、および３６ｎｔのイニシエーター配列を含む２１～３２のＤＮＡ ｓｍ－ＦＩＳＨプローブのセットを使用した。ＨＣＲ増幅条件は、ＨＣＲ重合をポリマー鎖あたり～２０から４０ヘアピンに制限するために調製された。培養細胞のために、ＨＣＲ増幅は、硫酸デキストランおよびＳＳＣを含むバッファー中で１２０ｎＭの各ヘアピンモノマーを用いて室温で４５分間実施された。胚のために、ＨＣＲ増幅は、硫酸デキストラン、ＳＳＣ、およびＴｗｅｅｎ２０を含むバッファー中で６０ｎＭの各ヘアピンモノマーを用いて室温で１時間実施された。脳スライスのために、ＨＣＲ増幅は、硫酸デキストランおよびＳＳＣを含む緩衝液中で１２０ｎＭの各ヘアピンモノマーを用いて室温で５～６時間実施された。
【0008】
ＨＣＲの現在の制限は、疑似シグナル（バックグラウンドシグナルとも称する）の生成を含む。洗浄後およびＨＣＲの開始時に非特異的に結合したままのタグ付きハイブリダイゼーションプローブはまた、バックグラウンドシグナルまたは偽陽性を構成する検出可能なシグナルを生成する。このようなシグナルの存在は、いくつかの参考文献で指摘されているが、それらのバックグラウンドシグナルの決定方法は、互いに異なっていた。Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、これらの非特異的バックグラウンドシグナルの範囲は、イニシエーターを含むハイブリダイゼーションプローブの長さと数に依存することを指摘した。Ｔａｂｌｅ Ｓ２において、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、ＨＣＲ検出実験の１つのシグナルおよびバックグラウンドレベルを報告する。平均シグナルレベルは、２０１０ユニットであり、バックグラウンドレベル（非特異的検出とも称する）は、２８ユニットであった。
【0009】
バックグラウンドシグナルはまた、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）によっても観察され、彼らは、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔａｂｌｅ３において、高倍率イメージングにおいてカウントしたスポットの数に関して、シグナルおよびバックグラウンドレベルを報告する。彼らは、遺伝子Ｄｌｇ４からのｍＲＮＡの発現についてマウス脳の領域を画像化した。Ｄｌｇ４ ｍＲＮＡに相補的なプローブを使用して得られたスポットの数は、脳の特定の領域で９，７９５であった。ミスセンスプローブ（ｍＲＮＡと同じ配列を持ち、したがってＲＮＡに結合できない）を代わりに使用した場合、同じ領域で１，５４０個のスポットが検出された。同様に、存在しないＲＮＡに対するプローブは、この領域に１，２０９個のスポットをもたらした。後者の２つの数字は、バックグラウンドシグナルのレベルを表し、最初の数字は、特定のシグナルを表す。
【0010】
Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）はまた、ＨＣＲイニシエーターでタグ付けされた非特異的に結合したプローブの増幅によって生成された顕著なバックグラウンドシグナルを観察した。彼らは、３セットのプローブで同時にＰｇｋ１ ｍＲＮＡを画像化することによりバックグラウンドレベルを分析した：Ａｌｅｘａ６４７で標識されたＨＣＲヘアピンの１つのセットからのシグナルを引き出すイニシエーターでタグ付けされたプローブの１セット、Ａｌｅｘａ ５９４で標識されたＨＣＲヘアピンの第２のセットからのシグナルを引き出す第２のイニシエーターでタグ付けされたプローブの第２のセット、およびＣｙ３ｂで直接標識されたプローブの第３のセット。彼らの結果は、Ａｌｅｘａ ６４７の３６％、Ａｌｅｘａ ５９４ ＨＣＲの２７％、およびＣｙ３ｂスポットの２０％が非特異的に結合したプローブに由来することを示している（偽陽性シグナル）（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．２０１６のＦｉｇｕｒｅＳ３Ｂ）。さらに、この文書の実施例１では、受動的にタグ付けされたプローブで実施されたＨＣＲで得られる偽陽性シグナルの追加の例について記載する。
【0011】
ＨＣＲのさらなる制限は、単一のヌクレオチドによって互いに異なるターゲットの間を区別するために使用できないことである。
【0012】
ＲＣＡによるシグナル増幅は、通常その後の連結反応のために５’および３’末端が互いに隣接するような方法で標的に結合する一本鎖リニアＤＮＡオリゴヌクレオチドからテンプレート依存的な方法で環状のテンプレートを最初に形成することにより実施される（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５－２３２およびＬａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：３９５－７）。こうして作製された環状ＤＮＡ分子は、次にＤＮＡプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼによるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のテンプレートとして使用される。環状のテンプレートのコピーは、テンプレート配列の相補体の多数の連結されたコピーを生成し、その後蛍光プローブによって検出される。ＲＣＡのより詳細な説明は、図２の説明に関連して以下に登場する。
【0013】
本発明の目的は、バックグラウンドを低減し、それにより、ＨＣＲシグナル増幅検出方法の感度を高めることである。
【0014】
本発明の他の目的は、ハイブリダイゼーションプローブにつながれた連結アンプリコンを生成するＲＣＡシグナル増幅検出方法であり、この際バックグラウンドシグナルが減少し、感度が増加する。
【0015】
本発明の他の目的は、わずか１ヌクレオチドだけ互いに異なる標的間を区別するために使用できるＨＣＲ検出方法である。
【発明の概要】
【0016】
ＨＣＲイニシエーターが標的の特異的な領域にタグ付けされているプローブは、公知である。このようなプローブは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの増幅検出を可能にするが、非特異的なシグナルを生成する傾向があり、同じ細胞内の２つのアレルの区別および検出には使用できない。本発明は、ＨＣＲイニシエーターがヘアピン内に隔離され、プローブが意図された位置で正しい標的に結合されるまで増幅を開始できないプローブペアを含む。さらに、本発明に係るプローブペアは、単一のヌクレオチド多型によって互いに異なる単一の標的分子からの増幅シグナルの発生および検出を可能にする。野生型および変異型の配列の両方を同時に検出することができる。本発明は、ＨＣＲによる固定および透過処理した細胞においてシグナル増幅を開始するための相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブペアを含む。
【0017】
本発明はまた、シグナル増幅のためにプローブ連結プライマーおよび環状テンプレートを利用するＲＣＡ法を含み、ヘアピン内に隔離され、プローブが意図した位置でそれらの正しい標的に結合するまで増幅を開始できないように、プライマーは、プローブペアに含まれる。本発明は、ＲＣＡにより固定および透過処理した細胞におけるシグナル増幅を開始するための相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブペアを含む。
【0018】
本発明は、かかるプローブの１つ以上のペアとＨＣＲオリゴヌクレオチドモノマーの１つ以上のペアまたはＲＣＡ用の追加のオリゴヌクレオチドのいずれかとのオリゴヌクレオチドセットを含む。本発明はまた、固定および透過処理した細胞と相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブのペアの少なくとも１つとを含む反応混合物、固定および透過処理した細胞と少なくとも１つのイニシエーター配列を生成するために相互作用しているハイブリダイズしたプローブペアとＨＣＲモノマーのペアの少なくとも１つとを含む反応混合物を含む。本発明はさらに、本発明の方法による単一分子蛍光ハイブリダイゼーション（ｓｍ－ＦＩＳＨ）アッセイを実施するためのアッセイキットを含み、キットは、少なくとも上記のオリゴヌクレオチドセットに加えて、ハイブリダイゼーションおよび増幅反応のためのバッファーの少なくとも１つを含む。相互作用ヘアピンプローブペアおよびＨＣＲモノマーは、天然または修飾ヌクレオチドを含み、好ましくは天然ヌクレオチドを含み、より好ましくはＤＮＡヌクレオチドからなる。
【0019】
本発明に係る方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的のためのＦＩＳＨ方法であり、特に単一分子検出（単一分子ＦＩＳＨ（ｓｍ－ＦＩＳＨ））のための方法またはそれが可能な方法を含む。ＲＮＡのカテゴリーの例は、制限されないが、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、プレＲＮＡ、およびスプライスされたまたは選択的にスプライスされたＲＮＡを含む。個別の細胞でＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのＦＩＳＨ法では、細胞を固定し、透過処理し、洗浄した後、ハイブリダイゼーションプローブでプローブする。細胞培養および組織中の細胞を固定および透過処理するためのＦＩＳＨ技術は、洗浄と同様に公知である。本発明に係る方法は、細胞を固定および透過処理するための特定の技術、または特定の洗浄工程に限定されない。
【0020】
本発明に係るＲＮＡまたはＤＮＡ ＦＩＳＨ検出方法では、固定および透過処理した細胞は、標的ストランドにおけるＲＮＡまたはＤＮＡ標的配列に隣接してハイブリダイズした場合、相互作用して一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生成する相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブのペアの少なくとも１つでプローブされる。かかるプロービングは、固定および透過処理した細胞と少なくとも１つのプローブペアとをインキュベートしてプローブペアをそれらの標的配列とハイブリダイズさせること、およびハイブリダイズしたプローブをインキュベートしてそれらの相互作用によりイニシエーター配列を生成することを含む。プローブのハイブリダイゼーションおよびプローブの相互作用の両方は、一回のインキュベーションで実施することができる。過剰なハイブリダイズしていないプローブを除去するために洗浄した後、ＨＣＲヘアピンモノマーのペアの１つとイニシエーターとの反応は、ＨＣＲによるシグナル増幅をもたらす。または、シグナル増幅は、ＲＣＡによって得られる。
【0021】
相互作用ヘアピンプローブの各ペアは、次の順番でセグメント（核酸配列エレメント）を有する第１のヘアピン含有プローブを含む；５’→３’または３’→５’：第１のヘアピンステムアーム配列、選択した核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）標的配列の第１の配列に相補的なループ配列、および一本鎖伸長（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を含む第１のステムアームに相補的な第２のヘアピンステムアーム。我々は、このプローブを「アーム供与ヘアピンプローブ（ａｒｍ－ｄｏｎａｔｉｎｇ ｈａｉｒｐｉｎ ｐｒｏｂｅ）」または「アーム供与ビーコン（ａｒｍ－ｄｏｎａｔｉｎｇ ｂｅａｃｏｎ）」とさまざまに称するが、我々は、「ＤＢ」と略すこともある。我々は、その第２のステムアームを「供与アーム（ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｒｍ）」と称する。相互作用ヘアピンプローブの各ペアはまた、次の順番で配列エレメントを有する第２のヘアピン含有プローブを含む；５’→３’または３’→５’：第１の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）に隣接する標的配列の第２の部分配列に相補的な末端標的相補配列、第１のヘアピン含有プローブの供与アームに相補的な第１のヘアピンステムアーム配列、ヘアピンループ配列、および少なくとも第１のヘアピンステムアームの一部分に相補的な第２のヘアピンステムアーム配列。我々は、このプローブを「アーム受容体ヘアピン（ａｒｍ－ａｃｃｅｐｔｏｒ ｈａｉｒｐｉｎ）または「アーム受容体プローブ（ａｒｍ－ａｃｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｂｅ）」と称する。その第２のステムアームは、末端標的相補配列を含む、ある実施形態ではトーホールド配列をも含む一本鎖伸長を有する。方向については、アーム供与ヘアピンプローブの第２のヘアピンステムアーム（供与アーム）およびアーム受容体プローブにおけるその相補体は、内側に向いており、すなわちプローブペアが標的配列にハイブリダイズする場合、互いに近接する。図４の第２のパネルを参照すると、これは、供与アームｅ’、ｆ’がアーム供与ヘアピンプローブ４９の５’末端にあるので、その相互作用アーム受容体プローブ５０は、３’末端にそのヘアピンｅ、ｆ、ｇ’、ｆ’を有すること；および供与アームｄ’、ｂ’がアーム供与ヘアピンプローブ４８の３’末端にあるので、その相互作用アーム受容体プローブ４７は、５’末端にそのヘアピンｄ、ｂ、ａ’、ｂ’を有することを意味する。
【0022】
第１のヘアピン含有プローブであるアーム供与プローブは、公知の分子ビーコンプローブのように機能し、これは、ステムループ構造を有し、ループ配列がその相補的な標的配列にハイブリダイズすると開く（Ｔｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３－３０８；Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４９－５３）。アーム供与ビーコンのループの標的配列へのハイブリダイゼーションは、そのステムアームを分離し、第２のステムアーム配列およびその伸長を一本鎖にし、それによって第２のヘアピン含有プローブであるアーム受容体プローブと相互作用することができる。相互作用は、アーム受容体プローブのステムアームを分離し、そのループ配列および第２のアーム配列を一本鎖とし、要望どおりＨＣＲ増幅のためのイニシエーターとしてまたはＲＣＡのためのイニシエーター（プライミング配列）として、機能できる。
【0023】
上記のように、第２のヘアピン含有プローブの第１のアーム配列であるアーム受容体プローブは、標的相補配列だけでなく、ステムおよび標的相補配列の間にトーホールド配列である、第１のアーム配列の一本鎖伸長を含むことができる。このような実施形態（図４を参照）では、トーホールド配列は、第１のプローブの供与アームのステム形成（ｓｔｅｍ－ｆｏｒｍｉｎｇ）部分に十分に相補的であり、供与アームを一本鎖とした後、そのステム部分は、トーホールド配列にハイブリダイズする。ストランド置換が続き、第２のプローブのステムを開く。他の実施形態（図５を参照）では、トーホールド配列はないが、相互作用は、それにもかかわらずアーム受容体プローブのステムを開く。両方のタイプの実施形態を以下および実施例で説明する。
【0024】
２つのプローブが標的配列に隣接して結合またはハイブリダイズする場合にのみ、それらは、相互作用して一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列またはＲＣＡプライマー配列を生成する。第２のプローブのループ配列がアレルを識別している、すなわち、単一ヌクレオチドのミスマッチがあり、その標的配列がアレル間で異なるヌクレオチドを含む際に、ハイブリダイズせず、プローブを開かない場合、ＨＣＲまたはＲＣＡ増幅は、プローブに完全に相補的なアレル標的配列からのみに由来するであろう。
【0025】
本発明の重要な側面は、増幅のイニシエーターが遊離または非特異的に結合したプローブにおいて「隔離され（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ）」または「隠され（ｍａｓｋｅｄ）」るが、プローブがそれらの特異的な標的に結合すると、「明らかにされ（ｒｅｖｅａｌｅｄ）」または「暴露され（ｕｎｍａｓｋｅｄ）」ることである。
【0026】
本発明に係る検出方法において、上記相互作用ヘアピンプローブのペアにより生成されるＨＣＲイニシエーター配列は、ＨＣＲによるシグナル増幅反応を開始する。ＨＣＲでは、同じ蛍光色素分子の少なくとも１つのコピー、好ましくは単一のコピーで標識されたヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーのペアは、ＨＣＲイニシエーターとの反応により開始されると、ハイブリダイゼーションおよび鎖置換により相互作用してイニシエーター配列の二本鎖伸長を生成する。伸長は、ＨＣＲポリマーとして知られている。多重に蛍光色素分子で標識されており、それによって直接蛍光色素分子で標識されたプローブと比較して、増幅された蛍光シグナルを生成する。ハイブリダイゼーションによりアーム受容体ヘアピンプローブと直接つながれ、プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションにより、そのプローブの標的配列と間接的につながれる。ＨＣＲの概略図を図２に示す。ＨＣＲの説明については、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ８：４２８４－４２９４を参照。
【0027】
本発明に係る検出方法において、相互作用ヘアピンプローブの単一のペアは、ＨＣＲイニシエーターの単一のコピーを生成することができる、または相互作用ヘアピンプローブの追加の（１つ以上の）ペアは、ＨＣＲイニシエーターの複数のコピーを生成するために使用することができる。複数のプローブペアを使用して単一の標的配列を検出する場合、最も単純な構成は、標的結合配列のみを変更でき、それによって単一のＨＣＲモノマーペアの使用を可能にする。
【0028】
特定の実施形態では、２つのプローブペアは、単一のアーム供与プローブを共有することができる。３つのプローブのみであるとしても、２つのプローブペアがあり、アーム供与プローブおよび第１のアーム受容体プローブを含む１のペアとアーム供与プローブおよび第２のアーム受容体プローブを含む第２のペアとがある。そのような実施形態において、１つのアーム受容体プローブは、アーム供与プローブの結合部位の標的配列５’にハイブリダイズし、第２のアーム受容体は、アーム供与プローブの結合部位の標的配列３’にハイブリダイズする。アーム供与プローブが標的配列にハイブリダイズし、そのステムアームが一本鎖になると、２つの解放された（ｆｒｅｅｄ）アームが両方のアーム受容体プローブと相互作用し、それにより２つのＨＣＲイニシエーターを放出する。２つの解放されたＨＣＲイニシエーターは、次にＨＣＲモノマーの単一のペアによってＨＣＲ増幅を開始し、これにより、共通のアーム供与プローブから１つではなく２つのＨＣＲポリマーが成長する。これは、標的配列の単一コピーからのより強い蛍光シグナルをもたらす。
【0029】
本発明に係る方法は、例えば野生型配列および単一ヌクレオチド多型または変異（ＳＮＰまたはＳＮＶ）含む突然変異配列のように、わずか１つのヌクレオチドだけ異なる２つのアレル変異の両方に対する、ｓｍ－ＦＩＳＨアッセイ、定性的および定量的アッセイの両方をさらに含む。そのような方法は、２つの相互作用ヘアピンプローブペアを利用し、各ペアは、アーム供与ビーコンプローブおよびアーム受容体ヘアピンプローブを含む。各アーム供与ビーコンプローブのループ配列は、標的配列の異なるアレル変異に相補的である。例えば、アーム供与ビーコンプローブの１つのループ配列は、野生型標的配列にハイブリダイズすることができるが、ＳＮＰを有する突然変異配列にはハイブリダイズすることができず、第２のアーム供与ビーコンプローブのループ配列は、突然変異配列にハイブリダイズすることができるが、野生型配列にはハイブリダイズすることができない。したがって、既定のＲＮＡ標的鎖のために、アーム供与ビーコンプローブの１つだけが既定の標的配列に結合するであろう。アーム供与ビーコンプローブの１つだけが既定の標的に結合するけれども、両方のアーム受容体プローブは、同じ標的に結合し、結合アーム供与ビーコンのいずれかの側に結合する（図３および４）。３’イニシエーター配列を有するアーム受容体ヘアピンプローブは、アーム供与ビーコンプローブのループが結合する３’である標的配列に結合する。５’イニシエーター配列を有するアーム受容体ヘアピンプローブは、第２のアーム供与ビーコンプローブのループが結合する５’である標的配列に結合する。２つのアーム受容体ヘアピンプローブのトーホールドおよびステムループ配列は、異なっており、これにより各相互作用プローブペアは、異なる蛍光色素分子ラベルで標識された異なるモノマーペアを用いてＨＣＲを開始する異なる一本鎖イニシエーター配列を生成し、よって検出可能な異なるＨＣＲ多量体生成物を生成する。４つのプローブおよびそれらがターゲットと互いとにどのように相互作用するのかについては、図３～５に示す。
【0030】
両方のアレル変異体がヘテロ接合細胞の異なるＲＮＡ鎖に存在する可能性があるため、そのような細胞では両方のＨＣＲ変異からのシグナルを観察できる。一方、ホモ接合体細胞は、たった１つのシグナルを示すであろう。最後に、一方のアレルが他方のアレルと比較して増幅され、より一層発現されるがん細胞において、対応するＨＣＲのシグナルの強度は、マイナーアレルに対応するＨＣＲからのシグナルの強度よりも大きくなる。
【0031】
隣接してハイブリダイズしたプローブペアの相互作用によって生成されない限り、一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列は、反応混合物に存在しないため、少なくとも１つのプローブペアおよび少なくとも１つのＨＣＲモノマーペアは、固定および透過処理した細胞へと一緒に添加することができる。しかしながら、特定の好ましい方法では、少なくとも１つのプローブペアが最初に添加され、ＨＣＲモノマーを添加する前に、非結合プローブを洗浄により除去する。本発明のｓｍ－ＦＩＳＨ方法は、ＨＣＲポリマーの検出を含む。ＨＣＲ重合後、未使用のＨＣＲモノマーおよび未結合プローブペアは、洗浄により除去される。蛍光は、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによって検出される。
【0032】
いくつかの状況では、ｓｍ－ＦＩＳＨのためのタイルのプローブ（ｔｉｌｅｄ ｐｒｏｂｅ）でｍＲＮＡターゲット長全体を標的にするのではなく、タイルのＳｔｅｌｌａｒｉｓプローブセットで行われるように、標的配列のごく一部（４０～５０ｎｔ）を使用することが必要または有利であり得る。例えば、保管されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルでは、標的ｍＲＮＡが分解され、小さな断片としてのみ存在し得る。その他の場合、標的は、多くのｓｍ－ＦＩＳＨプローブのタイリングを可能にするのに十分な長さではない小さなエクソンであり得る。さらに他の場合では、標的は、検出が必要な小さな変異を含みうる。これらの場合、単一の相互作用ヘアピンプローブのペアまたは共通のアーム供与プローブを共有する２つのペアを使用することで十分かつ有利になり得る。
【0033】
本発明により達成されるバックグラウンドのないシグナル増幅により、現在のＨＣＲ方法により達成されるよりも信頼性の高い標的核酸の検出が可能になる。バックグラウンドシグナルの減少により、より少ない標的の検出、細胞および組織の自然な自己蛍光を超える標的の検出、および組み合わせカラーコーディング（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｏｌｏｒ－ｃｏｄｉｎｇ）による同じ細胞内の複数の標的の検出も可能になる。組み合わせカラーコーディングに基づく多重化では、各標的は、色の組み合わせを生じさせるプローブの混合物を使用して検出される。しかしながら、各標的シグナルは、複数のチャンネルに分割されるため、これは、プローブが各チャンネルのための強いシグナルを生成することを必要とする。本発明のプローブは、強いシグナルを生成して組み合わせカラーコーディングに基づくの多重化のニーズを満たす。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図3】図３Ａは、相互作用ヘアピンプローブペアならびにＨＣＲイニシエーター配列を生成するためのお互いとおよびそれらの標的配列との相互作用の概略図である。図３Ｂは、重合が図３Ａに示される相互作用ヘアピンプローブペアによって開始されるＨＣＲモノマーのペアの概略図である。
【図4】図４は、相互作用ヘアピンプローブの２つのペアならびにＨＣＲイニシエーター配列を生成するためのお互いとおよびそれらの標的配列との相互作用の概略図である。アーム受容体プローブは、トーホールド配列を含み、アーム供与プローブは、トーホールド相補配列を含む。
【図5】図５は、トーホールドまたはトーホールド相補配列を有さないように変更された図４のプローブペアならびにＨＣＲイニシエーター配列を生成するためのお互いとおよびそれらの標的配列との相互作用の概略図である。
【図8】図８は、受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブによる検出およびＨＣＲシグナル増幅からのならびに相互作用プローブペアによる検出およびＨＣＲシグナル増幅からの標的特異的シグナルおよびバックグラウンドシグナルを示す顕微鏡画像のセットである。
【図9】図９Ａおよび９Ｂは、受動的にタグ付けされたプローブおよび相互作用ヘアピンプローブペアを使用してＨＣＲで生成された標的特異的シグナルおよびバックグラウンドシグナルを含むグラフである。分析はフローサイトメトリーにより実施された。
【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、相互作用ヘアピンプローブの２つのペアおよびＨＣＲモノマーの２つのペアを用いるｍＲＮＡ分子の単一ヌクレオチド変異の同時検出を示す顕微鏡画像を含む。また、定量的レベルの区別を表示するグラフを示す。
