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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-10
(45)【発行日】2023-03-20
(54)【発明の名称】遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20230313BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20230313BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20230313BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20230313BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230313BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230313BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/6883 Z
C12Q1/6886 Z
C12N15/11 Z
G01N33/50 P
【請求項の数】
12
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020103559
(22)【出願日】2020-06-16
(62)【分割の表示】P 2019066989の分割
【原出願日】2014-12-24
(65)【公開番号】P2020146062
(43)【公開日】2020-09-17
【審査請求日】2020-06-16
(31)【優先権主張番号】61/921,456
(32)【優先日】2013-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/948,509
(32)【優先日】2014-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】515059083
【氏名又は名称】ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ヘルミー エルトーキー
(72)【発明者】
【氏名】アミルアリ タラサズ
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】特許第６５７１６６５（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】米国特許出願公開第２００７／０１７２８７３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】PNAS，2012年08月01日，Vol. 109, No. 36，p. 14508-14513, Supporting Information
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステップであって、各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含む、ステップと、（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップであって、各二重鎖タグが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第１および第２の相補鎖を異なってタグ付けし、前記二重鎖タグが、前記タグの一末端にハイブリダイズした部分および前記タグの反対側の末端にハイブリダイズしていない部分を有するＹ字形である二本鎖タグである、ステップと、
（ｃ）前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産生するステップと、
（ｄ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと、
（ｅ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す、ステップと、
（ｆ）１種または複数種の遺伝子座のそれぞれにマッピングする、（ｉ）前記ペア形成されたリードおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、
（ｇ）プログラムされたコンピュータプロセッサにより、各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの前記定量的尺度に基づき、前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする前記セットにおける総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップと
を含む方法。
【請求項2】
（ｈ）前記１種または複数種の遺伝子座のそれぞれにおけるステップ（ｇ）において決定された正規化された総定量的尺度を決定し、前記正規化された尺度に基づきコピー数バリエーションを決定することにより、前記試料におけるコピー数バリエーションを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記試料が、腫瘍試料から供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記試料が、無細胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記二重鎖タグが、分子バーコードを含有し、必要に応じて、異なる分子バーコードの数が、１００、５０、４０、３０、２０または１０以下の分子バーコードである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
配列リードの前記セットにおける冗長性を低下させるステップが、前記試料における本来のポリヌクレオチド分子の増幅された産物から産生された配列リードを、前記本来のポリヌクレオチド分子に戻るよう崩壊させるステップを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記本来のポリヌクレオチド分子に戻るように崩壊させるステップが、それらのタグおよび１種または複数種の内在性配列に基づく、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記本来のポリヌクレオチド分子のコンセンサス配列を決定するステップをさらに含む、請求項６～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
配列バリアントを含む１種または複数種の遺伝子座におけるポリヌクレオチド分子を同定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードの定量的尺度を決定するステップであって、前記ペアの両方の鎖が、配列バリアントを含む、ステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
ペア形成された分子の定量的尺度を決定するステップであって、前記ペアの一方のメンバーのみが配列バリアントを有する、ステップ、および／または配列バリアントを有するペア形成されない分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記配列バリアントが、単一ヌクレオチドバリアント、インデル、トランスバージョン、転位置、逆位、欠失、染色体構造変更、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複および染色体病変からなる群から選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１３年１２月２８日に出願された米国
仮出願第６１／９２１，４５６号および２０１４年３月５日に出願され多米国仮出願第６
１／９４８，５０９号の利益を請求し、各々は参照によってその全体が本明細書に組み込
まれる。
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１３年１２月２８日に出願された米国
仮出願第６１／９２１，４５６号および２０１４年３月５日に出願され多米国仮出願第６
１／９４８，５０９号の利益を請求し、各々は参照によってその全体が本明細書に組み込
まれる。
【背景技術】
【0002】
ポリヌクレオチドの検出および定量化は、診断等、分子生物学および医学適用に重要で
ある。遺伝子検査は、多数の診断方法に特に有用である。例えば、がんおよび部分的また
は完全な異数性等、稀な遺伝子変更（例えば、配列バリアント）またはエピジェネティッ
クマーカーの変化が原因の障害は、ＤＮＡ配列情報により検出またはより正確に特徴付け
ることができる。
ある。遺伝子検査は、多数の診断方法に特に有用である。例えば、がんおよび部分的また
は完全な異数性等、稀な遺伝子変更（例えば、配列バリアント）またはエピジェネティッ
クマーカーの変化が原因の障害は、ＤＮＡ配列情報により検出またはより正確に特徴付け
ることができる。
【0003】
がん等、遺伝性疾患の早期検出およびモニタリングは、多くの場合、該疾患の処置また
は管理の成功において有用であり必要とされる。アプローチの１つは、異なる種類の体液
において見出すことができるポリヌクレオチドの集団である、無細胞（cell-free）核酸
に由来する試料のモニタリングを含むことができる。一部の事例において、疾患は、１種
または複数の核酸配列のコピー数バリエーションおよび／または配列バリエーション等、
遺伝的異常の検出、または他のある特定の稀な遺伝子変更の発生に基づき特徴付けるまた
は検出することができる。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、特定の疾患に関連する遺伝的
異常を含有することができる。配列決定および核酸を操作する技法における改善に伴い、
本技術分野において、無細胞ＤＮＡを使用して、疾患を検出およびモニタリングするため
の改善された方法およびシステムの必要がある。
は管理の成功において有用であり必要とされる。アプローチの１つは、異なる種類の体液
において見出すことができるポリヌクレオチドの集団である、無細胞（cell-free）核酸
に由来する試料のモニタリングを含むことができる。一部の事例において、疾患は、１種
または複数の核酸配列のコピー数バリエーションおよび／または配列バリエーション等、
遺伝的異常の検出、または他のある特定の稀な遺伝子変更の発生に基づき特徴付けるまた
は検出することができる。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、特定の疾患に関連する遺伝的
異常を含有することができる。配列決定および核酸を操作する技法における改善に伴い、
本技術分野において、無細胞ＤＮＡを使用して、疾患を検出およびモニタリングするため
の改善された方法およびシステムの必要がある。
【0004】
具体的には、特に、多くの適用（例えば、出生前、移植、免疫、メタゲノミクスまたは
がん診断）に対し、腫瘍由来ｇＤＮＡ等の異種性ゲノム試料またはｃｆＤＮＡのために、
正確なコピー数バリエーション推定のための多くの方法が開発された。これらの方法の大
部分は、本来の核酸を配列決定可能なライブラリーに変換する試料調製と、続く大規模並
列配列決定と、最終的に１種または複数の遺伝子座におけるコピー数バリエーションを推
定するためのバイオインフォマティクスを含む。
がん診断）に対し、腫瘍由来ｇＤＮＡ等の異種性ゲノム試料またはｃｆＤＮＡのために、
正確なコピー数バリエーション推定のための多くの方法が開発された。これらの方法の大
部分は、本来の核酸を配列決定可能なライブラリーに変換する試料調製と、続く大規模並
列配列決定と、最終的に１種または複数の遺伝子座におけるコピー数バリエーションを推
定するためのバイオインフォマティクスを含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
これらの方法の多くは、変換および配列決定されたあらゆる分子に対し、試料調製およ
び配列決定プロセスによって導入されるエラーを低下させることまたはこれと戦うことが
できるが、これらの方法は、変換されたが配列決定されていない分子の計数を推測するこ
とができない。変換されたが配列決定されていない分子のこのような計数は、ゲノム領域
間で高度に可変性となり得るため、これらの計数は、達成できる感度に劇的かつ有害に影
響を与え得る。
び配列決定プロセスによって導入されるエラーを低下させることまたはこれと戦うことが
できるが、これらの方法は、変換されたが配列決定されていない分子の計数を推測するこ
とができない。変換されたが配列決定されていない分子のこのような計数は、ゲノム領域
間で高度に可変性となり得るため、これらの計数は、達成できる感度に劇的かつ有害に影
響を与え得る。
【0006】
この問題に取り組むため、インプット二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、個々の二
本鎖分子の両半分を、一部の事例においては、異なってタグ付けするプロセスによって変
換することができる。この操作は、ヘアピン、バブルもしくはフォーク形アダプター（ad
apter）または二本鎖および一本鎖セグメント（バブル、フォーク形またはヘアピンアダ
プターのハイブリダイズしていない部分は、本明細書において一本鎖と考慮される）を有
する他のアダプタ（adaptor）のライゲーションを含む種々の技法を使用して行うことが
できる。正確にタグ付けされると、インプット二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの本来のワト
ソンおよびクリック（すなわち、鎖）側を異なってタグ付けし、シーケンサーおよびその
後のバイオインフォマティクスによって同定することができる。特定の領域におけるあら
ゆる分子に対し、両方のワトソンおよびクリック側が回収された分子（「ペア（Pair）」
）対一方の半分のみが回収された分子（「シングレット（Singlet）」）の計数を記録す
ることができる。未観測（unseen）分子の数は、検出されたペアおよびシングレットの数
に基づき推定することができる。
本鎖分子の両半分を、一部の事例においては、異なってタグ付けするプロセスによって変
換することができる。この操作は、ヘアピン、バブルもしくはフォーク形アダプター（ad
apter）または二本鎖および一本鎖セグメント（バブル、フォーク形またはヘアピンアダ
プターのハイブリダイズしていない部分は、本明細書において一本鎖と考慮される）を有
する他のアダプタ（adaptor）のライゲーションを含む種々の技法を使用して行うことが
できる。正確にタグ付けされると、インプット二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれの本来のワト
ソンおよびクリック（すなわち、鎖）側を異なってタグ付けし、シーケンサーおよびその
後のバイオインフォマティクスによって同定することができる。特定の領域におけるあら
ゆる分子に対し、両方のワトソンおよびクリック側が回収された分子（「ペア（Pair）」
）対一方の半分のみが回収された分子（「シングレット（Singlet）」）の計数を記録す
ることができる。未観測（unseen）分子の数は、検出されたペアおよびシングレットの数
に基づき推定することができる。
【0007】
本開示の態様は、本来のＤＮＡ断片の異種性集団における稀なデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を検出および／または定量化するための方法であって、断片の３０％超が、両端にお
いてタグ付けされるように、複数の異なるタグのライブラリーを使用して、単一の反応で
本来のＤＮＡ断片をタグ付けするステップを含み、タグのそれぞれが、分子バーコードを
含む方法を提供する。単一の反応は、単一の反応容器内で行われ得る。断片の５０％超が
、両端においてタグ付けされてよい。複数の異なるタグは、１００、５００、１０００、
１０，０００または１００，０００種のうちいずれか以下の異なるタグとなり得る。
Ａ）を検出および／または定量化するための方法であって、断片の３０％超が、両端にお
いてタグ付けされるように、複数の異なるタグのライブラリーを使用して、単一の反応で
本来のＤＮＡ断片をタグ付けするステップを含み、タグのそれぞれが、分子バーコードを
含む方法を提供する。単一の反応は、単一の反応容器内で行われ得る。断片の５０％超が
、両端においてタグ付けされてよい。複数の異なるタグは、１００、５００、１０００、
１０，０００または１００，０００種のうちいずれか以下の異なるタグとなり得る。
【0008】
別の態様は、目的の分子のタグ付け（例えば、ライゲーション、ハイブリダイゼーショ
ン等による）に使用することができるライブラリーアダプタのセットを提供する。ライブ
ラリーアダプタのセットは、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含む
ことができ、複数のポリヌクレオチド分子は、８０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等
しい長さであり、分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さであり、（ａ
）分子バーコードは、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し、（ｂ）
分子バーコードは、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１ヌクレオチ
ド塩基離れて位置し、（ｃ）任意選択で、少なくとも１末端塩基は、ポリヌクレオチド分
子の全てにおいて同一であり、（ｄ）ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサ
ーモチーフを含有しない。
ン等による）に使用することができるライブラリーアダプタのセットを提供する。ライブ
ラリーアダプタのセットは、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含む
ことができ、複数のポリヌクレオチド分子は、８０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等
しい長さであり、分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さであり、（ａ
）分子バーコードは、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し、（ｂ）
分子バーコードは、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１ヌクレオチ
ド塩基離れて位置し、（ｃ）任意選択で、少なくとも１末端塩基は、ポリヌクレオチド分
子の全てにおいて同一であり、（ｄ）ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサ
ーモチーフを含有しない。
【0009】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタ（またはアダプター）は、分子バーコ
ードを除いて互いに同一である。一部の実施形態において、複数のライブラリーアダプタ
のそれぞれは、少なくとも１個の二本鎖部分および少なくとも１個の一本鎖部分（例えば
、非相補的部分またはオーバーハング）を含む。一部の実施形態において、二本鎖部分は
、異なる分子バーコードのコレクションから選択される分子バーコードを有する。一部の
実施形態において、所与の分子バーコードは、ランダマーである。一部の実施形態におい
て、ライブラリーアダプタのそれぞれは、少なくとも１個の一本鎖部分に鎖同定バーコー
ドをさらに含む。一部の実施形態において、鎖同定バーコードは、少なくとも４ヌクレオ
チド塩基を含む。一部の実施形態において、一本鎖部分は、部分的シーケンサーモチーフ
を有する。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、完全シーケンサーモチー
フを含まない。
ードを除いて互いに同一である。一部の実施形態において、複数のライブラリーアダプタ
のそれぞれは、少なくとも１個の二本鎖部分および少なくとも１個の一本鎖部分（例えば
、非相補的部分またはオーバーハング）を含む。一部の実施形態において、二本鎖部分は
、異なる分子バーコードのコレクションから選択される分子バーコードを有する。一部の
実施形態において、所与の分子バーコードは、ランダマーである。一部の実施形態におい
て、ライブラリーアダプタのそれぞれは、少なくとも１個の一本鎖部分に鎖同定バーコー
ドをさらに含む。一部の実施形態において、鎖同定バーコードは、少なくとも４ヌクレオ
チド塩基を含む。一部の実施形態において、一本鎖部分は、部分的シーケンサーモチーフ
を有する。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、完全シーケンサーモチー
フを含まない。
【0010】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタのいずれも、フローセルにハイブリダ
イズするためのまたは配列決定のためにヘアピンを形成するための配列を含有しない。
イズするためのまたは配列決定のためにヘアピンを形成するための配列を含有しない。
【0011】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは全て、同じヌクレオチド（複数可）
を有する末端を有する。一部の実施形態において、同一末端ヌクレオチド（複数可）は、
２ヌクレオチド塩基またはそれを超える長さに及ぶ。
を有する末端を有する。一部の実施形態において、同一末端ヌクレオチド（複数可）は、
２ヌクレオチド塩基またはそれを超える長さに及ぶ。
【0012】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプターのそれぞれは、Ｙ字形、バブル形ま
たはヘアピン形である。一部の実施形態において、ライブラリーアダプターのいずれも、
試料同定モチーフを含有しない。一部の実施形態において、ライブラリーアダプターのそ
れぞれは、ユニバーサルプライマーに選択的にハイブリダイズ可能な配列を含む。一部の
実施形態において、ライブラリーアダプターのそれぞれは、少なくとも５、６、７、８、
９および１０ヌクレオチド塩基の長さの分子バーコードを含む。一部の実施形態において
、ライブラリーアダプターのそれぞれは、１０ヌクレオチド塩基～８０の長さまたは３０
～７０ヌクレオチド塩基の長さまたは４０～６０ヌクレオチド塩基の長さである。一部の
実施形態において、少なくとも１、２、３または４末端塩基が、全ライブラリーアダプタ
において同一である。一部の実施形態において、少なくとも４末端塩基が、全ライブラリ
ーアダプタにおいて同一である。
たはヘアピン形である。一部の実施形態において、ライブラリーアダプターのいずれも、
試料同定モチーフを含有しない。一部の実施形態において、ライブラリーアダプターのそ
れぞれは、ユニバーサルプライマーに選択的にハイブリダイズ可能な配列を含む。一部の
実施形態において、ライブラリーアダプターのそれぞれは、少なくとも５、６、７、８、
９および１０ヌクレオチド塩基の長さの分子バーコードを含む。一部の実施形態において
、ライブラリーアダプターのそれぞれは、１０ヌクレオチド塩基～８０の長さまたは３０
～７０ヌクレオチド塩基の長さまたは４０～６０ヌクレオチド塩基の長さである。一部の
実施形態において、少なくとも１、２、３または４末端塩基が、全ライブラリーアダプタ
において同一である。一部の実施形態において、少なくとも４末端塩基が、全ライブラリ
ーアダプタにおいて同一である。
【0013】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプターの分子バーコードの編集距離は、ハ
ミング距離である。一部の実施形態において、編集距離は、少なくとも１、２、３、４ま
たは５である。一部の実施形態において、編集距離は、複数のポリヌクレオチド分子の個
々の塩基に関する。一部の実施形態において、分子バーコードは、アダプターの末端から
少なくとも１０ヌクレオチド塩基離れて位置する。一部の実施形態において、複数のライ
ブラリーアダプターは、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０もしくは５
０種の異なる分子バーコード、または２～１００、４～８０、６～６０もしくは８～４０
種の異なる分子バーコードを含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、タグ
付けが特有ではなくなるように、異なる分子バーコードが存在するよりも多くのタグ付け
するべきポリヌクレオチド（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）が存在する。
ミング距離である。一部の実施形態において、編集距離は、少なくとも１、２、３、４ま
たは５である。一部の実施形態において、編集距離は、複数のポリヌクレオチド分子の個
々の塩基に関する。一部の実施形態において、分子バーコードは、アダプターの末端から
少なくとも１０ヌクレオチド塩基離れて位置する。一部の実施形態において、複数のライ
ブラリーアダプターは、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０もしくは５
０種の異なる分子バーコード、または２～１００、４～８０、６～６０もしくは８～４０
種の異なる分子バーコードを含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、タグ
付けが特有ではなくなるように、異なる分子バーコードが存在するよりも多くのタグ付け
するべきポリヌクレオチド（例えば、ｃｆＤＮＡ断片）が存在する。
【0014】
一部の実施形態において、アダプタの末端は、（例えば、標的核酸分子への）ライゲー
ションのために構成される。一部の実施形態において、アダプタの末端は、平滑末端であ
る。
ションのために構成される。一部の実施形態において、アダプタの末端は、平滑末端であ
る。
【0015】
一部の実施形態において、アダプタは、精製および単離される。一部の実施形態におい
て、ライブラリーは、１個または複数の非天然起源の塩基を含む。
て、ライブラリーは、１個または複数の非天然起源の塩基を含む。
【0016】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、分子バーコードに関して５’に配
置されたプライマー配列を含む。
置されたプライマー配列を含む。
【0017】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタのセットは、複数のポリヌクレオチド
分子から本質的になる。
分子から本質的になる。
【0018】
別の態様において、方法は、（ａ）アダプタのライブラリー由来の複数のポリヌクレオ
チド分子をポリヌクレオチドのコレクションにタグ付けして、タグ付けされたポリヌクレ
オチドのコレクションを作製するステップと、（ｂ）配列決定アダプタの存在下で、タグ
付けされたポリヌクレオチドのコレクションを増幅するステップであって、配列決定アダ
プタは、複数のポリヌクレオチド分子における相補的配列に選択的にハイブリダイズ可能
なヌクレオチド配列を有するプライマーを有するステップを含む。アダプタのライブラリ
ーは、上述または本明細書の他の箇所に記載のものとなり得る。一部の実施形態において
、シーケンサーアダプタのそれぞれは、試料同定モチーフとなり得る指標タグをさらに含
む。
チド分子をポリヌクレオチドのコレクションにタグ付けして、タグ付けされたポリヌクレ
オチドのコレクションを作製するステップと、（ｂ）配列決定アダプタの存在下で、タグ
付けされたポリヌクレオチドのコレクションを増幅するステップであって、配列決定アダ
プタは、複数のポリヌクレオチド分子における相補的配列に選択的にハイブリダイズ可能
なヌクレオチド配列を有するプライマーを有するステップを含む。アダプタのライブラリ
ーは、上述または本明細書の他の箇所に記載のものとなり得る。一部の実施形態において
、シーケンサーアダプタのそれぞれは、試料同定モチーフとなり得る指標タグをさらに含
む。
【0019】
別の態様は、本来のＤＮＡ断片の異種性集団における稀なＤＮＡを検出および／または
定量化するための方法であって、稀なＤＮＡは、１％未満である濃度を有し、方法は、（
ａ）本来のＤＮＡ断片の３０％超が、分子バーコードを含むライブラリーアダプタを両端
にタグ付けされるように、単一の反応において本来のＤＮＡ断片にタグ付けし、これによ
り、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意するステップと、（ｂ）タグ付けされたＤＮＡ断片
において高忠実度増幅を行うステップと、（ｃ）任意選択で、タグ付けされたＤＮＡ断片
のサブセットを選択的に濃縮するステップと、（ｄ）タグ付けされ、増幅され、任意選択
で選択的に濃縮されたＤＮＡ断片の一方または両方の鎖を配列決定して、分子バーコード
および本来のＤＮＡ断片の少なくとも一部分とのヌクレオチド配列を含む配列リードを得
るステップと、（ｅ）配列リードから、本来のＤＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセン
サスリードを決定するステップと、（ｆ）コンセンサスリードを定量化して、９９．９％
を超える特異性で、稀なＤＮＡを検出および／または定量化するステップとを含む方法を
提供する。
定量化するための方法であって、稀なＤＮＡは、１％未満である濃度を有し、方法は、（
ａ）本来のＤＮＡ断片の３０％超が、分子バーコードを含むライブラリーアダプタを両端
にタグ付けされるように、単一の反応において本来のＤＮＡ断片にタグ付けし、これによ
り、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意するステップと、（ｂ）タグ付けされたＤＮＡ断片
において高忠実度増幅を行うステップと、（ｃ）任意選択で、タグ付けされたＤＮＡ断片
のサブセットを選択的に濃縮するステップと、（ｄ）タグ付けされ、増幅され、任意選択
で選択的に濃縮されたＤＮＡ断片の一方または両方の鎖を配列決定して、分子バーコード
および本来のＤＮＡ断片の少なくとも一部分とのヌクレオチド配列を含む配列リードを得
るステップと、（ｅ）配列リードから、本来のＤＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセン
サスリードを決定するステップと、（ｆ）コンセンサスリードを定量化して、９９．９％
を超える特異性で、稀なＤＮＡを検出および／または定量化するステップとを含む方法を
提供する。
【0020】
一部の実施形態において、（ｅ）は、同じまたは類似の分子バーコードおよび同じまた
は類似の断片配列の末端を有する配列リードを比較するステップを含む。一部の実施形態
において、比較するステップは、同じまたは類似の分子バーコードを有する配列リードに
おける系統発生（phylogentic）解析を実行するステップをさらに含む。一部の実施形態
において、分子バーコードは、最大３の編集距離を有するバーコードを含む。一部の実施
形態において、断片配列の末端は、最大３の編集距離を有する断片配列を含む。
は類似の断片配列の末端を有する配列リードを比較するステップを含む。一部の実施形態
において、比較するステップは、同じまたは類似の分子バーコードを有する配列リードに
おける系統発生（phylogentic）解析を実行するステップをさらに含む。一部の実施形態
において、分子バーコードは、最大３の編集距離を有するバーコードを含む。一部の実施
形態において、断片配列の末端は、最大３の編集距離を有する断片配列を含む。
【0021】
一部の実施形態において、本方法は、配列リードをペア形成されたリードおよびペア形
成されないリードへと選別するステップと、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッ
ピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの数を定量化するステッ
プとをさらに含む。
成されないリードへと選別するステップと、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッ
ピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの数を定量化するステッ
プとをさらに含む。
【0022】
一部の実施形態において、タグ付けは、本来のＤＮＡ断片と比較して過剰量のライブラ
リーアダプタを有することにより起こる。一部の実施形態において、過剰は、少なくとも
５倍過剰である。一部の実施形態において、タグ付けは、リガーゼの使用を含む。一部の
実施形態において、タグ付けは、平滑末端への取り付けを含む。
リーアダプタを有することにより起こる。一部の実施形態において、過剰は、少なくとも
５倍過剰である。一部の実施形態において、タグ付けは、リガーゼの使用を含む。一部の
実施形態において、タグ付けは、平滑末端への取り付けを含む。
【0023】
一部の実施形態において、本方法は、分子バーコードおよび本来のＤＮＡ断片のそれぞ
れの少なくとも一端由来の配列情報に従って配列リードをビニングして、一本鎖リードの
ビンを作製するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、各ビンにお
いて、配列リードを解析することにより、本来のＤＮＡ断片の中の所与の本来のＤＮＡ断
片の配列を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、タグ付
けされ、増幅され、任意選択で濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノムの各位置に
おいて各塩基が生じる回数を比較することにより、稀なＤＮＡを検出および／または定量
化するステップをさらに含む。
れの少なくとも一端由来の配列情報に従って配列リードをビニングして、一本鎖リードの
ビンを作製するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、各ビンにお
いて、配列リードを解析することにより、本来のＤＮＡ断片の中の所与の本来のＤＮＡ断
片の配列を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、タグ付
けされ、増幅され、任意選択で濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノムの各位置に
おいて各塩基が生じる回数を比較することにより、稀なＤＮＡを検出および／または定量
化するステップをさらに含む。
【0024】
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、完全シーケンサーモチーフを含有
しない。一部の実施形態において、本方法は、タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを
選択的に濃縮するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、濃縮後に
、プライマーを含む配列決定アダプタの存在下で、濃縮されたタグ付けされたＤＮＡ断片
を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態において、（ａ）は、分子バーコード
の２～１０００種の異なる組合せを有するタグ付けされたＤＮＡ断片をもたらす。
しない。一部の実施形態において、本方法は、タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを
選択的に濃縮するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、濃縮後に
、プライマーを含む配列決定アダプタの存在下で、濃縮されたタグ付けされたＤＮＡ断片
を増幅するステップをさらに含む。一部の実施形態において、（ａ）は、分子バーコード
の２～１０００種の異なる組合せを有するタグ付けされたＤＮＡ断片をもたらす。
【0025】
一部の実施形態において、ＤＮＡ断片は、上述または本明細書の他の箇所に記載のアダ
プタのライブラリー由来のポリヌクレオチド分子をタグ付けされる。
プタのライブラリー由来のポリヌクレオチド分子をタグ付けされる。
【0026】
別の態様において、対象の核酸試料を処理および／または解析するための方法は、（ａ
）核酸試料由来のポリヌクレオチド断片をライブラリーアダプタのセットに曝露して、タ
グ付けされたポリヌクレオチド断片を生成するステップと、（ｂ）タグ付けされたポリヌ
クレオチド断片の増幅産物として増幅されたポリヌクレオチド断片を生じる条件下で、タ
グ付けされたポリヌクレオチド断片を核酸増幅反応に供するステップとを含む。ライブラ
リーアダプタのセットは、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含み、
複数のポリヌクレオチド分子は、８０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等しい長さであ
り、分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さであり、（１）分子バーコ
ードは、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し、（２）分子バーコー
ドは、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１ヌクレオチド塩基離れて
位置し、（３）任意選択で、少なくとも１末端塩基は、ポリヌクレオチド分子の全てにお
いて同一であり、（４）ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを
含有しない。
）核酸試料由来のポリヌクレオチド断片をライブラリーアダプタのセットに曝露して、タ
グ付けされたポリヌクレオチド断片を生成するステップと、（ｂ）タグ付けされたポリヌ
クレオチド断片の増幅産物として増幅されたポリヌクレオチド断片を生じる条件下で、タ
グ付けされたポリヌクレオチド断片を核酸増幅反応に供するステップとを含む。ライブラ
リーアダプタのセットは、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含み、
複数のポリヌクレオチド分子は、８０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等しい長さであ
り、分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さであり、（１）分子バーコ
ードは、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し、（２）分子バーコー
ドは、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１ヌクレオチド塩基離れて
位置し、（３）任意選択で、少なくとも１末端塩基は、ポリヌクレオチド分子の全てにお
いて同一であり、（４）ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを
含有しない。
【0027】
一部の実施形態において、本方法は、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片
のヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、増幅さ
れたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）なしで決定される。一部の実施形態において、本方法は、プログラムされたコ
ンピュータプロセッサによりヌクレオチド配列を解析して、対象のヌクレオチド試料にお
ける１種または複数の遺伝的バリアントを同定するステップをさらに含む。一部の実施形
態において、１種または複数の遺伝的バリアントは、塩基変化（複数可）、挿入（複数可
）、反復（複数可）、欠失（複数可）、コピー数バリエーション（複数可）およびトラン
スバージョン（複数可）からなる群から選択される。一部の実施形態において、１種また
は複数の遺伝的バリアントは、１種または複数の腫瘍関連遺伝子変更を含む。
のヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、増幅さ
れたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）なしで決定される。一部の実施形態において、本方法は、プログラムされたコ
ンピュータプロセッサによりヌクレオチド配列を解析して、対象のヌクレオチド試料にお
ける１種または複数の遺伝的バリアントを同定するステップをさらに含む。一部の実施形
態において、１種または複数の遺伝的バリアントは、塩基変化（複数可）、挿入（複数可
）、反復（複数可）、欠失（複数可）、コピー数バリエーション（複数可）およびトラン
スバージョン（複数可）からなる群から選択される。一部の実施形態において、１種また
は複数の遺伝的バリアントは、１種または複数の腫瘍関連遺伝子変更を含む。
【0028】
一部の実施形態において、対象は、疾患であるまたはそうであると疑われる。一部の実
施形態において、疾患は、がんである。一部の実施形態において、本方法は、対象から核
酸試料を収集するステップをさらに含む。一部の実施形態において、核酸試料は、対象の
血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄、痰、糞便、脳脊髄液および涙からなる群から選
択される位置から収集される。一部の実施形態において、核酸試料は、無細胞核酸試料で
ある。一部の実施形態において、核酸試料は、対象の１００ナノグラム（ｎｇ）以下の二
本鎖ポリヌクレオチド分子から収集される。
施形態において、疾患は、がんである。一部の実施形態において、本方法は、対象から核
酸試料を収集するステップをさらに含む。一部の実施形態において、核酸試料は、対象の
血液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄、痰、糞便、脳脊髄液および涙からなる群から選
択される位置から収集される。一部の実施形態において、核酸試料は、無細胞核酸試料で
ある。一部の実施形態において、核酸試料は、対象の１００ナノグラム（ｎｇ）以下の二
本鎖ポリヌクレオチド分子から収集される。
【0029】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチド断片は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を含
む。一部の実施形態において、（ａ）において、複数のポリヌクレオチド分子は、平滑末
端ライゲーション、粘着末端ライゲーション、分子逆位プローブ、ＰＣＲ、ライゲーショ
ンに基づくＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライゲーションおよび一本鎖環状化
によりポリヌクレオチド断片にカップリングする。一部の実施形態において、核酸試料の
ポリヌクレオチド断片を複数のポリヌクレオチド分子に曝露するステップは、少なくとも
１０％の変換効率で、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生じる。一部の実施形態に
おいて、タグ付けされたポリヌクレオチド断片の少なくとも５％、６％、７％、８％、９
％、１０％、２０％または２５％のいずれかは、共通ポリヌクレオチド分子または配列を
共有する。一部の実施形態において、本方法は、核酸試料からポリヌクレオチド断片を生
成するステップをさらに含む。
む。一部の実施形態において、（ａ）において、複数のポリヌクレオチド分子は、平滑末
端ライゲーション、粘着末端ライゲーション、分子逆位プローブ、ＰＣＲ、ライゲーショ
ンに基づくＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライゲーションおよび一本鎖環状化
によりポリヌクレオチド断片にカップリングする。一部の実施形態において、核酸試料の
ポリヌクレオチド断片を複数のポリヌクレオチド分子に曝露するステップは、少なくとも
１０％の変換効率で、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生じる。一部の実施形態に
おいて、タグ付けされたポリヌクレオチド断片の少なくとも５％、６％、７％、８％、９
％、１０％、２０％または２５％のいずれかは、共通ポリヌクレオチド分子または配列を
共有する。一部の実施形態において、本方法は、核酸試料からポリヌクレオチド断片を生
成するステップをさらに含む。
【0030】
一部の実施形態において、供するステップは、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２
Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、
ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴ
Ｍ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ
Ｒ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ
、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰ
Ｍ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、
ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ
、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、Ｂ
ＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、Ｒ
ＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる
群から選択される遺伝子に対応する配列からタグ付けされたポリヌクレオチド断片を増幅
するステップを含む。
Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、
ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴ
Ｍ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ
Ｒ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ
、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰ
Ｍ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、
ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ
、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、Ｂ
ＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、Ｒ
ＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる
群から選択される遺伝子に対応する配列からタグ付けされたポリヌクレオチド断片を増幅
するステップを含む。
【0031】
別の態様において、方法は、（ａ）複数のポリヌクレオチド分子から複数の配列リード
を生成するステップであって、複数のポリヌクレオチド分子が、標的ゲノムのゲノム遺伝
子座を網羅し、ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ
、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ
、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１
、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦ
Ｒ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、
ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧ
ＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲ
Ｃ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、
ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、Ｃ
ＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲ
ＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択さ
れる複数の遺伝子に対応するステップと、（ｂ）コンピュータプロセッサにより、複数の
配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、鋳型ポリヌ
クレオチドのうち１種に由来する配列リードを含むステップと、（ｃ）ファミリーのそれ
ぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成するステップと、（ｄ）ゲ
ノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコール（call）す
るステップと、（ｅ）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、
コールの中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれか
を検出するステップとを含む。
を生成するステップであって、複数のポリヌクレオチド分子が、標的ゲノムのゲノム遺伝
子座を網羅し、ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ
、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ
、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１
、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦ
Ｒ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、
ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧ
ＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲ
Ｃ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、
ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、Ｃ
ＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲ
ＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択さ
れる複数の遺伝子に対応するステップと、（ｂ）コンピュータプロセッサにより、複数の
配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、鋳型ポリヌ
クレオチドのうち１種に由来する配列リードを含むステップと、（ｃ）ファミリーのそれ
ぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成するステップと、（ｄ）ゲ
ノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコール（call）す
るステップと、（ｅ）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、
コールの中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれか
を検出するステップとを含む。
【0032】
一部の実施形態において、各ファミリーは、鋳型ポリヌクレオチドのうち１種のみに由
来する配列リードを含む。一部の実施形態において、所与のゲノム遺伝子座は、少なくと
も１核酸塩基を含む。一部の実施形態において、所与のゲノム遺伝子座は、複数の核酸塩
基を含む。一部の実施形態において、コールするステップは、所与のゲノム遺伝子座にお
いて少なくとも１核酸塩基をコールするステップを含む。一部の実施形態において、コー
ルするステップは、所与のゲノム遺伝子座において複数の核酸塩基をコールするステップ
を含む。一部の実施形態において、コールするステップは、系統発生解析、投票、秤量、
ファミリーにおける遺伝子座における各リードへの確率の割り当て、および最高確率によ
る塩基のコールのうちいずれか１種を含む。
来する配列リードを含む。一部の実施形態において、所与のゲノム遺伝子座は、少なくと
も１核酸塩基を含む。一部の実施形態において、所与のゲノム遺伝子座は、複数の核酸塩
基を含む。一部の実施形態において、コールするステップは、所与のゲノム遺伝子座にお
いて少なくとも１核酸塩基をコールするステップを含む。一部の実施形態において、コー
ルするステップは、所与のゲノム遺伝子座において複数の核酸塩基をコールするステップ
を含む。一部の実施形態において、コールするステップは、系統発生解析、投票、秤量、
ファミリーにおける遺伝子座における各リードへの確率の割り当て、および最高確率によ
る塩基のコールのうちいずれか１種を含む。
【0033】
一部の実施形態において、本方法は、ゲノム遺伝子座の中の追加的なゲノム遺伝子座に
おいて（ｄ）～（ｅ）を行うステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は
、所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、所与のゲ
ノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリエーショ
ンを決定するステップをさらに含む。
おいて（ｄ）～（ｅ）を行うステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は
、所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、所与のゲ
ノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリエーショ
ンを決定するステップをさらに含む。
【0034】
一部の実施形態において、群分けするステップは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド分子
にカップリングされた異なる分子バーコードおよび（ｉｉ）複数の配列リードの間の類似
性を同定することにより、複数の配列リードをファミリーへと分類するステップを含み、
各ファミリーは、分子バーコードおよび類似または同一の配列リードの異なる組合せに関
連付けられた複数の核酸配列を含む。異なる分子バーコードは、異なる配列を有する。
にカップリングされた異なる分子バーコードおよび（ｉｉ）複数の配列リードの間の類似
性を同定することにより、複数の配列リードをファミリーへと分類するステップを含み、
各ファミリーは、分子バーコードおよび類似または同一の配列リードの異なる組合せに関
連付けられた複数の核酸配列を含む。異なる分子バーコードは、異なる配列を有する。
【0035】
一部の実施形態において、コンセンサス配列は、配列リードのそれぞれの定量的尺度ま
たは統計的有意性レベルを評価することにより生成される。一部の実施形態において、定
量的尺度は、二項分布、指数関数的分布、ベータ分布または経験的分布の使用を含む。一
部の実施形態において、本方法は、コンセンサス配列を標的ゲノムにマッピングするステ
ップをさらに含む。一部の実施形態において、複数の遺伝子は、群から選択される複数の
遺伝子のうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５
０種または全種を含む。
たは統計的有意性レベルを評価することにより生成される。一部の実施形態において、定
量的尺度は、二項分布、指数関数的分布、ベータ分布または経験的分布の使用を含む。一
部の実施形態において、本方法は、コンセンサス配列を標的ゲノムにマッピングするステ
ップをさらに含む。一部の実施形態において、複数の遺伝子は、群から選択される複数の
遺伝子のうち少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５
０種または全種を含む。
【0036】
本開示の別の態様は、（ａ）単一の反応容器内に鋳型ポリヌクレオチド分子およびライ
