特許 7241422 ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-09

(45)【発行日】2023-03-17

(54)【発明の名称】ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230310BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20230310BHJP

   C12Q 1/24 20060101ALI20230310BHJP

   C12M 1/12 20060101ALI20230310BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230310BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230310BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20230310BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230310BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20230310BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/24

C12M1/12

A61K45/00

A61P35/00

A61K31/4545

G01N33/50 P

C12N15/11 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2020504378

(86)(22)【出願日】2018-07-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-10-01

(86)【国際出願番号】 KR2018008046

(87)【国際公開番号】W WO2019031722

(87)【国際公開日】2019-02-14

【審査請求日】2020-01-23

(31)【優先権主張番号】10-2017-0099591

(32)【優先日】2017-08-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520029457

【氏名又は名称】サイトジェン インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＹＴＯＧＥＮ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】（Ｍｏｏｎｊｕｎｇ－ｄｏｎｇ，Ｍｏｏｎｊｕｎｇ ＳＫ Ｖ１ ＧＬ Ｍｅｔｒｏｃｉｔｙ） Ａ－８，１２８，Ｂｅｏｂｗｏｎ－ｒｏ Ｓｏｎｇｐａ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０５８３９，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ビョン ヒ

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１６－０００１３０４（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国登録特許第１０－１２５４６７９（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１１－０１１５４７８（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国登録特許第１０－１２５４６８０（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】韓国登録特許第１０－１２２６５１５（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】国際公開第２０１７／１８１１８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】TAN, C. L. et al. ，Concordance of anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements between circulating tumor cells and tumor in non-small cell lung cancer，Oncotarget，2016年，Vol.7, No.17，P.23251-23262

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の気孔を有し、気孔径（ｐｏｒｅ－ｓｉｚｅ）が５．５～８．５μｍであり、ＢＳＡ溶液でコーティングされた細胞分離用マイクロチップを用いて、癌患者から取得された液体生検サンプルから、血中循環癌細胞を分離するステップと、
前記分離された血中循環癌細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも３成分を含む培地で培養するステップと、
前記培養された血中循環癌細胞からＲＮＡを分離するステップと、
前記分離されたＲＮＡを鋳型とし、２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行うステップと、
前記ｑＲＴ－ＰＣＲの産物を鋳型とし、前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーに対する２つのｎｅｓｔｅｄプライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うステップと、
前記ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲの産物によりＥＭＬ－ＡＬＫ遺伝子の変異型を検出するステップと、を含む
ことを特徴とするＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項2】

前記液体生検サンプルは、血液である
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項3】

前記癌は、肺癌である
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項4】

前記癌は、非小細胞肺癌である
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項5】

前記血中循環癌細胞を分離するステップは、大気圧１０００～１０２０ｈＰａ下で行われる
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項6】

前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、０．０５～０．１５％の濃度で行われる
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項7】

前記ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子の変異型は、Ｖ１型またはＶ３型である
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項8】

前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーのうちの一方は、フォワードｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーであり、他方は、リバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーである
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項9】

前記フォワードｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーは、配列番号１、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される１つである
請求項８に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項10】

前記リバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーは、配列番号２である
請求項８に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項11】

前記２つのｎｅｓｔｅｄプライマーのうちの一方は、フォワードｎｅｓｔｅｄプライマーであり、他方は、リバースｎｅｓｔｅｄプライマーである
請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項12】

前記フォワードｎｅｓｔｅｄプライマーは、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号１０からなる群から選択される１つである
請求項１１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項13】

前記リバースｎｅｓｔｅｄプライマーは、配列番号２または配列番号９である
請求項１１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法。

【請求項14】

請求項１に記載のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法により得られた癌患者の遺伝子変異が、
（ｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－１３＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－２０＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ａ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ｂ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１５＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４＋１１ｂｐサイズのオリゴヌクレオチドからなるリンカー＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のイントロン１９＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、からなる群から選択されたいずれか１つと一致すれば、
前記癌患者は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異をターゲットにする抗癌剤の投与による治療効果の期待できる癌患者であると評価する
ことを特徴とする癌患者スクリーニング方法。

【請求項15】

前記癌は、肺癌である
請求項１４に記載の癌患者スクリーニング方法。

【請求項16】

前記癌は、非小細胞肺癌である
請求項１４に記載の癌患者スクリーニング方法。

【請求項17】

前記抗癌剤は、クリゾチニブである
請求項１４に記載の癌患者スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異の検出方法に係り、さらに詳しくは、血中循環癌細胞ベースのＥＭＬ４－ＡＬＫ変異検出用ＰＣＲプライマー対、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを用いたＥＭＬ４－ＡＬＫ変異の検出方法および非小細胞肺癌患者の血液由来癌細胞を利用して、抗癌剤の非小細胞肺癌患者スクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

肺癌は、２０１０年に韓国において発生した全ての癌患者（２０２，０５３人）のうちの４位（１０．３％）を占めるほど韓国人に一般的な癌である。しかし、５年生存率は１９．７％で、他の癌に比べて予後が悪い。肺癌は、癌細胞の大きさや形状を顕微鏡で見ると、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とに分類され、このように非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを区別するということは、臨床的経過と治療が異なるからである。２０１１年に発表された、韓国の中央癌登録本部の資料によると、２００９年に韓国で発生した癌は１９２，５６１件であり、その中で非小細胞肺癌は、男女を合わせ１４，３００件であり、非小細胞肺癌は、全ての肺癌発生１９，６８５件の７２．６％を占めた。男女の性比は２．５：１で男の方が多かった（韓国の保健福祉部・中央癌登録本部２０１１年１２月２９日の発表資料）。ＡＬＫ陽性非小細胞肺癌は、２つの遺伝子ＡＬＫとＥＭＬ４の融合によって引き起こされる肺癌であり、全ての非小細胞肺癌患者の４～７％（東洋人７％）に相当する患者がＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異を有し、韓国の非小細胞肺癌患者１６７人のうちの１０人がＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を有すると報告された（非特許文献１）。

【0003】

上記ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異による非小細胞肺癌に対する標的抗癌剤は、ファイザー社が開発したザーコリ（登録商標）（一般名：クリゾチニブ）である。２０１１年８月にアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）がザーコリと共同でアボット社のコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を承認した以来、アメリカの腫瘍学コミュニティで広く使用され、臨床的に証明され、標準化された遺伝子検査法になった。ヨーロッパでのＣＥ－ＩＶＤテストに承認されており、２０１１年９月から医療現場で使用されており、主に学術研究と新しい治療法の評価をサポートするために使用されている。ザーコリの出現後、非小細胞肺癌の治療は、ＥＧＦＲ変異検査の後、変異体の有無に応じて、イレッサ又は姑息的細胞毒性抗癌剤（治療効果が低く、副作用が強い）を投薬する標準的な治療方法から、ＥＧＦＲ、ＥＭＬ４－ＡＬＫ検査の後、イレッサ／ザーコリ／姑息的細胞毒性抗癌剤のうちから治療方法を選択する方式に、そのパラダイムが転換された。ＡＬＫ遺伝子変異は、様々なタイプの遺伝子融合を示し、これを検出するための方法として、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ＲＴ－ＰＣＲ、ＦＩＳＨなどが臨床に使用でき、現在は、クリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）投与のための標準的なコンパニオン診断テストとして、ＦＤＡにより承認されたアボット社のＶｙｓｉｓ ＡＬＫ ＦＩＳＨ方法が利用されている。しかし、この方法は難しく複雑なので、多数の患者をテストするのに多くの費用と時間がかかるという問題がある。さらに、解剖学的特性上、肺癌組織の採取が難しいため、前記ＡＬＫ－ＦＩＳＨ検査が不可能な患者が８～１８％（非特許文献２）に達することが知られており、これに対する代案の模索が切実に求められている。

