特許 7241888 ｐＨ勾配ＳＰＲに基づく結合アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-09

(45)【発行日】2023-03-17

(54)【発明の名称】ｐＨ勾配ＳＰＲに基づく結合アッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20230310BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20230310BHJP

   C07K 17/02 20060101ALN20230310BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

G01N33/53 D

G01N33/543 595

C07K17/02

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021538211

(86)(22)【出願日】2019-12-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-18

(86)【国際出願番号】 EP2019086740

(87)【国際公開番号】W WO2020141117

(87)【国際公開日】2020-07-09

【審査請求日】2021-08-05

(31)【優先権主張番号】18215921.0

(32)【優先日】2018-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】シュロットハウアー ティルマン

(72)【発明者】

【氏名】スピック クリスチャン

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５０７９０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５００２４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Lakayan, D., Haselberg, R., Gahoual, R. et al，Affinity profiling of monoclonal antibody and antibody-drug-conjugate preparations by coupled liquid chromatography-surface plasmon resonance biosensing，Analytical and Bioanalytical Chemistry，2018年10月17日，410，7837-7848

【文献】Tilman Schlothauer, Petra Rueger, Jan Olaf Stracke, Hubert Hertenberger, Felix Fingas, Lothar Kling, Thomas Emrich, Georg Drabner, Stefan Seeber, Johannes Auer, Stefan Koch & Apollon Papadimitriou，Analytical FcRn affinity chromatography for functional characterization of monoclonal antibodies，mAbs，2013年05月29日，5:4，576-586

【文献】Szabolcs Fekete, Alain Beck, Jeno Fekete, Davy Guillarme，Method development for the separation of monoclonal antibody charge variants in cation exchange chromatography, Part II: pH gradient approach，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015年01月05日，Volume 102，Pages 282-289

【文献】Nico Lingg, Eddy Tan, Beate Hintersteiner, Muriel Bardor, Alois Jungbauer，Highly linear pH gradients for analyzing monoclonal antibody charge heterogeneity in the alkaline range，Journal of Chromatography A，2013年12月06日，Volume 1319，Pages 65-71

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

解離ｐＨ値での抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを決定するための表面プラズモン共鳴方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｂ）第１のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｃ）ｐＨ値を維持している間、結合シグナルを記録し、そこから、解離ｐＨ値での該抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを計算する工程と
を含む、表面プラズモン共鳴方法。

【請求項2】

解離ｐＨ値での抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを決定するための表面プラズモン共鳴方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、該抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｂ）捕捉された該抗体をその抗原とインキュベートして、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）該固相に第１のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｄ）ｐＨ値を維持している間、結合シグナルを記録し、そこから、解離ｐＨ値での該抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを計算する工程と
を含む、表面プラズモン共鳴方法。

【請求項3】

解離ｐＨ値が、
ｉ）第１のｐＨ値において、前記抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｉｉ）該固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、該抗体の該固相からの解離をモニターする工程と
を含む方法で決定され、
該抗体がその抗原から解離するｐＨ値が、工程ｉｉ）において該抗体の該固相からの解離が検出できるｐＨ勾配のｐＨ値である、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

解離ｐＨ値が、
ｉ）第１のｐＨ値において、前記抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｉｉ）捕捉された該抗体をその抗原とインキュベートして、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｉｉｉ）該固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、該抗原の該抗体からの解離をモニターする工程と
を含む方法で決定され、
該抗原がその抗体から解離するｐＨ値が、工程ｉｉｉ）において該抗原の該抗体からの解離が検出できるｐＨ勾配のｐＨ値である、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

解離が、表面プラズモン共鳴によって測定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

抗原が高密度で固定化されている、請求項１、３および５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

第１のｐＨ値がｐＨ６．７以上ｐＨ１０．０以下であり、第２のｐＨ値がｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

第１のｐＨ値が約ｐＨ７．４であり、第２のｐＨ値がｐＨ５．５以上ｐＨ５．８以下である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

解離は、結合シグナルが５％以上変化したときである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

抗原が可溶性抗原である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

抗体が単一特異性抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

捕捉または固定が、抗体を、２．５から３０μＬ／ｍｉｎの流速で、０．６μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬの濃度で、４５から７２０秒間注入することにより行われる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、機能アッセイの分野に関する。本明細書において、抗体のｐＨ依存的な相互作用を測定するための、ＳＰＲに基づく新規な結合アッセイが報告される。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）は、リアルタイムのタンパク質間相互作用を測定するためのバイオセンサーに基づく技術である。ＳＰＲ技術は生物医薬品の研究開発において標準的な手段となっており［１～５］、一般に高分子の相互作用の結合定数を決定するために用いられる。分子の相互作用の会合および解離の速度論を明らかにできることによって、複合体形成機構に詳細な理解が与えられる［６］。この情報は、モノクローナル抗体およびその他の生物医薬品生成物の選択プロセスおよび最適化プロセスの不可欠な要素となってきている［７～１０］。さらに、ＳＰＲ技術によって、例えば標的に結合している抗体などの、結合活性（結合能力）の測定が可能になる。

【0003】

単一の抗体分子の抗原中和能力は、その親和性に依存する。親和性を上げることによって、より少ない量の抗体で抗原を中和することができる。抗体の親和性を高めるために様々な方法を使用することができる。さらに、共有結合的に抗体を抗原に結合することによって親和性を無限にできれば、単一の抗体分子が１つの抗原分子を中和できることになるであろう（二価の抗体であれば２つの抗原分子を中和できる）。しかし、１つの抗原に対して１つの抗体（２つの抗原に対して１つの二価の抗体）という化学量論的な中和であるために、抗原の量よりも少ない抗体の量で完全に抗原を中和することは不可能である。一定期間、中和抗体の中和効果を持続させるためには、同じ期間に体の中で産生される抗原の量よりも高い用量で抗体を投与しなければならない。抗体の薬物動態または親和性成熟技術を改善するだけでは、必要な抗体の用量を下げることには限界がある。