ブラリーアダプタのセットを用意するステップであって、ライブラリーアダプタが、異な
る分子バーコード（例えば、２～１，０００種の異なる分子バーコード）を有するポリヌ
クレオチド分子であり、ライブラリーアダプタのいずれも、完全シーケンサーモチーフを
含有しないステップと、（ｂ）単一の反応容器内で、少なくとも１０％の効率で、ライブ
ラリーアダプタを鋳型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、複数の異な
るタグ付け組合せ（例えば、４～１，０００，０００種の異なるタグ付け組合せ）の中に
あるタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タグ付けされたポリヌク
レオチド分子を産生するステップと、（ｃ）タグ付けされたポリヌクレオチド分子の増幅
産物として増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、タグ付けされたポリヌク
レオチド分子を増幅反応に供するステップと、（ｄ）増幅されたポリヌクレオチド分子を
配列決定するステップとを含む方法を提供する。
ブラリーアダプタのセットを用意するステップであって、ライブラリーアダプタが、異な
る分子バーコード（例えば、２～１，０００種の異なる分子バーコード）を有するポリヌ
クレオチド分子であり、ライブラリーアダプタのいずれも、完全シーケンサーモチーフを
含有しないステップと、（ｂ）単一の反応容器内で、少なくとも１０％の効率で、ライブ
ラリーアダプタを鋳型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、複数の異な
るタグ付け組合せ（例えば、４～１，０００，０００種の異なるタグ付け組合せ）の中に
あるタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タグ付けされたポリヌク
レオチド分子を産生するステップと、（ｃ）タグ付けされたポリヌクレオチド分子の増幅
産物として増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、タグ付けされたポリヌク
レオチド分子を増幅反応に供するステップと、（ｄ）増幅されたポリヌクレオチド分子を
配列決定するステップとを含む方法を提供する。
【0037】
一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチド分子は、平滑末端または粘着末端であ
る。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、分子バーコードを除いて同一で
ある。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタのそれぞれは、二本鎖部分および
少なくとも１個の一本鎖部分を有する。一部の実施形態において、二本鎖部分は、複数の
分子バーコードの中の１つの分子バーコードを有する。一部の実施形態において、ライブ
ラリーアダプタのそれぞれは、少なくとも１個の一本鎖部分に鎖同定バーコードをさらに
含む。一部の実施形態において、一本鎖部分は、部分的シーケンサーモチーフを有する。
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、同じ末端ヌクレオチドの配列を有す
る。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチド分子は、二本鎖である。一部の実施
形態において、ライブラリーアダプタは、鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリン
グする。
る。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、分子バーコードを除いて同一で
ある。一部の実施形態において、ライブラリーアダプタのそれぞれは、二本鎖部分および
少なくとも１個の一本鎖部分を有する。一部の実施形態において、二本鎖部分は、複数の
分子バーコードの中の１つの分子バーコードを有する。一部の実施形態において、ライブ
ラリーアダプタのそれぞれは、少なくとも１個の一本鎖部分に鎖同定バーコードをさらに
含む。一部の実施形態において、一本鎖部分は、部分的シーケンサーモチーフを有する。
一部の実施形態において、ライブラリーアダプタは、同じ末端ヌクレオチドの配列を有す
る。一部の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチド分子は、二本鎖である。一部の実施
形態において、ライブラリーアダプタは、鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリン
グする。
【0038】
一部の実施形態において、タグ付けされたポリヌクレオチド分子を増幅反応に供するス
テップは、タグ付けされたポリヌクレオチド分子を非特異的に増幅するステップを含む。
テップは、タグ付けされたポリヌクレオチド分子を非特異的に増幅するステップを含む。
【0039】
一部の実施形態において、増幅反応は、タグ付けされたポリヌクレオチド分子のそれぞ
れを増幅するためのプライミング部位の使用を含む。一部の実施形態において、プライミ
ング部位は、プライマーである。一部の実施形態において、プライマーは、ユニバーサル
プライマーである。一部の実施形態において、プライミング部位は、ニックである。
れを増幅するためのプライミング部位の使用を含む。一部の実施形態において、プライミ
ング部位は、プライマーである。一部の実施形態において、プライマーは、ユニバーサル
プライマーである。一部の実施形態において、プライミング部位は、ニックである。
【0040】
一部の実施形態において、本方法は、（ｅ）に先立ち、（ｉ）増幅されたポリヌクレオ
チド分子から、１種または複数の所与の配列を含むポリヌクレオチド分子を分離して、濃
縮されたポリヌクレオチド分子を産生するステップと、（ｉｉ）配列決定アダプタにより
濃縮されたポリヌクレオチド分子を増幅するステップとをさらに含む。
チド分子から、１種または複数の所与の配列を含むポリヌクレオチド分子を分離して、濃
縮されたポリヌクレオチド分子を産生するステップと、（ｉｉ）配列決定アダプタにより
濃縮されたポリヌクレオチド分子を増幅するステップとをさらに含む。
【0041】
一部の実施形態において、効率は、少なくとも３０％、４０％または５０％である。一
部の実施形態において、本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺
伝的バリアントを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、配列決定す
るステップは、（ｉ）増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物として追加的な増幅さ
れたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅されたポリヌクレオチド分子を追加的
な増幅反応に供するステップと、（ｉｉ）追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を配
列決定するステップとを含む。一部の実施形態において、追加的な増幅は、配列決定アダ
プタの存在下で行われる。
部の実施形態において、本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺
伝的バリアントを同定するステップをさらに含む。一部の実施形態において、配列決定す
るステップは、（ｉ）増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物として追加的な増幅さ
れたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅されたポリヌクレオチド分子を追加的
な増幅反応に供するステップと、（ｉｉ）追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を配
列決定するステップとを含む。一部の実施形態において、追加的な増幅は、配列決定アダ
プタの存在下で行われる。
【0042】
一部の実施形態において、（ｂ）および（ｃ）は、タグ付けされたポリヌクレオチド分
子をアリコートにすることなく行われる。一部の実施形態において、タグ付けは、非特有
のタグ付けである。
子をアリコートにすることなく行われる。一部の実施形態において、タグ付けは、非特有
のタグ付けである。
【0043】
別の態様は、対象の標的核酸分子を解析するためのシステムであって、標的ゲノムのゲ
ノム遺伝子座を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リードを受け取る通信イ
ンターフェイスと；通信インターフェイスによって受け取られた複数のポリヌクレオチド
分子の核酸配列リードを記憶するコンピュータメモリと；通信インターフェイスおよびメ
モリに作動可能にカップリングされ、（ｉ）複数の配列リードを、各ファミリーが、鋳型
ポリヌクレオチドのうち１種に由来する配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉ
ｉ）ファミリーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、
（ｉｉｉ）ゲノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコー
ルし、（ｉｖ）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、コール
の中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出
するようにプログラムされたコンピュータプロセッサとを含み、ゲノム遺伝子座が、ＡＬ
Ｋ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、
ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ
、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ
４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ
、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ
、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥ
Ｔ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、Ｃ
ＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、Ｎ
Ｆ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴ
Ａ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、Ｒ
ＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に対応するシステムを
提供する。
ノム遺伝子座を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リードを受け取る通信イ
ンターフェイスと；通信インターフェイスによって受け取られた複数のポリヌクレオチド
分子の核酸配列リードを記憶するコンピュータメモリと；通信インターフェイスおよびメ
モリに作動可能にカップリングされ、（ｉ）複数の配列リードを、各ファミリーが、鋳型
ポリヌクレオチドのうち１種に由来する配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉ
ｉ）ファミリーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、
（ｉｉｉ）ゲノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコー
ルし、（ｉｖ）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、コール
の中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出
するようにプログラムされたコンピュータプロセッサとを含み、ゲノム遺伝子座が、ＡＬ
Ｋ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、
ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ
、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ
４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ
、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ
、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥ
Ｔ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、Ｃ
ＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、Ｎ
Ｆ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴ
Ａ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、Ｒ
ＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に対応するシステムを
提供する。
【0044】
別の態様において、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２
、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、
ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ
、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ
３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、Ｊ
ＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲ
ＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１
１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、
ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、Ｅ
ＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ
２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される少なくと
も５種の遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子のセットが提供さ
れる。
、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、
ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ
、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ
３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、Ｊ
ＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲ
ＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１
１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、
ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、Ｅ
ＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ
２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される少なくと
も５種の遺伝子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子のセットが提供さ
れる。
【0045】
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド分子は、１０～２００塩基の長さである
。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド分子は、少なくとも５種の遺伝子のエク
ソン領域に選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド
分子は、少なくとも５種の遺伝子における少なくとも３０種のエクソンに選択的にハイブ
リダイズする。一部の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド分子は、少なくとも
３０種のエクソンのそれぞれに選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態において、
各エクソンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子は、少なくとも１種の他のオリ
ゴヌクレオチド分子と重複する配列を有する。
。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド分子は、少なくとも５種の遺伝子のエク
ソン領域に選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド
分子は、少なくとも５種の遺伝子における少なくとも３０種のエクソンに選択的にハイブ
リダイズする。一部の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド分子は、少なくとも
３０種のエクソンのそれぞれに選択的にハイブリダイズする。一部の実施形態において、
各エクソンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子は、少なくとも１種の他のオリ
ゴヌクレオチド分子と重複する配列を有する。
【0046】
別の態様において、キットは、それぞれ異なる分子バーコードを有する複数のライブラ
リーアダプタを含有する第１の容器と、複数の配列決定アダプタを含有する第２の容器で
あって、各配列決定アダプタが、シーケンサーモチーフの少なくとも一部分および任意選
択で試料バーコードを含む第２の容器とを含む。ライブラリーアダプタは、上述または本
明細書の他の箇所に記載のものとなり得る。
リーアダプタを含有する第１の容器と、複数の配列決定アダプタを含有する第２の容器で
あって、各配列決定アダプタが、シーケンサーモチーフの少なくとも一部分および任意選
択で試料バーコードを含む第２の容器とを含む。ライブラリーアダプタは、上述または本
明細書の他の箇所に記載のものとなり得る。
【0047】
一部の実施形態において、配列決定アダプタは、試料バーコードを含む。一部の実施形
態において、ライブラリーアダプタは、平滑末端およびＹ字形であり、８０核酸塩基未満
またはそれに等しい長さである。一部の実施形態において、配列決定アダプタは、末端か
ら末端まで最大７０塩基である。
態において、ライブラリーアダプタは、平滑末端およびＹ字形であり、８０核酸塩基未満
またはそれに等しい長さである。一部の実施形態において、配列決定アダプタは、末端か
ら末端まで最大７０塩基である。
【0048】
別の態様において、無細胞ＤＮＡ試料における配列バリアントを検出するための方法で
あって、９９．９％を超える特異性で、１％未満の濃度の稀なＤＮＡを検出するステップ
を含む方法が提供される。
あって、９９．９％を超える特異性で、１％未満の濃度の稀なＤＮＡを検出するステップ
を含む方法が提供される。
【0049】
別の態様において、方法は、少なくとも１％の検出限界および９９．９％を超える特異
性で、ＤＮＡを含む試料における遺伝的バリアントを検出するステップを含む。一部の実
施形態において、本方法は、少なくとも３０％、４０％または５０％の変換効率で、ｃＤ
ＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）をアダプタタグ付けされたＤＮＡに変換し、偽陽性配列リー
ドを排除することにより配列決定ノイズ（または歪み）を低下させるステップをさらに含
む。
性で、ＤＮＡを含む試料における遺伝的バリアントを検出するステップを含む。一部の実
施形態において、本方法は、少なくとも３０％、４０％または５０％の変換効率で、ｃＤ
ＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）をアダプタタグ付けされたＤＮＡに変換し、偽陽性配列リー
ドを排除することにより配列決定ノイズ（または歪み）を低下させるステップをさらに含
む。
【0050】
別の態様は、（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステッ
プであって、各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップ
と、（ｂ）二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の第１および第２
の相補鎖に異なってタグ付けするステップと、（ｃ）タグ付けされた鎖の少なくとも一部
を配列決定して、配列リードのセットを産生するステップと、（ｄ）配列リードのセット
における冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｅ）配列リードをペア形成
されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであって、（ｉ）各ペ
ア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタ
グ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに
対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにおける配列リード
の中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタグ付けされた相
補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｆ）１種または複数の遺伝
子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉｉ）ペア形成さ
れないリードの定量的尺度を決定するステップと、（ｇ）プログラムされたコンピュータ
プロセッサにより、各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成さ
れないリードの定量的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピング
するセットにおける総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップとを
含む方法を提供する。
プであって、各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップ
と、（ｂ）二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の第１および第２
の相補鎖に異なってタグ付けするステップと、（ｃ）タグ付けされた鎖の少なくとも一部
を配列決定して、配列リードのセットを産生するステップと、（ｄ）配列リードのセット
における冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｅ）配列リードをペア形成
されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであって、（ｉ）各ペ
ア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタ
グ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに
対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにおける配列リード
の中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタグ付けされた相
補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｆ）１種または複数の遺伝
子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉｉ）ペア形成さ
れないリードの定量的尺度を決定するステップと、（ｇ）プログラムされたコンピュータ
プロセッサにより、各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成さ
れないリードの定量的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピング
するセットにおける総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップとを
含む方法を提供する。
【0051】
一部の実施形態において、本方法は、（ｈ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにお
けるステップ（ｇ）において決定された正規化された総定量的尺度を決定し、正規化され
た尺度に基づきコピー数バリエーションを決定することにより、試料におけるコピー数バ
リエーションを検出するステップをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、無細
胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態にお
いて、二重鎖タグは、配列決定アダプタではない。
けるステップ（ｇ）において決定された正規化された総定量的尺度を決定し、正規化され
た尺度に基づきコピー数バリエーションを決定することにより、試料におけるコピー数バ
リエーションを検出するステップをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、無細
胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態にお
いて、二重鎖タグは、配列決定アダプタではない。
【0052】
一部の実施形態において、配列リードのセットにおける冗長性を低下させるステップは
、試料における本来のポリヌクレオチド分子の増幅された産物から産生された配列リード
を、本来のポリヌクレオチド分子に戻るよう崩壊させるステップを含む。一部の実施形態
において、本方法は、本来のポリヌクレオチド分子のコンセンサス配列を決定するステッ
プをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、配列バリアントを含む１種または
複数の遺伝子座におけるポリヌクレオチド分子を同定するステップをさらに含む。一部の
実施形態において、本方法は、遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードの定量的
尺度を決定するステップであって、ペアの両方の鎖は、配列バリアントを含むステップを
さらに含む。一部の実施形態において、本方法は、ペア形成された分子の定量的尺度を決
定するステップであって、ペアの一方のメンバーのみが配列バリアントを有するステップ
、および／または配列バリアントを有するペア形成されない分子の定量的尺度を決定する
ステップをさらに含む。一部の実施形態において、配列バリアントは、単一ヌクレオチド
バリアント、インデル、トランスバージョン、転位置、逆位、欠失、染色体構造変更、遺
伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複および染色体
病変からなる群から選択される。
、試料における本来のポリヌクレオチド分子の増幅された産物から産生された配列リード
を、本来のポリヌクレオチド分子に戻るよう崩壊させるステップを含む。一部の実施形態
において、本方法は、本来のポリヌクレオチド分子のコンセンサス配列を決定するステッ
プをさらに含む。一部の実施形態において、本方法は、配列バリアントを含む１種または
複数の遺伝子座におけるポリヌクレオチド分子を同定するステップをさらに含む。一部の
実施形態において、本方法は、遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードの定量的
尺度を決定するステップであって、ペアの両方の鎖は、配列バリアントを含むステップを
さらに含む。一部の実施形態において、本方法は、ペア形成された分子の定量的尺度を決
定するステップであって、ペアの一方のメンバーのみが配列バリアントを有するステップ
、および／または配列バリアントを有するペア形成されない分子の定量的尺度を決定する
ステップをさらに含む。一部の実施形態において、配列バリアントは、単一ヌクレオチド
バリアント、インデル、トランスバージョン、転位置、逆位、欠失、染色体構造変更、遺
伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複および染色体
病変からなる群から選択される。
【0053】
別の態様は、コンピュータプロセッサによる実行後に、（ａ）二重鎖タグをタグ付けさ
れたポリヌクレオチドの配列リードのセットをメモリに受け取るステップと、（ｂ）配列
リードのセットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｃ）配列リ
ードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであっ
て、（ｉ）各ペア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由
来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成され
た配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにお
ける配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタ
グ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｄ）１種ま
たは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉ
ｉ）ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、（ｅ）各遺伝子座にマ
ッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの定量的尺度に基づき
、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするセットにおける総二本鎖ポリヌ
クレオチド分子の定量的尺度を推定するステップとを含む方法を実施する機械実行可能コ
ードを含むコンピュータ可読媒体を含むシステムを提供する。
れたポリヌクレオチドの配列リードのセットをメモリに受け取るステップと、（ｂ）配列
リードのセットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｃ）配列リ
ードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであっ
て、（ｉ）各ペア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由
来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成され
た配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにお
ける配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタ
グ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｄ）１種ま
たは複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉ
ｉ）ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、（ｅ）各遺伝子座にマ
ッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの定量的尺度に基づき
、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするセットにおける総二本鎖ポリヌ
クレオチド分子の定量的尺度を推定するステップとを含む方法を実施する機械実行可能コ
ードを含むコンピュータ可読媒体を含むシステムを提供する。
【0054】
別の態様は、（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステッ
プであって、各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップ
と、（ｂ）二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の第１および第２
の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、（ｃ）タグ付けされた鎖の少なくとも一部
を配列決定して、配列リードのセットを産生するステップと、（ｄ）配列リードのセット
における冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｅ）配列リードをペア形成
されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであって、（ｉ）各ペ
ア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタ
グ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに
対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにおける配列リード
の中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタグ付けされた相
補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｆ）（ｉ）ペア形成された
リード、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするペア形成されな
いリード、（ｉｉｉ）ペア形成されたリードのリード深度および（ｉｖ）ペア形成されな
いリードのリード深度のうち少なくとも２種の定量的尺度を決定するステップとを含む方
法を提供する。
プであって、各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップ
と、（ｂ）二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の第１および第２
の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、（ｃ）タグ付けされた鎖の少なくとも一部
を配列決定して、配列リードのセットを産生するステップと、（ｄ）配列リードのセット
における冗長性を低下および／または追跡するステップと、（ｅ）配列リードをペア形成
されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステップであって、（ｉ）各ペ
ア形成されたリードが、セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第１のタ
グ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖から生成された配列リードに
対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リードのセットにおける配列リード
の中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２の異なってタグ付けされた相
補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップと、（ｆ）（ｉ）ペア形成された
リード、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするペア形成されな
いリード、（ｉｉｉ）ペア形成されたリードのリード深度および（ｉｖ）ペア形成されな
いリードのリード深度のうち少なくとも２種の定量的尺度を決定するステップとを含む方
法を提供する。
【0055】
一部の実施形態において、（ｆ）は、（ｉ）～（ｉｖ）のうち少なくとも３種の定量的
尺度を決定するステップを含む。一部の実施形態において、（ｆ）は、（ｉ）～（ｉｖ）
のうち全ての定量的尺度を決定するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は
、（ｇ）プログラムされたコンピュータプロセッサにより、各遺伝子座にマッピングする
ペア形成されたリードおよびペア形成されないリードならびにこれらのリード深度の定量
的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするセットにおける
総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップをさらに含む。
尺度を決定するステップを含む。一部の実施形態において、（ｆ）は、（ｉ）～（ｉｖ）
のうち全ての定量的尺度を決定するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は
、（ｇ）プログラムされたコンピュータプロセッサにより、各遺伝子座にマッピングする
ペア形成されたリードおよびペア形成されないリードならびにこれらのリード深度の定量
的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするセットにおける
総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップをさらに含む。
【0056】
別の態様において、方法は、（ａ）対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ
付けして、タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、第１の
タグセットが、複数のタグを含み、第１のタグセットにおける各タグが、同じ対照タグお
よび同定タグを含み、タグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、（ｂ）被
験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験親ポリヌ
クレオチドを産生するステップであって、第２のタグセットが、複数のタグを含み、第２
のタグセットにおける各タグが、対照タグおよび同定タグから識別可能な同じ被験タグを
含み、第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、（ｃ）タグ付けさ
れた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドと混合して、プー
ルを形成するステップと、（ｄ）プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増
幅して、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、（
ｅ）増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定し
て、複数の配列リードを産生するステップと、（ｆ）配列リードをファミリーへと群分け
するステップであって、各ファミリーが、同じ親ポリヌクレオチドから生成された配列リ
ードを含み、この群分けが、任意選択で、同定タグおよび親ポリヌクレオチドの開始／終
了配列由来の情報に基づくステップと、任意選択で、群における複数の配列リード由来の
複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコンセンサス配列を決定するステップと、（ｇ）
被験タグまたは対照タグを有することに基づき、対照親ポリヌクレオチドまたは被験親ポ
リヌクレオチドとして各ファミリーまたはコンセンサス配列を分類するステップと、（ｈ
）少なくとも２種の遺伝子座のそれぞれにマッピングする対照親ポリヌクレオチドおよび
対照被験ポリヌクレオチドの定量的尺度を決定するステップと、（ｉ）少なくとも１種の
遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親ポリヌクレオチドの相対
的分量に基づき、少なくとも１種の遺伝子座における被験親ポリヌクレオチドにおけるコ
ピー数バリエーションを決定するステップとを含む。
付けして、タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、第１の
タグセットが、複数のタグを含み、第１のタグセットにおける各タグが、同じ対照タグお
よび同定タグを含み、タグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、（ｂ）被
験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験親ポリヌ
クレオチドを産生するステップであって、第２のタグセットが、複数のタグを含み、第２
のタグセットにおける各タグが、対照タグおよび同定タグから識別可能な同じ被験タグを
含み、第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、（ｃ）タグ付けさ
れた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドと混合して、プー
ルを形成するステップと、（ｄ）プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増
幅して、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、（
ｅ）増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定し
て、複数の配列リードを産生するステップと、（ｆ）配列リードをファミリーへと群分け
するステップであって、各ファミリーが、同じ親ポリヌクレオチドから生成された配列リ
ードを含み、この群分けが、任意選択で、同定タグおよび親ポリヌクレオチドの開始／終
了配列由来の情報に基づくステップと、任意選択で、群における複数の配列リード由来の
複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコンセンサス配列を決定するステップと、（ｇ）
被験タグまたは対照タグを有することに基づき、対照親ポリヌクレオチドまたは被験親ポ
リヌクレオチドとして各ファミリーまたはコンセンサス配列を分類するステップと、（ｈ
）少なくとも２種の遺伝子座のそれぞれにマッピングする対照親ポリヌクレオチドおよび
対照被験ポリヌクレオチドの定量的尺度を決定するステップと、（ｉ）少なくとも１種の
遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親ポリヌクレオチドの相対
的分量に基づき、少なくとも１種の遺伝子座における被験親ポリヌクレオチドにおけるコ
ピー数バリエーションを決定するステップとを含む。
【0057】
別の態様において、方法は、（ａ）複数の鋳型ポリヌクレオチドから複数の配列リード
を生成するステップであって、各ポリヌクレオチドが、ゲノム遺伝子座にマッピングされ
るステップと、（ｂ）配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファ
ミリーが、鋳型ポリヌクレオチドのうち１種から生成された配列リードを含むステップと
、（ｃ）ファミリーのそれぞれに対しゲノム遺伝子座において塩基（または配列）をコー
ルするステップと、（ｄ）ゲノム遺伝子座において、コールの中のゲノム変更、コールの
中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出す
るステップとを含む。
を生成するステップであって、各ポリヌクレオチドが、ゲノム遺伝子座にマッピングされ
るステップと、（ｂ）配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファ
ミリーが、鋳型ポリヌクレオチドのうち１種から生成された配列リードを含むステップと
、（ｃ）ファミリーのそれぞれに対しゲノム遺伝子座において塩基（または配列）をコー
ルするステップと、（ｄ）ゲノム遺伝子座において、コールの中のゲノム変更、コールの
中の遺伝子変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出す
るステップとを含む。
【0058】
一部の実施形態において、コールは、系統発生解析、投票、秤量、ファミリーにおける
遺伝子座における各リードへの確率の割り当ておよび最高確率での塩基のコールのいずれ
かを含む。一部の実施形態において、本方法は、２種の遺伝子座において行われ、遺伝子
座のそれぞれにおける計数に基づき、遺伝子座のうち１種におけるＣＮＶを決定するステ
ップを含む。
遺伝子座における各リードへの確率の割り当ておよび最高確率での塩基のコールのいずれ
かを含む。一部の実施形態において、本方法は、２種の遺伝子座において行われ、遺伝子
座のそれぞれにおける計数に基づき、遺伝子座のうち１種におけるＣＮＶを決定するステ
ップを含む。
【0059】
別の態様は、試料における二本鎖ＤＮＡ断片の数を示す定量的尺度を決定するための方
法であって、（ａ）両方の鎖が検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステ
ップと、（ｂ）ＤＮＡ鎖の一方のみが検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定す
るステップと、（ｃ）上述の（ａ）および（ｂ）から、どちらの鎖も検出されなかった個
々のＤＮＡ分子の定量的尺度を推測するステップと、（ｄ）（ａ）～（ｃ）を使用して、
試料における個々の二本鎖ＤＮＡ断片の数を示す定量的尺度を決定するステップとを含む
方法を提供する。
法であって、（ａ）両方の鎖が検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステ
ップと、（ｂ）ＤＮＡ鎖の一方のみが検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定す
るステップと、（ｃ）上述の（ａ）および（ｂ）から、どちらの鎖も検出されなかった個
々のＤＮＡ分子の定量的尺度を推測するステップと、（ｄ）（ａ）～（ｃ）を使用して、
試料における個々の二本鎖ＤＮＡ断片の数を示す定量的尺度を決定するステップとを含む
方法を提供する。
【0060】
一部の実施形態において、本方法は、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにおけるス
テップ（ｄ）において決定された正規化された定量的尺度を決定し、正規化された尺度に
基づきコピー数バリエーションを決定することにより、試料におけるコピー数バリエーシ
ョンを検出するステップをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、無細胞核酸か
ら実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む。
テップ（ｄ）において決定された正規化された定量的尺度を決定し、正規化された尺度に
基づきコピー数バリエーションを決定することにより、試料におけるコピー数バリエーシ
ョンを検出するステップをさらに含む。一部の実施形態において、試料は、無細胞核酸か
ら実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む。
【0061】
一部の実施形態において、個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップは、ＤＮ
Ａ分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップを含み、各二重鎖タグは、試料にお
ける二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖を異なってタグ付けして、タグ付けされた鎖を用意する。
一部の実施形態において、本方法は、タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して
、配列リードのセットを産生するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方
法は、配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードは、セットにおける二本鎖ポリヌクレオ
チド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖
から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードは、配列リード
のセットにおける配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２
の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップを含
む。一部の実施形態において、本方法は、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピ
ングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉｉ）ペア形成されないリードの定量的尺
度を決定して、各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されな
いリードの定量的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする
試料における総二本鎖ＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む。
Ａ分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップを含み、各二重鎖タグは、試料にお
ける二本鎖ＤＮＡ分子の相補鎖を異なってタグ付けして、タグ付けされた鎖を用意する。
一部の実施形態において、本方法は、タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して
、配列リードのセットを産生するステップをさらに含む。一部の実施形態において、本方
法は、配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードは、セットにおける二本鎖ポリヌクレオ
チド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖
から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードは、配列リード
のセットにおける配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来する第２
の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステップを含
む。一部の実施形態において、本方法は、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピ
ングする（ｉ）ペア形成されたリードおよび（ｉｉ）ペア形成されないリードの定量的尺
度を決定して、各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されな
いリードの定量的尺度に基づき、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする
試料における総二本鎖ＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む。
【0062】
別の態様において、配列決定アッセイにおける歪みを低下させるための方法は、（ａ）
対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対照親ポリ
ヌクレオチドを産生するステップと、（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセット
をタグ付けして、タグ付けされた被験親ポリヌクレオチドを産生するステップと、（ｃ）
タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドと混合
して、プールを形成するステップと、（ｄ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドおよ
びタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドの分量を決定するステップと、（ｅ）タグ付け
された対照親ポリヌクレオチドの分量を使用して、タグ付けされた被験親ポリヌクレオチ
ドの分量における歪みを低下させるステップとを含む。
対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対照親ポリ
ヌクレオチドを産生するステップと、（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセット
をタグ付けして、タグ付けされた被験親ポリヌクレオチドを産生するステップと、（ｃ）
タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドと混合
して、プールを形成するステップと、（ｄ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドおよ
びタグ付けされた被験親ポリヌクレオチドの分量を決定するステップと、（ｅ）タグ付け
された対照親ポリヌクレオチドの分量を使用して、タグ付けされた被験親ポリヌクレオチ
ドの分量における歪みを低下させるステップとを含む。
【0063】
一部の実施形態において、第１のタグセットは、複数のタグを含み、第１のタグセット
における各タグは、同じ対照タグおよび同定タグを含み、第１のタグセットは、複数の異
なる同定タグを含む。一部の実施形態において、第２のタグセットは、複数のタグを含み
、第２のタグセットにおける各タグは、同じ被験タグおよび同定タグを含み、被験タグは
、対照タグから識別可能であり、第２のタグセットは、複数の異なる同定タグを含む。一
部の実施形態において、（ｄ）は、プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを
増幅して、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、
増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定して、
複数の配列リードを産生するステップとを含む。一部の実施形態において、本方法は、配
列リードをファミリーへと群分けするステップをさらに含み、各ファミリーは、同じ親ポ
リヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けは、任意選択で、同定タグ
および親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任意選択で
、群における複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコンセンサ
ス配列を決定するステップを含む。
における各タグは、同じ対照タグおよび同定タグを含み、第１のタグセットは、複数の異
なる同定タグを含む。一部の実施形態において、第２のタグセットは、複数のタグを含み
、第２のタグセットにおける各タグは、同じ被験タグおよび同定タグを含み、被験タグは