【0004】

一方、血中循環癌細胞（ＣＴＣ、ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ）とは、原発腫瘍組織から離れ出て血流に循環する少数の腫瘍細胞であり、癌の種類に応じて、血液１ｍＬあたり１から数千の血中循環癌細胞が存在する。血中循環癌細胞を用いた検査法は、従来の組織検査を置き換えることができる強力な技術であり、低コスト、組織検査による患者の苦痛と危険を低減し、ターゲット薬物の迅速な選択により患者の寿命を延ばすことができるというメリットがある。

【0005】

そこで、本発明者らは、肺癌組織の採取が困難な患者に抗癌剤、例えばクリゾチニブ（ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ）を投与できるようにするための遺伝子検査法の開発に鋭意努力し、その結果、血中循環癌細胞の形で存在する肺癌細胞を捕獲して、前記血中循環肺癌細胞のＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を高精度で確認する方法を開発し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２７：２２８－２３０，２０１２

【文献】Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ８４：３９－４４，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ２０１４．４．１０

【文献】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２７：２２８－２３０，２０１２

【文献】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）

【文献】Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）

【文献】Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、血中循環癌細胞ベースのＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異を高精度で確認するためのＥＭＬ４－ＡＬＫ変異検出用ＰＣＲプライマー対を提供することである。本発明の他の目的は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型変異を高精度に検出する方法を提供することである。本発明のまた他の目的は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型変異を高精度に検出する方法を提供することにある。

【0008】

本発明のまた他の目的は、非小細胞肺癌患者の血液由来の癌細胞を用いて、癌患者への抗癌剤の有効可能性を通じて、癌患者をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明の別の目的は、非小細胞肺癌患者における血液由来の癌細胞の使用を通じて、癌患者への抗癌剤の入手可能性を通じて、癌患者をスクリーニングする方法を提供することである。

【0009】

本発明が解決しようとする技術的課題は、上述した技術的課題に何ら制限されるものではなく、未言及の他の技術的課題は、次の記載から本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって明らかに理解できる筈である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記技術的課題を達成するために、本発明の一側面によるＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法は、
癌患者から液体生検サンプルを取得するステップと、
バイオチップを用いて、前記液体生検サンプルから血中循環癌細胞を分離するステップと、
前記分離された血中循環癌細胞からＲＮＡを分離するステップと、
前記分離されたＲＮＡを鋳型とし、２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行うステップと、
前記ｑＲＴ－ＰＣＲの産物を鋳型とし、前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーに対する２つのｎｅｓｔｅｄプライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うステップと、
前記ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲの産物によりＥＭＬ－ＡＬＫ遺伝子の変異型を検出するステップと、
を含んでいてもよい。

【0011】

本発明の実施例において、前記液体生検サンプルは、血液であってもよい。

【0012】

本発明の実施例において、前記癌は、肺癌であってもよい。

【0013】

本発明の実施例において、前記癌は、非小細胞肺癌であってもよい。

【0014】

本発明の実施例において、前記血中循環癌細胞を分離するステップは、大気圧１０００～１０２０ｈＰａ下で行われてもよい。

【0015】

本発明の実施例において、前記バイオチップは、ＢＳＡ溶液でコーティングされた高密度マイクロチップであってもよい。

【0016】

本発明の実施例において、前記高密度マイクロチップは、サイズ特異性を有してもよい。

【0017】

本発明の実施例において、前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、０．０５～０．１５％の濃度で行われてもよい。

【0018】

本発明の実施例において、前記ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子の変異型は、Ｖ１型またはＶ３型であってもよい。

【0019】

本発明の実施例において、前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーのうちの一方は、フォワードｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーであり、他方は、リバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーであってもよい。

【0020】

本発明の実施例において、前記フォワードｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーは、配列番号１、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される１つであってもよい。

【0021】

本発明の実施例において、前記リバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーは、配列番号２であってもよい。

【0022】

本発明の実施例において、前記２つのｎｅｓｔｅｄプライマーのうちの一方は、フォワードｎｅｓｔｅｄプライマーであり、他方は、リバースｎｅｓｔｅｄプライマーであってもよい。

【0023】

本発明の実施例において、前記フォワードｎｅｓｔｅｄプライマーは、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号１０からなる群から選択される１つであってもよい。

【0024】

本発明の実施例において、前記リバースｎｅｓｔｅｄプライマーは、配列番号２または配列番号９であってもよい。

【0025】

上記技術的課題を達成するために、本発明の他の一側面による癌患者スクリーニング方法では、
本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法により得られた癌患者の遺伝子変異が、
（ｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－１３＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－２０＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ａ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ｂ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１５＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４＋１１ｂｐサイズのオリゴヌクレオチドからなるリンカー＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のイントロン１９＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、からなる群から選択されたか１つと一致すれば、抗癌剤は、前記癌患者に対して有効可能性があることを示すことができる。

【0026】

本発明の実施例において、前記癌は、肺癌であってもよい。

【0027】

本発明の実施例において、前記癌は、非小細胞肺癌であってもよい。

【0028】

本発明の実施例において、前記抗癌剤は、クリゾチニブであってもよい。

【発明の効果】

【0029】

本発明の実施例によれば、肺癌組織の採取が困難でＡＬＫ－ＦＩＳＨ検査が実施できない肺癌患者でも、血中循環癌細胞を用いてＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を検出可能であり、これによりＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を標的とする抗癌剤の投与に適しているかどうかを容易に確認することができる。

【0030】

本発明の効果は、前述した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明の欄または特許請求の範囲に記載の発明の構成から推論可能なあらゆる効果を含むものと理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】血中循環癌細胞を分離する過程を示す説明図

【図2】高密度マイクロチップによって分離された血中循環癌細胞を撮影した写真

【図3】本発明による培養液で培養された血中循環癌細胞の成長と分裂、および一般的な培養液で培養された血中循環癌細胞の成長と分裂について示すグラフ

【図4】本発明による培養液を用いて、本発明で使用されるハイドロゲルコーティングされた培養プレートで培養された血中循環癌細胞の成長と分裂、および一般的な培養プレートで培養された血中循環癌細胞の成長と分裂について示すグラフ

【図5】公知のＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異の検出方法によるＶ１型遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図6】本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異検出用プライマーを用いたＶ１型遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図7】本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異検出用プライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ実行によるＶ１型遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図8】公知のＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異の検出方法によるＶ３遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図9】本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異検出用プライマーを用いたＶ３型遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図10】本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異検出用プライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ実行によるＶ３型遺伝子変異の検出結果を示す説明図

【図11】本発明によるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異検出用プライマーを用いて、実際の患者のサンプルに適用した結果を示す説明図

【図12】Ｈ３１２２細胞株におけるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異のｑＲＴ－ＰＣＲグラフ

【図13】Ｈ２２２８細胞株におけるＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異のｑＲＴ－ＰＣＲグラフ

【発明を実施するための最良の形態】

【0032】

以下、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳細に説明する。しかしながら、本発明は、種々の異なる形態に具現化でき、ここで説明する実施例に限定されるものではない。