【0004】

したがって、抗原の量よりも少ない抗体の量で、目標期間、抗体の抗原中和効果を持続させるためには、単一の抗体が複数の抗原を中和しなければならないことになる。

【0005】

Ｓｈａｎｋ－Ｒｅｔｚｌａｆｆ，Ｍ．Ｌ．およびＳｌｉｇａｒ，Ｓ．Ｇ．は、反応速度（ｋｉｎｅｔｉｃ ｒａｔｅ）および高分子結合親和性を測定するためのワンステップ方法として、被分析物勾配表面プラズモン共鳴を開示した（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（２０００）４２１２～４２２０）。

【0006】

ＵＳ２００５／００１９９３３は、液体環境中の２種間の相互作用を特徴づける方法であって、少なくとも前記１種を含む液体が測定系を流れて通過し、前記測定系中で相互作用が生じる方法を開示した。この方法は、少なくとも前記種の１つ、または相互作用もしくは相互作用成分に影響を及ぼす少なくとも１つの別の種の濃度勾配を発生させることを含む。

【0007】

Ｓｃｈａｓｆｏｏｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｍ．らは表面プラズモン共鳴のハンドブック（２００８年１２月３１日（２００８－１２－３１）、３５４～３９４ページ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）において、ＳＰＲ技術の将来動向を開示した。

【0008】

ＵＳ２０１０／２５６３３８は、完全長抗体および単鎖Ｆａｂ断片を含む多重特異性抗体、特に二重特異性抗体、それらの産生方法、それらの抗体を含有する薬学的組成物、ならびにそれらの使用を開示した。

【0009】

ＷＯ２０１２／０２３０５３は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を担う新規の二重特異性モノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を担う新規の二重特異性モノクローナル抗体の産生方法を開示した。

【0010】

Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ，Ｔ．らは、モノクローナル抗体の機能的特徴づけのための分析的ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを開示した（ｍＡｂｓ５（２０１３）５７６～５８６。

【0011】

ＷＯ２０１５／１４０１２６は、ｉｎ ｖｉｖｏの半減期に影響を及ぼす抗体－Ｆｃ－ＦｃＲｎ複合体中の抗体－Ｆａｂ－ＦｃＲｎ相互作用の存在を、異なる塩濃度の存在下で、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムを正の線形ｐＨ勾配溶出で使用することによって明らかにする方法を開示した。

【0012】

ＷＯ２０１５／１７２８００は、新規の多重特異性分子およびそのような多重特異性分子に基づく新規の治療方法を開示した。

【0013】

Ｍｅｓｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｗ．らは、二重特異性分子の完全機能解析を可能にするＳＰＲに基づくアッセイを開示した（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３２（２０１６）１４１～１４７）。

【0014】

ＥＰ２２７５４４３は、抗原結合分子の薬物動態を改善するための方法および抗原結合分子の抗原結合回数を増加させるための方法、ならびに薬物動態が改善した抗原結合分子、抗原結合回数が増加した抗原結合分子、およびそのような分子の産生方法を開示した。

【発明の概要】

【0015】

本明細書において、抗体のｐＨ依存的な結合活性を測定するための、ＳＰＲに基づく新規なアッセイが報告される。

【0016】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原への結合がｐＨ依存的である（すなわち、抗体がｐＨ依存的な抗原結合性を有する）かどうかを明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターする工程と
を含み、工程ｂ）で抗体の固相からの解離が検出できれば抗体のその抗原への結合はｐＨ依存的である、方法である。

【0017】

ｐＨ依存的な解離を示す例示的なＳＰＲのセンサーグラムを図２に示す。

【0018】

本明細書で報告される一態様は、その抗原にｐＨ依存的に結合する（モノクローナル）抗体（すなわち、抗体がｐＨ依存的な抗原結合性を有する）を選択するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターする工程と
を含み、工程ｂ）で抗体の固相からの解離が検出できればその抗体を選択する、方法である。

【0019】

本明細書で報告される一態様は、その抗原にｐＨ依存的に結合する抗体が、その抗原から解離（ｐＨ依存的に解離）するｐＨ値を決定するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターする工程と
を含み、抗体がその抗原から解離するｐＨ値は、工程ｂ）で抗体の固相からの解離が検出できる、ｐＨ勾配のｐＨ値である、方法である。

【0020】

本明細書で報告される一態様は、抗体がその抗原にｐＨ依存的に結合（ｐＨ依存的に解離）するところでの、解離ｐＨ値（解離ｐＨ値とは、抗体のその抗原からの解離が検出できるｐＨ値のことである）における、抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを決定するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、該抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｃ）（結合）シグナルを記録し、そこから解離速度定数ｋ_ｄを計算し、それによって解離ｐＨ値での解離速度定数ｋ_ｄを決定する工程と
を含む方法である。

【0021】

解離ｐＨ値での解離を示す例示的なＳＰＲのセンサーグラムを図３に示す。

【0022】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合に、抗体のオリゴマー化が及ぼす影響を明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、モノマーの抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターし、それによって解離速度を計算する工程と、
ｃ）ダイマー、トライマー、テトラマー、および／またはオリゴマーの抗体で工程ａ）から工程ｂ）を繰り返す工程と
を含み、工程ｂ）で計算された解離速度が、モノマーの抗体と、ダイマー、トライマー、テトラマーおよび／またはオリゴマーの抗体とで１０％超異なっていれば、抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合はオリゴマー化によって影響される、方法である。

