(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-09
(45)【発行日】2023-03-17
(54)【発明の名称】抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体抗体およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/22 20060101AFI20230310BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230310BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230310BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230310BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20230310BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230310BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230310BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230310BHJP
【ＦＩ】
C07K16/22 ZNA
C12P21/08
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 J
A61P3/10
A61P3/04
A61P3/06
A61P1/16
A61P13/12
C12N15/13
【請求項の数】
36
(21)【出願番号】P 2021535936
(86)(22)【出願日】2019-12-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-15
(86)【国際出願番号】 US2019066261
(87)【国際公開番号】W WO2020131624
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2021-08-13
(31)【優先権主張番号】62/783,260
(32)【優先日】2018-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/783,265
(32)【優先日】2018-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(72)【発明者】
【氏名】チャイ，チン
(72)【発明者】
【氏名】デイ，ジョナサン ウェズリー
(72)【発明者】
【氏名】コンラッド，ロバート ジョン
(72)【発明者】
【氏名】チアン，ユエウェイ
(72)【発明者】
【氏名】シュレーダー，オリヴァー
(72)【発明者】
【氏名】シーゲル，ロバート ウィリアム
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１７７１８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Journal of Lipid Research, 2017, Vol.58,No.6, pp.1166-1173
【文献】Endocrinology, 2017, Vol.158, No.5,pp.1252-1259
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合する抗体であって、ＬＣＤＲ１が、ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が、ＹＭＬＳＹＲＡＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が、ＭＱＲＩＥＦＰＬＴ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が、ＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧ（配列番号１４）のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が、ＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を有し、ならびにＨＣＤＲ３が、ＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰ（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する、抗体。
【請求項2】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲが配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
前記ＬＣＶＲが配列番号９のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣＶＲが配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含むヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合する抗体であって、前記ＬＣが配列番号５、２１、２２、２３、２４および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項7】
前記ＬＣが配列番号５のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項8】
前記ＬＣが配列番号２１のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項9】
前記ＬＣが配列番号２２のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項10】
前記ＬＣが配列番号２３のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項11】
前記ＬＣが配列番号２４のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項12】
前記ＬＣが配列番号２５のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項13】
抗体の作製方法であって、配列番号５および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記ポリペプチドが発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項14】
抗体の作製方法であって、配列番号２１および６のアミノ酸配列を含む抗体をコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項15】
抗体の作製方法であって、配列番号２２および６のアミノ酸配列を含む抗体をコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項16】
抗体の作製方法であって、配列番号２３および６のアミノ酸配列を含む抗体をコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項17】
抗体の作製方法であって、配列番号２４および６のアミノ酸配列を含む抗体をコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項18】
抗体の作製方法であって、配列番号２５および６のアミノ酸配列を含む抗体をコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現する条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項19】
抗体の作製方法であって、第１のｃＤＮＡ分子が、配列番号５、２１、２２、２３、２４および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記抗体の軽鎖をコードし、第２のｃＤＮＡ分子が、配列番号６のアミノ酸配列を含む前記抗体の重鎖をコードする、少なくとも２つのｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現するような条件下で培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。
【請求項20】
前記抗体が、標準的なリポタンパク質リパーゼ活性アッセイにおいて３．０ｎＭ以下のＥＣ５０を伴って、ヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合し、それを中和する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項21】
前記抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される場合に、最大１００ｎＭまでは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３単独またはヒトＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項22】
前記抗体が、投与後１４日の時点で、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩｇＧ対照と比較して、インビボでトリグリセリドを少なくとも５０％低下させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項23】
請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体と、許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項24】
配列番号５および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項25】
配列番号２１および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項26】
配列番号２２および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項27】
配列番号２３および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項28】
配列番号２４および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項29】
配列番号２５および６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項30】
第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記第１のＤＮＡ分子が、配列番号５、２１、２２、２３、２４または２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記第２のＤＮＡ分子が、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記細胞が、前記ポリペプチドを発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項31】
抗体が発現するような条件下で請求項２４～３０のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現した抗体を回収することとを含む、前記抗体を作製するための、方法。
【請求項32】
請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＡＳＣＶＤ、糖尿病、肥満、ＮＡＳＨ、ＣＫＤ、もしくは高トリグリセリド血症、またはそれらの組み合わせの治療剤であって、前記治療を必要とする患者に、有効量の前記抗体を投与することを特徴とする、治療剤。
【請求項33】
請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体を含む、トリグリセリドを低下させる薬剤であって、トリグリセリドの低下を必要とする患者に、有効量の前記抗体を投与することを特徴とする、薬剤。
【請求項34】
治療における使用のための薬剤の製造における、請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項35】
ＡＳＣＶＤ、糖尿病、肥満、ＮＡＳＨ、ＣＫＤ、もしくは高トリグリセリド血症、またはそれらの組み合わせの治療に使用するための薬剤の製造における、請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項36】
ＡＳＣＶＤ、糖尿病、肥満、ＮＡＳＨ、ＣＫＤ、もしくは高トリグリセリド血症、またはそれらの組み合わせを治療することに使用するための、有効量の請求項１～１２および２０～２２のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して生物学および医学に関し、より詳細には、ヒトアンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）３／８複合体に結合し、それによってそれを中和する抗体（Ａｂ）に関する。このような抗体は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を増加させ、それによって血清トリグリセリド（ＴＧ）を低下させ、脂質代謝関連およびグルコース代謝関連の疾患および障害の治療に使用され得る。
【背景技術】
【0002】
ＡＮＧＰＴＬは、多くの生理学的および病態生理学的プロセスを調節するタンパク質のファミリーである。本明細書において特に興味深いのは、脂質およびグルコース代謝におけるＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８の役割である。
【0003】
エビデンスによって、リポタンパク質代謝の主要な調節因子としてのＡＮＧＰＴＬ３の役割が支持されており、ＡＮＧＰＴＬ３は、ＬＰＬを阻害し、内皮リパーゼ（ＥＬ）を阻害することによってＴＧクリアランスを調節している可能性がある。Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６：１１３７－１１４９を参照されたい。ＡＮＧＰＴＬ３の欠乏、不活性化、または損失により、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、およびＴＧのレベルが低下する可能性がある。ＡＮＧＰＴＬ３はまた、インスリン感受性に影響を与える可能性があり、それによって脂質代謝だけでなく、グルコース代謝の調節にも役割を果たす可能性がある。Ｒｏｂｃｉｕｃ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．３３：１７０６－１７１３を参照されたい。ヒトＡＮＧＰＴＬ３の核酸およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１４４９５（配列番号１）には、１つの核酸配列が見出され、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０５５３１０（配列番号２）には、１つのアミノ酸配列が見出される。