【図12】図１２は、相互作用ヘアピンプローブを用いて得られたシグナルを示す顕微鏡画像のセットであり、アーム受容体プローブは、ホスホジエステル結合のみを有し、アーム受容体プローブは、クリックケミストリーによる非ホスホジエステル結合を含んだ。
【発明を実施するための形態】
【0035】
詳細な説明
定義：
「ＲＮＡ」。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、標的配列に言及する場合、「ＲＮＡ」は、すべてのバリアント、例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、コーディングまたは非コーディングＲＮＡ、直鎖または環状ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、スプライスされたまたは交互にスプライスされたＲＮＡ、およびプレＲＮＡを含む。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、相互作用ヘアピンプローブに言及する場合、「ＲＮＡ」は、天然リボヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を有するオリゴリボヌクレオチドを含み、また１つ以上の非天然ヌクレオチド（例えば、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド）を含むオリゴリボヌクレオチドを含む。
定義：
「ＲＮＡ」。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、標的配列に言及する場合、「ＲＮＡ」は、すべてのバリアント、例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、コーディングまたは非コーディングＲＮＡ、直鎖または環状ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、スプライスされたまたは交互にスプライスされたＲＮＡ、およびプレＲＮＡを含む。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、相互作用ヘアピンプローブに言及する場合、「ＲＮＡ」は、天然リボヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を有するオリゴリボヌクレオチドを含み、また１つ以上の非天然ヌクレオチド（例えば、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド）を含むオリゴリボヌクレオチドを含む。
【0036】
「ＤＮＡ」。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、相互作用ヘアピンプローブに言及する場合、「ＤＮＡ」は、天然デオキシリボヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み、また１つ以上の非天然ヌクレオチド（例えば、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド）および非天然の骨格を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む。
【0037】
「核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、標的分子または標的配列に言及する場合、「核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、いずれの場合も天然ヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを含み；または相互作用ヘアピンプローブに言及する場合、天然ヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を有するＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、また１つ以上の非天然ヌクレオチド（例えば、ＰＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチドまたは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド）を含む。
【0038】
「隣接して（Ａｄｊａｃｅｎｔｌｙ）」。相互作用ヘアピンプローブペアのハイブリダイゼーションを記述するために本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、「隣接して」は、互いに十分に近く、相互作用ヘアピンプローブ間の相互作用を可能にするサイトを意味する。好ましい選択は、２つの相互作用するプローブの結合サイト間にギャップがない「直接隣接した（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）」である。
【0039】
「標的分子（ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」、「標的鎖（ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）」、「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、および「標的配列領域（ｔａｒｇｅｔ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｇｉｏｎ）」または「部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」。本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、標的分子または標的鎖は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである核酸鎖であり、１以上の標的配列を含む。「標的配列」は、１つ以上の従来の受動的にタグ付けされたプローブによりまたは１つ以上の本発明の相互作用ヘアピンプローブのペアにより、プローブされるＲＮＡまたはＤＮＡ標的配列中の配列であり、シグナル増幅は、単一色のシグナルをもたらす。２つ以上の従来の受動的にタグ付けされたプローブのセットまたは相互作用ヘアピンプローブの２つ以上のペアのセットが同じ標的配列を標的とする場合、セット内の従来の受動的にタグ付けされたプローブのそれぞれまたはセット内の相互作用ヘアピンプローブのペアは、標的配列の別々の標的配列領域（または部分配列）を標的とする。１つまたは複数の標的分子（または標的鎖）の２つ以上の標的配列を同時に検出する多重法では、各標的配列は、１つ以上の従来の受動的にタグ付けされたプローブによりまたは１つ以上の相互作用ヘアピンプローブのペアによりプローブされ、シグナル増幅は、各標的配列の異なる色のシグナルをもたらす。
【0040】
「受動的にタグ付けされた（Ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｔａｇｇｅｄ）」。先行技術（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４））のプローブに対応するハイブリダイゼーションプローブを記述するために本特許出願の明細書および特許請求の範囲での使用では、「受動的にタグ付けされた」とは、イニシエーター配列であるＨＣＲイニシエーター配列またはＲＣＡイニシエーター配列のいずれかは、標的配列相補配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の少なくとも一端に付加されることを意味する。このようなプローブのイニシエーターは、イニシエーターとしての機能を妨げる構造に隔離されていない。それどころか、受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブのイニシエーター配列は、プローブがその特定の標的配列に結合しているかまたは非特異的な部位に結合しているかにかかわらず、シグナル増幅を開始し得る。
【0041】
図面の解釈
図において、お互いに相補的な配列は、同じ文字で示されており、１つは、相補的な配列の間を区別するためにプライム（’）で示されている。したがって、図において、配列ａおよびａ’は、お互いに相補的であり、配列ｂおよびｂ’、Ｉ５およびＩ’５も同様である。
図において、お互いに相補的な配列は、同じ文字で示されており、１つは、相補的な配列の間を区別するためにプライム（’）で示されている。したがって、図において、配列ａおよびａ’は、お互いに相補的であり、配列ｂおよびｂ’、Ｉ５およびＩ’５も同様である。
【0042】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
本発明に係る方法は、ＦＩＳＨ方法である。ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、細胞内の核酸標的を検出するための公知の方法である。最初に、細胞は、通常ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定され、通常エタノールまたは界面活性剤で透過処理されて、核酸ハイブリダイゼーションプローブの導入が可能にる。本発明は、細胞を固定および透過処理する特定の方法に限定されず、ｉｎ－ｓｉｔｕプローブハイブリダイゼーションおよびＨＣＲまたはＲＣＡ増幅と互換性のある、任意の固定および透過処理方法を使用できる。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、４％パラホルムアルデヒドで胚を固定し、メタノールで透過処理することを教示する（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｔ Ｓ１．１）。Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４３：２８６２－２８６８は、マウス脳スライスを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の８％ＳＤＳ界面活性剤の溶液でのインキュベーションを含む、「ＰＡＣＴ ｃｌｅａｒｉｎｇ」として知られる技術により透過処理することを教示している（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３：６７９－６８４およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓは、培養細胞を１０％ホルマリンで固定し、７０％エタノールに保存して固定した細胞を透過処理することを教示している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。実施例で報告する我々の研究において、我々は、固定のために１Ｘ ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを１０分間使用し、透過処理のために７０％エタノールを３０分間使用した。
本発明に係る方法は、ＦＩＳＨ方法である。ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、細胞内の核酸標的を検出するための公知の方法である。最初に、細胞は、通常ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドで固定され、通常エタノールまたは界面活性剤で透過処理されて、核酸ハイブリダイゼーションプローブの導入が可能にる。本発明は、細胞を固定および透過処理する特定の方法に限定されず、ｉｎ－ｓｉｔｕプローブハイブリダイゼーションおよびＨＣＲまたはＲＣＡ増幅と互換性のある、任意の固定および透過処理方法を使用できる。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、４％パラホルムアルデヒドで胚を固定し、メタノールで透過処理することを教示する（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｔ Ｓ１．１）。Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４３：２８６２－２８６８は、マウス脳スライスを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の８％ＳＤＳ界面活性剤の溶液でのインキュベーションを含む、「ＰＡＣＴ ｃｌｅａｒｉｎｇ」として知られる技術により透過処理することを教示している（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３：６７９－６８４およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓは、培養細胞を１０％ホルマリンで固定し、７０％エタノールに保存して固定した細胞を透過処理することを教示している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。実施例で報告する我々の研究において、我々は、固定のために１Ｘ ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを１０分間使用し、透過処理のために７０％エタノールを３０分間使用した。
【0043】
最もシンプルなＦＩＳＨ方法では、選択された標的配列、例えばＤＮＡプローブに相補的な蛍光色素分子標識リニア（またはランダムコイル）ハイブリダイゼーションプローブを次に添加し、ハイブリダイズしていないプローブ（ハイブリダイズしていないプローブのコピーを意味する）を洗い流す。その後、蛍光を検出する。最もシンプルなＦＩＳＨ方法は、ただ豊富な標的分子を検出するためだけには十分である。まれな標的分子を検出するため、特にまれな標的分子を単一分子レベルで検出する場合、ＦＩＳＨ方法は、単一の標的分子から発せられる蛍光を増加させる方法を含む必要がある。それを行う一般的な方法の１つは、シグナル増幅である。本発明は、２つのシグナル増幅方法のいずれかを含むＦＩＳＨ方法に関する：ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）。本発明に係る方法は、高レベルの感度でＲＮＡおよびＤＮＡ標的の検出のためにＦＩＳＨを利用し、特定の好ましい実施形態では、単一分子ＦＩＳＨ（ｓｍ－ＦＩＳＨ）と呼ばれることもある単一分子感度を可能とする。以下の説明では、主にＲＮＡ標識の検出に焦点を当てる。ＤＮＡ検出に必要な特定の調整については、別途説明する。
【0044】
ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）
本発明の特定の方法は、固定および透過処理した細胞における単一核酸分子の検出のための、ハイブリダイゼーション連鎖反応、ＨＣＲとして知られるシグナル増幅方法を含むＦＩＳＨに関し、またそれを使用する（単一分子ＦＩＳＨ、ｓｍ－ＦＩＳＨと略す）。従来のＨＣＲシグナル増幅による検出は、特定の核酸標的配列、例えばＲＮＡ標的配列のために、１つのハイブリダイゼーションプローブ、またはより多くの場合、数個のハイブリダイゼーションプローブのセットを使用する。通常、ハイブリダイゼーションプローブまたはプローブセットの複数のハイブリダイゼーションプローブは、蛍光色素分子標識されていない。各ハイブリダイゼーションプローブは、それを３’テール、５’テール、または３’テールおよび５’テールの両方に結合しており、いずれも標的配列にハイブリダイズしない。代わりに、各テールは末端ＨＣＲ「イニシエーター」配列を含む。我々は、それらの標的配列に結合したときに、遊離の（隔離されていない）イニシエーター配列を有するハイブリダイゼーションプローブを「受動的にタグ付けされたプローブ」と称する。ＨＣＲによるＲＮＡ標的配列またはＤＮＡ標的配列の検出はまた、ＨＣＲモノマーと呼ばれることもある、蛍光色素分子標識ヘアピンオリゴヌクレオチドのペアを使用する；その一つは、ハイブリダイゼーションプローブのイニシエーター配列と相互作用してＨＣＲ増幅を開始する。既存のＨＣＲ検出方法の基本を図１に示し、これは、単一プローブの単一核酸標的配列へのハイブリダイゼーションを示すかかる方法を表し、ハイブリダイゼーションプローブは、単一のＨＣＲイニシエーター配列を含む。細胞は、培養中であろうと組織切片中であろうと、ＦＩＳＨ方法において慣習となっているように、固定および透過処理される。核酸標的配列、例えばＲＮＡ標的配列に相補的なハイブリダイゼーションプローブを固定および透過処理した細胞に加え、インキュベートしてプローブを標的配列にハイブリダイズさせる。ＨＣＲモノマーを添加する前に、サンプルを洗浄してプローブの未結合コピーを除去する。以下の説明から理解されるように、そのような除去は、プローブのコピーが特異的に（正しく）ハイブリダイズしたか非特異的に結合したかにかかわらずＨＣＲ増幅を開始できるため、極めて必要である。ＨＣＲは、その後蛍光色素分子標識ＨＣＲモノマーを添加してインキュベートすることにより実行される。その後、未使用のＨＣＲモノマーを洗浄により除去して、その後、蛍光を顕微鏡によりまたはフローサイトメトリーにより検出する。
本発明の特定の方法は、固定および透過処理した細胞における単一核酸分子の検出のための、ハイブリダイゼーション連鎖反応、ＨＣＲとして知られるシグナル増幅方法を含むＦＩＳＨに関し、またそれを使用する（単一分子ＦＩＳＨ、ｓｍ－ＦＩＳＨと略す）。従来のＨＣＲシグナル増幅による検出は、特定の核酸標的配列、例えばＲＮＡ標的配列のために、１つのハイブリダイゼーションプローブ、またはより多くの場合、数個のハイブリダイゼーションプローブのセットを使用する。通常、ハイブリダイゼーションプローブまたはプローブセットの複数のハイブリダイゼーションプローブは、蛍光色素分子標識されていない。各ハイブリダイゼーションプローブは、それを３’テール、５’テール、または３’テールおよび５’テールの両方に結合しており、いずれも標的配列にハイブリダイズしない。代わりに、各テールは末端ＨＣＲ「イニシエーター」配列を含む。我々は、それらの標的配列に結合したときに、遊離の（隔離されていない）イニシエーター配列を有するハイブリダイゼーションプローブを「受動的にタグ付けされたプローブ」と称する。ＨＣＲによるＲＮＡ標的配列またはＤＮＡ標的配列の検出はまた、ＨＣＲモノマーと呼ばれることもある、蛍光色素分子標識ヘアピンオリゴヌクレオチドのペアを使用する；その一つは、ハイブリダイゼーションプローブのイニシエーター配列と相互作用してＨＣＲ増幅を開始する。既存のＨＣＲ検出方法の基本を図１に示し、これは、単一プローブの単一核酸標的配列へのハイブリダイゼーションを示すかかる方法を表し、ハイブリダイゼーションプローブは、単一のＨＣＲイニシエーター配列を含む。細胞は、培養中であろうと組織切片中であろうと、ＦＩＳＨ方法において慣習となっているように、固定および透過処理される。核酸標的配列、例えばＲＮＡ標的配列に相補的なハイブリダイゼーションプローブを固定および透過処理した細胞に加え、インキュベートしてプローブを標的配列にハイブリダイズさせる。ＨＣＲモノマーを添加する前に、サンプルを洗浄してプローブの未結合コピーを除去する。以下の説明から理解されるように、そのような除去は、プローブのコピーが特異的に（正しく）ハイブリダイズしたか非特異的に結合したかにかかわらずＨＣＲ増幅を開始できるため、極めて必要である。ＨＣＲは、その後蛍光色素分子標識ＨＣＲモノマーを添加してインキュベートすることにより実行される。その後、未使用のＨＣＲモノマーを洗浄により除去して、その後、蛍光を顕微鏡によりまたはフローサイトメトリーにより検出する。
【0045】
図１は、核酸標的分子１０における標的配列ＴＳ１に相補的であるプロービング配列Ｐ１を含む単一の受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブ１１により開始されるＨＣＲによるシグナル増幅を示す。ハイブリダイゼーションプローブ１１はまた、５’テールとしてイニシエーターＩ１を含み、これは、セグメントａ’およびｂ’を含む。イニシエーターＩ１は、スペーサーＳ１によってプローブ配列Ｐ１に結合している。また図１に示すように、ＨＣＲヘアピンのペアはオリゴヌクレオチド（ＨＣＲモノマー）、すなわち蛍光色素分子標識ヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１およびＨ２である。モノマーＨ１は、「トーホールド」配列として知られる一本鎖５’末端配列ａと、ステムｂ－ｂ’を含むステムループヘアピン（ハイブリダイズされたアーム配列ｂおよびｂ’を含む）と一本鎖ループ配列ｃ’とを含む。トーホールド配列ａは、ステムアームｂの一本鎖伸長である。順序において、Ｈ１の４つの配列は、５’－ａ－ｂ－ｃ’－ｂ’－３’である。ヘアピンモノマーＨ１は、単一の３’末端蛍光色素分子Ｏのみを含むことが示される。モノマーＨ２は、一本鎖末端トーホールド配列ｃと、ステムｂ－ｂ’を含むステムループヘアピン（ハイブリダイズされたアーム配列ｂおよびｂ’を含む）と一本鎖ループ配列ａ’とを含む。順序において、４つの配列は、３’－ｃ－ｂ－ａ’－ｂ’－５’である。ＨＣＲモノマーＨ２はまた、単一の５’末端蛍光色素分子Ｏを含む。Ｈ１およびＨ２の蛍光色素分子Ｏは、同じである。モノマーはまた、複数のコピーの蛍光色素分子Ｏで標識することができる。
【0046】
図１は、イニシエーターＩ１により開始されるＨＣＲ増幅の概略フローチャートである。まずプローブＩ１は、固定および透過処理した細胞を含むサンプルに添加され、インキュベートされる。図１の一番上に示されるように、プローブ配列（標的配列相補配列）Ｐ１は、標的配列ＴＳ１にハイブリダイズするが、スペーサー配列Ｓ１およびイニシエーター配列Ｉ１は、ハイブリダイズしない。したがって、配列ａ’、ｂ’を含む、イニシエーター配列Ｉ１は、プローブ配列Ｐ１を介して標的配列ＴＳ１に結合される（またはつながれる）が、一本鎖を維持する。洗浄によるプローブ１１の未結合コピーの除去後、ＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２のペアは、図１の右上に示すように、標的分子１０およびハイブリダイズしたプローブ１１を含む洗浄サンプルに添加される。
【0047】
ハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイズしたプローブ１１を含むサンプルとＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２とのインキュベーションは、次のようにＨＣＲシグナル増幅を引き起こす。図１の第２の図を参照すると、イニシエーター配列１１の配列ａ’は、Ｈ１トーホールド配列ａにハイブリダイズし、鎖置換により伸長されたハイブリッドを形成し、それによりイニシエーター配列ｂ’は、Ｈ１配列ｂにハイブリダイズして、ＨＣＲ重合を開始する。ハイブリダイゼーション条件下で不可逆である、このハイブリダイゼーションおよび鎖置換反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａｎｄ－ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、モノマーＨ１のステムｂ－ｂ’を分離し、その結果Ｈ１配列ｃ’、ｂ’が示されるような一本鎖３’末端領域となり、モノマーＨ２のためのイニシエーター配列Ｉ２として機能することができる。したがって、現在一本鎖であるＨ１配列ｃ’は、Ｈ２トーホールド配列ｃにハイブリダイズし、鎖置換により伸長されたハイブリッドを形成し、図１の第３の図に示すように、ＨＣＲ重合を継続する。ハイブリダイゼーション条件下で同様に不可逆である、第２のハイブリダイゼーションおよび鎖置換反応は、Ｈ２のステムｂ’－ｂを分離し、その結果図１の第３の図に示すように、成長するポリマー鎖の終端で、Ｈ２配列ａ’、ｂ’がオリジナルのイニシエーター配列Ｉ１と同一の一本鎖５’末端領域となる。図１に示すように、Ｈ２の一本鎖配列ａ’、ｂ’は、次に別のＨ１モノマーを加えることができる。これは、図１の一番下の図に示すように、一方の鎖における一連のモノマーＨ１および相補鎖におけるイニシエーター配列Ｉ１から伸長する一連のＨ２モノマーを有する、成長する二本鎖ＨＣＲポリマーＨＣＲ－Ｐをもたらす。非結合のＨ１およびＨ２モノマーは、洗浄により除去され、蛍光は、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより検出される。ＨＣＲは、特異的に結合したプローブおよび非特異的に結合したプローブで同等に動作するため、プローブ１１などの受動的にタグ付けされたプローブは、疑似シグナルを生成する傾向がある。
【0048】
イニシエーター配列Ｉ２が３’タグとしてプローブ１１に含まれる場合（３’－ｂ－ｃ－Ｐ１）、同じＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２のＨＣＲ重合を同様に開始することができる。イニシエーター配列Ｉ２の配列ｃ’は、上述のＨ２トーホールド配列ｃにハイブリダイズし、上記の方法で重合を開始して、Ｈ１よりむしろＨ２で開始して、プローブ配列Ｐ１の３’末端から伸長する第２のＨＣＲポリマーを生成する。また、プローブのセットは、プローブ１１の標的配列相補配列を変えることにより作製して、標的配列ＴＳ１におけるさらなる配列にハイブリダイズすることができる。
【0049】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）でのｓｍ－ＦＩＳＨ
本発明はまた、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅を含むｓｍ－ＦＩＳＨ検出のための、またはその検出を可能にする、試薬および方法を含む。我々はまず、図２に記載のＲＣＡが受動的にタグ付けされたプローブで使用することができる方法である我々のコンセプトを説明し、図２は、ハイブリダイゼーション、ＲＣＡ増幅および蛍光色素分子（Ｏ）標識検出プローブＬＰとしてここに示すように、検出プローブでの検出の概略フローチャートを表す。図２の左側の第１の図は、標的配列ＴＳ２を含む標的配列２０にハイブリダイズしたプローブ２１を示す。ハイブリダイゼーションプローブ２１は、標的配列特異的な部分Ｐ２、スペーサーＳ５およびプローブ配列Ｐ２が標的配列ＴＳ２に結合したときに一本鎖を維持するＤＮＡ配列であるＲＣＡイニシエーターＩ５を含む。プローブ２１は、固定および透過処理した細胞の標的にハイブリダイズして、過剰な未結合プローブは、ＨＣＲ方法のために、上述のように洗浄により除去される。