【0023】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合に、抗原のオリゴマー化が及ぼす影響を明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体のモノマーの抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する、すなわち、捕捉／固定化を、抗体のその抗原との相互作用によって行う工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターし、それによって解離速度を計算する工程と、
ｃ）固相上に固定化されている、ダイマー、トライマー、テトラマーおよび／またはオリゴマーの抗原で工程ａ）から工程ｂ）を繰り返す工程と、
を含み、工程ｂ）で計算された解離速度が、モノマーの抗原と、ダイマー、トライマー、テトラマーおよび／またはオリゴマーの抗原とで１０％超異なっていれば、抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合はオリゴマー化によって影響される、方法である。

【0024】

本明細書で報告される一態様は、同じ抗原に結合する抗体の混合物から、低ｐＨ結合性（モノクローナル）抗体を分離または単離するための方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の混合物を、抗体の混合物の抗原がコンジュゲートされた固相に添加する、すなわち、抗体をその抗原との相互作用によって捕捉／固定化する工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、場合により抗体の固相からの解離をモニターする工程と、
ｃ）低ｐＨ値で解離する抗体を集める工程と
を含み、それによって同じ抗原に結合する抗体の混合物から低ｐＨ結合性（モノクローナル）抗体を分離または単離する、方法である。

【0025】

一実施形態では、低ｐＨ値はｐＨ６．５以下である。一実施形態では、低ｐＨ値はｐＨ６．０以下である。一実施形態では、低ｐＨ値はｐＨ５．５以下である。

【0026】

下記に、先に概説された態様の実施形態が示される。実施形態のすべての可能な組み合わせもまた開示されることが理解される。

【0027】

一実施形態では、工程ｂ）における条件が、ｐＨ値を除いて一定に保たれる。

【0028】

一実施形態では、方法は表面プラズモン共鳴方法である。

【0029】

一実施形態では、解離は表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0030】

一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップである。

【0031】

一実施形態では、抗原は高密度で固定化されている。

【0032】

一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップであって、解離は表面プラズモン共鳴によって測定され、抗原は少なくとも５００ＲＵにて／で、表面プラズモン共鳴チップに固定化されている。好ましい一実施形態では、抗原は５００～４０００ＲＵにて／で、固定化されている。

【0033】

一実施形態では、抗体の固相への結合は強い結合（ａｖｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）である。

【0034】

一実施形態では、第１のｐＨ値はｐＨ７．４以上であって第２のｐＨ値はｐＨ５．５以下であるか、または第１のｐＨ値はｐＨ５．５以下であって第２のｐＨ値はｐＨ７．４以上である。

【0035】

一実施形態では、抗原がモノマーでなければ抗体はモノマーであり、抗体がモノマーでなければ抗原はモノマーである。

【0036】

一実施形態では、抗体はその抗原に対して二価である。

【0037】

一実施形態では、解離は、結合シグナルが５％以上変化したときである。一実施形態では、解離は、結合シグナルが１０％以上変化したときである。

【0038】

一実施形態では、抗原は可溶性抗原である。

【0039】

一実施形態では、抗体は単一特異性抗体である。

【0040】

一実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。

【0041】

一実施形態では、抗体は、抗原上の第１のエピトープに特異的に結合する第１の結合部位、および抗原上の第２のエピトープに特異的に結合する第２の結合部位を有する二重特異性抗体である。

【0042】

一実施形態では、捕捉は、抗体を、２．５から３０μＬ／ｍｉｎ、好ましい一実施形態では２．５から１０μＬ／ｍｉｎの流速で、０．６μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬの濃度で、４５から７２０秒間注入することによって行う。好ましい一実施形態では、捕捉は、抗体を、約５μＬ／ｍｉｎの流速で、０．６μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの濃度で、約６０秒間注入することによって行う。

【0043】

一実施形態では、ｐＨ勾配は１００から１０，０００秒間である。一実施形態では、ｐＨ勾配は１０００から５０００秒間である。一実施形態では、ｐＨ勾配は２０００～２３００秒間である。

【0044】

一実施形態では、第１の工程において、解離ｐＨ値は、本発明による方法を用いて決定される。

【0045】

一実施形態では、解離ｐＨ値は１００から１０，０００秒間維持される。一実施形態では、解離ｐＨ値は１５０から１，０００秒間維持される。

【0046】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原への結合がｐＨ依存的（ｐＨ依存的な抗原結合）であるかどうかを明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にその抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗原の抗体からの解離をモニターする工程と
を含み、工程ｃ）で抗原の抗体からの解離が検出できれば抗体のその抗原への結合はｐＨ依存的である、方法である。

【0047】

本明細書で報告される一態様は、その抗原にｐＨ依存的に結合する（ｐＨ依存的な抗原結合性を有する）（モノクローナル）抗体を選択するアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にその抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗原の抗体からの解離をモニターする工程と
を含み、工程ｃ）で抗原の抗体からの解離が検出できればその抗体を選択する、方法である。

【0048】

本明細書で報告される一態様は、その抗原にｐＨ依存的に結合する抗体がその抗原から解離（ｐＨ依存的に解離）するｐＨ値を決定するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にその抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗原の抗体からの解離をモニターする工程と、
を含み、抗原が抗体から解離するｐＨ値が、工程ｃ）において抗原の抗体からの解離が検出できるｐＨ勾配のｐＨ値である、方法である。

【0049】

本明細書で報告される一態様は、抗体がその抗原にｐＨ依存的に結合（ｐＨ依存的に解離）するところでの、解離ｐＨ値（解離ｐＨ値とは、抗体のその抗原からの解離が検出できるｐＨ値のことである）における、抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを決定するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にその抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｄ）結合シグナルを記録し、そこから解離速度定数ｋ_ｄを計算し、それによって解離ｐＨ値での解離速度定数ｋ_ｄを決定する工程と
を含む方法である。