【0004】
ＡＮＧＰＴＬ８は、肝臓および脂肪組織で高度に発現しており、ＡＮＧＰＴＬ３と複合体を形成し、それによってＡＮＧＰＴＬ３を活性化することにより、ＬＰＬを阻害することが報告されている。前述のＣｈｉを参照されたい。ヒトＡＮＧＰＴＬ８は、摂食によって誘発されるようである。ヒトＡＮＧＰＴＬ８の核酸およびアミノ酸配列は公知である。例えば、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１８６８７（配列番号３）には、１つの核酸配列が見出され、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１１５７（配列番号４）には、１つのアミノ酸配列が見出される。
【0005】
１つ以上のＡＮＧＰＴＬ８に結合された１つ以上のＡＮＧＰＴＬ３を有するＡＮＧＰＴＬ３／８複合体が存在する。エビデンスによって、これらの複合体は、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８単独と比較した場合、ＬＰＬの阻害をより効果的に媒介することが示唆されている。さらに、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体は、哺乳動物発現系においてＡＮＧＰＴＬ８およびＡＮＧＰＴＬ３を共発現することにより、インビトロで作製することができる。前述のＣｈｉを参照されたい。
【0006】
ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８のいずれかに結合し、脂質代謝関連およびグルコース代謝関連の疾患および障害を治療するために、単独でまたは互いに組み合わせて使用できる抗体が知られている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７４１７８号は、ＡＮＧＰＴＬ３に結合してその活性を妨害する完全ヒトモノクローナルＡｂおよびその抗原結合フラグメントを開示している。他の治療用抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体も知られている。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０７３３００号および米国特許第７，９３５，７９６号を参照されたい。同様に、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０２７３１６号は、ＡＮＧＰＴＬ８に結合してその活性を妨害する完全ヒトモノクローナルＡｂまたはその抗原結合フラグメントを開示している。また、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／１７７１８１号は、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体および抗ＡＮＧＰＴＬ８抗体の併用療法を開示している。
【0007】
残念ながら、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８のいずれかにのみ結合する既存の抗体は、脂質および／またはグルコース代謝に対するこれらのＡＮＧＰＴＬおよび／またはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の効果を完全に無効にするわけではない。例えば、Ｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７７：２１１－２２１、およびＧｕｓａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５８：１２５２－１２５９を参照されたい。それを考慮すると、脂質代謝関連およびグルコース代謝関連疾患および障害を治療するための追加のＡｂ、特に抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂが必要であり、このようなＡｂは、脂質および／またはグルコース代謝を調節するための改善された薬理学的な阻害的および／または制御的特性を有する。
【発明の概要】
【0008】
この必要性に対処するために、改変ＡＮＧＴＰＬ３／８複合体の核酸およびアミノ酸配列が提供される。したがって、改変ＡＮＧＰＴＬ３および改変ＡＮＧＰＴＬ８の１つ以上（すなわち、融合タンパク質）をコードする核酸配列が本明細書に記載される。場合によっては、核酸配列には、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。他の例では、核酸配列には、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。さらに他の例では、核酸配列は、配列番号１７および１８をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0009】
さらに、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質、またはその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物が提供され、そのような構築物は発現カセットまたはベクターであり得る。
【0010】
上記を考慮して、本明細書に記載の１つ以上の発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞が提供される。場合によっては、宿主細胞は真核細胞である。場合によっては、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＴＰＬ８融合タンパク質のポリヌクレオチド配列は、別々の発現カセットまたはベクター上にあり、他の場合には、それらは同じ発現カセットまたはベクター上にあり得る。
【0011】
また、配列番号１７または１９のアミノ酸配列、ならびにその活性バリアントまたはフラグメントを含むＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質が提供される。同様に、配列番号１８または２０のアミノ酸配列、ならびにその活性バリアントまたはフラグメントを含むＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質が提供される。
【0012】
さらに、機能的ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、特にヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体が提供され、複合体のＡＮＧＰＴＬ３部分は天然（完全長または切断型）ＡＮＧＰＴＬ３または本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質であり、複合体のＡＮＧＰＴＬ８部分は、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質である。場合によっては、ＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。同様に、場合によっては、ＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。さらに、場合によっては、複合体は、ＡＮＧＰＴＬ３部分対ＡＮＧＰＴＬ８部分の１：１の比率を有することができる。他の例では、複合体は、１：１以外の比率、例えば、それぞれ１：２、１：３、２：１、または３：１のＡＮＧＰＴＬ３部分対ＡＮＧＰＴＬ８部分の比率を有することができる。
【0013】
組換えＡＮＧＴＰＬ３／８複合体を作製するための方法も提供される。この方法は、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３部分およびＡＮＧＰＴＬ８部分の１つ以上のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物発現系などの宿主細胞で発現させて、そこからＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を得るという少なくとも１つの工程を含むことができる。場合によっては、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８部分は、別個の発現構築物またはベクター上に提供される。他の例では、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８が１つの発現構築物またはベクターで提供される。この方法は、結果として生じるＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を精製する工程も含むことができ、これにはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を濃縮するだけでなく、ＡＮＧＰＴＬ３部分および／またはＡＮＧＰＴＬ８部分から１つ以上のタグ、リンカー、ならびに血清アルブミンを除去することも含まれ得る。この方法はまた、精製工程の前および／または後にＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を濃縮する工程を含むことができる。
【0014】
第二に、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に対するＡｂおよびその使用が提供され、これには、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合し、それによってＡＮＧＰＴＬ３／８複合体活性を阻害することにより脂質代謝関連およびグルコース代謝関連疾患および障害を治療することが含まれる。
【0015】
本明細書に記載の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂまたはその薬学的に許容される塩の有効量は、ＬＰＬ活性の増加、ＴＧの低下、ならびに脂質代謝および／またはグルコース代謝関連疾患または障害の治療のために、それらを必要とする個体において使用され得る。
【0016】
本明細書に記載の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、可溶性ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合し、それによってＬＰＬ活性を増加させ、血清ＴＧレベルを低下させる。ＴＧレベルが低い個体は、心血管疾患のリスクが低くなる。有利なことに、本明細書に記載の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、適切な濃度では、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体のみに結合し、ＡＮＧＰＴＬ３単独またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しない。抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＴＧが豊富なリポタンパク質（ＴＲＬ）の異化作用を増加させ、ＴＧおよび／または非ＨＤＬ－Ｃを減少させ、それによって、現在の療法では対処することのできないアテローム性動脈硬化症（ＡＳＣＶＤ）の脂質異常症の危険因子を改善すると考えられている。さらに、本明細書に記載の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しないため、これらのＡＮＧＰＴＬの他の作用は阻害されず、ＥＬの抑制解除の減少などの不都合なインビボ効果が少なくなる可能性がある。
【0017】
特に、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ヒト抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂである。場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体のインビボ活性、特にそのＬＰＬ阻害活性を抑制、遮断、阻害、干渉、中和、または低下させることができる。場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、完全長であるか、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみであり得る。抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの望ましい特性には、低用量のＡｂでのＴＧ低下が含まれ、これは少なくとも２１日間持続する。
【0018】
場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合し、軽鎖決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、ならびに重鎖決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、ＹＭＬＳＹＲＡＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、ＭＱＲＩＥＦＰＬＴ（配列番号１３）のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、ＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧ（配列番号１４）のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、ＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、ＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰ（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する。