本発明はまた、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅を含むｓｍ－ＦＩＳＨ検出のための、またはその検出を可能にする、試薬および方法を含む。我々はまず、図２に記載のＲＣＡが受動的にタグ付けされたプローブで使用することができる方法である我々のコンセプトを説明し、図２は、ハイブリダイゼーション、ＲＣＡ増幅および蛍光色素分子（Ｏ）標識検出プローブＬＰとしてここに示すように、検出プローブでの検出の概略フローチャートを表す。図２の左側の第１の図は、標的配列ＴＳ２を含む標的配列２０にハイブリダイズしたプローブ２１を示す。ハイブリダイゼーションプローブ２１は、標的配列特異的な部分Ｐ２、スペーサーＳ５およびプローブ配列Ｐ２が標的配列ＴＳ２に結合したときに一本鎖を維持するＤＮＡ配列であるＲＣＡイニシエーターＩ５を含む。プローブ２１は、固定および透過処理した細胞の標的にハイブリダイズして、過剰な未結合プローブは、ＨＣＲ方法のために、上述のように洗浄により除去される。
【0050】
その後、ＲＣＡは、プローブのイニシエーター配列Ｉ５と相補的であり、また検出プローブ結合配列ＰＢＳを含む配列Ｉ５’を含む環状ＤＮＡテンプレートＣＴを使用してサンプルに対して行われる。テンプレートＣＴおよびＤＮＡポリメラーゼは、洗浄したサンプルに添加され、その後ＲＣＡ条件下でインキュベートされる。イニシエーター（プライマー）配列Ｉ５は、図２の第２の図に示されるように、テンプレートＣＴの配列Ｉ５’にハイブリダイズする。テンプレートＣＴはその後、連続して複数回コピーされる、すなわち図２の第３の図に示すように、ＤＮＡポリメラーゼにより重合される。テンプレートＣＴが環状でありエンドレスであるため、非常に長い一本鎖ＤＮＡ増幅産物ＡＰが生成され、示されるように環状テンプレートＣＴの多くの直列に繰り返されたコピーを含む。環状テンプレートは、反応を行うために添加されてもよく、またはまずＩ５に結合し、その後リガーゼの添加により環状に変化される、ＣＴのリニアバージョンを用いることによりｉｎ ｓｉｔｕで生成されてもよい。増幅産物ＡＰは、ハイブリダイズしたプローブ２１を介して標的配列ＴＳ２へのつながりを維持する。未結合のテンプレートＣＴを洗い流し、検出プローブＬＰを添加して、ハイブリダイズする条件下サンプルとインキュベートする。図２の最後の図に示すように、セグメントＰＢＳ環状テンプレートＣＴの配列を有する、標識プローブＬＰは、増幅産物ＡＰにおける環状テンプレートＣＴの各コピーにハイブリダイズする。標識プローブＬＰは、少なくとも一つの蛍光色素分子Ｏを含む。図２に記載の実施形態において、プローブＬＰは、単一の蛍光色素分子で標識されたリニア（ランダムコイル）プローブである。多くのコピーの標識プローブＬＰは、結合し、標的配列ＴＳ２が強い蛍光を発するようにする。過剰の未結合標識プローブＬＰを洗浄により除去し、蛍光を顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより検出する。分子ビーコンプローブを単一標識プローブＬＰの代わりに使用して、洗浄による後者の除去の必要性を回避することができる。ＨＣＲと同様に、ＲＣＡは、特異的に結合したプローブおよび非特異的に結合したプローブで同等に動作するため、プローブ２１のようなＲＣＡを開始するための受動的にタグ付けされたプローブは、疑似シグナルを生成する傾向がある。
【0051】
ＨＣＲを用いた本発明の方法および試薬
本発明の検出方法は、上述の通り、細胞を固定および透過処理すること、プローブを細胞の核酸標的配列、例えばｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすること、および上記のＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチド（ＨＣＲモノマー）のペアを重合することを含むｓｍ－ＦＩＳＨ方法である。本発明の方法は、とりわけＨＣＲ重合を開始するために使用されるハイブリダイゼーションプローブの設計および構築において、ＨＣＲ増幅による従来公知のＦＩＳＨ法とは異なる。プローブが標的配列にハイブリダイズするか非特異的部位に結合するかにかかわらず、ＨＣＲを開始することができるイニシエーター配列で受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブを使用するのではなく、本発明の方法は、意図された核酸標的配列、例えばｍＲＮＡ標的分子中の選択した標的配列にハイブリダイズした場合にのみ、ＨＣＲシグナル増幅を開始する本発明のプローブを使用する。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、我々が好ましくはＤＮＡからなる相互作用ヘアピンオリゴヌクレオチドプローブペアと称する相互作用ステムループオリゴヌクレオチドのペアを含み、プローブは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法により固定および透過処理されたサンプル中のＤＮＡ鎖またはｍＲＮＡ鎖などのＲＮＡ鎖であり得る、核酸標的鎖の標的配列に隣接してハイブリダイズする。
本発明の検出方法は、上述の通り、細胞を固定および透過処理すること、プローブを細胞の核酸標的配列、例えばｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすること、および上記のＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチド（ＨＣＲモノマー）のペアを重合することを含むｓｍ－ＦＩＳＨ方法である。本発明の方法は、とりわけＨＣＲ重合を開始するために使用されるハイブリダイゼーションプローブの設計および構築において、ＨＣＲ増幅による従来公知のＦＩＳＨ法とは異なる。プローブが標的配列にハイブリダイズするか非特異的部位に結合するかにかかわらず、ＨＣＲを開始することができるイニシエーター配列で受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブを使用するのではなく、本発明の方法は、意図された核酸標的配列、例えばｍＲＮＡ標的分子中の選択した標的配列にハイブリダイズした場合にのみ、ＨＣＲシグナル増幅を開始する本発明のプローブを使用する。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、我々が好ましくはＤＮＡからなる相互作用ヘアピンオリゴヌクレオチドプローブペアと称する相互作用ステムループオリゴヌクレオチドのペアを含み、プローブは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）方法により固定および透過処理されたサンプル中のＤＮＡ鎖またはｍＲＮＡ鎖などのＲＮＡ鎖であり得る、核酸標的鎖の標的配列に隣接してハイブリダイズする。
【0052】
ａ．本発明の相互作用ヘアピンプローブペアおよびそれらの相互作用
本発明に係る相互作用ヘアピンプローブペアの実施形態およびそれらの相互作用の概略フローチャートを図３Ａに示す。プローブヘアは、我々が「アーム供与ビーコン」と称することもある、第１の「アーム供与ヘアピンプローブ」３１を含む。プローブ３１は、ステムｅ－ｅ’および標的核酸分子３０の標的配列ＴＳ３に相補的である一本鎖ループ配列Ｐ３を有するステムループオリゴヌクレオチドである。ステムのハイブリダイズするアームの一つである「供与アーム」は、末端の、一本鎖伸長ｆ’を含む。プローブペアはまた、第２の「アーム受容体ヘアピンプローブ」３２を含む。プローブ３２は、ステムｆ－ｆ’および一本鎖ロープ配列ｇ’を有するステムループオリゴヌクレオチドである。ステムのアームの一つは、末端標的相補配列Ｐ４を含み、示される実施形態においては、トーホールド配列ｅも含む、一本鎖伸長を含む。
本発明に係る相互作用ヘアピンプローブペアの実施形態およびそれらの相互作用の概略フローチャートを図３Ａに示す。プローブヘアは、我々が「アーム供与ビーコン」と称することもある、第１の「アーム供与ヘアピンプローブ」３１を含む。プローブ３１は、ステムｅ－ｅ’および標的核酸分子３０の標的配列ＴＳ３に相補的である一本鎖ループ配列Ｐ３を有するステムループオリゴヌクレオチドである。ステムのハイブリダイズするアームの一つである「供与アーム」は、末端の、一本鎖伸長ｆ’を含む。プローブペアはまた、第２の「アーム受容体ヘアピンプローブ」３２を含む。プローブ３２は、ステムｆ－ｆ’および一本鎖ロープ配列ｇ’を有するステムループオリゴヌクレオチドである。ステムのアームの一つは、末端標的相補配列Ｐ４を含み、示される実施形態においては、トーホールド配列ｅも含む、一本鎖伸長を含む。
【0053】
本発明に係るｓｍ－ＦＩＳＨ方法は、標的配列を含む標的分子を含む、または含むと疑われる細胞のサンプル中の標的配列を検出する工程を含む：
ａ）サンプル中の細胞を固定および透過処理すること；
ｂ）固定および透過処理した細胞を洗浄すること；
ｃ）洗浄した細胞を含むサンプルを本発明に係る相互作用ヘアピンプローブペアの少なくとも一つとインキュベートすること；
ｄ）必須ではないが好ましくは、インキュベートした細胞を洗浄して、ハイブリダイゼーションしなかったプローブを除去すること；
ｅ）ｃ）工程後または、もし含む場合、ｄ）工程後、重合試薬を添加し、インキュベートして、増幅産物を生成すること、前記重合試薬は、ＨＣＲシグナル増幅用として、少なくとも１つのペアの蛍光色素分子標識ＨＣＲモノマー、またはＲＣＡシグナル増幅用として、少なくとも１つの環状ＤＮＡテンプレートおよびＤＮＡポリメラーゼを含む；
ｆ）過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーまたは過剰（未使用）ＲＣＡ環状テンプレートを洗い流すこと；
ｇ）ＲＣＡシグナル増幅用として、各標的配列用の蛍光色素分子標識検出プローブを添加し、インキュベートして、その後洗浄により過剰検出プローブを除去すること；
ｈ）顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより前記細胞における蛍光を検出すること。
ａ）サンプル中の細胞を固定および透過処理すること；
ｂ）固定および透過処理した細胞を洗浄すること；
ｃ）洗浄した細胞を含むサンプルを本発明に係る相互作用ヘアピンプローブペアの少なくとも一つとインキュベートすること；
ｄ）必須ではないが好ましくは、インキュベートした細胞を洗浄して、ハイブリダイゼーションしなかったプローブを除去すること；
ｅ）ｃ）工程後または、もし含む場合、ｄ）工程後、重合試薬を添加し、インキュベートして、増幅産物を生成すること、前記重合試薬は、ＨＣＲシグナル増幅用として、少なくとも１つのペアの蛍光色素分子標識ＨＣＲモノマー、またはＲＣＡシグナル増幅用として、少なくとも１つの環状ＤＮＡテンプレートおよびＤＮＡポリメラーゼを含む；
ｆ）過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドモノマーまたは過剰（未使用）ＲＣＡ環状テンプレートを洗い流すこと；
ｇ）ＲＣＡシグナル増幅用として、各標的配列用の蛍光色素分子標識検出プローブを添加し、インキュベートして、その後洗浄により過剰検出プローブを除去すること；
ｈ）顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより前記細胞における蛍光を検出すること。
【0054】
図３に示す相互作用プローブペアは、以下のように機能する。固定および透過処理した細胞を含むサンプルを図３Ａの第２の図に示すように、プローブペア３１、３２とインキュベートする場合、プローブペアはまず、それらの標的相補配列、ここではループ配列Ｐ３および伸長配列Ｐ４により標的配列ＴＳ３にハイブリダイズする。本発明に係る相互作用プローブペアのプローブ、ここではプローブ３１、３２は、「隣接して」ハイブリダイズする、すなわちお互いに十分に近接しており、図３Ａの真ん中の図に示すように、それらの相互作用を可能にする。「隣接して」に関して、我々は、本発明に係る相互作用プローブペアの標的相補配列（または「プローブ配列」）、ここではプローブ配列Ｐ３およびＰ４は、それらの間にいかなるギャップもなく、またはそれらの意図した相互作用を依然として可能にするそれらの間の小さなギャップのみ、好ましくは多くて４～５ヌクレオチドのギャップで、ハイブリダイズすることを意味する。ループ配列Ｐ３のハイブリダイゼーションは、プローブ３１のステムｅ－ｅ’を開き、これにより供与アームｅ’、ｆ’は、一本鎖となる。伸長Ｐ４のハイブリダイゼーションは、プローブ３２のステムｆ’－ｆを開かない。図３Ａの真ん中の図に示すように、標的に結合した後、ハイブリダイズして開いたプローブ３１は、ハイブリダイズしたプローブ３２と相互作用する。図３Ａに示す実施形態において、プローブ３１のアーム配列ｅ’は、ハイブリダイズしたプローブ３２のトーホールド配列ｅにハイブリダイズして、ハイブリッドｅ’－ｅを形成する。鎖置換により、ハイブリッドｅ’－ｅは、伸長し、それによりプローブ３２のステムｆ’－ｆを開き、ループ配列ｇ’およびアームｆ’を含む配列を３’末端一本鎖配列ｇ’、ｆ’とし、これらは共にＨＣＲイニシエーター配列Ｉ３を形成する。
【0055】
ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチド（ＨＣＲモノマー）のペア、すなわち蛍光色素分子標識ヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４を図３Ｂに示す。モノマーＨ３は、「トーホールド配列」として知られる一本鎖３’末端配列ｇ、ならびにステムｆ－ｆ’（ハイブリダイズしたアーム配列ｆおよびｆ’を含む）および一本鎖ループ配列ｈ’を含むステムループヘアピンを含む。トーホールド配列ｇは、ステムアームｆの一本鎖伸長である。順序において、Ｈ３の４つの配列は、３’－ｇ－ｆ－ｈ’－ｆ’－５’である。モノマーＨ４は、一本鎖末端トーホールド配列ｈ、ならびにステムｆ’－ｆ（ハイブリダイズしたアーム配列ｆ’およびｆを含む）および一本鎖ループ配列ｇ’を含むステムループヘアピンを含む。順序において、４つの配列は、５’－ｈ－ｆ－ｇ’－ｆ’－３’である。ＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４は、同じ蛍光色素分子Ｉで標識されている（その蛍光色素分子は、モノマーペアＨ１、Ｈ２およびモノマーペアＨ３、Ｈ４が同じ反応で使用された場合、図４に関連して以下で説明するように、モノマーペアＨ１、Ｈ２の蛍光色素分子は、モノマーペアＨ３、Ｈ４の蛍光色素分子とは異なる色であるということを反映して、中抜きの星として示す）。
【0056】
ＨＣＲシグナル増幅は、上述の方法によりイニシエーター配列Ｉ３を生成した後に実施される。プローブ３１および３２が相互作用して、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ３を生成した後、未結合のプローブを洗い流す。その後、ＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４を添加して、ハイブリダイズする条件下でサンプルとインキュベートする。遊離したイニシエーター配列Ｉ３の配列ｇ’（図３Ａ）は、ＨＣＲモノマーＨ３のトーホールド配列ｇにハイブリダイズし、鎖置換により伸長するハイブリッドを形成して、それによりＩ３イニシエーター配列ｆ’は、Ｈ３配列ｆにハイブリダイズして、ＨＣＲ重合を開始する。ハイブリダイゼーション条件下で不可逆である、このハイブリダイゼーションおよび鎖置換反応は、モノマーＨ３のステムｆ－ｆ’を分離し、その結果Ｈ３配列ｈ’、ｆ’は、示されるように一本鎖３’末端領域となり、Ｈ４モノマーのためのイニシエーター配列Ｉ４としての機能を果たすことができる。したがって、現在一本鎖であるＨ３配列ｈ’は、Ｈ４トーホールド配列ｈにハイブリダイズし、鎖置換により伸長されるハイブリッドを形成して、図１に関連して上記で説明した方法で、ＨＣＲ重合を継続する。同様にハイブリダイゼーション条件下で不可逆である、この第２のハイブリダイゼーションおよび鎖置換反応は、Ｈ４のステムｆ’－ｆを分離し、その結果Ｈ４配列ｇ’、ｆ’は、成長するポリマー鎖の末端で、オリジナルのイニシエーター配列Ｉ３と同じ一本鎖３’末端領域となり、モノマーユニットＨ３およびＨ４を除き図１に記載のものと同様のＨＣＲポリマーを生成する。未結合のＨ３およびＨ４モノマーは、洗浄により除去され、蛍光色素分子は、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより検出される。
【0057】
相互作用ヘアピンプローブ３１～３２は、ペアが標的配列ＴＳ３に隣接してハイブリダイズする場合に限り、ＨＣＲイニシエーター配列ｇ’、ｆ’（Ｉ３）を生成する。溶液中で遊離または非特異的に結合している場合、プローブ３１は、開かず、供与アームｅ’、ｆ’は、一本鎖の形態で存在せず、よってプローブ３２と相互作用できず、そのステムループ構造を維持する。したがって、イニシエーター配列ｇ’、ｆ’（Ｉ３）は、隔離される、すなわちＨＣＲ重合を開始するために必要な一本鎖の形態にはならない。まずプローブ３１は、構造および機能において未標識分子ビーコンプローブのようなものであり、両方とも公知である。例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：４９－５３；およびＢｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：６１７１－６１７６を参照。プローブ３１は、意図した（正しい）標的配列ＴＳ３に対して極めて特異的である。ミスマッチ耐性、すなわち標的配列ＴＳ３がループＰ３に対して１つまたは２つのミスマッチヌクレオチドを含む場合でも、ハイブリダイズして開くように設計することができる、またはアレルを認識するように、すなわちループＰ３が完全に相補的な標的配列ＴＳ３にハイブリダイズする場合には、ハイブリダイズして開くが、標的配列ＴＳ３がループＰ３に対して単一のミスマッチヌクレオチドを含む場合、または非特異的に結合する場合には、開かないように設計することができる。したがって、本発明の方法を用いて、（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む標的配列のような）標的配列中の複数の密接に関連しているアレルのたった一つからＨＣＲシグナル増幅を開始することができる。開いたプローブ３１に隣接してハイブリダイズしない限り、プローブ３２は、開かず、一本鎖イニシエーター配列Ｉ３を生成しないであろう。よって、プローブ３２は、分子ビーコンタイプではなく、結果として標的配列３０のミスマッチ配列または細胞マトリクスのいずれかにハイブリダイズするように、リニア配列Ｐ４を介して非特異的に結合しやすいにもかかわらず、プローブ３２は、開かされて一本鎖配列Ｉ３を生成するために、開いたプローブ３１に隣接してハイブリダイズしなければならないということにより、開かないであろう。よって、第１のプローブが正しくハイブリダイズするかぎり、および第２のプローブがそれに隣接してハイブリダイズする限り（これは正しくハイブリダイズすることを意味する）、一本鎖ＨＣＲイニシエーター配列を生じるであろう。溶液中にあるまたは非特異的に結合したプローブ３２のコピーは、ＨＣＲモノマーＨ３、Ｈ４のＨＣＲ増幅を開始できず、したがってバックグラウンドの生成の原因とならないであろう。したがって、本発明に係る方法は、プローブハイブリダイゼーションおよびＨＣＲ増幅の間に洗浄工程を有さない実施形態でさえ、バックグラウンドが低いであろう。しかし、ステムハイブリッドは、動的（ｄｙｎａｍｉｃ）であり、「呼吸（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」を受けるため、非常に稀に溶液中のプローブ３１のコピーが簡単に開き、プローブ３２のコピーと接触して、ＨＣＲ増幅を引き起こす可能性がある。その可能性を防ぐために、本発明の方法の好ましい実施形態は、低レベルのバックグラウンドシグナルでさえ発生することに対する予防策として、モノマーＨ３、Ｈ４の添加の前に洗浄工程を含む。
【0058】
上記の設計において、アーム供与ビーコン３１のプローブ配列は、ヘアピンの２つのアームに結合しており、これは、上述のとおり、プローブにより高い特異性を付与する。一方、アーム受容体プローブ３２のプローブ配列は、末端配列である。ユーザーがこのプローブにもより高い特異性を付与したい場合は、ヘアピン形成アーム配列をプローブ配列Ｐ４に向かって付加することができる。例えば、図３のプローブ３２を参照すると、配列ｅ’は、プローブの５’末端に付加されるであろう。この追加により、フリープローブ３２は、２つのヘアピンｆ’、ｇ、ｆおよびｅ、Ｐ４、ｅ’を含むであろう。標的に結合すると、後者のヘアピンは、解かれて、トーホールド配列ｅを一本鎖にするであろう。上記のように、その後の鎖置換およびイニシエーターの暴露（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ）が起こるであろう。この変更は、フリープローブがお互いに相互作用しないことをさらに保証するであろう。
【0059】
以下の実施例において、我々は、既定の標的配列のために、ＨＣＲイニシエーター配列を生成する単一の相互作用プローブペアを用いる成功したｓｍ－ＦＩＳＨ検出を示す。プローブペアのセットは、異なるプローブペアが標的配列の異なる場所でハイブリダイズし、同じイニシエーターを生成し、ＨＣＲモノマーの同じペアでＨＣＲ重合化を開始してより強い蛍光シグナルを生成することができるように、両方のプローブの標的配列相補配列を変更することで作製できる。
【0060】
ｂ．２つの密接に関連するアレルのための２つの本発明に係る相互作用プローブペア
本発明の特定の実施形態は、存在する場合は２つの密接に関連するアレルの両方、もしくは標的配列バリアントのいずれかを検出、または検出および定量化する方法を含む。アレル間の変異は、１つ以上のヌクレオチドの置換、削除、または挿入を含むことができる。変異は、スプライス変異も含むことができる。好ましくは、標的配列の変異は、アーム供与プローブの結合領域内に含まれるが、アーム供与プローブおよびアーム受容体プローブの両方の結合領域に及ぶより長い変異も検出することができる。検出および定量化は、単一分子の感度および分解能を実現できる。２つの密接に関連するアレルの１つ、または存在する場合はその両方の検出は、相互作用ヘアピンプローブペアの２つおよび異なる標識ＨＣＲモノマーのペアの２つを使用し、各アレルのための一つのプローブペアおよび一つのモノマーペアは、図４に図式化して示される。図４は、各プローブペアに１つずつ、２つの並列フローチャートを示す。
本発明の特定の実施形態は、存在する場合は２つの密接に関連するアレルの両方、もしくは標的配列バリアントのいずれかを検出、または検出および定量化する方法を含む。アレル間の変異は、１つ以上のヌクレオチドの置換、削除、または挿入を含むことができる。変異は、スプライス変異も含むことができる。好ましくは、標的配列の変異は、アーム供与プローブの結合領域内に含まれるが、アーム供与プローブおよびアーム受容体プローブの両方の結合領域に及ぶより長い変異も検出することができる。検出および定量化は、単一分子の感度および分解能を実現できる。２つの密接に関連するアレルの１つ、または存在する場合はその両方の検出は、相互作用ヘアピンプローブペアの２つおよび異なる標識ＨＣＲモノマーのペアの２つを使用し、各アレルのための一つのプローブペアおよび一つのモノマーペアは、図４に図式化して示される。図４は、各プローブペアに１つずつ、２つの並列フローチャートを示す。
【0061】
図４は、２つの異なる核酸標的分子を示し、それらは密接に関連するアレル変異である。標的分子４１は、第１の標的配列変異を含み、これを説明のために我々は、野生型標的配列変異ＷＴＴＳと称する。標的分子４６は、第２の標的配列変異を含み、これを説明の目的のために我々は、突然変異型標的配列変異ＭＴＴＳと称する。標的配列変異は、単一ヌクレオチド置換によって異なる密接に関連するアレルである。標的配列変異ＷＴＴＳは、白丸（〇）４３として表される野生型ヌクレオチドを有し、標的配列ＭＴＴＳは、黒丸（λ）４５によって表される置換された変異ヌクレオチドを有する。標的配列変異ＷＴＴＳおよびＭＴＴＳ、並びに標的鎖４１および４６は、それ以外の点では同一である。出発のサンプルは、鎖４１および４６のいずれか、またはその両方を含むことができる。
【0062】
溶液中に遊離して存在する相互作用プローブの２つのペア：アーム供与ヘアピンプローブ４８およびアーム受容体プローブ４７を含むペアならびにアーム受容体プローブ４９およびアーム受容体プローブ５０を含むペアを図４の一番上の図に示す。説明の目的のために、左側の４８および４７の相互作用プローブペアを破線で描き、一方右側の４９および５０の相互作用プローブペアを実線で描く。最初に後者のペアを考慮すると、プローブ４９および５０は、それぞれ図３Ａのプローブ３１および３２の構造を有し、それらは、２つの図において同じラベルが付けられている。標的配列ＭＴＴＳ（図４の右側の中央の図）に隣接してハイブリダイズした場合のそれらの相互作用は、イニシエーター配列Ｉ３（図４の右側の一番下の図）を解放する。イニシエーターＩ３は、図３Ａおよび３Ｂに関連して上述したように、ＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４（図３Ｂ）のＨＣＲ重合を開始する。ＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４は、同じ蛍光色素分子Ｉで単一標識されている。プローブ４９のループＰ３は、標的配列変異ＭＴＴＳと完全に相補的である。それは、ヌクレオチド４４（黒丸λ）を含み、標的鎖４６の標的配列ＭＴＴＳのヌクレオチド４５（黒丸λ）に相補的であるが、鎖４１の標的配列ＷＴＴＳのヌクレオチド４３（白丸）にミスマッチである。我々は、ヌクレオチド４２および４４のそれぞれを「問い合わせヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」と称することがある。アーム供与プローブ４９は、アレルを認識する：標的配列ＭＴＴＳにハイブリダイズすると開くが、標的配列ＷＴＴＳと接触、または非特異的に結合した場合、ハイブリダイズせず、開くこともない。