【0033】

実施例１：高密度マイクロチップの製造
実験で使用されている高密度マイクロチップは、気孔径（ｐｏｒｅ－ｓｉｚｅ）が５．５～８．５μｍであるため、５．５μｍよりも小さい白血球（ＷＢＣ；ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）および赤血球（ＲＢＣ；ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）の場合、チップを通過させて除去し、５．５μｍよりも大きい標的細胞の場合、チップを通過させないようにすることで、特定のサイズを選択的に回収できるように考案したマイクロチップである。

【0034】

ちなみに、高密度マイクロチップの細胞回収率を確認するために、癌患者の癌細胞を１０個、１００個、１０００個スパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）して、それをチップに通過させて、チップ上の癌細胞の回収率を調べる実験を行った。その結果を下記表１に示す。

【0035】

【表1】

【0036】

チップの細胞回収率を計算した結果、約８０％以上の高い細胞回収率を示し、回収された細胞が癌細胞であることを再び確認するために、従来の癌検定で使われているＣＫ抗体を染色して確認した結果、いずれもＣＫ陽性癌細胞であることが確認された。

【0037】

実施例２：血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の分離過程
１．血液５ｍｌに抗体重合体２５０μｌを入れ、３秒程度混合した後、常温で２０分間反応させる。
２．１％ＦＢＳを含むＰＢＳ５ｍｌを加える。
３．Ｆｉｃｏｌｌ溶液１５ｍｌが入っている５０ｍｌチューブ（ｔｕｂｅ）に反応溶液１０ｍｌを注意深く入れる。
４．溶液を１２００ｇで２０分間遠心分離し、血球細胞を１次的に除去する。
５．不要な細胞吸着を防止するために、高密度マイクロチップ（ＨＤ Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｃｈｉｐ、濾過網）を０．１％ＢＳＡ溶液で１０分間処理してコーティングした後、ＰＢＳでリンスする。
６．Ｆｉｃｏｌｌの上層溶液を濾過網上に置き、微量に存在する赤血球を重力濾過して、高純度の血中循環癌細胞を２次的に分離する。これにより、遠心分離や免疫ビーズ（ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ）などの処理を行わないことにより、血中循環癌細胞の損傷を防ぐ。
７．分離された血中循環癌細胞は染色により同定される。

【0038】

実施例３.分離された血中循環癌細胞の短期培養
本発明による高密度マイクロチップにより分離された血中循環癌細胞を、中性電荷を有する親水性ハイドロゲルでコーティングされた超低付着（Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）培養プレートに播種した。前記培養プレートには、１１ｎｇ／ｍｌのインスリン、２２ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン、２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび８μＭのＲＯＣＫ阻害剤を含む培養液が含まれており、前記短期培養は、培養した時点から１４日間、細胞培養インキュベーターで３７℃および５～１０％ＣＯ_２の条件下で行われた。

【0039】

実施例４．血中循環癌細胞の確認
前記実施例３により短期培養された血中循環癌細胞が染色法により癌細胞であることを確認するために、下記の方法を用いて細胞染色工程を行う。

【0040】

１．細胞遠心分離法であるサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）工程を行い、回収した細胞を染色用スライドに固定する。
２．抗体が細胞内に入ることができるように、透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）工程を行う。
３．ＰＢＳで洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）工程を行う。
４．ＰＢＳを用いて１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ウシ血清アルブミン）を得、非特異的結合（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）および内因性ペルオキシダーゼ活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を低下させるために、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）工程を行う。
５．１次抗体としてのＥｐＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：上皮細胞接着分子）、ＣＫ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ：サイトケラチン）、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：分化抗原群）４５を、常温で６０分間反応させる。
６．前記１次抗体に結合する蛍光標識された二次抗体を、室温で６０分間反応させる。
７．ＰＢＳで洗浄工程を行う。
８．最後に、細胞核を染色するために、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ：４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）溶液を入れた後、ガラスカバーを覆い、常温で１０分間反応させる。
９．染色された細胞を観察しながら、染色率および回収率をマニュアルで計算する。

【0041】

比較例１．培養液による血中循環癌細胞の培養された細胞数の変化
一般に、細胞培養に使用される細胞培養液および本発明による培養液における血中循環癌細胞の分裂および成長の度合いを比較実験した。一般に、細胞培養に使用される培養液は、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、５０ｎＭヒドロコルチゾン、０．０１ｍＭエタノールアミン、０．０１ｍＭホスホリルエタノールアミン、１００ｐＭトリヨードサイロニン、０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、４．５ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１Ｘ抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）－抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を含み、本発明による培養液は、前記実施例３と同様である。また、培養条件は、一般的なプレートを用いたことを除いては、実施例３と同様である。

【0042】

図３に示すように、ＣＤ４５－は、培養される血中循環癌細胞のバイオマーカーであり、Ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ（通常の成長培地）は一般的な細胞培養液を意味し、ＣＧ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ（ＣＧ成長培地）は本発明による培養液を意味する。図３は、本発明による培養液で培養された血中循環癌細胞がより多いことを示し、これは、一般的な培養液よりも本発明による培養液の方が、血中循環癌細胞の分裂および培養においてより効果的であることを示す。

【0043】

比較例２．ハイドロゲルコーティングされた培養プレートにおける、培養液による血中循環癌細胞の培養された細胞数の変化
本発明による培養液を用いた状況で、血中循環癌細胞の細胞成長および分裂に対する、ハイドロゲルコーティングされた培養プレートの効果を測定するために、一般的な培養プレートとの比較培養を実施した。本発明による培養液は、前記実施例３と同様である。

【0044】

図４に示すように、Ｎｏｒｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｙｐｅ（通常の培養タイプ）は一般的な細胞培養プレート（細胞が培養プレートの表面に接着）を示し、Ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔｙｐｅ（低接着タイプ）は、本発明で使用される、ハイドロゲルコーティングされた培養プレートを示す。図４は、本発明による培養液を用い、ハイドロゲルコーディングされた培養プレートで培養された血中循環癌細胞がより多いことを示し、これは、ハイドロゲルコーティングされた培養プレートの方が、血中循環癌細胞の分裂および培養においてより効果的であることを示す。

【0045】

実施例５：ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型変異の検出方法
ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型の変異を有する肺癌細胞株であるＨ３１２２細胞株（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｍｅｙｅｒｓｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｄａｎａ－Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ ０２１１５）を培養した後、ＲＮＡを抽出した。前記抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを順次希釈してＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型検出用ｑＲＴ－ＰＣＲの鋳型として使用した。

【0046】

陰性対照群としては、ＰＢＭＣ細胞およびＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１８５）を使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応用混合物の組成を表２に示す。

【0047】

【表2】

【0048】

ＰＣＲサイクルは、９５℃で１０分間変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を１サイクルとして４０サイクルを行い、７２℃で１０分間伸長させた。

【0049】

使用したＰＣＲプライマーは以下の通りである。
ＥＭＬ４（Ｅ１２）－ＦＰ：５’－ＣＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡ－３’（Ｖ１フォワードプライマー）（配列番号１）
ＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰ５’－ＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ－３’（Ｖ１リバースプライマー）（配列番号２）
対照群プライマー配列（ＦＰ）：５’－ＧＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧ－３’（フォワードプライマー）（配列番号５）
対照群プライマー配列（ＲＰ）：５’－ＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣ－３’（リバースプライマー）（配列番号６）

【0050】

増幅されたｑＲＴ－ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動してバンドを確認し、確認されたバンドを分離してシーケンスを行った。

【0051】

その結果、従来公知のプライマーを用いたＰＣＲ法（図５）と本発明のプライマーを用いたｑＲＴ－ＰＣＲ法（図６）の両方で、Ｖ１変位を検出限界０．１％～１％で検出することができ、本実施例の方法ではよりクリーンなバンドを確認することができた。ここで０．１％とは、白血球１０００個あたり血中循環癌細胞１個から検出できることを意味する。

