特許 7242364 生体対象物の培養方法及び培養ユニット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-10

(45)【発行日】2023-03-20

(54)【発明の名称】生体対象物の培養方法及び培養ユニット

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230313BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230313BHJP

   C12M 1/02 20060101ALI20230313BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20230313BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20230313BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12M1/34 D

C12M1/02 A

C12M3/00 Z

C12N5/02

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2019053090

(22)【出願日】2019-03-20

(65)【公開番号】P2020150865

(43)【公開日】2020-09-24

【審査請求日】2021-12-07

(73)【特許権者】

【識別番号】000010076

【氏名又は名称】ヤマハ発動機株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100115381

【弁理士】

【氏名又は名称】小谷 昌崇

(74)【代理人】

【識別番号】100127797

【弁理士】

【氏名又は名称】平田 晴洋

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 三郎

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０２０９８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００６－０７５０４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０２２０６７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体対象物及びその培養液を収容可能であって、底面と側壁面とを備えた凹部からなり、前記底面には開口が備えられた培養領域に前記生体対象物を配置し、
前記開口から培養液を前記凹部内に供給することによって、前記開口から前記凹部内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させ、
前記生体対象物を、前記液流によって前記凹部内において浮上および回転させつつ、１日～数週間程度の所定期間保持し、
前記生体対象物を前記所定期間保持する間に、前記生体対象物の浮上状態および回転状態を監視し、
前記生体対象物に前記浮上状態および前記回転状態に所定の変化が生じたときに、前記液流の発生条件を変更する、生体対象物の培養方法。

【請求項2】

生体対象物及び培養液を収容可能なウェルと、前記ウェルの底部に設けられた開口とを備えたチャンバーと、
前記開口を通して前記ウェルに培養液を送り、前記開口から前記ウェル内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させるポンプ装置と、
前記ポンプ装置の動作を制御するポンプ制御部と、を備え、
前記ポンプ制御部は、前記ウェルの底面に接面している前記生体対象物を前記培養液中で流動させることが可能な液流を、前記ポンプ装置に発生させる、生体対象物の培養ユニットにおいて、
前記チャンバーとして、第１の生体対象物を前記ウェルで収容する第１チャンバーと、前記第１の生体対象物とは異なる複数の第２の生体対象物を前記ウェルで収容する第２チャンバーと、を有し、
前記第１チャンバーと前記複数の第２チャンバーとを接続する接続流路であって、前記第１チャンバーを循環中心として培養液を前記複数の第２チャンバーに循環させる循環系をさらに備え、
前記ポンプ装置は、前記循環系を通して、前記第１チャンバーのウェル及び前記第２チャンバーのウェルに培養液を循環させることで、前記第１の生体対象物及び前記第２の生体対象物を各々のウェル内で流動させる、生体対象物の培養ユニット。

【請求項3】

生体対象物及び培養液を収容可能なウェルと、前記ウェルの底部に設けられた開口とを備えたチャンバーと、
前記開口を通して前記ウェルに培養液を送り、前記開口から前記ウェル内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させるポンプ装置と、
前記ポンプ装置の動作を制御するポンプ制御部と、を備え、
前記ポンプ制御部は、前記ウェルの底面に接面している前記生体対象物を前記培養液中で流動させることが可能な液流を、前記ポンプ装置に発生させる、生体対象物の培養ユニットにおいて、
前記チャンバーは、第１ウェルを有する第１プレートと、前記第１プレートの上方に配置され第２ウェルを有する第２プレートとを備える、生体対象物の培養ユニット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば細胞又は細胞塊のような生体対象物を所要の期間培養する方法、及びこの方法に適用する培養ユニットに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞又は細胞塊等の生体対象物を長期培養するに際しては、一般に、培地及び生体対象物を収容したシャーレ等の容器を所定の環境下に配置する手法が採られる。この他、特許文献１には、細胞が収容された培養室に培地の導入・排出通路を設け、培地を入れ替え可能とした細胞培養デバイスが開示されている。また、特許文献２には、培養室に配置された繊維集合体に細胞を付着させ、培地を当該培養室に流入出させながら長期培養する細胞培養モジュールが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１１－２４４７１３号公報

【文献】国際公開第２０１４／０３４１４６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

生体対象物の長期培養には、当該生体対象物に酸素や栄養素を満遍なく供給すること、並びに、成長して大きくなろうとする生体対象物に物理的な障害を与えないことが要請される。前者の要請は、特許文献１、２に示された、培養室への培地の流入出により達成可能である。一方、後者の要請については、特許文献１、２の手法では不十分である。特許文献１のデバイスの如く細胞を足場材に接面させたり、特許文献２のモジュールの如く繊維集合体に細胞を付着させたりすると、その接面・付着箇所における細胞の三次元的な成長が阻害されるという問題がある。

【0005】

本発明の目的は、生体対象物の三次元的な成長を可及的に阻害することのない生体対象物の培養方法及び培養ユニットを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一局面に係る生体対象物の培養方法は、生体対象物及びその培養液を収容可能であって、底面と側壁面とを備えた凹部からなり、前記底面には開口が備えられた培養領域に前記生体対象物を配置し、前記開口から培養液を前記凹部内に供給することによって、前記開口から前記凹部内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させ、前記生体対象物を、前記液流によって前記凹部内において浮上および回転させつつ、１日～数週間程度の所定期間保持し、前記生体対象物を前記所定期間保持する間に、前記生体対象物の浮上状態および回転状態を監視し、前記生体対象物に前記浮上状態および前記回転状態に所定の変化が生じたときに、前記液流の発生条件を変更することを特徴とする。

【0007】

この培養方法によれば、培養領域に培養液の液流を発生させることで、当該生体対象物に酸素や栄養素を供給することが可能となる。また、前記液流によって生体対象物を培養領域内において流動させることで、当該生体対象物の一部が前記培養領域を区画する壁面等に同じ姿勢で接面し続けないようにすることができる。つまり、生体対象物を前記培養液中で遊動させた状態で、長期培養することが可能となる。これにより、前記壁面等に対する接面の影響を抑制して、生体対象物に自在な三次元的成長を行わせることができる。

【0008】

上記の生体対象物の培養方法において、前記培養領域は、底面と側壁面とを備えた凹部からなり、前記底面若しくは側壁面には開口が備えられ、前記開口から培養液を前記凹部内に供給することによって、前記液流を発生させることが望ましい。

【0009】

この培養方法によれば、所定単位の生体対象物を凹部に収容し、他の生体対象物と区別した状態で長期培養することができる。そして、前記凹部に備えられた開口から供給される培養液によって、生体対象物を遊動させると共に酸素や栄養素を供給することができるので、良好な状態で生体対象物を長期培養することができる。

【0010】

上記の生体対象物の培養方法において、前記培養領域は、底面と側壁面とを備えた凹部からなり、前記液流は、底面に接面している前記生体対象物を前記培養液中で浮上させることが可能な液流であることが望ましい。

【0011】

この培養方法によれば、液流によって生体対象物を培養液中で浮上させた状態で、当該生体対象物を長期培養することができる。これにより、凹部の底面や側壁面と生体対象物との接触が抑制され、より一層、生体対象物の三次元的成長を促進することができる。

【0012】

上記の生体対象物の培養方法において、前記生体対象物を流動状態で所定期間保持する間に、前記生体対象物の状態変化を監視し、前記生体対象物に所定の状態変化が生じたときに、前記液流の発生条件を変更することが望ましい。

【0013】

この培養方法によれば、生体対象物の成長に応じて、適正な液流を当該生体対象物に与えることができる。例えば、成長によって重量の増した生体対象物に対して強度の大きい液流を与えることで、前記生体対象物の流動状態を維持させることができる。

【0014】

本発明の他の局面に係る生体対象物の培養ユニットは、生体対象物及び培養液を収容可能なウェルと、前記ウェルの底部に設けられた開口とを備えたチャンバーと、前記開口を通して前記ウェルに培養液を送り、前記開口から前記ウェル内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させるポンプ装置と、前記ポンプ装置の動作を制御するポンプ制御部と、を備え、前記ポンプ制御部は、前記ウェルの底面に接面している前記生体対象物を前記培養液中で流動させることが可能な液流を、前記ポンプ装置に発生させる、生体対象物の培養ユニットにおいて、前記チャンバーとして、第１の生体対象物を前記ウェルで収容する第１チャンバーと、前記第１の生体対象物とは異なる複数の第２の生体対象物を前記ウェルで収容する第２チャンバーと、を有し、前記第１チャンバーと前記複数の第２チャンバーとを接続する接続流路であって、前記第１チャンバーを循環中心として培養液を前記複数の第２チャンバーに循環させる循環系をさらに備え、前記ポンプ装置は、前記循環系を通して、前記第１チャンバーのウェル及び前記第２チャンバーのウェルに培養液を循環させることで、前記第１の生体対象物及び前記第２の生体対象物を各々のウェル内で流動させることを特徴とする。