【0063】
プローブペア４８および４７に目を向けると、アーム供与ヘアピンプローブ４８は、アレル識別性のステムループオリゴヌクレオチドである。その標的配列相補ループＰ５は、標的配列変異ＷＴＴＳに完全に相補的である。それは、標的鎖４１の標的配列ＷＴＴＳのヌクレオチド４３（白丸〇）に相補的である、ヌクレオチド４２（白丸〇）を含むが、標的配列４６のヌクレオチド４５（黒丸λ）とはミスマッチである。プローブ４８はまた、ステムｄ－ｄ’を含む。ステムアームｄ’である供与アームは、末端の一本鎖伸長ｂ’を含む。プローブ４７は、「アーム受容体ヘアピン」プローブ、すなわちステムｂ’－ｂおよび一本鎖ループ配列ａ’を有するステムループオリゴヌクレオチドである。ステムのアームの一つ、ここでは３’アームｂは、標的相補配列（または領域）Ｐ６を含み、描かれた実施形態において、トーホールド配列ｄも含む一本鎖伸長を含む。標的配列ＷＴＴＳに隣接してハイブリダイズした場合のプローブ４７，４８（図４の左側中央の図）の相互作用は、イニシエーター配列Ｉ１を自由にする（図４の左側一番下の図）。イニシエーター配列Ｉ１は、図１に関連して上述したように、ＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２のＨＣＲ重合を開始する。ＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２は、同じ蛍光色素分子Ｏで単一標識され、これはＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４を標識するのに使用した蛍光色素分子Ｉの色とは異なる色を有する。アーム供与プローブ４８は、アレル認識性である：それは標的配列ＷＴＴＳにハイブリダイズした場合に開くが、標的配列ＭＴＴＳと接触、または非特異的に結合した場合、ハイブリダイズせず、開くこともない。
【0064】
各供与ビーコンプローブの供与アームがその相補的なアームよりも長いことに留意することが重要である。例えば、プローブ４９の５’アームは、５’アームがステム要素である配列ｅ’に加えて配列要素ｆ’を含むので、その３’アームよりも長い。プローブ４９が図４の右側中央の図に示すように、標的配列ＭＴＴＳにうまく結合すると、配列要素ｅ’（トーホールド相補体）が自由になり（ステムにおいてハイブリダイズせず）、図４の右側中央の図に示すように、プローブ５０の配列要素ｅ（トーホールド）に結合する態勢となり、その後プローブ５０の配列要素ｆ’に取って代わり、配列ｇ’およびｆ’を含む一本鎖イニシエーターＩ３を生成する（図４右側一番下の図）。プローブ４８が標的ＷＴＴＳにうまく結合すると、配列要素ｄ’（トーホールド相補体）が自由になり、図４の左側中央の図に示すように、プローブ４７の配列要素ｄ（トーホールド）に結合する態勢となり、その後プローブ４７の配列要素ｂ’に取って代わり、配列ａ’およびｂ’を含む一本鎖イニシエーターＩ１を生成する。
【0065】
単一のアッセイで標的配列変異ＷＴＴＳおよびＭＴＴＳのいずれかまたは両方を検出できるように、２つの相互作用プローブペアの４つのプローブすべてを、ハイブリダイゼーション反応において、固定および透過処理した細胞を含むサンプルと同時にインキュベートするが、図４の真ん中の図に示すように、４つのプローブのうち３つのみが既定の標的配列変異、ここではＷＴＴＳまたはＭＴＴＳのいずれかに結合する。右側の受容体プローブ５０および左側の受容体プローブ４７の両方は、両方のアレル標的配列変異に常に結合するが、供与ビーコンの１つだけがそれらの間で結合する。標的配列変異が野生型の場合（白丸〇で示される可変ヌクレオチド）、プローブ４８が結合し、標的配列変異が変異体の場合（黒丸λで示される可変ヌクレオチド）、プローブ４９が結合する。両方の標的配列変異がサンプルに存在する場合、プローブ４７、４９および５０は、標的配列変異ＭＴＴＳのコピーに結合し、プローブ４７、４８および５０は標的配列変異ＷＴＴＳのコピーに結合する。アーム受容体プローブ４７および５０は、サンプルに存在する場合、両方の標的配列変異に、単一ヌクレオチド変異領域の左および右に隣接して結合し、ここでアーム供与ヘアピンプローブ４８が結合し、アーム供与ヘアピンプローブ４９が結合する。
【0066】
ハイブリダイゼーションおよびプローブ４９、５０もしくはプローブ４８、４７または両方の間での相互作用を可能にするインキュベーションの後、どの標的配列または配列がサンプル中に存在するのによって決まるが、ハイブリダイズしなかったプローブを洗浄により除去し、ＨＣＲモノマーＨ３、Ｈ４、Ｈ１およびＨ２を添加すると、１つまたは２つのＨＣＲポリマーを生成する。重合後、非結合の（過剰な）ＨＣＲモノマーを洗浄により除去する。一本鎖イニシエーター配列Ｉ１（野生型標的配列ＷＴＴＳが存在する場合に生成される）のアベイラビリティは、ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１およびＨ２の重合を引き起こす（図１）。その増幅は、１色の蛍光シグナルを生成する（例えば、ＴＭＲ）。一方、一本鎖イニシエーター配列Ｉ３（変異標的配列ＭＴＴＳが存在する場合に生成される）のアベイラビリティは、ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４の重合を引き起こす（図３）。その増幅は、異なっていて、スペクトルとして区別できる色のシグナルを生成する（例えば、Ｃｙ５）。ＨＣＲ増幅後、２つの蛍光色素分子からの蛍光を顕微鏡検査またはフローサイトメトリーにより検出する。顕微鏡検査による検出において、増幅した蛍光シグナルを異なる色のスポットとして検出し、それにより１または両方のアレルの存在を異なる色のスポットの存在によって示し、各アレルでの標的鎖の相対存在量を２つの色のスポットの比率によって示す。どの供与ビーコンが野生型標的配列変異のために設計されているかは任意であり、ヌクレオチド４２および４４は、逆にすることができる。
【0067】
２つのプローブにおける関連する配列が相補的であるよりむしろ異なっている（プローブ４７の配列ｄおよびプローブ４９のｅ’は相補的ではなく、プローブ４７の配列ｂおよびプローブ４９のｆ’は相補的ではない）ので、アーム供与プローブ４９の標的配列ＭＴＴＳへの結合は、隣接してハイブリダイズしたアーム受容体プローブ４７のステムを開くことはない。プローブ４８は、プローブ４９がプローブ４７からのいかなる応答も引き出すことができないのと同じ理由で、プローブ５０からのいかなる応答を引き出すことができない。
【0068】
図５は、ハイブリダイゼーションおよびアーム受容体プローブ４７および５０からトーホールド配列を取り除き、アーム供与プローブ４８および４９からトーホールド相補配列を取り除くように変更した図４のプローブの相互作用を図式で示す。標的配列は、図４の記載と同じである。アーム受容体プローブ６０（図５）は、Ｐ４が続く一本鎖伸長ｅ（図４）ではなく一本鎖伸長Ｐ４を含む。トーホールド配列ｅをプローブ５０から取り除き、プローブ６０を作製している。同じことがアーム受容体プローブ５７にも当てはまり、一本鎖伸長は、Ｐ６に続く一本鎖伸長ｄ（図４）ではなく、Ｐ６である。トーホールド配列ｄは、取り除かれている。アーム供与プローブ５９は、供与アーム４９の供与アームｅ’、ｆ’（図４）の代わりに、供与アームｆ’を含む。トーホールド相補配列ｅ’をプローブ４９から取り除き、プローブ５９を作製している。同じことがアーム供与プローブ５８にも当てはまり、供与アームは、ｄ’、ｂ’（図４）ではなく、ｂ’である。トーホールド相補配列ｄ’をプローブ４８から取り除き、プローブ５８を作製している。
【0069】
プローブ４８（図４）において、ステム形成ヌクレオチドは、配列ｄおよびｄ’内のヌクレオチドであり、その両方がプローブ５８（図５）から削除されることが分かるであろう。図５に記載の実施形態において、ステムがプローブ５８においても形成できるように、プローブ５８の５’ステムアーム（ｂｓｕｂと呼ぶ）は、配列ｂの一部分に由来する。同じことがアーム供与プローブ５９にも当てはまり、配列ｅおよびｅ’は、取り除かれている。ステムがプローブ５９においても形成できるように、プローブ５９の３’ステム（ｆｓｕｂと呼ぶ）は、配列ｆの一部分に由来する。
【0070】
図５における相互作用プローブペアを用いてＨＣＲイニシエーター配列を生成する方法は、図４における相互作用プローブペアのための上記方法と同じであり、生成されるイニシエーター配列もまた同じである。図５の中央右側の図に示すように、アーム供与プローブ５９が標的配列ＭＴＴＳにハイブリダイズする場合、その解放された供与アーム（配列ｆ’）は、プローブ６０のステムアームｆと同じ長さである；トーホールド配列がない。我々は、それにもかかわらず、図５の一番下の右側の図に示すように、プローブ５９がプローブ６０と相互作用し、イニシエーターＩ３を遊離することを見出した。同様に、図５の中央左側の図に示すように、アーム供与プローブ５８が標的配列ＷＴＴＳにハイブリダイズする場合、その解放された供与アーム（配列ｂ’）は、プローブ５７のステムアームｂと同じ長さである；トーホールド配列がない。それにもかかわらず、図５の一番下の左側の図に示すように、プローブ５８は、プローブ５７と相互作用し、イニシエーターＩ１を遊離する。アーム供与ヘアピンプローブの供与アームにおけるトーホールド相補配列が２つの機能を果たし、プローブが溶液中で遊離している場合にヘアピン構造を維持し、標的に結合するとアーム受容体プローブと相互作用するという事実は、それにもかかわらず、非常に短い、または図５に示すように、０ｎｔのトーホールド相補セグメントを有するプローブ設計を可能にする。いかなるトーホールド配列を有さない相互作用ヘアピンプローブペアの設計を実施例に記載する。いかなるトーホールド配列を有さない相互作用ヘアピンプローブペアが十分に機能するという事実は、驚くべきことであり、本発明の態様である。
【0071】
ｃ．２つのマスクされたイニシエーター配列を暴露し、ＨＣＲモノマーの単一ペアからのＨＣＲシグナルを生成するアーム供与ビーコンプローブ
相互作用ヘアピンプローブシステムでのシグナルを増加するために、各標的配列のために、１つではなく２つのＨＣＲイニシエーター配列を暴露するプローブのセットを利用することが有利である。２つのイニシエーター配列は、同じＨＣＲモノマーペアから増幅を開始し、よって同じ色のシグナルを生成するであろう。このようなシステムの例を図６に示す。このシステムは、３つのプローブ、６１、６２および５０を含む２つの相互作用プローブペア（６２、６１および６２、５０）を含む（図６、一番上）。２つのプローブペアは、同じアーム供与プローブ６２を共有する。３つのプローブは、標的相補配列Ｐ６、Ｐ３およびＰ４を含み、これらは標的分子４６の標的配列ＭＴＴＳにハイブリダイズする。この実施形態において、標的配列は、変異配列であり得るが、そうである必要はないことが分かるであろう。図６の真ん中の図に示すように、３つのプローブは、標的配列上で隣接してハイブリダイズする。それらは、モノマーＨ３およびＨ４からのＨＣＲ増幅を開始するように設計される（図３Ｂ）。アーム供与ビーコン６２は、プローブが溶液中で遊離している場合、標的配列相補ループＰ３の両側に存在する配列要素ｅおよびｅ’の結合を介して分子間のステムを形成する。このプローブはまた、ステム要素ｅおよびｅ’の一本鎖伸長として配列要素ｆ’の２つのコピーを含む。プローブ６２のｅおよびｅ’がお互いに結合する一方、２つのコピーのｆ’配列は、お互いに結合または相互作用せず、一本鎖を維持する。図に記載の他のアーム供与ビーコンプローブとは異なり、アーム供与ビーコン６２は、その両側のそれぞれに位置する受容体ヘアピンプローブにそのアームの両方を提供することができる。図４に関連して上述したように、アーム受容体プローブ５０は、（３’から５’）配列要素ｆ’、ｇ’、ｆを含み、標的相補配列Ｐ４が続く。アーム受容体ヘアピン６１は、（３’から５’）標的相補配列Ｐ６、配列要素ｅ’、ｆ、ｈ’およびｆ’を含む。３つのプローブのハイブリダイゼーションは、アーム供与ビーコン６２のヘアピンステムｅ－ｅ’の分裂につながり、同時にプローブ６２の開いたステムアームｅとアーム受容体ヘアピン６１のトーホールド配列ｅ’との結合およびプローブ６２の開いたステムアームｅ’とアーム受容体ヘアピン５０のトーホールドｅとの結合の両方の可能性を生み出す（図６、真ん中）。これらの結合は、両方のアーム受容体プローブでの鎖置換につながる。アーム受容体プローブ５０での鎖置換は、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ３（ループｇ’およびアームｆ’）を一本鎖とする。アーム受容体プローブ６１での鎖置換は、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ４（ループｈ’およびアームｆ’）を一本鎖とする（図６、一番下）。解放されたイニシエーター配列Ｉ３は、ＨＣＲモノマーＨ３に始まるモノマーＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができ、解放されたイニシエーター配列Ｉ４は、ＨＣＲモノマーＨ４に始まるモノマーＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができる。両方の増幅反応は、基本的に同じ重合産物をもたらし、同じ色のシグナルを生成する。これは、３つのプローブの隣接した結合が２つの別の色の１つにおける増幅シグナルを生成する図４に記載のプローブのシステムとは対照的である。
相互作用ヘアピンプローブシステムでのシグナルを増加するために、各標的配列のために、１つではなく２つのＨＣＲイニシエーター配列を暴露するプローブのセットを利用することが有利である。２つのイニシエーター配列は、同じＨＣＲモノマーペアから増幅を開始し、よって同じ色のシグナルを生成するであろう。このようなシステムの例を図６に示す。このシステムは、３つのプローブ、６１、６２および５０を含む２つの相互作用プローブペア（６２、６１および６２、５０）を含む（図６、一番上）。２つのプローブペアは、同じアーム供与プローブ６２を共有する。３つのプローブは、標的相補配列Ｐ６、Ｐ３およびＰ４を含み、これらは標的分子４６の標的配列ＭＴＴＳにハイブリダイズする。この実施形態において、標的配列は、変異配列であり得るが、そうである必要はないことが分かるであろう。図６の真ん中の図に示すように、３つのプローブは、標的配列上で隣接してハイブリダイズする。それらは、モノマーＨ３およびＨ４からのＨＣＲ増幅を開始するように設計される（図３Ｂ）。アーム供与ビーコン６２は、プローブが溶液中で遊離している場合、標的配列相補ループＰ３の両側に存在する配列要素ｅおよびｅ’の結合を介して分子間のステムを形成する。このプローブはまた、ステム要素ｅおよびｅ’の一本鎖伸長として配列要素ｆ’の２つのコピーを含む。プローブ６２のｅおよびｅ’がお互いに結合する一方、２つのコピーのｆ’配列は、お互いに結合または相互作用せず、一本鎖を維持する。図に記載の他のアーム供与ビーコンプローブとは異なり、アーム供与ビーコン６２は、その両側のそれぞれに位置する受容体ヘアピンプローブにそのアームの両方を提供することができる。図４に関連して上述したように、アーム受容体プローブ５０は、（３’から５’）配列要素ｆ’、ｇ’、ｆを含み、標的相補配列Ｐ４が続く。アーム受容体ヘアピン６１は、（３’から５’）標的相補配列Ｐ６、配列要素ｅ’、ｆ、ｈ’およびｆ’を含む。３つのプローブのハイブリダイゼーションは、アーム供与ビーコン６２のヘアピンステムｅ－ｅ’の分裂につながり、同時にプローブ６２の開いたステムアームｅとアーム受容体ヘアピン６１のトーホールド配列ｅ’との結合およびプローブ６２の開いたステムアームｅ’とアーム受容体ヘアピン５０のトーホールドｅとの結合の両方の可能性を生み出す（図６、真ん中）。これらの結合は、両方のアーム受容体プローブでの鎖置換につながる。アーム受容体プローブ５０での鎖置換は、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ３（ループｇ’およびアームｆ’）を一本鎖とする。アーム受容体プローブ６１での鎖置換は、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ４（ループｈ’およびアームｆ’）を一本鎖とする（図６、一番下）。解放されたイニシエーター配列Ｉ３は、ＨＣＲモノマーＨ３に始まるモノマーＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができ、解放されたイニシエーター配列Ｉ４は、ＨＣＲモノマーＨ４に始まるモノマーＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができる。両方の増幅反応は、基本的に同じ重合産物をもたらし、同じ色のシグナルを生成する。これは、３つのプローブの隣接した結合が２つの別の色の１つにおける増幅シグナルを生成する図４に記載のプローブのシステムとは対照的である。
【0072】
ＲＣＡの開始のための相互作用ヘアピンプローブペア
受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブ（図２）がＲＣＡにおいて疑似シグナルを生成する傾向を克服するために、本発明の相互作用ヘアピンプローブペアは、ＨＣＲについて上述したのと同じ方法で展開することができる。本発明に係るＲＣＡを図７に示し、これはＲＣＡ実施形態の概略フローチャートを表す。分かりやすくするために、プローブ３１、３２（図３）の要素と共通である相互作用ヘアピンプローブ７１、７２の要素は、図３と同じ名称を付す。図７の他の要素は、図２の要素と共通であり、図２と同じ名称を付す。
受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブ（図２）がＲＣＡにおいて疑似シグナルを生成する傾向を克服するために、本発明の相互作用ヘアピンプローブペアは、ＨＣＲについて上述したのと同じ方法で展開することができる。本発明に係るＲＣＡを図７に示し、これはＲＣＡ実施形態の概略フローチャートを表す。分かりやすくするために、プローブ３１、３２（図３）の要素と共通である相互作用ヘアピンプローブ７１、７２の要素は、図３と同じ名称を付す。図７の他の要素は、図２の要素と共通であり、図２と同じ名称を付す。
【0073】
標的配列ＴＳ３および相互作用ヘアピンプローブペア７１、７２を含む標的分子３０を図７の最初の図に示す。アーム受容体プローブ７２は、ループｇ’およびステムアームｆ’を含むＨＣＲイニシエーターＩ３がループｊ’およびステムアームｉ’（ヘアピンステムｉ－ｉ’を形成する）を含むＲＣＡイニシエーター（プライマー）Ｉ５（図２）と置き換えられたことを除き、アーム受容体プローブ３２（図３）と同じである。アーム供与プローブ７１は、供与アームの一本鎖伸長ｆ’が一本鎖伸長ｉ’と置き換えられたことを除き、アーム供与プローブ３１（図３）と同じである。プローブハイブリダイゼーションおよび相互作用は、図３に関連して上述したように進行する。しかし、プローブペア７１、７２の相互作用は、ループ配列ｊ’およびアーム配列ｉ’を含む一本鎖ＲＣＡイニシエーター配列Ｉ５を開放する。イニシエーターＩ５は、その機能を図２に関連して上述したイニシエーターと同じである。Ｉ５は、環状テンプレートＣＴのためのプライミング配列である。ＤＮＡポリメラーゼによりＣＴをコピーしてポリマーＡＰを生成すること、蛍光色素分子（Ｏ）標識検出プローブＬＰのハイブリダイゼーション、および蛍光検出は、図２について説明したように進行する。簡単に述べると、図３に記載のシステムにおいて、相互作用ヘアピンプローブ３２は、遊離している場合、ハイブリダイゼーションにより重合を開始するイニシエーター配列Ｉ３を含むが、図７に記載のシステムにおいて、相互作用ヘアピンプローブ７２は、遊離している場合、ＲＣＡによる重合を開始するプライミング配列であるイニシエーター配列Ｉ５を含む。
【0074】
我々は、配列ｉ’がプローブ７１および７２の両方に存在することを強調する。その３’末端が解放されていない（配列ｅ’に結合している）ので、プローブ７１の配列ｉ’は、決してプライマーとしての機能を果たすことができない。プローブ７２の配列ｉ’は、標的配列の意図する隣接した部位にハイブリダイズした場合、２つの相互作用ヘアピンプローブの相互作用によってのみ、環状テンプレートＣＴに結合することができる。ＤＮＡポリメラーゼが添加された場合に残っているプローブ７２の遊離のまたは非特異的に結合したコピーは、それら自体の３’末端を伸長し（プローブ７２構造を参照）、さらに疑似シグナルを生成する可能性を減少することができるので、標的結合プローブの相互作用のみがＲＣＡを開始することができる。したがって、我々の好ましい方法は、増幅試薬の添加の前に未結合の相互作用プローブを除く洗浄工程を含むけれども、そのような洗浄工程を削除することができる。ＲＣＡ産物ＡＰは、図２に関連して上述したように、検出される。シグナルをさらに増幅するために、複数のペアの相互作用プローブを単一の標的配列のために使用することができ、すべては、同じイニシエーター配列を生成し、各ペアは、同じ環状テンプレートからのＲＣＡシグナルを生成するであろう。また、異なる標的の多重検出およびＲＣＡシグナル増幅を実施するために、各ターゲット用に異なる環状化した標的のための異なるイニシエーター配列を生成する異なる相互作用ヘアピンプローブペアおよび異なる色で標識された異なる検出プローブを使用することができる。
【0075】
相互作用ヘアピンプローブの設計および構築
本発明のヘアピンプローブにおけるさまざまな要素の長さおよび配列のいくつかの態様は、比較的フレキシブルである一方、他の態様は、比較的制約されている。
本発明のヘアピンプローブにおけるさまざまな要素の長さおよび配列のいくつかの態様は、比較的フレキシブルである一方、他の態様は、比較的制約されている。
【0076】
アーム供与プローブのループ配列は、意図する標的配列に相補的である（いくつかの実施形態では複数のアレル変異を含み、他の実施形態では１つの変異を除くすべてを除外する）が、サンプルに存在し得る他の非標的配列に相補的ではないように設計される。ループは、必要な特異性を確保するのに十分な長さに設計される。供与アームは、溶液中で遊離または非特異的に結合している場合、そのヘアピン構造を維持するのに十分な数のヌクレオチドを含まねばならない。さらに、ミスマッチ耐性であろうとアレル特異的であろうと、ループがその意図する標的配列に結合する場合には、ステムが開く（解離する）必要があるが、非特異的に結合する場合には、そうではない。これは、本技術分野内である公知の分子ビーコンプローブ構造である。アーム供与プローブのヘアピンがアレルを認識する場合、そのループの長さは、アレル変異、特に単一ヌクレオチド変異（ＳＮＰ）を拒絶する必要性により制約されるため、通常１０～２５ヌクレオチド長の範囲である。以下の実施例では、ループ長／ステム長の組み合わせは、ヌクレオチド単位で、ＨＣＲに関して、１５／６、１２／６、１１／６、９／６（不十分）、および２０／１１であった。実施例６は、ＲＣＡに関して、２５／５の組み合わせを示す。供与アームが比較的不可逆に相互作用できるように、アーム供与プローブの供与アームは、アーム受容体プローブの１つのステムアームと相互作用して、アーム供与プローブのステムよりも強いハイブリッドを形成する必要がある。供与アームは、その要件を達成するために、いくつかのヌクレオチドの一本鎖伸長を有する。以下の実施例において、供与アーム伸長の長さは、ヌクレオチド単位で、１２、１７、および１８であった。
【0077】
ＨＣＲシグナル増幅を含む実施形態に関して、アーム受容体プローブのループおよびステムの長さおよび配列は、プローブの相互作用によって遊離すると、ループおよび１つのステムアームがＨＣＲイニシエーター配列を含むため、ＨＣＲモノマーの選択によって決まる。同様に、ＲＣＡシグナル増幅を含む実施形態に関して、アーム受容体プローブのループおよびステムの長さおよび配列は、環状テンプレートの選択によって決まる。アーム受容体プローブは、溶液中で遊離している場合、そのヘアピン構成を維持する必要があり、プローブがその標的配列に正しくまたは非特異的にハイブリダイズする場合、開かないようにする必要がある。アーム供与プローブと比較すると、そのループは、一般的により短く、そのステムは、一般的により長い。以下の実施例では、アーム受容体プローブのループ長／ステム長の組み合わせは、ヌクレオチド単位で、ＨＣＲに関しては８／１８であった。実施例６は、ＲＣＡに関して６／２０の組み合わせを記載する。アーム受容体プローブのヘアピンの１つのアームは、ステム形成ヌクレオチドに加えて、標的相補配列を含む一本鎖伸長を有し、特定の実施形態では、アーム供与プローブの供与アームのステム形成配列に相補的であるトーホールド配列も有する。標的相補セグメントの長さは、例えば１５から５０ヌクレオチドまで、非常に大きく異なる。以下の実施例では、アーム受容体プローブの標的相補セグメントは、ヌクレオチド単位で、ＨＣＲ関しては１９、２０、２２または２４であった。実施例６は、ＲＣＡに関して２２ヌクレオチドの長さを記載する。
【0078】
トーホールド配列（およびアーム供与プローブにおけるその相補体）の長さは、アレル識別の特異性に大きな影響を与える：トーホールド配列が短いほど、プローブはより識別力がある。３～１１ヌクレオチド長のトーホールド配列を有するアーム受容体プローブは、一般的な標的検出プローブとして十分に機能する。しかし、アレル識別の実施形態において、より好ましいアレル識別は、より小さなトーホールド配列で達成され、我々が発見したように、最良のアレル識別は、０ヌクレオチドのトーホールド配列により発揮される。以下の実施例では、ＨＣＲ開始に関して、一本鎖伸長の長さは、ヌクレオチド単位で、０－ｎｔのトーホールドに１９、２０、または２２の標的相補的ヌクレオチドを加えたもの；５－ｎｔのトーホールドに２２の標的相補ヌクレオチドを加えたもの；および１４－ｎｔのトーホールドに２４の標的相補ヌクレオチドを加えたものであった。その一本鎖伸長が２２の標的相補ヌクレオチドと、さらに５－ｎｔの長さのトーホールド配列とを含むアーム受容体プローブをＲＣＡ開始に関して記載する。