【0052】

実施例６：ｑＲＴ－ＰＣＲを用いたＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型変異の検出方法
ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型の変異を有する肺癌細胞株であるＨ２２２８細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－５９３５）を培養した後、ＲＮＡを抽出した。前記抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを順次希釈して、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型検出用ｑＲＴ－ＰＣＲの鋳型として使用した。使用されたプライマーを除いては、実施例５と同様の方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0053】

ＥＭＬ４（Ｅ１Ｅ２）－ＦＰプライマー（配列番号３）およびＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰプライマー（配列番号２）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行う場合は、７８９ｂｐ（Ｖ３ａ型）または８２２ｂｐ（Ｖ３ｂ型）のＰＣＲ産物が増幅され、ＥＭＬ４（Ｅ４）－ＦＰプライマー（配列番号４）およびＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰプライマー（配列番号２）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行う場合は、３８７ｂｐ（Ｖ３ａ型）または４２０ｂｐ（Ｖ３ｂ型）のｑＲＴ－ＰＣＲ産物が増幅される。

【0054】

使用したｑＲＴ－ＰＣＲプライマーは以下の通りである。
ＥＭＬ４（Ｅ１Ｅ２）－ＦＰ：５’－ＣＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＡＴ－３’（Ｖ３フォワードプライマー）（配列番号３）
ＥＭＬ４（Ｅ４）－ＦＰ：５’－ＣＡＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣ－３’（Ｖ３フォワードプライマー）（配列番号４）
ＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰ ５’－ＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ－３’（配列番号２）（プライマーＶ３リバース）
対照群プライマー配列（ＦＰ）：５’－ＧＴＣＡＧＣＴＣＩＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＧＩＴ－３’（フォワードプライマー）（配列番号７）
対照群プライマー配列（ＲＰ）：５’－ＡＴＣＣＡＧＩＴＣＧＴＣＣＴＧＩＴＣＡＧＡＧＣ－３’（リバースプライマー）（配列番号８）

【0055】

増幅されたｑＲＴ－ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動してバンドを確認し、確認されたｂａｎｄを分離してシーケンスを行った。

【0056】

その結果、従来公知のプライマーを用いたＰＣＲ法（図８）では、Ｖ３変異を検出限界１％～１０％で検出することができ、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ法（図９）では、ＥＭＬ４（Ｅ１Ｅ２）－ＦＰプライマーを使用した場合、１～１０％の検出限界を示し、ＥＭＬ４（Ｅ４）－ＦＰプライマーを使用した場合、０．１～１％の検出限界を示した。

【0057】

実施例７：Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを用いたＶ１およびＶ３型変異の検出
Ｖ１変異を検出するためのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて、１回目のＰＣＲでは、ＥＭＬ４（Ｅ１２）－ＦＰ（配列番号１）および３０７８ＲＲプライマー（配列番号９）を使用し、２回目のＰＣＲでは、Ｆｕｓｉｏｎ ＲＴ－Ｓプライマー（配列番号１０）およびＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰ（配列番号２）を使用した。

【0058】

３０７８ＲＲプライマー配列：５’－ＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣ－３’（配列番号９）
Ｆｕｓｉｏｎ ＲＴ－Ｓプライマー配列：５’－ＧＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧ－３’（配列番号１０）

【0059】

その結果、図７に示すように、Ｖ１型変異の場合、検出限界０．００１％で変異型の検出が可能であって、敏感度が公知の技術よりも１０００倍向上することが確認された。

【0060】

Ｖ３変異を検出するためのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲにおいて、１回目のＰＣＲでは、ＥＭＬ４（Ｅ１Ｅ２）－ＦＰ（配列番号３）およびＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰ（配列番号２）を使用し、２回目のＰＣＲでは、ＥＭＬ４（Ｅ４）－ＦＰ（配列番号４）およびＡＬＫ（Ｅ２０）－ＲＰ（配列番号２）を使用した。

【0061】

その結果、図１０に示すように、Ｖ３型変異の場合、検出限界０．１％で変異型の検出が可能であって、敏感度が１０倍向上することが確認された。

【0062】

実施例８：Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを用いた臨床サンプルにおけるＥＭＩ．Ａ－ＡＬＫ変異検出
実施例６及び実施例７のＰＣＲおよびＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を用いて、臨床サンプルにおけるＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を検出した。

【0063】

組織学的に確診された非小細胞肺癌患者のうち、癌組織のＦＩＳＨの結果でＥＭＬ４－ＡＬＫ陽性と確認された患者（韓国のソウル大学病院ＩＲＢ １２０９－０２９－４２４、２０１２．９．１２）の血液から分離した血中循環癌細胞からＲＮＡを抽出した。前記抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型として用いて、実施例７の方法でＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。

【0064】

その結果、図１１に示すように、Ｖ１型変異の検出が確認され、実際ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を有する患者の血中癌細胞からＥＭＬ４－ＡＬＫ変異を検出できることが確認された。

【0065】

上述した本発明の説明は、単なる例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態へと容易に変形できることが理解できる筈である。よって、上述した実施例は、あらゆる面において例示的なものに過ぎず、限定的ではないものと理解すべきである。例えば、単一型であると説明されている各構成要素は、分散されて実施されてもよく、同様に、分散されていると説明されている構成要素もまた、組み合わせられた形態に実施されてもよい。

【0066】

本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって表わされ、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導き出されるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【発明を実施するための形態】

【0067】

以下では、添付図面に基づいて、本発明を詳しく説明する。しかしながら、本発明は、種々の異なる形態に具現化可能であり、したがって、ここで説明する実施例に限定されるものではない。また、図中、本発明を明確に説明するために、説明とは無関係な部分は省略し、明細書の全般に亘って、類似の部分には類似の図面符号を付している。

【0068】

明細書の全般に亘って、ある部分が他の部分と「連結（接続、接触、結合）」されているとしたとき、これは、「直接的に連結（接続、接触、結合）」されている場合のみならず、これらの間に他の部材を挟んで「間接的に連結（接続、接触、結合）」されている場合も含む。なお、ある部分がある構成要素を「含む」としたとき、これは、特に断りのない限り、他の構成要素を除外するわけではなく、他の構成要素をさらに備えていてもよいことを意味する。

【0069】

本明細書において用いた用語は、単に特定の実施例を説明するために用いられたものであり、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現は、文脈からみて明らかに他の意味を有さない限り、複数の言い回しを含む。本明細書において、「含む」または「有する」などの用語は、明細書に記載の特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定するものに過ぎず、１つまたはそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものの存在または付加の可能性を予め排除しないものと理解すべきである。

【0070】

以下、添付図面に基づいて、本発明の実施例を詳しく説明する。

【0071】

本発明の一側面によるＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法は、
（ａ）癌患者から液体生検サンプルを取得するステップと、（ｂ）バイオチップを用いて、前記液体生検サンプルから血中循環癌細胞を分離するステップと、（ｃ）前記分離された血中循環癌細胞からＲＮＡを分離するステップと、（ｄ）前記分離されたＲＮＡを鋳型とし、２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーを用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行うステップと、（ｅ）前記ｑＲＴ－ＰＣＲの産物を鋳型とし、前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーに対する２つのｎｅｓｔｅｄプライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うステップと、（ｆ）前記ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲの産物によりＥＭＬ－ＡＬＫ遺伝子の変異型を検出するステップと、を含んでいてもよい。