【0015】

この培養ユニットによれば、ウェル内に開口を通して培養液を供給することで、ウェルに収容された生体対象物に酸素や栄養素を供給することが可能となる。また、前記液流によって生体対象物をウェル内において流動させることで、当該生体対象物の一部がウェルの底面に同じ姿勢で接面し続けないようにすることができる。つまり、生体対象物をウェル内の前記培養液中で遊動させた状態で、長期培養することが可能となる。これにより、前記底面に対する接面の影響を抑制して、生体対象物に自在な三次元的成長を行わせることができる。

【0016】

上記の生体対象物の培養ユニットにおいて、前記チャンバーとして、第１の生体対象物を前記ウェルで収容する第１チャンバーと、前記第１の生体対象物とは異なる第２の生体対象物を前記ウェルで収容する第２チャンバーと、を有し、前記第１チャンバーと前記第２チャンバーとを並列接続又は直列接続する接続流路をさらに備え、前記ポンプ装置は、前記接続流路を通して、前記第１チャンバーのウェル及び前記第２チャンバーのウェルに培養液を送ることで、前記第１の生体対象物及び前記第２の生体対象物を各々のウェル内で流動させることが望ましい。

【0017】

この培養ユニットによれば、複数の生体対象物に対して同一の培養液を供給しつつ、これら生体対象物を長期培養することが可能となる。

【0018】

本発明のさらに他の局面に係る生体対象物の培養ユニットは、生体対象物及び培養液を収容可能なウェルと、前記ウェルの底部に設けられた開口とを備えたチャンバーと、前記開口を通して前記ウェルに培養液を送り、前記開口から前記ウェル内に吹き上がる前記培養液の液流を発生させるポンプ装置と、前記ポンプ装置の動作を制御するポンプ制御部と、を備え、前記ポンプ制御部は、前記ウェルの底面に接面している前記生体対象物を前記培養液中で流動させることが可能な液流を、前記ポンプ装置に発生させる、生体対象物の培養ユニットにおいて、前記チャンバーは、第１ウェルを有する第１プレートと、前記第１プレートの上方に配置され第２ウェルを有する第２プレートとを備えることを特徴とする。

【0019】

この培養ユニットによれば、ウェルを有するプレートを積重してチャンバーに配置することができる。従って、一度に多くの生体対象物を長期培養することが可能となる。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、生体対象物の三次元的な成長を可及的に阻害することのない生体対象物の培養方法及び培養ユニットを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、本発明の第１実施形態に係る生体対象物の培養方法を実現するための細胞培養ユニットの構成を示すブロック図である。

【図2】図２（Ａ）は、細部の培養領域となるウェルの断面図、図２（Ｂ）～（Ｅ）は、ウェル内における細胞の浮上状態と観察される画像との関係を示す図である。

【図3】図３（Ａ）及び（Ｂ）は、液流の有無による長期培養の結果を示すグラフであって、図３（Ａ）は細胞の投影面積を、図３（Ｂ）は細胞のＡＴＰ生成状況を各々示す。

【図4】図４（Ａ）は、液流を伴って長期培養した細胞を示す図、図４（Ｂ）は、液流を発生させずに長期培養した細胞を示す図である。

【図5】図５は、第１実施形態の細胞培養ユニットによる細胞の長期培養開始時における動作の一例を示すフローチャートである。

【図6】図６（Ａ）、（Ｂ）は、細胞の浮上と、カメラのＺ高さとの関係を説明するための図である。

【図7】図７は、第１実施形態の細胞培養ユニットによる細胞の長期培養中における動作の一例を示すフローチャートである。

【図8】図８は、本発明の第２実施形態に係る生体対象物の培養方法を実現するための細胞培養ユニットの構成を示すブロック図である。

【図9】図９は、第２実施形態の細胞培養ユニットによる細胞の長期培養開始時における動作の一例を示すフローチャートである。

【図10】図１０は、第２実施形態の細胞培養ユニットによる細胞の長期培養中における動作の一例を示すフローチャートである。

【図11】図１１は、第２実施形態の細胞培養ユニットによる細胞の長期培養中における動作の一例を示すフローチャートである。

【図12】図１２は、変形例に係るチャンバーを示す断面図である。

【図13】図１３は、変形例に係るチャンバーを示す断面図である。

【図14】図１４（Ａ）～（Ｄ）は、ウェルの変形例を示す図である。

【図15】図１５（Ａ）～（Ｃ）は、ウェルの貫通孔の変形例を示す図である。

【図16】図１６（Ａ）、（Ｂ）は、ウェルへの液流の供給形態の変形例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。本発明に係る生体対象物の培養方法及び培養ユニットでは、多岐に亘る生体対象物を対象とすることができる。本発明が適用可能な生体対象物としては、代表的には生体由来の細胞を例示することができる。ここでの生体由来の細胞は、例えば血球系細胞やシングル化細胞などのシングルセル（細胞）、ＨｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅやＣＴＯＳなどの組織小片、スフェロイドやオルガノイドなどの細胞凝集塊、ゼブラフィッシュ、線虫、受精卵などの個体、２Ｄ又は３Ｄのコロニー等である。この他、生体対象物として、組織、微生物、小サイズの種等を例示することができる。以下に説明する実施形態では、生体対象物が細胞又は細胞が数個～数十万個凝集してなる細胞凝集塊（以下、これらを総称して単に「細胞Ｃ」という）である例を示す。

【0023】

［第１実施形態の細胞培養ユニットの全体構成］
図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養ユニットＵ（生体対象物の培養ユニット）の構成を示すブロック図である。細胞培養ユニットＵは、細胞Ｃ及び培地Ｌ（培養液）を収容可能な複数のウェル２（凹部）を有するチャンバーＣＨと、ウェル２に収容された細胞Ｃを撮像するためのカメラユニット３と、ウェル２に培地Ｌの液流ＬＦを発生させるためのポンプユニット４（ポンプ装置）と、カメラユニット３及びポンプユニット４の動作を制御すると共に、各種の処理を行うコントローラ５とを備えている。カメラユニット３は、チャンバーＣＨの下方に配置されている。

【0024】

チャンバーＣＨは、上面が開口した容器１１と、この容器１１内に配置されるウェルプレート１２とを含む。ウェルプレート１２は、複数のウェル２を備える。ウェル２は、細胞Ｃの培養領域となる微小な凹部であり、ウェルプレート１２は多数のマトリクス配列されたウェル２を備えている。容器１１及びウェルプレート１２は、透光性の樹脂又はガラスからなる。これは、ウェル２に収容された細胞Ｃを、チャンバーＣＨの下方に配置されたカメラユニット３にて透視撮像可能とするためである。

【0025】

容器１１には培地Ｌが注液されており、ウェルプレート１２は培地Ｌ内に浸漬されている。容器１１は、底壁１３、側壁１４、天壁１５及び開口壁１６を含む。底壁１３は、チャンバーＣＨの底面を構成している。側壁１４は、底壁１３の周縁から立設され、チャンバーＣＨの外枠部分を構成している。天壁１５は、側壁１４の上端からチャンバーＣＨの内側へ水平に延び、底壁１３の周縁付近の上方を覆っている。開口壁１６は、天壁１５の内側端からチャンバーＣＨの内側へ向かう方向へ斜め下方に延びる傾斜壁である。開口壁１６の下端は底壁１３よりも高い位置にあり、当該下端にて、ウェルプレート１２の周縁部が保持されている。つまり、ウェルプレート１２は、底壁１３から上方に離間した状態で保持されている。開口壁１６は、上方に向けてテーパ状に広がるチャンバーＣＨの開口を形成しており、ユーザーはこの開口を通して、細胞Ｃをウェルプレート１２に担持させたり、細胞Ｃをピックアップしたりすることができる。

【0026】

図２（Ａ）を参照して、ウェル２は、筒状側面２１、底面２２、テーパ開口面２３及び貫通孔２４（ウェルに連通する開口）を備えている。筒状側面２１は、ウェル２の側壁面を構成する部分であり、所要の細胞Ｃを収容可能な断面積を有するキャビティを区画している。筒状側面２１は、鉛直方向に延びる壁面である。底面２２は、筒状側面２１の下端に連設され、ウェル２の筒心に向けて緩く下り傾斜する傾斜面からなる。テーパ開口面２３は、筒状側面２１の上端に連設され、上方に向けて拡開するテーパ面である。一のウェル２と隣接するウェル２とは、テーパ開口面２３の上端同士で繋がっており、当該繋がり部分は尖った稜線部２５となっている。筒状側面２１、底面２２及びテーパ開口面２３は、ウェルプレート１２の上面から下方に凹むキャビティ２０を区画している。キャビティ２０は、細胞Ｃ及び培地Ｌを収容する培養領域である。