【0050】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合に、抗体のオリゴマー化が及ぼす影響を明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、固相上にモノマーの抗体を捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にその抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗原の抗体からの解離をモニターし、それによって解離速度を計算する工程と、
ｄ）ダイマー、トライマー、テトラマー、および／またはオリゴマーの抗体で工程ａ）から工程ｃ）を繰り返す工程と
を含み、工程ｃ）において計算された解離速度が、モノマーの抗体と、ダイマー、トライマー、テトラマーおよび／またはオリゴマーの抗体とで１０％超異なっていれば、抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合はオリゴマー化によって影響される、方法である。

【0051】

本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合に、抗原のオリゴマー化が及ぼす影響を明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をそのモノマーの抗原とインキュベートして／捕捉された抗体にそのモノマーの抗原を添加して、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗原の抗体からの解離をモニターし、それによって解離速度を計算する工程と、
ｄ）ダイマー、トライマー、テトラマー、および／またはオリゴマーの抗原で工程ａ）から工程ｃ）を繰り返す工程と
を含み、工程ｃ）において計算された解離速度が、モノマーの抗原と、ダイマー、トライマー、テトラマーおよび／またはオリゴマーの抗原とで１０％超異なっていれば、抗体のその抗原へのｐＨ依存的な結合はオリゴマー化によって影響される、方法である。

【0052】

下記に、先に概説した態様の実施形態が示される。実施形態のすべての可能な組み合わせもまた開示されることが理解される。

【0053】

一実施形態では、工程ｃ）におけるｐＨ値を除くすべての条件が一定に保たれる。

【0054】

一実施形態では、解離は表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0055】

一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップである。

【0056】

一実施形態では、抗体は高密度で固定化されている。

【0057】

一実施形態では、固相は表面プラズモン共鳴チップであって、解離は表面プラズモン共鳴によって測定され、抗体は少なくとも５０ＲＵにて／で、表面プラズモン共鳴チップに固定化されている。好ましい一実施形態では、抗体は５０～４００ＲＵにて／で、固定化されている。

【0058】

一実施形態では、第１のｐＨ値はｐＨ７．４以上であって第２のｐＨ値はｐＨ５．５以下であるか、または第１のｐＨ値はｐＨ５．５以下であって第２のｐＨ値はｐＨ７．４以上である。

【0059】

一実施形態では、抗原がモノマーでなければ抗体はモノマーであり、抗体がモノマーでなければ抗原はモノマーである。

【0060】

一実施形態では、抗体はその抗原に対して二価である。

【0061】

一実施形態では、解離は、結合シグナルが５％以上変化したときである。一実施形態では、解離は、結合シグナルが１０％以上変化したときである。

【0062】

一実施形態では、抗原は可溶性抗原である。

【0063】

一実施形態では、抗体は単一特異性抗体である。

【0064】

一実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。

【0065】

一実施形態では、抗体は、抗原上の第１のエピトープに特異的に結合する第１の結合部位、および抗原上の第２のエピトープに特異的に結合する第２の結合部位を有する二重特異性抗体である。

【0066】

一実施形態では、捕捉は、抗体を、２．５から３０μＬ／ｍｉｎ、好ましい一実施形態では２．５から１０μＬ／ｍｉｎの流速で、０．６μｇ／ｍＬから３０μｇ／ｍＬの濃度で、４５から７２０秒間注入することによって行う。好ましい一実施形態では、捕捉は、抗体を、約５μＬ／ｍｉｎの流速で、０．６μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの濃度で、約６０秒間注入することによって行う。

【0067】

一実施形態では、ｐＨ勾配は１００から１０，０００秒間である。一実施形態では、ｐＨ勾配は１０００から５０００秒間である。一実施形態では、ｐＨ勾配は２０００～２３００秒間である。

【0068】

一実施形態では、第１の工程において、解離ｐＨ値は、本発明による方法を用いて決定される。

【0069】

一実施形態では、解離ｐＨ値は１００から１０，０００秒間維持される。一実施形態では、解離ｐＨ値は１５０から１，０００秒間維持される。

【0070】

[本発明1001]
解離ｐＨ値での抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ _ｄ を決定するための表面プラズモン共鳴方法であって、
ａ）第1のｐＨ値において、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｂ）第1のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｃ）ｐＨ値を維持している間、結合シグナルを記録し、そこから、解離ｐＨ値での該抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ _ｄ を計算する工程と
を含む、表面プラズモン共鳴方法。
[本発明1002]
解離ｐＨ値での抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ _ｄ を決定するための表面プラズモン共鳴方法であって、
ａ）第1のｐＨ値において、該抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｂ）捕捉された該抗体をその抗原とインキュベートして、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）該固相に第1のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｄ）ｐＨ値を維持している間、結合シグナルを記録し、そこから、解離ｐＨ値での該抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ _ｄ を計算する工程と
を含む、表面プラズモン共鳴方法。
[本発明1003]
解離ｐＨ値が、
ｉ）第1のｐＨ値において、前記抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｉｉ）該固相に第1のｐＨ値から第2のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、該抗体の該固相からの解離をモニターする工程と
を含む方法で決定され、
該抗体がその抗原から解離するｐＨ値が、工程ｉｉ）において該抗体の該固相からの解離が検出できるｐＨ勾配のｐＨ値である、
本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
解離ｐＨ値が、
ｉ）第1のｐＨ値において、前記抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、固相上に該抗体を固定化する工程と、
ｉｉ）捕捉された該抗体をその抗原とインキュベートして、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｉｉｉ）該固相に第1のｐＨ値から第2のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、該抗原の該抗体からの解離をモニターする工程と
を含む方法で決定され、
該抗原がその抗体から解離するｐＨ値が、工程ｉｉｉ）において該抗原の該抗体からの解離が検出できるｐＨ勾配のｐＨ値である、
本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
解離が、表面プラズモン共鳴によって測定される、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
抗原が高密度で固定化されている、本発明1001または1003から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
第1のｐＨ値がｐＨ6．7以上ｐＨ10．0以下であり、第2のｐＨ値がｐＨ4．0以上ｐＨ6．5以下である、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
第1のｐＨ値が約ｐＨ7．4であり、第2のｐＨ値がｐＨ5．5以上ｐＨ5．8以下である、本発明1001から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
解離は、結合シグナルが5％以上変化したときである、本発明1001から1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
抗原が可溶性抗原である、本発明1001から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
抗体が単一特異性抗体である、本発明1001から1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
捕捉は、抗体を、2．5から30μＬ／ｍｉｎの流速で、0．6μｇ／ｍＬから30μｇ／ｍＬの濃度で、45から720秒間注入することによる、本発明1001から1011のいずれかの方法。
下記の実施例および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の主旨を逸脱することなく、記載された手順を変更することが可能であることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1】１つの測定に対して１つの一定のバッファー条件のみが適用される、古典的なＳＰＲ－ＢＩＡｃｏｒｅの速度論的実験の模式図である。