【0079】
トーホールド配列がある場合、アーム供与プローブのステム部分は、アーム受容体プローブのトーホールド配列に相補的である。実施例３に記載の第１のプローブペアにおいて、アーム受容体プローブのトーホールド配列は、５ｎｔ長であったが、アーム供与プローブのステムは、６ｎｔ長であった。その違いに対応するために、一本鎖伸長は、１８ヌクレオチド（アーム受容体プローブの１８ｎｔ長ステムアームに完全に相補的である）から１７ヌクレオチドへと削減され、アーム供与プローブのステムの末端ヌクレオチドが１８番目のヌクレオチドを提供した。したがって、５’アームのステム形成配列は、必要に応じてトーホールド配列に相補的であるが、１ヌクレオチドより長く、一本鎖伸長は、１ヌクレオチド短いが、アーム受容体プローブにおけるその相補体に相補的である。トーホールド配列がない場合、ステム形成ヌクレオチドおよび一本鎖伸長を含む、ビーコンプローブの供与アームは、アーム受容体プローブのステムと同じ長さである。
【0080】
相互作用ヘアピンプローブペアの各プローブの一部は、標的配列に特異的であり、各プローブのその他の部分は、汎用であり、多くの異なる標的配列のために異なるプローブペアで使用することができる。図３を参照すると、例えばアーム受容体プローブ３２において、ヘアピンステムループおよびトーホールド配列（ｆ’－ｇ’－ｆ－ｅ）は、汎用部分である。標的相補配列Ｐ４のみが標的特異的である。同様に、アーム供与プローブ３１において、ループＰ３のみが標的特異的である。上記実施形態において、プローブの汎用部分は、ＤＮＡ分子などの連続する一本鎖核酸分子の一部である。本発明の態様は、相互作用ヘアピンプローブの汎用部分および標的特異的部分が非ホスホジエステル結合を介して互いに連結でき、プローブが標的依存的な方法でＨＣＲまたはＲＣＡからの増幅したシグナルの生成において依然として十分に機能することである。例えば、プローブの汎用部分は、クリックケミストリーを介して標的特異的部分に結合することができる（Ｂａｓｋｉｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４（４３）：１６７９３－１６７９７）。２つのコンポーネントを結合させる他の方法は、当業者には明らかであろう。この方法における汎用部分の標的特異的部分への結合は、比較的長い汎用部分を繰り返し合成する必要がなく、比較的短い標的特異的部分のみを異なる標的配列ごとに合成する必要があるため、プローブ合成の大幅なコスト削減を可能にする。
【0081】
ハイブリダイゼーションの手順の特別な調整が本発明のプローブを用いたＤＮＡ標的の検出のために必要である。細胞ＤＮＡは、二本鎖であるため、ハイブリダイゼーションのためのプローブには容易にアクセスすることができない。そのようなＤＮＡ標的配列へのアクセスを可能にするために、固定および透過処理した細胞は、変性剤の存在下で熱処理される（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１７００８－１７０１３）。例えば、２Ｘ ＳＳＣおよび７０％ホルムアミドの存在下、８０℃で１０分間、細胞をインキュベートすると、ゲノムＤＮＡが十分に変性し、通常の条件下、本発明の相互作用プローブペアを含む、オリゴヌクレオチドプローブとのその後のハイブリダイゼーションが可能になる。加えて、ＤＮＡ標的から転写されて細胞内に存在する任意のＲＮＡ種がＤＮＡ標的からの蛍光シグナルを不明瞭にしないように、細胞ＲＮＡは、相互作用ヘアピンププローブを添加する前に、リボヌクレアーゼＡでの前処理によって、除去することができる。通常、非反復核ＤＮＡ標的配列は、既定の細胞核の２つのコピー（各染色体に１つ）にのみ存在するであろう。したがって、２つのスポットのみが相互作用ヘアピンプローブの各セットによって生成され、それらは核内に位置する。ＤＮＡ標的の検出のための追加の検討事項は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが相互作用ＤＮＡプローブペアおよびＲＮＡ標的配列の間で形成されるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりもわずかに安定性が低いため、標的配列がＤＮＡである場合、プローブペアの標的相補セグメントが一般的に比較的長くなることである。
【0082】
実施例の説明
実施例１は、固定、透過処理した細胞におけるＲＮＡ標的配列およびＨＣＲ増幅の検出が本発明に係る相互作用ＤＮＡヘアピンプローブの単一ペアを用いて開始された場合に得られた、またはＨＣＲが図１に示すタイプの単一の受動的にタグ付けされたＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて開始された場合に得られた標的配列特異的なシグナルのレベルおよびバックグラウンドシグナルのレベルを比較する。ヘアピンプローブペアの構造は、図５に示すプローブ５９および６９のようなトーホールド配列がないことを除き、図３におけるプローブ３１および３２として一般的に示されている。我々は、いくつかの分析を行った。第１の分析において、我々は、ハイブリダイゼーションプローブのためのＧＦＰ標的配列を含む、ＧＦＰを発現するようにトランスフェクトされた細胞を顕微鏡で撮影し、また我々は、同じプローブおよびＨＣＲ増幅を受けた非トランスフェクト細胞を撮影した。代表的な画像を図８に示す。Ｃｙ５チャンネルに現れる蛍光スポットは、Ｃｙ５でタグ付けされたＨＣＲポリマーからであった。細胞境界内のスポットを上述のアルゴリズムを用いてカウントした（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７－８７９）。図８の左の４つのパネルは、ＧＦＰテンプレートでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に関し、右の４つのパネルは、このテンプレートでトランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞に関する。左端の２つのパネルのそれぞれの１つの細胞は、ＧＦＰチャンネルにおける蛍光を示し、これら２つの細胞がテンプレートプラスミドでトランスフェクトされたことを示している（トランスフェクションは一部の細胞で発生し、他の細胞では発生しない）。同じセットの細胞をＣｙ５チャンネルで見ると（左から２列目のパネル）、ＨＣＲシグナルが見られる。相互作用ヘアピンプローブによる検出およびシグナル増幅に対応する、下のパネルにおいて、Ｃｙ５シグナルは、トランスフェクト細胞でのみ見られる。受動的にタグ付けされたプローブによる検出およびシグナル増幅に対応する、上のパネルにおいて、トランスフェクト細胞は、前のケースで起こったように、強いシグナルを示す。しかし、前のケースとは異なり、いくつかのスポットがＧＦＰ蛍光を全く示さない（トランスフェクトされていない）細胞で見られる。これらのシグナルは、潜在的にバックグラウンドまたは偽陽性シグナルを表す。バックグラウンドの分析のために非トランスフェクト細胞のみを考慮することを完全に確認するために、我々はまた、ＧＦＰテンプレートでトランスフェクトされなかったＨｅＬａ細胞を撮影した。これらの細胞をフルオレセインチャンネルで見ると、わずかな自己蛍光のみがすべての細胞で観察される（左から３列目のパネル）。しかし、これらの細胞をＣｙ５チャンネルで見た場合（一番右のパネル）、すべてのスポットは、非特異的なソースからであろう。右下のパネルの画像は、フィールド全体での一つのスポットを明らかにするために、より高いコントラストで表される。下のパネルは、目に見える８つの細胞の１つにおけるただ１つのスポットを示すが、上のパネルでは、約１３のスポットが合計たった５つの細胞において見られる。これらの観察結果は、異なるプローブシステムにおける標的特異的なシグナルの大きさは、ほぼ同じであるが、バックグラウンドシグナルの大きさは、ＨＣＲが受動的にタグ付けされたプローブにより開始された場合、ＨＣＲが相互作用ヘアピンプローブペアにより開始された場合よりも高いことを示す。
実施例１は、固定、透過処理した細胞におけるＲＮＡ標的配列およびＨＣＲ増幅の検出が本発明に係る相互作用ＤＮＡヘアピンプローブの単一ペアを用いて開始された場合に得られた、またはＨＣＲが図１に示すタイプの単一の受動的にタグ付けされたＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて開始された場合に得られた標的配列特異的なシグナルのレベルおよびバックグラウンドシグナルのレベルを比較する。ヘアピンプローブペアの構造は、図５に示すプローブ５９および６９のようなトーホールド配列がないことを除き、図３におけるプローブ３１および３２として一般的に示されている。我々は、いくつかの分析を行った。第１の分析において、我々は、ハイブリダイゼーションプローブのためのＧＦＰ標的配列を含む、ＧＦＰを発現するようにトランスフェクトされた細胞を顕微鏡で撮影し、また我々は、同じプローブおよびＨＣＲ増幅を受けた非トランスフェクト細胞を撮影した。代表的な画像を図８に示す。Ｃｙ５チャンネルに現れる蛍光スポットは、Ｃｙ５でタグ付けされたＨＣＲポリマーからであった。細胞境界内のスポットを上述のアルゴリズムを用いてカウントした（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７－８７９）。図８の左の４つのパネルは、ＧＦＰテンプレートでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞に関し、右の４つのパネルは、このテンプレートでトランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞に関する。左端の２つのパネルのそれぞれの１つの細胞は、ＧＦＰチャンネルにおける蛍光を示し、これら２つの細胞がテンプレートプラスミドでトランスフェクトされたことを示している（トランスフェクションは一部の細胞で発生し、他の細胞では発生しない）。同じセットの細胞をＣｙ５チャンネルで見ると（左から２列目のパネル）、ＨＣＲシグナルが見られる。相互作用ヘアピンプローブによる検出およびシグナル増幅に対応する、下のパネルにおいて、Ｃｙ５シグナルは、トランスフェクト細胞でのみ見られる。受動的にタグ付けされたプローブによる検出およびシグナル増幅に対応する、上のパネルにおいて、トランスフェクト細胞は、前のケースで起こったように、強いシグナルを示す。しかし、前のケースとは異なり、いくつかのスポットがＧＦＰ蛍光を全く示さない（トランスフェクトされていない）細胞で見られる。これらのシグナルは、潜在的にバックグラウンドまたは偽陽性シグナルを表す。バックグラウンドの分析のために非トランスフェクト細胞のみを考慮することを完全に確認するために、我々はまた、ＧＦＰテンプレートでトランスフェクトされなかったＨｅＬａ細胞を撮影した。これらの細胞をフルオレセインチャンネルで見ると、わずかな自己蛍光のみがすべての細胞で観察される（左から３列目のパネル）。しかし、これらの細胞をＣｙ５チャンネルで見た場合（一番右のパネル）、すべてのスポットは、非特異的なソースからであろう。右下のパネルの画像は、フィールド全体での一つのスポットを明らかにするために、より高いコントラストで表される。下のパネルは、目に見える８つの細胞の１つにおけるただ１つのスポットを示すが、上のパネルでは、約１３のスポットが合計たった５つの細胞において見られる。これらの観察結果は、異なるプローブシステムにおける標的特異的なシグナルの大きさは、ほぼ同じであるが、バックグラウンドシグナルの大きさは、ＨＣＲが受動的にタグ付けされたプローブにより開始された場合、ＨＣＲが相互作用ヘアピンプローブペアにより開始された場合よりも高いことを示す。
【0083】
我々はまた、コンピュータ画像分析により４つのカテゴリー（トランスフェクト細胞／受動的にタグ付けされたプローブ；トランスフェクト細胞／相互作用ヘアピンプローブペア；非トランスフェクト細胞／受動的にタグ付けされたプローブ；および非トランスフェクト細胞／相互作用ヘアピンプローブペア）のそれそれの細胞におけるスポットの平均数を分析した（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ（２００８））。我々は、平均して、ＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞が両方の種類のプローブで１００スポット／細胞を超えて生成されたことを見出した（多くの細胞において、スポットが非常に多すぎて、それらがお互いに融合し、よってアルゴリズムがそれらをお互いから分解することができなかったため、スポットの平均数は、より正確に決定することができなかった）。一方、ＧＦＰを発現しなかったコントロール細胞において、受動的にタグ付けされたプローブは、１．４６スポット／細胞を生成したが、相互作用ヘアピンプローブペアは、細胞あたり０．６２スポットを生成した。図８の代表的な画像のように、この分析はまた、２種類のプローブにより得られた特異的なシグナルがほぼ同じであるが、受動的にタグ付けされたプローブにより生成されたバックグラウンドシグナルが相互作用ヘアピンプローブペアにより生成されたバックグラウンドシグナルよりも高いことを示す。
【0084】
２つのプローブシステムにより生成されたバックグラウンドおよび特異的なシグナルにさらなる光を当てるために、我々は、細胞懸濁液で実施したパラレルハイブリダイゼーションおよび増幅反応からのフローサイトメトリーにより細胞を分析した。この分析を図９に示す。図９Ａの２つのパネルに示される散布図において、各ドットは、それぞれＣｙ５チャンネルおよびＧＦＰチャンネルでの単一細胞の蛍光のＸ－Ｙ座標を表す。中央のスポットの大きなクラスター（ＧＦＰ蛍光の１０４ユニットおよびＣｙ５蛍光の１０３ユニットの交点）は、ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされてなく、よって有意水準のＧＦＰまたはＣｙ５蛍光を示さなかったＨｅＬａ細胞を表す。対角線上にあるスポットは、両方のチャンネルにおいて蛍光を示す、トランスフェクト細胞を示す。２つの分布を示す仮想的な線の傾きは、ほぼ同じであり、２つのプローブシステムの感度が類似することを示す。我々はまた、トランスフェクトされなかった細胞におけるＣｙ５蛍光を分析した。これらの細胞は、有意水準のＧＦＰ蛍光を示さないため、Ｃｙ５蛍光のみが示され、データは、実線ヒストグラムとして表される（図９Ｂ）。２種類のプローブで用いられるＨｅＬａ細胞に加えて、我々は、いかなるプローブにもさらされていないＨｅＬａ細胞の第３のカテゴリーを準備した。これらのヒストグラムおよび関連する平均Ｃｙ５蛍光レベルは、相互作用ヘアピンプローブでの蛍光のバックグラウンドレベルがいかなるプローブにもさらされていない細胞とほぼ同じである一方、受動的にタグ付けされたプローブでの蛍光のバックグラウンドレベルがかなり高いことを示す。
【0085】
画像に基づくおよびフローサイトメトリーに基づく分析の両方は、相互作用ヘアピンプローブが受動的にタグ付けされたプローブよりも少ないバックグラウンドシグナルを生成することを示す。一方、特異的なシグナルのレベルは、両方の種類のプローブにおいてほぼ同じである。受動的にタグ付けされたプローブでの比較的高いレベルのバックグラウンドシグナルは、上記で議論した他の研究所での観察結果と一致する。
【0086】
図９Ｂは、いかなるプローブにもさらされていないＨｅＬａ細胞（平均７６４ユニット）、１つの受動的にタグ付けされたプローブ（平均１０８３）、または相互作用ヘアピンプローブの１つのペアで得られたバックグラウンドシグナルの定量比較を提供する。細胞の蛍光のプローブありおよびプローブなしの間の差は、各種のプローブにより生成されるバックグラウンドシグナルの増加を示す。受動的にタグ付けされたプローブの場合、差は３０１ユニット（１０８５－７６４）であったが、相互作用ヘアピンプローブの場合、それは７５ユニット（８３９－７６４）であった。この比較では、単一の受動的にタグ付けされたプローブまたは相互作用ヘアピンプローブの単一ペアを使用した。しかし、標的に結合するプローブの数は、シグナル強度を高めるために標的に対してそれらをタイリングすることにより増加するため、バックグラウンドシグナルは、受動的にタグ付けされたプローブの場合には実質的に増加するが、相互作用ヘアピンプローブの場合にはほとんど増加しない。
【0087】
実施例２のパートＡは、図５で図式的に記載し、そのシステムに関して上述したタイプのシステムを使用して単一のヌクレオチド変化により異なる２つの標的配列変異のいずれかについての実験を記載する。この４つのプローブのセットでは、２つのアーム供与ヘアピンプローブが、サンプルに存在するどの単一の標的配列変異に対しても競合する。相互作用プローブペアの設計は次のとおりであった：第１のアーム供与ヘアピンプローブ（ＲＤＢ６．６Ｃ）は、存在する場合、Ｇ標的配列変異に結合し、その後そのアーム受容体プローブ（ＲＡ６．３）と相互作用して、Ｃｙ５標識ヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅からのシグナル増幅をもたらし、Ｃｙ５シグナルを生成する；または第２のアーム供与ヘアピンプローブ（ＬＤＢ６．１Ｔ）は、存在する場合、Ａ標的配列変異に結合し、その後そのアーム受容体プローブ（ＬＡ６．１）と相互作用して、ＴＭＲ標識ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１およびＨ２からのシグナル増幅をもたらし、ＴＭＲシグナルを生成する。２つのサンプルからの蛍光画像を図１０Ａに示す。左側の２つのパネルは、Ｃｙ５チャンネル（上）およびＴＭＲチャンネル（下）で見られるＧ変異を発現する細胞の同じフィールドを示す。同様に、右側の２つのパネルは、Ｃｙ５チャンネル（上）およびＴＭＲチャンネル（下）で見られるＡ変異を発現する細胞の同じフィールドを示す。多くのそのような画像の分析後、同じプローブ混合物を２つの標的配列変異のそれぞれをプローブするために使用しても、平均して、Ｇ変異は多くのＧｙ５スポット（８６．７％）および非常に少ないＴＭＲスポット（１３．３％）を生成し、一方Ａ変異は、多くのＴＭＲスポット（９３．８％）および非常に少ないＣｙ５スポット（６．２％）を生成したことが判明した（このデータは、図１０Ｂの５行目にも示す）。我々はまた、Ａ標的配列変異に相補的な第１のアーム供与ヘアピンプローブおよびＧ標的配列変異に相補的な第２のアーム供与ヘアピンプローブを作製することにより色を反転した。主要な色のスポットは、実際に反転し、左右のアーム受容体ヘアピンプローブおよびそれらと類似のＨＣＲペアが同等で互換性のある方法で機能することを示した。
【0088】
実施例２のパートＢにおいて、我々は、パートＡの実験を４つの標的配列変異、すなわちＡ、Ｔ、ＣまたはＧの１つを含むサンプルまで拡大した。各標的配列変異に対して、我々は、標的配列変異の１つに完全に相補的なループを有する、２つの異なるアーム供与ヘアピンプローブの６つの組み合わせのすべてを使用した。検出アッセイおよびプローブ／ＨＣＲモノマーシステムは、パートＡで記載したとおりであった。６つのプローブ混合物のそれぞれを４つの標的配列変異のそれぞれでテストした。この一連の実験を設計した際、各標的配列変異に関して、３つのプローブの組み合わせは、識別力のあるアーム供与ヘアピンプローブのいずれも標的配列変異に完全に相補的ではなかったので、顕著なシグナルを生成しないはずであった；しかし、３つのプローブの組み合わせは、１つのアーム供与ヘアピンプローブが標的配列変異に完全に相補的であるので、顕著なシグナルを生成するはずであった。存在する標的配列に完全に相補的であるアーム供与プローブは、設計されたＨＣＲモノマーペア（Ｃｙ５標識Ｈ３およびＨ４またはＴＭＲ標識Ｈ１およびＨ２のいずれか）のＨＣＲ重合を開始し、適切な色の蛍光シグナルを生成するはずである一方、混合物中の他のアーム供与プローブは、他のＨＣＲモノマーペアによるＨＣＲ重合を極めてまれに開始し、それらの色の最小のシグナルのみを生成するはずである。実施例２Ｂの結果は、それがまさに起こったことを示した。第１に、いずれのアーム供与ヘアピンプローブも標的配列変異に相補的ではなかったアッセイは、顕著な蛍光シグナルを生成せず、顕微鏡分析により平均して合計１８スポットであった。これらのアッセイに関して、棒グラフを表示していない。一方、１つのアーム供与ヘアピンプローブが標的配列変異に相補的であったアッセイは、顕著なシグナルを生成し、細胞あたり平均して９１スポットであった。図１０Ｂは、水平パーセントバーグラフとして後者の結果を示す。各バーは、両方の色で検出されたスポットの１００％を表し、各バーの灰色の部分は、赤（Ｃｙ５）であったスポットのパーセントである。完全に相補的なアーム供与ヘアピンプローブによるＨＣＲ開始に起因する色におけるスポットの平均割合は、９２％であり、たった８％のスポットがミスマッチ（単一ヌクレオチド変化）アーム供与ヘアピンプローブからのＨＣＲ開始に起因する色であった。我々はまた、６つのプローブの組み合わせとＧＦＰが発現していない細胞とをテストした。それらは、平均して、細胞あたり１．５スポットを生成した。これらの結果は、変異部位のヌクレオチドの性質に関係なく、プローブシステムが非常に高い忠実性で識別することを示す。
【0089】
実施例３は、ＨＣＲシグナル増幅を用いる検出アッセイにおいて、２つの密接に関連するアレル、すなわち完璧に相補的な標的配列および単一のヌクレオチド置換により異なる配列の間を識別する能力を最大化するために相互作用ヘアピンプローブペアの構造の最適化に関する実験を記載する。アレル識別能力に影響を与える相互作用ヘアピンプローブの重要な特徴は、（ａ）アーム供与ヘアピンプローブのループの長さおよび（ｂ）それが鎖置換の開始のためのアーム受容体ヘアピンプローブの一本鎖トーホールド配列に相補的なトーホールド相補配列を含む（図４参照）か、または含まない（図５参照）か、である。これらの特徴における変化の影響を明らかにするために、我々は、２つの基準よってお互いに異なる４つの相互作用プローブペアを設計し、その後各ペアを野生型ＧＦＰ ｍＲＮＡ、各ペアのアーム供与プローブが完全に相補的であった（Ｇ）標的配列変異、または変異ＧＦＰ ｍＲＮＡ、各ペアのアーム供与プローブが単一ヌクレオチドによってミスマッチであった（Ａ）標的配列変異のいずれかを発現する細胞を用いてテストした。プローブハイブリダイゼーションおよびＨＣＲシグナル増幅後の代表的な顕微鏡画像を図１１に示す。左側のパネルは、完全に相補的な（Ｇ）標的配列変異でのアッセイからであり、右側のパネルは、ミスマッチ（Ａ）標的配列変異でのアッセイからである。上の２行のパネルは、アーム受容体プローブのトーホールド配列を有する（一番上の行）および有さない（２行目）１５ヌクレオチド長ループを有するアーム供与ヘアピンプローブの使用を比較する。これらの結果は、１５－ｎｔ長ループを有するアーム供与プローブが完全に相補的な標的のために強いシグナル（スポット）を生成するがミスマッチ標的ではより弱いシグナルを生成することを示す。トーホールド相補配列（およびアーム受容体プローブにおけるその一本鎖相補トーホールド）を削除すると、２行目の画像に示すように、ミスマッチ標的からのシグナルがさらに減少するが、完全に相補的な標的配列からのシグナルは引き続き強かった。図１１の下の３行のパネルは、トーホールド相補配列を有さないが６ヌクレオチド長のステムおよび１５、１２または９ヌクレオチド長のループを有するアーム供与プローブからの結果を比較する。本実施例のアッセイにおいて、ループ長が１５ヌクレオチドから１２ヌクレオチドへと減少すると、ミスマッチ標的配列変異からのシグナルは、ほぼ完全に消失する一方、完全に相補的な標的配列変異からのシグナルは、ほぼ同じ強さのまま維持された。しかし、ループ長がさらに９ヌクレオチドまで減少すると、両方の標的配列変異からのシグナルは、バックグラウンドレベルまで減少した。下の２つのパネルは、画像に存在するわずかなスポットを明らかにするために他よりも高いコントラストで表示する。プローブ構造におけるこれらの変化および結果として生じるシグナルでの結果として生じる変化は、どのように特定のアッセイ条件下での相互作用ヘアピンプローブの特定のペアの識別能力を最適化できるのかについて示す。
【0090】
実施例４は、本発明に係る相互作用ヘアピンプローブペアのプローブを構築するために汎用な配列を利用する能力を明らかにする。我々は、実施例１で使用され、図５のプローブ６０のセグメントを有するアーム受容体プローブＲＡ６．３を選択した。我々は、汎用オリゴヌクレオチドとして汎用セグメントｆ－ｇ’－ｆ’－３’を使用し、我々は、標的特異的オリゴヌクレオチドとして標的相補配列Ｐ４－５’を使用した。我々は、クリックケミストリーを介して汎用オリゴヌクレオチドを標的特異的オリゴヌクレオチドに結合し、クリックリンクを含む、アーム受容体プローブＲＡ６．３－ｃｌｉｃｋを形成した。我々は、実施例１のハイブリダイゼーションおよびＨＣＲシグナル増幅方法において、プローブＲＡ６．３－ｃｌｉｃｋのパフォーマンスを「通常」（すべてホスホジエステルヌクレオチド間リンク）のパフォーマンスと比較した。図１２に示す代表的な画像は、２種類のアーム受容体ヘアピンプローブが同等の結果をもたらすことを明らかにする。したがって、ホスホジエステル骨格の不連続性（「クリック」リンクによる）にも関わらず、組み立てられたヘアピンプローブおよびその相互作用ヘアピンプローブは、両方が標的配列に結合された場合、相互作用し、必要な立体構造の変化を受けてアクセス可能なＨＣＲイニシエーターを生成し、ＨＣＲ増幅を開始して、ＨＣＲ増幅シグナルを生成することができた。
【0091】