【0019】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むＡｂがさらに提供され、ここで、ＬＣＶＲは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。あるいは重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むＡｂがさらに提供され、ここで、ＨＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。場合によっては、Ａｂは、配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。場合によっては、Ａｂは、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ここで、ＬＣは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＨＣは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。代替的には、Ａｂは、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ここで、ＬＣは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、重鎖（ＨＣ）が配列番号６のアミノ酸配列を有する。場合によっては、Ａｂは、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【0020】
場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、上記のＡｂのバリアント、特にＤ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２３）、Ｍ５６Ｔ変異（配列番号２４）、Ｅ９９Ｑ変異（配列番号２５）またはそれらの組み合わせ（例えば、Ｄ３３ＴおよびＭ５６Ｔ変異、またはＤ３３ＡおよびＭ５６Ｔ変異）を有するＬＣバリアントであり得る。
【0021】
さらに、配列番号５および６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、ポリペプチドが発現するような条件下で培養し、抗体を回収することにより作製された抗体が提供される。さらに、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第１のｃＤＮＡと、配列番号６のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする第２のｃＤＮＡ分子との、２つのｃＤＮＡを含む哺乳動物細胞を、ポリペプチドが発現するような条件下で培養し、抗体を回収することにより、作製した抗体が提供される。場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、上記のＡｂのバリアント、特にＤ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２３）、Ｍ５６Ｔ変異（配列番号２４）、Ｅ９９Ｑ変異（配列番号２５）またはそれらの組み合わせを有するＬＣバリアントであり得る。
【0022】
さらに、標準のＬＰＬ活性アッセイにおいて、０．５ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合して中和するＡｂが提供される。また、１×１０－６Ｍ以下の解離定数でヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合するＡｂが提供される。さらに、１×１０－６Ｍより大きな解離定数でＡＮＧＰＴＬ３およびヒトＡＮＧＰＴＬ８に結合するＡｂも提供される。さらに、シングルポイントＥＬＩＳＡアッセイによって測定される場合に、非結合バックグラウンドシグナルよりも３倍超大きいシグナルを伴ってヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に結合するが、シングルポイントＥＬＩＳＡアッセイによって測定される場合に、非結合のバックグラウンドシグナルより３倍超大きいシグナルを伴ってヒトＡＮＧＰＴＬ３単独またはヒトＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しないＡｂが提供される。同様に、投与後１４日の時点で、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩｇＧ対照と比較して、インビボでＴＧを少なくとも５０％低下させるＡｂが提供される。
【0023】
第三に、本明細書のＡｂまたは本明細書のＡｂの集団および許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞も提供され、ここで細胞は本明細書のＡｂを発現することができる。第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞がさらに提供され、ここで、第１のＤＮＡ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のＤＮＡ分子は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、細胞は本明細書のＡｂを発現することができる。場合によっては、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、上記のＡｂのバリアント、特にＤ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２３）、Ｍ５６Ｔ変異（配列番号２４）、Ｅ９９Ｑ変異（配列番号２５）またはそれらの組み合わせを有するＬＣバリアントであり得る。
【0024】
第四に、Ａｂを作製するための方法が提供され、この方法は、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を有する哺乳動物細胞を培養することであって、細胞は、Ａｂが発現されるような条件下で本明細書のＡｂを発現することができる、培養することと、発現されたＡｂを回収することとを含む。場合によっては、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｄ３１Ｓ変異、Ｄ３３Ａ変異、Ｄ３３Ｔ変異、Ｍ５６Ｔ変異、Ｅ９９Ｑ変異、またはそれらの組み合わせをコードすることができる。ＡＳＣＶＤ、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、糖尿病、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肥満、またはそれらの組み合わせを治療する方法も本明細書に提供され、この方法は、治療を必要とする個体に本明細書の有効量のＡｂを投与することを含む。本明細書の有効量のＡｂをＴＧを低下させる必要のある個体に投与することを含む、ＴＧを低下させる方法がさらに提供される。
【0025】
第五に、療法に使用するためにＡｂが提供される。特に、Ａｂは、ＡＳＣＶＤ、ＣＫＤ、糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満（ｏｂｓｅｓｉｔｙ）、またはそれらの組み合わせの治療に使用するためのものである。また、ＡＳＣＶＤ、ＣＫＤ、糖尿病、高トリグリセリド血症、ＮＡＳＨ、肥満（ｏｂｓｅｓｉｔｙ）、またはそれらの組み合わせを治療することに使用するための薬学的組成物も提供され、それは、本明細書のＡｂを有効量で含む。
【0026】
上記以外の利点、効果、特徴および目的は、以下の詳細な説明を考慮すれば、より容易に明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、次の図面（複数可）を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】還元および非還元条件下で実行されたＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を示すＳＤＳページゲルの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈が１つおよび１つのみの要素があることを明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【0029】
定義
本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値（複数の場合がある）の統計学的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、ｐＨ、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値（複数の場合がある）の統計学的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の典型的には２０％以内、より典型的には１０％以内、さらにより典型的には５％以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究での特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
【0030】
本明細書で使用される「親和性」は、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体上のエピトープへのＡｂの結合の強さを意味する。
【0031】
本明細書で使用される「アンジオポエチン様タンパク質３」または「ＡＮＧＰＴＬ３」とは、配列番号２を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【0032】
本明細書で使用される「アンジオポエチン様タンパク質８」または「ＡＮＧＰＴＬ８」とは、配列番号４を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【0033】
本明細書で使用される「ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体」は、１つ以上のＡＮＧＰＴＬ８化合物に結合した１つ以上のＡＮＧＰＴＬ３化合物のマルチタンパク質複合体を意味する。
【0034】
本明細書で使用される「抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂ」または「抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂ」は、特にＡＮＧＰＴＬ３／８の形態の場合、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８の両方の領域を同時に認識して結合するＡｂを意味する。一般に、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは通常、他のＡＮＧＰＴＬファミリーメンバー（例えば、ＡＮＧＰＴＬ１、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、またはＡＮＧＰＴＬ７）には結合しない。さらに、他の箇所で述べたように、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、以下のシングルポイントＥＬＩＳＡアッセイに記載されているように、指定された濃度ではＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８単独に結合しない。
【0035】
本明細書で使用される「結合」または「結合する」は、当技術分野で公知の一般的な方法によって決定されるように、タンパク質が別のタンパク質または分子とある種の化学結合または引力を形成する能力を意味する。結合は、平衡解離定数（ＫＤ）が約１×１０－６Ｍ以下であることを特徴とすることができる（すなわち、ＫＤが小さいほど結合が強いことを示す）。２つの分子が結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが含まれる。ここで、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体のみに結合し、ＡＮＧＰＴＬ３単独、またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しない。ＡｂがＡＮＧＰＴＬ３／８複合体のみに結合し、ＡＮＧＰＴＬ３単独またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しないかどうかは、以下に記載するように、シングルポイント形式の標準的ＥＬＩＳＡアッセイで決定することができ、結合は、以下に記載するように、Ｂｉａｃｏｒｅによって特徴付けることができる。本明細書のＡｂはヒトであるが、それらは、他の種、例えば、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、マウスＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、またはラットＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に由来する他のＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に対して交差反応性を示し得る。
【0036】
本明細書で使用される「有効量」は、個体への単回または複数回用量の投与で、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、系、動物、哺乳動物またはヒトに対して、生物学的または医学的応答または所望の治療効果を誘発する、本発明の化合物または本発明の化合物を含む薬学的組成物の量または用量を意味する。場合によっては、有効量の本明細書の化合物またはそれを含む組成物をそれを必要とする個体に投与すると、ＬＰＬ活性が増加する。用量は、より高い初期負荷用量、その後でより少ない用量を含むことができる。用量は、１日に複数回、１日１回、１日おき、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、２ヶ月に１回など、治療上有効な任意の間隔で投与され得る。有効量を構成する用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【0037】
本明細書で使用される「平衡解離定数」または「ＫＤ」は、特定の抗原相互作用に対するＡｂ親和性の定量的測定、例えば、ＡｂのＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に対する親和性、特に、その構成要素に可逆的に分離するＡｂ／ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体コンジュゲートの傾向の尺度を意味する。同様に、本明細書で使用される「平衡結合定数」または「Ｋａ」は、ＫＤの逆数を意味する。
【0038】
本明細書で使用される「機能的」とは、ＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質、ＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質またはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体が、例えばＬＰＬの阻害することと、Ａｂが作製され指向される抗原として作用することを含む、天然のＡＮＧＰＴＬ３、天然のＡＮＧＰＴＬ８または天然のＡＮＧＰＴＬ３／８複合体のものと同様の生物活性を有することを意味する。
【0039】
本明細書で使用される「グルコース代謝関連疾患または障害」とは、糖尿病等を意味する。
【0040】