【図2】ｐＨ７．４からｐＨ４．９までのｐＨ勾配を用いた本発明の方法による、固体表面からのｐＨ依存的な抗体の解離を表す例示的なセンサーグラムを示す図である。

【図3】解離ｐＨ値での解離速度定数を決定するための例示的なセンサーグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0072】

発明の詳細な説明
定義
「約」という用語は、その後に続く数値の＋／－２０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－１０％の範囲を意味する。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の＋／－５％の範囲を意味する。

【0073】

本明細書の「抗体」という用語は広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体）、および抗体断片を包含するが、それらに限定されない様々な抗体の構造を網羅する。

【0074】

抗体は、一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用可能な結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部）を含有する。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、定常領域（通常はカルボキシル末端部）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞、例えば食細胞、またはｉｉ）Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体としても知られる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞への抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域はまた、成分（Ｃ１ｑ）などの古典的な補体系の因子を包含する一部の因子への結合を媒介する。抗体重鎖の定常ドメインはＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む一方、軽鎖はただ１つの定常ドメイン、ＣＬを含み、ＣＬはカッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプでもよい。

【0075】

免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を交互に含む。

【0076】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類のことを指す。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれている。

【0077】

「への結合」という用語は、結合部位のその標的への結合、例えば、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬペア）を含む抗体の結合部位の、それぞれの抗原への結合を意味する。この結合は、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定することができる。

【0078】

例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの可能な一実施形態では、抗原を表面に結合させて、抗体の結合部位の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する。結合の親和性は、ｋａ（結合定数：複合体形成のための結合の速度定数）、ｋｄ（解離定数；複合体の解離の速度定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）という用語によって定義される。あるいは、共鳴シグナルの高さおよび解離の挙動に関して、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを基準の応答シグナルと直接比較することができる。

【0079】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、可能性のある変異体抗体、例えば天然に存在する変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、通常微量に存在する変異体抗体を除いて、同一でありかつ／または同じエピトープに結合する、という抗体の集団から得られた抗体のことを指す。種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的には包含するポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体としての性質を示すものであって、いずれかの特定の方法で抗体を産生することが必要であると解釈するべきではない。例えば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法、組み換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全体または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を包含するがそれらに限定されない様々な技術によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法が本明細書において記載される。

【0080】

本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの各領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域および／または抗原と接触する残基（「抗原接触部」）を含有する抗体可変ドメインの各領域のことを指す。通常は、抗体は６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内の３つおよびＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内の３つを含む。本明細書における例示的なＨＶＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触部（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））；および
（ｄ）ＨＶＲのアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）および９４～１０２（Ｈ３）を包含する（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ、が挙げられる。

【0081】

別途指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中ではＫａｂａｔらに従って番号付けされる。

【0082】

本出願において使用される「価」という用語は、（抗体）分子中に結合部位が特定数存在することを意味する。そのため、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、２つの結合部位、４つの結合部位および６つの結合部位が、（抗体）分子中にそれぞれ存在することを意味する。本明細書において報告される二重特異性抗体は、好ましい一実施形態では、「二価」である。

【0083】

ある特定の実施形態では、抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は第１の抗原に対してであり、他方は異なる第２の抗原に対してである。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体は、抗原を発現する細胞に、細胞傷害性剤を局在させるために使用することもできる。多重特異性抗体は、完全長の抗体または抗体断片として調製することができる。

【0084】

多重特異性抗体を作製するための手法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７～５４０、ＷＯ９３／０８８２９、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５～３６５９を参照されたい）および「ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」工学（例えば、ＵＳ５，７３１，１６８を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロダイマー分子を作製するための工学的静電的ステアリング効果（ＷＯ２００９／０８９００４）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、ＵＳ４，６７６，９８０およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１９８５）８１～８３を参照されたい）；二重特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７～１５５３を参照されたい；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１９９３）６４４４～６４４８を参照されたい）；および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーの使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）５３６８～５３７４）；ならびに、例えばＴｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０～６９）に記載される三重特異性抗体の調製によって作製してもよい。

【0085】

抗体または断片は、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、またはＷＯ２０１０／１４５７９３に記載されるような多重特異性抗体でもよい。

【0086】

抗体またはその断片はまた、ＷＯ２０１２／１６３５２０に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。

【0087】

本明細書において報告される方法
抗体などの新規の生物治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）がますます複雑になってきているため、機能的特徴づけに新たな課題が生じている。それぞれの抗原に対してｐＨ依存的な結合を示す抗体を特徴づけしなければならない場合は特にそうである。