【0027】

貫通孔２４は、底面２２の最も低い箇所となる底面２２の中央部に穿孔された開口であって、ウェル２のキャビティ２０と容器１１内の空間とを連通させる開口である。貫通孔２４は、容器１１に注液された培地をキャビティ２０に流入させると共に、キャビティ２０内の培地Ｌに液流ＬＦを発生させるために設けられている。図１に示すように、容器１１内にウェルプレート１２を越える高さまで培地Ｌが注液されると、側壁１４、天壁１５及び開口壁１６で囲まれる容器１１の内部空間Ａは密閉空間となる。従って、内部空間Ａ内の培地Ｌを加圧することで、貫通孔２４からウェル２内に流入する液流ＬＦを発生させることができる。

【0028】

カメラユニット３は、レンズ部３１、カメラ本体３２及びレンズ駆動部３３を備えた、共焦点光学系を備えた撮像ユニットである。レンズ部３１は、光学顕微鏡に用いられている対物レンズであり、所定倍率の光像を結像させるレンズ群と、このレンズ群を収容するレンズ鏡筒とを含む。カメラ本体３２は、ＣＣＤイメージセンサのような撮像素子３５（図６）を備える。レンズ部３１は、撮像素子３５の像面に撮像対象物の光像を結像させる。レンズ駆動部３３は、サーボモータ等からなり、合焦動作のためにレンズ部３１を上下動させる。レンズ部３１の焦点位置は、胴付き面３４の高さ位置ｈからの同焦点距離にて定まる。なお、レンズ部３１を移動させるのではなく、チャンバーＣＨを上下動させることで、合焦動作を行わせるようにしても良い。

【0029】

ポンプユニット４は、例えばチューブポンプ等の循環ポンプからなり、ウェルプレート１２の貫通孔２４を通して各ウェル２に流体を送り、ウェル２内の液体に液流を発生させる機能を果たす。本実施形態では、ポンプユニット４がウェル２に送る流体は培地Ｌであり、ウェル２内の液体も培地Ｌである。ポンプユニット４は、ポンプ本体４１、送液チューブ４２及び吸液チューブ４３を備える。

【0030】

ポンプ本体４１は、送液チューブ４２には液体を送り出し、吸液チューブ４３には液体の吸引力を発生させるポンプ動作を行う。チューブポンプが用いられる場合、ポンプ本体４１は、駆動モータで回動駆動されるロータと、このロータでしごかれる湾曲チューブ部とを含む。送液チューブ４２の一端４２１はポンプ本体４１へ繋がっている一方、他端４２２はウェルプレート１２の天壁１５を貫通し、容器１１の内部空間Ａ内に開口している。吸液チューブ４３の一端４３１は、他端４２２と対極位置において内部空間Ａ内に開口しており、他端４３２はポンプ本体４１へ繋がっている。

【0031】

ポンプ本体４１が動作すると、貫通孔２４を通して培地Ｌが循環する。すなわち、ポンプ本体４１が動作して送液チューブ４２に培地Ｌが送り出されると、その送り出された培地Ｌは容器１１の内部空間Ａに進入する。内部空間Ａは、容器１１の底壁１３、側壁１４天壁１５及び開口壁１６とウェルプレート１２とによって半密閉状態にあり、圧力を開放できる部分は貫通孔２４のみである。従って、図２（Ｂ）、（Ｄ）に示しているように、内部空間Ａから貫通孔２４を通してウェル２のキャビティ２０内に流入しようとする液流ＬＦが発生する。送液チューブ４２からの培地Ｌの供給によって容器１１内の液量が増加するが、その増加分は吸液チューブ４３によって吸引され、ポンプ本体４１に向かうことになる。

【0032】

コントローラ５は、細胞Ｃの長期培養に必要な制御を行うコントローラ５は、ポンプユニット４の動作を制御して、貫通孔２４からウェル２のキャビティ２０内に吹き上がるような液流ＬＦを発生させ、この液流ＬＦによって細胞Ｃをキャビティ２０内で流動させる。また、コントローラ５は、当該細胞Ｃをキャビティ２０内において流動させつつ、その状態を所定期間保持する制御を行う。さらに、コントローラ５は、カメラユニット３の動作を制御して、ウェル２内の細胞Ｃの画像を撮像させ、細胞Ｃの状態変化を監視する。そして、細胞Ｃに所定の状態変化が生じたとき、液流ＬＦの発生条件を変更する制御を行う。コントローラ５の機能構成の詳細については、後記で説明する。

【0033】

［細胞の長期培養方法］
本実施形態に係る細胞Ｃの培養方法は、ウェル２のキャビティ２０内に培地Ｌの液流を発生させ、キャビティ２０に収容されている細胞Ｃを当該液流ＬＦによって浮上、回転するように流動させつつ、所定期間保持するものである。保持期間は任意であるが、例えば１日～数週間程度の長期間である。この培養方法を、上述の細胞培養ユニットＵを用いて実施する例を説明する。

【0034】

図２（Ａ）は、培地Ｌに浸漬された状態のウェルプレート１２のウェル２に、細胞Ｃが投入された状態を示している。貫通孔２４から液流ＬＦが発生されていない場合、細胞Ｃは自重で沈降し、底面２２に接面する。図２（Ａ）では、概略的に楕円形状を有する細胞Ｃが、横倒れした態様で底面２２に接面している状態を示している。このように、細胞Ｃの一部が何らかの部材に接面した状態で当該細胞Ｃを長期培養すると、その接面箇所における細胞Ｃの拘束、栄養分の不行き渡り等で三次元的な成長が阻害され易くなる。

【0035】

そこで、本実施形態では、細胞Ｃの一部がウェル２の筒状側面２１や底面２２に接面し続けることがないよう、細胞Ｃをキャビティ２０内で流動させる。より望ましくは、筒状側面２１や底面２２になるべく接触しないように、細胞Ｃキャビティ２０内で浮上させる。このような細胞Ｃの流動ないしは浮上を実現する手段として、図２（Ｂ）、（Ｄ）に示すように、ポンプユニット４により発生される液流ＬＦが利用される。液流ＬＦは、容器１１内の培地Ｌが貫通孔２４を通してウェル２に供給されることによって発生される。

【0036】

図２（Ａ）に示すように、細胞Ｃが底面２２に接面した状態において液流ＬＦが発生されたとする。液流ＬＦは、貫通孔２４を通して上方へ吹き上がる液体流動であるので、細胞Ｃは当該液流ＬＦに押されて浮上を開始する。そして、図２（Ｂ）、（Ｄ）に示す通り、細胞Ｃは液流ＬＦの強度に応じて、ウェル２内で所定の高さ位置まで浮上する。一般に、細胞凝集塊のような細胞Ｃは、真球形状を持つことはなく、その形状や質量は非対称であって、表面には凹凸が存在する。従って、液流ＬＦが細胞Ｃに吹き当たると、図中の矢印Ｒで示すように細胞Ｃは回転する。

【0037】

ウェル２内の細胞Ｃの流動状態は、チャンバーＣＨの下方に配置されたカメラユニット３の撮像画像により確認することができる。図２（Ｃ）は、細胞Ｃが図２（Ｂ）の姿勢のときにカメラユニット３で撮像された二次元画像を示し、図２（Ｅ）は、細胞Ｃが図２（Ｄ）の姿勢のときにカメラユニット３で撮像された二次元画像を示している。細胞Ｃが回転している場合、カメラユニット３に撮像動作を連続的に実行させると、異なる形状で細胞Ｃが撮像される。従って、連続撮像画像を解析することで、細胞Ｃが回転しているか否かを判別することができる。また、細胞Ｃが備える形状若しくは色彩の特徴部に着目し、その特徴部の動きを連続画像で観察することで、細胞Ｃが一回転したか否か等も把握することができる。さらに、細胞Ｃの回転により、下方に固定的に配置されたカメラユニット３にて、細胞Ｃの表面画像を多面的に取得することができる。これにより、取得された画像を合成することで、細胞Ｃの三次元形状を把握することも可能となる。

【0038】

長期培養中に発生させる、望ましい液流ＬＦの条件は次の通りである。先ず、底面２２に接面している細胞Ｃを培地Ｌ中で浮上させることができる程度以上の液流ＬＦの流速が必要である。その一方で、ウェル２から細胞Ｃが飛び出してしまう程度の流速の液流ＬＦであってはならない。また、ウェル２内で細胞Ｃが乱高下せず、安定した高さ位置に細胞Ｃを浮上させ、その高さ位置で細胞Ｃを回転させ得る液流ＬＦの流速を選択することが望ましい。