本明細書で使用される「脂質代謝関連疾患または障害」は、異常脂質代謝に関連する状態、例えば、異常脂質血症、高脂血症および高リポタンパク血症を意味し、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合脂質異常症（肥満、代謝症候群、糖尿病など）、脂肪異栄養症、および脂肪組織萎縮症を含む。この用語は、アテローム性動脈硬化症および冠動脈疾患、急性膵炎、ＮＡＳＨ、肥満などの特定の心血管疾患も包含する。
【0041】
本明細書で使用される「最大半量効果濃度」または「ＥＣ５０」は、所定の期間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導するＡｂの濃度（通常、モル単位（Ｍ）で表される）を意味する。本明細書に記載のＥＣ５０は、理想的には３．０ｎＭ以下である。
【0042】
本明細書で使用される「核酸構築物」または「発現カセット」は、コード配列に作動可能に連結された少なくとも１つの制御配列を有する核酸分子を意味する。このようにして、プロモーターなどの制御配列は、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質および／または本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質などの目的の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列と作動可能に相互作用する。そのような核酸構築物は、発現カセットまたは導入カセットの形態であり得る。核酸構築物は、対象の１つ以上のポリペプチドのヌクレオチド配列が組み込まれた、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから構成されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。
【0043】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、核酸構築物の要素がそれらの通常の機能を果たすように構成されることを意味する。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列（すなわち、プロモーター）は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、その発現を指示するように機能する（すなわち、適切なリーディングフレームを維持する）限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されていないが転写される配列は、プロモーターとコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。
【0044】
本明細書で使用される「制御配列」または「制御配列（複数）」は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写および翻訳終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを意味し、これらは、受容宿主細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、翻訳できる限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。
【0045】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード配列（複数）」は、１つ以上の目的のポリペプチドをコードする核酸配列を意味し、これは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ＲＮＡの場合）される核酸配列である。コード配列（複数可）の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス核酸配列、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、または合成ＤＮＡ配列さえ含まれるが、これらに限定されない。
【0046】
制御配列およびコード配列に関して、それらは、宿主細胞または互いに対して内在性／類似であり得る。あるいは、制御配列およびコード配列は、宿主細胞または互いに対して異種であり得る。
【0047】
本明細書で使用される「プロモーター」は、核酸調節配列から構成されるヌクレオチド領域を意味し、ここで、調節配列は、遺伝子に由来するか、合成により作成され、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる。１つ以上の目的のポリペプチドの内在性プロモーターを含む、多くのプロモーターを核酸構築物に使用することができる。あるいは、所望の結果に基づいてプロモーターを選択することができる。このようなプロモーターには、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび構成的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【0048】
本明細書で使用される「バリアント」は、参照核酸もしくはアミノ酸配列と比較した場合に、１つ以上の特定の核酸もしくはアミノ酸残基の付加、欠失、挿入および／または置換などの１つ以上の修飾を有するポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを意味する。したがって、バリアントは、参照核酸またはアミノ酸配列と比較した場合、１つ以上の変更を含む。ここで、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＬＣまたはＨＣのバリエーションを有することができる。特に、Ａｂは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２３）、Ｍ５６Ｔ変異（配列番号２４）、またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）を有するＬＣバリアントであり得る。同様に、ＬＣバリアントは、やはり配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、例えば、Ｄ３１ＳおよびＤ３３Ａ変異、Ｄ３１ＳおよびＤ３３Ｔ変異、Ｄ３１ＳおよびＭ５６Ｔ変異、Ｄ３１ＳおよびＥ９９Ｑ変異、Ｄ３３ＡおよびＭ５６Ｔ変異、Ｄ３３ＡおよびＥ９９Ｑ変異、Ｄ３３ＴおよびＭ５６Ｔ変異、Ｄ３３ＴおよびＥ９９Ｑ変異、ならびにＭ５６ＴおよびＥ９９Ｑなど、上記の任意の２つの組み合わせであり得る。さらに、ＬＣバリアントは、やはり配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、例えば、Ｄ３１Ｓ、Ｄ３３ＡおよびＭ５６Ｔ変異、Ｄ３１Ｓ、Ｄ３３ＡおよびＥ９９Ｑ変異、Ｄ３１Ｓ、Ｄ３３ＴおよびＭ５６Ｔ変異、Ｄ３１Ｓ、Ｄ３３ＴおよびＥ９９Ｑ変異、Ｄ３３Ａ、Ｍ５６ＴおよびＥ９９Ｑ変異、ならびにＤ３３Ｔ、Ｍ５６ＴおよびＥ９９Ｑ変異など、上記の任意の３つの組み合わせであり得る。さらに、ＬＣバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列を有するＬＣに関しては、例えば、Ｄ３１Ｓ、Ｄ３３Ａ、Ｍ５６ＴおよびＥ９９Ｑ変異、ならびにＤ３１Ｓ、Ｄ３３Ｔ、Ｍ５６ＴおよびＥ９９Ｑ変異など、上記の任意の４つの組み合わせであり得る。
【0049】
本明細書で使用される「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンを意味し、これに発現カセットなどの別の核酸配列が結合して、結合した配列の複製をもたらすことができる。ベクターは、核酸分子を宿主細胞に導入ことができる。ベクターは通常、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、目的のヌクレオチド配列を、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な方法で挿入できるほか、ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を識別および選択に使用できる選択マーカーを挿入できる。そのためのベクターは、核酸配列を標的細胞に導入することができる。
【0050】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂ投与が、個体の状態の症状および合併症に有効であるかまたはそれらを緩和する目的で示される状態を有する個体を管理およびケアすることを意味する。治療は、症状または合併症の発症を予防するため、症状もしくは合併症を緩和するため、または疾患、状態もしくは障害を排除するために、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。治療には、本明細書の化合物または本明細書の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与して、ＬＰＬ活性の増加およびＴＧの低下をもたらすことが含まれる。治療される個体は動物、特に、ヒトである。
【0051】
本明細書で使用される「患者」、「対象」および「個体」は、本明細書では互換的に使用され、動物、特にヒトを意味する。特定の例では、個体はヒトであり、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの投与から利益を受ける疾患、障害または状態をさらに特徴とする。
【0052】
本明細書で使用される「抗体」または「Ａｂ」などは、鎖間および鎖内ジスルフィド結合を有する２つの重鎖および２つの軽鎖を含む完全長Ａｂを意味する。４つのポリペプチド鎖のそれぞれのアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する可変領域を含む。各ＨＣは、Ｎ末端ＨＣＶＲおよびＨＣ定常領域（ＨＣＣＲ）を含む。各軽鎖は、軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＬＣＶＲ）、およびＬＣ定常領域（ＬＣＣＲ）を含む。ここで、Ａｂは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）型Ａｂであり、ＩｇＧアイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に分類され得る。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、より保存性のあるフレームワーク領域（ＦＲ）とともに散在している、超可変領域にさらに分類される。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、次の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で、Ｎ末端からＣ末端に配置されている３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。本明細書中、ＨＣの３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と称され、ＬＣの３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される。ＣＤＲには、ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体などの抗原との特異的相互作用を形成する残基のほとんどが含まれている。残基をさまざまなＣＤＲに割り当てることは、例えばＣｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、またはＮｏｒｔｈなどのアルゴリズムによって行うことができる。Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義は、多数の結晶構造による親和性プロパゲーションクラスタリングに基づく（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４０６：２２８－２５６）。ここで、ＣＤＲは、Ｎｏｒｔｈを含む複数の定義の組み合わせに基づいた、配列表で列挙された配列によって最もよく定義される。
【0053】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。
【0054】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域でよい。
【0055】
本明細書のＡｂは、ＩｇＧ４－ＰＡＡ Ｆｃ部分を含み得る。ＩｇＧ４－ＰＡＡ Ｆｃ部分は、配列番号６の絶対位置によって番号付けされるように、位置２３１でＳｅｒからＰｒｏへの変異（Ｓ２３１Ｐ）、位置２３７でＰｈｅからＡｌａへの変異（Ｆ２３７Ａ）、および位置２３８でＬｅｕからＡｌａへの変異（Ｌ２３８Ａ）を有する。Ｓ２３１Ｐ変異は、半抗体形成（ＩｇＧ４ Ａｂ中の半分子の動的交換現象）を防ぐヒンジ変異である。Ｆ２３７ＡおよびＬ２３８Ａの変異は、すでに低いヒトＩｇＧ４アイソタイプのエフェクター機能をさらに低下させる。しかしながら、本明細書のＡｂは代替的に異なるＦｃ部分を含み得ることが意図される。
【0056】
ヒトに投与したときの免疫応答の潜在的な誘導を減少させるために、ある特定のアミノ酸は、Ａｂ生殖細胞系配列と適合させるために逆変異を必要とし得る。
【0057】
本発明の化合物を含む薬学的組成物は、このような治療を必要とする個体に非経口的に投与することができる。このような個体は、ＡＳＣＶＤを有するか、ＡＳＣＶＤの危険性が高い可能性がある。これらの個体は、急性冠症候群、心筋梗塞（ＭＩ）の病歴、安定狭心症または不安定狭心症、冠動脈またはその他の動脈血行再建、脳卒中、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、胸部または腹部大動脈瘤、またはアテローム性動脈硬化症の起源と推定される末梢動脈疾患を有し得る。ＡＳＣＶＤの危険性が高い人は、さらに２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）、ＣＫＤ、または家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を患っている可能性がある。
【0058】
非経口投与は、シリンジ、任意でペン様シリンジ、または機械駆動式注射器を用いた皮下、筋肉内または静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うことができる。場合によっては、個体への投与に適した薬学的組成物は、治療有効量の本明細書の化合物および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を有する。そのような薬学的組成物は、当該技術分野で周知である医薬品用の従来の賦形剤を使用する様々な技術のいずれかによって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ ｅｄ．，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい。