実施例５は、ｍＲＮＡに加えて、他の種類のＲＮＡもまた、相互作用ヘアピンプローブを使用して検出できることを明らかにする。実施例５で報告される実験において、我々は、スモールガイドＲＮＡを標的とした。スモールガイドＲＮＡは、遺伝子編集ツールＣａｓ－９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ９用）をゲノム内のその標的位置へ導くために使用される（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３）。スモールガイドＲＮＡは、２つの機能要素を有する：Ｃａｓ－９タンパク質に結合する部分およびゲノム内の標的配列に相補的であるガイド部分。標的配列相補要素は、結果として生じるＣａｓ－９複合体を、Ｃａｓ－９がＤＮＡを切断するその相補的なゲノム部位へと導き、標的遺伝子の喪失をもたらす。実施例５は、ＲＮＡガイド配列を発現して、隣接してハイブリダイズするとＨＣＲシグナル増幅を開始するように操作されたＨｅＬａ細胞のＣａｓ－９ガイド配列を標的とする相互作用ヘアピンプローブペアを記載する。操作されたガイドＲＮＡは、Ｕ６プロモーターの制御下にあるため、操作された細胞の核に局在することが期待された（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００８）ＲＮＡ １４：１８２３－１８３３）。これは、細胞の細胞質に局在するｍＲＮＡとは異なる。
【0092】
図１３は、ガイドＲＮＡに対応するスポットが核内に見られるＨｅｌａ細胞の画像を示す。ガイドＲＮＡでトランスフェクトされなかった細胞は、かなりの数のスポットを生成しなかった。重要なのは、このＲＮＡが核内に局在するという観察結果は、その親プラスミドにより利用されたプロモーターから期待されるように、標的核酸配列、ここではＲＮＡ配列が、細胞内のどこに存在しても、相互作用ヘアピンプローブが標的を認識し、その存在を報告できることを示す。
【0093】
実施例６は、シグナル増幅のためにＨＣＲではなくローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を利用する本発明に係る方法を記載する。まず図２を参照すると、ＲＣＡイニシエーターＩ５（受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブ２１のタグ）が環状テンプレートＣＴのコピーを準備して、ＲＣＡによる増幅産物ＡＰを生成できること、および蛍光色素分子標識検出プローブＬＰが増幅産物を検出できることが分かる。
【0094】
実施例６は、固定および透過処理した細胞の核酸標的配列で隣接してハイブリダイズする相互作用ヘアピンプローブペア、ＲＤＢ ＲＣＡおよびＲＡ ＲＣＡを記載する。ハイブリダイズすると、それらは、相互作用してイニシエーター配列、この場合ＲＣＡイニシエーターＩ５を生成する。図２に関連して説明したように、環状テンプレートおよびＤＮＡポリメラーゼの添加は、ＲＣＡシグナル増幅および検出をもたらす。そのような相互作用ヘアピンプローブの構造の略図を、プローブ７１および７２として図７に示す。そのような方法のフローチャートを図７に示す。
【0095】
実施例７は、３つのタイプのプロービング：すべて同じ蛍光色素分子で単一標識された、多数のショートプローブ；多数の受動的にタグ付けされたプローブを用いるＨＣＲ；および半数の相互作用ヘアピンプローブペアを用いるＨＣＲを使用して、刺激されたヒト初代血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）によって発現されるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ） ｍＲＮＡのフローサイトメトリー検出からの標的配列特異的シグナルのレベルとバックグラウンドシグナルのレベルとを比較する。ＰＢＭＣｓは、静止状態ではＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現しないが、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンで刺激すると、それらの約１５％がＩＦＮγ ｍＲＮＡを合成することにより反応する（Ｂｕｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９４：８３６－８４１）。大部分の細胞は、ＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現しないため、このシステムは、同じ細胞集団からのシグナルおよびバックグラウンドレベルの評価を可能にする。フローサイトメトリーにおいて、各細胞からの総合的な蛍光のみが記録され、顕微鏡とは異なり、スポット検出が特異的シグナルとバックグラウンドシグナルとを区別するための補助として使用できないため、細胞内ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく分析における低レベルのバックグラウンドを達成することは、特に重要であることが理解される。
【0096】
実施例７のテストにおいて、固定および透過処理されたＰＢＭＣｓならびに刺激されたＰＢＭＣｓを、３つの異なるタイプのプローブのハイブリダイゼーションおよび２つのプローブタイプに関してはＨＣＲシグナル増幅後、フローサイトメトリーにより分析した。ＰＢＭＣｓおよび刺激されたＰＢＭＣｓの第１のテストは、それぞれがＩＦＮγ ｍＲＮＡ標的配列に完全に相補的であり、単一のＣｙ５蛍光色素分子でその３’末端を標識された（直接標識された）、４８のショート（２０～２４ヌクレオチド長）ランダムコイルＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを含んだ。第２のテストは、それぞれが３’伸長として３１ヌクレオチド長ＨＣＲイニシエーター配列を有し、第１のテストと同じ標的相補配列を有する４８のプローブのハイブリダイゼーションと、Ｃｙ５標識ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４（実施例１）のＨＣＲ増幅とを含んだ。第３のテストは、それぞれのペアが第１のテストの一連のプローブと同じ標的相補配列を有する２３の相互作用ヘアピンプローブペアのハイブリダイゼーションと、Ｃｙ５標識ＨＣＲヘアピンモノマーＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅とを含んだ。
【0097】
フローサイトメトリー分析の結果を図１４に示す。右側のパネルは、刺激された細胞を表し、左側のパネルは、静止細胞を表す。これらの散布図の各スポットは、単一の細胞を表し、横軸が細胞のＣｙ５蛍光強度を表し、縦軸が同じ細胞の側方散乱を表す（後者のパラメーターは、細胞のサイズに関する）。刺激されていない細胞は、ＩＦＮγ ｍＲＮＡを有さないため、左側のパネルの細胞は、単一のクラスターで現れ、バックグラウンドシグナルの測定を可能にする（Ｂｕｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。これらのクラスターのピーク蛍光強度は、各パネル上の垂直バーで表され、ピーク蛍光強度は、上部に示される。一方、刺激された細胞は、２つのクラスターに分かれ、左側のクラスターは、応答しない細胞を表し、右側のクラスターは、ＩＦＮγ ｍＲＮＡを産生する細胞を表し、よってより蛍光を発した（右側のパネル）。各パネルのこれらのクラスターのピーク蛍光は、同様に垂直バーで示される。刺激されていない細胞の蛍光ピーク（左側のパネル）および刺激されたが応答しない細胞の蛍光ピーク（右側のパネル）は、ほぼ同じある。
【0098】
図１４に示す結果は、ｍＲＮＡ特異的シグナルの強度が、直接標識されたプローブのセットと比較した受動的にタグ付けされたプローブによるＨＣＲの結果として約１０倍増加した（３７３，０００対３７，０００）が、バックグラウンドのレベルも同じ程度増加し（９６００対９２０）、同じシグナル対バックグラウンド比が得られたことを明らかにする。しかし、顕著には、相互作用ヘアピンプローブでのＨＣＲは、直接標識されたプローブのセットと比較して、より高いｍＲＮＡ特異的シグナルを生成した（６６，０００対９７００）だけではなく、バックグラウンドのレベルもより低かった（６５０対９２０）。３つのプローブシステムのシグナル対バックグラウンド比は、直接標識されたプローブでは４０、受動的にタグ付けされたプローブでのＨＣＲでは３９、相互作用ヘアピンプローブでのＨＣＲでは１０２であった。相互作用ヘアピンプローブでのＨＣＲにより生成されたｍＲＮＡ特異的シグナルの絶対的な大きさは、受動的にタグ付けされたプローブでのＨＣＲのものよりも有意に低い（６６，０００対３７３，０００）が、半数の相互作用ヘアピンプローブペアだけが受動的にタグ付けされたプローブと比較して使用された（２３対４８）ことが理解されるであろう。
【0099】
図１４と図９Ｂとの比較は、ＨＣＲを開始するために使用される受動的にタグ付けされたプローブの数を１から４８に増やすと、バックグラウンドシグナルのレベルが大幅に増加するが、一方相互作用ヘアピンプローブにより生成されたバックグラウンドシグナルは、プローブペアの数を１ペアから２３に増やした場合、はっきりとは増加しなかったことを示す。
【0100】
実施例８は、点突然変異を検出するための本発明の相互作用ヘアピンプローブによるＨＣＲの能力を明らかにする。この証明のために、我々は、ガン細胞株の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ） ｍＲＮＡにおける突然変異Ｌ８５８Ｒを選択した。いくつかのＥＧＦＲ変異は、ガンがＥＧＦＲに結合する薬の影響を受けやすくなる一方、この遺伝子の他のＥＧＦＲ変異は、ガンがこれらの薬に影響されなくなる（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ １１：１６９－１８１）。我々が選択した体細胞突然変異Ｌ８５８Ｒは、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡ（実施例８に示すｃＤＮＡ配列）の２５７３の位置で、一つの野生型チミジン（Ｔ）残基を変異グアノシン（Ｇ）残基へと変化させ、エルロチニブおよびゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩｓ）がガンに対して効果的であろうことを示す。顕微鏡検出によるＦＩＳＨのために、我々は、２つの細胞株を選択した：非小細胞肺ガンに由来し、そのＥＧＦＲ遺伝子の２つのコピー（ヘテロ接合体）の１つにおいてこの変異を含むことが知られている、Ｈ１９７５；およびこの変異を含まず、よってこの変異に関して野生型である、ＨｅＬａ細胞株（Ｋａｗａｈａｒａ ｅｔ ａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１０）１６：３１６３－３１７０）。変異ホモ接合細胞株（ｍｕｔａｎｔ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、この変異には利用できない。
【0101】
ＨＣＲシグナル増幅のプロービングおよび開始のために、我々は、固定および透過処理した細胞に、図４に記載され、その図および実施例２に関連して上述した４つのプローブシステムの両方の相互作用プローブペアを添加した。２つのヘアピン受容体プローブを野生型であろうと変異であろうとも標的に結合するように設計したが、２つのアーム供与ヘアピンプローブの１つのみを各標的に結合するように設計した。この実験において、図４を参照すると、変異標的配列に相補的である右側のアーム供与ヘアピンプローブ４９を右側の受容体ヘアピンプローブ５９と相互作用して、ＣＹ５で標識されたＨＣＲモノマーＨ３およびＨ４の合成を開始するように設計した；および野生型標的配列に相補的である左側のアーム供与ヘアピンプローブ４８を左側の受容体ヘアピンプローブ４７と相互作用して、ＴＭＲで標識されたＨＣＲモノマーＨ１およびＨ２の合成を開始するように設計した。
【0102】
相互作用ヘアピンプローブペアによって生成されたスポットが一般にＥＧＦＲ ｍＲＮＡに由来することを明らかにするために、我々は、それぞれが野生型および変異標的配列の両方に完全に相補的であり、単一のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ蛍光色素分子でその３’末端を標識された（直接標識された）、４８のショートランダムコイルＤＮＡプローブのセットを（相互作用ヘアピンプローブの２つのペアと）同時にハイブリダイズした。これらのプローブは、両方の種類の標的に結合でき、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄチャンネルでシグナルを生成することができる。それらを「トレーサー（ｔｒａｃｅｒ）」または「マーカー（ｍａｒｋｅｒ）」プローブとして使用して、ＨＣＲシグナルが意図した標的から発生していることを確認した。実質的に細胞内のすべてのｍＲＮＡ分子をＴｅｘａｓ Ｒｅｄチャンネルで検出されることが予想された（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：８７７－８７９）。ＥＧＦＲ ｍＲＮＡから発する特異的なＨＣＲシグナルは、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄシグナルと共局在化すると予測されたが、非特異的なＨＣＲシグナルは、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄシグナルと共局在化するとは予測されなかった。
【0103】
実施例８は、２つの実験を報告する。第１の実験において、我々は、１ステップハイブリダイゼーション反応を使用し、ここでハイブリダイゼーション反応混合物（５０μｌ）は、ショート直接標識プローブのセット、５ｎｇの各アーム供与ヘアピンプローブ、および５ｎｇの各受容体ヘアピンプローブを含んだ。第２の実験のために、我々は、２つの変更を行った：我々は、洗浄によって分離された２ステップのプローブハイブリダイゼーションを行った。第１のハイブリダイゼーションのための反応混合物は、受容体プローブを含んだが、アーム供与プローブを含まず、第２のハイブリダイゼーションのための反応混合物は、アーム供与ヘアピンプローブを含んだが、受容体プローブを含まなかった。第２の実験では、各アーム供与ヘアピンプローブの量を５ｎｇから２０ｎｇに増加した。我々は、ヘアピン配列、反応混合物の濃度、および前述の実験の手順が、このデモンストレーションには充分であるが、最適化されていなかったことに留意する。加えて、我々は、おそらく不均衡でありうる、２つのアレルの相対的な発現レベルを確認しなかった（Ｍｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｌｌｅｌｉｃ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５：ｅ３４）。
【0104】
画像および画像解析は、図１５において、Ｈ１９７５およびＨｅＬａ細胞株のそれぞれ１つの細胞から表示される。この図では、水平行のパネルは、示される４つの異なるチャンネルから得られた同じ細胞の画像を示す。上の行（Ｈ１９７５細胞）は、下の行（Ｈｅｌａ細胞）よりも多くのＣｙ５スポットを示し、ヘテロ接合体サンプルにおけるＬ８５８Ｒ変異の検出に成功したことを明らかにする。表２は、これらの実験でカウントされたスポット、すなわち：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポット；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化したＴＭＲスポットおよび共局在化しなかったもの；ならびにＴｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化したＣｙ５スポットおよび共局在化しなかったもの（「単独（Ａｌｏｎｅ）」）の数を示す。上の２つの行は、第１の実験の間の図１５で画像化された単一の細胞である。真ん中の２つの行は、第１の実験からの６０の細胞の平均である。下の２つの行は、第２の実験からの５０の細胞の平均である。標準偏差は、報告された値の約３０％であった。
【0105】
相互作用ヘアピンプローブの１ステップハイブリダイゼーションを用いた第１の実験において、我々は、平均で、Ｈ１９７５細胞が４２．５分子のＥＧＦＲ ｍＲＮＡを発現し、一方ＨｅＬａ細胞が１８．３分子のこのｍＲＮＡを生成することを見出した。Ｈ１９７５細胞において、相互作用ヘアピンプローブは、３４％の標的を検出することができ、一方ＨｅＬａ細胞において、それらは、２２％の標的を検出することができる。ヘテロ接合体細胞株Ｈ１９７５において、プローブは、６６％の検出されたｍＲＮＡ分子（１００＊（（９．４／（９．４＋４．９）））が変異体であり、残りが野生型であることを示すシグナルを生成したが、野生型細胞株ＨｅＬａにおいて、９２％の分子（１００＊（３．３／（３．４＋０．２）））が野生型であり、残りが変異体であることが判明した。ガイドとしてＴｅｘａｓ Ｒｅｄシグナルに依存する、この分析は、突然変異に対するプローブの精巧な特異性を示す。第１の実験の結果はまた、ＴＭＲおよびＣｙ５チャンネルの両方における多くのスポットがＴｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在しないことを示す。これらのスポットが潜在的に非特異的なソースから発生し、アッセイの感度を下げるため、我々は、２ステップハイブリダイゼーションを行うことによりこれらの数を減らすことに努めた。
【0106】
最後の２行対中央の２行におけるＴＭＲ「単独」スポットとＣｙ５「単独」スポットとの比較は、１ステップから２ステップハイブリダイゼーションへの変更が非共局在スポットの平均数を有意に減らした一方、特異的なスポット（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄと共局在化したもの）がほぼ同じに維持された、またはわずかに増加したことを示す。したがって、ヘテロ接合体と野生型との区別は、１ステップハイブリダイゼーションよりもさらに正確で信頼性が高くなった。この区別は、トレーサーとして短く、直接標識されたプローブとの共局在化の知識なしに行うことができる。
【0107】
２つの実験の結果は、変異Ｌ８５８Ｒ ｍＲＮＡ標的が野生型標的よりも高い効率で検出されることを示唆する。Ｈ１９７５の１ステップハイブリダイゼーション（６０細胞）において、４４％のＭＣＴ ｍＲＮＡが検出され（９．４／２１．２）、２３％のＷＴ ｍＲＮＡが検出された（４．９／２１．２）一方、Ｈ１０７５の２ステップハイブリダイゼーション（５０細胞）において、４７％のＭＵＴ ｍＲＮＡが検出され（１２．９／２７．３）、１３％のＷＴ ｍＲＮＡが検出された（３．６／２７．３）。これらの計算の分子は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄと共局在化したＴＭＲおよびＣｙ５チャンネルにおけるスポットの数を表し、分母は、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｃ ｍＲＮＡ分子の合計の半分を表す（表２）。野生型ｍＲＮＡの検出のより低い効率はまた、野生型細胞株ＨｅＬａでも明らかであった。この場合、ＨｅＬａの１ステップハイブリダイゼーション（６０細胞）において、１９％のＷＴ ｍＲＮＡが検出され（３．４／１８．３）、（誤って）１％のみ変異プローブに応答した（０．２／１８．３）。同様に、ＨｅＬａの２ステップハイブリダイゼーション（５０細胞）において、１７％のＷＴ ｍＲＮＡが検出され（３．４／２０．１）、（誤って）２％のみが変異プローブに応答した（０．５／２０．１）。これらの計算の分母は、トータルのＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ｍＲＮＡ分子である。
【0108】
これらの違いは、アレルの不均衡による２つのアレルの発現における不均衡に起因する可能性がある（Ｍｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）が、別の要因は、２つのアレルのｍＲＮＡのプローブへの異なるアクセシビリティであり得る。アッセイを最適化するためにこのことに対処するシンプルな方法は、各アレルのスポットの数を独立して正規化することである。第２のアプローチは、２つのプローブの濃度を「微調整（ｆｉｎｅ ｔｕｎｅ）」することであり、すなわち２つのｍＲＮＡの検出の全体的な効率がほぼ同じであるように、左側の供与ビーコンプローブ（ＷＴ）の濃度を上げ、右側の供与ビーコンプローブ（ＭＵＴ）の濃度を下げる。さらに別のアプローチは、左側のアーム供与プローブもしくは左側の受容体プローブまたはその両方の構造を変更して、イニシエーター生成の効率を高めることであろう。
【実施例】
【0109】
実施例１．受動的にタグ付けされたプローブにより達成されるよりも、相互作用ヘアピンプローブの使用により達成される、より高いシグナル対バックグラウンド比の実証
意図するｍＲＮＡ標的配列から特異的に増幅したシグナルを生成する相互作用ヘアピンプローブペアの能力を実証するために、我々は、ＨｅＬａ細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする異種ｍＲＮＡを発現させた。ＧＦＰは、通常これらの細胞に存在しない。このｍＲＮＡは、我々のプローブの標的として機能した。このシステムにより、我々は、ＧＦＰ ｍＲＮＡを発現する細胞からの標的特異的シグナルの評価およびＧＦＰ ｍＲＮＡを発現しないＨｅＬａ細胞からのバックグラウンドシグナルの評価が可能になった。
意図するｍＲＮＡ標的配列から特異的に増幅したシグナルを生成する相互作用ヘアピンプローブペアの能力を実証するために、我々は、ＨｅＬａ細胞において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする異種ｍＲＮＡを発現させた。ＧＦＰは、通常これらの細胞に存在しない。このｍＲＮＡは、我々のプローブの標的として機能した。このシステムにより、我々は、ＧＦＰ ｍＲＮＡを発現する細胞からの標的特異的シグナルの評価およびＧＦＰ ｍＲＮＡを発現しないＨｅＬａ細胞からのバックグラウンドシグナルの評価が可能になった。
【0110】
【化1】
【0111】
前述の配列において、ステム形成相補セグメントには下線が引かれている。
【0112】
これらの一連の実験のために、我々は、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ （２０１４）のプローブに類似のＧＦＰ ｍＲＮＡに対する受動的にタグ付けされたハイブリダイゼーションプローブを使用した、または我々は、本発明に係る相互作用ヘアピンハイブリダイゼーションプローブペアである標的相補配列を含む第１の相互作用ヘアピンプローブＲＤＢ６．６および第２の相互作用ヘアピンプローブＲＡ６．３を使用した。受動的にタグ付けされたプローブを、その標的相補セグメント（またはプローブ配列）が第２の相互作用ヘアピンプローブＲＡ６．３であるアーム受容体プローブにおける標的相補配列（またはプローブ配列）と同じになるように設計した。この受動的にタグ付けされたプローブにおいて、５’末端の標的相補配列（またはプローブ配列もしくはプロービング配列）の後に、（その３’末端に向かって）５ヌクレオチドのスペーサー（ＡＡＡＡＡ）が続き、次にＨＣＲヘアピンＨ３およびＨ４のためのイニシエーターである配列ｇ’、ｆ’－３’を含むＨＣＲイニシエーター配列Ｉ３が続く。すべてのオリゴヌクレオチドをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＩＤＴ）（Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ，ＩＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。ＨＣＲヘアピンＨ３は、５’末端アミノ標識で得られ、ＨＣＲヘアピンＨ４は、３’末端アミノ標識で得られた。アミノ標識を有するオリゴヌクレオチドは、Ｃｙ５スクシンイミジルエステルに結合され、その後上述のように、ＨＰＬＣにより生成された（Ｔｙａｇｉ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ（１９９６））。これらの標識ＨＣＲヘアピンモノマーおよびプローブは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、８Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲルでさらに精製され、水に再懸濁され、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して定量された。プローブおよびヘアピンモノマーが使用前に適切に折りたたまれていることを保証するために、２Ｘ ＳＳＣで、プローブを５ｎｇ／μｌに希釈し、ＨＣＲヘアピンモノマーを２５ｎＭに希釈し（約１００μｌ溶液）、２分間沸騰水内で加熱し、その後室温で１０分間冷却された。
【0113】
このｍＲＮＡのＤＮＡテンプレート（ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴＲＥｄ２ＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、標準プロトコルを用いてＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされた（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５））。トランスフェクトされた（プラスミドを受け取った）細胞は、ＧＦＰの発現により蛍光を発した。その後、細胞をプラスチック皿から取り出し、ガラスのカバースリップに移し、そこでさらに１日培養した。これらの細胞を１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで固定し、７０％エタノールで透過処理し、２Ｘ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）バッファー（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（プローブ洗浄バッファー）中の１０％ホルムアミドで平衡化した。
【0114】