【0039】

細胞Ｃの培養を続けると、細胞Ｃが成長し、一般にその体積や質量が増加する状態変化が生じる。この場合、従前の液流ＬＦの強度では所要の細胞Ｃの浮上状態を得られない。そこで、細胞Ｃの浮上状態をカメラユニット３で監視し、細胞Ｃの浮上状態若しくは回転状態に有意な変化が観察されたときに、液流ＬＦの発生条件を変更することが望ましい。例えば、成長によって重量の増した細胞Ｃに対して、強度の大きい液流を与えることで、細胞Ｃの浮上状態を維持させることができる。

【0040】

［長期培養の評価］
図３（Ａ）及び（Ｂ）は、液流ＬＦの有無による長期培養試験の結果を示すグラフであって、図３（Ａ）は細胞Ｃの投影面積を、図３（Ｂ）は細胞ＣのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の生成状況を各々示すグラフである。この試験では、液流ＬＦを発生させる実施例チャンバーと、液流ＬＦを発生させない比較例チャンバーとを用意した。マトリクス配列された多数のウェル２を有するウェルプレート１２を、各チャンバーにセットした。ウェルプレート１２は、容器１１内において、所定の培地からなる培養液に浸漬した。各ウェルプレート１２において、１８０個のスフェロイド（生体対象物の一例）を個別にウェル２に収容し、長期培養を開始した。

【0041】

実施例チャンバーでは、培養開始直後から、ウェル２内においてスフェロイドが浮上するように液流ＬＦを発生させ、これを継続した。一方、比較例チャンバーでは、液流ＬＦを発生させず、スフェロイドが自重で底面２２に接面している状態にて培養を行った。そして、培養開始から３日後に培地の一部を交換した。その後、両チャンバーで培養を継続し、１３日後に細胞Ｃの投影面積とＡＴＰの生成状況とを評価した。

【0042】

図３（Ａ）の投影面積は、カメラユニット３により撮像される細胞Ｃの、二次元画像から求められる面積である。図３（Ａ）の棒グラフは、１８０個のスフェロイドについて各々投影面積を求め、これらを平均した値を示している。液流ありの実施例チャンバーで培養されたスフェロイドの投影面積は、液流なしの比較例チャンバーで培養されたものに比べて、明らかに大きいことが判る。

【0043】

図３（Ｂ）のＡＴＰ生成状況は、培養されたスフェロイドの生体活性を評価するための指標である。図３（Ａ）に示す投影面積は、スフェロイドの二次元的な大きさを評価するものであり、その三次元形状までは判らない。また、死滅したスフェロイドが崩壊して、見かけ上で投影面積が大きくなっている場合もある。生物は、ＡＴＰを分解して活動エネルギーを作るので、スフェロイドが成長し且つ正常である場合、ＡＴＰの生成量は増加することになる。従って、ＡＴＰの生成状況を計測することで、スフェロイドの成長状況を把握することができる。

【0044】

図３（Ｂ）のグラフは、ＡＴＰの測定試薬を実施例及び比較例チャンバーで培養されたスフェロイドに投与し、各スフェロイドのＡＴＰ量を測定すると共に、１８０個のスフェロイドのＡＴＰ量を平均した値を示している。液流ありの実施例チャンバーで培養されたスフェロイドのＡＴＰ量は、液流なしの比較例チャンバーで培養されたＡＴＰ量に比べて、明らかに大きいことが判る。

【0045】

図４（Ａ）は、液流ＬＦを伴って１３日間培養した実施例チャンバーの細胞Ｃを示す図、図４（Ｂ）は、液流ＬＦを発生させずに１３日間培養した比較例チャンバーの細胞Ｃを示す図である。実施例チャンバーの細胞Ｃは、全体的にサイズが大きく、種々の三次元形状に成長していることが判る。これに対し、比較例チャンバーの細胞Ｃは、全体的にサイズが小さく、増殖状況が良好ではないことが判る。以上の通り、液流ＬＦを発生させて長期培養することで、液流ＬＦを発生させない場合に比べて細胞Ｃをより大きく、様々な三次元形状に生育させ得ることが確認された。

【0046】

［コントローラの機能構成］
続いて、上記のような液流ＬＦを伴う長期培養を実現する、図１のコントローラ５の機能構成について説明する。コントローラ５は、マイクロコンピュータ等からなり、所定のプログラムが実行されることで、ポンプ制御部５１、カメラ制御部５２、画像処理部５３、データ処理部５４及び記憶部５５を具備するように動作する。

【0047】

ポンプ制御部５１は、ポンプユニット４の動作を制御する。ポンプ制御部５１は、ポンプユニット４の送液チューブ４２からの吐出力を制御することで、上述の液流ＬＦを発生させると共に、液流ＬＦの流速を増減する。具体的にはポンプ制御部５１は、ウェル２の底面２２に接面している細胞Ｃを培地Ｌ内で浮上させると共に流動若しくは回転させることが可能な液流ＬＦを、ポンプユニット４に発生させる。ポンプユニット４がチューブポンプである場合、所要の細胞Ｃの浮上及び回転を達成できる液流ＬＦを発生させるよう、ポンプ制御部５１はポンプ本体４１が備えるロータの回転速度を制御する。

【0048】

カメラ制御部５２は、カメラユニット３の動作を制御する。カメラ制御部５２は、ポンプユニット４が液流ＬＦを発生させている状態において、カメラユニット３にウェル２内の細胞Ｃの撮像を連続的に行わせる。すなわち、カメラ制御部５２は、ウェル２内で浮上し流動若しくは回転している状態の細胞Ｃの連続画像を、カメラユニット３に撮像させる。具体的にはカメラ制御部５２は、ウェル２内の細胞Ｃに対する合焦動作のために、レンズ駆動部３３にレンズ部３１を上下方向に、例えば数十μｍピッチで移動させるための制御パルスを与える。また、カメラ制御部５２はカメラ本体３２を制御して、所定のタイミングで撮像動作を実行させる。

【0049】

画像処理部５３は、カメラユニット３が撮像した画像に基づいて、細胞Ｃの三次元形状を特定する処理を行う。画像処理部５３は、カメラ本体３２により取得された画像データに対して、エッジ検出処理や特徴量抽出を伴うパターン認識処理などの画像処理を施し、各撮像タイミングで取得された画像において、細胞Ｃの形状を特定する。また、画像処理部５３は、細胞Ｃの回転状態の把握に用いるための、細胞Ｃの特徴部を抽出する処理も行う。

【0050】

データ処理部５４は、画像処理部５３により特定された細胞Ｃの形状データや前記特徴部の位置データ等に基づいて、各種の処理を実行する。例えばデータ処理部５４は、レンズ駆動部３３が設定した合焦位置情報に基づき、細胞Ｃがウェル２の底面２２から浮上しているか否かを判定する。また、データ処理部５４は、画像処理部５３が各々の画像について特定した細胞Ｃの形状データを合成して、当該細胞Ｃの三次元形状を作成する処理を行う。さらに、データ処理部５４は、画像処理部５３が特定した細胞Ｃの形状データに基づいて、細胞Ｃが回転しているか又は静止しているか、どの程度の回転数で回転しているか等、細胞Ｃの回転状態を判定する処理を行う。具体的には、一つの細胞Ｃの連続的な撮像画像に基づき、前記特徴部の表出状態乃至は移動状態から、細胞Ｃが一回転したか否か、並びに、細胞Ｃの回転速度を導出する。

【0051】

記憶部５５は、細胞培養ユニットＵに関する各種の設定データや、テーブルデータを記憶する。また、記憶部５５は、細胞Ｃに浮上及び回転状態と、液流ＬＦの発生条件に相当するポンプ本体４１の駆動データの実績とを関連付けて記憶する。この種のデータを多量に蓄積し、ＡＩ学習によりポンプ本体４１の駆動を最適化することが望ましい。

【0052】

［第１実施形態の細胞培養ユニットの動作フロー］
続いて、第１実施形態の細胞培養ユニットＵの動作フローの一例について、図１及び図５を主に参照して説明する。図５は、第１実施形態の細胞培養ユニットＵによる細胞の長期培養開始時における動作の一例を示すフローチャートである。フローの開始前に、ウェルプレート１２のウェル２に細胞Ｃが投入され、当該細胞Ｃが底面２２に接面しているものとする。図５に示すフローは、細胞Ｃの長期培養の開始に際して、細胞Ｃをウェル２内において所定の高さまで浮上させるフローである。