【0059】
本明細書の化合物は、上記に列挙した障害のいずれかを含む、ＬＰＬ活性の調節、脂質代謝関連疾患もしくは障害の治療、またはグルコース代謝関連疾患または障害の治療のために有用な１つ以上の追加の治療剤と同時、別個、または連続的に組み合わせて使用することができる。本発明の化合物と組み合わせることができる追加の治療剤の非限定的な例には、抗糖尿病薬、例えば、インスリンもしくはインスリン類似体、ビグアナイド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ－４（「ＤＰＰ－４」）阻害剤、またはナトリウム依存性グルコーストランスポーター（ＳＧＬＴ２）阻害剤；インクレチン化合物、例えば、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）もしくはＧＬＰ－１類似体、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）もしくはＧＩＰ類似体、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）もしくはＯＸＭ類似体；アスピリン；抗血小板剤；Ｈ２受容体遮断薬；プロトンポンプ阻害剤；降圧薬；脂質修飾治療薬、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、フィブラート、ナイアシン、ＬＸＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、ＲＯＲアゴニスト、またはコレステロール逆輸送モジュレーター；心不全治療薬、例えば、ＡＣＥ、アンギオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、ＡＲＢ、またはＢアドレナリン拮抗薬；抗炎症治療薬；高血圧治療薬、心房細動治療薬；神経変性治療薬；癌治療薬；糖尿病性心筋症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、体重減少、創傷治癒のための治療薬；腎症治療薬；ＰＡＤ治療薬、または前述した薬剤のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂおよび１つ以上の追加の治療剤（複数可）は、単一の丸剤、カプセル、錠剤、もしくは注射可能な製剤などの同じ送達経路および装置を介して一緒に投与するか、または別々の送達装置もしくは経路で同時に投与するか、または逐次的に投与するかのいずれかで別々に投与することができる。
【0060】
ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の調製および精製
本開示の一態様は、複合体のみに結合し、ＡＮＧＰＴＬ３単独またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しないＡｂを作製するために使用できるＡＮＧＰＴＬ３／８複合体である。抗ＡＮＧＰＴＬ３Ａｂおよび抗ＡＮＧＰＴＬ８Ａｂは知られているが、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂを作製するために、十分な量の機能的ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、特にヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を合成することには課題がある。さらに、または代替的には、そのようなＡＮＧＰＴＬ３／８複合体をアッセイに使用して、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ８および／またはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に対するＡｂの特性を評価することができる。
本開示の一態様は、複合体のみに結合し、ＡＮＧＰＴＬ３単独またはＡＮＧＰＴＬ８単独には結合しないＡｂを作製するために使用できるＡＮＧＰＴＬ３／８複合体である。抗ＡＮＧＰＴＬ３Ａｂおよび抗ＡＮＧＰＴＬ８Ａｂは知られているが、抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂを作製するために、十分な量の機能的ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、特にヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を合成することには課題がある。さらに、または代替的には、そのようなＡＮＧＰＴＬ３／８複合体をアッセイに使用して、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ８および／またはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に対するＡｂの特性を評価することができる。
【0061】
このように、本開示は、Ｎ末端またはＣ末端血清アルブミン（例えば、ヒト、マウス、またはウサギ）融合タンパク質としてＡＮＧＰＴＬ８を生成する方法も記載する。機能的ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体は、次に、哺乳動物発現系においてＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質を天然のＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質と共発現させることにより作製することができる。
【0062】
上記のように、天然のヒトＡＮＧＰＴＬ３および天然のヒトＡＮＧＰＴＬ８の核酸およびアミノ酸配列が知られている（例えば、それぞれ配列番号１～２および３～４を参照されたい）。しかしながら、本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３またはＡＮＧＰＴＬ８は、改変（すなわち、組換え／合成）されており、したがって、ＡＮＧＴＰＬ３およびＡＮＧＴＰＬ８の生成、分泌ならびに／または複合化を改善するために追加のアミノ酸配列を含むことにより、天然配列とは異なる。
【0063】
例えば、当技術分野で知られているように、ＡＮＧＰＴＬ３を改変して、１つ以上のリンカーおよびタグを含めることができる。ここで、ヒトＡＮＧＰＴＬ３（配列番号２）は、ＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質が配列番号１７のアミノ酸配列を有するように、リンカーおよびＦＬＡＧタグを含むように改変される。場合によっては、リンカーは約１～約１０個のアミノ酸、例えば３個のアミノ酸、特に３個のＡｌａ残基であり得る。リンカーおよびＦＬＡＧタグは、ＡＮＧＰＴＬ３配列のＮ末端またはＣ末端、特に配列番号１７のようなＣ末端に配置でき、残基１～４６０はＡＮＧＰＴＬ３に対応し、残基４６１～４７１は３－ＡｌａリンカーおよびＦＬＡＧタグに対応する。
【0064】
同様に、血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンの配列に加えて、１つ以上のリンカーおよびタグを含むようにＡＮＧＰＴＬ８を改変することができる。ここで、ヒトＡＮＧＰＴＬ８（配列番号４）は、リンカー、ＩｇＧカッパシグナルペプチド、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、成熟ヒト血清アルブミン、リンカーおよびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位を含むように変更され、その結果、ＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。場合によっては、リンカーは、剛性ポリプロリンリピート、特にＡｌａ－Ｐｒｏ（ＡＰ）－１０リンカーなどの、約１～約１０個のアミノ酸であり得る。シグナルペプチド、Ｈｉｓタグ、成熟ＨＳＡ、リンカーおよびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位は、ＡＮＧＰＴＬ８配列のＮ末端またはＣ末端、特に配列番号１８のようなＮ末端に配置でき、ここで、残基１～２０は、ＩｇＧカッパシグナルペプチドに対応し、残基２１～２７は、Ｈｉｓ－ｔａｇに対応し、残基２８～６１２は、ＨＳＡに対応し、残基６１３～６３２は、ＡＰ－１０リンカーに対応し、残基６３３～６４３は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位に対応し、および残基６４４～８２０は、ＡＮＧＰＴＬ８に対応する。
【0065】
本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質および／またはＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質を発現する核酸構築物を構築する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｂａｌｂａｓ ＆ Ｌｏｒｅｎｃｅ，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（２ｎｄ Ｅｄ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ １９８６）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｔｉｊｓｓｅｎ，”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９９３）、および”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９９５）、ならびに米国特許第６，６６４，３８７号、同第７，０６０，４９１号、同第７，３４５，２１６号および同第７，４９４，８０５号で見出すことができる。ＡＮＧＰＴＬ８にはジスルフィド結合が含まれていないため、哺乳動物の発現系を使用できる。ここで、ＨＥＫ２９３発現系またはＣＨＯ発現系を使用して、特に共発現により、ＡＮＧＰＴＬ３および／またはＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質を生成することができる。
【0066】
ＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質および／またはＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質の発現に加えて、本方法は、当技術分野で周知の、各融合タンパク質に使用される特定のタグに基づいて、得られた融合タンパク質を精製することも含むことができる。本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＴＰＬ８融合タンパク質に関して、精製は、タグを除去した後に多数の切断をもたらす可能性があり、その結果、ＡＮＧＰＴＬ３融合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を有し（残基１～４４４はＡＮＧＰＴＬ３に対応し、残基４４５～４５５は、３－ＡｌａリンカーおよびＦＬＡＧ－タグに対応する）、ＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質は、配列番号２０のアミノ酸配列を有し（残基１～４は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位からの切断残基に対応し、残基５～１８２はＡＮＧＰＴＬ８のフラグメントに対応する）、これらは互いに容易に会合して機能的ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を形成する。
【0067】
抗体の調製および精製
抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＣＨＯ ＧＳＫＯ細胞株を使用して、哺乳動物細胞発現系で産生することができる。グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子ノックアウトは、分泌条件下で低生産性または非生産性の細胞の生存を許容し得る内因性ＧＳバックグラウンド活性を排除することによって、厳しい選択厳密性を可能にする。本明細書のＡｂ ＨＣおよびＬＣをコードする遺伝子は、同時トランスフェクションのために個々のＧＳ含有発現プラスミドにサブクローニングするか、または両方の鎖を単一のＧＳ含有発現プラスミドにサブクローニングすることができる。ＨＣまたはＬＣ鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、マウスカッパリーダー配列であり得るシグナルペプチドのコード配列とインフレームで融合されて、細胞培養培地への所望の産物の分泌を増強する。発現はウイルス性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。
抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂは、ＣＨＯ ＧＳＫＯ細胞株を使用して、哺乳動物細胞発現系で産生することができる。グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子ノックアウトは、分泌条件下で低生産性または非生産性の細胞の生存を許容し得る内因性ＧＳバックグラウンド活性を排除することによって、厳しい選択厳密性を可能にする。本明細書のＡｂ ＨＣおよびＬＣをコードする遺伝子は、同時トランスフェクションのために個々のＧＳ含有発現プラスミドにサブクローニングするか、または両方の鎖を単一のＧＳ含有発現プラスミドにサブクローニングすることができる。ＨＣまたはＬＣ鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、マウスカッパリーダー配列であり得るシグナルペプチドのコード配列とインフレームで融合されて、細胞培養培地への所望の産物の分泌を増強する。発現はウイルス性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。
【0068】
ＣＨＯ ＧＳＫＯ細胞は、エレクトロポレーションおよび適切な量の組換えＨＣおよびＬＣ発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は、適切な細胞密度で浮遊培養において維持される。トランスフェクトされた細胞の選択は、グルタミンなしの、２５μＭのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）含有無血清培地での増殖によって達成され、３２～３７℃および５％～７％ＣＯ２でインキュベートされる。Ａｂは、ＣＨＯ細胞から培地に分泌される。Ａｂは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、その後の陰イオン交換、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（または他の適切な方法）によって精製することができ、さらに精製するためにサイズ排除クロマトグラフィーを利用することができる。