【0072】

前記液体生検とは、穿刺や切開などの侵襲的手術を行わず、血液や腹水などの体液中の癌遺伝子断片を採取する検査を意味する。すなわち、前記液体生検は、血液などの体液の検査だけで、身体の部位別血液や腹水内に存在する癌細胞由来のＤＮＡを分析することにより、癌の発生と転移などについての詳細な観察を行うことができる。本発明の一実施例によれば、前記液体生検のためのサンプルは、血液、滑液、腹水、胸膜液、脳脊髄液、および腹膜液を含んでいてもよい。本発明の好適な一実施例によれば、前記液体生検サンプルは、血液であってもよい。

【0073】

前記血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ、ＣＴＣ）とは、悪性腫瘍の患者の末梢血に見られる腫瘍細胞を意味する。血中循環癌細胞は非常にまれであり、入手できる標本の量が非常に制限される。血中循環癌細胞の検出および特性解析における技術は、複数の逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応の方法、イメージングベースのアプローチ、および精密ろ過法、ならびにマイクロチップデバイスを含み、これらに限定されない。血中循環癌細胞は、液体生検検体によりパーソナライズされた治療と治療後の経過観察を必然的に提供できる腫瘍の生物学的マーカーとして機能することができる。また、血中循環癌細胞は、腫瘍の生物学的特性および腫瘍細胞の播種を理解するための標的として使用できるが、これらに限定されない。本発明の一実施例によれば、前記血中循環癌細胞は肺癌由来細胞であってもよい。本発明の好適な一実施例によれば、前記血中循環癌細胞は非小細胞肺癌由来細胞であってもよい。

【0074】

前記バイオチップとは、半導体などの無機物からなる固体基質に、生物に由来するＤＮＡ、タンパク質、酵素、抗体、微生物、動植物細胞および器官、神経細胞などの物質を、高密度に集積化して組み合わせて、従来の半導体チップ形状にした混成素子であり、生体分子の固有の機能を用いて、遺伝子発現パターン、遺伝子結合、タンパク質の分布などの生物学的情報を得るか、または生化学的プロセスおよび反応速度または情報処理速度を高めるツールや装置をいう。

【0075】

前記高密度マイクロチップとは、バイオチップの作用原理に基づいて特定のサイズの物質を分離できるバイオチップをいう。

【0076】

前記高密度マイクロチップは、血液細胞の大きさの違いに基づいて、血中循環癌細胞を１０分以内に約９０％の回収率で捕捉することができる。

【0077】

本発明の実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）は、好ましくは５．５～８．５μｍ、より好ましくは６．５～７．５μｍであってもよい。気孔径が５．５μｍよりも小さい場合には、赤血球および白血球がチップを通過できず、チップ上にかかるようになって除去されない。気孔径が８．５μｍよりも大きい場合には、気孔径が血中循環癌細胞および免疫細胞の大きさよりも大きいため、血中循環癌細胞および免疫細胞がチップを通過して、血中循環癌細胞および免疫細胞を選択的に回収することができない。本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔形状は、円形、四角形または楕円形であってもよく、好ましくは四角形であってもよい。

【0078】

本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップの気孔は、規則的なパターンで配置されてもよい。本発明の他の一実施例において、前記高密度マイクロチップは、具体的にはステンレス鋼、ニッケル、アルミニウムまたは銅で作られていてもよい。前記気孔は、メムス（ＭＥＭＳ、Ｍｉｃｒｏ－ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ：微小電気機械システム）技術を利用したエッチング（ｅｔｃｈｉｎｇ）によって形成されてもよい。

【0079】

気孔の中で２つの隣接する気孔間の間隔は、血中循環癌細胞および免疫細胞の直径よりも狭く形成されている。本発明の一実施例によれば、２つの気孔間の間隔は、血中循環癌細胞および免疫細胞の直径に対して４５～６５％で形成されてもよい。前記高密度マイクロチップは、通路を流れる血液または溶液の圧力によって変形されない。

【0080】

血液は、気孔を通過した後に外に排出され、血液中の血中循環癌細胞は、気孔を通過せずに表面に残留される。本発明の一実施例によれば、前記血中循環癌細胞は肺癌由来細胞であってもよい。本発明の好適な一実施例によれば、前記血中循環癌細胞は非小細胞肺癌由来細胞であってもよい。

【0081】

非標的細胞、すなわち血中循環癌細胞よりも高い変形率を有する赤血球は、気孔を容易に通過する。

【0082】

血中循環癌細胞のろ過後、血中循環癌細胞は、溶液を逆方向または順方向に供給して外に排出することができる。本発明の一実施例によれば、血中循環癌細胞の損傷を最小限に抑えるために、溶液を逆方向に供給してもよい。前記溶液を、注射器、シリンジポンプ、プランジャーポンプ等を使用して供給することができる。本発明の一実施例によれば、前記溶液は、血液を希釈する希釈剤、水（Ｗａｔｅｒ）および希釈用酸から構成されていてもよい。前記溶液の供給によって外に排出される血中循環癌細胞および免疫細胞を、コンテナ（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、例えば試験管、ペトリ皿などに収集して簡単に採取することができる。

【0083】

一方、直径７．５～１５μｍの血中循環癌細胞は、約１００ｍｍＨｇの圧力が加えられるとき、直径８μｍの管を通過する。直径８μｍの管を通過する直径１５μｍの血中循環癌細胞は、約５３％の変形率を有する。逆洗浄（Ｂａｃｋ ｗａｓｈｉｎｇ）、すなわち溶液を血液の流れとは反対方向に流して、直径７．５μｍの血中循環癌細胞を外に排出させるとき、血中循環癌細胞の変形率を考慮すると、２つの気孔間の間隔は、好ましくは４μｍ以下である。例えば、非小細胞肺癌と乳癌の癌細胞は、直径が４０μｍ程度に達することが知られている。逆洗浄の際、直径４０μｍの血中循環癌細胞の変形率を考慮すると、好ましくは、２つの気孔間の間隔を２１μｍ以下に設定する。直径７．５μｍの血中循環癌細胞が間隔４μｍを超える２つの気孔の間に存在するとき、血中循環癌細胞が溶液の流れによって変形されて表面から脱落しない場合がある。また、直径４０μｍの癌細胞も間隔２１μｍを超える２つの気孔間の表面から脱落しない場合がある。本発明による高密度マイクロチップにおいて、溶液の圧力を考慮して、２つの気孔間の間隔は、血中循環癌細胞の直径に対して４５～６５％で設けられる。直径７．５μｍの血中循環癌細胞は、間隔が６５％を超え、すなわち約４．９μｍを超える場合、逆洗浄によって２つの気孔間の表面から脱落しない場合がある。直径４０μｍの血中循環癌細胞は、間隔が６５％を超え、すなわち２６μｍを超える場合、逆洗浄によって２つの気孔間の表面から脱落しない場合がある。２つの気孔間の表面にくっついた血中循環癌細胞を強制的に脱落させるために溶液の圧力を上げると、血中循環癌細胞が損傷して、生きている血中循環癌細胞の採集率が低下する。直径７．５μｍの血中循環癌細胞に対する間隔が４５％未満、すなわち約３．３７５μｍ未満の場合、血液と溶液の流れによって前記高密度マイクロチップが破損する恐れが高い。

【0084】

本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップで前記試料を繰り返し通過させることができる。具体的には、血中循環癌細胞が前記高密度マイクロチップで一回分離された後、前記分離された血中循環癌細胞を再び前記高密度マイクロチップにロードして分離することができ、前記分離工程を繰り返すことができる。