【0053】

まず、コントローラ５のカメラ制御部５２によりカメラユニット３が制御され、当該カメラユニット３の位置調整が行われる（ステップＳ１）と共に、ウェル２の底面２２に接面している細胞Ｃに対する合焦動作が実行される（ステップＳ２）。この時点では、液流ＬＦは発生させていない。この合焦動作では、レンズ駆動部３３がレンズ部３１を上下動させ、得られた画像について画像処理部５３がエッジ検出処理を行うと共にコントラストの評価を行う。そして、最もコントラストが良好なレンズ部３１の高さ位置（Ｚ方向高さ）が探知され、当該Ｚ方向高さが合焦位置とされる。合焦位置における画像データ、Ｚ方向高さデータ及び細胞Ｃの面積データ等の画像情報は、記憶部５５に格納される。

【0054】

図６（Ａ）は、ステップＳ１の位置調整及びステップＳ２の合焦動作が行われている状態を示す図である。細胞Ｃの合焦光像は、カメラ本体３２が備える撮像素子３５の像面上に作られる。細胞Ｃの如く微小な対象物を撮像する対物レンズであるレンズ部３１の焦点位置は、胴付き面３４からの同焦点距離Ｚｈにて定められている。従って、細胞Ｃに合焦した状態が作られれば、細胞Ｃと胴付き面３４との間の距離が同焦点距離Ｚｈとなる。つまり、図６（Ａ）のＺ方向高さにカメラユニット３を移動させることで（ステップＳ１）、底面２２に接面している細胞Ｃに合焦させることができる（ステップＳ２）。従って、胴付き面３４のＺ方向高さを求めることで、細胞ＣのＺ方向高さを把握することができる。なお、実際には被写界深度ａが存在するため、焦点位置にはＺ方向に一定の幅がある。ある基準高さＺ０を設定して、底面２２に接面している細胞Ｃに合焦しているときの、基準高さＺ０に対する胴付き面３４のＺ方向高さＺ１が記憶部５５に格納される。このＺ１が、底面２２から浮上していない状態における細胞ＣのＺ方向高さに相当する。

【0055】

その後、カメラ制御部５２により、カメラユニット３のＺ方向高さが所定の高さ位置になるように、カメラユニット３がＺ方向に移動される（ステップＳ３）。この移動は、例えば図６（Ｂ）に示すＺ２の位置に胴付き面３４が位置するようにカメラユニット３をＺ方向へ上昇させる移動であり、浮上させる細胞Ｃの狙いの高さ位置に当該カメラユニット３の焦点位置を設定するための移動である。

【0056】

続いて、ポンプ制御部５１が、液流ＬＦをゼロから徐々に増加させるようポンプユニット４を制御し、細胞Ｃを所定範囲内の浮上高さに浮上させる液流ＬＦの流速Ｆを探知する処理が実行される。なお、ポンプ本体４１の動作ランク、例えば単位時間当たりの液体の吐出量等と、発生させることができる液流ＬＦの流速Ｆとの関係を、予めテーブル化しておくことが望ましい。また、浮上高さは、前記ウェルの底面から完全に離間した浮上のほか、前記底面に一部が接面した状態における浮上高さでも良い。

【0057】

ポンプ制御部５１は、最も低ランクの流速Ｆの液流ＬＦを発生させるよう、ポンプ本体４１を動作させる（ステップＳ４）。次いで、カメラ制御部５２がレンズ駆動部３３を制御して、この流速Ｆの液流ＬＦが発生している状態において、細胞Ｃに対する合焦動作をレンズ部３１に実行させる（ステップＳ５）。実際は、既にステップＳ３において合焦位置が狙いの高さ位置Ｚ２となるようにカメラユニット３のＺ方向高さが設定されているので、細胞Ｃが前記合焦位置まで浮上するのを待つ期間となる。そして、細胞Ｃが所定のＺ方向高さに到達しているか否かが判定される（ステップＳ６）。つまり、所定のＺ方向高さに胴付き面３４が設定されたカメラユニット３にて、細胞Ｃが合焦状態で撮像されているか否かが判定される。

【0058】

図６（Ｂ）は、貫通孔２４を通した液流ＬＦの発生により細胞Ｃが浮上し、その浮上した細胞Ｃにレンズ部３１が合焦している状態を示している。同焦点距離Ｚｈは固定的な距離であり、ステップＳ３において胴付き面３４のＺ方向高さは、Ｚ１からＺ２に上昇している。浮上した細胞Ｃに合焦したということは、当該細胞ＣもＺ１からＺ２の高さ分だけ浮上したことになる。つまり、Ｚ２－Ｚ１の距離が細胞Ｃの浮上高さとなる。前記浮上高さが小さすぎると、細胞Ｃは底面２２と干渉して回転不能又は回転に障害がある状態となる。一方、前記浮上高さが大きすぎると、ウェル２からの細胞Ｃの飛び出しが生じかねない。

【0059】

これらに鑑みて、ステップＳ６において判定基準とする「所定高さ」は、細胞Ｃが自在に回転可能であって、なるべくウェル２の低層位置、つまり底面２２に近い位置に相当する高さに設定することが望ましい。また、液流ＬＦの流速Ｆが大きくなると、自ずと細胞Ｃの浮上高さが高くなる傾向が出る一方、細胞Ｃの浮上時における上下揺動も大きくなる傾向が出る。この観点からも、あまり浮上高さを高くせず、前記上下揺動を抑制することが望ましい。この場合、細胞Ｃが所定のＺ方向高さの範囲内に浮上した状態を維持し易くなるので、カメラユニット３によって撮像し易い状態を形成することができる。

【0060】

ステップＳ６において、細胞ＣのＺ方向高さが所定高さに至っていない場合（ステップＳ６でＮＯ）、当該細胞Ｃの浮上が不十分であるということになる。この場合、ポンプ制御部５１は、液流ＬＦの流速Ｆを、Ｆ＝Ｆ＋１ランクにインクリメントする（ステップＳ７）。なお、「１ランク」は、予め定められたポンプ吐出量の増量単位であって、流速Ｆの増加に連動する。そして、ポンプ制御部５１は、新たに与えられた流速Ｆを達成するよう、ポンプ本体４１の動作を制御する（ステップＳ４）。

【0061】

ステップＳ６において、細胞ＣのＺ方向高さが所定高さに至っている場合（ステップＳ６でＹＥＳ）、当該細胞Ｃが所定の高さまで浮上したことになる。この場合、ポンプ制御部５１は、ポンプ本体４１の動作状態を維持し、その流速Ｆを固定した状態とする。併せて、適正なウェル２の温度管理、雰囲気ガスの設定が行われる。以上で長期培養の準備処理は完了し、細胞Ｃの長期培養が開始される（ステップＳ８）。細胞Ｃは、浮上した後に回転する挙動を示すことが多い。従って、このステップＳ８の時点乃至はそれ以前に、細胞Ｃは回転し始めている。

【0062】

図７は、上記のステップＳ８までの処理を終えた後の、細胞培養ユニットＵによる細胞Ｃの長期培養中における動作の一例を示すフローチャートである。この時点で、ポンプ制御部５１はポンプユニット４に、上記のステップＳ４で設定した流速Ｆの液流ＬＦを発生させ続けている。コントローラ５は、細胞Ｃのモニターのタイミングが到来したか否かを判定する（ステップＳ１１）。このモニタータイミングは、例えば１時間～１日程度のスパンで設定することができる。モニタータイミングが到来すると（ステップＳ１１でＹＥＳ）、カメラ制御部５２が細胞Ｃの状態情報の取得のために、上記のステップＳ３で胴付き面３４のＺ方向高さ＝Ｚ２に設定されたカメラユニット３に、細胞Ｃの画像を撮像させる（ステップＳ１２）。

【0063】

続いて、取得された細胞Ｃの画像に基づき、細胞Ｃの状態を特定すると共に、その状態の記録及び解析が行われる（ステップＳ１３）。具体的には、画像処理部５３が、取得された細胞Ｃの画像に対して所定の画像処理を行うことで、細胞Ｃの外形形状や色彩等のデータが把握される。このデータは、取得タイミングに関連付けて記憶部５５に格納される。また前記データに基づき、データ処理部５４が、細胞Ｃの回転数を求める処理、細胞Ｃの各種サイズを抽出する処理、色やテクスチャを識別する処理、細胞Ｃの蛍光性を評価する処理等を行う。これらの処理結果より、例えば、細胞Ｃのサイズの変化に基づく細胞成長量解析、細胞テクスチャに基づく生死などの品質解析、蛍光状態に基づく細胞Ｃの生死若しくは特定タンパク質の発現解析などの解析処理が、データ処理部５４により実行される。上記の処理結果及び解析結果も、記憶部５５に格納される。そして、過去の流速Ｆ及び細胞Ｃの回転データと細胞品質のデータとの関係を参照し、今回取得されたデータとの対比を行う処理が行われる（ステップＳ１４）。