、対照タグから識別可能であり、第２のタグセットは、複数の異なる同定タグを含む。一
部の実施形態において、（ｄ）は、プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを
増幅して、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、
増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定して、
複数の配列リードを産生するステップとを含む。一部の実施形態において、本方法は、配
列リードをファミリーへと群分けするステップをさらに含み、各ファミリーは、同じ親ポ
リヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けは、任意選択で、同定タグ
および親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任意選択で
、群における複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコンセンサ
ス配列を決定するステップを含む。
【0064】
一部の実施形態において、（ｄ）は、遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチ
ドおよび対照親ポリヌクレオチドの相対的分量に基づき、１種を超えるまたはそれに等し
い遺伝子座における被験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定する
ステップを含む。
ドおよび対照親ポリヌクレオチドの相対的分量に基づき、１種を超えるまたはそれに等し
い遺伝子座における被験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定する
ステップを含む。
【0065】
別の態様は、（ａ）二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド由来の挿入物を含み、４～百万種の
間の異なるタグを有するタグ付けされたライブラリーを産生するように、アダプタを二本
鎖ＤＮＡポリヌクレオチドにライゲーションするステップであって、ライゲーションが、
単一の反応容器内で行われ、アダプタが、分子バーコードを含むステップと、（ｂ）タグ
付けされたライブラリーにおける二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドのそれぞれの複数の配列
リードを生成するステップと、（ｃ）タグにおける情報および挿入物の末端における情報
に基づき、配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、
二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの中の単一ＤＮＡポリヌクレオチドから生成された配列リ
ードを含むステップと、（ｄ）ファミリーのメンバーにおける位置における塩基に基づき
、二本鎖ＤＮＡ分子における各位置における塩基をコールするステップとを含む方法を提
供する。一部の実施形態において、（ｂ）は、タグ付けされたライブラリーにおける二本
鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子のそれぞれを増幅して、増幅産物を生成するステップと、
増幅産物を配列決定するステップとを含む。一部の実施形態において、本方法は、二本鎖
ＤＮＡポリヌクレオチド分子を複数回配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形
態において、（ｂ）は、挿入物全体を配列決定するステップを含む。一部の実施形態にお
いて、（ｃ）は、各ファミリーにおける配列リードを崩壊させて、コンセンサス配列を生
成するステップをさらに含む。一部の実施形態において、（ｄ）は、配列リードの少なく
ともサブセット由来の複数の連続的塩基をコールして、二本鎖ＤＮＡ分子における単一ヌ
クレオチドバリエーション（ＳＮＶ）を同定するステップを含む。
間の異なるタグを有するタグ付けされたライブラリーを産生するように、アダプタを二本
鎖ＤＮＡポリヌクレオチドにライゲーションするステップであって、ライゲーションが、
単一の反応容器内で行われ、アダプタが、分子バーコードを含むステップと、（ｂ）タグ
付けされたライブラリーにおける二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドのそれぞれの複数の配列
リードを生成するステップと、（ｃ）タグにおける情報および挿入物の末端における情報
に基づき、配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、
二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの中の単一ＤＮＡポリヌクレオチドから生成された配列リ
ードを含むステップと、（ｄ）ファミリーのメンバーにおける位置における塩基に基づき
、二本鎖ＤＮＡ分子における各位置における塩基をコールするステップとを含む方法を提
供する。一部の実施形態において、（ｂ）は、タグ付けされたライブラリーにおける二本
鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子のそれぞれを増幅して、増幅産物を生成するステップと、
増幅産物を配列決定するステップとを含む。一部の実施形態において、本方法は、二本鎖
ＤＮＡポリヌクレオチド分子を複数回配列決定するステップをさらに含む。一部の実施形
態において、（ｂ）は、挿入物全体を配列決定するステップを含む。一部の実施形態にお
いて、（ｃ）は、各ファミリーにおける配列リードを崩壊させて、コンセンサス配列を生
成するステップをさらに含む。一部の実施形態において、（ｄ）は、配列リードの少なく
ともサブセット由来の複数の連続的塩基をコールして、二本鎖ＤＮＡ分子における単一ヌ
クレオチドバリエーション（ＳＮＶ）を同定するステップを含む。
【0066】
別の態様は、体細胞および疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含む試料から疾患細胞異
種性を検出する方法を提供する。本方法は、複数の遺伝子座のそれぞれにヌクレオチド配
列バリアントを有する試料におけるポリヌクレオチドを定量化するステップと、複数の遺
伝子座のそれぞれにおけるコピー数バリエーション（ＣＮＶ）を決定するステップであっ
て、ＣＮＶが、疾患細胞ポリヌクレオチドにおける遺伝子座の遺伝子量を示すステップと
、プログラムされたコンピュータプロセッサにより、複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子
座における遺伝子量当たりの遺伝子座における配列バリアントを有するポリヌクレオチド
の分量の相対的尺度を決定するステップと、複数の遺伝子座のそれぞれにおける相対的尺
度を比較するステップであって、異なる相対的尺度が、腫瘍異種性を示すステップとを含
む。
種性を検出する方法を提供する。本方法は、複数の遺伝子座のそれぞれにヌクレオチド配
列バリアントを有する試料におけるポリヌクレオチドを定量化するステップと、複数の遺
伝子座のそれぞれにおけるコピー数バリエーション（ＣＮＶ）を決定するステップであっ
て、ＣＮＶが、疾患細胞ポリヌクレオチドにおける遺伝子座の遺伝子量を示すステップと
、プログラムされたコンピュータプロセッサにより、複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子
座における遺伝子量当たりの遺伝子座における配列バリアントを有するポリヌクレオチド
の分量の相対的尺度を決定するステップと、複数の遺伝子座のそれぞれにおける相対的尺
度を比較するステップであって、異なる相対的尺度が、腫瘍異種性を示すステップとを含
む。
【0067】
別の態様において、方法は、対象を１または複数のパルス治療サイクルに供するステッ
プであって、各パルス治療サイクルが、（ａ）第１の量で薬物が投与される第１の期間お
よび（ｂ）第２の低下した量で薬物が投与される第２の期間を含むステップを含み、（ｉ
）第１の期間は、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ
、（ｉｉ）第２の期間は、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴
付けられる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料における個々の二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の数を示す定量的尺度を決
定するための方法であって、
（ａ）両方の鎖が検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップと、
（ｂ）ＤＮＡ鎖の一方のみが検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステッ
プと、
（ｃ）上述の（ａ）および（ｂ）から、どちらの鎖も検出されなかった個々のＤＮＡ分子
の定量的尺度を推測するステップと、
（ｄ）（ａ）～（ｃ）を使用して、前記試料における個々の二本鎖ＤＮＡ分子の数を示す
前記定量的尺度を決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
１種または複数の遺伝子座のそれぞれにおけるステップ（ｄ）において決定された正規
化された定量的尺度を決定し、前記正規化された尺度に基づきコピー数バリエーションを
決定することにより、前記試料におけるコピー数バリエーションを検出するステップをさ
らに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、無細胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、
項目１に記載の方法。
（項目４）
個々のＤＮＡ分子の前記定量的尺度を決定するステップが、前記ＤＮＡ分子に二重鎖タ
グのセットをタグ付けするステップを含み、各二重鎖タグが、前記試料における二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の相補鎖を異なってタグ付けして、タグ付けされた鎖を用意する、項目１に記載
の方法。
（項目５）
前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産生す
るステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステッ
プであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオ
チド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖
から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リード
の前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来
する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステ
ップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成されたリー
ドおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定して、各遺伝子座にマ
ッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの前記定量的尺度に基
づき、前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする前記試料における総二
本鎖ＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
配列決定アッセイにおける歪みを低下させるための方法であって、
（ａ）対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対照
親ポリヌクレオチドを産生するステップと、
（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験
親ポリヌクレオチドを産生するステップと、
（ｃ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチド
と混合して、プールを形成するステップと、
（ｄ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドおよびタグ付けされた被験親ポリヌクレオ
チドの分量を決定するステップと、
（ｅ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドの前記分量を使用して、タグ付けされた被
験親ポリヌクレオチドの前記分量における歪みを低下させるステップと
を含む方法。
（項目９）
前記第１のタグセットが、複数のタグを含み、前記第１のタグセットにおける各タグが
、同じ対照タグおよび同定タグを含み、前記第１のタグセットが、複数の異なる同定タグ
を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第２のタグセットが、複数のタグを含み、前記第２のタグセットにおける各タグが
、同じ被験タグおよび同定タグを含み、前記被験タグが、前記対照タグから識別可能であ
り、前記第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｄ）が、前記プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅さ
れたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、前記増幅されたプ
ールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列リ
ードを産生するステップとを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、同じ親ポ
リヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けが、任意選択で、同定タグ
および前記親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任意選
択で、群における前記複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコ
ンセンサス配列を決定するステップとをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
（ｄ）が、遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親ポリヌクレ
オチドの相対的分量に基づき、１種を超えるまたはそれに等しい前記遺伝子座における前
記被験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定するステップを含む、
項目８に記載の方法。
（項目１４）
分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含むライブラリーアダプタのセ
ットであって、前記複数のポリヌクレオチド分子が、８０ヌクレオチド塩基未満またはそ
れに等しい長さであり、前記分子バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さで
あり、
（ａ）前記分子バーコードが、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し
、
（ｂ）前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１
ヌクレオチド塩基離れて位置し、
（ｃ）任意選択で、少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおいて
同一であり、
（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを含有しない
ライブラリーアダプタのセット。
（項目１５）
前記ポリヌクレオチド分子が、前記分子バーコードを除いて同一である、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１６）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、二本鎖部分および少なくとも１個の一
本鎖部分を有する、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１７）
前記二本鎖部分が、複数の前記分子バーコードの中の１つの分子バーコードを有する、
項目１６に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１８）
前記所与の分子バーコードが、ランダマーである、項目１７に記載のライブラリーアダ
プタのセット。
（項目１９）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、前記少なくとも１個の一本鎖部分に鎖
同定バーコードをさらに含む、項目１６に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２０）
前記鎖同定バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基を含む、項目１９に記載のラ
イブラリーアダプタのセット。
（項目２１）
前記一本鎖部分が、部分的シーケンサーモチーフを有する、項目１６に記載のライブラ
リーアダプタのセット。
（項目２２）
前記ポリヌクレオチド分子が、同じである末端ヌクレオチドの配列を有する、項目１４
に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２３）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、Ｙ字形、バブル形またはヘアピン形で
ある、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２４）
前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、試料同定モチーフを含有しない、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２５）
前記分子バーコードが、少なくとも１０ヌクレオチド塩基の長さである、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２６）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、１０ヌクレオチド塩基～６０ヌクレオ
チド塩基の長さである、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２７）
前記少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおいて同一である、
項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２８）
前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１０ヌ
クレオチド塩基離れて位置する、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２９）
前記複数のポリヌクレオチド分子から本質的になる、項目１４に記載のライブラリーア
ダプタのセット。
（項目３０）
（ａ）項目１４に記載のアダプタのライブラリー由来の複数のポリヌクレオチド分子を
ポリヌクレオチドのコレクションにタグ付けして、タグ付けされたポリヌクレオチドのコ
レクションを作製するステップと、
（ｂ）配列決定アダプタの存在下で、タグ付けされたポリヌクレオチドの前記コレクショ
ンを増幅するステップであって、前記配列決定アダプタが、前記複数のポリヌクレオチド
分子における相補的配列に選択的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するプラ
イマーを有するステップと
を含む方法。
（項目３１）
本来のＤＮＡ断片の異種性集団における稀なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を検出または
定量化するための方法であって、前記稀なＤＮＡが、１％未満である濃度を有し、前記方
法が、
（ａ）前記本来のＤＮＡ断片の３０％超が、分子バーコードを含むライブラリーアダプタ
を両端にタグ付けされるように、単一の反応において前記本来のＤＮＡ断片にタグ付けし
、これにより、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意するステップと、
（ｂ）前記タグ付けされたＤＮＡ断片において高忠実度増幅を行うステップと、
（ｃ）任意選択で、前記タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを選択的に濃縮するステ
ップと、
（ｄ）前記タグ付けされ、増幅され、任意選択で選択的に濃縮されたＤＮＡ断片の一方ま
たは両方の鎖を配列決定して、前記分子バーコードおよび前記本来のＤＮＡ断片の少なく
とも一部分のヌクレオチド配列を含む配列リードを得るステップと、
（ｅ）前記配列リードから、前記本来のＤＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセンサスリ
ードを決定するステップと、
（ｆ）前記コンセンサスリードを定量化して、９９．９％を超える特異性で、前記稀なＤ
ＮＡを検出または定量化するステップと
を含む方法。
（項目３２）
ステップ（ｅ）が、同じまたは類似の分子バーコードおよび同じまたは類似の断片配列
の末端を有する配列リードを比較するステップを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記比較するステップが、同じまたは類似の分子バーコードを有する前記配列リードに
おける系統発生解析を実行するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記分子バーコードが、最大３の編集距離を有するバーコードを含む、項目３２に記載
の方法。
（項目３５）
前記断片配列の末端が、最大３の編集距離を有する断片配列を含む、項目３１に記載の
方法。
（項目３６）
配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステッ
プと、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするペア形成されたリードおよ
びペア形成されないリードの数を定量化するステップとをさらに含む、項目３１に記載の
方法。
（項目３７）
前記タグ付けが、本来のＤＮＡ断片と比較して過剰量のライブラリーアダプタを有する
ことにより起こる、項目３１に記載の方法。
（項目３８）
前記分子バーコードおよび前記本来のＤＮＡ断片のそれぞれの少なくとも一端由来の配
列情報に従って前記配列リードをビニングして、一本鎖リードのビンを作製するステップ
をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
各ビンにおいて、配列リードを解析することにより、前記本来のＤＮＡ断片の中の所与
の本来のＤＮＡ断片の配列を決定するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記タグ付けされ、増幅され、任意選択で濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノ
ムの各位置において各塩基が生じる回数を比較することにより、前記稀なＤＮＡを検出ま
たは定量化するステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを選択的に濃縮するステップをさらに含む
、項目３１に記載の方法。
（項目４２）
濃縮後に、プライマーを含む配列決定アダプタの存在下で、前記濃縮されたタグ付けさ
れたＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＤＮＡ断片が、項目１に記載のアダプタのライブラリー由来のポリヌクレオチド分
子をタグ付けされる、項目３１に記載の方法。
（項目４４）
対象の核酸試料を処理および／または解析するための方法であって、
（ａ）前記核酸試料由来のポリヌクレオチド断片をライブラリーアダプタのセットに曝露
して、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生成するステップと、
（ｂ）前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片の増幅産物として増幅されたポリヌクレ
オチド断片を生じる条件下で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片を核酸増幅反応
に供するステップとを含み、
前記ライブラリーアダプタのセットが、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチ
ド分子を含み、前記複数のポリヌクレオチド分子が、８０ヌクレオチド塩基未満またはそ
れに等しい長さであり、前記分子バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さで
あり、
（１）前記分子バーコードが、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有
し、
（２）前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも
１ヌクレオチド塩基離れて位置し、
（３）任意選択で、少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおい
て同一であり、
（４）前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを含有しない
方法。
（項目４５）
前記増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配列を決定するス
テップをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片の前記ヌクレオチド配列が、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）なしで決定される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
プログラムされたコンピュータプロセッサにより前記ヌクレオチド配列を解析して、前
記対象の前記ヌクレオチド試料における１種または複数の遺伝的バリアントを同定するス
テップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸試料が、無細胞核酸試料である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記核酸試料の前記ポリヌクレオチド断片を前記複数のポリヌクレオチド分子に曝露す
るステップが、少なくとも１０％の変換効率で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド断
片を生じる、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記供するステップが、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ
Ｂ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥ
Ｎ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ
１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、Ｆ
ＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２
、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、
ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴ
Ｋ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ
１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１
、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、Ｍ
ＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される遺伝
子に対応する配列から前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片を増幅するステップを含
む、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
（ａ）複数のポリヌクレオチド分子から複数の配列リードを生成するステップであって
、前記複数のポリヌクレオチド分子が、標的ゲノムのゲノム遺伝子座を網羅し、前記ゲノ
ム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢ
ＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１
、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴ
ＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、Ｇ
ＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２
、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、
ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、Ｖ
ＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮ
Ｄ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１
、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２
、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に
対応するステップと、
（ｂ）コンピュータプロセッサにより、前記複数の配列リードをファミリーへと群分けす
るステップであって、各ファミリーが、鋳型ポリヌクレオチドのうち１種に由来する配列
リードを含むステップと、
（ｃ）前記ファミリーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生
成するステップと、
（ｄ）前記ゲノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座において前記コンセンサス配列を
コールするステップと、
（ｅ）前記所与のゲノム遺伝子座において、
ｉ．前記コールの中の遺伝的バリアント、
ｉｉ．前記コールの中の遺伝子変更の頻度、
ｉｉｉ．コールの総数、および
ｉｖ．前記コールの中の変更の総数
のいずれかを検出するステップと
を含む方法。
（項目５２）
各ファミリーが、前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種のみに由来する配列リードを含
む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ゲノム遺伝子座の中の追加的なゲノム遺伝子座において（ｄ）～（ｅ）を行うステ
ップをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、前記
所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリ
エーションを決定するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記群分けするステップが、（ｉ）前記複数のポリヌクレオチド分子にカップリングさ
れた別個の分子バーコードおよび（ｉｉ）前記複数の配列リードの間の類似性を同定する
ことにより、前記複数の配列リードをファミリーへと分類するステップを含み、各ファミ
リーが、分子バーコードおよび類似または同一の配列リードの別個の組合せに関連する複
数の核酸配列を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記コンセンサス配列が、前記配列リードのそれぞれの定量的尺度または統計的有意性
レベルを評価することにより生成される、項目５１に記載の方法。
（項目５７）
前記複数の遺伝子が、前記群から選択される前記複数の遺伝子のうち少なくとも１０種
を含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５８）
（ａ）単一の反応容器内に鋳型ポリヌクレオチド分子およびライブラリーアダプタのセ
ットを用意するステップであって、前記ライブラリーアダプタが、異なる分子バーコード
を有するポリヌクレオチド分子であり、前記ライブラリーアダプタのいずれも、完全シー
ケンサーモチーフを含有しないステップと、
（ｂ）前記単一の反応容器内で、少なくとも１０％の効率で、前記ライブラリーアダプタ
を前記鋳型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、複数の異なるタグ付け
組合せの中にあるタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タグ付けさ
れたポリヌクレオチド分子を産生するステップと、
（ｃ）前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子の増幅産物として増幅されたポリヌクレ
オチド分子を生じる条件下で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子を増幅反応に供
するステップと、
（ｄ）前記増幅されたポリヌクレオチド分子を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目５９）
前記ライブラリーアダプタが、前記分子バーコードを除いて同一である、項目５８に記
載の方法。
（項目６０）
前記ライブラリーアダプタのそれぞれが、二本鎖部分および少なくとも１個の一本鎖部
分を有し、前記一本鎖部分が、部分的シーケンサーモチーフを有する、項目５８に記載の
方法。
（項目６１）
前記ライブラリーアダプタが、前記鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリングす
る、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記効率が、少なくとも３０％である、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺伝的バリアントを同定するス
テップをさらに含む、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記配列決定するステップが、（ｉ）前記増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物
として追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、前記増幅されたポリ
ヌクレオチド分子を追加的な増幅反応に供するステップと、（ｉｉ）前記追加的な増幅さ
れたポリヌクレオチド分子を配列決定するステップとを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６５）
前記追加的な増幅が、配列決定アダプタの存在下で行われる、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
（ｂ）および（ｃ）が、前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子をアリコートにする
ことなく行われる、項目５８に記載の方法。
（項目６７）
対象の標的核酸分子を解析するためのシステムであって、
標的ゲノムのゲノム遺伝子座を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リード
を受け取る通信インターフェイスと、
前記通信インターフェイスによって受け取られた前記複数のポリヌクレオチド分子の前
記核酸配列リードを記憶するコンピュータメモリと、
前記通信インターフェイスおよび前記メモリに作動可能にカップリングされ、（ｉ）前
記複数の配列リードを、各ファミリーが、前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種に由来す
る配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉｉ）前記ファミリーのそれぞれに対し
、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、（ｉｉｉ）前記ゲノム遺伝子座の
中の所与のゲノム遺伝子座において前記コンセンサス配列をコールし、（ｉｖ）前記所与
のゲノム遺伝子座において、前記コールの中の遺伝的バリアント、前記コールの中の遺伝
子変更の頻度、コールの総数および前記コールの中の変更の総数のいずれかを検出するよ
うにプログラムされたコンピュータプロセッサと
を含み、前記ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、
ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、
ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、
ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ
３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、Ｉ
ＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦ
ＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ
、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、Ｂ
ＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣ
ＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡ
Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択され
る複数の遺伝子に対応する
システム。
（項目６８）
ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲ
ＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、
ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、Ｅ
ＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、Ｇ
ＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、
ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１
、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲ
Ｔ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ
６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、
ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ
２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される少なくとも５種の遺伝子に選
択的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子のセット。
（項目６９）
前記オリゴヌクレオチド分子が、１０～２００塩基の長さである、項目６８に記載のセ
ット。
（項目７０）
前記オリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも５種の遺伝子のエクソン領域に選択的
にハイブリダイズする、項目６８に記載のキット。
（項目７１）
前記オリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも５種の遺伝子における少なくとも３０
種のエクソンに選択的にハイブリダイズする、項目７０に記載のキット。
（項目７２）
複数のオリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも３０種のエクソンのそれぞれに選択
的にハイブリダイズする、項目７１に記載のキット。
（項目７３）
各エクソンにハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも１種の他
のオリゴヌクレオチド分子と重複する配列を有する、項目７２に記載のキット。
（項目７４）
それぞれ異なる分子バーコードを有する複数のライブラリーアダプタを含有する第１の
容器と、
複数の配列決定アダプタを含有する第２の容器であって、各配列決定アダプタが、シー
ケンサーモチーフの少なくとも一部分および任意選択で試料バーコードを含む第２の容器
と
を含むキット。
（項目７５）
前記配列決定アダプタが、前記試料バーコードを含む、項目７４に記載のキット。
（項目７６）
無細胞ＤＮＡ試料における配列バリアントを検出するための方法であって、９９．９％
を超える特異性で、１％未満の濃度の稀なＤＮＡを検出するステップを含む、方法。
（項目７７）
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステップであって、
各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップと、
（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第１お
よび第２の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、
（ｃ）前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産
生するステップと、
（ｄ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｅ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｆ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成された
リードおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、
（ｇ）プログラムされたコンピュータプロセッサにより、各遺伝子座にマッピングするペ
ア形成されたリードおよびペア形成されないリードの前記定量的尺度に基づき、前記１種
または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする前記セットにおける総二本鎖ポリヌク
レオチド分子の定量的尺度を推定するステップと
を含む方法。
（項目７８）
（ｈ）前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにおけるステップ（ｇ）において決定
された正規化された総定量的尺度を決定し、前記正規化された尺度に基づきコピー数バリ
エーションを決定することにより、前記試料におけるコピー数バリエーションを検出する
ステップをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記試料が、無細胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、
項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記二重鎖タグが、配列決定アダプタではない、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
配列リードの前記セットにおける冗長性を低下させるステップが、前記試料における本
来のポリヌクレオチド分子の増幅された産物から産生された配列リードを、前記本来のポ
リヌクレオチド分子に戻るよう崩壊させるステップを含む、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記本来のポリヌクレオチド分子のコンセンサス配列を決定するステップをさらに含む
、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
配列バリアントを含む１種または複数の遺伝子座におけるポリヌクレオチド分子を同定
するステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードの定量的尺度を決定するステップであ
って、前記ペアの両方の鎖が、配列バリアントを含むステップをさらに含む、項目８２に
記載の方法。
（項目８５）
ペア形成された分子の定量的尺度を決定するステップであって、前記ペアの一方のメン
バーのみが配列バリアントを有するステップ、および／または配列バリアントを有するペ
ア形成されない分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む、項目８４に記載の方
法。
（項目８６）
（ａ）シーケンサーからメモリへと、二重鎖タグをタグ付けされたポリヌクレオチドの
配列リードのセットを受け取るステップと、
（ｂ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｃ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｄ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成された
リードおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、
（ｅ）各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリード
の前記定量的尺度に基づき、前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする
前記セットにおける総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップと
を含む方法。
（項目８７）
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステップであって、
各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップと、
（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第１お
よび第２の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、
（ｃ）前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産
生するステップと、
（ｄ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｅ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｆ）（ｉ）前記ペア形成されたリード、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれ
にマッピングする前記ペア形成されないリード、（ｉｉｉ）前記ペア形成されたリードの
リード深度および（ｉｖ）ペア形成されないリードのリード深度のうち少なくとも２種の
定量的尺度を決定するステップと
を含む方法。
（項目８８）
（ａ）対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対
照親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、前記第１のタグセットが、複数のタ
グを含み、前記第１のタグセットにおける各タグが、同じ対照タグおよび同定タグを含み
、前記タグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、
（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験
親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、前記第２のタグセットが、複数のタグ
を含み、前記第２のタグセットにおける各タグが、前記対照タグおよび同定タグから識別
可能な同じ被験タグを含み、前記第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含むステ
ップと、
（ｃ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチド
と混合して、プールを形成するステップと、
（ｄ）前記プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅されたタ
グ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、
（ｅ）前記増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列
決定して、複数の配列リードを産生するステップと、
（ｆ）配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、同じ
親ポリヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けが、任意選択で、同定
タグおよび前記親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任
意選択で、群における前記複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれ
のコンセンサス配列を決定するステップと、
（ｇ）被験タグまたは対照タグを有することに基づき、対照親ポリヌクレオチドまたは被
験親ポリヌクレオチドとして各ファミリーまたはコンセンサス配列を分類するステップと
、
（ｈ）少なくとも２種の遺伝子座のそれぞれにマッピングする対照親ポリヌクレオチドお
よび対照被験ポリヌクレオチドの定量的尺度を決定するステップと、
（ｉ）少なくとも１種の遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親
ポリヌクレオチドの相対的分量に基づき、前記少なくとも１種の遺伝子座における前記被
験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定するステップと
を含む方法。
（項目８９）
（ａ）複数の鋳型ポリヌクレオチドから複数の配列リードを生成するステップであって
、各ポリヌクレオチドが、ゲノム遺伝子座にマッピングされるステップと、
（ｂ）前記配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、
前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種から生成された配列リードを含むステップと、
（ｃ）前記ファミリーのそれぞれに対し前記ゲノム遺伝子座においてヌクレオチド塩基ま
たは配列をコールするステップと、
（ｄ）前記ゲノム遺伝子座において、
ｉ．前記コールの中のゲノム変更、
ｉｉ．前記コールの中の遺伝子変更の頻度、
ｉｉｉ．コールの総数、
ｉｖ．前記コールの中の変更の総数
のいずれかを検出するステップと
を含む方法。
（項目９０）
コールが、系統発生解析、投票、秤量、ファミリーにおける前記遺伝子座における各リ
ードへの確率の割り当ておよび最高確率での前記ヌクレオチド塩基のコールのいずれかを
含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
２種の遺伝子座において行われ、前記遺伝子座のそれぞれにおける計数に基づき、前記
遺伝子座のうち１種におけるＣＮＶを決定するステップを含む、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
（ａ）二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチド由来の挿入物を含み、４～
百万種の間の異なるタグを有するタグ付けされたライブラリーを産生するように、アダプ
タを前記二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドにライゲーションするステップであって、ライゲ
ーションが、単一の反応容器内で行われ、前記アダプタが、分子バーコードを含むステッ
プと、
（ｂ）前記タグ付けされたライブラリーにおける前記二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドのそ
れぞれの複数の配列リードを生成するステップと、
（ｃ）タグにおける情報および前記挿入物の末端における情報に基づき、配列リードをフ
ァミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、前記二本鎖ＤＮＡポリヌク
レオチドの中の単一ＤＮＡポリヌクレオチドから生成された配列リードを含むステップと
、
（ｄ）ファミリーのメンバーにおける位置におけるヌクレオチド塩基に基づき、前記二本
鎖ＤＮＡ分子における前記各位置におけるヌクレオチド塩基をコールするステップと
を含む方法。
（項目９３）
（ｄ）が、前記配列リードの少なくともサブセット由来の複数の連続的塩基をコールし
て、前記二本鎖ＤＮＡ分子における単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）を同定す
るステップを含む、項目９３に記載の方法。
プであって、各パルス治療サイクルが、（ａ）第１の量で薬物が投与される第１の期間お
よび（ｂ）第２の低下した量で薬物が投与される第２の期間を含むステップを含み、（ｉ
）第１の期間は、第１の臨床レベルを上回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けられ
、（ｉｉ）第２の期間は、第２の臨床レベルを下回って検出される腫瘍負荷によって特徴
付けられる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料における個々の二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の数を示す定量的尺度を決
定するための方法であって、
（ａ）両方の鎖が検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップと、
（ｂ）ＤＮＡ鎖の一方のみが検出された個々のＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステッ
プと、
（ｃ）上述の（ａ）および（ｂ）から、どちらの鎖も検出されなかった個々のＤＮＡ分子
の定量的尺度を推測するステップと、
（ｄ）（ａ）～（ｃ）を使用して、前記試料における個々の二本鎖ＤＮＡ分子の数を示す
前記定量的尺度を決定するステップと
を含む方法。
（項目２）
１種または複数の遺伝子座のそれぞれにおけるステップ（ｄ）において決定された正規
化された定量的尺度を決定し、前記正規化された尺度に基づきコピー数バリエーションを
決定することにより、前記試料におけるコピー数バリエーションを検出するステップをさ
らに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、無細胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、
項目１に記載の方法。
（項目４）