【0088】

ｐＨ依存的な抗原結合性を有する例示的な抗体およびその生成が、例えば、ＥＰ２２７５４４３において報告されている。ｐＨ依存的な抗原結合は、原理的には任意の抗体に導入することができる。抗体にｐＨ依存的な抗原結合を導入することによって、単一抗原結合抗体を、複数の抗原分子に結合可能な、繰り返し抗原結合抗体に変換することができる。抗体が複数の抗原分子に結合する場合、そのような抗体は、普通の抗原結合分子よりも優れたｉｎ ｖｉｖｏ効果を発揮する。

【0089】

ｐＨ５．８での抗体の抗原結合活性を、ｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性と比べて低下させるための方法（ｐＨ依存的な結合能を付与するための方法）は特に限定されることはなく、いずれの方法であってもよい。このような方法としては、例えば、抗体中の他のアミノ酸をヒスチジンで置換するか、または抗体にヒスチジンを挿入することによってｐＨ５．８での抗原結合活性をｐＨ７．４での抗原結合活性と比べて低下させる方法が挙げられる。抗体中のアミノ酸をヒスチジンで置換することによって抗体にｐＨ依存的な抗原結合活性を付与することができることは既に知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、３０９（１）、８５８８（１９９２））。そのようなヒスチジン変異（置換）部位または挿入部位は、変異または挿入前と比べて、ｐＨ５．８での抗原結合活性がｐＨ７．４での抗原結合活性より低下する（Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）の値が大きくなる）限り、特には限定されず、いずれの部位も許容される。抗体の場合、そのような部位としては、例えば、抗体の可変領域内の部位が挙げられる。ヒスチジン変異または挿入部位の適切な数は、当業者が適宜決定することができる。

【0090】

ヒスチジンは単一の部位または２つ以上の部位に、置換または挿入してもよい。それに加えて非ヒスチジン変異（ヒスチジン以外のアミノ酸による変異）を導入することも可能である。さらに、ヒスチジンの挿入と同時にヒスチジン変異を導入してもよい。当業者に知られているアラニンスキャニングのアラニンの代わりにヒスチジンを使用するヒスチジンスキャニングのような方法を使用して、無作為にヒスチジンで置換またはヒスチジンを挿入することが可能である。あるいは、Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）が変異前と比べて増加する抗原結合分子を、無作為なヒスチジン変異または挿入によって抗原結合分子のライブラリーから選択することができる。

【0091】

抗体のアミノ酸をヒスチジンで置換するまたは抗体のアミノ酸の間にヒスチジンを挿入する場合、ヒスチジン置換または挿入後のｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性が、ヒスチジン置換または挿入前のｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性と比較可能であることが好ましいが、必要ではない。「ヒスチジン置換または挿入後のｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性が、ヒスチジン置換または挿入前のｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性と比較可能である」とは、ヒスチジン置換または挿入後であっても、抗体が、ヒスチジン置換または挿入前の抗原結合活性の１０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上を保持していることを意味する。ヒスチジン置換または挿入が原因で抗体の抗原結合活性が低下してしまった場合には、抗原結合活性がヒスチジン置換または挿入前の抗原結合活性と比較可能になるように、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入を抗体に導入することによって抗原結合活性を調節することができる。

【0092】

ｐＨ５．８での抗体の抗原結合活性を、ｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性と比べて低下させるための別の方法としては、抗体中のアミノ酸を非天然アミノ酸で置換するまたは抗体のアミノ酸に非天然アミノ酸を挿入する方法が挙げられる。ｐＫａは、非天然アミノ酸を使用して人為的に制御できることが知られている（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編 ２００５、４４、３４； Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００４年９月１０日；３３（７）：４２２～３０； Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．１９９９；１６（３～４）：３４５～７９）。したがって、非天然アミノ酸を上記のヒスチジンの代わりに使用することができる。そのような非天然アミノ酸置換および／また挿入は、上記のヒスチジン置換および／または挿入と同時に導入することができる。本発明においては、任意の非天然アミノ酸を使用してもよい。当業者に知られている非天然アミノ酸を使用することが可能である。

【0093】

したがって、本発明の目的は、抗原に複数回結合する抗体のｐＨ依存的な抗原結合を測定するための方法を提供することである。

【0094】

標準的なＳＰＲに基づくアッセイ構成が、当技術分野において記述されてきた。これらによって、抗体のその抗原に対する結合活性を一組の条件で評価することが可能になる。

【0095】

本発明においては、酸性ｐＨと中性ｐＨとの間で抗原結合活性に絶対的な差があることは、酸性ｐＨでの抗原結合活性が中性ｐＨでの抗原結合活性と異なる限り必須ではない。

【0096】

しかし、一実施形態では、ｐＨ５．８での抗原に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）とｐＨ７．４での抗原に対する解離定数との比である、Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）の値は、好ましくは２以上、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは４０以上である。分子を当業者の技術によって産生することができる限り、Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）の値の上限は特に定められず、例えば４００、１，０００、または１０，０００などのいずれの値であってもよい。

【0097】

しかし、一実施形態では、ｐＨ７．４での抗原に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）とｐＨ５．８での抗原に対する解離定数との比である、Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）の値は、好ましくは２以上、より好ましくは１０以上、さらにより好ましくは４０以上である。分子を当業者の技術によって産生することができる限り、Ｋ_Ｄ（ｐＨ７．４）／Ｋ_Ｄ（ｐＨ５．８）の値の上限は特に定められず、例えば４００、１，０００、または１０，０００などのいずれの値であってもよい。