【0064】

続いて、細胞Ｃの浮上状態を解析する処理が実行される（ステップＳ１５）。具体的には、画像処理部５３による画像処理データに基づき、データ処理部５４が細胞Ｃに対する合焦度合いを判定する。合焦度合いが良好であれば、細胞Ｃが図６（Ｂ）に示した同焦点距離Ｚｈの高さ位置に浮上し続けていることになる。一方、合焦度合いが低い場合は、細胞Ｃが設定高さ位置に存在していないことになる。例えば、細胞Ｃが成長して質量が増加した場合には沈降気味となり、死滅や劣化する等して質量が低下すると浮上気味となる。

【0065】

そして、データ処理部５４は、ステップＳ１４及びＳ１５の処理結果に基づき、細胞Ｃの浮上状態及び回転状態が、予め定めた「良好」と認定できる範囲であるか否かを判定する（ステップＳ１６）。「良好」な範囲ではない場合（ステップＳ１６でＮＯ）、ポンプ制御部５１が、細胞Ｃの浮上高さ及び回転数を変更するために、液流ＬＦの流速Ｆを、Ｆ＝Ｆ＋１ランク若しくはＦ＝Ｆ－１に変更する（ステップＳ１７）。そして、ステップＳ１２に戻り、同様な解析処理がリピートされる。一方、細胞Ｃの浮上状態及び回転状態が「良好」である場合（ステップＳ１６でＹＥＳ）、ポンプ制御部５１は現状の液流ＬＦの流速Ｆを維持する（ステップＳ１８）。

【0066】

［第２実施形態］
図８は、本発明の第２実施形態に係る生体対象物の培養方法を実現するための細胞培養ユニットＵ１の構成を示すブロック図である。第１実施形態では、１つのチャンバーが用いられる例を示したが、第２実施形態では、複数のチャンバーが接続流路にて直列接続及び並列接続される例を示す。細胞培養ユニットＵ１は、５つのチャンバー０、１、２、３、４を含んでいる。これらチャンバー０、１、２、３、４には、異なる細胞を各々収容することが予定されている。

【0067】

細胞リソースとしては、例えば患者由来の正常細胞或いは癌等の疾患細胞、ｉＰＳ／ＥＳ細胞由来の分化細胞を使用することができる。ここでは、チャンバー０（第１チャンバー）のウェルには心臓細胞（第１の生体対象物）、チャンバー１（第２チャンバー）のウェルには脳細胞（第２の生体対象物）、チャンバー２のウェルには肺細胞、チャンバー３のウェルには肝臓細胞、チャンバー４のウェルには腸細胞が各々収容されている例を示している。また、これらチャンバー０、１、２、３、４には、各チャンバー内の培地（培養液）の液面の高さを検出する液面センサー０、１、２、３、４が付設されている。

【0068】

細胞培養ユニットＵ１は、さらに、チャンバー０、１、２、３、４の各々に対応して設置される、第１の流量制御弁の群であるＦＣＶ０、１、２、３、４と、第２の流量制御弁の群であるＦＣＶ１０、１１、１２、１３、１４と、第１ポンプＰ１、第２ポンプＰ２、補給ポンプＰ３及び回収ポンプＰ４からなるポンプ群と、リザーバ培地タンクＴ１及び廃液タンクＴ２と、コントローラ５００とを含む。

【0069】

細胞培養ユニットＵ１は、心臓細胞を収容するチャンバー０を循環中心として、培地を他のチャンバー１、２、３、４へ循環させる循環系と、必要に応じて培地を補給し或いは培地を回収する補給系及び回収系とを有している。前記循環系は、チャンバー０、１、２、３、４同士を直列・並列接続する接続流路としての、静脈チューブ６１、動脈チューブ６２、動脈側のチューブ６３１～６３４、静脈側のチューブ６４１～６４４を含む。

【0070】

チャンバー０の入口側には静脈チューブ６１の下流端が、出口側には動脈チューブ６２の上流端が、各々接続されている。動脈チューブ６２の下流端には、マニホールド管の形態の動脈並列チューブ６３が接続されている。静脈チューブ６１の上流端には、同じくマニホールド管の形態の静脈並列チューブ６４が接続されている。動脈並列チューブ６３からは、それぞれ下流端がチャンバー１に接続された第１チューブ６３１、チャンバー２に接続された第２チューブ６３２、チャンバー３に接続された第３チューブ６３３及びチャンバー４に接続された第４チューブ６３４の各上流端が分岐している。また、静脈並列チューブ６４には、それぞれ上流端がチャンバー１に接続された第５チューブ６４１、チャンバー２に接続された第６チューブ６４２、チャンバー３に接続された第７チューブ６４３及びチャンバー４に接続された第８チューブ６４４の各下流端が接続されている。つまり、心臓細胞のチャンバー０と他のチャンバー１、２、３、４とは直列接続の状態、チャンバー１、２、３、４相互間は並列接続の状態である。

【0071】

動脈チューブ６２にはＦＣＶ１０が、第１チューブ６３１にはＦＣＶ１１が、第２チューブ６３２にはＦＣＶ１２が、第３チューブ６３３にはＦＣＶ１３が、第４チューブ６３４にはＦＣＶ１４が、各々配置されている。また、静脈チューブ６１にはＦＣＶ０が、第５チューブ６４１にはＦＣＶ１が、第６チューブ６４２にはＦＣＶ２が、第７チューブ６４３にはＦＣＶ３が、第８チューブ６４４にはＦＣＶ４が、各々配置されている。静脈チューブ６１には第１ポンプＰ１が配置され、動脈チューブ６２には第２ポンプＰ２が配置されている。

【0072】

第２ポンプＰ２の駆動により、チャンバー０から動脈チューブ６２を通して培地が送り出される。培地の送り出し量は、ＦＣＶ１０の開度によって調整される。第２ポンプＰ２に送り出された培地は、動脈並列チューブ６３及びチューブ６３１～６３４を介して、各チャンバー１、２、３、４に並列供給される。各チャンバー１、２、３、４への培地供給量は、第２の流量制御弁の群であるＦＣＶ１１、１２、１３、１４の開度及び又は第１の流量制御弁の群であるＦＣＶ０、１、２、３、４の開度によって調整可能である。

【0073】

第１ポンプＰ１の駆動により吸引力が発生され、チューブ６４１～６４４及び静脈並列チューブ６４を介して、チャンバー１、２、３、４から培地が吸引される。吸引された培地は、静脈チューブ６１を通してチャンバー０に戻される。つまり、第１ポンプＰ１及び第２ポンプＰ２の駆動により、チャンバー０を出発点とし、チャンバー１、２、３、４を経由してチャンバー０に戻るように、培地を循環させることができる。なお、静脈チューブ６１に配置されているＦＣＶ０を閉とすることで、培地の循環を停止させることができる。また、チューブ６４１～６４４に各々配置されているＦＣＶ１、２、３、４を閉じることで、チャンバー１、２、３、４を循環系から切り離すことができる。

【0074】

ここで、第１ポンプＰ１及び第２ポンプＰ２の２つのポンプを用いて培地を循環させるのは、チャンバー０、１、２、３、４として、図１に示したようなオープンタイプのチャンバーの使用を想定しているからである。図１に示す容器１１は上面に開口壁１６を有し、ウェルプレート１２の貫通孔２４を通して、容器１１の内部空間Ａが外気と連通している状態である。つまり、循環回路が閉鎖されていないゆえ、チャンバー０からの培地の流出の制御、及びチャンバー０への培地の流入の制御には、２つのポンプが必要となるからである。もし、チャンバー０、１、２、３、４として開口壁１６の上面を封止した密閉型のものを用いる場合は、第１ポンプＰ１及び第２ポンプＰ２のいずれか一つを省くようにしても良い。

【0075】

前記補給系は、補給ポンプＰ３及びリザーバ培地タンクＴ１からなる。リザーバ培地タンクＴ１には、フレッシュな培地が貯留されている。なお、リザーバ培地タンクＴ１には培地以外の他の成分が含まれていても良く、例えば試薬類が含まれていても良い。この場合、試薬を含有した培地を適宜なタイミングで前記循環系において循環させることができる。補給ポンプＰ３は、リザーバ培地タンクＴ１から動脈並列チューブ６３へ培地を送り出す。前記循環系を循環する培地量が不足した場合、所要量の培地が動脈並列チューブ６３へ供給されるよう、補給ポンプＰ３が駆動される。前記回収系は、回収ポンプＰ４及び廃液タンクＴ２からなる。回収ポンプＰ４は、動脈並列チューブ６３を通して前記循環系から過剰な培地を吸引し、回収する。廃液タンクＴ２には、回収された培地が貯留される。この廃液タンクＴ２を分析回収用タンクＴ２として扱うようにしても良い。この場合、前記循環系内で循環している培地の一部を分析回収用タンクＴ２に回収し、回収された培地の成分を分析するという実施態様が実現できる。