個々のＤＮＡ分子の前記定量的尺度を決定するステップが、前記ＤＮＡ分子に二重鎖タ
グのセットをタグ付けするステップを含み、各二重鎖タグが、前記試料における二本鎖Ｄ
ＮＡ分子の相補鎖を異なってタグ付けして、タグ付けされた鎖を用意する、項目１に記載
の方法。
（項目５）
前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産生す
るステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステッ
プであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオ
チド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相補鎖
から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リード
の前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に由来
する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表すステ
ップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成されたリー
ドおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定して、各遺伝子座にマ
ッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの前記定量的尺度に基
づき、前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする前記試料における総二
本鎖ＤＮＡ分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
配列決定アッセイにおける歪みを低下させるための方法であって、
（ａ）対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対照
親ポリヌクレオチドを産生するステップと、
（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験
親ポリヌクレオチドを産生するステップと、
（ｃ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチド
と混合して、プールを形成するステップと、
（ｄ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドおよびタグ付けされた被験親ポリヌクレオ
チドの分量を決定するステップと、
（ｅ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドの前記分量を使用して、タグ付けされた被
験親ポリヌクレオチドの前記分量における歪みを低下させるステップと
を含む方法。
（項目９）
前記第１のタグセットが、複数のタグを含み、前記第１のタグセットにおける各タグが
、同じ対照タグおよび同定タグを含み、前記第１のタグセットが、複数の異なる同定タグ
を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第２のタグセットが、複数のタグを含み、前記第２のタグセットにおける各タグが
、同じ被験タグおよび同定タグを含み、前記被験タグが、前記対照タグから識別可能であ
り、前記第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
（ｄ）が、前記プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅さ
れたタグ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、前記増幅されたプ
ールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定して、複数の配列リ
ードを産生するステップとを含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、同じ親ポ
リヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けが、任意選択で、同定タグ
および前記親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任意選
択で、群における前記複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれのコ
ンセンサス配列を決定するステップとをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
（ｄ）が、遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親ポリヌクレ
オチドの相対的分量に基づき、１種を超えるまたはそれに等しい前記遺伝子座における前
記被験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定するステップを含む、
項目８に記載の方法。
（項目１４）
分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチド分子を含むライブラリーアダプタのセ
ットであって、前記複数のポリヌクレオチド分子が、８０ヌクレオチド塩基未満またはそ
れに等しい長さであり、前記分子バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さで
あり、
（ａ）前記分子バーコードが、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有し
、
（ｂ）前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１
ヌクレオチド塩基離れて位置し、
（ｃ）任意選択で、少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおいて
同一であり、
（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを含有しない
ライブラリーアダプタのセット。
（項目１５）
前記ポリヌクレオチド分子が、前記分子バーコードを除いて同一である、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１６）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、二本鎖部分および少なくとも１個の一
本鎖部分を有する、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１７）
前記二本鎖部分が、複数の前記分子バーコードの中の１つの分子バーコードを有する、
項目１６に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目１８）
前記所与の分子バーコードが、ランダマーである、項目１７に記載のライブラリーアダ
プタのセット。
（項目１９）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、前記少なくとも１個の一本鎖部分に鎖
同定バーコードをさらに含む、項目１６に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２０）
前記鎖同定バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基を含む、項目１９に記載のラ
イブラリーアダプタのセット。
（項目２１）
前記一本鎖部分が、部分的シーケンサーモチーフを有する、項目１６に記載のライブラ
リーアダプタのセット。
（項目２２）
前記ポリヌクレオチド分子が、同じである末端ヌクレオチドの配列を有する、項目１４
に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２３）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、Ｙ字形、バブル形またはヘアピン形で
ある、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２４）
前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、試料同定モチーフを含有しない、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２５）
前記分子バーコードが、少なくとも１０ヌクレオチド塩基の長さである、項目１４に記
載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２６）
前記複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれが、１０ヌクレオチド塩基～６０ヌクレオ
チド塩基の長さである、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２７）
前記少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおいて同一である、
項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２８）
前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも１０ヌ
クレオチド塩基離れて位置する、項目１４に記載のライブラリーアダプタのセット。
（項目２９）
前記複数のポリヌクレオチド分子から本質的になる、項目１４に記載のライブラリーア
ダプタのセット。
（項目３０）
（ａ）項目１４に記載のアダプタのライブラリー由来の複数のポリヌクレオチド分子を
ポリヌクレオチドのコレクションにタグ付けして、タグ付けされたポリヌクレオチドのコ
レクションを作製するステップと、
（ｂ）配列決定アダプタの存在下で、タグ付けされたポリヌクレオチドの前記コレクショ
ンを増幅するステップであって、前記配列決定アダプタが、前記複数のポリヌクレオチド
分子における相補的配列に選択的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するプラ
イマーを有するステップと
を含む方法。
（項目３１）
本来のＤＮＡ断片の異種性集団における稀なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を検出または
定量化するための方法であって、前記稀なＤＮＡが、１％未満である濃度を有し、前記方
法が、
（ａ）前記本来のＤＮＡ断片の３０％超が、分子バーコードを含むライブラリーアダプタ
を両端にタグ付けされるように、単一の反応において前記本来のＤＮＡ断片にタグ付けし
、これにより、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意するステップと、
（ｂ）前記タグ付けされたＤＮＡ断片において高忠実度増幅を行うステップと、
（ｃ）任意選択で、前記タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを選択的に濃縮するステ
ップと、
（ｄ）前記タグ付けされ、増幅され、任意選択で選択的に濃縮されたＤＮＡ断片の一方ま
たは両方の鎖を配列決定して、前記分子バーコードおよび前記本来のＤＮＡ断片の少なく
とも一部分のヌクレオチド配列を含む配列リードを得るステップと、
（ｅ）前記配列リードから、前記本来のＤＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセンサスリ
ードを決定するステップと、
（ｆ）前記コンセンサスリードを定量化して、９９．９％を超える特異性で、前記稀なＤ
ＮＡを検出または定量化するステップと
を含む方法。
（項目３２）
ステップ（ｅ）が、同じまたは類似の分子バーコードおよび同じまたは類似の断片配列
の末端を有する配列リードを比較するステップを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記比較するステップが、同じまたは類似の分子バーコードを有する前記配列リードに
おける系統発生解析を実行するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記分子バーコードが、最大３の編集距離を有するバーコードを含む、項目３２に記載
の方法。
（項目３５）
前記断片配列の末端が、最大３の編集距離を有する断片配列を含む、項目３１に記載の
方法。
（項目３６）
配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するステッ
プと、１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングするペア形成されたリードおよ
びペア形成されないリードの数を定量化するステップとをさらに含む、項目３１に記載の
方法。
（項目３７）
前記タグ付けが、本来のＤＮＡ断片と比較して過剰量のライブラリーアダプタを有する
ことにより起こる、項目３１に記載の方法。
（項目３８）
前記分子バーコードおよび前記本来のＤＮＡ断片のそれぞれの少なくとも一端由来の配
列情報に従って前記配列リードをビニングして、一本鎖リードのビンを作製するステップ
をさらに含む、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
各ビンにおいて、配列リードを解析することにより、前記本来のＤＮＡ断片の中の所与
の本来のＤＮＡ断片の配列を決定するステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記タグ付けされ、増幅され、任意選択で濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノ
ムの各位置において各塩基が生じる回数を比較することにより、前記稀なＤＮＡを検出ま
たは定量化するステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを選択的に濃縮するステップをさらに含む
、項目３１に記載の方法。
（項目４２）
濃縮後に、プライマーを含む配列決定アダプタの存在下で、前記濃縮されたタグ付けさ
れたＤＮＡ断片を増幅するステップをさらに含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ＤＮＡ断片が、項目１に記載のアダプタのライブラリー由来のポリヌクレオチド分
子をタグ付けされる、項目３１に記載の方法。
（項目４４）
対象の核酸試料を処理および／または解析するための方法であって、
（ａ）前記核酸試料由来のポリヌクレオチド断片をライブラリーアダプタのセットに曝露
して、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生成するステップと、
（ｂ）前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片の増幅産物として増幅されたポリヌクレ
オチド断片を生じる条件下で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片を核酸増幅反応
に供するステップとを含み、
前記ライブラリーアダプタのセットが、分子バーコードを有する複数のポリヌクレオチ
ド分子を含み、前記複数のポリヌクレオチド分子が、８０ヌクレオチド塩基未満またはそ
れに等しい長さであり、前記分子バーコードが、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さで
あり、
（１）前記分子バーコードが、互いに異なり、互いの間に少なくとも１の編集距離を有
し、
（２）前記分子バーコードが、それぞれのポリヌクレオチド分子の末端から少なくとも
１ヌクレオチド塩基離れて位置し、
（３）任意選択で、少なくとも１末端塩基が、前記ポリヌクレオチド分子の全てにおい
て同一であり、
（４）前記ポリヌクレオチド分子のいずれも、完全シーケンサーモチーフを含有しない
方法。
（項目４５）
前記増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配列を決定するス
テップをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片の前記ヌクレオチド配列が、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）なしで決定される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
プログラムされたコンピュータプロセッサにより前記ヌクレオチド配列を解析して、前
記対象の前記ヌクレオチド試料における１種または複数の遺伝的バリアントを同定するス
テップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸試料が、無細胞核酸試料である、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記核酸試料の前記ポリヌクレオチド断片を前記複数のポリヌクレオチド分子に曝露す
るステップが、少なくとも１０％の変換効率で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド断
片を生じる、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記供するステップが、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢ
Ｂ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥ
Ｎ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ
１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、Ｆ
ＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２
、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、
ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴ
Ｋ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ
１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１
、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、Ｍ
ＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される遺伝
子に対応する配列から前記タグ付けされたポリヌクレオチド断片を増幅するステップを含
む、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
（ａ）複数のポリヌクレオチド分子から複数の配列リードを生成するステップであって
、前記複数のポリヌクレオチド分子が、標的ゲノムのゲノム遺伝子座を網羅し、前記ゲノ
ム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢ
ＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１
、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴ
ＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、Ｇ
ＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２
、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、
ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、Ｖ
ＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮ
Ｄ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１
、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２
、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に
対応するステップと、
（ｂ）コンピュータプロセッサにより、前記複数の配列リードをファミリーへと群分けす
るステップであって、各ファミリーが、鋳型ポリヌクレオチドのうち１種に由来する配列
リードを含むステップと、
（ｃ）前記ファミリーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生
成するステップと、
（ｄ）前記ゲノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座において前記コンセンサス配列を
コールするステップと、
（ｅ）前記所与のゲノム遺伝子座において、
ｉ．前記コールの中の遺伝的バリアント、
ｉｉ．前記コールの中の遺伝子変更の頻度、
ｉｉｉ．コールの総数、および
ｉｖ．前記コールの中の変更の総数
のいずれかを検出するステップと
を含む方法。
（項目５２）
各ファミリーが、前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種のみに由来する配列リードを含
む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ゲノム遺伝子座の中の追加的なゲノム遺伝子座において（ｄ）～（ｅ）を行うステ
ップをさらに含む、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、前記
所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリ
エーションを決定するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記群分けするステップが、（ｉ）前記複数のポリヌクレオチド分子にカップリングさ
れた別個の分子バーコードおよび（ｉｉ）前記複数の配列リードの間の類似性を同定する
ことにより、前記複数の配列リードをファミリーへと分類するステップを含み、各ファミ
リーが、分子バーコードおよび類似または同一の配列リードの別個の組合せに関連する複
数の核酸配列を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記コンセンサス配列が、前記配列リードのそれぞれの定量的尺度または統計的有意性
レベルを評価することにより生成される、項目５１に記載の方法。
（項目５７）
前記複数の遺伝子が、前記群から選択される前記複数の遺伝子のうち少なくとも１０種
を含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５８）
（ａ）単一の反応容器内に鋳型ポリヌクレオチド分子およびライブラリーアダプタのセ
ットを用意するステップであって、前記ライブラリーアダプタが、異なる分子バーコード
を有するポリヌクレオチド分子であり、前記ライブラリーアダプタのいずれも、完全シー
ケンサーモチーフを含有しないステップと、
（ｂ）前記単一の反応容器内で、少なくとも１０％の効率で、前記ライブラリーアダプタ
を前記鋳型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、複数の異なるタグ付け
組合せの中にあるタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タグ付けさ
れたポリヌクレオチド分子を産生するステップと、
（ｃ）前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子の増幅産物として増幅されたポリヌクレ
オチド分子を生じる条件下で、前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子を増幅反応に供
するステップと、
（ｄ）前記増幅されたポリヌクレオチド分子を配列決定するステップと
を含む方法。
（項目５９）
前記ライブラリーアダプタが、前記分子バーコードを除いて同一である、項目５８に記
載の方法。
（項目６０）
前記ライブラリーアダプタのそれぞれが、二本鎖部分および少なくとも１個の一本鎖部
分を有し、前記一本鎖部分が、部分的シーケンサーモチーフを有する、項目５８に記載の
方法。
（項目６１）
前記ライブラリーアダプタが、前記鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリングす
る、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記効率が、少なくとも３０％である、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺伝的バリアントを同定するス
テップをさらに含む、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記配列決定するステップが、（ｉ）前記増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物
として追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、前記増幅されたポリ
ヌクレオチド分子を追加的な増幅反応に供するステップと、（ｉｉ）前記追加的な増幅さ
れたポリヌクレオチド分子を配列決定するステップとを含む、項目５８に記載の方法。
（項目６５）
前記追加的な増幅が、配列決定アダプタの存在下で行われる、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
（ｂ）および（ｃ）が、前記タグ付けされたポリヌクレオチド分子をアリコートにする
ことなく行われる、項目５８に記載の方法。
（項目６７）
対象の標的核酸分子を解析するためのシステムであって、
標的ゲノムのゲノム遺伝子座を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リード
を受け取る通信インターフェイスと、
前記通信インターフェイスによって受け取られた前記複数のポリヌクレオチド分子の前
記核酸配列リードを記憶するコンピュータメモリと、
前記通信インターフェイスおよび前記メモリに作動可能にカップリングされ、（ｉ）前
記複数の配列リードを、各ファミリーが、前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種に由来す
る配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉｉ）前記ファミリーのそれぞれに対し
、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、（ｉｉｉ）前記ゲノム遺伝子座の
中の所与のゲノム遺伝子座において前記コンセンサス配列をコールし、（ｉｖ）前記所与
のゲノム遺伝子座において、前記コールの中の遺伝的バリアント、前記コールの中の遺伝
子変更の頻度、コールの総数および前記コールの中の変更の総数のいずれかを検出するよ
うにプログラムされたコンピュータプロセッサと
を含み、前記ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、
ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、
ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、
ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ
３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、Ｉ
ＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦ
ＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ
、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、Ｂ
ＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣ
ＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡ
Ｆ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択され
る複数の遺伝子に対応する
システム。
（項目６８）
ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲ
ＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、
ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、Ｅ
ＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、Ｇ
ＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、
ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１
、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲ
Ｔ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ
６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、
ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ
２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択される少なくとも５種の遺伝子に選
択的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子のセット。
（項目６９）
前記オリゴヌクレオチド分子が、１０～２００塩基の長さである、項目６８に記載のセ
ット。
（項目７０）
前記オリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも５種の遺伝子のエクソン領域に選択的
にハイブリダイズする、項目６８に記載のキット。
（項目７１）
前記オリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも５種の遺伝子における少なくとも３０
種のエクソンに選択的にハイブリダイズする、項目７０に記載のキット。
（項目７２）
複数のオリゴヌクレオチド分子が、前記少なくとも３０種のエクソンのそれぞれに選択
的にハイブリダイズする、項目７１に記載のキット。
（項目７３）
各エクソンにハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチド分子が、少なくとも１種の他
のオリゴヌクレオチド分子と重複する配列を有する、項目７２に記載のキット。
（項目７４）
それぞれ異なる分子バーコードを有する複数のライブラリーアダプタを含有する第１の
容器と、
複数の配列決定アダプタを含有する第２の容器であって、各配列決定アダプタが、シー
ケンサーモチーフの少なくとも一部分および任意選択で試料バーコードを含む第２の容器
と
を含むキット。
（項目７５）
前記配列決定アダプタが、前記試料バーコードを含む、項目７４に記載のキット。
（項目７６）
無細胞ＤＮＡ試料における配列バリアントを検出するための方法であって、９９．９％
を超える特異性で、１％未満の濃度の稀なＤＮＡを検出するステップを含む、方法。
（項目７７）
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステップであって、
各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップと、
（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第１お
よび第２の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、
（ｃ）前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産
生するステップと、
（ｄ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｅ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｆ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成された
リードおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、
（ｇ）プログラムされたコンピュータプロセッサにより、各遺伝子座にマッピングするペ
ア形成されたリードおよびペア形成されないリードの前記定量的尺度に基づき、前記１種
または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする前記セットにおける総二本鎖ポリヌク
レオチド分子の定量的尺度を推定するステップと
を含む方法。
（項目７８）
（ｈ）前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにおけるステップ（ｇ）において決定
された正規化された総定量的尺度を決定し、前記正規化された尺度に基づきコピー数バリ
エーションを決定することにより、前記試料におけるコピー数バリエーションを検出する
ステップをさらに含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記試料が、無細胞核酸から実質的に供給される二本鎖ポリヌクレオチド分子を含む、
項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記二重鎖タグが、配列決定アダプタではない、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
配列リードの前記セットにおける冗長性を低下させるステップが、前記試料における本
来のポリヌクレオチド分子の増幅された産物から産生された配列リードを、前記本来のポ
リヌクレオチド分子に戻るよう崩壊させるステップを含む、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記本来のポリヌクレオチド分子のコンセンサス配列を決定するステップをさらに含む
、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
配列バリアントを含む１種または複数の遺伝子座におけるポリヌクレオチド分子を同定
するステップをさらに含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードの定量的尺度を決定するステップであ
って、前記ペアの両方の鎖が、配列バリアントを含むステップをさらに含む、項目８２に
記載の方法。
（項目８５）
ペア形成された分子の定量的尺度を決定するステップであって、前記ペアの一方のメン
バーのみが配列バリアントを有するステップ、および／または配列バリアントを有するペ
ア形成されない分子の定量的尺度を決定するステップをさらに含む、項目８４に記載の方
法。
（項目８６）
（ａ）シーケンサーからメモリへと、二重鎖タグをタグ付けされたポリヌクレオチドの
配列リードのセットを受け取るステップと、
（ｂ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｃ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｄ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする（ｉ）前記ペア形成された
リードおよび（ｉｉ）前記ペア形成されないリードの定量的尺度を決定するステップと、
（ｅ）各遺伝子座にマッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリード
の前記定量的尺度に基づき、前記１種または複数の遺伝子座のそれぞれにマッピングする
前記セットにおける総二本鎖ポリヌクレオチド分子の定量的尺度を推定するステップと
を含む方法。
（項目８７）
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチド分子のセットを含む試料を用意するステップであって、
各二本鎖ポリヌクレオチド分子が、第１および第２の相補鎖を含むステップと、
（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチド分子に二重鎖タグのセットをタグ付けするステップで
あって、各二重鎖タグが、前記セットにおける二本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第１お
よび第２の相補鎖を異なってタグ付けするステップと、
（ｃ）前記タグ付けされた鎖の少なくとも一部を配列決定して、配列リードのセットを産
生するステップと、
（ｄ）配列リードの前記セットにおける冗長性を低下および／または追跡するステップと
、
（ｅ）配列リードをペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選別するス
テップであって、（ｉ）各ペア形成されたリードが、前記セットにおける二本鎖ポリヌク
レオチド分子に由来する第１のタグ付けされた鎖および第２の異なってタグ付けされた相
補鎖から生成された配列リードに対応し、（ｉｉ）各ペア形成されないリードが、配列リ
ードの前記セットにおける前記配列リードの中に表される二本鎖ポリヌクレオチド分子に
由来する第２の異なってタグ付けされた相補鎖を持たない第１のタグ付けされた鎖を表す
ステップと、
（ｆ）（ｉ）前記ペア形成されたリード、（ｉｉ）１種または複数の遺伝子座のそれぞれ
にマッピングする前記ペア形成されないリード、（ｉｉｉ）前記ペア形成されたリードの
リード深度および（ｉｖ）ペア形成されないリードのリード深度のうち少なくとも２種の
定量的尺度を決定するステップと
を含む方法。
（項目８８）
（ａ）対照親ポリヌクレオチドに第１のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた対
照親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、前記第１のタグセットが、複数のタ
グを含み、前記第１のタグセットにおける各タグが、同じ対照タグおよび同定タグを含み
、前記タグセットが、複数の異なる同定タグを含むステップと、
（ｂ）被験親ポリヌクレオチドに第２のタグセットをタグ付けして、タグ付けされた被験
親ポリヌクレオチドを産生するステップであって、前記第２のタグセットが、複数のタグ
を含み、前記第２のタグセットにおける各タグが、前記対照タグおよび同定タグから識別
可能な同じ被験タグを含み、前記第２のタグセットが、複数の異なる同定タグを含むステ
ップと、
（ｃ）タグ付けされた対照親ポリヌクレオチドをタグ付けされた被験親ポリヌクレオチド
と混合して、プールを形成するステップと、
（ｄ）前記プールにおけるタグ付けされた親ポリヌクレオチドを増幅して、増幅されたタ
グ付けされたポリヌクレオチドのプールを形成するステップと、
（ｅ）前記増幅されたプールにおける増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチドを配列
決定して、複数の配列リードを産生するステップと、
（ｆ）配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、同じ
親ポリヌクレオチドから生成された配列リードを含み、この群分けが、任意選択で、同定
タグおよび前記親ポリヌクレオチドの開始／終了配列由来の情報に基づくステップと、任
意選択で、群における前記複数の配列リード由来の複数の親ポリヌクレオチドのそれぞれ
のコンセンサス配列を決定するステップと、
（ｇ）被験タグまたは対照タグを有することに基づき、対照親ポリヌクレオチドまたは被
験親ポリヌクレオチドとして各ファミリーまたはコンセンサス配列を分類するステップと
、
（ｈ）少なくとも２種の遺伝子座のそれぞれにマッピングする対照親ポリヌクレオチドお
よび対照被験ポリヌクレオチドの定量的尺度を決定するステップと、
（ｉ）少なくとも１種の遺伝子座にマッピングする被験親ポリヌクレオチドおよび対照親
ポリヌクレオチドの相対的分量に基づき、前記少なくとも１種の遺伝子座における前記被
験親ポリヌクレオチドにおけるコピー数バリエーションを決定するステップと
を含む方法。
（項目８９）
（ａ）複数の鋳型ポリヌクレオチドから複数の配列リードを生成するステップであって
、各ポリヌクレオチドが、ゲノム遺伝子座にマッピングされるステップと、
（ｂ）前記配列リードをファミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、
前記鋳型ポリヌクレオチドのうち１種から生成された配列リードを含むステップと、
（ｃ）前記ファミリーのそれぞれに対し前記ゲノム遺伝子座においてヌクレオチド塩基ま
たは配列をコールするステップと、
（ｄ）前記ゲノム遺伝子座において、
ｉ．前記コールの中のゲノム変更、
ｉｉ．前記コールの中の遺伝子変更の頻度、
ｉｉｉ．コールの総数、
ｉｖ．前記コールの中の変更の総数
のいずれかを検出するステップと
を含む方法。
（項目９０）
コールが、系統発生解析、投票、秤量、ファミリーにおける前記遺伝子座における各リ
ードへの確率の割り当ておよび最高確率での前記ヌクレオチド塩基のコールのいずれかを
含む、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
２種の遺伝子座において行われ、前記遺伝子座のそれぞれにおける計数に基づき、前記
遺伝子座のうち１種におけるＣＮＶを決定するステップを含む、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
（ａ）二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリヌクレオチド由来の挿入物を含み、４～
百万種の間の異なるタグを有するタグ付けされたライブラリーを産生するように、アダプ
タを前記二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドにライゲーションするステップであって、ライゲ
ーションが、単一の反応容器内で行われ、前記アダプタが、分子バーコードを含むステッ
プと、
（ｂ）前記タグ付けされたライブラリーにおける前記二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドのそ
れぞれの複数の配列リードを生成するステップと、
（ｃ）タグにおける情報および前記挿入物の末端における情報に基づき、配列リードをフ
ァミリーへと群分けするステップであって、各ファミリーが、前記二本鎖ＤＮＡポリヌク
レオチドの中の単一ＤＮＡポリヌクレオチドから生成された配列リードを含むステップと
、
（ｄ）ファミリーのメンバーにおける位置におけるヌクレオチド塩基に基づき、前記二本
鎖ＤＮＡ分子における前記各位置におけるヌクレオチド塩基をコールするステップと
を含む方法。
（項目９３）
（ｄ）が、前記配列リードの少なくともサブセット由来の複数の連続的塩基をコールし
て、前記二本鎖ＤＮＡ分子における単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）を同定す
るステップを含む、項目９３に記載の方法。
【0068】
本開示の追加的な態様および利点は、当業者であれば、本開示の例示的な実施形態のみ
が示され記載されている次の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。了解される通
り、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らか
な観点における修正が可能であり、全て本開示から逸脱することはない。したがって、図
面および記載は、制限的ではなく例示的な性質として考慮するべきである。
参照による援用
が示され記載されている次の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。了解される通
り、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らか
な観点における修正が可能であり、全て本開示から逸脱することはない。したがって、図
面および記載は、制限的ではなく例示的な性質として考慮するべきである。
参照による援用
【0069】
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊
行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれると具体的に
かつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれると具体的に
かつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【0070】
本発明の新規特色を添付の特許請求の範囲において詳細に表記する。本発明の特色およ
び利点のより十分な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を表記する次の
詳細な説明および次の添付の図面（本明細書において同様に、図（「ｆｉｇｕｒｅ」およ
び「ＦＩＧ．」））を参照することにより得られるであろう。
び利点のより十分な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を表記する次の
詳細な説明および次の添付の図面（本明細書において同様に、図（「ｆｉｇｕｒｅ」およ
び「ＦＩＧ．」））を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【0075】
【0076】
【0077】
【0078】
【0079】
【発明を実施するための形態】
【0080】
本発明の様々な実施形態を本明細書において示し、記載してきたが、当業者には、かか
る実施形態が単なる一例として提供されていることが明らかであろう。当業者であれば、
本発明から逸脱することなく多数のバリエーション、変化および置換を思いつくことがで
きる。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替を用いることができるこ
とを理解されたい。
る実施形態が単なる一例として提供されていることが明らかであろう。当業者であれば、
本発明から逸脱することなく多数のバリエーション、変化および置換を思いつくことがで
きる。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替を用いることができるこ
とを理解されたい。
【0081】
用語「遺伝的バリアント」は、本明細書において一般に、対象の核酸試料またはゲノム
における変更、バリアントまたは多型を指す。かかる変更、バリアントまたは多型は、参
照ゲノムに関するものとなることができ、これは、対象または他の個体の参照ゲノムとな
ることができる。一塩基多型（ＳＮＰ）は、多型の一形態である。一部の例において、１
個または複数の多型は、１個または複数の単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）、
挿入、欠失、反復、小型の挿入、小型の欠失、小型の反復、構造バリアントジャンクショ
ン、可変長タンデム反復および／またはフランキング配列を含む。コピー数バリアント（
ＣＮＶ）、トランスバージョンおよび他の再編成も、遺伝的バリエーションの形態である
。ゲノム変更（alternation）は、塩基変化、挿入、欠失、反復、コピー数バリエーショ
ンまたはトランスバージョンとなり得る。
における変更、バリアントまたは多型を指す。かかる変更、バリアントまたは多型は、参
照ゲノムに関するものとなることができ、これは、対象または他の個体の参照ゲノムとな
ることができる。一塩基多型（ＳＮＰ）は、多型の一形態である。一部の例において、１
個または複数の多型は、１個または複数の単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）、
挿入、欠失、反復、小型の挿入、小型の欠失、小型の反復、構造バリアントジャンクショ
ン、可変長タンデム反復および／またはフランキング配列を含む。コピー数バリアント（
ＣＮＶ）、トランスバージョンおよび他の再編成も、遺伝的バリエーションの形態である
。ゲノム変更（alternation）は、塩基変化、挿入、欠失、反復、コピー数バリエーショ
ンまたはトランスバージョンとなり得る。
【0082】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において一般に、１個または複数の核酸サブユ
ニットを含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グ
アニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）またはこれらのバリアントから選択さ
れる１個または複数のサブユニットを含むことができる。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、
ＴもしくはＵまたはこれらのバリアントを含むことができる。ヌクレオチドは、成長中の
核酸鎖に取り込まれることができるいずれかのサブユニットを含むことができる。かかる
サブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ、あるいは１個もしくは複数の相補的Ａ、Ｃ、
Ｇ、ＴもしくはＵに特異的な、またはプリン（すなわち、ＡもしくはＧまたはこれらのバ
リアント）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴもしくはＵまたはこれらのバリアント
）に相補的な他のいずれかのサブユニットとなることができる。サブユニットは、個々の
核酸塩基または塩基の群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、
ＴＧ、ＡＣ、ＣＡまたはこれらのウラシル対応物）を分解させることができる。一部の例
において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ
）またはこれらの誘導体である。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖となり得る。
ニットを含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グ
アニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）またはこれらのバリアントから選択さ
れる１個または複数のサブユニットを含むことができる。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、
ＴもしくはＵまたはこれらのバリアントを含むことができる。ヌクレオチドは、成長中の
核酸鎖に取り込まれることができるいずれかのサブユニットを含むことができる。かかる
サブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ、あるいは１個もしくは複数の相補的Ａ、Ｃ、
Ｇ、ＴもしくはＵに特異的な、またはプリン（すなわち、ＡもしくはＧまたはこれらのバ
リアント）もしくはピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴもしくはＵまたはこれらのバリアント
）に相補的な他のいずれかのサブユニットとなることができる。サブユニットは、個々の
核酸塩基または塩基の群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、
ＴＧ、ＡＣ、ＣＡまたはこれらのウラシル対応物）を分解させることができる。一部の例
において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ
）またはこれらの誘導体である。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖となり得る。
【0083】
用語「対象」は、本明細書において一般に、哺乳動物種（例えば、ヒト）もしくは鳥類
（例えば、トリ）種等の動物または植物等の他の生物を指す。より具体的には、対象は、
脊椎動物、哺乳動物、マウス、霊長類、サルまたはヒトとなり得る。動物として、家畜、
競技用動物およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。対象は、健康個体、疾患
であるもしくは疾患が疑われるもしくは疾患の素因がある個体、または治療法の必要があ
るもしくは治療法の必要があると疑われる個体となり得る。対象は、患者となり得る。
（例えば、トリ）種等の動物または植物等の他の生物を指す。より具体的には、対象は、
脊椎動物、哺乳動物、マウス、霊長類、サルまたはヒトとなり得る。動物として、家畜、
競技用動物およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。対象は、健康個体、疾患
であるもしくは疾患が疑われるもしくは疾患の素因がある個体、または治療法の必要があ
るもしくは治療法の必要があると疑われる個体となり得る。対象は、患者となり得る。
【0084】
用語「ゲノム」は一般に、生物の遺伝的な情報の全体を指す。ゲノムは、ＤＮＡまたは
ＲＮＡのいずれかにおいてコードされ得る。ゲノムは、タンパク質をコードするコード領
域と共に非コード領域を含むことができる。ゲノムは、生物における全染色体の配列を一
体に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、合計４６本の染色体を有する。これら全
ての配列は一体に、ヒトゲノムを構成する。
ＲＮＡのいずれかにおいてコードされ得る。ゲノムは、タンパク質をコードするコード領
域と共に非コード領域を含むことができる。ゲノムは、生物における全染色体の配列を一
体に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、合計４６本の染色体を有する。これら全
ての配列は一体に、ヒトゲノムを構成する。
【0085】
用語「アダプタ（複数可）」、「アダプター（複数可）」および「タグ（複数可）」は
、本明細書を通して同義的に使用される。ライゲーション、ハイブリダイゼーションまた
は他のアプローチを含むいずれかのアプローチにより、アダプタまたはタグをポリヌクレ
オチド配列にカップリングして、「タグ付け」することができる。
、本明細書を通して同義的に使用される。ライゲーション、ハイブリダイゼーションまた
は他のアプローチを含むいずれかのアプローチにより、アダプタまたはタグをポリヌクレ
オチド配列にカップリングして、「タグ付け」することができる。
【0086】
用語「ライブラリーアダプタ」または「ライブラリーアダプター」は、本明細書におい
て一般に、その同一性（例えば、配列）を使用して生物学的試料（本明細書において同様
に「試料」）におけるポリヌクレオチドを区別することができる分子（例えば、ポリヌク
レオチド）を指す。
て一般に、その同一性（例えば、配列）を使用して生物学的試料（本明細書において同様
に「試料」）におけるポリヌクレオチドを区別することができる分子（例えば、ポリヌク
レオチド）を指す。
【0087】
用語「配列決定アダプタ」は、本明細書において一般に、配列決定を可能にするための
標的ポリヌクレオチドとの相互作用による等、配列決定機器に標的ポリヌクレオチドを配
列決定させるように適応された分子（例えば、ポリヌクレオチド）を指す。配列決定アダ
プタは、配列決定機器による標的ポリヌクレオチドの配列決定を可能にする。一例におい
て、配列決定アダプタは、フローセル等、配列決定システムの固体支持体に取り付けられ
た捕捉ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合するヌクレオチド配列を含む。別の
例において、配列決定アダプタは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合して、
配列決定システムによる標的ポリヌクレオチドの配列決定を可能にするヘアピンループを
生成するヌクレオチド配列を含む。配列決定アダプタは、他の分子（例えば、ポリヌクレ
オチド）のフローセル配列に相補的であり、標的ポリヌクレオチドを配列決定するために
配列決定システムによって使用可能であるヌクレオチド配列となり得るシーケンサーモチ