【0098】

抗原が可溶性抗原の場合、抗原結合活性は、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって提示することができる。あるいは、抗原が膜抗原の場合、抗原結合活性は、見かけの解離定数によって提示することができる。解離定数（Ｋ_Ｄ）および見かけの解離定数（見かけのＫ_Ｄ）は、当業者に知られている方法によって、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、スキャッチャードプロット、またはＦＡＣＳを使用して決定することができる。

【0099】

一実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）の代わりに、解離速度定数（ｋ_ｄ）を結合活性の差の指標として使用する場合、ｐＨ５．８での抗原に対する解離速度定数（ｋ_ｄ）とｐＨ７．４での抗原に対する解離速度定数との比である、ｋ_ｄ（ｐＨ５．８）／ｋ_ｄ（ｐＨ７．４）の値は、好ましくは２以上、より好ましくは５以上、さらにより好ましくは１０以上、さらにより好ましくは３０以上である。分子を当業者に共通する技術によって産生することができる限り、ｋ_ｄ（ｐＨ５．８）／ｋ_ｄ（ｐＨ７．４）の値の上限は特に定められず、例えば５０、１００、または２００などのいずれの値であってもよい。

【0100】

一実施形態では、解離定数（Ｋ_Ｄ）の代わりに、解離速度定数（ｋ_ｄ）を結合活性の差の指標として使用する場合、ｐＨ７．４での抗原に対する解離速度定数（ｋ_ｄ）とｐＨ５．８での抗原に対する解離速度定数との比である、ｋ_ｄ（ｐＨ７．４）／ｋ_ｄ（ｐＨ５．８）の値は、好ましくは２以上、より好ましくは５以上、さらにより好ましくは１０以上、さらにより好ましくは３０以上である。分子を当業者に共通する技術によって産生することができる限り、ｋ_ｄ（ｐＨ７．４）／ｋ_ｄ（ｐＨ５．８）の値の上限は特に定められず、例えば５０、１００、または２００などのいずれの値であってもよい。

【0101】

抗原が可溶性抗原の場合、抗原結合活性は、解離速度定数（ｋ_ｄ）によって提示することができる。あるいは、抗原が膜抗原の場合、抗原結合活性は、見かけの解離速度定数（見かけのｋ_ｄ）によって提示することができる。解離速度定数（ｋ_ｄ）および見かけの解離速度定数（見かけのｋ_ｄ）は、解離ｐＨ値において、本発明による方法によって直接決定することができる。

【0102】

本明細書において、酸性ｐＨでの抗原結合活性を、中性ｐＨでの抗原結合活性と比べて低下させるとは、ｐＨ４．０からｐＨ６．５での抗体の抗原結合能を、ｐＨ６．７からｐＨ１０．０での抗体の抗原結合能と比べて低下させること、好ましくはｐＨ５．５からｐＨ６．５での抗体の抗原結合活性を、ｐＨ７．０からｐＨ８．０での抗体の抗原結合活性と比べて低下させること、より好ましくはｐＨ５．８での抗体の抗原結合活性を、ｐＨ７．４での抗体の抗原結合活性と比べて低下させることを意味する。したがって、本発明においては、酸性ｐＨは典型的にはｐＨ４．０からｐＨ６．５、好ましくはｐＨ５．５からｐＨ６．５、より好ましくはｐＨ５．８である。あるいは、本発明においては、中性ｐＨは典型的にはｐＨ６．７からｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ７．０からｐＨ８．０、より好ましくはｐＨ７．４である。

【0103】

したがって、一実施形態では、第１のｐＨ値はｐＨ６．７以上ｐＨ１０．０以下であり、第２のｐＨ値はｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下である。一実施形態では、第１のｐＨ値はｐＨ７．０以上ｐＨ８．０以下であり、第２のｐＨ値はｐＨ５．５以上ｐＨ６．５以下である。一実施形態では、第１のｐＨ値はｐＨ７．２以上ｐＨ７．６以下であり、第２のｐＨ値はｐＨ５．５以上ｐＨ５．８以下である。好ましい一実施形態では、第１のｐＨ値は約ｐＨ７．４であり、第２のｐＨ値はｐＨ５．５以上ｐＨ５．８以下である。

【0104】

本発明は、表面プラズモン共鳴実験はｐＨ勾配を用いて実施することができるという知見に、少なくとも部分的には基づく。それによって、一方では抗体のその抗原からの解離が起こる正確なｐＨ値、すなわち解離ｐＨ値を決定することにより、他方では該解離ｐＨ値における解離速度定数を決定することにより、抗体のｐＨ依存的な抗原結合を特徴づけることが可能である。

【0105】

本発明による方法は、ｐＨ勾配を適用している間、抗体の抗原への結合シグナルを記録またはモニターすることを必須の工程として含む。結合シグナルが低下し始めるｐＨ勾配の一点では、結合部位のアミノ酸残基のプロトン化または脱プロトン化によって抗体とその抗原との間の相互作用が弱められている。ｐＨ勾配の前記一点が、抗体とその抗原との間のｐＨ依存的な相互作用に対して解離ｐＨ値を定める。

【0106】

例えば、ｐＨ依存的な抗原結合性を有する抗体の、複数の抗原分子に結合可能な繰り返し抗原結合抗体としての適性を評価するために、本発明による方法を用いて、ｐＨ依存的な抗原結合を測定することができる。リソソームのｐＨ、すなわちｐＨ６．０未満、好ましくは約ｐＨ５．０での抗原への結合が減少する（または無くなりさえする）一方で、生理的ｐＨ、すなわちｐＨ７．０超、好ましくは約ｐＨ７．４での結合は維持する（または最大でありさえする）のであれば、前記抗体は所期の目的に適するものである。

【0107】

したがって、本発明による方法は、
－ 生理的ｐＨからリソソームのｐＨまでのｐＨ勾配に抗体－抗原複合体を曝露し、
ｉ）少しでもあるかどうか（ｉｆ ａｔ ａｌｌ）、
または
ｉｉ）抗体－抗原複合体が解離する、正確なｐＨ値
を決定する、主要な工程を含む。