【0069】
回収した培地からのＡｂを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉する。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）などのランニングバッファーまたはＴｒｉｓを含むランニングバッファーで樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。次に、Ａｂを、２０ｍＭの酢酸／５ｍＭのクエン酸などの低ｐＨ溶液で樹脂から溶出する。ＡＮＧＰＴＬ３／８Ａｂを含む画分はプールされ、潜在的なウイルスを不活化するために低ｐＨに保持することができる。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０などの塩基を加えることで、ｐＨを中性化できる。ＡＮＧＰＴＬ３／８Ａｂは、フェニルＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの樹脂を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってさらに精製できる。抗ＡＮＧＰＴＬ３／８Ａｂは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０中の硫酸ナトリウム勾配を使用して、ＨＩＣカラムから溶出できる。抗ＡＮＧＰＴＬ３／８Ａｂは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４でアイソクラティック溶出することにより、サイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製できる。
【0070】
本発明に記載される化合物は、この様式で、または当業者によって容易に決定される同様の方法で、調製される。
【0071】
ヒト可変軽鎖および重鎖ドメインを保有するマウスを上記のＡＮＧＰＴＬ３／８複合体で免疫し、マーカーとしてＡＮＧＰＴＬ３／８（陽性）およびＡＮＧＰＴＬ３（陰性）を使用して、単一の抗原特異的Ｂ細胞をＦＡＣＳによって単離する。重鎖および軽鎖可変領域ＤＮＡは、ＰＣＲによって単一のＢ細胞から回収され、ＩｇＧ発現ベクターにクローニングされる。トランスフェクション後に結合活性についてＣＨＯ細胞上清を試験する。
【実施例】
【0072】
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
【0073】
実施例１：ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の作成
ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８の発現：ヒトＡＮＧＰＴＬ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、リンカーおよびＦＬＡＧタグ（配列番号１７）を、ＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターに挿入する。同様に、ヒトＡＮＧＴＰＬ８、マウスＩｇＧカッパシグナルペプチド、ＨＩＳタグ、成熟ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）－ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位（配列番号１８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含有する哺乳動物発現ベクターに挿入される。タンパク質の発現は、無血清培地で培養されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞における、上記の両方の発現ベクターの一過性の同時トランスフェクションによるものである。トランスフェクションの５日後に培養液を回収し、その後のタンパク質精製のために４℃で保存する。
ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ８の発現：ヒトＡＮＧＰＴＬ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、リンカーおよびＦＬＡＧタグ（配列番号１７）を、ＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターに挿入する。同様に、ヒトＡＮＧＴＰＬ８、マウスＩｇＧカッパシグナルペプチド、ＨＩＳタグ、成熟ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）－ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）切断部位（配列番号１８）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターを含有する哺乳動物発現ベクターに挿入される。タンパク質の発現は、無血清培地で培養されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞における、上記の両方の発現ベクターの一過性の同時トランスフェクションによるものである。トランスフェクションの５日後に培養液を回収し、その後のタンパク質精製のために４℃で保存する。
【0074】
タンパク質精製：タンパク質精製は、４℃で行われ、４Ｌの培養培地に１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および５ＭのＮａＣｌがそれぞれ最終濃度２５ｍＭおよび１５０ｍＭで補充される。次に、培地を１５０ｍｌのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）とともに一晩インキュベートする。樹脂をカラムに詰め、バッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ）で洗浄する。タンパク質は、バッファーＡ中の０～３００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出される。ＨＩＳ－ＨＳＡ－ＡＮＧＰＴＬ８／ＡＮＧＰＴＬ３－Ｆｌａｇを含む画分をプールし、濃縮して、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードし、バッファーＡで溶出する。ＨＩＳ－ＨＳＡ－ＡＮＧＰＴＬ８／ＡＮＧＰＴＬ３－Ｆｌａｇを含む画分を再びプールし、濃縮し、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で消化して、ＨＩＳ－ＨＳＡ－ＡＮＧＰＴＬ８融合タンパク質からＨＳＡを除去する。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）で消化したタンパク質試料を、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００カラムにロードし、保存バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で溶出する。ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体を含む画分をプールして濃縮し、ブラッドフォード法を使用してタンパク質濃度を決定する。ＡＮＧＴＰＬ３／８複合体をアリコートに分け、さらに使用するまで－８０℃で保存する。
【0075】
ＬＰＬ活性アッセイ：ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）ＬＰＬアッセイは、製造元（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従って実行される。簡単にいうと、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＬＴ３／８複合体を増殖培地で連続希釈し、１時間インキュベートしてＬＰＬ細胞培地と交換する。次に、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）リパーゼ基質（ＥＬＳ）をＬＰＬ発現細胞に加え、３０分間インキュベートする。蛍光は４８２ｎｍ／５１５ｎｍ（それぞれ励起／蛍光）で測定される。ＬＰＬに対するＡＮＧＰＴＬ３および３／８の阻害％を計算する。
【0076】
結果：
表１は、精製／濃縮のさまざまな段階でのＡＮＧＴＰＬ３／８複合体タンパク質の収量を示す。
表１は、精製／濃縮のさまざまな段階でのＡＮＧＴＰＬ３／８複合体タンパク質の収量を示す。
【0077】
【表1】
【0078】
同様に、図１は、カラムから得られた精製および濃縮されたＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の４～２０％のＴＧ ＴＧＸクーマシー染色ゲルを示し、複合体が形成／集合することを確証している。精製および濃縮後、ＡＮＧＴＬ３は配列番号１９のアミノ酸配列を有し、ＡＮＧＰＴＬ８は配列番号２０のアミノ酸配列を有する。
【0079】
ＬＰＬアッセイでは、ＡＮＧＰＴＬ３のＥＣ５０は、２１．５ｎＭであり、一方、ＡＮＧＴＰＬ３／８複合体のＥＣ５０は、０．５４ｎＭであり、複合体が機能的であることが確証している。
【0080】
実施例２：アッセイ
シングルポイントＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）アッセイ：ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、遊離ＡＮＧＰＴＬ３または遊離ＡＮＧＰＴＬ８のいずれかに対するＡｂ結合選択性は、シングルポイント形式の標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して最初に検証される。簡単に言えば、アッセイプレートを２μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＦｃ Ａｂでコーティングし、続いてカゼインでブロックする。ＣＨＯ細胞での発現後に上清に分泌されたＩｇＧは、次に、アッセイプレートに捕捉される。ビオチン化抗原を２５ｎＭの濃度で添加して、Ａｂ／抗原の結合を可能にする。Ａｂ／抗原複合体は、アルカリホスファターゼ結合ニュートラアビジンおよびアルカリホスファターゼ基質を添加し、続いて５６０ｎｍで光学密度を測定した後に検出される。正の結合は、非結合バックグラウンドシグナルの３倍を超えるシグナルによって決定される。
シングルポイントＥＬＩＳＡ（ＳＰＥ）アッセイ：ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、遊離ＡＮＧＰＴＬ３または遊離ＡＮＧＰＴＬ８のいずれかに対するＡｂ結合選択性は、シングルポイント形式の標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して最初に検証される。簡単に言えば、アッセイプレートを２μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＦｃ Ａｂでコーティングし、続いてカゼインでブロックする。ＣＨＯ細胞での発現後に上清に分泌されたＩｇＧは、次に、アッセイプレートに捕捉される。ビオチン化抗原を２５ｎＭの濃度で添加して、Ａｂ／抗原の結合を可能にする。Ａｂ／抗原複合体は、アルカリホスファターゼ結合ニュートラアビジンおよびアルカリホスファターゼ基質を添加し、続いて５６０ｎｍで光学密度を測定した後に検出される。正の結合は、非結合バックグラウンドシグナルの３倍を超えるシグナルによって決定される。
【0081】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体、遊離ＡＮＧＰＴＬ３または遊離ＡＮＧＰＴＬ８のいずれかに対するＡｂ結合選択性は、標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検証される。簡単に言えば、アッセイプレートを２μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＦｃ Ａｂでコーティングし、続いてカゼインでブロックする。次に、ＣＨＯ細胞での発現後のＣＨＯ上清からのＡｂをアッセイプレートに捕捉すると、Ａｂ濃度は２μｇ／ｍｌとなる。ビオチン化抗原（ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ８、またはＡＮＧＰＴＬ３／８複合体）を段階希釈によりさまざまな濃度で添加し、Ａｂ／抗原の結合を可能にする。Ａｂ／抗原複合体は、アルカリホスファターゼ結合ニュートラアビジンおよびアルカリホスファターゼ基質を添加し、続いて５６０ｎｍで光学密度を測定した後に検出される。
【0082】
【表2】
【0083】
ＳＰＥアッセイにおいて、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有するＡｂは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への正の結合を示し、ならびにヒトＡＮＧＰＴＬ８およびヒトＡＮＧＰＴＬ３への負の結合を示す。Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２４）、Ｍ５６Ｔ変異（配列番号２４）またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）を有するＬＣバリアントと、配列番号６のＨＣとを有するＡｂは、同様に、ヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への結合を示し、ならびにヒトＡＮＧＰＴＬ８およびヒトＡＮＧＰＴＬへの負の結合を示す。
【0084】
【表3】
【0085】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有するＡｂは、このアッセイにおいて１００ｎＭの抗原濃度までは、濃度依存的にヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体に正の結合を示し、ヒトＡＮＧＰＴＬ８およびヒトＡＮＧＰＴＬ３には検出可能な結合を示さない（表３）。
【0086】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する上記の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂに加えて、Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）を有するＬＣバリアントと、配列番号６のＨＣとを有するＡｂがアッセイされ、同様に、このアッセイにおいて１００ｎＭの抗原濃度までは、濃度依存的にヒトＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への正の結合を示し、ヒトＡＮＧＰＴＬ８およびヒトＡＮＧＰＴＬ３には検出可能な結合を示さない（表４～６）。
【0087】
【表4】
【0088】
【表5】
【0089】