【0085】

本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップを用いた血中循環癌細胞の分離は、血中循環癌細胞を含む溶液を高密度マイクロチップにロードした後に特定の人為的圧力を加えることで行われるのではなく、重力を用いて行われてもよい。本発明による高密度マイクロチップを用いた血中循環癌細胞の分離は、血中循環癌細胞への人為的な圧力により引き起こされるダメージを最小限に抑えることにより、患者の体内に存在していた状態をそのまま維持することができる。

【0086】

本発明の一実施例において、前記高密度マイクロチップは、血中循環癌細胞が分離されるとき、前記高密度マイクロチップによる血中循環癌細胞へのダメージを最小限に抑えるか、前記高密度マイクロチップの繰り返し使用をより効率的にするために、または血中循環癌細胞の回収率をより効率的に高めるために、特定の物質でコーティングされてもよい。前記特定の物質は、具体的に血中循環癌細胞に特異的に結合できる抗体であってもよく、細胞に物理的または化学的にダメージを与えない生体材料であってもよい。本発明の一実施例によれば、前記の特定の物質は、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）または抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、抗上皮細胞接着分子抗体（Ａｎｔｉ－Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗サイトケラチン抗体（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｎｔｉ－ＣＫ ａｎｔｉｂｏｄｙ）などから構成されていてもよい。本発明の好適な一実施例によれば、前記特定の物質は、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）であってもよい。

【0087】

前記ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液とは、ウシ血清アルブミンをいう。これは、分子量約６６．４ｋＤａ程度のタンパク質であって、ほとんどの動物に大量に含まれている蛋白質である。ＢＳＡは、生化学／生物学において、細胞培養時に細胞の栄養分として加えてもよく、タンパク質の定量で検量線を得るための標準物としても多く使われており、制限酵素を使用する場合、少量の酵素（タンパク質）を使用する必要があるので、溶液内のタンパク質濃度を補うために加えられてもよい。また、種々の生化学的実験（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＥＬＩＳＡなど）において、特定の抗体を検出しようとするタンパク質を接着する前に、非特異的結合（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）、すなわち所望しないタンパク質、あるいは所望しない位置に抗体がくっつく非特異的結合を防ぐために使用されてもよい。

【0088】

本発明の一実施例によれば、遠心分離法を用いて末梢血を、前記ＢＳＡ溶液でコーティングされた高密度マイクロチップに反応させて、血中循環癌細胞を除いた他の生体高分子を除去することができる。本発明の一実施例によれば、前記高密度マイクロチップを用いた分離は、重力により行われてもよく、具体的には大気圧１０００～１０２０ｈＰａで、好ましくは大気圧１０００～１０１５ｈＰａで、より好ましくは大気圧１０００～１０１３ｈＰａで行われてもよい。

【0089】

本発明の一実施例によれば、前記ＢＳＡ溶液は、前記高密度マイクロチップの上面、下面または前記気孔の内面にコーティングされてもよい。好ましくは、前記高密度マイクロチップの上面、下面及び前記気孔の内面のすべてにコーティングされてもよい。

【0090】

本発明の一実施例によれば、前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、０．０５～０．１５％の濃度で行われてもよい。本発明の好ましい実施例によれば、前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、０．０８～０．０１２％の濃度で行われてもよい。

【0091】

本発明の一実施例によれば、前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、５～１５分間処理されてもよい。本発明の好適な一実施例によれば、前記ＢＳＡ溶液のコーティングは、８～１２分間処理されてもよい。

【0092】

図１に示すように、患者の血液からまず血球細胞を除去するために、採血された患者の血液に抗体重合体を入れた後、よく混合し、常温で反応させる。次に、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ溶液を加え、反応溶液にＦｉｃｏｌｌ溶液を加えた後、遠心分離により血球細胞を１次的に除去する。このように、本発明では、不要な血球細胞を１次的に除去した後、ＢＳＡ溶液で特別にコーティングされた高密度マイクロチップを用いて、赤血球をろ過して高純度の血中循環癌細胞を分離する。分離された血中循環癌細胞は染色により同定される。前記ＢＳＡでコーティングされた高密度マイクロチップを用いると、本発明において分離しようとする血中循環癌細胞を、損傷を最小限に抑えた状態で分離させることができる。このように高純度の血中循環癌細胞は、本発明のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法が効果的に作用できるように、その効率を大幅に高めることができる。

【0093】

本発明の一実施例によれば、バイオチップを用いて前記液体生検サンプルから血中循環癌細胞を分離するステップの後に、分離された血中循環癌細胞を短期培養するステップをさらに行ってもよい。

【0094】

本発明の一実施例において、前記の短期培養で使用される培養液は、インスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：上皮成長因子）およびＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ｋｉｎａｓｅ：Ｒｈｏキナーゼ）阻害剤からなる群から選ばれた少なくとも３つから構成されてもよい。

【0095】

前記インスリンは、ヒトの代謝系のホルモンの１つであり、膵臓（器官）のランゲルハンス島のベータ細胞から分泌され、血液中のブドウ糖の数値である血糖値を一定に保つ働きをする。血糖値が一定以上に上がるとインスリンが分泌され、血液中のブドウ糖（グルコース）が細胞内に取り込まれて再び多糖（グリコーゲン）の形で蓄える作用を促進する。本発明による短期培養ステップで使用される培養液は、前記インスリンを含むことにより、血中癌細胞を培養するにあたり、従来の血中循環腫瘍細胞培養液よりも細胞の成長および分裂をさらに促進させることができる。本発明の一実施例によれば、前記インスリンは、３～５０ｎｇ／ｍｌの、３～４５ｎｇ／ｍｌ、３～４０ｎｇ／ｍｌ、３～３０ｎｇ／ｍｌ、４～５０ｎｇ／ｍｌ、４～４５ｎｇ／ｍｌ、４～３０ｎｇ／ｍｌ、５～５０ｎｇ／ｍｌ、５～４５ｎｇ／ｍｌまたは５～３０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0096】

前記トランスフェリンはβグロブリンの一種であり、血清中に吸収された2分子の3価鉄イオンと結合して、細胞増殖やヘモグロビン産生に必要な鉄を、トランスフェリン受容体を介して細胞内に供給する鉄輸送タンパク質である。血清中の鉄９９％以上がトランスフェリンと結合し、通常はトランスフェリンの約３分の１が鉄と結合できる。本発明による短期培養ステップで使用される培養液は、前記トランスフェリンを含むことにより、血中癌細胞を培養するにあたり、従来の血中循環腫瘍細胞培養液よりも細胞の成長および分裂をさらに促進させることができる。本発明の一実施例によれば、前記トランスフェリンは、３～５０ｎｇ／ｍｌ、３～４５ｎｇ／ｍｌ、３～４０ｎｇ／ｍｌ、３～３０ｎｇ／ｍｌ、４～５０ｎｇ／ｍｌ、４～４５ｎｇ／ｍｌ、４～３０ｎｇ／ｍｌ、５～５０ｎｇ／ｍｌ、５～４５ｎｇ／ｍｌまたは５～３０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0097】