ーフを含むことができる。シーケンサーモチーフは、合成による配列決定等、配列決定に
おける使用のためのプライマー配列を含むこともできる。シーケンサーモチーフは、配列
決定システムへのライブラリーアダプタのカップリングおよび標的ポリヌクレオチドの配
列決定に必要とされる配列（複数可）を含むことができる。
標的ポリヌクレオチドとの相互作用による等、配列決定機器に標的ポリヌクレオチドを配
列決定させるように適応された分子（例えば、ポリヌクレオチド）を指す。配列決定アダ
プタは、配列決定機器による標的ポリヌクレオチドの配列決定を可能にする。一例におい
て、配列決定アダプタは、フローセル等、配列決定システムの固体支持体に取り付けられ
た捕捉ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合するヌクレオチド配列を含む。別の
例において、配列決定アダプタは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズまたは結合して、
配列決定システムによる標的ポリヌクレオチドの配列決定を可能にするヘアピンループを
生成するヌクレオチド配列を含む。配列決定アダプタは、他の分子（例えば、ポリヌクレ
オチド）のフローセル配列に相補的であり、標的ポリヌクレオチドを配列決定するために
配列決定システムによって使用可能であるヌクレオチド配列となり得るシーケンサーモチ
ーフを含むことができる。シーケンサーモチーフは、合成による配列決定等、配列決定に
おける使用のためのプライマー配列を含むこともできる。シーケンサーモチーフは、配列
決定システムへのライブラリーアダプタのカップリングおよび標的ポリヌクレオチドの配
列決定に必要とされる配列（複数可）を含むことができる。
【0088】
本明細書において、用語「少なくとも」、「多くても」または「約」は、数列に先行す
る場合、他に同定されていなければ、該数列の各メンバーを指す。
る場合、他に同定されていなければ、該数列の各メンバーを指す。
【0089】
参照数値に関する用語「約」およびその文法的均等は、該値から最大プラス・マイナス
１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、量「約１０」は、９～１１の量を含むこ
とができる。他の実施形態において、参照数値に関する用語「約」は、該値からプラス・
マイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の値の範
囲を含むことができる。
１０％の値の範囲を含むことができる。例えば、量「約１０」は、９～１１の量を含むこ
とができる。他の実施形態において、参照数値に関する用語「約」は、該値からプラス・
マイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の値の範
囲を含むことができる。
【0090】
参照数値に関する用語「少なくとも」およびその文法的均等は、該参照数値および該値
を超えるものを含むことができる。例えば、量「少なくとも１０」は、値１０、ならびに
１１、１００および１，０００等、１０を上回るいずれかの数値を含むことができる。
を超えるものを含むことができる。例えば、量「少なくとも１０」は、値１０、ならびに
１１、１００および１，０００等、１０を上回るいずれかの数値を含むことができる。
【0091】
参照数値に関する用語「多くても」およびその文法的均等は、該参照数値および該値未
満を含むことができる。例えば、量「多くても１０」は、値１０、ならびに９、８、５、
１、０．５および０．１等、１０を下回るいずれかの数値を含むことができる。
満を含むことができる。例えば、量「多くても１０」は、値１０、ならびに９、８、５、
１、０．５および０．１等、１０を下回るいずれかの数値を含むことができる。
【0092】
１．核酸試料を処理および／または解析するための方法
【0093】
本開示の態様は、対象の核酸試料におけるゲノム変更を決定するための方法を提供する
。図１は、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）を決定する方法を示す。本方法は、ＳＮＶ
等、他のゲノム変更を決定するために実施することができる。
。図１は、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）を決定する方法を示す。本方法は、ＳＮＶ
等、他のゲノム変更を決定するために実施することができる。
【0094】
Ａ．ポリヌクレオチド単離
【0095】
本明細書に開示されている方法は、１種または複数のポリヌクレオチドを単離するステ
ップを含むことができる。ポリヌクレオチドは、いずれかの種類の核酸、例えば、ゲノム
核酸の配列または人工配列（例えば、ゲノム核酸には存在しない配列）を含むことができ
る。例えば、人工配列は、非天然ヌクレオチドを含有することができる。また、ポリヌク
レオチドは、いずれかの部分においてゲノム核酸および人工配列の両方を含むことができ
る。例えば、ポリヌクレオチドは、１～９９％のゲノム核酸および９９％～１％の人工配
列を含むことができ、その合計は最大１００％となる。よって、パーセンテージの分数も
企図される。例えば、９９．１％対０．９％の比が企図される。
ップを含むことができる。ポリヌクレオチドは、いずれかの種類の核酸、例えば、ゲノム
核酸の配列または人工配列（例えば、ゲノム核酸には存在しない配列）を含むことができ
る。例えば、人工配列は、非天然ヌクレオチドを含有することができる。また、ポリヌク
レオチドは、いずれかの部分においてゲノム核酸および人工配列の両方を含むことができ
る。例えば、ポリヌクレオチドは、１～９９％のゲノム核酸および９９％～１％の人工配
列を含むことができ、その合計は最大１００％となる。よって、パーセンテージの分数も
企図される。例えば、９９．１％対０．９％の比が企図される。
【0096】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ等、いずれかの種類の核酸を含むこ
とができる。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、これは、ゲノムＤＮＡ、相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または他のいずれかのデオキシリボ核酸となり得る。ポリヌクレ
オチドは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）となることもできる。例えば、ポリヌクレオチド
は、循環ＤＮＡとなり得る。循環ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むことが
できる。ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖となり得る。あるいは、ポリヌクレオ
チドは、二本鎖部分および一本鎖部分の組合せを含むことができる。
とができる。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、これは、ゲノムＤＮＡ、相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または他のいずれかのデオキシリボ核酸となり得る。ポリヌクレ
オチドは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）となることもできる。例えば、ポリヌクレオチド
は、循環ＤＮＡとなり得る。循環ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含むことが
できる。ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖となり得る。あるいは、ポリヌクレオ
チドは、二本鎖部分および一本鎖部分の組合せを含むことができる。
【0097】
ポリヌクレオチドは、無細胞である必要はない。一部の事例において、ポリヌクレオチ
ドは、試料から単離することができる。例えば、ステップ（１０２）において（図１）、
二本鎖ポリヌクレオチドは、試料から単離される。試料は、対象から単離されるいずれか
の生物学的試料となり得る。例えば、試料は、体液、全血、血小板、血清、血漿、糞便、
赤血球細胞、白血球細胞もしくは白血球、内皮細胞、組織生検、滑液、リンパ液、腹水、
間質もしくは細胞外液、歯肉溝滲出液を含む細胞間間隙の液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘
液、痰、精液、汗、尿または他のいずれかの体液を限定することなく含むことができる。
体液は、唾液、血液または血清を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、体液
、例えば、血液または血清から単離される無細胞ＤＮＡとなり得る。試料は、静脈穿刺、
排泄、射精、マッサージ、生検、針穿刺吸引、洗浄、擦過、外科的切開もしくは介入また
は他のアプローチ等が挙げられるがこれらに限定されない、様々なアプローチによって対
象から得ることができる腫瘍試料となることもできる。
ドは、試料から単離することができる。例えば、ステップ（１０２）において（図１）、
二本鎖ポリヌクレオチドは、試料から単離される。試料は、対象から単離されるいずれか
の生物学的試料となり得る。例えば、試料は、体液、全血、血小板、血清、血漿、糞便、
赤血球細胞、白血球細胞もしくは白血球、内皮細胞、組織生検、滑液、リンパ液、腹水、
間質もしくは細胞外液、歯肉溝滲出液を含む細胞間間隙の液、骨髄、脳脊髄液、唾液、粘
液、痰、精液、汗、尿または他のいずれかの体液を限定することなく含むことができる。
体液は、唾液、血液または血清を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドは、体液
、例えば、血液または血清から単離される無細胞ＤＮＡとなり得る。試料は、静脈穿刺、
排泄、射精、マッサージ、生検、針穿刺吸引、洗浄、擦過、外科的切開もしくは介入また
は他のアプローチ等が挙げられるがこれらに限定されない、様々なアプローチによって対
象から得ることができる腫瘍試料となることもできる。
【0098】
試料は、ゲノム当量を含有する核酸の様々な量を含むことができる。例えば、約３０ｎ
ｇ ＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）の一倍体ヒトゲノム当量を含有すること
ができ、ｃｆＤＮＡの場合、約２千億（２×１０１１）個の個々のポリヌクレオチド分子
を含有することができる。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００の一
倍体ヒトゲノム当量を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合、約６千億個の個々の分子
を含有することができる。
ｇ ＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）の一倍体ヒトゲノム当量を含有すること
ができ、ｃｆＤＮＡの場合、約２千億（２×１０１１）個の個々のポリヌクレオチド分子
を含有することができる。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００の一
倍体ヒトゲノム当量を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合、約６千億個の個々の分子
を含有することができる。
【0099】
試料は、異なる供給源由来の核酸を含むことができる。例えば、試料は、生殖系列ＤＮ
Ａまたは体細胞ＤＮＡを含むことができる。試料は、突然変異を保有する核酸を含むこと
ができる。例えば、試料は、生殖系列突然変異および／または体細胞突然変異を保有する
ＤＮＡを含むことができる。試料は、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変
異）を保有するＤＮＡを含むこともできる。
Ａまたは体細胞ＤＮＡを含むことができる。試料は、突然変異を保有する核酸を含むこと
ができる。例えば、試料は、生殖系列突然変異および／または体細胞突然変異を保有する
ＤＮＡを含むことができる。試料は、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変
異）を保有するＤＮＡを含むこともできる。
【0100】
Ｂ．タグ付け
【0101】
本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、タグ付けすることができる。例えば、
ステップ（１０４）（図１）において、二本鎖ポリヌクレオチドは、二重鎖タグ、二本鎖
分子の相補鎖（すなわち、「ワトソン」および「クリック」鎖）を異なって標識するタグ
をタグ付けされる。一実施形態において、二重鎖タグは、相補的および非相補的部分を有
するポリヌクレオチドである。
ステップ（１０４）（図１）において、二本鎖ポリヌクレオチドは、二重鎖タグ、二本鎖
分子の相補鎖（すなわち、「ワトソン」および「クリック」鎖）を異なって標識するタグ
をタグ付けされる。一実施形態において、二重鎖タグは、相補的および非相補的部分を有
するポリヌクレオチドである。
【0102】
タグは、核酸、化学化合物、蛍光（florescent）プローブまたは放射性プローブ等が挙
げられるがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドに取り付けられるいずれかの種類の
分子となり得る。タグは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であって
もよい。タグは、公知配列、未知配列またはその両方を含むことができる。タグは、ラン
ダム配列、既定の配列またはその両方を含むことができる。タグは、二本鎖または一本鎖
となり得る。二本鎖タグは、二重鎖タグとなり得る。二本鎖タグは、２本の相補鎖を含む
ことができる。あるいは、二本鎖タグは、ハイブリダイズした部分およびハイブリダイズ
していない部分を含むことができる。二本鎖タグは、Ｙ字形となることができ、例えば、
ハイブリダイズした部分が、タグの一末端に存在し、ハイブリダイズしていない部分が、
タグの反対側の末端に存在する。かかる例の１つは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定において
使用される「Ｙアダプター」である。他の例として、ヘアピン形アダプターまたはバブル
形アダプターが挙げられる。バブル形アダプターは、両サイドにおいて相補的配列に挟ま
れた非相補的配列を有する。
げられるがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドに取り付けられるいずれかの種類の
分子となり得る。タグは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であって
もよい。タグは、公知配列、未知配列またはその両方を含むことができる。タグは、ラン
ダム配列、既定の配列またはその両方を含むことができる。タグは、二本鎖または一本鎖
となり得る。二本鎖タグは、二重鎖タグとなり得る。二本鎖タグは、２本の相補鎖を含む
ことができる。あるいは、二本鎖タグは、ハイブリダイズした部分およびハイブリダイズ
していない部分を含むことができる。二本鎖タグは、Ｙ字形となることができ、例えば、
ハイブリダイズした部分が、タグの一末端に存在し、ハイブリダイズしていない部分が、
タグの反対側の末端に存在する。かかる例の１つは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定において
使用される「Ｙアダプター」である。他の例として、ヘアピン形アダプターまたはバブル
形アダプターが挙げられる。バブル形アダプターは、両サイドにおいて相補的配列に挟ま
れた非相補的配列を有する。
【0103】
本明細書に開示されているタグ付けは、いずれかの方法を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによりアダプタをタグ付けすることができ
る。例えば、アダプタは、ポリヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレ
オチド配列を有することができる。代替として、ポリヌクレオチドは、ライゲーションに
よりアダプタをタグ付けすることができる。
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションによりアダプタをタグ付けすることができ
る。例えば、アダプタは、ポリヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレ
オチド配列を有することができる。代替として、ポリヌクレオチドは、ライゲーションに
よりアダプタをタグ付けすることができる。
【0104】
例えば、タグ付けは、１種または複数の酵素の使用を含むことができる。酵素は、リガ
ーゼとなり得る。リガーゼは、ＤＮＡリガーゼとなり得る。例えば、ＤＮＡリガーゼは、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼおよび／または哺乳動物リガーゼ
となり得る。哺乳動物リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩまたはＤＮ
ＡリガーゼＩＶとなり得る。リガーゼは、熱安定性リガーゼであってもよい。タグは、ポ
リヌクレオチドの平滑末端にライゲーションすることができる（平滑末端ライゲーション
）。あるいは、タグは、ポリヌクレオチドの粘着末端にライゲーションすることができる
（粘着末端ライゲーション）。ライゲーションの効率は、様々な条件を最適化することに
より増加され得る。ライゲーションの効率は、ライゲーションの反応時間を最適化するこ
とにより増加され得る。例えば、ライゲーションの反応時間は、１２時間未満、例えば、
１時間未満、２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満、６時間未満、７時間未
満、８時間未満、９時間未満、１０時間未満、１１時間未満、１２時間未満、１３時間未
満、１４時間未満、１５時間未満、１６時間未満、１７時間未満、１８時間未満、１９時
間未満または２０時間未満となり得る。特定の例において、ライゲーションの反応時間は
、２０時間未満である。ライゲーションの効率は、反応におけるリガーゼ濃度を最適化す
ることにより増加され得る。例えば、リガーゼ濃度は、少なくとも１０、少なくとも５０
、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なく
とも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも６００ユニット／マ
イクロリットルとなり得る。効率は、ライゲーションに適した酵素、酵素補因子もしくは
他の添加物を添加することによりまたはその濃度を変動させることにより、および／また
は酵素を有する溶液の温度を最適化することにより最適化することもできる。効率は、反
応の様々な構成成分の添加順を変動させることにより最適化することもできる。タグ配列
の末端は、ライゲーション効率を増加させるためのジヌクレオチドを含むことができる。
タグが、非相補的部分を含む場合（例えば、Ｙ字形アダプタ）、タグアダプタの相補的部
分における配列は、ライゲーション効率を促進する１種または複数の選択された配列を含
むことができる。好ましくは、かかる配列は、タグの末端に位置する。かかる配列は、１
、２、３、４、５または６末端塩基を含むことができる。高い粘性（例えば、低いレイノ
ルズ数）を有する反応溶液を使用して、ライゲーション効率を増加させることもできる。
例えば、溶液は、３０００未満、２０００未満、１０００未満、９００未満、８００未満
、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００
未満、５０未満、２５未満または１０未満のレイノルズ数を有することができる。断片の
大まかに統一された分布（例えば、緊密な標準偏差）を使用して、ライゲーション効率を
増加させることができることも企図される。例えば、断片サイズにおけるバリエーション
は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満変動し得る。タグ付
けは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるプライマー伸長を含むこともでき
る。タグ付けは、ライゲーションに基づくＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライ
ゲーションまたは一本鎖環状化のいずれかを含むこともできる。
ーゼとなり得る。リガーゼは、ＤＮＡリガーゼとなり得る。例えば、ＤＮＡリガーゼは、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼおよび／または哺乳動物リガーゼ
となり得る。哺乳動物リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩまたはＤＮ
ＡリガーゼＩＶとなり得る。リガーゼは、熱安定性リガーゼであってもよい。タグは、ポ
リヌクレオチドの平滑末端にライゲーションすることができる（平滑末端ライゲーション
）。あるいは、タグは、ポリヌクレオチドの粘着末端にライゲーションすることができる
（粘着末端ライゲーション）。ライゲーションの効率は、様々な条件を最適化することに
より増加され得る。ライゲーションの効率は、ライゲーションの反応時間を最適化するこ
とにより増加され得る。例えば、ライゲーションの反応時間は、１２時間未満、例えば、
１時間未満、２時間未満、３時間未満、４時間未満、５時間未満、６時間未満、７時間未
満、８時間未満、９時間未満、１０時間未満、１１時間未満、１２時間未満、１３時間未
満、１４時間未満、１５時間未満、１６時間未満、１７時間未満、１８時間未満、１９時
間未満または２０時間未満となり得る。特定の例において、ライゲーションの反応時間は
、２０時間未満である。ライゲーションの効率は、反応におけるリガーゼ濃度を最適化す
ることにより増加され得る。例えば、リガーゼ濃度は、少なくとも１０、少なくとも５０
、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なく
とも３００、少なくとも４００、少なくとも５００または少なくとも６００ユニット／マ
イクロリットルとなり得る。効率は、ライゲーションに適した酵素、酵素補因子もしくは
他の添加物を添加することによりまたはその濃度を変動させることにより、および／また
は酵素を有する溶液の温度を最適化することにより最適化することもできる。効率は、反
応の様々な構成成分の添加順を変動させることにより最適化することもできる。タグ配列
の末端は、ライゲーション効率を増加させるためのジヌクレオチドを含むことができる。
タグが、非相補的部分を含む場合（例えば、Ｙ字形アダプタ）、タグアダプタの相補的部
分における配列は、ライゲーション効率を促進する１種または複数の選択された配列を含
むことができる。好ましくは、かかる配列は、タグの末端に位置する。かかる配列は、１
、２、３、４、５または６末端塩基を含むことができる。高い粘性（例えば、低いレイノ
ルズ数）を有する反応溶液を使用して、ライゲーション効率を増加させることもできる。
例えば、溶液は、３０００未満、２０００未満、１０００未満、９００未満、８００未満
、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００
未満、５０未満、２５未満または１０未満のレイノルズ数を有することができる。断片の
大まかに統一された分布（例えば、緊密な標準偏差）を使用して、ライゲーション効率を
増加させることができることも企図される。例えば、断片サイズにおけるバリエーション
は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満変動し得る。タグ付
けは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるプライマー伸長を含むこともでき
る。タグ付けは、ライゲーションに基づくＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライ
ゲーションまたは一本鎖環状化のいずれかを含むこともできる。
【0105】
一部の事例において、本明細書におけるタグは、分子バーコードを含む。かかる分子バ
ーコードを使用して、試料におけるポリヌクレオチドを区別することができる。好ましく
は、分子バーコード同士は、互いに異なる。例えば、分子バーコード同士は、既定の編集
距離またはハミング距離によって特徴付けることができる差を互いの間に有することがで
きる。一部の事例において、本明細書における分子バーコードは、１、２、３、４、５、
６、７、８、９または１０の最小編集距離を有する。タグ付けされていない分子からタグ
付けされた分子への変換（例えば、タグ付け）の効率をさらに改善するために、好ましく
は、短いタグを利用する。例えば、一部の実施形態において、ライブラリーアダプタータ
グは、最大６５、６０、５５、５０、４５、４０または３５ヌクレオチド塩基の長さとな
り得る。かかる短いライブラリーバーコードのコレクションは、好ましくは、１、２、３
またはそれを超える最小編集距離で、多数の異なる分子バーコード、例えば、少なくとも
２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０種の異なるバーコードを含む
。
ーコードを使用して、試料におけるポリヌクレオチドを区別することができる。好ましく
は、分子バーコード同士は、互いに異なる。例えば、分子バーコード同士は、既定の編集
距離またはハミング距離によって特徴付けることができる差を互いの間に有することがで
きる。一部の事例において、本明細書における分子バーコードは、１、２、３、４、５、
６、７、８、９または１０の最小編集距離を有する。タグ付けされていない分子からタグ
付けされた分子への変換（例えば、タグ付け）の効率をさらに改善するために、好ましく
は、短いタグを利用する。例えば、一部の実施形態において、ライブラリーアダプタータ
グは、最大６５、６０、５５、５０、４５、４０または３５ヌクレオチド塩基の長さとな
り得る。かかる短いライブラリーバーコードのコレクションは、好ましくは、１、２、３
またはそれを超える最小編集距離で、多数の異なる分子バーコード、例えば、少なくとも
２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０種の異なるバーコードを含む
。
【0106】
よって、分子のコレクションは、１種または複数のタグを含むことができる。一部の事
例において、コレクションにおける一部の分子は、コレクションにおける他のいずれかの
分子によって共有されない分子バーコード等、同定タグ（「識別子」）を含むことができ
る。例えば、分子のコレクションの一部の事例において、コレクションにおける分子の少
なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも
５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、
少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくと
も６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％
、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なく
とも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６
％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少な
くとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８
５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少
なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも
９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または１００％は、コレクションにおける他のいずれかの分子によって
共有されない識別子または分子バーコードを含むことができる。本明細書において、コレ
クションにおける分子の少なくとも９５％のそれぞれが、コレクションにおける他のいず
れかの分子によって共有されない識別子（「特有タグ」または「特有識別子」）を有する
場合、分子のコレクションは、「特有にタグ付け」されたと考慮される。コレクションに
おける分子の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、
少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくと
も４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％もしくは約５０％のそれぞれが、
コレクションにおける少なくとも１種の他の分子によって共有される同定タグまたは分子
バーコード（「非特有タグ」または「非特有識別子」）を有する場合、分子のコレクショ
ンは、「非特有にタグ付け」されたと考慮される。したがって、非特有にタグ付けされた
集団において、分子の１％以下が、特有にタグ付けされている。例えば、非特有にタグ付
けされた集団において、分子の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、
３５％、４０％、４５％または５０％以下が、特有にタグ付けされ得る。
例において、コレクションにおける一部の分子は、コレクションにおける他のいずれかの
分子によって共有されない分子バーコード等、同定タグ（「識別子」）を含むことができ
る。例えば、分子のコレクションの一部の事例において、コレクションにおける分子の少
なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも
５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、
少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくと
も６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％
、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なく
とも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６
％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少な
くとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８
５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少
なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも
９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または１００％は、コレクションにおける他のいずれかの分子によって
共有されない識別子または分子バーコードを含むことができる。本明細書において、コレ
クションにおける分子の少なくとも９５％のそれぞれが、コレクションにおける他のいず
れかの分子によって共有されない識別子（「特有タグ」または「特有識別子」）を有する
場合、分子のコレクションは、「特有にタグ付け」されたと考慮される。コレクションに
おける分子の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、
少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくと
も４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％もしくは約５０％のそれぞれが、
コレクションにおける少なくとも１種の他の分子によって共有される同定タグまたは分子
バーコード（「非特有タグ」または「非特有識別子」）を有する場合、分子のコレクショ
ンは、「非特有にタグ付け」されたと考慮される。したがって、非特有にタグ付けされた
集団において、分子の１％以下が、特有にタグ付けされている。例えば、非特有にタグ付
けされた集団において、分子の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、
３５％、４０％、４５％または５０％以下が、特有にタグ付けされ得る。
【0107】
試料における分子の推定される数に基づき、多数の異なるタグを使用することができる
。一部のタグ付け方法において、異なるタグの数は、試料における分子の推定される数と
少なくとも同じものとなり得る。他のタグ付け方法において、異なるタグの数は、試料に
おける分子の推定される数の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００
または１０００倍の多さとなり得る。特有のタグ付けにおいて、試料における分子の推定
される数の少なくとも２倍（またはそれを超える）の多さの異なるタグを使用することが
できる。
。一部のタグ付け方法において、異なるタグの数は、試料における分子の推定される数と
少なくとも同じものとなり得る。他のタグ付け方法において、異なるタグの数は、試料に
おける分子の推定される数の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００
または１０００倍の多さとなり得る。特有のタグ付けにおいて、試料における分子の推定
される数の少なくとも２倍（またはそれを超える）の多さの異なるタグを使用することが
できる。
【0108】
試料における分子は、非特有にタグ付けすることができる。かかる事例において、試料
におけるタグ付けするべき分子の数よりも（then）少ない数のタグまたは分子バーコード
が使用される。例えば、１００、５０、４０、３０、２０または１０種以下の特有タグま
たは分子バーコードが、多くのより異なる断片を有する無細胞ＤＮＡ試料等、複合試料の
タグ付けに使用される。
におけるタグ付けするべき分子の数よりも（then）少ない数のタグまたは分子バーコード
が使用される。例えば、１００、５０、４０、３０、２０または１０種以下の特有タグま
たは分子バーコードが、多くのより異なる断片を有する無細胞ＤＮＡ試料等、複合試料の
タグ付けに使用される。
【0109】
タグ付けするべきポリヌクレオチドは、天然に、あるいは例えば剪断等の他のアプロー
チを使用して断片化することができる。ポリヌクレオチドは、機械的剪断、試料のシリン
ジ通過、超音波処理、熱処理（例えば、３０分間９０℃）および／またはヌクレアーゼ処
理（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよび
／または制限酵素の使用）等が挙げられるがこれらに限定されない、ある特定の方法によ
って断片化することができる。
チを使用して断片化することができる。ポリヌクレオチドは、機械的剪断、試料のシリン
ジ通過、超音波処理、熱処理（例えば、３０分間９０℃）および／またはヌクレアーゼ処
理（例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよび
／または制限酵素の使用）等が挙げられるがこれらに限定されない、ある特定の方法によ
って断片化することができる。
【0110】
ポリヌクレオチド断片（タグ付けに先立つ）は、いずれかの長さの配列を含むことがで
きる。例えば、ポリヌクレオチド断片（タグ付けに先立つ）は、少なくとも５０、５５、
６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、
１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、
１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、
２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、
２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、４００、５００、６００、
７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５０
０、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００またはそれを超えるヌクレオチ
ドの長さを含むことができる。ポリヌクレオチド断片は、好ましくは、無細胞ＤＮＡの約
平均の長さである。例えば、ポリヌクレオチド断片は、約１６０塩基の長さを含むことが
できる。ポリヌクレオチド断片は、より大型の断片からより小型の断片に、約１６０塩基
の長さに断片化することもできる。
きる。例えば、ポリヌクレオチド断片（タグ付けに先立つ）は、少なくとも５０、５５、
６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、
１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、
１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、
２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、
２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、４００、５００、６００、
７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５０
０、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００またはそれを超えるヌクレオチ
ドの長さを含むことができる。ポリヌクレオチド断片は、好ましくは、無細胞ＤＮＡの約
平均の長さである。例えば、ポリヌクレオチド断片は、約１６０塩基の長さを含むことが
できる。ポリヌクレオチド断片は、より大型の断片からより小型の断片に、約１６０塩基
の長さに断片化することもできる。
【0111】
タグ付けされたポリヌクレオチドは、がんに関連する配列を含むことができる。がん関
連配列は、単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）、コピー数バリエーション（ＣＮ
Ｖ）、挿入、欠失および／または再編成を含むことができる。
連配列は、単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）、コピー数バリエーション（ＣＮ
Ｖ）、挿入、欠失および／または再編成を含むことができる。
【0112】
ポリヌクレオチドは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ
）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、肛門がん、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨
肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫
、髄芽腫、髄上皮腫（medulloeptithelioma）、松果体実質腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、
バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸部がん、脊索腫、
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸が
ん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管上皮内癌、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼
がん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、ヘ
アリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下
咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、口唇がん、口腔がん、肺がん、非小細胞癌、小細胞癌、
メラノーマ、口腔内がん、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、髄芽腫、鼻腔がん、副鼻腔
がん、神経芽細胞腫、鼻咽頭がん、口内（oral）がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、
膵がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細
胞新生物、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候
群、皮膚がん、非メラノーマ、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、精巣がん、咽頭が
ん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、腟がん、外陰部がん、ワルデ
ンストレーム高ガンマグロブリン血症および／またはウィルムス腫瘍等、がんに関連する
配列を含むことができる。
）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、肛門がん、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨
肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫
、髄芽腫、髄上皮腫（medulloeptithelioma）、松果体実質腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、
バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸部がん、脊索腫、
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸がん、結腸直腸が
ん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管上皮内癌、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼
がん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、ヘ
アリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下
咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、口唇がん、口腔がん、肺がん、非小細胞癌、小細胞癌、
メラノーマ、口腔内がん、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、髄芽腫、鼻腔がん、副鼻腔
がん、神経芽細胞腫、鼻咽頭がん、口内（oral）がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、
膵がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細
胞新生物、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザリー症候
群、皮膚がん、非メラノーマ、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、精巣がん、咽頭が
ん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、腟がん、外陰部がん、ワルデ
ンストレーム高ガンマグロブリン血症および／またはウィルムス腫瘍等、がんに関連する
配列を含むことができる。
【0113】
一倍体ヒトゲノム当量は、約３ピコグラムのＤＮＡを有する。約１マイクログラムのＤ
ＮＡの試料は、約３００，０００一倍体ヒトゲノム当量を含有する。重複または同族ポリ
ヌクレオチドの少なくとも一部が、互いに対して特有の識別子を有する、すなわち、異な
るタグを有する限りにおいて、配列決定における改善を達成することができる。しかし、
ある特定の実施形態において、使用されるタグの数は、いずれか１つの位置において開始
する全重複分子が特有の識別子を有する少なくとも９５％確率が存在し得るように選択さ
れる。例えば、断片化ゲノムＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡの約１０，０００一倍体ヒトゲ
ノム当量を含む試料において、ｚは、２～８の間であると予想される。かかる集団は、約
１０～１００種の間の異なる識別子、例えば、約２種の識別子、約４種の識別子、約９種
の識別子、約１６種の識別子、約２５種の識別子、約３６種の異なる識別子、約４９種の
異なる識別子、約６４種の異なる識別子、約８１種の異なる識別子または約１００種の異
なる識別子をタグ付けすることができる。
ＮＡの試料は、約３００，０００一倍体ヒトゲノム当量を含有する。重複または同族ポリ
ヌクレオチドの少なくとも一部が、互いに対して特有の識別子を有する、すなわち、異な
るタグを有する限りにおいて、配列決定における改善を達成することができる。しかし、
ある特定の実施形態において、使用されるタグの数は、いずれか１つの位置において開始
する全重複分子が特有の識別子を有する少なくとも９５％確率が存在し得るように選択さ
れる。例えば、断片化ゲノムＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡの約１０，０００一倍体ヒトゲ
ノム当量を含む試料において、ｚは、２～８の間であると予想される。かかる集団は、約
１０～１００種の間の異なる識別子、例えば、約２種の識別子、約４種の識別子、約９種
の識別子、約１６種の識別子、約２５種の識別子、約３６種の異なる識別子、約４９種の
異なる識別子、約６４種の異なる識別子、約８１種の異なる識別子または約１００種の異
なる識別子をタグ付けすることができる。
【0114】
分子バーコードを含む同定可能な配列を有する核酸バーコードをタグ付けのために使用
することができる。例えば、複数のＤＮＡバーコードは、様々な数のヌクレオチド配列を
含むことができる。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、３０種またはそれを超える同定可能なヌクレオチド配列を有する複数のＤＮＡ
バーコードを使用することができる。ポリヌクレオチドの一端のみに取り付けられる場合
、複数のＤＮＡバーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０種またはそれを超える異なる識別子を産生することができる。
あるいは、ポリヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、複数のＤＮＡバーコードは、
４、９、１６、２５、３６、４９、６４、８１、１００、１２１、１４４、１６９、１９
６、２２５、２５６、２８９、３２４、３６１、４００種またはそれを超える異なる識別
子（これは、ＤＮＡバーコードがポリヌクレオチドの１端のみに取り付けられる場合の＾
２である）を産生することができる。一例において、６、７、８、９または１０種の同定
可能なヌクレオチド配列を有する複数のＤＮＡバーコードを使用することができる。ポリ
ヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、これらは、それぞれ３６、４９、６４、８１
または１００種の可能な異なる識別子を産生する。特定の例において、複数のＤＮＡバー
コードは、８種の同定可能なヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドの
一端のみに取り付けられる場合、複数のＤＮＡバーコードは、８種の異なる識別子を産生
することができる。あるいは、ポリヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、複数のＤ
ＮＡバーコードは、６４種の異なる識別子を産生することができる。かかる仕方でタグ付
けされる試料は、約１０ｎｇから約１００ｎｇ、約１μｇ、約１０μｇのいずれかまでの
範囲の断片化ポリヌクレオチド、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡを有する試
料となり得る。
することができる。例えば、複数のＤＮＡバーコードは、様々な数のヌクレオチド配列を
含むことができる。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、３０種またはそれを超える同定可能なヌクレオチド配列を有する複数のＤＮＡ
バーコードを使用することができる。ポリヌクレオチドの一端のみに取り付けられる場合
、複数のＤＮＡバーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０種またはそれを超える異なる識別子を産生することができる。
あるいは、ポリヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、複数のＤＮＡバーコードは、
４、９、１６、２５、３６、４９、６４、８１、１００、１２１、１４４、１６９、１９
６、２２５、２５６、２８９、３２４、３６１、４００種またはそれを超える異なる識別
子（これは、ＤＮＡバーコードがポリヌクレオチドの１端のみに取り付けられる場合の＾
２である）を産生することができる。一例において、６、７、８、９または１０種の同定
可能なヌクレオチド配列を有する複数のＤＮＡバーコードを使用することができる。ポリ
ヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、これらは、それぞれ３６、４９、６４、８１
または１００種の可能な異なる識別子を産生する。特定の例において、複数のＤＮＡバー
コードは、８種の同定可能なヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドの
一端のみに取り付けられる場合、複数のＤＮＡバーコードは、８種の異なる識別子を産生
することができる。あるいは、ポリヌクレオチドの両端に取り付けられる場合、複数のＤ
ＮＡバーコードは、６４種の異なる識別子を産生することができる。かかる仕方でタグ付
けされる試料は、約１０ｎｇから約１００ｎｇ、約１μｇ、約１０μｇのいずれかまでの
範囲の断片化ポリヌクレオチド、例えば、ゲノムＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡを有する試
料となり得る。
【0115】
ポリヌクレオチドは、様々な仕方で特有に同定することができる。ポリヌクレオチドは
、特有のＤＮＡバーコードにより特有に同定することができる。例えば、試料におけるい
ずれか２種のポリヌクレオチドは、２種の異なるＤＮＡバーコードに取り付けられる。あ
るいは、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードおよびポリヌクレオチドの１種または複
数の内在性配列の組合せにより特有に同定することができる。例えば、試料におけるいず
れか２種のポリヌクレオチドは、同じＤＮＡバーコードに取り付けることができるが、こ
の２種のポリヌクレオチドは、異なる内在性配列により依然として同定することができる
。内在性配列は、ポリヌクレオチドの末端に存在し得る。例えば、内在性配列は、取り付
けられたＤＮＡバーコードに隣接（例えば、その間の塩基）することができる。一部の事
例において、内在性配列は、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０
、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さとなり得る。好ましくは、内在性配列
は、解析しようとする断片／ポリヌクレオチドの末端配列である。内在性配列は、配列の
長さとなり得る。例えば、８種の異なるＤＮＡバーコードを含む複数のＤＮＡバーコード
は、試料における各ポリヌクレオチドの両端に取り付けることができる。試料における各
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードおよびポリヌクレオチドの末端における約１０塩
基対の内在性配列の組合せにより同定することができる。理論に制約されることなく、ポ
リヌクレオチドの内在性配列は、ポリヌクレオチド配列全体となることもできる。
、特有のＤＮＡバーコードにより特有に同定することができる。例えば、試料におけるい
ずれか２種のポリヌクレオチドは、２種の異なるＤＮＡバーコードに取り付けられる。あ
るいは、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードおよびポリヌクレオチドの１種または複
数の内在性配列の組合せにより特有に同定することができる。例えば、試料におけるいず
れか２種のポリヌクレオチドは、同じＤＮＡバーコードに取り付けることができるが、こ
の２種のポリヌクレオチドは、異なる内在性配列により依然として同定することができる
。内在性配列は、ポリヌクレオチドの末端に存在し得る。例えば、内在性配列は、取り付
けられたＤＮＡバーコードに隣接（例えば、その間の塩基）することができる。一部の事
例において、内在性配列は、少なくとも２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０
、６０、７０、８０、９０または１００塩基の長さとなり得る。好ましくは、内在性配列
は、解析しようとする断片／ポリヌクレオチドの末端配列である。内在性配列は、配列の
長さとなり得る。例えば、８種の異なるＤＮＡバーコードを含む複数のＤＮＡバーコード
は、試料における各ポリヌクレオチドの両端に取り付けることができる。試料における各
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡバーコードおよびポリヌクレオチドの末端における約１０塩
基対の内在性配列の組合せにより同定することができる。理論に制約されることなく、ポ
リヌクレオチドの内在性配列は、ポリヌクレオチド配列全体となることもできる。
【0116】
タグ付けされたポリヌクレオチドの組成物も本明細書に開示されている。タグ付けされ
たポリヌクレオチドは、一本鎖となり得る。あるいは、タグ付けされたポリヌクレオチド
は、二本鎖となり得る（例えば、二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチド）。したがって
、本発明は、二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチドの組成物も提供する。ポリヌクレオ
チドは、いずれかの種類の核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を含むことができる。ポ
リヌクレオチドは、本明細書に開示されているいずれかの種類のＤＮＡを含む。例えば、
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、断片化ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを含むことができ
る。ゲノム内のマッピング可能な塩基位置にマッピングされる組成物におけるポリヌクレ
オチドのセットは、非特有にタグ付けされ得る、すなわち、異なる識別子の数は、少なく
とも２かつマッピング可能な塩基位置にマッピングされるポリヌクレオチドの数未満とな
り得る。異なる識別子の数は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
かつマッピング可能な塩基位置にマッピングされるポリヌクレオチドの数未満となること
もできる。
たポリヌクレオチドは、一本鎖となり得る。あるいは、タグ付けされたポリヌクレオチド
は、二本鎖となり得る（例えば、二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチド）。したがって
、本発明は、二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチドの組成物も提供する。ポリヌクレオ
チドは、いずれかの種類の核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を含むことができる。ポ
リヌクレオチドは、本明細書に開示されているいずれかの種類のＤＮＡを含む。例えば、
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、断片化ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを含むことができ