【表6】
【0090】
実施例３：インビトロ受容体親和性
結合速度論は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して決定することができる。ＣＭ４センサーチップ表面は、Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ｂｉｎｄｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）の共有結合により調製することができる。速度論的実験は、ＨＢＳＥＰ＋、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４のランニングバッファー中、約２５℃で行うことができる。抗体を捕捉し、マウス、カニクイザル、またはヒトのＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の一連の濃度を、約５０μＬ／分で約２４０秒間、約８００秒の解離時間で、チップ表面に注入することができる。速度論的パラメーター（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）を決定するために、データを二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して、１：１の結合モデルに当てはめる。以下の表７は、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの、ｐＨ７．４および温度２５℃における、異なる種からの様々なＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への結合を示す。
結合速度論は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して決定することができる。ＣＭ４センサーチップ表面は、Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ｂｉｎｄｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）の共有結合により調製することができる。速度論的実験は、ＨＢＳＥＰ＋、０．０１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４のランニングバッファー中、約２５℃で行うことができる。抗体を捕捉し、マウス、カニクイザル、またはヒトのＡＮＧＰＴＬ３／８複合体の一連の濃度を、約５０μＬ／分で約２４０秒間、約８００秒の解離時間で、チップ表面に注入することができる。速度論的パラメーター（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）を決定するために、データを二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して、１：１の結合モデルに当てはめる。以下の表７は、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの、ｐＨ７．４および温度２５℃における、異なる種からの様々なＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への結合を示す。
【0091】
【表7】
【0092】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する上記の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂに加えて、Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）を有するＬＣバリアントと、配列番号６のＨＣとを有するＡｂは、ｐＨ７．４および温度２５℃で、異なる種からのさまざまなＡＮＧＰＴＬ３／８複合体への結合についてアッセイされる（表８～１０）。
【0093】
【表8】
【0094】
【表9】
【0095】
【表10】
【0096】
実施例４：インビトロ機能的活性ＬＰＬアッセイ
細胞に基づくバイオアッセイを使用して、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂが、ＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ３／８精製タンパク質阻害を抑制解除する能力を評価する。ＡｂのＡＮＧＰＴＬ３／８阻害活性は、ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）リパーゼ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定される。ヒト、カニクイザル、マウスまたはラットのＬＰＬ、および精製されたヒト、カニクイザル、マウスまたはラットのＡＮＧＰＴＬ３／８タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞株。ＨＥＫ２９３－ＬＰＬの生成には、標準的な方法を使用して生成されたヒトＬＰＬを安定して発現するヒト胚細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈｕＬＰＬ）が含まれる。簡単に言えば、ＣＭＶプロモーターおよびブラスチシジン耐性を持つレンチウイルスプラスミドにヒトＬＰＬをクローニングする。プラスミドは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してヒトＬＰＬレンチウイルスを生成するために使用される。ＨＥＫ２９３細胞をＬＰＬレンチウイルスとともにインキュベートし、ブラスチシジンに耐性のあるクローンを選択する。ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）基質を利用したｑＰＣＲおよびＬＰＬ活性により、ヒトＬＰＬ ｍＲＮＡの発現を確認した後、クローンを選択する。この方法は、カニクイザル、マウス、およびラットのＬＰＬに対して繰り返される。
細胞に基づくバイオアッセイを使用して、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂが、ＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ３／８精製タンパク質阻害を抑制解除する能力を評価する。ＡｂのＡＮＧＰＴＬ３／８阻害活性は、ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）リパーゼ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定される。ヒト、カニクイザル、マウスまたはラットのＬＰＬ、および精製されたヒト、カニクイザル、マウスまたはラットのＡＮＧＰＴＬ３／８タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞株。ＨＥＫ２９３－ＬＰＬの生成には、標準的な方法を使用して生成されたヒトＬＰＬを安定して発現するヒト胚細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈｕＬＰＬ）が含まれる。簡単に言えば、ＣＭＶプロモーターおよびブラスチシジン耐性を持つレンチウイルスプラスミドにヒトＬＰＬをクローニングする。プラスミドは、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してヒトＬＰＬレンチウイルスを生成するために使用される。ＨＥＫ２９３細胞をＬＰＬレンチウイルスとともにインキュベートし、ブラスチシジンに耐性のあるクローンを選択する。ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）基質を利用したｑＰＣＲおよびＬＰＬ活性により、ヒトＬＰＬ ｍＲＮＡの発現を確認した後、クローンを選択する。この方法は、カニクイザル、マウス、およびラットのＬＰＬに対して繰り返される。
【0097】
方法は、Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５２：８２６－８３２）に記載されている方法を変更した：（ａ）ＨＥＫ２９３－ＬＰＬ細胞を、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジンをコーティングしたプレートＡ（ヒト）、Ｂ（カニクイザル）、Ｃ（マウス）またはＤ（ラット）の半分の領域に、２５０００細胞／ウェルの密度で加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートする。Ａｂを開始ストック濃度から９倍に連続希釈して、１０ポイントのＣＲＣを生成し、次いで、９６ウェルのプレートＥ（ヒト）、Ｆ（カニクイザル）、Ｇ（マウス）またはＨ（ラット）中の、精製されたＡＮＧＰＴＬ３／８タンパク質に添加する（ＩＣ８０濃度は、ヒトで０．４２ｎＭ、カニクイザルで０．３８ｎＭ、マウスで０．１３ｎＭ、またはラットで０．８１ｎＭである）。
【0098】
プレートＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ中のＨＥＫ２９３－ＬＰＬ細胞の培地を、プレートＥ、Ｆ、Ｇ、およびＨからのＡＮＧＰＴＬ３／８およびＡｂ混合物とそれぞれ置き換え、３７℃、５％のＣＯ２で、１時間インキュベートする。１０μｌのＥｎｚＣｈｅｋ（商標）リパーゼ基質（０．０５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート）（Ｓｉｇｍａ）中５μＭの濃度で調製）を、プレートＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ中の細胞、ＡＮＧＰＴＬ３／８およびＡｂ混合物に加える。プレートリーダーを使用して、４９５ｎｍカットオフフィルターを使用して、４８２ｎｍでの励起および５１５ｎｍでの発光での蛍光を測定する。プレートは、各時点の間、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートされる。相対蛍光（ＬＰＬ活性に直接比例）は、３１分でのシグナルから１分でのシグナルを差し引くことで計算される。ＡｂがＬＰＬ活性を５０％回復する有効濃度（ＥＣ５０）は、エクセルフィットを利用して計算される。ＥＣ５０濃度を表１１に示す。
【0099】
抑制解除率は次のように計算される。
［式中、ＭＡＸ＝細胞のみ（ＬＰＬ）、およびＭＩＮ＝細胞（ＬＰＬ）＋ＡＮＧＰＴＬ３／８ＣＭ（馴化培地）］
【数1】
【0100】
Ａｂは、一般に、ＥＣ５０が低いため、ＬＰＬの抑制解除において強力である。Ａｂはまた、ＬＰＬの有利な最大抑制解除％を有する。
【0101】
【表11】
【0102】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する上記の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂに加えて、Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異（配列番号２２）、Ｄ３３Ｔ変異（配列番号２３）またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）を有するＬＣバリアントと、配列番号６のＨＣとを有するＡｂは、ＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ３／８精製タンパク質の抑制解除についてアッセイされる（表１２）。
【0103】
【表12】
【0104】
実施例５：インビボトリグリセリド応答
血清ＴＧに対する、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの効果は、ｈｕＣＥＴＰおよびｈｕアポリポタンパク質Ａ１について形質転換されたマウスにおいて評価される（ａ）。マウスから血液を採取し、実験開始前に血清を分離する。Ｃｏｂａｓ（登録商標）臨床化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、血清試料中のＴＧを測定する。動物を２０匹からなる５群に割り当てて、同様の血清ＴＧ平均値を持つ群を得る。次に、２０匹の各群を、同様の血清トリグリセリド平均値を持つ５匹人からなる４群にさらに細分化する。Ａｂは、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）で、動物の４つの別々の群に、単回皮下注射によりマウスに投与される。対照抗原結合無効アイソタイプ適合ｍＡｂを、３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）の単回皮下注射により、動物の第５群に投与する。
血清ＴＧに対する、配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂの効果は、ｈｕＣＥＴＰおよびｈｕアポリポタンパク質Ａ１について形質転換されたマウスにおいて評価される（ａ）。マウスから血液を採取し、実験開始前に血清を分離する。Ｃｏｂａｓ（登録商標）臨床化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、血清試料中のＴＧを測定する。動物を２０匹からなる５群に割り当てて、同様の血清ＴＧ平均値を持つ群を得る。次に、２０匹の各群を、同様の血清トリグリセリド平均値を持つ５匹人からなる４群にさらに細分化する。Ａｂは、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）、または３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）で、動物の４つの別々の群に、単回皮下注射によりマウスに投与される。対照抗原結合無効アイソタイプ適合ｍＡｂを、３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２０）の単回皮下注射により、動物の第５群に投与する。
【0105】
Ａｂ投与後１時間（ｎ＝５）、８時間（ｎ＝５）、１日（ｎ＝５）、２日（ｎ＝５）、３日（ｎ＝５）、７日（ｎ＝５）、１４日（ｎ＝５）および２１日（ｎ＝５）に、動物から採血する。亜群Ａの動物から、１時間および３日の時点で、血液を採取する。亜群Ｂの動物から、８時間および７日の時点で、血液を採取する。亜群Ｃの動物から、１日および１４日の時点で、血液を採取する。亜群Ｄの動物から、２日および２１日の時点で、血液を採取する。血清は血液から調製され、血清ＴＧレベルはＣｏｂａｓ（登録商標）臨床化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ）を使用して測定された。時間一致したアイソタイプ対照からのＴＧのパーセント変化は、各時点でのＡｂの各用量について計算される。変化パーセントの計算は、［（Ｒ×血清トリグリセリド－時間一致したアイソタイプ対照血清トリグリセリド）／（時間一致したアイソタイプ対照血清トリグリセリド）］×１００である。データを表１３に示す。
【0106】
【表13】