【0076】

コントローラ５００は、細胞培養ユニットＵ１の動作を統括的に制御するものであって、ポンプ制御部５０１、第１ＦＣＶ制御部５０２、第２ＦＣＶ制御部５０３、データ処理部５０４及び記憶部５０５を機能的に有する。なお、図８では図示を省いているが、チャンバー０、１、２、３、４には、各チャンバーのウェルに収容された細胞の画像を取得するカメラユニットが配置されている。

【0077】

ポンプ制御部５０１は、第１ポンプＰ１、第２ポンプＰ２、補給ポンプＰ３及び回収ポンプＰ４を制御し、所定のタイミングで、所要の培地吐出力又は培地吸引力を発生させる。第１ＦＣＶ制御部５０２は、ＦＣＶ０、１、２、３、４の開度を調整する制御を行う。第２ＦＣＶ制御部５０３は、ＦＣＶ１０、１１、１２、１３、１４の開度を調整する制御を行う。データ処理部５０４は、各チャンバーの細胞の画像データに基づき、第１実施形態のデータ処理部５４と同様なデータ処理、解析処理を行う。記憶部５０５は、細胞培養ユニットＵ１に関する各種の設定データや、テーブルデータを記憶する。

【0078】

［第２実施形態の細胞培養ユニットの動作フロー］
続いて、第２実施形態の細胞培養ユニットＵ１の動作フローを説明する。図９は、細胞培養ユニットＵ１による細胞の長期培養開始時における動作の一例を示すフローチャートである。コントローラ５００は、チャンバー０、１、２、３、４が所定の状態でセットされたことを確認する（ステップＳ２１）。この確認動作は、例えばユーザーからの動作開始指示の受け付けである。この時点までに、チャンバー０、１、２、３、４には、指定された細胞と培地とが予め収容されている。また、静脈チューブ６１及び動脈チューブ６２などの循環系のチューブにも、培地が予め充填されている。

【0079】

次に、第２ＦＣＶ制御部５０３がＦＣＶ１０、１１、１２、１３、１４の開度を、各細胞に応じて予め定められた規定値に設定する（ステップＳ２２）。なお、第１ＦＣＶ制御部５０２も、ＦＣＶ０、１、２、３、４の開度を規定値に設定する。次いで、ポンプ制御部５０１が、第１ポンプＰ１及び第２ポンプＰ２を駆動させる（ステップＳ２３）。これにより、心臓細胞を収容するチャンバー０を起点とし、動脈チューブ６２から培地が流出し、並列接続されたチャンバー１、２、３、４を各々経由して、静脈チューブ６１より培地がチャンバー０に戻る培地の循環が開始される。これにより、各チャンバー０、１、２、３、４内の細胞がウェル内で流動乃至は浮上するようになる。

【0080】

その後、コントローラ５００は、各チャンバー０、１、２、３、４に付設されている液面センサー０、１、２、３、４から、チャンバー内の培地液面の高さの検出値を取得する（ステップＳ２４）。この検出値のデータを用いてデータ処理部５０４が、各チャンバー０、１、２、３、４内の液面の高さが既定値であるか否か、つまり、各チャンバー０、１、２、３、４内の培地が不足しているか過剰であるかを判定する（ステップＳ２５）。一つの実施形態として、心臓細胞以外のチャンバー１、２、３、４について、ＦＣＶ１、２、３、４のうち、調整対象のチャンバーのＦＣＶだけを順次「開」、他を「閉」としてゆき、個別に培地の不足／過剰を判定するようにしても良い。

【0081】

ステップＳ２５で培地が「不足」と判定された場合、ポンプ制御部５０１は補給ポンプＰ３を駆動させ、リザーバ培地タンクＴ１から培地を動脈並列チューブ６３に供給させる（ステップＳ２６）。一方、ステップＳ２５で培地が「過剰」と判定された場合、ポンプ制御部５０１は回収ポンプＰ４を駆動させ、動脈並列チューブ６３から培地を吸引し、廃液タンクＴ２に流入させる（ステップＳ２７）。そして、ステップＳ２４に戻って、チャンバー内の液面高さが再確認する動作が繰り返される。

【0082】

これに対し、ステップＳ２５で培地が「既定値」と判定された場合は、補給ポンプＰ３及び回収ポンプＰ４のいずれかが駆動されている場合には、ポンプ制御部５０１はこれを停止させる（ステップＳ２８）。そして、図略のカメラユニットにて、第１実施形態と同様の手法でチャンバー０、１、２、３、４内の細胞が所定の高さに浮上したことが確認されたならば、その時の液流の流速を維持する。これにより、細胞の長期培養が開始されることになる（ステップＳ２９）。細胞の長期培養中には、前記カメラユニットにて、例えば細胞の増殖状態が観察される。

【0083】

図１０は、細胞培養ユニットＵ１による細胞の長期培養中におけるチャンバーの取り出し処理を示すフローチャートである。細胞の長期培養中において、コントローラ５００は、特定のチャンバーの取り出しリクエストが存在しているか否かを判定する（ステップＳ３１）。前記取り出しリクエストとは、培地の循環を継続しつつ、チャンバー１、２、３、４のいずれか又は複数を循環系から切り離して、細胞培養ユニットＵ１から取り出し可能とする処理のリクエストである。前記取り出しリクエストが無い場合は、待機する。

【0084】

前記取り出しリクエストが有った場合（ステップＳ３１でＹＥＳ）、コントローラ５００は以下の処理を行う。ここで、脳細胞用のチャンバー１の取り出しリクエストが有った場合を想定する。この場合、第２ＦＣＶ制御部５０３がＦＣＶ１１を絞って「閉」とする制御を行う（ステップＳ３２）。また、第１ＦＣＶ制御部５０２が、ＦＣＶ１を「閉」とする制御を行う（ステップＳ３３）。これにより、チャンバー１は動脈並列チューブ６３及び静脈並列チューブ６４を通した培地の循環回路から切り離された状態となる。

【0085】

チャンバー１が循環回路から切り離されたことで、他のチャンバー２、３、４の液圧が上昇することになる。この場合、これらチャンバー２、３、４内の液流の流速が増してしまい、各ウェルの細胞が過剰に浮上する、或いはウェルから飛び出してしまうことが生じ得る。そこで第２ＦＣＶ制御部５０３は、ＦＣＶ１１を「閉」とした分を按分して、ＦＣＶ１２、１３、１４の開度を各々小さくする（ステップＳ３４）。また、ポンプ制御部５０１は、第１ポンプＰ１の出力を、チャンバー１を切り離した分だけ抑制する。これにより、チャンバー２、３、４について、チャンバー１の切り離し前の液流の流速を維持させることができる。なお、その後のユーザーの作業としては、取り出したチャンバー１を観察や薬液処理後、若しくは一部の細胞の取り出し後に元に戻す、チャンバー１に代えて新たな細胞を収容したチャンバーを組み付ける、といった作業が想定される。

【0086】

図１１は、細胞培養ユニットＵ１による細胞の長期培養中における、チャンバー内の液面管理動作を示すフローチャートである。コントローラ５００は、所定のサンプリングタイミングに、液面センサー０、１、２、３、４から、各チャンバー０、１、２、３、４内の培地液面の高さの検出値を取得する（ステップＳ４１）。長期培養中には、培地の蒸発、細胞の増殖又は減少等の要因によって、培地液面の高さや液流ＬＦの状態に変化が生じ得る。培地の減少は、液面センサー０、１、２、３、４の出力値にて、液流ＬＦの状態変化に起因する細胞の流動乃至は浮上状態の変動は、常時監視しているカメラユニットの画像にて、各々知見することができる。

【0087】

次いで、データ処理部５０４が、各チャンバーの培地液面の高さに異常が無いか否か、つまり、各チャンバー０、１、２、３、４内の培地が不足又は過剰でないか否か、並びに、各細胞の浮上状態に異常がないか否かを判定する（ステップＳ４２）。培地液面の高さや細胞の浮上状態に異常が無い場合（ステップＳ４２でＮＯ）、現状の液流ＬＦの強度が維持される。