前記上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）は、上皮成長因子受容体に結合して細胞の成長および分裂を促進させるポリペプチド成長因子である。また、前記上皮成長因子は、タンパク質合成やＲＮＡ合成を促進するほか、オルニチン脱炭酸酵素を誘導することができる。本発明による短期培養ステップで使用される培養液は、前記上皮成長因子を含むことにより、血中癌細胞を培養するにあたり、従来の血中循環腫瘍細胞培養液よりも細胞の成長および分裂をさらに促進させることができる。本発明の実施例によれば、前記上皮成長因子は、０．５～１０ｎｇ／ｍｌ、０．５～９ｎｇ／ｍｌ、０．５～８ｎｇ／ｍｌ、０．５～７ｎｇ／ｍｌ、０．５～６ｎｇ／ｍｌ、０．５～５ｎｇ／ｍｌ、０．７～１０ｎｇ／ｍｌ、０．７～９ｎｇ／ｍｌ、０．７～８ｎｇ／ｍｌ、０．７～７ｎｇ／ｍｌ、０．７～６ｎｇ／ｍｌ、０．７～５ｎｇ／ｍｌ、１～１０ｎｇ／ｍｌ、１～９ｎｇ／ｍｌ、１～８ｎｇ／ｍｌ、１～７ｎｇ／ｍｌ、１～６ｎｇ／ｍｌまたは１～５ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0098】

前記ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）をターゲットにしてその機能を阻害または低下させることができる化合物を意味する。ここで、Ｒｈｏキナーゼは、セリン－トレオニンキナーゼのＡＧＣファミリー（ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣ）に属するキナーゼである。前記Ｒｈｏキナーゼは、細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）に作用することにより、細胞の運動および形態を制御する過程に関連している。具体的には、前記Ｒｈｏキナーゼは、細胞の移動およびアクチン組織化の調節因子として作用することができる。前記Ｒｈｏキナーゼは、糖尿病、出血性脳血管疾患、パーキンソン氏病などの神経変性疾患に関連しており、前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、前記Ｒｈｏキナーゼ関連疾患の治療および阻害に使用できる。本発明の一実施例によれば、前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）、リパスジル（Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ）、ＲＫＩ－１４４７及びＹ２７６３２からなる群から選択された少なくとも１つであってもよい。前記ファスジルは、ＲＯＣＫ阻害剤の１つであって、脳血管痙攣の治療に使用でき、肺高血圧症の治療にも効果的である。前記リパスジルは、前記ファスジルの誘導体であって、ＲＯＣＫ阻害剤として作用でき、緑内障または高眼圧症の治療にも使用できる。前記ＲＫＩ－１４４７は、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２を阻害することができる。前記Ｙ２７６３２は、細胞を通過して、酵素の触媒部位に結合するためにＡＴＰと競合することにより、ＲＯＣＫ１およびＲＯＣＫ２を阻害することができる。本発明の一実施例によれば、前記ＲＯＣＫ阻害剤は、３～３０μＭ、３～２７μＭ、３～２４μＭ、３～２１μＭ、４～２０μＭ、４～３０μＭ、４～２７μＭ、４～２４μＭ、４～２１μＭ、４～２０μＭであってもよい。

【0099】

本発明による短期培養で使用される前記培養プレートは、細胞接着を防ぐ表面を有してもよい。本発明の一実施例によれば、血中癌細胞を浮遊状態で培養することができるため、細胞接着を防ぐために前記培養プレートの表面をコーティングしてもよい。前記培養プレートの表面コーティングは、ハイドロゲルで行われてもよい。前記ハイドロゲルは、水を分散媒とするゲルを意味し、ヒドロゾルが冷却により流動性を喪失したり、３次元網目構造および微結晶構造を有する親水性高分子が水を含有して膨張したりして形成される。具体的には、前記ハイドロゲルは、共有結合、水素結合、ファンデルワールス結合または物理的結合などの凝集力によって架橋された親水性高分子であって、水溶液上で多量の水を内部に含有して膨潤できる３次元高分子ネットワーク構造を有する物質である。このように、水を吸収した状態では、生体の組織と同様の挙動を示す。前記ハイドロゲルは、温度、ｐＨなどにより相転移するため、膨張率を不連続的に変化させることができ、コンタクトレンズ、医療用電極、細胞培養に使用できる。本発明の一実施例によれば、前記ハイドロゲルは、血中癌細胞が培養プレートの表面に接着されるのを防ぐために、培養プレート上に共有結合的にコーティングされてもよい。本発明の他の一実施例によれば、前記ハイドロゲルは、中性電荷を持ちながら親水性を有してもよい。前記中性電荷を持つということは、電荷が正でも負でもないことを意味し、前記親水性とは、水に対する強い親和性を意味し、水によく溶けることを意味する。

【0100】

本発明の一実施例において、前記短期培養するステップは、培養の開始から１～１５日間行われてもよい。本発明の他の実施例においては、５～１５日、好ましくは１０～１５日、より好ましくは１２～１５日であってもよい。

【0101】

本発明の一実施例によれば、ＡＬＫ陽性非小細胞肺癌は、２つの遺伝子ＡＬＫおよびＥＭＬ４の融合によるＥＭＬ４－ＡＬＫ変異によって引き起こされる肺癌であり、ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異には、融合されるＥＭＬ４遺伝子のエクソンおよび／またはイントロン部位に応じて、以下に示すような様々な変異型がある。

【0102】

変異（Ｖａｒｉａｎｔ）１：エクソン１－１３（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）２：エクソン１－２０（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）３ａ：エクソン１－６ａ（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）３ｂ：エクソン１－６ｂ（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）４ａ：エクソン１５（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）４ｂ：エクソン１４（ＥＭＬ４）＋１１ｂｐサイズのオリゴヌクレオチドからなるリンカー＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）５ａ：エクソン２（ＥＭＬ４）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）
変異（Ｖａｒｉａｎｔ）５ｂ：エクソン２（ＥＭＬ４）＋イントロン１９（ＡＬＫ）＋エクソン２０－２９（ＡＬＫ）

【0103】

これらの変異のうち、韓国では、２種類の変異、変異１（Ｖａｒｉａｎｔ１、Ｖ１）と変異３（Ｖａｒｉａｎｔ３、Ｖ３）の患者が多数存在することが確認されており、非小細胞肺癌患者１６７人を確認した結果、１０人の患者がＥＭＬ４－ＡＬＫ融合変異を有していることが確認された場合、そのうちの４人がＶ１型変異であり、２人がＶ３ｂ型変位であるという報告があった（非特許文献３）。

【0104】

Ｖ３型には、２つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）があり、Ｖ３ｂ型には、ＥＭＬ４のイントロン６の３３ｂｐがさらに融合部分に含まれている。したがって、Ｖ３型のＰＣＲを検出すると、２つのサイズのＰＣＲ産物が発生する可能性がある。

【0105】

本発明の一実施例によれば、前記ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子の変異型は、Ｖ１型、Ｖ２型、Ｖ３ａ型、Ｖ３ｂ型、Ｖ４ａ型、Ｖ４ｂ型、Ｖ５ａ型またはＶ５ｂ型であってもよく、好ましくはＶ１型またはＶ３型であってもよい。