る。ゲノム内のマッピング可能な塩基位置にマッピングされる組成物におけるポリヌクレ
オチドのセットは、非特有にタグ付けされ得る、すなわち、異なる識別子の数は、少なく
とも２かつマッピング可能な塩基位置にマッピングされるポリヌクレオチドの数未満とな
り得る。異なる識別子の数は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
かつマッピング可能な塩基位置にマッピングされるポリヌクレオチドの数未満となること
もできる。
【0117】
一部の事例において、組成物が、約１ｎｇから約１０μｇまたはより多くなるにつれて
、異なる分子バーコードのより大型のセットを使用することができる。例えば、５～１０
０種の間の異なるライブラリーアダプタを使用して、ｃｆＤＮＡ試料におけるポリヌクレ
オチドにタグ付けすることができる。
、異なる分子バーコードのより大型のセットを使用することができる。例えば、５～１０
０種の間の異なるライブラリーアダプタを使用して、ｃｆＤＮＡ試料におけるポリヌクレ
オチドにタグ付けすることができる。
【0118】
本明細書に開示されているシステムおよび方法は、分子バーコードの割り当てに関与す
る適用において使用することができる。分子バーコードは、本発明において開示されてい
るいずれかの種類のポリヌクレオチドに割り当てることができる。例えば、分子バーコー
ドは、無細胞ポリヌクレオチド（例えば、ｃｆＤＮＡ）に割り当てることができる。多く
の場合、本明細書に開示されている識別子は、ポリヌクレオチドのタグ付けに使用される
バーコードオリゴヌクレオチドとなり得る。バーコード識別子は、核酸オリゴヌクレオチ
ド（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）となり得る。バーコード識別子は、一本鎖とな
り得る。あるいは、バーコード識別子は、二本鎖となり得る。バーコード識別子は、本明
細書に開示されているいずれかの方法を使用してポリヌクレオチドに取り付けることがで
きる。例えば、バーコード識別子は、酵素を使用したライゲーションによりポリヌクレオ
チドに取り付けることができる。バーコード識別子は、ＰＣＲによりポリヌクレオチドに
取り込むこともできる。他の事例において、反応は、分析物への直接的な、あるいは同位
体で標識したプローブによる、金属同位体の添加を含むことができる。一般に、本開示の
反応物における特有または非特有識別子または分子バーコードの割り当ては、例えば、こ
れらそれぞれ、参照により本明細書に全体的に組み込まれる米国特許出願公開第２００１
／００５３５１９号、同第２００３／０１５２４９０号、同第２０１１／０１６００７８
号および米国特許第６，５８２，９０８号に記載されている方法およびシステムに従うこ
とができる。
る適用において使用することができる。分子バーコードは、本発明において開示されてい
るいずれかの種類のポリヌクレオチドに割り当てることができる。例えば、分子バーコー
ドは、無細胞ポリヌクレオチド（例えば、ｃｆＤＮＡ）に割り当てることができる。多く
の場合、本明細書に開示されている識別子は、ポリヌクレオチドのタグ付けに使用される
バーコードオリゴヌクレオチドとなり得る。バーコード識別子は、核酸オリゴヌクレオチ
ド（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）となり得る。バーコード識別子は、一本鎖とな
り得る。あるいは、バーコード識別子は、二本鎖となり得る。バーコード識別子は、本明
細書に開示されているいずれかの方法を使用してポリヌクレオチドに取り付けることがで
きる。例えば、バーコード識別子は、酵素を使用したライゲーションによりポリヌクレオ
チドに取り付けることができる。バーコード識別子は、ＰＣＲによりポリヌクレオチドに
取り込むこともできる。他の事例において、反応は、分析物への直接的な、あるいは同位
体で標識したプローブによる、金属同位体の添加を含むことができる。一般に、本開示の
反応物における特有または非特有識別子または分子バーコードの割り当ては、例えば、こ
れらそれぞれ、参照により本明細書に全体的に組み込まれる米国特許出願公開第２００１
／００５３５１９号、同第２００３／０１５２４９０号、同第２０１１／０１６００７８
号および米国特許第６，５８２，９０８号に記載されている方法およびシステムに従うこ
とができる。
【0119】
本明細書において使用されている識別子または分子バーコードは、完全に内在性となる
ことができ、これにより、個々の断片の環状ライゲーションを行い、続いてランダム剪断
または標的化増幅を行うことができる。この場合、分子の新たな開始および停止点ならび
に本来の分子内ライゲーション点の組合せは、特異的識別子を形成することができる。
ことができ、これにより、個々の断片の環状ライゲーションを行い、続いてランダム剪断
または標的化増幅を行うことができる。この場合、分子の新たな開始および停止点ならび
に本来の分子内ライゲーション点の組合せは、特異的識別子を形成することができる。
【0120】
本明細書において使用されている識別子または分子バーコードは、いずれかの種類のオ
リゴヌクレオチドを含むことができる。一部の事例において、識別子は、既定の、ランダ
ムまたはセミランダム配列オリゴヌクレオチドとなり得る。識別子は、バーコードとなり
得る。例えば、バーコードが、複数内で必ずしも互いに特有でないように、複数のバーコ
ードを使用することができる。あるいは、各バーコードが、複数内の他のいずれかのバー
コードに特有となるように、複数のバーコードを使用することができる。バーコードは、
個々に追跡され得る特異的な配列（例えば、既定の配列）を含むことができる。さらに、
バーコードおよびこれがライゲーションされ得る配列の組合せが、個々に追跡され得る特
異的な配列を作製するように、バーコードは、個々の分子に取り付けることができる（例
えば、ライゲーションにより）。本明細書に記載されている通り、配列リードの始まり（
開始）および／または終わり（停止）部分の配列データと組み合わせたバーコードの検出
は、特定の分子への特有の同一性の割り当てを可能にすることができる。個々の配列リー
ドの塩基対の長さまたは数を使用して、かかる分子に特有の同一性を割り当てることもで
きる。本明細書に記載されている通り、特有の同一性を割り当てられた核酸の一本鎖由来
の断片は、これにより、親鎖由来の断片のその後の同定を可能にすることができる。この
ようにして、試料におけるポリヌクレオチドは、特有にまたは実質的に特有にタグ付けす
ることができる。二重鎖タグは、縮重またはセミ縮重ヌクレオチド配列、例えば、ランダ
ム縮重配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、いずれかの数のヌクレオチドを含
むことができる。例えば、ヌクレオチド配列は、１（非天然ヌクレオチドを使用する場合
）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０
、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、
４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超えるヌクレオチドを含むこ
とができる。特定の例において、配列は、７ヌクレオチドを含むことができる。別の例に
おいて、配列は、８ヌクレオチドを含むことができる。配列は、９ヌクレオチドを含むこ
ともできる。配列は、１０ヌクレオチドを含むことができる。
リゴヌクレオチドを含むことができる。一部の事例において、識別子は、既定の、ランダ
ムまたはセミランダム配列オリゴヌクレオチドとなり得る。識別子は、バーコードとなり
得る。例えば、バーコードが、複数内で必ずしも互いに特有でないように、複数のバーコ
ードを使用することができる。あるいは、各バーコードが、複数内の他のいずれかのバー
コードに特有となるように、複数のバーコードを使用することができる。バーコードは、
個々に追跡され得る特異的な配列（例えば、既定の配列）を含むことができる。さらに、
バーコードおよびこれがライゲーションされ得る配列の組合せが、個々に追跡され得る特
異的な配列を作製するように、バーコードは、個々の分子に取り付けることができる（例
えば、ライゲーションにより）。本明細書に記載されている通り、配列リードの始まり（
開始）および／または終わり（停止）部分の配列データと組み合わせたバーコードの検出
は、特定の分子への特有の同一性の割り当てを可能にすることができる。個々の配列リー
ドの塩基対の長さまたは数を使用して、かかる分子に特有の同一性を割り当てることもで
きる。本明細書に記載されている通り、特有の同一性を割り当てられた核酸の一本鎖由来
の断片は、これにより、親鎖由来の断片のその後の同定を可能にすることができる。この
ようにして、試料におけるポリヌクレオチドは、特有にまたは実質的に特有にタグ付けす
ることができる。二重鎖タグは、縮重またはセミ縮重ヌクレオチド配列、例えば、ランダ
ム縮重配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、いずれかの数のヌクレオチドを含
むことができる。例えば、ヌクレオチド配列は、１（非天然ヌクレオチドを使用する場合
）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０
、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、
４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超えるヌクレオチドを含むこ
とができる。特定の例において、配列は、７ヌクレオチドを含むことができる。別の例に
おいて、配列は、８ヌクレオチドを含むことができる。配列は、９ヌクレオチドを含むこ
ともできる。配列は、１０ヌクレオチドを含むことができる。
【0121】
バーコードは、近接または非近接配列を含むことができる。４ヌクレオチドが、他のい
ずれかのヌクレオチドによって中断されていない場合、少なくとも１、２、３、４、５個
またはそれを超えるヌクレオチドを含むバーコードは、近接配列または非近接配列である
。例えば、バーコードが、配列ＴＴＧＣを含む場合、バーコードがＴＴＧＣであればバー
コードは近接している。他方では、バーコードがＴＴＸＧＣ（式中、Ｘは核酸塩基である
）である場合、バーコードは非近接である。
ずれかのヌクレオチドによって中断されていない場合、少なくとも１、２、３、４、５個
またはそれを超えるヌクレオチドを含むバーコードは、近接配列または非近接配列である
。例えば、バーコードが、配列ＴＴＧＣを含む場合、バーコードがＴＴＧＣであればバー
コードは近接している。他方では、バーコードがＴＴＸＧＣ（式中、Ｘは核酸塩基である
）である場合、バーコードは非近接である。
【0122】
識別子または分子バーコードは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを
超えるヌクレオチドの長さとなり得るｎ－ｍｅｒ配列を有することができる。本明細書に
おけるタグは、いずれかの範囲のヌクレオチドの長さを含むことができる。例えば、配列
は、２～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０の間または約５０ヌ
クレオチドの長さとなり得る。
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを
超えるヌクレオチドの長さとなり得るｎ－ｍｅｒ配列を有することができる。本明細書に
おけるタグは、いずれかの範囲のヌクレオチドの長さを含むことができる。例えば、配列
は、２～１００、１０～９０、２０～８０、３０～７０、４０～６０の間または約５０ヌ
クレオチドの長さとなり得る。
【0123】
タグは、識別子または分子バーコードの下流に二本鎖の固定された参照配列を含むこと
ができる。あるいは、タグは、識別子または分子バーコードの上流または下流に二本鎖の
固定された参照配列を含むことができる。二本鎖の固定された参照配列の各鎖は、例えば
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１
、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、
４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドの長さとなり得る。
ができる。あるいは、タグは、識別子または分子バーコードの上流または下流に二本鎖の
固定された参照配列を含むことができる。二本鎖の固定された参照配列の各鎖は、例えば
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１
、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、
４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドの長さとなり得る。
【0124】
Ｃ．アダプタ
【0125】
ポリヌクレオチド分子のライブラリーは、配列決定における使用のために合成すること
ができる。例えば、それぞれ、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０また
は３５核酸（またはヌクレオチド）塩基未満またはそれに等しい長さの複数のポリヌクレ
オチド分子を含むポリヌクレオチドのライブラリーを作製することができる。複数のポリ
ヌクレオチド分子はそれぞれ、３５核酸塩基未満またはそれに等しい長さとなり得る。複
数のポリヌクレオチド分子はそれぞれ、３０核酸塩基未満またはそれに等しい長さとなり
得る。複数のポリヌクレオチド分子は、２５０、２００、１５０、１００もしくは５０核
酸塩基未満またはそれに等しくなることもできる。その上、複数のポリヌクレオチド分子
は、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８
８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５
、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、
６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４
８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５
、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、
２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０核酸
塩基未満またはそれに等しくなることもできる。
ができる。例えば、それぞれ、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０また
は３５核酸（またはヌクレオチド）塩基未満またはそれに等しい長さの複数のポリヌクレ
オチド分子を含むポリヌクレオチドのライブラリーを作製することができる。複数のポリ
ヌクレオチド分子はそれぞれ、３５核酸塩基未満またはそれに等しい長さとなり得る。複
数のポリヌクレオチド分子はそれぞれ、３０核酸塩基未満またはそれに等しい長さとなり
得る。複数のポリヌクレオチド分子は、２５０、２００、１５０、１００もしくは５０核
酸塩基未満またはそれに等しくなることもできる。その上、複数のポリヌクレオチド分子
は、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８
８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５
、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、
６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４
８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５
、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、
２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１もしくは１０核酸
塩基未満またはそれに等しくなることもできる。
【0126】
複数のポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチドのライブラリーは、少なくとも４
核酸塩基に関して別個の（互いに関して）分子バーコード配列（または分子バーコード）
を有することもできる。分子バーコード（本明細書において同様に、「バーコード」また
は「識別子」）配列は、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドから識別するヌク
レオチド配列である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３
、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、
４７、４８、４９、５０またはそれを超える核酸塩基に関して異なるバーコード配列を有
することもできる。
核酸塩基に関して別個の（互いに関して）分子バーコード配列（または分子バーコード）
を有することもできる。分子バーコード（本明細書において同様に、「バーコード」また
は「識別子」）配列は、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドから識別するヌク
レオチド配列である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２
０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３
、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、
４７、４８、４９、５０またはそれを超える核酸塩基に関して異なるバーコード配列を有
することもできる。
【0127】
複数のポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の異なる
バーコード配列を有することもできる。例えば、複数のポリヌクレオチド分子は、少なく
とも４種の異なる分子バーコード配列を有することができる。一部の事例において、複数
のポリヌクレオチド分子は、２～１００、４～５０、４～３０、４～２０または４～１０
種の異なる分子バーコード配列を有する。複数のポリヌクレオチド分子は、１～４、２～
５、３～６、４～７、５～８、６～９、７～１０、８～１１、９～１２、１０～１３、１
１～１４、１２～１５、１３～１６、１４～１７、１５～１８、１６～１９、１７～２０
、１８～２１、１９～２２、２０～２３、２１～２４または２２～２５種の異なるバーコ
ード配列等、他の範囲の異なるバーコード配列を有することもできる。他の事例において
、複数のポリヌクレオチド分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００種またはそれを超
える（more）異なるバーコード配列を有することができる。特定の例において、複数のラ
イブラリーアダプターは、少なくとも８種の異なる配列を含む。
バーコード配列を有することもできる。例えば、複数のポリヌクレオチド分子は、少なく
とも４種の異なる分子バーコード配列を有することができる。一部の事例において、複数
のポリヌクレオチド分子は、２～１００、４～５０、４～３０、４～２０または４～１０
種の異なる分子バーコード配列を有する。複数のポリヌクレオチド分子は、１～４、２～
５、３～６、４～７、５～８、６～９、７～１０、８～１１、９～１２、１０～１３、１
１～１４、１２～１５、１３～１６、１４～１７、１５～１８、１６～１９、１７～２０
、１８～２１、１９～２２、２０～２３、２１～２４または２２～２５種の異なるバーコ
ード配列等、他の範囲の異なるバーコード配列を有することもできる。他の事例において
、複数のポリヌクレオチド分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００種またはそれを超
える（more）異なるバーコード配列を有することができる。特定の例において、複数のラ
イブラリーアダプターは、少なくとも８種の異なる配列を含む。
【0128】
異なるバーコード配列の位置は、複数のポリヌクレオチド内で変動し得る。例えば、異
なるバーコード配列は、複数のポリヌクレオチド分子のうちそれぞれ１種の末端から２０
、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３または２核酸塩基以内となり得る。一例にお
いて、複数のポリヌクレオチド分子は、末端から１０核酸塩基以内にある別個のバーコー
ド配列を有する。別の例において、複数のポリヌクレオチド分子は、末端から５または１
核酸塩基以内にある別個のバーコード配列を有する。他の事例において、別個のバーコー
ド配列は、複数のポリヌクレオチド分子のうちそれぞれ１種の末端に存在することができ
る。他のバリエーションは、別個の分子バーコード配列が、複数のポリヌクレオチド分子
のうちそれぞれ１種の末端から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９ま
たは４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、
６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５
４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７
４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８
４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９
４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００またはそれを超える核酸塩基以内
に存在し得る分子を含む。
なるバーコード配列は、複数のポリヌクレオチド分子のうちそれぞれ１種の末端から２０
、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３または２核酸塩基以内となり得る。一例にお
いて、複数のポリヌクレオチド分子は、末端から１０核酸塩基以内にある別個のバーコー
ド配列を有する。別の例において、複数のポリヌクレオチド分子は、末端から５または１
核酸塩基以内にある別個のバーコード配列を有する。他の事例において、別個のバーコー
ド配列は、複数のポリヌクレオチド分子のうちそれぞれ１種の末端に存在することができ
る。他のバリエーションは、別個の分子バーコード配列が、複数のポリヌクレオチド分子
のうちそれぞれ１種の末端から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９ま
たは４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、
６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５
４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７
４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８
４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９
４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００またはそれを超える核酸塩基以内
に存在し得る分子を含む。
【0129】
複数のポリヌクレオチド分子の末端は、標的核酸分子へのライゲーションに適応させる
ことができる。例えば、末端は、平滑末端となり得る。他の一部の事例において、末端は
、標的核酸分子の相補的配列へのハイブリダイゼーションに適応される。
ことができる。例えば、末端は、平滑末端となり得る。他の一部の事例において、末端は
、標的核酸分子の相補的配列へのハイブリダイゼーションに適応される。
【0130】
複数のポリヌクレオチド分子を含むポリヌクレオチドのライブラリーは、少なくとも１
の編集距離を有することもできる。一部の事例において、編集距離は、複数のポリヌクレ
オチド分子の個々の塩基に関する。他の事例において、複数のポリヌクレオチド分子は、
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、
２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４
２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを超える編集距離を有
することができる。編集距離は、ハミング距離となり得る。
の編集距離を有することもできる。一部の事例において、編集距離は、複数のポリヌクレ
オチド分子の個々の塩基に関する。他の事例において、複数のポリヌクレオチド分子は、
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、
２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４
２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを超える編集距離を有
することができる。編集距離は、ハミング距離となり得る。
【0131】
一部の事例において、複数のポリヌクレオチドは、配列決定アダプタを含有しない。配
列アダプタは、１種または複数の配列決定アダプタまたはプライマーにハイブリダイズす
る配列を含むポリヌクレオチドとなり得る。配列決定アダプタは、固体支持体、例えば、
フローセル配列にハイブリダイズする配列をさらに含むことができる。用語「フローセル
配列」およびその文法的均等は、本明細書において、例えば、基板に取り付けられたプラ
イマーにより基板へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を指す。基板は、ビーズ
または平面状の表面となり得る。一部の実施形態において、フローセル配列は、フローセ
ルまたは表面（例えば、ビーズの表面、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル）へのポリ
ヌクレオチドの取り付けを可能にし得る。
列アダプタは、１種または複数の配列決定アダプタまたはプライマーにハイブリダイズす
る配列を含むポリヌクレオチドとなり得る。配列決定アダプタは、固体支持体、例えば、
フローセル配列にハイブリダイズする配列をさらに含むことができる。用語「フローセル
配列」およびその文法的均等は、本明細書において、例えば、基板に取り付けられたプラ
イマーにより基板へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を指す。基板は、ビーズ
または平面状の表面となり得る。一部の実施形態において、フローセル配列は、フローセ
ルまたは表面（例えば、ビーズの表面、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル）へのポリ
ヌクレオチドの取り付けを可能にし得る。
【0132】
複数のポリヌクレオチド分子が、配列決定アダプタまたはプライマーを含有しない場合
、該複数のうち各ポリヌクレオチド分子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳＯＬｉＤ、Ｐａｃｉｆ
ｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒ
ｅ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｎｕ－Ｂｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、
Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅまたはＧｅｎｉａ等、所与の配列決定アプローチによる
標的核酸分子の配列決定を可能にするように適応された核酸配列または他の部分を含有し
ない。一部の例において、複数のポリヌクレオチド分子が、配列決定アダプタまたはプラ
イマーを含有しない場合、複数のポリヌクレオチド分子は、フローセル配列を含有しない
。例えば、複数のポリヌクレオチド分子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルシーケンサーに
おいて使用されるもの等、フローセルに結合できない。しかし、これらのフローセル配列
は、必要に応じて、ＰＣＲ増幅またはライゲーション等の方法によって複数のポリヌクレ
オチド分子に付加することができる。現時点では、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルシーケン
サーを使用することができる。あるいは、複数のポリヌクレオチド分子が、配列決定アダ
プタまたはプライマーを含有しない場合、複数のポリヌクレオチド分子は、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＳＭＲＴｂｅｌｌ（商標）アダプタ等、ヘアピン形アダプタ
または標的核酸分子においてヘアピンループを生成するためのアダプタを含有しない。し
かし、このようなヘアピン形アダプタは、必要に応じて、ＰＣＲ増幅またはライゲーショ
ン等、方法により複数のポリヌクレオチド分子に付加することができる。複数のポリヌク
レオチド分子は、環状または直鎖状となり得る。
、該複数のうち各ポリヌクレオチド分子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳＯＬｉＤ、Ｐａｃｉｆ
ｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒ
ｅ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｎｕ－Ｂｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、
Ｏｘｆｏｒｄ ＮａｎｏｐｏｒｅまたはＧｅｎｉａ等、所与の配列決定アプローチによる
標的核酸分子の配列決定を可能にするように適応された核酸配列または他の部分を含有し
ない。一部の例において、複数のポリヌクレオチド分子が、配列決定アダプタまたはプラ
イマーを含有しない場合、複数のポリヌクレオチド分子は、フローセル配列を含有しない
。例えば、複数のポリヌクレオチド分子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルシーケンサーに
おいて使用されるもの等、フローセルに結合できない。しかし、これらのフローセル配列
は、必要に応じて、ＰＣＲ増幅またはライゲーション等の方法によって複数のポリヌクレ
オチド分子に付加することができる。現時点では、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセルシーケン
サーを使用することができる。あるいは、複数のポリヌクレオチド分子が、配列決定アダ
プタまたはプライマーを含有しない場合、複数のポリヌクレオチド分子は、Ｐａｃｉｆｉ
ｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＳＭＲＴｂｅｌｌ（商標）アダプタ等、ヘアピン形アダプタ
または標的核酸分子においてヘアピンループを生成するためのアダプタを含有しない。し
かし、このようなヘアピン形アダプタは、必要に応じて、ＰＣＲ増幅またはライゲーショ
ン等、方法により複数のポリヌクレオチド分子に付加することができる。複数のポリヌク
レオチド分子は、環状または直鎖状となり得る。
【0133】
複数のポリヌクレオチド分子は、二本鎖となり得る。一部の事例において、複数のポリ
ヌクレオチド分子は、一本鎖となり得る、あるいはハイブリダイズされたおよびハイブリ
ダイズされていない領域を含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、非天然起
源のポリヌクレオチド分子となり得る。
ヌクレオチド分子は、一本鎖となり得る、あるいはハイブリダイズされたおよびハイブリ
ダイズされていない領域を含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、非天然起
源のポリヌクレオチド分子となり得る。
【0134】
アダプタは、ポリヌクレオチド分子となり得る。ポリヌクレオチド分子は、Ｙ字形、バ
ブル形またはヘアピン形となり得る。ヘアピンアダプタは、制限部位（複数可）またはウ
ラシル含有塩基を含有することができる。アダプタは、相補的部分および非相補的部分を
含むことができる。非相補的部分は、編集距離（例えば、ハミング距離）を有することが
できる。例えば、編集距離は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも
４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なく
とも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なく
とも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なく
とも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なく
とも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９または少
なくとも３０となり得る。アダプタの相補的部分は、ポリヌクレオチドへのライゲーショ
ンを可能にするおよび／または促進するために選択される配列、例えば、高収率でのポリ
ヌクレオチドへのライゲーションを可能にするおよび／または促進する配列を含むことが
できる。
ブル形またはヘアピン形となり得る。ヘアピンアダプタは、制限部位（複数可）またはウ
ラシル含有塩基を含有することができる。アダプタは、相補的部分および非相補的部分を
含むことができる。非相補的部分は、編集距離（例えば、ハミング距離）を有することが
できる。例えば、編集距離は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも
４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なく
とも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なく
とも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なく
とも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なく
とも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９または少
なくとも３０となり得る。アダプタの相補的部分は、ポリヌクレオチドへのライゲーショ
ンを可能にするおよび／または促進するために選択される配列、例えば、高収率でのポリ
ヌクレオチドへのライゲーションを可能にするおよび／または促進する配列を含むことが
できる。
【0135】
本明細書に開示されている複数のポリヌクレオチド分子は、精製することができる。一
部の事例において、本明細書に開示されている複数のポリヌクレオチド分子は、単離され
たポリヌクレオチド分子となり得る。他の事例において、本明細書に開示されている複数
のポリヌクレオチド分子は、精製および単離されたポリヌクレオチド分子となり得る。
部の事例において、本明細書に開示されている複数のポリヌクレオチド分子は、単離され
たポリヌクレオチド分子となり得る。他の事例において、本明細書に開示されている複数
のポリヌクレオチド分子は、精製および単離されたポリヌクレオチド分子となり得る。
【0136】
ある特定の態様において、複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれは、Ｙ字形またはヘ
アピン形である。複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれは、異なるバーコードを含むこ
とができる。異なるバーコードは、Ｙ字形またはヘアピン形アダプタの相補的部分（例え
ば、二本鎖部分）におけるランダマーとなり得る。あるいは、異なるバーコードは、非相
補的部分（例えば、Ｙ字形アームの１本）の１本の鎖に存在し得る。上に記す通り、異な
るバーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５また
はそれを超える（または本願を通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基、例え
ば、７塩基となり得る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接配列となり得る。
複数のポリヌクレオチド分子は、１０核酸塩基～３５核酸塩基の長さ（または上述のいず
れかの長さ）である。さらに、複数のポリヌクレオチド分子は、ハミング距離である編集
距離（上述）を含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、末端から１０核酸塩
基以内の別個のバーコード配列を有することができる。
アピン形である。複数のポリヌクレオチド分子のそれぞれは、異なるバーコードを含むこ
とができる。異なるバーコードは、Ｙ字形またはヘアピン形アダプタの相補的部分（例え
ば、二本鎖部分）におけるランダマーとなり得る。あるいは、異なるバーコードは、非相
補的部分（例えば、Ｙ字形アームの１本）の１本の鎖に存在し得る。上に記す通り、異な
るバーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５また
はそれを超える（または本願を通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基、例え
ば、７塩基となり得る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接配列となり得る。
複数のポリヌクレオチド分子は、１０核酸塩基～３５核酸塩基の長さ（または上述のいず
れかの長さ）である。さらに、複数のポリヌクレオチド分子は、ハミング距離である編集
距離（上述）を含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、末端から１０核酸塩
基以内の別個のバーコード配列を有することができる。
【0137】
別の態様において、複数のポリヌクレオチド分子は、配列決定アダプタとなり得る。配
列決定アダプタは、１種または複数の配列決定プライマーにハイブリダイズする配列を含
むことができる。配列決定アダプタは、固体支持体にハイブリダイズする配列、例えば、
フローセル配列をさらに含むことができる。例えば、配列決定アダプタは、フローセルア
ダプタとなり得る。配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片の一端または両端に取り
付けることができる。別の例において、配列決定アダプタは、ヘアピン形となり得る。例
えば、ヘアピン形アダプタは、相補的二本鎖部分およびループ部分を含むことができ、二
本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに取り付ける（例えば、ライゲーションする）こと
ができる。ヘアピン形配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片の両端に取り付けて、
複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる。配列決定アダプタは
、末端から末端まで、最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１
９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５
９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、
８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９
９、１００またはそれを超える塩基となり得る。例えば、配列決定アダプタは、末端から
末端まで最大７０塩基となり得る。配列決定アダプタは、末端から末端まで２０～３０、
２０～４０、３０～５０、３０～６０、４０～６０、４０～７０、５０～６０、５０～７
０塩基を含むことができる。特定の例において、配列決定アダプタは、末端から末端まで
２０～３０塩基を含むことができる。別の例において、配列決定アダプタは、末端から末
端まで５０～６０塩基を含むことができる。配列決定アダプタは、１種または複数のバー
コードを含むことができる。例えば、配列決定アダプタは、試料バーコードを含むことが
できる。試料バーコードは、既定の配列を含むことができる。試料バーコードを使用して
、ポリヌクレオチドの供給源を同定することができる。試料バーコードは、少なくとも１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれを超える（または本願を
通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基、例えば、少なくとも８塩基となり得
る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接配列となり得る。
列決定アダプタは、１種または複数の配列決定プライマーにハイブリダイズする配列を含
むことができる。配列決定アダプタは、固体支持体にハイブリダイズする配列、例えば、
フローセル配列をさらに含むことができる。例えば、配列決定アダプタは、フローセルア
ダプタとなり得る。配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片の一端または両端に取り
付けることができる。別の例において、配列決定アダプタは、ヘアピン形となり得る。例
えば、ヘアピン形アダプタは、相補的二本鎖部分およびループ部分を含むことができ、二
本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに取り付ける（例えば、ライゲーションする）こと
ができる。ヘアピン形配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片の両端に取り付けて、
複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる。配列決定アダプタは
、末端から末端まで、最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１
９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２
、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５
９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２
、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、
８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９
９、１００またはそれを超える塩基となり得る。例えば、配列決定アダプタは、末端から
末端まで最大７０塩基となり得る。配列決定アダプタは、末端から末端まで２０～３０、
２０～４０、３０～５０、３０～６０、４０～６０、４０～７０、５０～６０、５０～７
０塩基を含むことができる。特定の例において、配列決定アダプタは、末端から末端まで
２０～３０塩基を含むことができる。別の例において、配列決定アダプタは、末端から末
端まで５０～６０塩基を含むことができる。配列決定アダプタは、１種または複数のバー
コードを含むことができる。例えば、配列決定アダプタは、試料バーコードを含むことが
できる。試料バーコードは、既定の配列を含むことができる。試料バーコードを使用して
、ポリヌクレオチドの供給源を同定することができる。試料バーコードは、少なくとも１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれを超える（または本願を
通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基、例えば、少なくとも８塩基となり得
る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接配列となり得る。
【0138】
本明細書に記載されている複数のポリヌクレオチド分子は、アダプタとして使用するこ
とができる。アダプタは、１種または複数の識別子を含むことができる。アダプタは、ラ
ンダム配列を有する識別子を含むことができる。あるいは、アダプタは、既定の配列を有
する識別子を含むことができる。一部のアダプタは、ランダム配列を有する識別子および
既定の配列を有する別の識別子を含むことができる。識別子を含むアダプタは、二本鎖ま
たは一本鎖アダプタとなり得る。識別子を含むアダプタは、Ｙ字形アダプタとなり得る。
Ｙ字形アダプタは、ランダム配列を有する１種または複数の識別子を含むことができる。
１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる（hybrid）部分およ
び／またはハイブリダイズされない部分に存在し得る。Ｙ字形アダプタは、既定の配列を
有する１種または複数の識別子を含むことができる。既定の配列を有する１種または複数
の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる部分および／またはハイブリダイズ
されない部分に存在し得る。Ｙ字形アダプタは、ランダム配列を有する１種または複数の
識別子および既定の配列を有する１種または複数の識別子を含むことができる。例えば、
ランダム配列を有する１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされ
る部分および／またはＹ字形アダプタのハイブリダイズされない部分に存在し得る。既定
の配列を有する１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる部分
および／またはＹ字形アダプタのハイブリダイズされない部分に存在し得る。特定の例に
おいて、Ｙ字形アダプタは、そのハイブリダイズされる部分にランダム配列を有する識別
子を含み、そのハイブリダイズされない部分に既定の配列を有する識別子を含むことがで
きる。識別子は、本明細書に開示されているいずれかの長さとなり得る。例えば、Ｙ字形
アダプタは、そのハイブリダイズされる部分に７ヌクレオチドのランダム配列を有する識
別子を含み、そのハイブリダイズされない部分に８ヌクレオチドの既定の配列を有する識
別子を含むことができる。
とができる。アダプタは、１種または複数の識別子を含むことができる。アダプタは、ラ
ンダム配列を有する識別子を含むことができる。あるいは、アダプタは、既定の配列を有
する識別子を含むことができる。一部のアダプタは、ランダム配列を有する識別子および
既定の配列を有する別の識別子を含むことができる。識別子を含むアダプタは、二本鎖ま
たは一本鎖アダプタとなり得る。識別子を含むアダプタは、Ｙ字形アダプタとなり得る。
Ｙ字形アダプタは、ランダム配列を有する１種または複数の識別子を含むことができる。
１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる（hybrid）部分およ
び／またはハイブリダイズされない部分に存在し得る。Ｙ字形アダプタは、既定の配列を
有する１種または複数の識別子を含むことができる。既定の配列を有する１種または複数
の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる部分および／またはハイブリダイズ
されない部分に存在し得る。Ｙ字形アダプタは、ランダム配列を有する１種または複数の
識別子および既定の配列を有する１種または複数の識別子を含むことができる。例えば、
ランダム配列を有する１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされ
る部分および／またはＹ字形アダプタのハイブリダイズされない部分に存在し得る。既定
の配列を有する１種または複数の識別子は、Ｙ字形アダプタのハイブリダイズされる部分
および／またはＹ字形アダプタのハイブリダイズされない部分に存在し得る。特定の例に
おいて、Ｙ字形アダプタは、そのハイブリダイズされる部分にランダム配列を有する識別
子を含み、そのハイブリダイズされない部分に既定の配列を有する識別子を含むことがで
きる。識別子は、本明細書に開示されているいずれかの長さとなり得る。例えば、Ｙ字形
アダプタは、そのハイブリダイズされる部分に７ヌクレオチドのランダム配列を有する識
別子を含み、そのハイブリダイズされない部分に８ヌクレオチドの既定の配列を有する識
別子を含むことができる。
【0139】
アダプタは、分子バーコードを有する二本鎖部分および少なくとも１または２個の一本
鎖部分を含むことができる。例えば、アダプタは、Ｙ字形となり、二本鎖部分および２個
の一本鎖部分を含むことができる。一本鎖部分は、互いに相補的ではない配列を含むこと
ができる。
鎖部分を含むことができる。例えば、アダプタは、Ｙ字形となり、二本鎖部分および２個
の一本鎖部分を含むことができる。一本鎖部分は、互いに相補的ではない配列を含むこと
ができる。
【0140】
アダプタは、アダプタがポリヌクレオチドに効率的に（例えば、少なくとも約２０％、
３０％、４０％、５０％の効率で）ライゲーションされるまたは他の仕方でカップリング
されることを可能にするように選択される配列を有する末端を含むことができる。一部の
例において、アダプタの二本鎖部分における末端ヌクレオチドは、効率的ライゲーション
をもたらすためのプリンおよびピリミジンの組合せから選択される。
３０％、４０％、５０％の効率で）ライゲーションされるまたは他の仕方でカップリング
されることを可能にするように選択される配列を有する末端を含むことができる。一部の
例において、アダプタの二本鎖部分における末端ヌクレオチドは、効率的ライゲーション
をもたらすためのプリンおよびピリミジンの組合せから選択される。
【0141】
一部の例において、ライブラリーアダプタのセットは、分子バーコードを有する複数の
ポリヌクレオチド分子（ライブラリーアダプタ）を含む。ライブラリーアダプタは、８０
、７０、６０、５０、４５または４０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等しい長さであ
る。分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さとなり得るが、４～２０ヌ
クレオチド塩基の長さとなり得る。分子バーコードは、互いに異なり、互いの間に少なく
とも１、２、３、４または５の編集距離を有することができる。分子バーコードは、それ
ぞれのライブラリーアダプタの末端から少なくとも１、２、３、４、５、１０または２０
ヌクレオチド塩基離れて位置する。一部の事例において、少なくとも１末端塩基は、全ラ
イブラリーアダプタにおいて同一である。
ポリヌクレオチド分子（ライブラリーアダプタ）を含む。ライブラリーアダプタは、８０
、７０、６０、５０、４５または４０ヌクレオチド塩基未満またはそれに等しい長さであ
る。分子バーコードは、少なくとも４ヌクレオチド塩基の長さとなり得るが、４～２０ヌ
クレオチド塩基の長さとなり得る。分子バーコードは、互いに異なり、互いの間に少なく
とも１、２、３、４または５の編集距離を有することができる。分子バーコードは、それ
ぞれのライブラリーアダプタの末端から少なくとも１、２、３、４、５、１０または２０
ヌクレオチド塩基離れて位置する。一部の事例において、少なくとも１末端塩基は、全ラ
イブラリーアダプタにおいて同一である。
【0142】
ライブラリーアダプタは、分子バーコードを除いて同一となり得る。例えば、ライブラ
リーアダプタは、同一配列を有することができるが、分子バーコードのヌクレオチド配列
に関してのみ異なる。
リーアダプタは、同一配列を有することができるが、分子バーコードのヌクレオチド配列
に関してのみ異なる。
【0143】
ライブラリーアダプタのそれぞれは、二本鎖部分および少なくとも１個の一本鎖部分を
有することができる。「一本鎖部分」とは、非相補性またはオーバーハングの区域を意味
する。一部の事例において、ライブラリーアダプタのそれぞれは、二本鎖部分および２個
の一本鎖部分を有する。二本鎖部分は、分子バーコードを有することができる。一部の事
例において、分子バーコードは、ランダマーである。ライブラリーアダプタのそれぞれは
、一本鎖部分に鎖同定バーコードをさらに含むことができる。鎖同定バーコードは、少な
くとも４ヌクレオチド塩基、一部の事例において、４～２０ヌクレオチド塩基を含むこと
ができる。
有することができる。「一本鎖部分」とは、非相補性またはオーバーハングの区域を意味
する。一部の事例において、ライブラリーアダプタのそれぞれは、二本鎖部分および２個
の一本鎖部分を有する。二本鎖部分は、分子バーコードを有することができる。一部の事
例において、分子バーコードは、ランダマーである。ライブラリーアダプタのそれぞれは
、一本鎖部分に鎖同定バーコードをさらに含むことができる。鎖同定バーコードは、少な
くとも４ヌクレオチド塩基、一部の事例において、４～２０ヌクレオチド塩基を含むこと
ができる。
【0144】
一部の例において、ライブラリーアダプタのそれぞれは、分子バーコードを有する二本
鎖部分および２個の一本鎖部分を有する。一本鎖部分は、互いにハイブリダイズしなくて
よい。一本鎖部分は、互いに完全に相補的でなくてよい。
鎖部分および２個の一本鎖部分を有する。一本鎖部分は、互いにハイブリダイズしなくて
よい。一本鎖部分は、互いに完全に相補的でなくてよい。
【0145】
ライブラリーアダプタは、同じである二本鎖部分に末端ヌクレオチドの配列を有するこ
とができる。末端ヌクレオチドの配列は、少なくとも２、３、４、５または６ヌクレオチ
ド塩基の長さとなり得る。例えば、ライブラリーアダプタの二本鎖部分の一方の鎖は、末
端に配列ＡＣＴＴ、ＴＣＧＣまたはＴＡＣＣを有することができる一方、他方の鎖は、相
補的配列を有することができる。一部の事例において、かかる配列は、ライブラリーアダ
プタが標的ポリヌクレオチドにライゲーションする効率を最適化するように選択される。
かかる配列は、ライブラリーアダプタの末端および標的ポリヌクレオチドの間の結合相互
作用を最適化するように選択することができる。
とができる。末端ヌクレオチドの配列は、少なくとも２、３、４、５または６ヌクレオチ
ド塩基の長さとなり得る。例えば、ライブラリーアダプタの二本鎖部分の一方の鎖は、末
端に配列ＡＣＴＴ、ＴＣＧＣまたはＴＡＣＣを有することができる一方、他方の鎖は、相
補的配列を有することができる。一部の事例において、かかる配列は、ライブラリーアダ
プタが標的ポリヌクレオチドにライゲーションする効率を最適化するように選択される。
かかる配列は、ライブラリーアダプタの末端および標的ポリヌクレオチドの間の結合相互
作用を最適化するように選択することができる。
【0146】
一部の事例において、ライブラリーアダプタのいずれも、試料同定モチーフ（または試
料分子バーコード）を含有しない。かかる試料同定モチーフは、配列決定アダプタにより
もたらすことができる。試料同定モチーフは、所与の試料由来のポリヌクレオチド分子の
、他の試料由来のポリヌクレオチド分子からの同定を可能にする少なくとも４、５、６、
７、８、９、１０、２０、３０または４０ヌクレオチド塩基のシーケンサーを含むことが
できる。例えば、これは、２名の対象由来のポリヌクレオチド分子が同じプールにおいて
配列決定され、該対象の配列リードがその後に同定されることを可能にし得る。
料分子バーコード）を含有しない。かかる試料同定モチーフは、配列決定アダプタにより
もたらすことができる。試料同定モチーフは、所与の試料由来のポリヌクレオチド分子の
、他の試料由来のポリヌクレオチド分子からの同定を可能にする少なくとも４、５、６、
７、８、９、１０、２０、３０または４０ヌクレオチド塩基のシーケンサーを含むことが
できる。例えば、これは、２名の対象由来のポリヌクレオチド分子が同じプールにおいて
配列決定され、該対象の配列リードがその後に同定されることを可能にし得る。
【0147】
シーケンサーモチーフは、配列決定システムへのライブラリーアダプタのカップリング
およびライブラリーアダプタにカップリングされた標的ポリヌクレオチドの配列決定に必
要とされるヌクレオチド配列（複数可）を含む。シーケンサーモチーフは、フローセル配
列に相補的な配列および配列決定における使用のためのプライマー（またはプライミング
配列）に選択的にハイブリダイズ可能な配列（配列決定開始配列）を含むことができる。