次に、受動的にタグ付けされたプローブまたは相互作用プローブペアを固定および透過処理した細胞に添加し、結果として得られた混合物を３７℃の湿潤チャンバーで一晩インキュベートして、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、プローブ－プローブ相互作用を可能にした。ハイブリダイゼーション反応混合物（５０μｌ）は、５ｎｇの各プローブならびに１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．０２％ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ牛血清アルブミン（Ａｍｂｉｏｎ）、１０％ホルムアミドおよび２Ｘ ＳＳＣを含んだ。プローブペアのハイブリダイゼーションおよび相互作用後、カバースリップを１ｍｌのプローブ洗浄バッファーで２回洗浄して、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した。各洗浄は、室温で１０分間行われた。最後に、細胞を５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＣＲバッファー）で平衡化した。
【0115】
過剰なプローブの除去後、ＨＣＲを５０μｌ反応中、湿潤チャンバー内で３７℃、４時間行った。ＨＣＲ反応混合物は、Ｋｏｓｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：７２９４）により以前に説明され、ＨＣＲバッファーに溶解した、ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４のそれぞれを２５ｎＭ含んだ。ＨＣＲヘアピンモノマーをＣｙ５で標識した。ＨＣＲ増幅後、過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドを上記プローブ除去で行ったのと同じ方法で、ＨＣＲバッファー内で洗浄により除去した。インキュベーション工程（ハイブリダイゼーションおよびＨＣＲ）の両方のために、パラフィルムシートをガラスプレート上に置き、反応バッファーの液滴をパラフィルムシート上に置き、その後カバースリップを細胞が付着している側を下に向けて液滴上に置いた。上述のように、カバースリップを取り付けて撮像した（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ（２００８））。
【0116】
フローサイトメトリーによるシグナルを分析することを目的とした並行実験において、細胞をトランスフェクション後１日間プラスチック皿で培養し、その後取り出した。取り出した細胞をＰＢＳに懸濁し、固定し、透過処理した。プローブペアを添加し、ハイブリダイゼーションおよび相互作用のためにインキュベートし、その後結合してないプローブを除去するために洗浄し、ＨＣＲ増幅を行い、ＨＣＲバッファーを使用して再度洗浄した。しかし、細胞は、カバースリップへ付着されるのではなく、浮遊状態であったため、インキュベーション／洗浄サイクルごとに、それらをスイングチューブローターを用いる遠心分離機で手短に回転し、上清を吸引により除去し、新たな溶液により置き換えた。最後の洗浄後、それらの細胞をプローブ洗浄バッファーに懸濁し、フルオレセインチャンネル（ＧＦＰ用）およびＣｙ５チャンネル（ＨＣＲ産物用）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｃｃｕｒｉ ６Ｃフローサイトメーターで分析した。
【0117】
カバースリップを、ＤＡＰＩ、ＤＩＣ、フルオレセイン（またはＧＦＰ）およびＣｙ５チャンネルで、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡を使用し、６０倍の対物レンズで撮像した。最初の２つのチャンネルは、細胞およびそれらの境界の識別を可能にし、フルオレセインチャンネルは、トランスフェクトされた細胞の識別を可能にし、Ｃｙ５チャンネルは、プローブシグナルの記録のために使用された。１１の光学セクションがＣｙ５チャンネルのために得られた。ＨＣＲ増幅シグナルは、個別のスポットとして現れる。細胞境界内のスポットは、上述のアルゴリズムを用いてカウントされた（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ （２００８））。代表的な画像を図８に示す。図８の左側の４つのパネルは、ＧＦＰテンプレートでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞に関し、右側の４つのパネルは、このテンプレートでトランスフェクトされなかったＨｅＬａ細胞に関する。我々はまた、フローサイトメトリーにより細胞懸濁液で行われた並行ハイブリダイゼーション反応からの細胞を分析した。この分析を図９に示す。図９Ａの２つの上部パネルに示す散布図において、各ドットは、受動的にタグ付けされたプローブを用いた反応（左側のパネル）に関するおよび相互作用プローブペアを用いた反応（右側のパネル）に関する、Ｃｙ５およびＧＦＰチャンネルそれぞれでの単一の細胞の蛍光のｘ－ｙ座標を表す。我々はまた、トランスフェクトされなかった細胞におけるＣｙ５蛍光を分析した。これらの細胞は、有意レベルのＧＦＰ蛍光を示さないため、Ｃｙ５蛍光のみが示され、データは、実線ヒストグラムとして表される（図９Ｂ）。
【0118】
実施例２．単一分子感度でのｍＲＮＡのアレル変異のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために相互作用ヘアピンプローブを使用する
標的配列の単一ヌクレオチド変異の検出のための相互作用ヘアピンプローブの有用性を明らかにするために、我々は、変化がその蛍光に悪影響を与えないように、特定の場所での部位特異的変異導入（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）手順（Ｃｈａｎｇｅ－ＩＴ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、野生型ｄ２ＥＧＦＰ配列（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を変異させることにより、ＧＦＰコード配列の４つの単一ヌクレオチド変異体を作製した。我々は、ｄ２ＥＧＦＰコード配列の２０７の位置に通常存在するグアノシンをアデノシン、シトシンまたはチミジンのいずれかに置換した。変更された（下線）ヌクレオチドの配列コンテクストは、ＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣ（配列番号４７）である。これら４つのＧＦＰ変異をコードするプラスミドを、実施例１に記載されるように、ＨｅＬａ細胞に別々にトランスフェクトした。得られたＧＦＰ蛍光細胞の各変異体を確認した。
標的配列の単一ヌクレオチド変異の検出のための相互作用ヘアピンプローブの有用性を明らかにするために、我々は、変化がその蛍光に悪影響を与えないように、特定の場所での部位特異的変異導入（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）手順（Ｃｈａｎｇｅ－ＩＴ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、野生型ｄ２ＥＧＦＰ配列（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を変異させることにより、ＧＦＰコード配列の４つの単一ヌクレオチド変異体を作製した。我々は、ｄ２ＥＧＦＰコード配列の２０７の位置に通常存在するグアノシンをアデノシン、シトシンまたはチミジンのいずれかに置換した。変更された（下線）ヌクレオチドの配列コンテクストは、ＣＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴＣ（配列番号４７）である。これら４つのＧＦＰ変異をコードするプラスミドを、実施例１に記載されるように、ＨｅＬａ細胞に別々にトランスフェクトした。得られたＧＦＰ蛍光細胞の各変異体を確認した。
【0119】
【化2】
【0120】
【化3】
【0121】
野生型ＧＦＰ標的配列およびアーム供与プローブにおいて、可変のヌクレオチドを太字とする。下線を引いた配列セグメントは、ヘアピンステムのアームを示す。
【0122】
Ａ．２つの相互作用ヘアピンプローブで２つの標的変異体のいずれかをプロービングする
我々は、最初に２つの相互作用ヘアピンプローブペアのセット（ＲＡ６．３、ＬＡ６．１、ＲＤＢ６．６Ｃ（そのループ配列は、Ｇ標的配列変異体に相補的である）およびＬＤＢ６．１Ｔ（そのループは、Ａ標的配列変異体に相補的である）からなる４つのプローブ）でＧ変異（野生型）を発現する細胞およびＧＦＰ ｍＲＮＡのＡ変異体を発現する細胞をプローブした。このプローブセットを使用すると、そのステムを開くようにアーム供与プローブＲＤＢ６．６Ｃが結合する場合、その供与アームは、その後アーム受容体プローブＲＡ６．３と相互作用することができ、次にＣｙ５標識ヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができる、そのＨＣＲイニシエーター配列を解放して、Ｃｙ５シグナルを生成する。しかし、そのステムを開くようにアーム供与プローブＬＤＢ６．１Ｔが代わりに結合する場合、その供与アームは、その後アーム受容体プローブＬＡ６．１と相互作用することができ、次にＴＭＲ標識ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１およびＨ２のＨＣＲ増幅を開始することができる、そのＨＣＲイニシエーター配列を開放して、テトラメチルロダイミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｉｍｉｎｅ）（ＴＭＲ）シグナルを生成する。
我々は、最初に２つの相互作用ヘアピンプローブペアのセット（ＲＡ６．３、ＬＡ６．１、ＲＤＢ６．６Ｃ（そのループ配列は、Ｇ標的配列変異体に相補的である）およびＬＤＢ６．１Ｔ（そのループは、Ａ標的配列変異体に相補的である）からなる４つのプローブ）でＧ変異（野生型）を発現する細胞およびＧＦＰ ｍＲＮＡのＡ変異体を発現する細胞をプローブした。このプローブセットを使用すると、そのステムを開くようにアーム供与プローブＲＤＢ６．６Ｃが結合する場合、その供与アームは、その後アーム受容体プローブＲＡ６．３と相互作用することができ、次にＣｙ５標識ヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４のＨＣＲ増幅を開始することができる、そのＨＣＲイニシエーター配列を解放して、Ｃｙ５シグナルを生成する。しかし、そのステムを開くようにアーム供与プローブＬＤＢ６．１Ｔが代わりに結合する場合、その供与アームは、その後アーム受容体プローブＬＡ６．１と相互作用することができ、次にＴＭＲ標識ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１およびＨ２のＨＣＲ増幅を開始することができる、そのＨＣＲイニシエーター配列を開放して、テトラメチルロダイミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｉｍｉｎｅ）（ＴＭＲ）シグナルを生成する。
【0123】
細胞およびプローブを調製し、各サンプル（Ｇ変異体またはＡ変異体）のハイブリダイゼーション－相互作用インキュベーションを各ケースで４つのプローブすべてを用いて実施例１のように実施した。実施例１に記載したように、洗浄による過剰なプローブの除去後、ＨＣＲ増幅を実施例１に記載したように各サンプルで実施し、その間ＨＣＲヘアピンＣｙ５標識Ｈ３およびＨ４ならびにＴＭＲ標識Ｈ１およびＨ２の２セットが存在した。過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドを除去した後、カバースリップをＤＡＰＩ、ＤＩＣ、ＴＭＲおよびＣｙ５チャンネルにおいて、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡の１００倍の対物レンズで撮像した。ＴＭＲおよびＣｙ５チャンネルから得られた代表的な画像を両方のサンプルについて図１０Ａに示す。結果を実施例の説明セクションで上述した。我々は、逆にしたアーム供与ヘアピンの問い合わせヌクレオチドを用いて上述の実験を繰り返した；すなわちプローブＲＤＢ６．６Ｔにより置き換えたプローブＲＤＢ６．６Ｃ（Ａ標的配列変異体に相補的）を用いておよびプローブＬＤＢ６．１Ｃに置き換えられたプローブＬＤＢ６．１Ｔ（Ｇ標的配列変異体に相補的）を用いて、主要なスポットの色が反転した場合、それらが行われたと理解する。
【0124】
Ｂ．２つの相互作用プローブペアで他の標的変異体をプロービングする
我々は、ＧＦＰ ｍＲＮＡ標的配列の４つの変異体すべてについて実施例２Ａを繰り返した。我々は、２つのアーム供与ヘアピンプローブの６つの組み合わせで異なる、６つの異なるプローブ混合物を用いて、各標的配列変異体でサンプルをテストした。すべてのアッセイは、受容体プローブＬＡ６．１およびＲＡ６．３、ならびにＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含んだ。６つの組み合わせのそれぞれについての２つのアーム供与プローブを表１に示す。
我々は、ＧＦＰ ｍＲＮＡ標的配列の４つの変異体すべてについて実施例２Ａを繰り返した。我々は、２つのアーム供与ヘアピンプローブの６つの組み合わせで異なる、６つの異なるプローブ混合物を用いて、各標的配列変異体でサンプルをテストした。すべてのアッセイは、受容体プローブＬＡ６．１およびＲＡ６．３、ならびにＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４を含んだ。６つの組み合わせのそれぞれについての２つのアーム供与プローブを表１に示す。
【0125】
【表1】
【0126】
表１のシステム名称において、大文字は、２つの相互作用プローブペアの２つのアーム供与ヘアピンプローブのそれぞれについて、標的配列可変ヌクレオチドに向かい合うループヌクレオチド、およびそれが開くことから生じるシグナルの色、すなわち緑（ＴＭＲ）または赤（Ｃｙ５）のいずれかを特定する。
【0127】
表１の６つのプローブ混合物のそれぞれを４つの標的配列のそれぞれでテストした。各プローブ混合物について、２つの標的配列変異体は、２つのアーム供与プローブの１つに相補的であり、２つの標的配列変異体は、いずれのアーム供与プローブにも相補的ではない、すなわちそれらは、非類似の（ｎｏｎ－ｃｏｇｎａｔｅ）標的配列変異体である。例えば、ＧｇＴｒと指定されたプローブシステムは、我々が左側のアーム供与プローブと呼ぶ、標的配列変異体Ｃに相補的なループを有するアーム供与プローブと、我々が右側のアーム供与プローブと呼ぶ、標的配列変異体Ａに相補的なループ配列を有するアーム供与プローブとを含み、したがって、それら２つの標的配列変異体は、類似の変異体であり、一方標的配列変異体ＧおよびＴは、非類似の変異体であった。非類似の標的配列変異体を含んだアッセイは、左側のアーム供与ヘアピンプローブのハイブリダイゼーションおよび開放に由来するＴＭＲ蛍光色素分子または右側のアーム供与ヘアピンプローブのハイブリダイゼーションおよび開放に由来するＣｙ５蛍光色素分子のいずれかからの有意な蛍光シグナルを生成しなかった。類似の標的配列変異体を含んだアッセイの結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂの水平のパーセントバー（各バーは１００％を示す）において、ライトグレーの背景での斜線領域は、緑のスポット（ＴＭＲ）の割合を表し、連続するダークグレーの部分は、赤のスポット（Ｃｙ５）の割合を表す。
【0128】
実施例３．相互作用ヘアピンプローブのアレル識別能力の最適化
我々は、２つの標的配列変異体：アーム供与ヘアピンプローブのループに完全に相補的であった、ＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｇ）（配列番号１）、または単一のヌクレオチドによりアーム供与ヘアピンプローブのループにミスマッチであった、ＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ａ）（配列番号８）のいずれか１つを発現する細胞を用いる検出アッセイにおける相互作用ヘアピンプローブの４つのペアをテストした。本実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
我々は、２つの標的配列変異体：アーム供与ヘアピンプローブのループに完全に相補的であった、ＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｇ）（配列番号１）、または単一のヌクレオチドによりアーム供与ヘアピンプローブのループにミスマッチであった、ＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ａ）（配列番号８）のいずれか１つを発現する細胞を用いる検出アッセイにおける相互作用ヘアピンプローブの４つのペアをテストした。本実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
【0129】
【化4】
【0130】
前述の配列において、ヘアピンアーム配列には下線を引いている。
【0131】
第１のプローブペアにおいて、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ６．３は、１５ｎｔ長のループ配列を含み、それは５ｎｔ長のトーホールド相補配列を含んだ。その相互作用プローブであるアーム受容体ヘアピンプローブＲＡ６．２は、５ｎｔ長のトーホールド配列を含んだ。プローブＲＡ６．２の配列を参照すると、５’末端の２２ヌクレオチドが標的配列に相補的であり、次の５ヌクレオチド（ＧＧＡＣＴ）がトーホールド配列である。第２のプローブペアにおいて、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ６．１は、１５ｎｔ長のループ配列を含んだが、トーホールド相補配列を含まなかった；およびアーム受容体ヘアピンプローブＲＡ６．０は、トーホールド配列を含まなかった。第３のプローブペアにおいて、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ６．５は、１２ｎｔ長のループ配列を含んだが、トーホールド相補配列を含まなかった；およびアーム受容体プローブＲＡ６．０は、トーホールド配列を含まなかった。最後に、第４のプローブペアにおいて、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ６．７は、９ｎｔ長のループ配列を含んだが、トーホールド相補配列を含まなかった；およびアーム受容体プローブＲＡ６．０は、トーホールド配列を含まなかった。
【0132】
各ＨＣＲ検出は、上記の標的配列変異体の１つおよび相互作用ヘアピンプローブペアの１つに加えて、ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドＨ３およびＨ４の単一ペアを利用した。実施例２に記載のように反応を実施した。結果を図１１に示す。各パネルは、プローブハイブリダイゼーションおよびＨＣＲシグナル増幅後の細胞の顕微鏡画像である。ｍＲＮＡ標的配列相補体は、パネルの各列の上に示され、パネルの各列におけるアーム供与ヘアピンプローブの特徴は、パネルの左側に示される。
【0133】
実施例４．汎用ヘアピンを非ホスホジエステル結合を介して標的特異的プローブへ連結する
汎用（ｇｅｎｅｒｉｃ）ヘアピンおよび特定の標的に特異的な標的相補配列からアーム受容体プローブを調製する可能性を調査するために、我々は、クリックケミストリーを使用してアーム受容体プローブＲＡ６．３のバージョンを合成し、そのパフォーマンスをホスホジエステル結合のみを含む「通常の（ｎｏｒｍａｌ）」アーム受容体プローブＲＡ６．３と比較した。２つの構成要素のうち、汎用受容体ヘアピンオリゴヌクレオチドは、５’アミノ基で得られ、受容体標的相補配列オリゴヌクレオチドは、３’アミノ基で得られた。本実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
汎用（ｇｅｎｅｒｉｃ）ヘアピンおよび特定の標的に特異的な標的相補配列からアーム受容体プローブを調製する可能性を調査するために、我々は、クリックケミストリーを使用してアーム受容体プローブＲＡ６．３のバージョンを合成し、そのパフォーマンスをホスホジエステル結合のみを含む「通常の（ｎｏｒｍａｌ）」アーム受容体プローブＲＡ６．３と比較した。２つの構成要素のうち、汎用受容体ヘアピンオリゴヌクレオチドは、５’アミノ基で得られ、受容体標的相補配列オリゴヌクレオチドは、３’アミノ基で得られた。本実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
【0134】
【化5】
【0135】
前述の配列において、ステムアーム配列には下線を引いている。
【0136】
標的相補配列オリゴヌクレオチドの３’アミノ基は、４－アジドブチレート－Ｎ－ヒドロスクシンイミジルエステル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることによりアジド官能基に改変されるた。これとは別に、汎用受容体ヘアピンの５’末端のアミノ基は、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロスクシンイミジルエステル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）に共役された。両方の改変オリゴヌクレオチドは、高圧液体クロマトグラフィーにより精製された。２つのオリゴヌクレオチドは、等モル比でそれらを混合し、それらを５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）から構成されるバッファーで一晩インキュベートすることによりお互いに結合された。我々は、完全長の共役オリゴヌクレオチドプローブをＲＡ６．３－クリックと称する。それを、８Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して精製し、水に再懸濁し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して定量した。ＲＡ６．３－クリックを、上述のように、加熱および冷却によってそのヘアピン構造に折りたたんだ。次に、実施例１に記載したように、適切に折りたたまれたアーム受容体プローブＲＡ６．３－クリックをＨＣＲシグナル増幅でのハイブリダイゼーションアッセイおよび野生型ＧＦＰ ｍＲＮＡ標的配列変異体Ｇ（配列番号１）を発現する細胞を撮像するための顕微鏡検出において、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ６．６およびＨＣＲモノマーＨ３、Ｈ４と組み合わせて使用した。並行して、我々は、同じアッセイ方法において、「通常の」アーム受容体プローブＲＡ６．３を使用し、同じＧＦＰ ｍＲＮＡを発現する細胞を撮像した。代表的な画像を図１２に示す。
【0137】
実施例５．スモールガイドＲＮＡの検出
我々は、ＨｅＬａ細胞において、Ｃｏｘ－２遺伝子に対するガイドＲＮＡ標的配列を発現させた。この配列をプラスミドｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ピューロマイシン（Ａｄｄｇｅｎｅ）にインサートし、改変プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、実施例１に記載したように、細胞を固定化および透過処理した。
我々は、ＨｅＬａ細胞において、Ｃｏｘ－２遺伝子に対するガイドＲＮＡ標的配列を発現させた。この配列をプラスミドｐＧＬ３－Ｕ６－ｓｇＲＮＡ－ＰＧＫ－ピューロマイシン（Ａｄｄｇｅｎｅ）にインサートし、改変プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、実施例１に記載したように、細胞を固定化および透過処理した。
【0138】
Ｃｏｘ－２ガイドＲＮＡを検出するために、我々は、実施例１の方法において、ＨＣＲ増幅を開始する相互作用ヘアピンプローブペアを設計した。実施例１に記載したように、これらのプローブを調製し、精製した。本実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりであった。
【0139】
【化6】
【0140】
前述の配列において、ステムアーム配列には下線を引いている。
【0141】
ヘアピンプローブペアのハイブリダイゼーションおよび相互作用、ＨＣＲ増幅、ならびにイメージングを、実施例１に記載したように行った。結果を図１２に示す。これは、ＨｅＬａ細胞の画像を示し、ガイドＲＮＡに対応するスポットが核内に見える。このガイドＲＮＡをトランスフェクトされなかった細胞は、有意な数のスポットを生成しなかった（表示せず）。
【0142】
実施例６．ローリングサークル増幅と組み合わせて相互作用ヘアピンプローブを使用する
本実施例は、ｓｍ－ＦＩＳＨによる核酸標的配列を検出するためのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅を開始するための相互作用ヘアピンプローブペアの使用についての試薬および方法を記載する。本実施例の標的は、Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７：１０５４－１０６５により以前説明された改変ＧＦＰ遺伝子のアレイ３配列である。ＧＦＰ－アレイ３コンストラクトを安定して発現するチャイニーズハムスター細胞株をガラスカラースリップ上で培養し、その後ＨｅＬａ細胞についての前の実施例で記載したのと同じ方法で固定および透過処理する。
本実施例は、ｓｍ－ＦＩＳＨによる核酸標的配列を検出するためのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅を開始するための相互作用ヘアピンプローブペアの使用についての試薬および方法を記載する。本実施例の標的は、Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｃｅｌｌ １４７：１０５４－１０６５により以前説明された改変ＧＦＰ遺伝子のアレイ３配列である。ＧＦＰ－アレイ３コンストラクトを安定して発現するチャイニーズハムスター細胞株をガラスカラースリップ上で培養し、その後ＨｅＬａ細胞についての前の実施例で記載したのと同じ方法で固定および透過処理する。