【0106】

前記ＲＮＡを分離するステップは、当業界で通常使用される方法により行われてもよく、商業的に販売されているＲＮＡ抽出キットを用いて行われてもよい。また、前記ｑＲＴ－ＰＣＲを行うステップにおいて、ｑＲＴ－ＰＣＲは、分離されたＲＮＡを鋳型とし、本発明の２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーのうちリバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーをプライマーとし、逆転写酵素を用いて逆転写反応により相補的ＤＮＡ鎖を合成した後、ＰＣＲ反応を行ってもよい。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応に必要な当業界に公知の種々の成分を含むＰＣＲ反応混合液を使用して行ってもよい。前記ＰＣＲ反応混合液は、逆転写反応により合成された相補的ＤＮＡおよび本発明で提供されるｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーに加えて、適量のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ緩衝液および蒸留水（ｄＨ_２Ｏ）を含む。前記ＰＣＲ緩衝液は、トリス－ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌなどを含む。このとき、ＭｇＣｌ_２濃度は、増幅の特異性と収量に大きく影響を与える。一般に、Ｍｇ^２＋が過剰な場合は、非特異的なＰＣＲ増幅産物が増加し、Ｍｇ^２＋が不十分な場合は、ＰＣＲ産物の算出率が減少する。前記ＰＣＲ緩衝溶液は、適量のトリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）をさらに含んでいてもよい。また、ＰＣＲは、ＤＮＡを前変性させた後、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、および増幅（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のサイクルを行い、最終的に７２℃で延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）させる一般的なＰＣＲ反応条件下で行われてもよい。上記において、変性及び増幅は９４～９５℃及び７２℃でそれぞれ行い、結合時の温度は増幅ステップで使用されるプライマーの種類によって変わり得る。本発明の一実施例によれば、本発明のｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーの場合は５５～６４℃で行われてもよい。各ステップの時間とサイクル数は、当業界において一般に行われる条件によって定められてもよい。

【0107】

ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異の検出に使用されてきた公知のプライマーの検出限界は、０．１～１％であり、検体が癌組織である場合は、変異の検出に問題がないが、血中循環癌細胞を分離して検出する方法を使用するためには０．１％以下でも確認する必要があるので、検出限界の低いプライマーが必要である。本発明では、高精度と検出効率を有するプライマーを設計するために、下記の方法でプライマーを設計した。プライマーの設計では、プライマー３（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｕｔ．ｅｅ／ｏｒ ｉｍｅｒ３－０．４．Ｏ／）プライマー設計（ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ）プログラムを用いて候補群を決定し、その後、ＮＣＢＩホームページ（ｈｔｔｏ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でｂｌａｓｔｓｅａｒｃｈを用いて、ＥＭＬ４－ＡＬＫ部位ではない他の部分にプライマーが結合する可能性と、ヘアピン構造が生じる可能性とを回避し、また、プライマー対の間の相同性を直接比較して、互いにｄｉｍｅｒを形成しないようにし、さらに、ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔを確認して、６０％以上にならないようにした。前記４種類のプライマーのＴｍ値を類似に調整することで、いかなるプライマーの組み合わせでもＰＣＲを容易に実施できるように設計した。反復配列又は連続配列を避け、ｃＤＮＡを鋳型として用いるため、プライマーがゲノムＤＮＡに結合して複数のバンド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂａｎｄｓ）を生成するのを防ぐために、可能な限りエキソンジャンクション間に設計した。

【0108】

本発明の他の一実施例によれば、２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーのうちの一方は、配列番号１、配列番号３および配列番号４で表されるプライマーからなる群から選択される１つのフォワードｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーであり、他方は、配列番号２で表されるリバースｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーであってもよい。

【0109】

本発明の一実施例によれば、前記２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーは、配列番号１および配列番号２で表されるプライマー対；配列番号３および配列番号２で表されるプライマー対；および配列弁護４および配列番号２で表されるプライマー対からなる群から選択されてもよい。

【0110】

本発明の別の一実施例によれば、２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーが配列番号１および配列番号２で表されるプライマー対は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異の検出に使用でき、配列番号３および配列番号２で表されるプライマー対；及び配列番号３および配列番号２で表されるプライマー対は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異の検出に使用できる。

【0111】

前記ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うステップでは、当業界で周知の方法により、ＰＣＲ産物のＤＮＡをサイズ別に分離することができる。好ましくは、アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）またはポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）電気泳動または蛍光分析装置（ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３１００ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ－ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）によって確認することができる。このとき、蛍光分析装置を使用するために、当業界に公知の蛍光色素（ｄｙｅ）を付けた２つのｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマーを用いて前記ｑＲＴ－ＰＣＲを行うステップでＰＣＲを行う。

【0112】

ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲステップを追加すると、ＰＣＶを検出する際の非特異的な反応によるエラーを最小限に抑えることができ、これは、必要な場合に役に立つ。

【0113】

ＰＣＲ増幅の結果は、好ましくは、アガロースゲル電気泳動により確認できる。電気泳動後、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）染色により電気泳動の結果を分析することができる。一般的な逆転写反応、ＰＣＲ実行およびその結果の分析方法は、当業界によく知られている。

【0114】

本発明の一実施例によれば、前記の２つのｎｅｓｔｅｄプライマーのうちの一方は、フォワードｎｅｓｔｅｄプライマーであり、他方は、リバースｎｅｓｔｅｄプライマーであってもよい。

【0115】

本発明の他の一実施例によれば、２つのｎｅｓｔｅｄプライマーのうちの一方は、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号１０で表されるプライマーからなる群から選択される１つのフォワードｎｅｓｔｅｄプライマーであり、他方は、配列番号２または配列番号９に表示されるプライマーからなる群から選択される１つのリバースｎｅｓｔｅｄプライマーであってもよいが、前記ｑＲＴ－ＰＣＲ産物を増幅できるプライマー対であれば制限なく使用可能である。

【0116】

本発明の他の一実施例によれば、前記の２つのｎｅｓｔｅｄプライマーが配列番号１および配列番号９で表されるプライマー対；及び配列番号１０および配列番号２で表されるプライマー対は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ１型遺伝子変異の検出に使用でき、配列番号３および配列番号２で表されるプライマー対；及び配列番号４および配列番号２で表されるプライマー対で表されるプライマー対は、ＥＭＬ４－ＡＬＫのＶ３型遺伝子変異の検出に使用できる。

【0117】

本発明で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分野で周知であり、次の文献に記載されている（非特許文献４～６）

【0118】

本発明のまた他の一側面による癌患者スクリーニング方法では、前記ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子変異分析方法により得られた遺伝子変異が、
（ｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－１３＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－２０＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ａ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｉｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１－６ｂ＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１５＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン１４＋１１ｂｐサイズのオリゴヌクレオチドからなるリンカー＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、
（ｖｉｉｉ）ＥＭＬ４遺伝子のエクソン２＋ＡＬＫ遺伝子のイントロン１９＋ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０－２９と、からなる群から選択された１つと一致すれば、抗癌剤は、癌患者に対して有効可能性があることを示すことができる。

【0119】

本発明の一実施例によれば、前記癌は肺癌、好ましくは非小細胞肺癌であってもよい。

【0120】

本発明の他の一実施例によれば、前記抗癌剤は、クリゾチニブであってもよい。

【0121】

ＥＭＬ４－ＡＬＫ変異によって発生する非小細胞肺癌に対する標的抗癌剤は、クリゾチニブ（製品名：ザーコリ、ファイザー社）であり、現在、非小細胞肺癌の治療は、ＥＧＦＲ遺伝子変異およびＥＭＬ４－ＡＬＫ融合変異検査の後、イレッサ／ザーコリ／姑息的細胞毒性抗癌剤のうちから治療方法を選択する方式により行われている。

【0122】

しかし、肺癌組織の侵襲的な組織検査を実施できない患者の場合、ＥＭＬ４－ＡＬＫ融合変異の遺伝子検査を実施できず、クリゾチニブの投与が有効かどうかを確認できないため、投薬治療を行うことができなかった。

【0123】

本発明による癌患者スクリーニング方法は、血中循環癌細胞を非小細胞肺癌患者の血液から分離し、前記血中循環癌細胞におけるＥＭＬ４－ＡＬＫ融合変異の存在を確認して、非小細胞肺癌患者にクリゾチニブが有効かどうかを判断することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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