例えば、かかる配列決定開始配列は、合成による配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
における使用に用いられるプライマーに相補的となり得る。かかるプライマーは、配列決
定アダプタに含まれ得る。配列決定開始配列は、プライマーハイブリダイゼーション部位
となり得る。
およびライブラリーアダプタにカップリングされた標的ポリヌクレオチドの配列決定に必
要とされるヌクレオチド配列（複数可）を含む。シーケンサーモチーフは、フローセル配
列に相補的な配列および配列決定における使用のためのプライマー（またはプライミング
配列）に選択的にハイブリダイズ可能な配列（配列決定開始配列）を含むことができる。
例えば、かかる配列決定開始配列は、合成による配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）
における使用に用いられるプライマーに相補的となり得る。かかるプライマーは、配列決
定アダプタに含まれ得る。配列決定開始配列は、プライマーハイブリダイゼーション部位
となり得る。
【0148】
一部の事例において、ライブラリーアダプタのいずれも、完全シーケンサーモチーフを
含有しない。ライブラリーアダプタは、部分的シーケンサーモチーフを含有することがで
きる、またはシーケンサーモチーフを含有しない。一部の事例において、ライブラリーア
ダプタは、配列決定開始配列を含む。ライブラリーアダプタは、配列決定開始配列を含む
ことができるが、フローセル配列を含まない。配列決定開始配列は、配列決定のためのプ
ライマーに相補的となり得る。プライマーは、配列特異的プライマーまたはユニバーサル
プライマーとなり得る。かかる配列決定開始配列は、ライブラリーアダプタの一本鎖部分
に位置し得る。代替として、かかる配列決定開始配列は、配列決定の際にポリメラーゼが
ライブラリーアダプタにカップリングすることを可能にするためのプライミング部位（例
えば、ねじれ（kink）またはニック）となり得る。
含有しない。ライブラリーアダプタは、部分的シーケンサーモチーフを含有することがで
きる、またはシーケンサーモチーフを含有しない。一部の事例において、ライブラリーア
ダプタは、配列決定開始配列を含む。ライブラリーアダプタは、配列決定開始配列を含む
ことができるが、フローセル配列を含まない。配列決定開始配列は、配列決定のためのプ
ライマーに相補的となり得る。プライマーは、配列特異的プライマーまたはユニバーサル
プライマーとなり得る。かかる配列決定開始配列は、ライブラリーアダプタの一本鎖部分
に位置し得る。代替として、かかる配列決定開始配列は、配列決定の際にポリメラーゼが
ライブラリーアダプタにカップリングすることを可能にするためのプライミング部位（例
えば、ねじれ（kink）またはニック）となり得る。
【0149】
一部の事例において、部分的または完全シーケンサーモチーフは、配列決定アダプタに
よってもたらされる。配列決定アダプタは、試料分子バーコードおよびシーケンサーモチ
ーフを含むことができる。配列決定アダプタは、ライブラリーアダプタから離間したセッ
トにおいて提供することができる。所与のセットにおける配列決定アダプタは、同一のも
のとなり得る － すなわち、同じ試料バーコードおよびシーケンサーモチーフを含有す
る。
よってもたらされる。配列決定アダプタは、試料分子バーコードおよびシーケンサーモチ
ーフを含むことができる。配列決定アダプタは、ライブラリーアダプタから離間したセッ
トにおいて提供することができる。所与のセットにおける配列決定アダプタは、同一のも
のとなり得る － すなわち、同じ試料バーコードおよびシーケンサーモチーフを含有す
る。
【0150】
配列決定アダプタは、試料同定モチーフおよびシーケンサーモチーフを含むことができ
る。シーケンサーモチーフは、配列決定開始配列に相補的なプライマーを含むことができ
る。一部の事例において、シーケンサーモチーフは、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオ
チドをシーケンサーによって配列決定させる様式で構成または配置されることを可能にす
る、フローセル配列または他の配列も含む。
る。シーケンサーモチーフは、配列決定開始配列に相補的なプライマーを含むことができ
る。一部の事例において、シーケンサーモチーフは、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオ
チドをシーケンサーによって配列決定させる様式で構成または配置されることを可能にす
る、フローセル配列または他の配列も含む。
【0151】
ライブラリーアダプタおよび配列決定アダプタはそれぞれ、部分的アダプタとなること
ができる、すなわち、配列決定プラットフォームによる配列決定を可能にするために必要
な配列の一部を含有するが、その全てを含有する訳ではない。これらは一体になって完全
アダプタをもたらす。例えば、ライブラリーアダプタは、部分的シーケンサーモチーフを
含むことができる、またはシーケンサーモチーフを含まないが、かかるシーケンサーモチ
ーフは、配列決定アダプタによってもたらされる。
ができる、すなわち、配列決定プラットフォームによる配列決定を可能にするために必要
な配列の一部を含有するが、その全てを含有する訳ではない。これらは一体になって完全
アダプタをもたらす。例えば、ライブラリーアダプタは、部分的シーケンサーモチーフを
含むことができる、またはシーケンサーモチーフを含まないが、かかるシーケンサーモチ
ーフは、配列決定アダプタによってもたらされる。
【0152】
図９Ａ～図９Ｃは、標的ポリヌクレオチド分子にライブラリーアダプタをタグ付けする
ための方法を模式的に図解する。図９Ａは、鎖の一方にプライマーハイブリダイゼーショ
ン部位および別の末端に向かって分子バーコードを含有する部分的アダプタとしてライブ
ラリーアダプタを示す。プライマーハイブリダイゼーション部位は、その後の配列決定の
ための配列決定開始配列となり得る。ライブラリーアダプタは、８０ヌクレオチド塩基未
満またはそれに等しい長さである。図９Ｂにおいて、ライブラリーアダプタは、標的ポリ
ヌクレオチド分子の両端においてライゲーションされて、タグ付けされた標的ポリヌクレ
オチド分子をもたらす。タグ付けされた標的ポリヌクレオチド分子を核酸増幅に供して、
標的のコピーを生成することができる。次に、図９Ｃにおいて、シーケンサーモチーフを
含有する配列決定アダプタが提供され、タグ付けされた標的ポリヌクレオチド分子にハイ
ブリダイズされる。配列決定アダプタは、試料同定モチーフを含有する。配列決定アダプ
タは、所与のシーケンサーによるタグ付けされた標的の配列決定を可能にするための配列
を含有することができる。
ための方法を模式的に図解する。図９Ａは、鎖の一方にプライマーハイブリダイゼーショ
ン部位および別の末端に向かって分子バーコードを含有する部分的アダプタとしてライブ
ラリーアダプタを示す。プライマーハイブリダイゼーション部位は、その後の配列決定の
ための配列決定開始配列となり得る。ライブラリーアダプタは、８０ヌクレオチド塩基未
満またはそれに等しい長さである。図９Ｂにおいて、ライブラリーアダプタは、標的ポリ
ヌクレオチド分子の両端においてライゲーションされて、タグ付けされた標的ポリヌクレ
オチド分子をもたらす。タグ付けされた標的ポリヌクレオチド分子を核酸増幅に供して、
標的のコピーを生成することができる。次に、図９Ｃにおいて、シーケンサーモチーフを
含有する配列決定アダプタが提供され、タグ付けされた標的ポリヌクレオチド分子にハイ
ブリダイズされる。配列決定アダプタは、試料同定モチーフを含有する。配列決定アダプ
タは、所与のシーケンサーによるタグ付けされた標的の配列決定を可能にするための配列
を含有することができる。
【0153】
Ｄ．配列決定
【0154】
タグ付けされたポリヌクレオチドを配列決定して、配列リードを生成することができる
（例えば、ステップ（１０６）、図１に示す通り）。例えば、タグ付けされた二重鎖ポリ
ヌクレオチドを配列決定することができる。配列リードは、タグ付けされた二重鎖ポリヌ
クレオチドの一方の鎖のみから生成することができる。あるいは、タグ付けされた二重鎖
ポリヌクレオチドの両方の鎖が、配列リードを生成することができる。タグ付けされた二
重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、同じタグを含むことができる。あるいは、タグ付け
された二重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、異なるタグを含むことができる。タグ付け
された二重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖が、異なってタグ付けされた場合、一方の鎖（
例えば、ワトソン鎖）から生成された配列リードは、他方の鎖（例えば、クリック鎖）か
ら生成された配列リードから識別することができる。配列決定は、分子毎に複数の配列リ
ードの生成に関与することができる。これは、例えば、配列決定プロセスにおける、例え
ば、ＰＣＲによる個々のポリヌクレオチド鎖の増幅の結果生じる。
（例えば、ステップ（１０６）、図１に示す通り）。例えば、タグ付けされた二重鎖ポリ
ヌクレオチドを配列決定することができる。配列リードは、タグ付けされた二重鎖ポリヌ
クレオチドの一方の鎖のみから生成することができる。あるいは、タグ付けされた二重鎖
ポリヌクレオチドの両方の鎖が、配列リードを生成することができる。タグ付けされた二
重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、同じタグを含むことができる。あるいは、タグ付け
された二重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、異なるタグを含むことができる。タグ付け
された二重鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖が、異なってタグ付けされた場合、一方の鎖（
例えば、ワトソン鎖）から生成された配列リードは、他方の鎖（例えば、クリック鎖）か
ら生成された配列リードから識別することができる。配列決定は、分子毎に複数の配列リ
ードの生成に関与することができる。これは、例えば、配列決定プロセスにおける、例え
ば、ＰＣＲによる個々のポリヌクレオチド鎖の増幅の結果生じる。
【0155】
本明細書に開示されている方法は、ポリヌクレオチドの増幅を含むことができる。ポリ
ヌクレオチド増幅は、核酸分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みをもたらし
、これにより、鋳型核酸に相補的な新たな核酸分子を形成することができる。新たに形成
されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、追加的なポリヌクレオチドを合成するた
めの鋳型として使用することができる。増幅されているポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｃｆＤＮＡおよび循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む
いずれかの核酸、例えば、デオキシリボ核酸となり得る。増幅されているポリヌクレオチ
ドは、ＲＮＡとなることもできる。本明細書において、１回の増幅反応は、ＤＮＡ複製の
多くのラウンドを含むことができる。ＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を含むことができる。１回のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の２～１００「サイク
ル」の変性、アニーリングおよび合成を含むことができる。例えば、増幅ステップにおい
て２～７、５～１０、６～１１、７～１２、８～１３、９～１４、１０～１５、１１～１
６、１２～１７、１３～１８、１４～１９または１５～２０サイクルを行うことができる
。ＰＣＲ条件は、プライマーを含む配列のＧＣ含量に基づき最適化することができる。
ヌクレオチド増幅は、核酸分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みをもたらし
、これにより、鋳型核酸に相補的な新たな核酸分子を形成することができる。新たに形成
されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、追加的なポリヌクレオチドを合成するた
めの鋳型として使用することができる。増幅されているポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｃｆＤＮＡおよび循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む
いずれかの核酸、例えば、デオキシリボ核酸となり得る。増幅されているポリヌクレオチ
ドは、ＲＮＡとなることもできる。本明細書において、１回の増幅反応は、ＤＮＡ複製の
多くのラウンドを含むことができる。ＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を含むことができる。１回のＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の２～１００「サイク
ル」の変性、アニーリングおよび合成を含むことができる。例えば、増幅ステップにおい
て２～７、５～１０、６～１１、７～１２、８～１３、９～１４、１０～１５、１１～１
６、１２～１７、１３～１８、１４～１９または１５～２０サイクルを行うことができる
。ＰＣＲ条件は、プライマーを含む配列のＧＣ含量に基づき最適化することができる。
【0156】
本明細書に記載されているアッセイと共に、核酸増幅技法を使用することができる。一
部の増幅技法は、ＰＣＲ方法論であり、その例として、溶液ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕ
ＰＣＲを挙げることができるがこれらに限定されない。例えば、増幅は、ＰＣＲに基づ
く増幅を含むことができる。あるいは、増幅は、ＰＣＲに基づかない増幅を含むことがで
きる。鋳型核酸の増幅は、１種または複数のポリメラーゼの使用を含むことができる。例
えば、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼとなり得る。一部
の事例において、高忠実度ポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度
ＤＮＡポリメラーゼ）またはＰＣＲプロトコールの使用による等、高忠実度増幅が行われ
る。一部の事例において、ポリメラーゼは、高忠実度ポリメラーゼとなり得る。例えば、
ポリメラーゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼとなり得る。ポリメラーゼは
、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼとなることもできる。ポリメラーゼは、例えば、
断片長、ＧＣ含量等による増幅バイアスを低下または最小化する反応条件下で使用するこ
とができる。
部の増幅技法は、ＰＣＲ方法論であり、その例として、溶液ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕ
ＰＣＲを挙げることができるがこれらに限定されない。例えば、増幅は、ＰＣＲに基づ
く増幅を含むことができる。あるいは、増幅は、ＰＣＲに基づかない増幅を含むことがで
きる。鋳型核酸の増幅は、１種または複数のポリメラーゼの使用を含むことができる。例
えば、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼとなり得る。一部
の事例において、高忠実度ポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度
ＤＮＡポリメラーゼ）またはＰＣＲプロトコールの使用による等、高忠実度増幅が行われ
る。一部の事例において、ポリメラーゼは、高忠実度ポリメラーゼとなり得る。例えば、
ポリメラーゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼとなり得る。ポリメラーゼは
、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼとなることもできる。ポリメラーゼは、例えば、
断片長、ＧＣ含量等による増幅バイアスを低下または最小化する反応条件下で使用するこ
とができる。
【0157】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの一本鎖の増幅は、かかる鎖およびその相補体の両方の
コピーを生成するであろう。配列決定の際に、鎖およびその相補体の両方が、配列リード
を生成するであろう。しかし、例えば、ワトソン鎖の相補体から生成された配列リードは
、本来のワトソン鎖にタグ付けされた二重鎖タグの部分の相補体を有するため、そのよう
に同定することができる。対照的に、クリック鎖またはその増幅産物から生成された配列
リードは、本来のクリック鎖にタグ付けされた二重鎖タグの部分を有するであろう。この
ようにして、ワトソン鎖の相補体の増幅された産物から生成された配列リードは、本来の
分子のクリック鎖の増幅産物から生成された相補体配列リードから識別することができる
。
コピーを生成するであろう。配列決定の際に、鎖およびその相補体の両方が、配列リード
を生成するであろう。しかし、例えば、ワトソン鎖の相補体から生成された配列リードは
、本来のワトソン鎖にタグ付けされた二重鎖タグの部分の相補体を有するため、そのよう
に同定することができる。対照的に、クリック鎖またはその増幅産物から生成された配列
リードは、本来のクリック鎖にタグ付けされた二重鎖タグの部分を有するであろう。この
ようにして、ワトソン鎖の相補体の増幅された産物から生成された配列リードは、本来の
分子のクリック鎖の増幅産物から生成された相補体配列リードから識別することができる
。
【0158】
増幅されたポリヌクレオチドは全て、配列決定のために配列決定装置に提出することが
できる。あるいは、増幅されたポリヌクレオチドの全てのサンプリング、またはサブセッ
トは、配列決定のために配列決定装置に提出される。いずれか本来の二本鎖ポリヌクレオ
チドに関して、配列決定に関して３通りの結果が存在し得る。第１に、配列リードは、本
来の分子の両方の相補鎖から（すなわち、ワトソン鎖およびクリック鎖の両方から）生成
することができる。第２に、配列リードは、２本の相補鎖のうち１本のみから（すなわち
、ワトソン鎖またはクリック鎖のいずれかからであって、両方からではない）生成するこ
とができる。第３に、配列リードは、２本の相補鎖のいずれから生成することもできない
。結果的に、ある遺伝子座にマッピングされる特有の配列リードの計数は、この遺伝子座
にマッピングされる本来の試料における二本鎖ポリヌクレオチドの数を過小評価するであ
ろう。未観測および未計数のポリヌクレオチドを推定する方法が、本明細書に記載されて
いる。
できる。あるいは、増幅されたポリヌクレオチドの全てのサンプリング、またはサブセッ
トは、配列決定のために配列決定装置に提出される。いずれか本来の二本鎖ポリヌクレオ
チドに関して、配列決定に関して３通りの結果が存在し得る。第１に、配列リードは、本
来の分子の両方の相補鎖から（すなわち、ワトソン鎖およびクリック鎖の両方から）生成
することができる。第２に、配列リードは、２本の相補鎖のうち１本のみから（すなわち
、ワトソン鎖またはクリック鎖のいずれかからであって、両方からではない）生成するこ
とができる。第３に、配列リードは、２本の相補鎖のいずれから生成することもできない
。結果的に、ある遺伝子座にマッピングされる特有の配列リードの計数は、この遺伝子座
にマッピングされる本来の試料における二本鎖ポリヌクレオチドの数を過小評価するであ
ろう。未観測および未計数のポリヌクレオチドを推定する方法が、本明細書に記載されて
いる。
【0159】
配列決定方法は、大規模並列配列決定となり得る、すなわち、少なくとも１００、１０
００、１０，０００、１００，０００、１００万、１千万、１億または１０億ポリヌクレ
オチド分子のいずれかを同時に（または素早く連続して）配列決定する。配列決定方法と
して、ハイスループット配列決定、ピロシーケンス、合成による配列決定、単一分子配列
決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダ
イゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一
分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローナル単一分
子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、マクサム・ギルバートまたはサンガ
ー配列決定、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅ
ｎｔまたはナノポアプラットフォームを使用した配列決定、および本技術分野で公知の他
のいずれかの配列決定方法を挙げることができるがこれらに限定されない。
００、１０，０００、１００，０００、１００万、１千万、１億または１０億ポリヌクレ
オチド分子のいずれかを同時に（または素早く連続して）配列決定する。配列決定方法と
して、ハイスループット配列決定、ピロシーケンス、合成による配列決定、単一分子配列
決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダ
イゼーションによる配列決定、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定、合成による単一
分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローナル単一分
子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、マクサム・ギルバートまたはサンガ
ー配列決定、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅ
ｎｔまたはナノポアプラットフォームを使用した配列決定、および本技術分野で公知の他
のいずれかの配列決定方法を挙げることができるがこれらに限定されない。
【0160】
例えば、二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチドは、例えばＰＣＲにより増幅すること
ができる（例えば、図４Ａを参照；二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチドは、ｍｍ’お
よびｎｎ’と称される）。図４Ａにおいて、配列ｍを含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は
、配列タグｗおよびｙを有する一方、配列ｍ’を含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配
列タグｘおよびｚを有する。同様に、配列ｎを含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配列
タグａおよびｃを有する一方、配列ｎ’を含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配列タグ
ｂおよびｄを有する。増幅において、各鎖は、それ自身およびその相補的配列を産生する
。しかし、例えば、本来の鎖ｍの後代は、配列５’－ｙ’ｍ’ｗ’－３’を有し、本来の
ｍ’鎖１本鎖の後代は、配列５’－ｚｍ’ｘ－３’を有するため、相補的配列ｍ’を含む
本来の鎖ｍの増幅後代は、本来の鎖ｍ’の増幅後代から識別可能である。図４Ｂは、増幅
をより詳細に示す。増幅において、ドットによって表されるエラーが、増幅後代に導入さ
れ得る。あらゆる鎖が、配列リードを産生するわけではなくなるように、適用後代を配列
決定のためにサンプリングし、示されている配列リードをもたらす。配列リードは、鎖ま
たはその相補体のいずれかに起因し得るため、配列および相補体配列の両方が、配列リー
ドのセットに含まれるであろう。ポリヌクレオチドが、各末端に同じタグを有することが
可能であることに留意されたい。よって、タグ「ａ」およびポリヌクレオチド「ｍ」に関
して、第１の鎖は、ａ－ｍ－ａ’とタグ付けされ、相補体は、ａ－ｍ’－ａとタグ付けさ
れ得る。
ができる（例えば、図４Ａを参照；二重鎖タグ付けされたポリヌクレオチドは、ｍｍ’お
よびｎｎ’と称される）。図４Ａにおいて、配列ｍを含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は
、配列タグｗおよびｙを有する一方、配列ｍ’を含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配
列タグｘおよびｚを有する。同様に、配列ｎを含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配列
タグａおよびｃを有する一方、配列ｎ’を含む二重鎖ポリヌクレオチドの鎖は、配列タグ
ｂおよびｄを有する。増幅において、各鎖は、それ自身およびその相補的配列を産生する
。しかし、例えば、本来の鎖ｍの後代は、配列５’－ｙ’ｍ’ｗ’－３’を有し、本来の
ｍ’鎖１本鎖の後代は、配列５’－ｚｍ’ｘ－３’を有するため、相補的配列ｍ’を含む
本来の鎖ｍの増幅後代は、本来の鎖ｍ’の増幅後代から識別可能である。図４Ｂは、増幅
をより詳細に示す。増幅において、ドットによって表されるエラーが、増幅後代に導入さ
れ得る。あらゆる鎖が、配列リードを産生するわけではなくなるように、適用後代を配列
決定のためにサンプリングし、示されている配列リードをもたらす。配列リードは、鎖ま
たはその相補体のいずれかに起因し得るため、配列および相補体配列の両方が、配列リー
ドのセットに含まれるであろう。ポリヌクレオチドが、各末端に同じタグを有することが
可能であることに留意されたい。よって、タグ「ａ」およびポリヌクレオチド「ｍ」に関
して、第１の鎖は、ａ－ｍ－ａ’とタグ付けされ、相補体は、ａ－ｍ’－ａとタグ付けさ
れ得る。
【0161】
Ｅ．コンセンサス配列リードの決定
【0162】
本明細書に開示されている方法は、冗長性を低下または追跡することによる等、配列リ
ードにおけるコンセンサス配列リードを決定するステップを含むことができる（例えば、
ステップ（１０８）、図１に示す通り）。増幅されたポリヌクレオチドの配列決定は、「
冗長リード」と称される、同じ本来のポリヌクレオチド由来の数種類の増幅産物のリード
を産生することができる。冗長リードを同定することにより、本来の試料における特有の
分子を決定することができる。試料における分子が、特有にタグ付けされる場合、単一の
特有の本来の分子の増幅から生成されたリードは、それらの別個のバーコードに基づき同
定することができる。バーコードを無視すると、特有の本来の分子由来のリードは、任意
選択で、リードの長さと組み合わせて、リードの始まりおよび終わりにおける配列に基づ
き決定することができる。しかし、ある特定の事例において、試料は、同じ開始停止配列
および同じ長さを有する複数の本来の分子を有すると予想され得る。バーコーディングな
しでは、これらの分子は、互いの識別が困難である。しかし、ポリヌクレオチドのコレク
ションが、非特有にタグ付けされる場合（すなわち、本来の分子が、少なくとも１種の他
の本来の分子と同じ識別子を共有する場合）、開始／停止配列および／またはポリヌクレ
オチド長と、バーコード由来の情報との組合せは、いずれかの配列リードを本来のポリヌ
クレオチドへとトレースできる確率を有意に増加させる。これは一部には、特有のタグ付
けがなくても、同じ開始／停止配列および長さを有するいずれか２種の本来のポリヌクレ
オチドが同様に、同じ識別子をタグ付けされる可能性が低いことが理由である。
ードにおけるコンセンサス配列リードを決定するステップを含むことができる（例えば、
ステップ（１０８）、図１に示す通り）。増幅されたポリヌクレオチドの配列決定は、「
冗長リード」と称される、同じ本来のポリヌクレオチド由来の数種類の増幅産物のリード
を産生することができる。冗長リードを同定することにより、本来の試料における特有の
分子を決定することができる。試料における分子が、特有にタグ付けされる場合、単一の
特有の本来の分子の増幅から生成されたリードは、それらの別個のバーコードに基づき同
定することができる。バーコードを無視すると、特有の本来の分子由来のリードは、任意
選択で、リードの長さと組み合わせて、リードの始まりおよび終わりにおける配列に基づ
き決定することができる。しかし、ある特定の事例において、試料は、同じ開始停止配列
および同じ長さを有する複数の本来の分子を有すると予想され得る。バーコーディングな
しでは、これらの分子は、互いの識別が困難である。しかし、ポリヌクレオチドのコレク
ションが、非特有にタグ付けされる場合（すなわち、本来の分子が、少なくとも１種の他
の本来の分子と同じ識別子を共有する場合）、開始／停止配列および／またはポリヌクレ
オチド長と、バーコード由来の情報との組合せは、いずれかの配列リードを本来のポリヌ
クレオチドへとトレースできる確率を有意に増加させる。これは一部には、特有のタグ付
けがなくても、同じ開始／停止配列および長さを有するいずれか２種の本来のポリヌクレ
オチドが同様に、同じ識別子をタグ付けされる可能性が低いことが理由である。
【0163】
Ｆ．崩壊
【0164】
崩壊は、プロセスの各ステップにおいて生成されるノイズ（すなわち、バックグラウン
ド）の低下を可能にする。本明細書に開示されている方法は、コンセンサス配列を崩壊、
例えば、複数の配列リードを比較することによりこれを生成するステップを含むことがで
きる。例えば、単一の本来のポリヌクレオチドから生成された配列リードを使用して、か
かる本来のポリヌクレオチドのコンセンサス配列を生成することができる。増幅の反復的
ラウンドは、後代ポリヌクレオチドにエラーを導入し得る。また、配列決定は、典型的に
、完全な忠実度で行われなくてもよいため、配列決定エラーが、同様にこのステージで導
入される。しかし、配列バリアントを有する分子を含む、単一の本来の分子に由来する分
子の配列リードの比較は、本来のまたは「コンセンサス」配列を決定できるように解析す
ることができる。これは、系統発生的に行うことができる。コンセンサス配列は、種々の
方法のいずれかにより配列リードのファミリーから生成することができる。かかる方法は
、例えば、デジタルコミュニケーション理論、情報理論またはバイオインフォマティクス
に由来するコンセンサス配列構築（投票（例えば、偏った投票）、平均化、統計的、最大
事後もしくは最大尤度検出、動的プログラミング、ベイジアン、隠れマルコフまたはサポ
ートベクターマシン方法等）の線形または非線形方法を含む。例えば、本来の分子へと追
跡する配列リードの全てまたは大部分が、同じ配列バリアントを有する場合、このバリア
ントは、本来の分子におそらく存在した。他方では、配列バリアントが、冗長配列リード
のサブセットに存在する場合、このバリアントは、増幅／配列決定において導入された可
能性があり、本来は存在しないアーチファクトを表す。さらに、本来のポリヌクレオチド
のワトソンまたはクリック鎖に由来する配列リードのみが、バリアントを含有する場合、
バリアントは、片面の（single-sided）ＤＮＡ損傷、第１のサイクルのＰＣＲエラーまた
は異なる試料から増幅されたポリヌクレオチドの混入により導入された可能性がある。
ド）の低下を可能にする。本明細書に開示されている方法は、コンセンサス配列を崩壊、
例えば、複数の配列リードを比較することによりこれを生成するステップを含むことがで
きる。例えば、単一の本来のポリヌクレオチドから生成された配列リードを使用して、か
かる本来のポリヌクレオチドのコンセンサス配列を生成することができる。増幅の反復的
ラウンドは、後代ポリヌクレオチドにエラーを導入し得る。また、配列決定は、典型的に
、完全な忠実度で行われなくてもよいため、配列決定エラーが、同様にこのステージで導
入される。しかし、配列バリアントを有する分子を含む、単一の本来の分子に由来する分
子の配列リードの比較は、本来のまたは「コンセンサス」配列を決定できるように解析す
ることができる。これは、系統発生的に行うことができる。コンセンサス配列は、種々の
方法のいずれかにより配列リードのファミリーから生成することができる。かかる方法は
、例えば、デジタルコミュニケーション理論、情報理論またはバイオインフォマティクス
に由来するコンセンサス配列構築（投票（例えば、偏った投票）、平均化、統計的、最大
事後もしくは最大尤度検出、動的プログラミング、ベイジアン、隠れマルコフまたはサポ
ートベクターマシン方法等）の線形または非線形方法を含む。例えば、本来の分子へと追
跡する配列リードの全てまたは大部分が、同じ配列バリアントを有する場合、このバリア
ントは、本来の分子におそらく存在した。他方では、配列バリアントが、冗長配列リード
のサブセットに存在する場合、このバリアントは、増幅／配列決定において導入された可
能性があり、本来は存在しないアーチファクトを表す。さらに、本来のポリヌクレオチド
のワトソンまたはクリック鎖に由来する配列リードのみが、バリアントを含有する場合、
バリアントは、片面の（single-sided）ＤＮＡ損傷、第１のサイクルのＰＣＲエラーまた
は異なる試料から増幅されたポリヌクレオチドの混入により導入された可能性がある。
【0165】
断片が増幅され、増幅された断片の配列が読み取られて整列された後に、断片は、塩基
コーリングに供される、例えば、遺伝子座毎に、最も可能性の高いヌクレオチドを決定す
る。しかし、増幅された断片および未観測の増幅された断片（例えば、その配列を読み取
られていない断片；増幅エラー、配列決定読み取りエラー、長過ぎる、短過ぎる、削られ
ている等、非常に多くの理由が考えられ得る）の数のバリエーションは、塩基コーリング
においてエラーを導入し得る。観察された増幅された断片（実際に読み取られている増幅
された断片）に対してあまりにも多くの未観測の増幅された断片が存在する場合、塩基コ
ーリングの信頼性は、縮小され得る。
コーリングに供される、例えば、遺伝子座毎に、最も可能性の高いヌクレオチドを決定す
る。しかし、増幅された断片および未観測の増幅された断片（例えば、その配列を読み取
られていない断片；増幅エラー、配列決定読み取りエラー、長過ぎる、短過ぎる、削られ
ている等、非常に多くの理由が考えられ得る）の数のバリエーションは、塩基コーリング
においてエラーを導入し得る。観察された増幅された断片（実際に読み取られている増幅
された断片）に対してあまりにも多くの未観測の増幅された断片が存在する場合、塩基コ
ーリングの信頼性は、縮小され得る。
【0166】
したがって、塩基コーリングにおける未観測断片の数を補正する方法が、本明細書に開
示されている。例えば、遺伝子座Ａ（任意の遺伝子座）の塩基コーリングの場合、Ｎ個の
増幅された断片が存在することが先ず想定される。配列リードアウトは、２種類の断片に
由来し得る：二本鎖断片および一本鎖断片。したがって、それぞれ二本鎖、一本鎖および
未観測断片の数としてＮ１、Ｎ２およびＮ３を割り当てる。よって、Ｎ＝Ｎ１＋Ｎ２＋Ｎ
３（Ｎ１およびＮ２は、配列リードアウトから公知であり、ＮおよびＮ３は未知である）
。式が、Ｎ（またはＮ３）に関して解かれる場合、Ｎ３（またはＮ）が推測される。
示されている。例えば、遺伝子座Ａ（任意の遺伝子座）の塩基コーリングの場合、Ｎ個の
増幅された断片が存在することが先ず想定される。配列リードアウトは、２種類の断片に
由来し得る：二本鎖断片および一本鎖断片。したがって、それぞれ二本鎖、一本鎖および
未観測断片の数としてＮ１、Ｎ２およびＮ３を割り当てる。よって、Ｎ＝Ｎ１＋Ｎ２＋Ｎ
３（Ｎ１およびＮ２は、配列リードアウトから公知であり、ＮおよびＮ３は未知である）
。式が、Ｎ（またはＮ３）に関して解かれる場合、Ｎ３（またはＮ）が推測される。
【0167】
確率が使用されて、Ｎを推定する。例えば、一本鎖の配列リードアウトにおける遺伝子
座Ａのヌクレオチドを検出した（または読み取った）確率になるように「ｐ」を割り当て
る。
座Ａのヌクレオチドを検出した（または読み取った）確率になるように「ｐ」を割り当て
る。
【0168】
二本鎖由来の配列リードアウトに関して、二本鎖の増幅された断片からのヌクレオチド
コールは、ｐ＊ｐ＝ｐ＾２の確率を有し、全Ｎ１個の二本鎖の観測は、次の方程式を有す
る：Ｎ１＝Ｎ＊（ｐ＾２）。
コールは、ｐ＊ｐ＝ｐ＾２の確率を有し、全Ｎ１個の二本鎖の観測は、次の方程式を有す
る：Ｎ１＝Ｎ＊（ｐ＾２）。
【0169】
一本鎖由来の配列リードアウトに関する。２本の鎖のうち１本が観測され、他方が未観
測であることを想定すると、１本の鎖の観測の確率は「ｐ」であるが、他方の鎖を見失う
確率は（１－ｐ）である。さらに、５－プライマー起源および３－プライマー起源の一本
鎖を識別しないことにより、因数２が存在する。したがって、一本鎖の増幅された断片由
来のヌクレオチドコールは、確率２×ｐ×（１－ｐ）を有する。よって、全Ｎ２個の一本
鎖の観測は、次の方程式を有する：Ｎ２＝Ｎ×２×ｐ×（１－ｐ）。
測であることを想定すると、１本の鎖の観測の確率は「ｐ」であるが、他方の鎖を見失う
確率は（１－ｐ）である。さらに、５－プライマー起源および３－プライマー起源の一本
鎖を識別しないことにより、因数２が存在する。したがって、一本鎖の増幅された断片由
来のヌクレオチドコールは、確率２×ｐ×（１－ｐ）を有する。よって、全Ｎ２個の一本
鎖の観測は、次の方程式を有する：Ｎ２＝Ｎ×２×ｐ×（１－ｐ）。
【0170】
「ｐ」も未知である。ｐを解くために、Ｎ１対Ｎ２の比を使用して、「ｐ」を解く：
「ｐ」が求められたら、Ｎを求めることができる。Ｎが求められた後に、Ｎ３＝Ｎ－Ｎ
１－Ｎ２を求めることができる。
【数1】
「ｐ」が求められたら、Ｎを求めることができる。Ｎが求められた後に、Ｎ３＝Ｎ－Ｎ
１－Ｎ２を求めることができる。
【0171】
ペア化対非ペア化鎖の比に加えて（崩壊後の尺度）、各遺伝子座における崩壊前リード
深度における有用な情報が存在する。この情報を使用して、総分子数のコールをさらに改
善するおよび／またはバリアントコールの信頼度を増加させることができる。
深度における有用な情報が存在する。この情報を使用して、総分子数のコールをさらに改
善するおよび／またはバリアントコールの信頼度を増加させることができる。
【0172】
例えば、図４Ｃは、相補的配列が補正された配列リードを実証する。本来のワトソン鎖
または本来のクリック鎖から生成された配列は、それらの二重鎖タグに基づいて区別する
ことができる。同じ本来の鎖から生成された配列を群分けすることができる。配列の検査
は、本来の鎖の配列（「コンセンサス配列」）の推測を可能にし得る。この場合、例えば
、ｎｎ’分子における配列バリアントは、全配列リードに含まれるため、コンセンサス配
列に含まれるが、他のバリアントは、迷走エラーであると観測される。配列の崩壊後に、
それらの相補的配列および二重鎖タグに基づき、本来のポリヌクレオチドペアを同定する
ことができる。
または本来のクリック鎖から生成された配列は、それらの二重鎖タグに基づいて区別する
ことができる。同じ本来の鎖から生成された配列を群分けすることができる。配列の検査
は、本来の鎖の配列（「コンセンサス配列」）の推測を可能にし得る。この場合、例えば
、ｎｎ’分子における配列バリアントは、全配列リードに含まれるため、コンセンサス配
列に含まれるが、他のバリアントは、迷走エラーであると観測される。配列の崩壊後に、
それらの相補的配列および二重鎖タグに基づき、本来のポリヌクレオチドペアを同定する
ことができる。
【0173】
図５は、ワトソンおよびクリック鎖由来のリードをペア形成することによる、配列バリ
アントの検出における信頼度増加を実証する。配列ｎｎ’は、ドットによって示される配
列バリアントを含むことができる。一部の事例において、配列ｐｐ’は、配列バリアント
を含まない。増幅、配列決定、冗長性低下およびペア形成は、配列バリアントを含む同じ
本来の分子のワトソンおよびクリック鎖の両方をもたらすことができる。対照的に、増幅
および配列決定におけるサンプリングの際に導入されたエラーの結果、ワトソン鎖ｐのコ
ンセンサス配列は、配列バリアントを含有することができる一方、クリック鎖ｐ’のコン
センサス配列は、これを含有しない。増幅および配列決定が、二重鎖の両方の鎖（ｎｎ’
配列）に同じバリアントを導入する可能性は、一方の鎖（ｐｐ’配列）よりも低い。した
がって、ｐｐ’配列におけるバリアントは、アーチファクトである可能性が高く、ｎｎ’
配列におけるバリアントは、本来の分子に存在する可能性が高い。
アントの検出における信頼度増加を実証する。配列ｎｎ’は、ドットによって示される配
列バリアントを含むことができる。一部の事例において、配列ｐｐ’は、配列バリアント
を含まない。増幅、配列決定、冗長性低下およびペア形成は、配列バリアントを含む同じ
本来の分子のワトソンおよびクリック鎖の両方をもたらすことができる。対照的に、増幅
および配列決定におけるサンプリングの際に導入されたエラーの結果、ワトソン鎖ｐのコ
ンセンサス配列は、配列バリアントを含有することができる一方、クリック鎖ｐ’のコン
センサス配列は、これを含有しない。増幅および配列決定が、二重鎖の両方の鎖（ｎｎ’
配列）に同じバリアントを導入する可能性は、一方の鎖（ｐｐ’配列）よりも低い。した
がって、ｐｐ’配列におけるバリアントは、アーチファクトである可能性が高く、ｎｎ’
配列におけるバリアントは、本来の分子に存在する可能性が高い。
【0174】
本明細書に開示されている方法を使用して、実験、例えば、ＰＣＲ、増幅および／また
は配列決定に起因するエラーを補正することができる。例えば、かかる方法は、二本鎖ポ
リヌクレオチドの両端に１種または複数の二本鎖アダプタを取り付け、これにより、タグ
付けされた二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップと、二本鎖タグ付けされたポリヌ
クレオチドを増幅するステップと、タグ付けされたポリヌクレオチドの両方の鎖を配列決
定するステップと、一方の鎖とその相補体との配列を比較して、配列決定の際に導入され
たいずれかのエラーを決定するステップと、（ｄ）に基づき配列におけるエラーを補正す
るステップとを含むことができる。本方法において使用されるアダプタは、本明細書に開
示されているいずれかのアダプタ、例えば、Ｙ字形アダプタとなり得る。アダプタは、本
明細書に開示されているいずれかのバーコード（例えば、別個のバーコード）を含むこと
ができる。
は配列決定に起因するエラーを補正することができる。例えば、かかる方法は、二本鎖ポ
リヌクレオチドの両端に１種または複数の二本鎖アダプタを取り付け、これにより、タグ
付けされた二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップと、二本鎖タグ付けされたポリヌ
クレオチドを増幅するステップと、タグ付けされたポリヌクレオチドの両方の鎖を配列決
定するステップと、一方の鎖とその相補体との配列を比較して、配列決定の際に導入され
たいずれかのエラーを決定するステップと、（ｄ）に基づき配列におけるエラーを補正す
るステップとを含むことができる。本方法において使用されるアダプタは、本明細書に開
示されているいずれかのアダプタ、例えば、Ｙ字形アダプタとなり得る。アダプタは、本
明細書に開示されているいずれかのバーコード（例えば、別個のバーコード）を含むこと
ができる。
【0175】
Ｇ．マッピング
【0176】
配列リードまたはコンセンサス配列は、１種または複数の選択された遺伝子座にマッピ
ングすることができる（例えば、ステップ（１１０）、図１に示す通り）。遺伝子座は、
例えば、ゲノム内の特異的なヌクレオチド位置、ヌクレオチドの配列（例えば、オープン
リーディングフレーム）、染色体の断片、染色体全体またはゲノム全体となり得る。遺伝
子座は、多型遺伝子座となり得る。多型遺伝子座は、配列バリエーションが、集団に存す
る、および／または対象および／または試料に存する遺伝子座となり得る。多型遺伝子座
は、ゲノムの同じ位置に共存する２種またはそれを超える別個の配列によって生成するこ
とができる。別個の配列は、いずれかの数のヌクレオチド、一般に、とりわけ５０、４５
、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、
１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレ
オチド（複数可）未満等、相対的に少数のヌクレオチドの１個または複数のヌクレオチド
置換、欠失／挿入および／または重複により、互いに異なることができる。多型遺伝子座
は、集団内で変動する単一ヌクレオチド位置により作製することができ、例えば、単一ヌ
クレオチドバリエーション（ＳＮＶ）または一塩基多型（ＳＮＰ）である。
ングすることができる（例えば、ステップ（１１０）、図１に示す通り）。遺伝子座は、
例えば、ゲノム内の特異的なヌクレオチド位置、ヌクレオチドの配列（例えば、オープン
リーディングフレーム）、染色体の断片、染色体全体またはゲノム全体となり得る。遺伝
子座は、多型遺伝子座となり得る。多型遺伝子座は、配列バリエーションが、集団に存す
る、および／または対象および／または試料に存する遺伝子座となり得る。多型遺伝子座
は、ゲノムの同じ位置に共存する２種またはそれを超える別個の配列によって生成するこ
とができる。別個の配列は、いずれかの数のヌクレオチド、一般に、とりわけ５０、４５
、４０、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、
１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレ
オチド（複数可）未満等、相対的に少数のヌクレオチドの１個または複数のヌクレオチド
置換、欠失／挿入および／または重複により、互いに異なることができる。多型遺伝子座
は、集団内で変動する単一ヌクレオチド位置により作製することができ、例えば、単一ヌ
クレオチドバリエーション（ＳＮＶ）または一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【0177】
マッピングのための参照ゲノムは、目的のいずれかの種のゲノムを含むことができる。
参照として有用なヒトゲノム配列は、ｈｇ１９アセンブリまたはいずれかの以前のもしく
は利用できるｈｇアセンブリを含むことができる。かかる配列は、genome.ucsc.edu/inde
x.htmlにて利用できるゲノムブラウザを使用して照合することができる。他の種のゲノム
は、例えば、ＰａｎＴｒｏ２（チンパンジー）およびｍｍ９（マウス）を含む。
参照として有用なヒトゲノム配列は、ｈｇ１９アセンブリまたはいずれかの以前のもしく
は利用できるｈｇアセンブリを含むことができる。かかる配列は、genome.ucsc.edu/inde
x.htmlにて利用できるゲノムブラウザを使用して照合することができる。他の種のゲノム
は、例えば、ＰａｎＴｒｏ２（チンパンジー）およびｍｍ９（マウス）を含む。
【0178】
本明細書に開示されている方法において、崩壊は、マッピングの前または後に行うこと
ができる。一部の態様において、崩壊は、マッピング前に行うことができる。例えば、配
列リードは、リードがゲノム内にマッピングされる位置を考慮することなく、それらのタ
グおよび１種または複数の内在性配列に基づき、ファミリーへと群分けすることができる
。次に、ファミリーのメンバーは、コンセンサス配列へと崩壊させることができる。コン
センサス配列は、本明細書に開示されているいずれかの崩壊方法を使用して生成すること
ができる。次に、コンセンサス配列は、ゲノム内の位置にマッピングすることができる。
遺伝子座にマッピングされたリードは、定量化（例えば、計数）することができる。遺伝
子座に突然変異を保有するリードのパーセンテージを決定することもできる。あるいは、
崩壊は、マッピング後に行うことができる。例えば、あらゆるリードは、先ず、ゲノムに
マッピングすることができる。次に、リードは、それらのタグおよび１種または複数の内
在性配列に基づき、ファミリーへと群分けすることができる。リードが、ゲノムにマッピ
ングされたら、各遺伝子座におけるファミリー毎にコンセンサス塩基を決定することがで
きる。他の態様において、コンセンサス配列は、ＤＮＡ分子の一方の鎖（例えば、ワトソ
ン鎖またはクリック鎖）のために生成することができる。マッピングは、ＤＮＡ分子の一
方の鎖のコンセンサス配列が決定される前または後に行うことができる。ダブレットおよ
びシングレットの数を決定することができる。これらの数を使用して、未観測分子を計算
することができる。例えば、未観測分子は、次の方程式を使用して計算することができる
：Ｎ＝Ｄ＋Ｓ＋Ｕ；Ｄ＝Ｎｐ（２）、Ｓ＝Ｎ２ｐｑ（式中、ｐ＝１－ｑ、ｐは、観測の確
率であり；ｑは、鎖を見失う確率である）。
ができる。一部の態様において、崩壊は、マッピング前に行うことができる。例えば、配
列リードは、リードがゲノム内にマッピングされる位置を考慮することなく、それらのタ
グおよび１種または複数の内在性配列に基づき、ファミリーへと群分けすることができる
。次に、ファミリーのメンバーは、コンセンサス配列へと崩壊させることができる。コン
センサス配列は、本明細書に開示されているいずれかの崩壊方法を使用して生成すること
ができる。次に、コンセンサス配列は、ゲノム内の位置にマッピングすることができる。
遺伝子座にマッピングされたリードは、定量化（例えば、計数）することができる。遺伝
子座に突然変異を保有するリードのパーセンテージを決定することもできる。あるいは、
崩壊は、マッピング後に行うことができる。例えば、あらゆるリードは、先ず、ゲノムに
マッピングすることができる。次に、リードは、それらのタグおよび１種または複数の内
在性配列に基づき、ファミリーへと群分けすることができる。リードが、ゲノムにマッピ
ングされたら、各遺伝子座におけるファミリー毎にコンセンサス塩基を決定することがで
きる。他の態様において、コンセンサス配列は、ＤＮＡ分子の一方の鎖（例えば、ワトソ
ン鎖またはクリック鎖）のために生成することができる。マッピングは、ＤＮＡ分子の一
方の鎖のコンセンサス配列が決定される前または後に行うことができる。ダブレットおよ
びシングレットの数を決定することができる。これらの数を使用して、未観測分子を計算
することができる。例えば、未観測分子は、次の方程式を使用して計算することができる
：Ｎ＝Ｄ＋Ｓ＋Ｕ；Ｄ＝Ｎｐ（２）、Ｓ＝Ｎ２ｐｑ（式中、ｐ＝１－ｑ、ｐは、観測の確
率であり；ｑは、鎖を見失う確率である）。
【0179】
Ｈ．群分け
【0180】
本明細書に開示されている方法は、配列リードを群分けするステップを含むこともでき
る。配列リードは、様々な種類の配列、例えば、オリゴヌクレオチドタグ（例えば、バー
コード）の配列、ポリヌクレオチド断片の配列またはいずれかの組合せに基づき群分けす
ることができる。例えば、ステップ（１１２）（図１）に示す通り、配列リードは、次の
通りに群分けすることができる：試料における二本鎖ポリヌクレオチドの「ワトソン」鎖
から生成された配列リードおよび「クリック」鎖から生成された配列リードは、これらが
有する二重鎖タグに基づき同定可能である。このようにして、二重鎖ポリヌクレオチドの
ワトソン鎖由来の配列リードまたはコンセンサス配列は、その相補的クリック鎖由来の配
列リードまたはコンセンサス配列とペア形成することができる。ペア形成された配列リー
ドは、「ペア」と称される。
る。配列リードは、様々な種類の配列、例えば、オリゴヌクレオチドタグ（例えば、バー
コード）の配列、ポリヌクレオチド断片の配列またはいずれかの組合せに基づき群分けす
ることができる。例えば、ステップ（１１２）（図１）に示す通り、配列リードは、次の
通りに群分けすることができる：試料における二本鎖ポリヌクレオチドの「ワトソン」鎖
から生成された配列リードおよび「クリック」鎖から生成された配列リードは、これらが
有する二重鎖タグに基づき同定可能である。このようにして、二重鎖ポリヌクレオチドの
ワトソン鎖由来の配列リードまたはコンセンサス配列は、その相補的クリック鎖由来の配
列リードまたはコンセンサス配列とペア形成することができる。ペア形成された配列リー
ドは、「ペア」と称される。
【0181】
相補鎖に対応する配列リードが配列リードの中に見出されない配列リードは、「シング
レット」と命名される。
レット」と命名される。
【0182】
２本の相補鎖のどちらの配列リードも生成されなかった二本鎖ポリヌクレオチドは、「
未観測」分子と称される。
未観測」分子と称される。
【0183】
Ｉ．定量化
【0184】
本明細書に開示されている方法は、配列リードを定量化するステップも含む。例えば、
ステップ（１１４）（図１）に示す通り、選択された遺伝子座または複数の選択された遺
伝子座のそれぞれにマッピングするペアおよびシングレットは、定量化される、例えば、
計数される。
ステップ（１１４）（図１）に示す通り、選択された遺伝子座または複数の選択された遺
伝子座のそれぞれにマッピングするペアおよびシングレットは、定量化される、例えば、
計数される。
【0185】
定量化は、試料におけるポリヌクレオチド（例えば、ペアポリヌクレオチド、シングレ
ットポリヌクレオチドまたは未観測ポリヌクレオチド）の数の推定を含むことができる。
例えば、ステップ（１１６）（図１）に示す通り、配列リードが生成されなかった試料に
おける二本鎖ポリヌクレオチド（「未観測」ポリヌクレオチド）の数が推定される。二本
鎖ポリヌクレオチドが配列リードを生成しない確率は、いずれかの遺伝子座におけるペア
およびシングレットの相対数に基づき決定することができる。この確率を使用して、未観
測ポリヌクレオチドの数を推定することができる。
ットポリヌクレオチドまたは未観測ポリヌクレオチド）の数の推定を含むことができる。
例えば、ステップ（１１６）（図１）に示す通り、配列リードが生成されなかった試料に
おける二本鎖ポリヌクレオチド（「未観測」ポリヌクレオチド）の数が推定される。二本
鎖ポリヌクレオチドが配列リードを生成しない確率は、いずれかの遺伝子座におけるペア
およびシングレットの相対数に基づき決定することができる。この確率を使用して、未観
測ポリヌクレオチドの数を推定することができる。
【0186】
ステップ（１１８）において、選択された遺伝子座にマッピングする試料における二本
鎖ポリヌクレオチドの総数の推定は、遺伝子座にマッピングするペアの数、シングレット
の数および未観測分子の数の和である。
鎖ポリヌクレオチドの総数の推定は、遺伝子座にマッピングするペアの数、シングレット
の数および未観測分子の数の和である。
【0187】
試料における未観測の本来の分子の数は、ペアおよびシングレットの相対数に基づき推
定することができる（図２）。図２を参照すると、一例として、特定のゲノム遺伝子座、
遺伝子座Ａの計数が記録され、それによると、１０００分子がペア形成され、１０００分
子がペア形成されない。変換後のプロセスを為すために個々のワトソンまたはクリック鎖
に対し均一確率、ｐを想定すると、プロセスを為すことができない（未観測）分子の比率
を次の通りに計算することができる：Ｒ＝ペア形成対ペア形成されない分子の比＝１とす
ると、Ｒ＝１＝ｐ２／（２ｐ（１－ｐ））。これは、ｐ＝２／３であることと、失われた
分子の分量が、（１－ｐ）２＝１／９に等しいことを意味する。よって、この例において
、変換された分子のおよそ１１％が、失われ、検出されない。同じ試料における別のゲノ
ム遺伝子座、遺伝子座Ｂを考慮し、これによると、１４４０分子がペア形成され、７２０
がペア形成されない。同じ方法を使用して、失われた分子の数が僅か４％であることを推
測することができる。この２区域を比較すると、遺伝子座Ｂにおける２１６０分子と比較
して、遺伝子座Ａが、２０００個の特有の分子を有したことを想定することができる －
ほぼ８％の差。しかし、各領域における失われた分子において正確に加えることにより
、遺伝子座Ａに２０００／（８／９）＝２２５０分子、遺伝子座Ｂに２１６０／０．９６
＝２２５０分子が存在すると推測する。したがって、両方の領域における計数は、実際に
等しい。この補正と、したがって、さらにより高い感度は、本来の二本鎖核酸分子を変換
し、プロセスの終わりにペア形成されるおよびペア形成されない全分子をバイオインフォ
マティクスにより追跡維持することにより達成可能である。同様に、同じ手順を使用して
、観察された特有の分子の類似の計数を有すると思われる領域における真のコピー数バリ
エーションを推測することができる。２種またはそれを超える領域における未観測分子の
数を考慮に入れることにより、コピー数バリエーションは明らかになる。
定することができる（図２）。図２を参照すると、一例として、特定のゲノム遺伝子座、
遺伝子座Ａの計数が記録され、それによると、１０００分子がペア形成され、１０００分
子がペア形成されない。変換後のプロセスを為すために個々のワトソンまたはクリック鎖
に対し均一確率、ｐを想定すると、プロセスを為すことができない（未観測）分子の比率
を次の通りに計算することができる：Ｒ＝ペア形成対ペア形成されない分子の比＝１とす
ると、Ｒ＝１＝ｐ２／（２ｐ（１－ｐ））。これは、ｐ＝２／３であることと、失われた
分子の分量が、（１－ｐ）２＝１／９に等しいことを意味する。よって、この例において
、変換された分子のおよそ１１％が、失われ、検出されない。同じ試料における別のゲノ
ム遺伝子座、遺伝子座Ｂを考慮し、これによると、１４４０分子がペア形成され、７２０
がペア形成されない。同じ方法を使用して、失われた分子の数が僅か４％であることを推
測することができる。この２区域を比較すると、遺伝子座Ｂにおける２１６０分子と比較
して、遺伝子座Ａが、２０００個の特有の分子を有したことを想定することができる －