【0088】

これに対し、培地液面の高さや細胞の浮上状態に異常が認められる場合（ステップＳ４２でＹＥＳ）、所定の措置が取られる（ステップＳ４３）。例えば、チャンバー１の細胞の浮上高さが低下していることが検出された場合には、第２ＦＣＶ制御部５０３が、ＦＣＶ１１の開度を大きくして液流ＬＦを増やし、逆に細胞の浮上高さが高すぎる状態であれば、ＦＣＶ１１の開度を小さくして液流ＬＦを減少させる。また、培地液面の高さの減少が検出された場合には、ポンプ制御部５０１が、補給ポンプＰ３を駆動して培地を循環系に補給させる。

【0089】

以上説明した第２実施形態の細胞培養ユニットＵ１によれば、複数種の細胞に対して同一の培養液を供給しつつ、これら細胞を長期培養することが可能となる。同様な細胞培養ユニットとして、培養液を流通させるマイクロ流路内に細胞を配置し前記培養液と反応させるものが既存する。しかし、既存ユニットでは、マイクロ流路を用いるため大量の細胞を扱うことは困難である。これに対し、細胞培養ユニットＵ１では、各チャンバー０、１、２、３、４に多数のウェル２を備えたウェルプレート１２を配置できるので、大量の細胞を同時に培養又は反応させることができる。また、既存ユニットでは、培養中の細胞をマイクロ流路から取り出すことはできないが、細胞培養ユニットＵ１では、図１０のフローで示した通り細胞を容易に取り出すことができる。さらに、細胞培養ユニットＵ１では、チャンバー間をチューブで繋ぐ構成であるので、チャンバーの数の増減、チャンバーの配置変更等を容易に行える利点もある。この他、細胞間の伝達物質（シグナル物質）であるホルモンやサイトカイン、神経伝達物質などを各チャンバー０、１、２、３、４の細胞へ循環させ、その反応を観察できるという利点もある。

【0090】

［他の実施形態］
以上、本発明の主な実施形態を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、種々の変形実施形態を取ることができる。例えば本発明は、次に示すような変形実施形態を採用することができる。

【0091】

（１）図１では、ウェルプレート１２を１層だけ備えたチャンバーＣＨを例示した。図１２は、変形例に係るチャンバーＣＨ１を示す断面図である。チャンバーＣＨ１は、下段ウェルプレート１２Ａ（第１プレート）と上段ウェルプレート１２Ｂ（第２プレート）とが、上下２層に配置されている。下段ウェルプレート１２Ａは、図１に示したウェルプレート１２と同じく、貫通孔２４付きのウェル２（第１ウェル）を備えている。上段ウェルプレート１２Ｂは、下段ウェルプレート１２Ａの上方に間隔を置いて配置され、同様に貫通孔２４付きのウェル２（第２ウェル）を備えている。

【0092】

このチャンバーＣＨ１を用いれば、下段ウェルプレート１２Ａの貫通孔２４を通過した液流が、さらに上段ウェルプレート１２Ｂの貫通孔２４を通過することで、下段ウェルプレート１２Ａのウェル２だけでなく、上段ウェルプレート１２Ｂのウェル２にも液流を発生させることができる。このため、下段ウェルプレート１２Ａでは第１の細胞Ｃａを培養し、上段ウェルプレート１２Ｂでは第１の細胞Ｃａとは異なる第２の細胞Ｃｂを培養するというように、異なる細胞を１つのチャンバーで長期培養することができる。

【0093】

（２）図１３は、他の変形例に係るチャンバーＣＨ２を示す断面図である。チャンバーＣＨ２は、下段ウェルプレート１２Ａ、中段ウェルプレート１２Ｃ及び蓋体４６を備えている。下段ウェルプレート１２Ａは、図１に示したウェルプレート１２と同じである。中段ウェルプレート１２Ｃは、下段ウェルプレート１２Ａの上方に間隔を置いて配置され、細胞を収容可能なウェル２を備えている。蓋体４６は、中段ウェルプレート１２Ｃの上方を密封している。下段ウェルプレート１２Ａは、第１の培地ＬＡに浸漬されている。一方、中段ウェルプレート１２Ｃと蓋体４６との間には、第１の培地ＬＡとは異なる第２の培地ＬＢが充填されている。

【0094】

下段ウェルプレート１２Ａでは第１の細胞Ｃａが担持され、中段ウェルプレート１２Ｃでは第２の細胞Ｃｂが担持されている。中段ウェルプレート１２Ｃは、第１の培地ＬＡ及び第２の培地ＬＡの相互の浸透は許容しつつ、両培地の自由な混合並びに両細胞の出入は許容しないフィルター機能を有している。下段ウェルプレート１２Ａには、容器１１に対して配置された送液チューブ４２及び吸液チューブ４３によって第１の培地ＬＡが供給され、液流が発生される。これに対し、中段ウェルプレート１２Ｃには、蓋体４６に対して配置された送液チューブ４４及び吸液チューブ４５によって第２の培地ＬＢが供給され、液流が発生される。このように、異なる細胞を１つのチャンバーにて上下２層で保持させると共に、各々の細胞に対して独立的に液流を発生させる構成を採用しても良い。

【0095】

（３）上記第２実施形態では、各チャンバー０、１、２、３、４に液面センサー０、１、２、３、４を付設する例を示した。液面センサー０、１、２、３、４に代えて、他の手段で培地の液面を監視するようにしても良い。例えば、培地の液面にフロートを配置し、細胞の観察用に配置しているカメラユニット３にて前記フロートも観察対象としてフロート浮上高さを把握することで、培地の液面を監視するようにしても良い。

【0096】

（４）上記実施形態では、図２（Ａ）に例示した通り、筒状側面２１、底面２２、テーパ開口面２３及び貫通孔２４を備えるウェル２を例示した。ウェル２の形状は種々変更することが可能である。図１４（Ａ）～（Ｄ）は、変形例に係るウェル２Ａ～２Ｄを示す図である。図１４（Ａ）のウェル２Ａは、砲弾形の断面形状を有するウェルを例示している。図１４（Ｂ）では単純な断面矩形のウェル２Ｂを、図１４（Ｃ）では断面三角形のウェル２Ｃを、各々例示している。また、図１４（Ｄ）では、断面矩形と断面台形のキャビティが上下方向に連なっているウェル２Ｄを例示している。ウェル２Ａ～２Ｄとも、最も低い位置に液流ＬＦを発生させるための貫通孔２４が備えられている。

【0097】

（５）また、貫通孔２４の数や形成位置についても、細胞Ｃを浮上及び回転させることが可能な液流ＬＦを形成できる限りにおいて、種々変更することが可能である。図１５（Ａ）～（Ｃ）は、変形例に係る貫通孔２４Ａ～２４Ｅを備えたウェル２Ｅ～２Ｇを示す図である。図１５（Ａ）のウェル２Ｅは、底部付近に２つの貫通孔２４Ａ、２４Ｂが形成されている例を示している。図１５（Ｂ）では、側面に貫通孔２４Ｃを一つ備えたウェル２Ｆを例示している。図１５（Ｃ）では、底部と側面とに各々、貫通孔２４Ｄ、２４Ｅが形成されたウェル２Ｇを例示している。

【0098】

（６）さらに、ウェルへ連通する開口の形態も、種々変更可能である。図１６（Ａ）では、ウェルの壁面に対して、直交する方向に貫通するのではなく、斜め方向に貫通する貫通孔２４Ｆを備えたウェル２Ｈを例示している。この貫通孔２４Ｆによれば、ウェル２Ｈ内に渦流を発生させ易くなる。図１６（Ｂ）では、前記開口が貫通孔の態様ではなく、ノズル２６が用いられているウェル２Ｉを例示している。ノズル２６の先端はウェル２Ｉのキャビティ内に臨んでおり、液体を噴射させることが可能である。

【0099】

以上説明した本発明によれば、細胞Ｃの培養領域となるウェル２内に培地Ｌの液流ＬＦを発生させることで、細胞Ｃに酸素や栄養素を供給することが可能となる。また、液流ＬＦによって細胞Ｃをウェル２内において流動乃至は浮上、回転させることで、当該細胞Ｃの一部がウェル２の筒状側面２１や底面２２に同じ姿勢で接面し続けないようにすることができる。つまり、細胞Ｃを培地Ｌ中で遊動させた状態で、長期培養することが可能となる。これにより、筒状側面２１や底面２２に対する接面の影響を抑制して、細胞Ｃに自在な三次元的成長を行わせることができる。

【符号の説明】

【0100】

Ｕ 細胞培養ユニット（生体対象物の培養ユニット）
Ｃ 細胞（生体対象物）
Ｌ 培地（培養液）
ＬＦ 液流
ＣＨ チャンバー
１２ ウェルプレート
２ ウェル凹部）
２０ キャビティ（培養領域）
２４ 貫通孔（開口）
３ カメラユニット
４ ポンプユニット（ポンプ装置）
５ コントローラ
５１ ポンプ制御部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】