【0107】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有するＡｂのＴＧを低下させる効力は、１日目から良好に開始し、良好な効果は２１日目まで持続する。
【0108】
配列番号５のＬＣおよび配列番号６のＨＣを有する上記の抗ＡＮＧＰＴＬ３／８複合体Ａｂに加えて、Ｄ３１Ｓ変異（配列番号２１）、Ｄ３３Ａ変異を有するＬＣバリアントを有するＡｂ（配列番号２２）またはＥ９９Ｑ変異（配列番号２５）および配列番号６のＨＣをアッセイして、マウスにおけるＩｇＧ対照と比較したＴＧの変化を評価する（表１４）。
【0109】
【表14】
【0110】
配列表
以下の核酸配列およびアミノ酸配列は、本開示において前述のように言及され、参照のために以下に提供される。
以下の核酸配列およびアミノ酸配列は、本開示において前述のように言及され、参照のために以下に提供される。
【0111】
配列番号１
ａｔａｔａｔａｇａｇｔｔａａｇａａｇｔｃｔａｇｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａａｇａａａａｃａｇｔｔｃｃａｃｇｔｔｇｃｔｔｇａａａｔｔｇａａａａｔｃａａｇａｔａａａａａｔｇｔｔｃａｃａａｔｔａａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｔｔａｔｔｇｔｔｃｃｔｃｔａｇｔｔａｔｔｔｃｃｔｃｃａｇａａｔｔｇａｔｃａａｇａｃａａｔｔｃａｔｃａｔｔｔｇａｔｔｃｔｃｔａｔｃｔｃｃａｇａｇｃｃａａａａｔｃａａｇａｔｔｔｇｃｔａｔｇｔｔａｇａｃｇａｔｇｔａａａａａｔｔｔｔａｇｃｃａａｔｇｇｃｃｔｃｃｔｔｃａｇｔｔｇｇｇａｃａｔｇｇｔｃｔｔａａａｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｔａａｇａｃｇａａｇｇｇｃｃａａａｔｔａａｔｇａｃａｔａｔｔｔｃａａａａａｃｔｃａａｃａｔａｔｔｔｇａｔｃａｇｔｃｔｔｔｔｔａｔｇａｔｃｔａｔｃｇｃｔｇｃａａａｃｃａｇｔｇａａａｔｃａａａｇａａｇａａｇａａａａｇｇａａｃｔｇａｇａａｇａａｃｔａｃａｔａｔａａａｃｔａｃａａｇｔｃａａａａａｔｇａａｇａｇｇｔａａａｇａａｔａｔｇｔｃａｃｔｔｇａａｃｔｃａａｃｔｃａａａａｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｃｃｔａｇａａｇａａａａａａｔｔｃｔａｃｔｔｃａａｃａａａａａｇｔｇａａａｔａｔｔｔａｇａａｇａｇｃａａｃｔａａｃｔａａｃｔｔａａｔｔｃａａａａｔｃａａｃｃｔｇａａａｃｔｃｃａｇａａｃａｃｃｃａｇａａｇｔａａｃｔｔｃａｃｔｔａａａａｃｔｔｔｔｇｔａｇａａａａａｃａａｇａｔａａｔａｇｃａｔｃａａａｇａｃｃｔｔｃｔｃｃａｇａｃｃｇｔｇｇａａｇａｃｃａａｔａｔａａａｃａａｔｔａａａｃｃａａｃａｇｃａｔａｇｔｃａａａｔａａａａｇａａａｔａｇａａａａｔｃａｇｃｔｃａｇａａｇｇａｃｔａｇｔａｔｔｃａａｇａａｃｃｃａｃａｇａａａｔｔｔｃｔｃｔａｔｃｔｔｃｃａａｇｃｃａａｇａｇｃａｃｃａａｇａａｃｔａｃｔｃｃｃｔｔｔｃｔｔｃａｇｔｔｇａａｔｇａａａｔａａｇａａａｔｇｔａａａａｃａｔｇａｔｇｇｃａｔｔｃｃｔｇｃｔｇａａｔｇｔａｃｃａｃｃａｔｔｔａｔａａｃａｇａｇｇｔｇａａｃａｔａｃａａｇｔｇｇｃａｔｇｔａｔｇｃｃａｔｃａｇａｃｃｃａｇｃａａｃｔｃｔｃａａｇｔｔｔｔｔｃａｔｇｔｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｔａｔａｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｔｇｇａｃａｔｔａａｔｔｃａａｃａｔｃｇａａｔａｇａｔｇｇａｔｃａｃａａａａｃｔｔｃａａｔｇａａａｃｇｔｇｇｇａｇａａｃｔａｃａａａｔａｔｇｇｔｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔｇｇａｇａａｔｔｔｔｇｇｔｔｇｇｇｃｃｔａｇａｇａａｇａｔａｔａｃｔｃｃａｔａｇｔｇａａｇｃａａｔｃｔａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａｃｇａａｔｔｇａｇｔｔｇｇａａｇａｃｔｇｇａａａｇａｃａａｃａａａｃａｔｔａｔａｔｔｇａａｔａｔｔｃｔｔｔｔｔａｃｔｔｇｇｇａａａｔｃａｃｇａａａｃｃａａｃｔａｔａｃｇｃｔａｃａｔｃｔａｇｔｔｇｃｇａｔｔａｃｔｇｇｃａａｔｇｔｃｃｃｃａａｔｇｃａａｔｃｃｃｇｇａａａａｃａａａｇａｔｔｔｇｇｔｇｔｔｔｔｃｔａｃｔｔｇｇｇａｔｃａｃａａａｇｃａａａａｇｇａｃａｃｔｔｃａａｃｔｇｔｃｃａｇａｇｇｇｔｔａｔｔｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃａｔｇａｔｇａｇｔｇｔｇｇａｇａａａａｃａａｃｃｔａａａｔｇｇｔａａａｔａｔａａｃａａａｃｃａａｇａｇｃａａａａｔｃｔａａｇｃｃａｇａｇａｇｇａｇａａｇａｇｇａｔｔａｔｃｔｔｇｇａａｇｔｃｔｃａａａａｔｇｇａａｇｇｔｔａｔａｃｔｃｔａｔａａａａｔｃａａｃｃａａａａｔｇｔｔｇａｔｃｃａｔｃｃａａｃａｇａｔｔｃａｇａａａｇｃｔｔｔｇａａｔｇａａｃｔｇａｇｇｃａａａｔｔｔａａａａｇｇｃａａｔａａｔｔｔａａａｃａｔｔａａｃｃｔｃａｔｔｃｃａａｇｔｔａａｔｇｔｇｇｔｃｔａａｔａａｔｃｔｇｇｔａｔｔａａａｔｃｃｔｔａａｇａｇａａａｇｃｔｔｇａｇａａａｔａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｃｔｔａａａｇｔｃａｃｔｇｔｃｔａｔｔｔａａｇａｔｔａａａｃａｔａｃａａｔｃａｃａｔａａｃｃｔｔａａａｇａａｔａｃｃｇｔｔｔａｃａｔｔｔｃｔｃａａｔｃａａａａｔｔｃｔｔａｔａａｔａｃｔａｔｔｔｇｔｔｔｔａａａｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｔｇｇｇａａｔｃａａｔｔｔｔａｇａｔｇｇｔｃａｃａａｔｃｔａｇａｔｔａｔａａｔｃａａｔａｇｇｔｇａａｃｔｔａｔｔａａａｔａａｃｔｔｔｔｃｔａａａｔａａａａａａｔｔｔａｇａｇａｃｔｔｔｔａｔｔｔｔａａａａｇｇｃａｔｃａｔａｔｇａｇｃｔａａｔａｔｃａｃａａｃｔｔｔｃｃｃａｇｔｔｔａａａａａａｃｔａｇｔａｃｔｃｔｔｇｔｔａａａａｃｔｃｔａａａｃｔｔｇａｃｔａａａｔａｃａｇａｇｇａｃｔｇｇｔａａｔｔｇｔａｃａｇｔｔｃｔｔａａａｔｇｔｔｇｔａｇｔａｔｔａａｔｔｔｃａａａａｃｔａａａａａｔｃｇｔｃａｇｃａｃａｇａｇｔａｔｇｔｇｔａａａａａｔｃｔｇｔａａｔａｃａａａｔｔｔｔｔａａａｃｔｇａｔｇｃｔｔｃａｔｔｔｔｇｃｔａｃａａａａｔａａｔｔｔｇｇａｇｔａａａｔｇｔｔｔｇａｔａｔｇａｔｔｔａｔｔｔａｔｇａａａｃｃｔａａｔｇａａｇｃａｇａａｔｔａａａｔａｃｔｇｔａｔｔａａａａｔａａｇｔｔｃｇｃｔｇｔｃｔｔｔａａａｃａａａｔｇｇａｇａｔｇａｃｔａｃｔａａｇｔｃａｃａｔｔｇａｃｔｔｔａａｃａｔｇａｇｇｔａｔｃａｃｔａｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｔｔａａａａｔａｔａｔａｃｔｇｔａｔａｃａｔｔｔｔａｔａｔａｔｔｔｔａａｃａｃｔｔａａｔａｃｔａｔｇａａａａｃａａａｔａａｔｔｇｔａａａｇｇａａｔｃｔｔｇｔｃａｇａｔｔａｃａｇｔａａｇａａｔｇａａｃａｔａｔｔｔｇｔｇｇｃａｔｃｇａｇｔｔａａａｇｔｔｔａｔａｔｔｔｃｃｃｃｔａａａｔａｔｇｃｔｇｔｇａｔｔｃｔａａｔａｃａｔｔｃｇｔｇｔａｇｇｔｔｔｔｃａａｇｔａｇａａａｔａａａｃｃｔｃｇｔａａｃａａｇｔｔａｃｔｇａａｃｇｔｔｔａａａｃａｇｃｃｔｇａｃａａｇｃａｔｇｔａｔａｔａｔｇｔｔｔａａａａｔｔｃａａｔａａａｃａａａｇａｃｃｃａｇｔｃｃｃｔａａａｔｔａｔａｇａａａｔｔｔａａａｔｔａｔｔｃｔｔｇｃａｔｇｔｔｔａｔｃｇａｃａｔｃａｃａａｃａｇａｔｃｃｃｔａａａｔｃｃｃｔａａａｔｃｃｃｔａａａｇａｔｔａｇａｔａｃａａａｔｔｔｔｔｔａｃｃａｃａｇｔａｔｃａｃｔｔｇｔｃａｇａａｔｔｔａｔｔｔｔｔａａａｔａｔｇａｔｔｔｔｔｔａａａａｃｔｇｃｃａｇｔａａｇａａａｔｔｔｔａａａｔｔａａａｃｃｃａｔｔｔｇｔｔａａａｇｇａｔａｔａｇｔｇｃｃｃａａｇｔｔａｔａｔｇｇｔｇａｃｃｔａｃｃｔｔｔｇｔｃａａｔａｃｔｔａｇｃａｔｔａｔｇｔａｔｔｔｃａａａｔｔａｔｃｃａａｔａｔａｃａｔｇｔｃａｔａｔａｔａｔｔｔｔｔａｔａｔｇｔｃａｃａｔａｔａｔａａａａｇａｔａｔｇｔａｔｇａｔｃｔａｔｇｔｇａａｔｃｃｔａａｇｔａａａｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｃａｇａａａａｇｔａｃａａａａｔａａｔａａａｇｇｔａａａａａｔａａｔｃｔａｔａａｔｔｔｔｃａｇｇａｃｃａｃａｇａｃｔａａｇｃｔｇｔｃｇａａａｔｔａａｃｇｃｔｇａｔｔｔｔｔｔｔａｇｇｇｃｃａｇａａｔａｃｃａａａａｔｇｇｃｔｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃａａａａｔｔｇｇａｃａａｔｔｔｃａａａｔｇｃａａａａｔａａｔｔｃａｔｔａｔｔｔａａｔａｔａｔｇａｇｔｔｇｃｔｔｃｃｔｃｔａｔｔ
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配列番号２
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【0113】
配列番号３
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【0114】
配列番号４
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【0115】
配列番号５
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0116】
配列番号６
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＬＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
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【0117】
配列番号７
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【0118】
配列番号８
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【0119】
配列番号９
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【0120】
配列番号１０
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＬＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＬＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0121】
配列番号１１
ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ
ＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤ
【0122】
配列番号１２
ＹＭＬＳＹＲＡＳ
ＹＭＬＳＹＲＡＳ
【0123】
配列番号１３
ＭＱＲＩＥＦＰＬＴ
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【0124】
配列番号１４
ＴＦＳＧＦＳＬＳＩＳＧＶＧＶＧ
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【0125】
配列番号１５
ＬＩＹＲＮＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳ
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【0126】
配列番号１６
ＡＲＴＹＳＳＧＷＹＧＮＷＦＤＰ
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【0127】
配列番号１７
ＭＦＴＩＫＬＬＬＦＩＶＰＬＶＩＳＳＲＩＤＱＤＮＳＳＦＤＳＬＳＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＱＴＳＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＹＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＮＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＩＬＬＱＱＫＶＫＹＬＥＥＱＬＴＮＬＩＱＮＱＰＥＴＰＥＨＰＥＶＴＳＬＫＴＦＶＥＫＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＴＶＥＤＱＹＫＱＬＮＱＱＨＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＱＬＮＥＩＲＮＶＫＨＤＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤＳＥＳＦＥＡＡＡＤＹＫＤＤＤＤＫ
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【0128】
配列番号１８
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【0129】
配列番号１９
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【0130】
配列番号２０
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【0131】
配列番号２１
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＳＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0132】
配列番号２２
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＡＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0133】
配列番号２３
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＴＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0134】
配列番号２４
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＥＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0135】
配列番号２５
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＤＳＤＤＧＮＴＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＭＬＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＲＩＱＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【図1】
【配列表】