【0143】
使用したオリゴヌクレオチドの配列は、以下のとおりである。
【0144】
【化7】
【0145】
ＲＣＡ用の環状テンプレートを作製するために、リニアオリゴヌクレオチド（配列番号３２）を、製造元の指示に従って、Ｔ７ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、その５’末端でリン酸化し、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）オリゴヌクレオチド（配列番号３３）とアニールし、その後Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて結合した。次に、環状化したテンプレートＤＮＡを、８５％ホルムアミド中、１００℃で１０分間の変性によりスプリントオリゴヌクレオチドから分離し、その後８Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により精製した。実施例１に記載したように、相互作用ヘアピンプローブペアを精製および調製した。
【0146】
相互作用ヘアピンプローブペア、アーム供与ヘアピンプローブＲＤＢ ＲＣＡおよびアーム受容体ヘアピンプローブＲＡ ＲＣＡを固定および透過処理した細胞の標的配列にハイブリダイズさせ（５０μｌのハイブリダイゼーション反応のそれぞれに対して、５ｎｇの各プローブ）、相互作用させることができる。過剰（未結合）プローブを実施例１に記載の方法で除去する。次に、環状化したテンプレートオリゴヌクレオチド（５０μｌのハイブリダイゼーション反応混合物中５ｎｇ）を添加し、１時間３７℃でハイブリダイズする。未結合（過剰）環状化したテンプレートをプローブ洗浄バッファーを用いて、２ラウンドの洗浄により除去する。その後、サンプルを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ ＤＴＴ、２５０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、および０．２５ｍＭの４つのヌクレオチドトリホスフェートのそれぞれで構成されるポリメラーゼバッファーで平衡化する。５０μｌの同じバッファーで、０．１２５Ｕ／μｌのｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下、１時間３７℃で、ＲＣＡシグナル増幅を行う。次に、カバースリップをＲＣＡ産物（５０μｌのプローブ洗浄バッファー中５ｎｇ）用のＴＭＲ標識検出プローブ（配列番号３６）を含む溶液に移し、３０分間３７℃、溶液中でインキュベートする。過剰（未結合）コピーの検出プローブをプローブ洗浄バッファーで２回の洗浄により除去し、実施例１に記載したように行われる顕微鏡観察のために、カバースリップを取り付ける。この手順において、高い処理能力と高い鎖置換能力とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することが重要である。この点において、ＤＮＡポリメラーゼバクテリオファージΦ２９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が最適な選択である。
【0147】
多くのバリエーションが上記方法の各工程について可能である。例えば、事前に作製した環状テンプレートを用いる代わりに、リニアバージョンの環状テンプレートを使用可能である。その場合、相互作用ヘアピンプローブの相互作用に起因する一本鎖ＲＣＡイニシエーター配列は、スプリントとして機能し、環状化は、ｉｎ－ｓｉｔｕライゲーション工程により達成されるであろう。これは、オリゴヌクレオチド調製に必要な労力を軽減するであろう。さらに、過剰の検出プローブの除去のための洗浄工程を必要とする、上記ＲＣＡ産物検出用のリニア検出プローブを使用する代わりに、同種の検出プローブ、好ましくは分子ビーコンプローブを利用できる。これは、必要に応じて、最後の洗浄工程を取り除くであろう。
【0148】
実施例７．相互作用ヘアピンプローブでのＨＣＲおよびｍＲＮＡのフローサイトメトリー検出を使用する
フローサイトメトリーにおいて、各細胞からの総合的な蛍光のみが記録され、顕微鏡検査とは異なり、スポット検出は、特定のシグナルとバックグラウンドシグナルとを区別するための補助として使用できないため、顕微鏡に基づく分析よりも細胞内ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく分析において、低レベルのバックグラウンドを達成することがより重要である。受動的にタグ付けされたプローブによるＨＣＲ検出および直接標識されたプローブによる検出よりも、相互作用ヘアピンプローブによるＨＣＲ検出がフローサイトメトリーでのより高いシグナル対バックグラウンド比を得られることを明らかにするために、我々は、３つのプローブタイプのすべてを用いて初代血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＩＦＮγ ｍＲＮＡを検出した。ＰＢＭＣｓは、それらの静止状態ではＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現しないが、それらがホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテートおよびイオノマイシンで刺激された場合、それらの約１５％がＩＦＮγ ｍＲＮＡを合成することによって応答する（Ｂｕｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：８３６－８４１）。ほとんどの細胞は、まったくＩＦＮｇ ｍＲＮＡを発現しないため、このシステムは、同じ細胞集団からのシグナルおよびバックグラウンドレベルの評価を可能にする。
フローサイトメトリーにおいて、各細胞からの総合的な蛍光のみが記録され、顕微鏡検査とは異なり、スポット検出は、特定のシグナルとバックグラウンドシグナルとを区別するための補助として使用できないため、顕微鏡に基づく分析よりも細胞内ＲＮＡのフローサイトメトリーに基づく分析において、低レベルのバックグラウンドを達成することがより重要である。受動的にタグ付けされたプローブによるＨＣＲ検出および直接標識されたプローブによる検出よりも、相互作用ヘアピンプローブによるＨＣＲ検出がフローサイトメトリーでのより高いシグナル対バックグラウンド比を得られることを明らかにするために、我々は、３つのプローブタイプのすべてを用いて初代血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＩＦＮγ ｍＲＮＡを検出した。ＰＢＭＣｓは、それらの静止状態ではＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現しないが、それらがホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセテートおよびイオノマイシンで刺激された場合、それらの約１５％がＩＦＮγ ｍＲＮＡを合成することによって応答する（Ｂｕｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：８３６－８４１）。ほとんどの細胞は、まったくＩＦＮｇ ｍＲＮＡを発現しないため、このシステムは、同じ細胞集団からのシグナルおよびバックグラウンドレベルの評価を可能にする。
【0149】
プローブ配列および合成
対応するｃＤＮＡ配列として示される、ＩＦＮγ ｍＲＮＡの配列を以下に示す。
対応するｃＤＮＡ配列として示される、ＩＦＮγ ｍＲＮＡの配列を以下に示す。
【0150】
【化8】
【0151】
プローブ配列は、以下のとおりであった。
【0152】
４８の短く、直接標識されたプローブ
ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における下線およびグレーの網掛けされた配列の逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）。
ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における下線およびグレーの網掛けされた配列の逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）。
【0153】
受動的に標識されたＨＣＲプローブ
同じセットの配列を受動的にタグ付けされたＨＣＲプローブの標的相補領域についても使用した。しかし、それらの３’末端では、ＨＣＲのイニシエーターとして機能する次の配列ＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣ（配列番号３８）が付加された。
同じセットの配列を受動的にタグ付けされたＨＣＲプローブの標的相補領域についても使用した。しかし、それらの３’末端では、ＨＣＲのイニシエーターとして機能する次の配列ＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣ（配列番号３８）が付加された。
【0154】
２３の右側のアーム供与ヘアピンプローブ
それらの一般的な配列は、ＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣＮＮＮ．．．ＮＮＮＧＴＧＧＧＡ（配列番号３９）であり、ＮＮＮ．．．ＮＮＮは、上記ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における２３の下線付きの配列の１つの逆相補体を示し、ＮＮＮ．．．ＮＮＮの左側の配列、すなわちＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡ（配列番号４０）は、各プローブの右側のアームであり（図３Ａの領域ｆ’およびｅ’に対応する）、ＮＮＮ．．．ＮＮＮの右側の配列、すなわちＧＴＧＧＧＡ（配列番号４１）は、この配列の一部分に相補的である（図３Ａの領域ｅに対応する）。
それらの一般的な配列は、ＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡＣＮＮＮ．．．ＮＮＮＧＴＧＧＧＡ（配列番号３９）であり、ＮＮＮ．．．ＮＮＮは、上記ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における２３の下線付きの配列の１つの逆相補体を示し、ＮＮＮ．．．ＮＮＮの左側の配列、すなわちＧＴＴＡＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＡ（配列番号４０）は、各プローブの右側のアームであり（図３Ａの領域ｆ’およびｅ’に対応する）、ＮＮＮ．．．ＮＮＮの右側の配列、すなわちＧＴＧＧＧＡ（配列番号４１）は、この配列の一部分に相補的である（図３Ａの領域ｅに対応する）。
【0155】
２３の右側の受容体ヘアピンプローブ
それらの配列は、最初の１つを除き、その３’末端に実施例４に記載の汎用アーム受容体プローブヘアピン（配列番号２６）がそれぞれに付加された、上記ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における網掛けされた配列の逆相補体であった。
それらの配列は、最初の１つを除き、その３’末端に実施例４に記載の汎用アーム受容体プローブヘアピン（配列番号２６）がそれぞれに付加された、上記ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における網掛けされた配列の逆相補体であった。
【0156】
Ｃｙ５蛍光色素分子を短く、直接標識されたプローブのそれぞれの３’末端に共役させた。右側のアーム供与ヘアピンプローブのそれぞれを完全に自動化されたＤＮＡ合成（ＩＤＴ ＤＮＡ Ｉｎｃ．）により調製した。一方、右側の受容体プローブのそれぞれをクリックケミストリーによりプローブの標的特異的な部分に汎用の右側の受容体ヘアピンを連結することにより調製した。このために、我々は、それぞれ当モル濃度の２３オリゴヌクレオチド（最初および最後のものを除き、上記ＩＦＮγ ｃＤＮＡ配列における網掛けされた配列の逆相補体を有する）のプールから始め、次に、実施例４に記載されるように、それらを３’末端で汎用アーム受容体プローブヘアピン（配列番号２６）に結合させた。クリックケミストリーを介するそれらの合成の後、実施例４に記載されるように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により右側の受容体プローブを精製した。右側のアーム供与ヘアピンプローブおよび右側の受容体プローブ（それぞれプールとして）を９５℃で２分間加熱し、２Ｘ ＳＳＣ（別々のチューブ内）中、室温で１０分間冷却して、それらがそれぞれのヘアピンを適切に形成していたことを確認することができた。
【0157】
ＰＢＭＣｓは、血液から精製された。一部は、刺激されず（「静止（ｒｅｓｔｉｎｇ）」）、一部は、ＰＭＡおよびイオノマイシンにより刺激された。刺激されなかった細胞および刺激された細胞の両方をホルムアルデヒドで固定し、アルコールで透過処理し、Ｂｕｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９４：８３６－８４１に記載されているような短く、直接標識されたプローブのセットでプローブした。ハイブリダイゼーション反応の並行セットにおいて、我々はまた、受動的にタグ付けされたＨＣＲプローブのセットを用いておよび相互作用ヘアピンプローブのセットを用いて細胞をプローブした。５０μｌのハイブリダイゼーション反応のそれぞれについて、我々は、２５ｎｇの短く、直接標識されたプローブまたは２５０ｎｇの受動的にタグ付けされたプローブまたは２５０ｎｇの右側の受容体プローブセットと一緒に２５０ｎｇの右側の供与ビーコンプローブセットを使用した。上述のように、各プローブセットを当モル濃度の複数のプローブで構成した。３７℃での一晩のハイブリダイゼーションの後、細胞をプローブ洗浄バッファー中で２回洗浄した。短く、直接標識されたプローブでの反応をこの工程後分析したが、受動的にタグ付けされたＨＣＲプローブでの反応および相互作用ヘアピンプローブでの反応をＨＣＲバッファーで洗浄し、実施例１に記載されたように、２時間３７℃で、Ｃｙ５で標識されたＨＣＲヘアピンＨ３およびＨ４用いてＨＣＲ増幅を行った。ＨＣＲ後、細胞をＨＣＲバッファーで２回、プローブ洗浄バッファーで１回洗浄し、分析した。実施例１に記載されるように、フローサイトメトリー分析を行った。
【0158】
フローサイトメトリー分析の結果を図１４に示す。右側の列のパネルは、刺激された細胞を表し、左側の列のパネルは、静止細胞を表す。一番上の行のパネルは、短く、直接標識されたプローブのセットでのプロービングからの結果であった。真ん中の行のパネルは、受動的にタグ付けされたＨＣＲプローブのセットでのプロービングからの結果であった。一番下の行のパネルは、相互作用ヘアピンＨＣＲプローブのセットからの結果であった。これらの散布図の各スポットは、単一の細胞を表し、横軸は、細胞のＣｙ５蛍光を表し、縦軸は、同じ細胞の側方散乱を表す（後者のパラメーターは、細胞のサイズに関する）。
【0159】
左側のパネルの細胞は、単一のクラスターで現れ、そのピーク蛍光強度は、各パネル上の垂直バーで表される。ピーク強度の値は、短く、直接標識されたプローブのセットでは、９２０蛍光ユニット、受動的に標識されたＨＣＲプローブのセットでは、９６００ユニット、相互作用ヘアピンＨＣＲプローブのセットでは、６５０であった。一方、右側のパネルの刺激された細胞は、２つのクラスターに分かれる。左側のクラスターは、応答しない細胞を表し、右側のクラスターは、ＩＦＮγｇ ｍＲＮＡを産生する細胞を表し、よってこれがより蛍光を発した。各パネルの右側のクラスターのピーク蛍光は、垂直バーで示される。これらのピーク強度の値は、短く、直接標識されたプローブのセットでは、３７０００任意の蛍光ユニット（ａ．ｕ．）、受動的に標識されたＨＣＲプローブのセットでは、３７３，０００ユニット、相互作用ヘアピンＨＣＲプローブのセットでは、６６，０００であった。
【0160】
実施例８．ガン細胞株における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｍＲＮＡの突然変異Ｌ８５８Ｒを検出する
細胞株Ｈ１９７５およびＨｅＬａ細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ）から入手し、サプライヤーの指示に従って培養した。細胞株Ｈ１０７５は、ＥＧＦＲ遺伝子（ヘテロ接合体）の２つのコピーの１つにおいて体細胞変異Ｌ８５８Ｒを有し、一方ＨｅＬａ細胞株は、その変異を有さない。突然変異は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの位置２５７３でチミジン（Ｔ）残基をグアノシン（Ｇ）残基に変える。
細胞株Ｈ１９７５およびＨｅＬａ細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ）から入手し、サプライヤーの指示に従って培養した。細胞株Ｈ１０７５は、ＥＧＦＲ遺伝子（ヘテロ接合体）の２つのコピーの１つにおいて体細胞変異Ｌ８５８Ｒを有し、一方ＨｅＬａ細胞株は、その変異を有さない。突然変異は、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの位置２５７３でチミジン（Ｔ）残基をグアノシン（Ｇ）残基に変える。
【0161】
プローブ配列および合成
対応するｃＤＮＡ配列として示される、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの配列を以下に示す。
対応するｃＤＮＡ配列として示される、ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの配列を以下に示す。
【0162】
【化9】
【0163】
【化10】
【0164】
Ｌ８５８Ｒ変異の対象となるチミジン残基は太字および括弧内である。
【0165】
４８の短く、直接標識されたプローブ
上記ＥＧＦＲ ｃＤＮＡ配列の下線が引かれた配列の逆相補体。２４は、突然変異の対象となるヌクレオチド（Ｔ）を含む網掛けの配列の５’であり、２４は、その配列の３’である。
上記ＥＧＦＲ ｃＤＮＡ配列の下線が引かれた配列の逆相補体。２４は、突然変異の対象となるヌクレオチド（Ｔ）を含む網掛けの配列の５’であり、２４は、その配列の３’である。
【0166】
右側のアーム供与ヘアピンプローブ ＥＧＦＲ ３．１（変異体）
【0167】
【化11】
【0168】
ステムを形成する配列には下線が引かれている。一本鎖ループを形成し、変異標的に相補的であるヌクレオチドは太字である。単一ヌクレオチド変異のヌクレオチドは括弧内である。
【0169】
左側のアーム供与ヘアピンプローブ ＥＧＦＲ３．０（野生型）
【0170】
【化12】
【0171】
ステムを形成する配列には下線が引かれている。一本鎖ループを形成し、野生型標的に相補的であるヌクレオチドは太字である。突然変異の対象となるヌクレオチドは括弧内である。
【0172】
右側の受容体ヘアピンプローブ ＥＧＦＲ３．０
【0173】
【化13】
【0174】
ステムを形成する配列には下線が引かれている。変異および野生型標的に相補的であるヌクレオチドは太字である。
【0175】
左側の受容体ヘアピンプローブ ＥＧＦＲ３．０
【0176】
【化14】
【0177】
ステムを形成する配列には下線が引かれている。変異および野生型標的に相補的であるヌクレオチドは太字である。
【0178】
相互作用ヘアピンプローブをＩＤＴ ＤＮＡ Ｉｎｃ．から入手し、その後実施例４に記載したように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。右側のアーム供与プローブおよび右側の受容体プローブを９５℃で２分間加熱し、２Ｘ ＳＳＣ中（別々のチューブ内）、１０分間室温で冷却して、それらがそれぞれのヘアピンを適切に形成したことを確認できた。短く、直接標識されたプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ＬＧＣからの３’アミノ基で得られ、次にＴｅｘａｓ Ｒｅｄ色素に結合した。標識されたプローブをＲａｊ ｅｔ ａｌ． （２００８）によって説明されたように精製した。
【0179】
実施例１に記載したように、細胞をカバースリップ上で培養し、固定および透過処理した。
【0180】
第１の実験では、プローブハイブリダイゼーション反応混合物（５０μｌ）は、２５ｎｇのプールされた短く、直接標識されたプローブ、５ｎｇの右側のアーム供与ヘアピンプローブＥＧＦＲ３．１（変異体）、左側のアーム供与ヘアピンプローブＥＧＦＲ３．１（野生型）、右側の受容体ヘアピンプローブＥＧＦＲ３．０、および左側の受容体ヘアピンプローブＥＧＦＲ３．０のそれぞれを含んだ。これらのプローブに加えて、ハイブリダイゼーション混合物はまた、１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、０．０２％ ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅウシ血清アルブミン（Ａｍｂｉｏｎ）、１０％ホルムアミドおよび２ｘ ＳＳＣを含んだ。このハイブリダイゼーション反応混合物を伸ばしたパラフィルム上に置き、カバースリップをその上に細胞を下向きして置き、その後一晩湿潤チャンバー内、５０℃でインキュベートした。カバースリップをプローブ洗浄バッファーで２回、ＨＣＲバッファーで１回洗浄した。
【0181】
第２の実験では、プローブハイブリダイゼーションを２つの工程で行い、アーム供与ヘアピンプローブの濃度を上げた。第１の工程では、ハイブリダイゼーション反応混合物は、左側および右側の受容体プローブを含んだが、アーム供与ヘアピンプローブを含まなかった。６時間にしたこと以外上記と同じ条件下で行った、このハイブリダイゼーション後、過剰の受容体プローブをプローブ洗浄バッファーでカバースリップを２回連続して洗浄することにより除去した。その後、２回目のハイブリダイゼーションを、２０ｎｇの右側および左側のアーム供与ヘアピンプローブのそれぞれを含んだが受容体プローブを含まなかった反応混合物で行った。２回目のハイブリダイゼーションを一晩行った。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識プローブは、両方のハイブリダイゼーション反応に含まれていた。過剰のアーム供与プローブを洗浄により除去した。
【0182】
次に、両方の実験において、実施例１に記載したように、ＨＣＲ増幅をＨＣＲバッファー中で行った。ＨＣＲ反応混合物は、２セットのＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチド：Ｃｙ５標識Ｈ３およびＨ４、ならびにＴＭＲ標識Ｈ１およびＨ２を含んだ。過剰（未使用）ＨＣＲヘアピンオリゴヌクレオチドを除去した後、カバースリップを、Ｐｒｉｍｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｓＣＭＯＳカメラを用いて、ＤＩＣ、ＤＡＰＩ、ＴＭＲ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＣｙ５チャンネルにおいて、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡、開口数１．４、６３倍の対物レンズで撮像した。ＴＭＲ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄおよびＣｙ５チャンネルにおいて、お互いに０．２μｍ離れた１６の光学セクションを取得した。これらのｚ－スタックを、各チャンネルにおいて、３－Ｄでスポットを同定し、その後チャンネルの各ペアの間の共局在化したスポットを同定するカスタムＭＡＴＬＡＢイメージプロセッシングプログラムにより分析した（Ｖａｒｇａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。３つのスポットすべてで共局在化されたスポットは、ほとんど見つからなかった。
【0183】
第１の実験からの画像および画像分析を図１５において細胞株Ｈ１９７５（上の行）およびＨｅＬａ細胞株（下の行）のそれぞれ１細胞から示す。各行の水平パネルは、示すように４つの異なるチャンネル（ＴＭＲ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ５およびＤＩＣ）から得られた同じ細胞の画像を表す。画像は、ｚ－スタックの中心レイヤーに対応する右側のＤＩＣパネルを除き、ｚ－スタックに由来する最大強度の投影である。ＤＩＣパネルは、図の一番下で示されるキーで同定された各種類のスポットの位置を表示する。
【0184】
表２は、２つの実験からの単一細胞の画像においてスポットをカウントした結果を示す。スポットの数を異なるカテゴリーのスポットで表す：Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポットの総数、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化しなかった（「単独」）ＴＭＲスポットの数、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化しなかったＣｙ５スポットの数、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化したＴＭＲスポットの数、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄスポットと共局在化したＣｙ５スポットの数。上の２行は、第１の実験（１ステッププローブハイブリダイゼーション）における単一細胞、すなわち図１５に示される細胞のカウントである。次の２行は、第１の実験からの６０細胞のカウントの平均である。下の２行は、第２の実験（２ステッププローブハイブリダイゼーション）からの５０細胞のカウントの平均である。標準偏差は、報告された値の約３０％であった。
【0185】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】