【0108】

上記は、中性から酸性のｐＨ値までのｐＨ勾配に対しては概説されているものの、本発明による方法は、任意のｐＨ勾配、すなわち中性から酸性、または中性からアルカリ性、またはアルカリ性から酸性、または酸性からアルカリ性までの任意のｐＨ勾配を用いて使用することができる。

【0109】

したがって、本明細書で報告される一態様は、（モノクローナル）抗体のその抗原への結合がｐＨ依存的（ｐＨ依存的な抗原結合）であるかどうかを明らかにするためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体を、該抗体の抗原がコンジュゲートされた固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）固相に第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、抗体の固相からの解離をモニターする工程と
を含み、工程ｂ）で抗体の固相からの解離が検出できれば、抗体のその抗原への結合はｐＨ依存的である方法である。

【0110】

本明細書で報告される一態様は、抗体がその抗原にｐＨ依存的に結合（ｐＨ依存的に解離）するところでの、解離ｐＨ値（解離ｐＨ値とは、抗体のその抗原からの解離が検出できるｐＨ値のことである）における、抗体のその抗原からの解離速度定数ｋ_ｄを決定するためのアッセイまたは方法であって、
ａ）第１のｐＨ値において、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を使用して、抗体を固相上に捕捉／固定化する工程と、
ｂ）捕捉された抗体をその抗原とインキュベートして、安定した／一定の結合シグナルが得られるまで、捕捉された抗体－抗原複合体を形成する工程と、
ｃ）固相に第１のｐＨ値から解離ｐＨ値までのｐＨ勾配を適用し、その後、該解離ｐＨ値でｐＨ値を維持する工程と、
ｄ）結合シグナルを記録し、そこから解離速度定数ｋ_ｄを計算し、それによって解離ｐＨ値での解離速度定数ｋ_ｄを決定する工程と
を含む、方法である。

【0111】

ｐＨ値を解離ｐＨ値より高いｐＨ値から解離ｐＨ値に下げることによって、エンドサイトーシスの間およびリソソーム酸性化の間のプロセスがシミュレーションできるため、この手法は有利である。さらに、解離速度定数を決定するための開始点を厳密に設定できることによって、解離ｐＨ値での解離速度定数をより正確に決定することが可能になる。

【0112】

文献リスト

【実施例】

【0113】

機器と試薬
すべてのＳＰＲ実験はセンサーチップＸａｎｔｅｃ ＳＣＲ ＣＭＤ５００Ｌを備えたＸａｎｔｅｃ ＳＲ７５００ＤＣ上で実施した。

【0114】

実施例１
チップの調製
抗原を固定化するために、ブランク対照としてのＦｃ１および特異的な標的が結合する相互作用表面としてのＦｃ２の２つのフローセル（Ｆｃ）を準備した。フローセル２上に抗原を固定化するために、ＥＤＣ／ＮＨＳによって表面を活性化し、ダイマーの抗原コンストラクトのアミンカップリングを行う準備をした。抗原のダイマーは、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸バッファー中に３０μｇ／ｍｌの濃度で調製した。この溶液を、２０μｌ／ｍｉｎの流速で１０分間Ｆｃ２上に注入した。

【0115】

ｐＨ勾配の操作
勾配を確立するために、２種類のＰＢＳ－Ｐ＋バッファーを調製した。バッファーＡは７．４のｐＨに調整した。バッファーＢはｐＨ４．９に調整した。

【0116】

１００μｌ／ｍｉｎの流速で、抗体試料を、バッファーＡ中１００ｎＭの濃度で９０秒間注入した。２１０秒の平衡化後に、１００％のバッファーＡから１００％のバッファーＢまでの勾配を２４００秒以内で開始した。操作の最後に、表面を１．５のｐＨの１０ｍＭグリシンバッファーによって再生した。

【0117】

ｐＨ依存的な結合体（ｂｉｎｄｅｒｓ）の解離が開始するｐＨ値は、２５：７５のバッファーＡとバッファーＢの比率に基づいて決定した。この混合物の測定により、５．８５から５．９のｐＨ値が結果として得られた。

【0118】

実施例２
チップの調製
抗ヒトＦｃ捕捉抗体（＜ｈＦｃ＞ ＧＥ ＢＲ－１００８－３９）を固定化するために、ブランク対照としてのＦｃ１および特異的な標的が結合する相互作用表面としてのＦｃ２の２つのフローセルを準備した。フローセル２上に捕捉抗体を固定化するために、ＥＤＣ／ＮＨＳによって表面を活性化し、アミンカップリングを行う準備をした。＜ｈＦｃ＞は、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸バッファー中に３０μｇ／ｍｌの濃度で調製した。この溶液を、２０μｌ／ｍｉｎの流速で１０分間Ｆｃ２上に注入した。

【0119】

抗体の後のｐＨ勾配の操作
勾配を確立するために、２種類のＰＢＳ－Ｐ＋バッファーを調製した。バッファーＡは７．４のｐＨに調整した。バッファーＢはｐＨ４．９に調整した。１００μｌ／ｍｉｎの流速で、当該抗体を、バッファーＡ中１００ｎＭの濃度で９０秒間注入した。第２の工程では、種々の抗原調製物（ダイマー、野生型およびモノマー）を、バッファーＡ中１００ｎＭの濃度で９０秒間注入した。２１０秒の平衡化後に、１００％のバッファーＡから１００％のバッファーＢまでの勾配を２４００秒以内で開始した。操作の最後に、表面を３ＭのＭｇＣｌ_２溶液によって再生した。

【図1】

【図2】

【図3】