ほぼ８％の差。しかし、各領域における失われた分子において正確に加えることにより
、遺伝子座Ａに２０００／（８／９）＝２２５０分子、遺伝子座Ｂに２１６０／０．９６
＝２２５０分子が存在すると推測する。したがって、両方の領域における計数は、実際に
等しい。この補正と、したがって、さらにより高い感度は、本来の二本鎖核酸分子を変換
し、プロセスの終わりにペア形成されるおよびペア形成されない全分子をバイオインフォ
マティクスにより追跡維持することにより達成可能である。同様に、同じ手順を使用して
、観察された特有の分子の類似の計数を有すると思われる領域における真のコピー数バリ
エーションを推測することができる。２種またはそれを超える領域における未観測分子の
数を考慮に入れることにより、コピー数バリエーションは明らかになる。
【0188】
二項分布の使用に加えて、未観測分子の数を推定する他の方法は、観察された配列リー
ドの冗長性に基づく指数関数的、ベータ、ガンマまたは経験的分布を含む。後者の場合、
ペア形成されたおよびペア形成されない分子のリード計数の分布は、特定の遺伝子座にお
ける本来のポリヌクレオチド分子の根底にある分布を推測するために、かかる冗長性に由
来し得る。これは多くの場合、未観測分子の数のより優れた推定をもたらし得る。
ドの冗長性に基づく指数関数的、ベータ、ガンマまたは経験的分布を含む。後者の場合、
ペア形成されたおよびペア形成されない分子のリード計数の分布は、特定の遺伝子座にお
ける本来のポリヌクレオチド分子の根底にある分布を推測するために、かかる冗長性に由
来し得る。これは多くの場合、未観測分子の数のより優れた推定をもたらし得る。
【0189】
Ｊ．ＣＮＶ検出
【0190】
本明細書に開示されている方法は、ＣＮＶを検出するステップも含む。例えば、ステッ
プ（１２０）（図１）に示す通り、遺伝子座にマッピングするポリヌクレオチドの総数が
決定されたら、該遺伝子座におけるＣＮＶを決定する標準方法において、この数を使用す
ることができる。定量的尺度は、標準に対し正規化することができる。標準は、いずれか
のポリヌクレオチドの量となり得る。一方法において、被験遺伝子座における定量的尺度
は、公知のコピー数の遺伝子等、ゲノムにおける対照遺伝子座にマッピングするポリヌク
レオチドの定量的尺度に対し標準化することができる。定量的尺度は、本明細書に開示さ
れているいずれかの試料における核酸の量に対し比較することができる。例えば、別の方
法において、定量的尺度は、本来の試料における核酸の量に対し比較することができる。
例えば、本来の試料が、１０，０００一倍体遺伝子当量を含有した場合、定量的尺度は、
二倍性に予想される尺度に対し比較することができる。別の方法において、定量的尺度は
、対照試料由来の尺度に対し正規化することができ、異なる遺伝子座における正規化され
た尺度を比較することができる。
プ（１２０）（図１）に示す通り、遺伝子座にマッピングするポリヌクレオチドの総数が
決定されたら、該遺伝子座におけるＣＮＶを決定する標準方法において、この数を使用す
ることができる。定量的尺度は、標準に対し正規化することができる。標準は、いずれか
のポリヌクレオチドの量となり得る。一方法において、被験遺伝子座における定量的尺度
は、公知のコピー数の遺伝子等、ゲノムにおける対照遺伝子座にマッピングするポリヌク
レオチドの定量的尺度に対し標準化することができる。定量的尺度は、本明細書に開示さ
れているいずれかの試料における核酸の量に対し比較することができる。例えば、別の方
法において、定量的尺度は、本来の試料における核酸の量に対し比較することができる。
例えば、本来の試料が、１０，０００一倍体遺伝子当量を含有した場合、定量的尺度は、
二倍性に予想される尺度に対し比較することができる。別の方法において、定量的尺度は
、対照試料由来の尺度に対し正規化することができ、異なる遺伝子座における正規化され
た尺度を比較することができる。
【0191】
コピー数バリエーション解析が望まれる一部の事例において、配列データは：１）参照
ゲノムと整列することができ；２）フィルターをかけマッピングすることができ；３）配
列のウィンドウまたはビンへとパーティションで区切ることができ；４）ウィンドウ毎に
計数される被覆リードとなることができ；５）次に、確率論的または統計的モデリングア
ルゴリズムを使用して、被覆リードを正規化することができ；６）ゲノム内の様々な位置
における別々のコピー数状態を反映する出力ファイルを生成することができる。稀な突然
変異解析が望まれる他の事例において、配列データは、１）参照ゲノムと整列することが
でき；２）フィルターをかけマッピングすることができ；３）バリアント塩基の頻度を、
この特異的塩基の被覆リードに基づき計算することができ；４）確率論的、統計的または
確率的モデリングアルゴリズムを使用してバリアント塩基頻度を正規化することができ；
５）ゲノム内の様々な位置における突然変異状態を反映する出力ファイルを生成すること
ができる。
ゲノムと整列することができ；２）フィルターをかけマッピングすることができ；３）配
列のウィンドウまたはビンへとパーティションで区切ることができ；４）ウィンドウ毎に
計数される被覆リードとなることができ；５）次に、確率論的または統計的モデリングア
ルゴリズムを使用して、被覆リードを正規化することができ；６）ゲノム内の様々な位置
における別々のコピー数状態を反映する出力ファイルを生成することができる。稀な突然
変異解析が望まれる他の事例において、配列データは、１）参照ゲノムと整列することが
でき；２）フィルターをかけマッピングすることができ；３）バリアント塩基の頻度を、
この特異的塩基の被覆リードに基づき計算することができ；４）確率論的、統計的または
確率的モデリングアルゴリズムを使用してバリアント塩基頻度を正規化することができ；
５）ゲノム内の様々な位置における突然変異状態を反映する出力ファイルを生成すること
ができる。
【0192】
配列リード被覆比が決定されたら、確率論的モデリングアルゴリズムを任意選択で適用
して、ウィンドウ領域毎の正規化された比を別々のコピー数状態に変換することができる
。一部の事例において、このアルゴリズムは、隠れマルコフモデルを含むことができる。
他の事例において、確率論的モデルは、動的プログラミング、サポートベクターマシン、
ベイジアンモデリング、確率的モデリング、トレリスデコーディング、ビタビデコーディ
ング、期待値最大化、カルマンフィルタリング方法論またはニューラル・ネットワークを
含むことができる。
して、ウィンドウ領域毎の正規化された比を別々のコピー数状態に変換することができる
。一部の事例において、このアルゴリズムは、隠れマルコフモデルを含むことができる。
他の事例において、確率論的モデルは、動的プログラミング、サポートベクターマシン、
ベイジアンモデリング、確率的モデリング、トレリスデコーディング、ビタビデコーディ
ング、期待値最大化、カルマンフィルタリング方法論またはニューラル・ネットワークを
含むことができる。
【0193】
本明細書に開示されている方法は、ゲノム内の特異的領域におけるＳＮＶ、ＣＮＶ、挿
入、欠失および／または再編成を検出するステップを含むことができる。特異的ゲノム領
域は、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、
ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５
３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１
、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１
、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ
３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ
１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、Ｔ
ＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、Ｃ
ＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ
１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ
２Ｌ２、ＲＨＯＡまたはＮＴＲＫ１等、遺伝子における配列を含むことができる。
入、欠失および／または再編成を検出するステップを含むことができる。特異的ゲノム領
域は、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、
ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５
３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１
、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１
、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ
３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ
１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、Ｔ
ＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、Ｃ
ＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ
１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ
２Ｌ２、ＲＨＯＡまたはＮＴＲＫ１等、遺伝子における配列を含むことができる。
【0194】
一部の事例において、本方法は、１種または複数の遺伝子のエクソンを含むパネルを使
用する。パネルは、１種または複数の遺伝子のイントロンも同様に含むことができる。パ
ネルは、１種または複数の遺伝子のエクソンおよびイントロンを含むこともできる。１種
または複数の遺伝子は、上に開示されている遺伝子となり得る。パネルは、遺伝子のパネ
ルを網羅する約８０，０００塩基を含むことができる。パネルは、約１０００、２０００
、３０００、４０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、
３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６０００
０、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５
０００、１０００００、１０５０００、１１００００、１１５０００、１２００００、１
２５０００またはそれを超える塩基を含むことができる。
用する。パネルは、１種または複数の遺伝子のイントロンも同様に含むことができる。パ
ネルは、１種または複数の遺伝子のエクソンおよびイントロンを含むこともできる。１種
または複数の遺伝子は、上に開示されている遺伝子となり得る。パネルは、遺伝子のパネ
ルを網羅する約８０，０００塩基を含むことができる。パネルは、約１０００、２０００
、３０００、４０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、
３００００、３５０００、４００００、４５０００、５００００、５５０００、６０００
０、６５０００、７００００、７５０００、８００００、８５０００、９００００、９５
０００、１０００００、１０５０００、１１００００、１１５０００、１２００００、１
２５０００またはそれを超える塩基を含むことができる。
【0195】
一部の態様において、遺伝子のコピー数は、試料における遺伝子の遺伝的形態の頻度に
おいて反映され得る。例えば、健康個体において、コピー数バリエーションは、試料にお
ける検出される分子の約５０％において検出される、１本の染色体内の遺伝子におけるバ
リアントにおいて反映されない（例えば、ヘテロ接合性）。また、健康個体において、バ
リアントを有する遺伝子の重複は、試料における検出される分子の約６６％において検出
されるバリアントにおいて反映され得る。したがって、ＤＮＡ試料における腫瘍負荷が、
１０％である場合、ＣＮＶなしで、がん細胞の１本の染色体内の遺伝子における体細胞突
然変異の頻度は、約５％となり得る。異数性の場合、逆も真となり得る。
おいて反映され得る。例えば、健康個体において、コピー数バリエーションは、試料にお
ける検出される分子の約５０％において検出される、１本の染色体内の遺伝子におけるバ
リアントにおいて反映されない（例えば、ヘテロ接合性）。また、健康個体において、バ
リアントを有する遺伝子の重複は、試料における検出される分子の約６６％において検出
されるバリアントにおいて反映され得る。したがって、ＤＮＡ試料における腫瘍負荷が、
１０％である場合、ＣＮＶなしで、がん細胞の１本の染色体内の遺伝子における体細胞突
然変異の頻度は、約５％となり得る。異数性の場合、逆も真となり得る。
【0196】
本明細書に開示されている方法を使用して、配列バリアントが、生殖系列レベルに存在
するかまたは例えばがん細胞における体細胞突然変異に起因する可能性がより高いか決定
することができる。例えば、生殖系列におけるヘテロ接合性とほぼ間違いなく一貫したレ
ベルで検出される遺伝子における配列バリアントは、該遺伝子においてＣＮＶも検出され
る場合、体細胞突然変異の産物である可能性がより高い。一部の事例において、生殖系列
における遺伝子重複が、遺伝子量と一貫したバリアントを有することが予想される程度ま
で（例えば、遺伝子座におけるトリソミーに関する６６％）、この予想される量から有意
に逸脱する配列バリアント用量による遺伝子増幅検出は、ＣＮＶが、体細胞突然変異の結
果として存在する可能性がより高いことを示す。
するかまたは例えばがん細胞における体細胞突然変異に起因する可能性がより高いか決定
することができる。例えば、生殖系列におけるヘテロ接合性とほぼ間違いなく一貫したレ
ベルで検出される遺伝子における配列バリアントは、該遺伝子においてＣＮＶも検出され
る場合、体細胞突然変異の産物である可能性がより高い。一部の事例において、生殖系列
における遺伝子重複が、遺伝子量と一貫したバリアントを有することが予想される程度ま
で（例えば、遺伝子座におけるトリソミーに関する６６％）、この予想される量から有意
に逸脱する配列バリアント用量による遺伝子増幅検出は、ＣＮＶが、体細胞突然変異の結
果として存在する可能性がより高いことを示す。
【0197】
本明細書に開示されている方法を使用して、２種の遺伝子における配列バリアントが異
なる頻度で検出される状況における腫瘍異種性を推測することもできる。例えば、２種の
遺伝子が異なる頻度で検出されるが、それらのコピー数が相対的に等しい場合、腫瘍異種
性を推測することができる。あるいは、２種の配列バリアント間の頻度における差が、該
２遺伝子のコピー数における差と一貫した場合、腫瘍均一性を推測することができる。よ
って、例えば、ＥＧＦＲバリアントが１１％で検出され、ＫＲＡＳバリアントが５％で検
出され、これらの遺伝子においてＣＮＶが検出されない場合、頻度における差は、腫瘍異
種性を反映する可能性がある（例えば、全腫瘍細胞が、ＥＧＦＲ突然変異体を保有し、腫
瘍細胞の半分が、ＫＲＡＳ突然変異体も保有する）。あるいは、突然変異体を保有するＥ
ＧＦＲ遺伝子が、２倍正常コピー数で検出される場合、解釈の１つは、腫瘍細胞の同種集
団であり、各細胞が、ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ遺伝子に突然変異体を保有するが、このＫ
ＲＡＳ遺伝子は重複している。
なる頻度で検出される状況における腫瘍異種性を推測することもできる。例えば、２種の
遺伝子が異なる頻度で検出されるが、それらのコピー数が相対的に等しい場合、腫瘍異種
性を推測することができる。あるいは、２種の配列バリアント間の頻度における差が、該
２遺伝子のコピー数における差と一貫した場合、腫瘍均一性を推測することができる。よ
って、例えば、ＥＧＦＲバリアントが１１％で検出され、ＫＲＡＳバリアントが５％で検
出され、これらの遺伝子においてＣＮＶが検出されない場合、頻度における差は、腫瘍異
種性を反映する可能性がある（例えば、全腫瘍細胞が、ＥＧＦＲ突然変異体を保有し、腫
瘍細胞の半分が、ＫＲＡＳ突然変異体も保有する）。あるいは、突然変異体を保有するＥ
ＧＦＲ遺伝子が、２倍正常コピー数で検出される場合、解釈の１つは、腫瘍細胞の同種集
団であり、各細胞が、ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ遺伝子に突然変異体を保有するが、このＫ
ＲＡＳ遺伝子は重複している。
【0198】
化学療法に応答して、優位な腫瘍型は、がんを治療レジメンに対し無応答性にする突然
変異体を保有するがん細胞へとダーウィン淘汰により最終的に取って代わられ得る。これ
らの抵抗性突然変異体の出現は、本発明の方法により遅延させることができる。本方法の
一実施形態において、対象は、１回または複数のパルス治療サイクルに供され、各パルス
治療サイクルは、薬物が第１の量で投与される第１の期間と、該薬物が第２の低下した量
で投与される第２のサイクルとを含む。第１の期間は、第１の臨床レベルを上回って検出
される腫瘍負荷によって特徴付けることができる。第２の期間は、第２の臨床レベルを下
回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けることができる。第１および第２の臨床レベ
ルは、異なるパルス治療サイクルにおいて異なることができる。例えば、第１の臨床レベ
ルは、後続サイクルにおいてより低くなることができる。複数のサイクルは、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８またはそれを超えるサイクルを含むことができる。例えば、
ＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅは、ｃｆＤＮＡにおける５％の腫瘍負荷を示す量で疾患細
胞のポリヌクレオチドにおいて検出することができる。化学療法は、ダブラフェニブと共
に開始することができる。その後の検査は、ｃｆＤＮＡにおけるＢＲＡＦ突然変異体の量
が、０．５％を下回って下落するまたは検出不能レベルとなることを示すことができる。
この時点で、ダブラフェニブ療法は、停止するまたは有意に短縮させることができる。さ
らに、その後の検査は、ＢＲＡＦ突然変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌ
クレオチドの２．５％に上昇したことを見出すことができる。この時点で、例えば、初期
処置と同じレベルで、ダブラフェニブ療法を再開することができる。その後の検査は、Ｂ
ＲＡＦ突然変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの０．５％まで
減少したことを見出すことができる。再度、ダブラフェニブ療法を停止または低下させる
ことができる。サイクルを多数回反復することができる。
変異体を保有するがん細胞へとダーウィン淘汰により最終的に取って代わられ得る。これ
らの抵抗性突然変異体の出現は、本発明の方法により遅延させることができる。本方法の
一実施形態において、対象は、１回または複数のパルス治療サイクルに供され、各パルス
治療サイクルは、薬物が第１の量で投与される第１の期間と、該薬物が第２の低下した量
で投与される第２のサイクルとを含む。第１の期間は、第１の臨床レベルを上回って検出
される腫瘍負荷によって特徴付けることができる。第２の期間は、第２の臨床レベルを下
回って検出される腫瘍負荷によって特徴付けることができる。第１および第２の臨床レベ
ルは、異なるパルス治療サイクルにおいて異なることができる。例えば、第１の臨床レベ
ルは、後続サイクルにおいてより低くなることができる。複数のサイクルは、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８またはそれを超えるサイクルを含むことができる。例えば、
ＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅは、ｃｆＤＮＡにおける５％の腫瘍負荷を示す量で疾患細
胞のポリヌクレオチドにおいて検出することができる。化学療法は、ダブラフェニブと共
に開始することができる。その後の検査は、ｃｆＤＮＡにおけるＢＲＡＦ突然変異体の量
が、０．５％を下回って下落するまたは検出不能レベルとなることを示すことができる。
この時点で、ダブラフェニブ療法は、停止するまたは有意に短縮させることができる。さ
らに、その後の検査は、ＢＲＡＦ突然変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌ
クレオチドの２．５％に上昇したことを見出すことができる。この時点で、例えば、初期
処置と同じレベルで、ダブラフェニブ療法を再開することができる。その後の検査は、Ｂ
ＲＡＦ突然変異を有するＤＮＡが、ｃｆＤＮＡにおけるポリヌクレオチドの０．５％まで
減少したことを見出すことができる。再度、ダブラフェニブ療法を停止または低下させる
ことができる。サイクルを多数回反復することができる。
【0199】
治療介入は、本来の薬物に対し抵抗性の突然変異体型の上昇の検出により変化させるこ
ともできる。例えば、ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒを有するがんは、エルロチニブによる
治療法に応答する。しかし、ＥＧＦＲ突然変異Ｔ７９０Ｍを有するがんは、エルロチニブ
に対し抵抗性である。しかし、これは、ルキソリチニブに対し応答性である。本発明の方
法は、腫瘍プロファイルの変化をモニタリングするステップと、薬物抵抗性に関連する遺
伝的バリアントが、既定の臨床レベルまで上昇する場合、治療介入を変化させるステップ
とに関与する。
ともできる。例えば、ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒを有するがんは、エルロチニブによる
治療法に応答する。しかし、ＥＧＦＲ突然変異Ｔ７９０Ｍを有するがんは、エルロチニブ
に対し抵抗性である。しかし、これは、ルキソリチニブに対し応答性である。本発明の方
法は、腫瘍プロファイルの変化をモニタリングするステップと、薬物抵抗性に関連する遺
伝的バリアントが、既定の臨床レベルまで上昇する場合、治療介入を変化させるステップ
とに関与する。
【0200】
本発明に開示されている方法は、体細胞および疾患細胞由来のポリヌクレオチドを含む
試料から疾患細胞異種性を検出する方法であって、ａ）複数の遺伝子座のそれぞれに配列
バリアントを有する試料におけるポリヌクレオチドを定量化するステップと、ｂ）複数の
遺伝子座のそれぞれにおけるＣＮＶ、遺伝子座における疾患分子の異なる相対量を決定す
るステップであって、ＣＮＶが、疾患細胞ポリヌクレオチドにおける遺伝子座の遺伝子量
を示すステップと、ｃ）複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座における遺伝子量当たりの
遺伝子座に配列バリアントを有するポリヌクレオチドの分量の相対的尺度を決定するステ
ップと、ｄ）複数の遺伝子座のそれぞれにおける相対的尺度を比較するステップであって
、異なる相対的尺度が、腫瘍異種性を示すステップとを含む方法を含むことができる。本
明細書に開示されている方法において、遺伝子量は、総分子基盤で決定することができる
。例えば、第１の遺伝子座に１×総分子が存在し、第２の遺伝子座にマッピングされた１
．２×分子が存在する場合、遺伝子量は１．２である。この遺伝子座におけるバリアント
は、１．２で割ることができる。一部の態様において、本明細書に開示されている方法を
使用して、いずれかの疾患細胞異種性、例えば、腫瘍細胞異種性を検出することができる
。本方法を使用して、いずれかの種類のポリヌクレオチド、例えば、ｃｆＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃｔＤＮＡを含む試料から疾患細胞異種性を検出することができ
る。本方法において、定量化は、例えば、ポリヌクレオチドの数または相対量の決定を含
むことができる。ＣＮＶの決定は、遺伝子座に対する異なる相対量の総分子のマッピング
および正規化を含むことができる。
試料から疾患細胞異種性を検出する方法であって、ａ）複数の遺伝子座のそれぞれに配列
バリアントを有する試料におけるポリヌクレオチドを定量化するステップと、ｂ）複数の
遺伝子座のそれぞれにおけるＣＮＶ、遺伝子座における疾患分子の異なる相対量を決定す
るステップであって、ＣＮＶが、疾患細胞ポリヌクレオチドにおける遺伝子座の遺伝子量
を示すステップと、ｃ）複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座における遺伝子量当たりの
遺伝子座に配列バリアントを有するポリヌクレオチドの分量の相対的尺度を決定するステ
ップと、ｄ）複数の遺伝子座のそれぞれにおける相対的尺度を比較するステップであって
、異なる相対的尺度が、腫瘍異種性を示すステップとを含む方法を含むことができる。本
明細書に開示されている方法において、遺伝子量は、総分子基盤で決定することができる
。例えば、第１の遺伝子座に１×総分子が存在し、第２の遺伝子座にマッピングされた１
．２×分子が存在する場合、遺伝子量は１．２である。この遺伝子座におけるバリアント
は、１．２で割ることができる。一部の態様において、本明細書に開示されている方法を
使用して、いずれかの疾患細胞異種性、例えば、腫瘍細胞異種性を検出することができる
。本方法を使用して、いずれかの種類のポリヌクレオチド、例えば、ｃｆＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃｔＤＮＡを含む試料から疾患細胞異種性を検出することができ
る。本方法において、定量化は、例えば、ポリヌクレオチドの数または相対量の決定を含
むことができる。ＣＮＶの決定は、遺伝子座に対する異なる相対量の総分子のマッピング
および正規化を含むことができる。
【0201】
別の態様において、化学療法に応答して、優位な腫瘍型は、がんを治療レジメンに対し
無応答性にする突然変異体を保有するがん細胞へとダーウィン淘汰により最終的に取って
代わられ得る。これらの抵抗性突然変異体の出現は、本明細書を通して開示されている方
法により遅延させることができる。本明細書に開示されている方法は、ａ）各パルス治療
サイクルが、（ｉ）薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）薬物が第２の
低下した量で投与される第２の期間を含む、対象を１回または複数のパルス治療サイクル
に供するステップであって、（Ａ）第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出され
る腫瘍負荷によって特徴付けられ、（Ｂ）第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検
出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップを含む方法を含むことができる。
無応答性にする突然変異体を保有するがん細胞へとダーウィン淘汰により最終的に取って
代わられ得る。これらの抵抗性突然変異体の出現は、本明細書を通して開示されている方
法により遅延させることができる。本明細書に開示されている方法は、ａ）各パルス治療
サイクルが、（ｉ）薬物が第１の量で投与される第１の期間および（ｉｉ）薬物が第２の
低下した量で投与される第２の期間を含む、対象を１回または複数のパルス治療サイクル
に供するステップであって、（Ａ）第１の期間が、第１の臨床レベルを上回って検出され
る腫瘍負荷によって特徴付けられ、（Ｂ）第２の期間が、第２の臨床レベルを下回って検
出される腫瘍負荷によって特徴付けられるステップを含む方法を含むことができる。
【0202】
Ｋ．配列バリアント検出
【0203】
本明細書に開示されているシステムおよび方法を使用して、配列バリアント、例えば、
ＳＮＶを検出することができる。例えば、配列バリアントは、複数の配列リード、例えば
、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくと
も７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７
、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２
、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７
、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２
、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７
、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２
、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７
、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２
、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７
、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２
、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７
、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２
、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７
、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、少なくとも８１、少なくとも８２
、少なくとも８３、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７
、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２
、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７
、少なくとも９８、少なくとも９９、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも
３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、
少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少な
くとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少な
くとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００種ま
たはそれを超える配列リード由来のコンセンサス配列から検出することができる。コンセ
ンサス配列は、一本鎖ポリヌクレオチドの配列リードに由来し得る。コンセンサス配列は
、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の配列リードに由来することもできる（例えば、リ
ードのペア形成）。例示的な方法において、リードのペア形成は、増加した信頼度での、
分子における配列バリアントの存在の同定を可能にする。例えば、ペアの両方の鎖が、同
じバリアントを含む場合、増幅／配列決定において同じバリアントが両方の鎖に導入され
る確率は、稀なため、バリアントが、本来の分子に存在したと合理的に確信することがで
きる。対照的に、ペアの一方の鎖のみが、配列バリアントを含む場合、これは、アーチフ
ァクトである可能性がより高い。同様に、増幅／配列決定においてバリアントが１回導入
され得る確率は、２回よりも高いため、配列バリアントを有するシングレットが、本来の
分子に存在した信頼度は、バリアントが二重鎖に存在する場合の信頼度に満たない。
ＳＮＶを検出することができる。例えば、配列バリアントは、複数の配列リード、例えば
、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくと
も７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７
、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２
、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７
、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２
、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７
、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２
、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７
、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２
、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７
、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２
、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７
、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２
、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７
、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、少なくとも８１、少なくとも８２
、少なくとも８３、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８７
、少なくとも８８、少なくとも８９、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２
、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７
、少なくとも９８、少なくとも９９、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも
３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、
少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少な
くとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少な
くとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００種ま
たはそれを超える配列リード由来のコンセンサス配列から検出することができる。コンセ
ンサス配列は、一本鎖ポリヌクレオチドの配列リードに由来し得る。コンセンサス配列は
、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の配列リードに由来することもできる（例えば、リ
ードのペア形成）。例示的な方法において、リードのペア形成は、増加した信頼度での、
分子における配列バリアントの存在の同定を可能にする。例えば、ペアの両方の鎖が、同
じバリアントを含む場合、増幅／配列決定において同じバリアントが両方の鎖に導入され
る確率は、稀なため、バリアントが、本来の分子に存在したと合理的に確信することがで
きる。対照的に、ペアの一方の鎖のみが、配列バリアントを含む場合、これは、アーチフ
ァクトである可能性がより高い。同様に、増幅／配列決定においてバリアントが１回導入
され得る確率は、２回よりも高いため、配列バリアントを有するシングレットが、本来の
分子に存在した信頼度は、バリアントが二重鎖に存在する場合の信頼度に満たない。
【0204】
コピー数バリエーション検出および配列バリアント検出の他の方法は、参照により本明
細書に全体的に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８０６１に記載されている。
細書に全体的に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８０６１に記載されている。
【0205】
配列リードを崩壊させて、コンセンサス配列を生成することができ、これを参照配列に
マッピングして、ＣＮＶまたはＳＮＶ等、遺伝的バリアントを同定することができる。代
替として、配列リードは、先にマッピングされる、またはマッピングなしであってもよい
。このような場合、配列リードを個々に参照にマッピングして、ＣＮＶまたはＳＮＶを同
定することができる。
マッピングして、ＣＮＶまたはＳＮＶ等、遺伝的バリアントを同定することができる。代
替として、配列リードは、先にマッピングされる、またはマッピングなしであってもよい
。このような場合、配列リードを個々に参照にマッピングして、ＣＮＶまたはＳＮＶを同
定することができる。
【0206】
【0207】
一部の事例において、ＳＮＶまたは複数ヌクレオチドバリアント（ＭＮＶ）は、遺伝子
座に対応する配列リードを整列することにより、所与の遺伝子座（例えば、ヌクレオチド
塩基）における複数の配列リードにわたり決定することができる。次に、配列リードの少
なくともサブセット由来の複数の連続的ヌクレオチド塩基は、参照にマッピングされて、
該リードに対応するポリヌクレオチド分子またはその部分におけるＳＮＶまたはＭＮＶを
決定する。複数の連続的ヌクレオチド塩基は、ＳＮＶまたはＭＮＶの実際の、推測される
または疑われる位置にまたがることができる。複数の連続的ヌクレオチド塩基は、少なく
とも３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド塩基にまたがることができる。
座に対応する配列リードを整列することにより、所与の遺伝子座（例えば、ヌクレオチド
塩基）における複数の配列リードにわたり決定することができる。次に、配列リードの少
なくともサブセット由来の複数の連続的ヌクレオチド塩基は、参照にマッピングされて、
該リードに対応するポリヌクレオチド分子またはその部分におけるＳＮＶまたはＭＮＶを
決定する。複数の連続的ヌクレオチド塩基は、ＳＮＶまたはＭＮＶの実際の、推測される
または疑われる位置にまたがることができる。複数の連続的ヌクレオチド塩基は、少なく
とも３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド塩基にまたがることができる。
【0208】
Ｌ．核酸の検出／定量化
【0209】
本願を通して記載されている方法を使用して、極めて高効率でデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）等の核酸断片をタグ付けすることができる。この効率的なタグ付けは、本来のＤＮＡ
断片の不均一集団（ｃｆＤＮＡ等）における稀なＤＮＡの効率的かつ正確な検出を可能に
する。稀なポリヌクレオチド（例えば、稀なＤＮＡ）は、１０％、５％、４％、３％、２
％、１％または０．１％未満の頻度でポリヌクレオチドの集団に生じる遺伝的バリアント
を含むポリヌクレオチドとなり得る。稀なＤＮＡは、５０％、２５％、１０％、５％、１
％または０．１％未満の濃度で検出可能な特性を有するポリヌクレオチドとなり得る。
Ａ）等の核酸断片をタグ付けすることができる。この効率的なタグ付けは、本来のＤＮＡ
断片の不均一集団（ｃｆＤＮＡ等）における稀なＤＮＡの効率的かつ正確な検出を可能に
する。稀なポリヌクレオチド（例えば、稀なＤＮＡ）は、１０％、５％、４％、３％、２
％、１％または０．１％未満の頻度でポリヌクレオチドの集団に生じる遺伝的バリアント
を含むポリヌクレオチドとなり得る。稀なＤＮＡは、５０％、２５％、１０％、５％、１
％または０．１％未満の濃度で検出可能な特性を有するポリヌクレオチドとなり得る。
【0210】
タグ付けは、単一の反応において起こり得る。一部の事例において、２回またはそれを
超える反応を共に実行およびプールすることができる。単一の反応における本来のＤＮＡ
断片それぞれのタグ付けは、本来のＤＮＡ断片の５０％超（例えば、６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％または９９％）が、分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けさ
れるようなタグ付けをもたらし、これにより、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意すること
ができる。タグ付けは、分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けされた、本来のＤＮ
Ａ断片の３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、
５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、
６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、
７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超をもたらすこともできる。タグ付けは、
分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けされた、本来のＤＮＡ断片の１００％をもた
らすこともできる。タグ付けは、単一末端タグ付けをもたらすこともできる。
超える反応を共に実行およびプールすることができる。単一の反応における本来のＤＮＡ
断片それぞれのタグ付けは、本来のＤＮＡ断片の５０％超（例えば、６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％または９９％）が、分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けさ
れるようなタグ付けをもたらし、これにより、タグ付けされたＤＮＡ断片を用意すること
ができる。タグ付けは、分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けされた、本来のＤＮ
Ａ断片の３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、
５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、
６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、
７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超をもたらすこともできる。タグ付けは、
分子バーコードを含むタグを両端にタグ付けされた、本来のＤＮＡ断片の１００％をもた
らすこともできる。タグ付けは、単一末端タグ付けをもたらすこともできる。
【0211】
タグ付けは、本来のＤＮＡ断片と比較して過剰量のタグを使用することにより起こるこ
ともできる。例えば、過剰は、少なくとも５倍過剰となり得る。他の事例において、過剰
は、少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９５、１００倍またはそれを超えて過剰となり得る。タグ付けは、平滑末端また
は粘着末端への取り付けを含むことができる。タグ付けは、ハイブリダイゼーションＰＣ
Ｒによって行うこともできる。タグ付けは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、
２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３
７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０
、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、
６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７
７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０
、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ピコおよび／ま
たはマイクロリットル等、少ない反応容量で行うこともできる。
ともできる。例えば、過剰は、少なくとも５倍過剰となり得る。他の事例において、過剰
は、少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９５、１００倍またはそれを超えて過剰となり得る。タグ付けは、平滑末端また
は粘着末端への取り付けを含むことができる。タグ付けは、ハイブリダイゼーションＰＣ
Ｒによって行うこともできる。タグ付けは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、
２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３
７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０
、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、
６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７
７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０
、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ピコおよび／ま
たはマイクロリットル等、少ない反応容量で行うこともできる。
【0212】
本方法は、タグ付けされたＤＮＡ断片において高忠実度増幅を行うステップを含むこと
もできる。いかなる高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。例えば、ポリメラー
ゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラ
ーゼとなり得る。
もできる。いかなる高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。例えば、ポリメラー
ゼは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラ
ーゼとなり得る。
【0213】
さらに、本方法は、タグ付けされたＤＮＡ断片のサブセットを選択的に濃縮するステッ
プを含むことができる。例えば、選択的濃縮は、ハイブリダイゼーションまたは増幅技法
によって行うことができる。選択的濃縮は、固体支持体（例えば、ビーズ）を使用して行
うことができる。固体支持体（例えば、ビーズ）は、プローブ（例えば、ある特定の配列
に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を含むことができる。例えば、プロ
ーブは、ある特定のゲノム領域、例えば、遺伝子とハイブリダイズすることができる。一
部の事例において、ゲノム領域、例えば、遺伝子は、疾患、例えば、がんに関連する領域
となり得る。濃縮後に、選択された断片は、本発明に開示されているいずれかの配列決定
アダプタを取り付けることができる。例えば、配列アダプタは、フローセル配列、試料バ
ーコードまたはその両方を含むことができる。別の例において、配列アダプタは、ヘアピ
ン形アダプタとなり得る、および／または試料バーコードを含む。さらに、得られた断片
を増幅および配列決定することができる。一部の事例において、アダプタは、配列決定プ
ライマー領域を含まない。
プを含むことができる。例えば、選択的濃縮は、ハイブリダイゼーションまたは増幅技法
によって行うことができる。選択的濃縮は、固体支持体（例えば、ビーズ）を使用して行
うことができる。固体支持体（例えば、ビーズ）は、プローブ（例えば、ある特定の配列
に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）を含むことができる。例えば、プロ
ーブは、ある特定のゲノム領域、例えば、遺伝子とハイブリダイズすることができる。一
部の事例において、ゲノム領域、例えば、遺伝子は、疾患、例えば、がんに関連する領域
となり得る。濃縮後に、選択された断片は、本発明に開示されているいずれかの配列決定
アダプタを取り付けることができる。例えば、配列アダプタは、フローセル配列、試料バ
ーコードまたはその両方を含むことができる。別の例において、配列アダプタは、ヘアピ
ン形アダプタとなり得る、および／または試料バーコードを含む。さらに、得られた断片
を増幅および配列決定することができる。一部の事例において、アダプタは、配列決定プ
ライマー領域を含まない。
【0214】
本方法は、ＤＮＡ断片の一方または両方の鎖を配列決定するステップを含むことができ
る。一事例において、ＤＮＡ断片の両方の鎖は、独立的に配列決定される。タグ付け、増
幅および／または選択的に濃縮されたＤＮＡ断片を配列決定して、分子バーコードおよび
本来のＤＮＡ断片の少なくとも一部分の配列情報を含む配列リードを得る。
る。一事例において、ＤＮＡ断片の両方の鎖は、独立的に配列決定される。タグ付け、増
幅および／または選択的に濃縮されたＤＮＡ断片を配列決定して、分子バーコードおよび
本来のＤＮＡ断片の少なくとも一部分の配列情報を含む配列リードを得る。
【0215】
本方法は、配列リードにおける冗長性（上述の通り）を低下または追跡して、本来のＤ
ＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセンサスリードを決定するステップを含むことができ
る。例えば、冗長性を低下または追跡するために、本方法は、同じまたは類似の分子バー
コードおよび同じまたは類似の断片配列の末端を有する配列リードを比較するステップを
含むことができる。本方法は、同じまたは類似の分子バーコードを有する配列リードにお
いて系統発生解析を行うステップを含むことができる。分子バーコードは、変動する編集
距離（本願を通して記載されているいずれかの編集距離を含む）、例えば、最大３の編集
距離を有するバーコードを有することができる。断片配列の末端は、変動する距離（本願
を通して記載されているいずれかの編集距離を含む）、例えば、最大３の編集距離を有す
る編集距離を有する断片配列を含むことができる。
ＮＡ断片の一本鎖の代表となるコンセンサスリードを決定するステップを含むことができ
る。例えば、冗長性を低下または追跡するために、本方法は、同じまたは類似の分子バー
コードおよび同じまたは類似の断片配列の末端を有する配列リードを比較するステップを
含むことができる。本方法は、同じまたは類似の分子バーコードを有する配列リードにお
いて系統発生解析を行うステップを含むことができる。分子バーコードは、変動する編集
距離（本願を通して記載されているいずれかの編集距離を含む）、例えば、最大３の編集
距離を有するバーコードを有することができる。断片配列の末端は、変動する距離（本願
を通して記載されているいずれかの編集距離を含む）、例えば、最大３の編集距離を有す
る編集距離を有する断片配列を含むことができる。
【0216】
本方法は、分子バーコードおよび配列情報に従って配列リードをビニングするステップ
を含むことができる。例えば、分子バーコードおよび配列情報に従った配列リードのビニ
ングは、本来のＤＮＡ断片のそれぞれの少なくとも一端から行って、一本鎖リードのビン
を作製することができる。本方法は、各ビンにおいて、配列リードを解析することにより
、本来のＤＮＡ断片の中の所与の本来のＤＮＡ断片の配列を決定するステップをさらに含
むことができる。
を含むことができる。例えば、分子バーコードおよび配列情報に従った配列リードのビニ
ングは、本来のＤＮＡ断片のそれぞれの少なくとも一端から行って、一本鎖リードのビン
を作製することができる。本方法は、各ビンにおいて、配列リードを解析することにより
、本来のＤＮＡ断片の中の所与の本来のＤＮＡ断片の配列を決定するステップをさらに含
むことができる。
【0217】
一部の事例において、各ビンにおける配列リードをコンセンサス配列へと崩壊させ、そ
の後、ゲノムにマッピングすることができる。代替として、配列リードをビニングに先立
ちゲノムにマッピングし、その後、コンセンサス配列へと崩壊させることができる。
の後、ゲノムにマッピングすることができる。代替として、配列リードをビニングに先立
ちゲノムにマッピングし、その後、コンセンサス配列へと崩壊させることができる。
【0218】
本方法は、配列リードを、ペア形成されたリードおよびペア形成されないリードへと選
別するステップを含むこともできる。選別後に、１種または複数の遺伝子座のそれぞれに
マッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの数を定量化するこ
とができる。
別するステップを含むこともできる。選別後に、１種または複数の遺伝子座のそれぞれに
マッピングするペア形成されたリードおよびペア形成されないリードの数を定量化するこ
とができる。
【0219】
本方法は、コンセンサスリードを定量化して、本願を通して記載されている稀なＤＮＡ
を検出および／または定量化するステップを含むことができる。本方法は、タグ付け、増
幅および／または濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノムの各位置において各塩基
が生じる回数を比較することにより、稀なＤＮＡを検出および／または定量化するステッ
プを含むことができる。
を検出および／または定量化するステップを含むことができる。本方法は、タグ付け、増
幅および／または濃縮されたＤＮＡ断片によって表されるゲノムの各位置において各塩基
が生じる回数を比較することにより、稀なＤＮＡを検出および／または定量化するステッ
プを含むことができる。
【0220】
本方法は、タグのライブラリーを使用して、単一の反応において本来のＤＮＡ断片にタ
グ付けするステップを含むことができる。ライブラリーは、少なくとも２、少なくとも３
、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくと
も９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも
１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも
１９、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なく
とも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００種またはいずれかの数の本願
を通して開示されているタグを含むことができる。例えば、タグのライブラリーは、少な
くとも８種のタグを含むことができる。タグのライブラリーは、８種のタグを含むことが
できる（これは、６４種の異なる可能な組合せを生成することができる）。本方法は、高
パーセンテージの断片、例えば、５０％超（または本願を通して記載されているいずれか
のパーセンテージ）が両端にタグ付けされるように行うことができ、タグのそれぞれは、
分子バーコードを含む。
グ付けするステップを含むことができる。ライブラリーは、少なくとも２、少なくとも３
、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくと
も９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも
１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも
１９、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なく
とも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００種またはいずれかの数の本願
を通して開示されているタグを含むことができる。例えば、タグのライブラリーは、少な
くとも８種のタグを含むことができる。タグのライブラリーは、８種のタグを含むことが
できる（これは、６４種の異なる可能な組合せを生成することができる）。本方法は、高
パーセンテージの断片、例えば、５０％超（または本願を通して記載されているいずれか
のパーセンテージ）が両端にタグ付けされるように行うことができ、タグのそれぞれは、
分子バーコードを含む。
【0221】
Ｍ．核酸の処理および／または解析
【0222】
本願を通して記載されている方法は、対象の核酸試料を処理および／または解析するた
めに使用することができる。本方法は、複数のポリヌクレオチド分子への核酸試料のポリ
ヌクレオチド断片を曝露して、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を得るステップを含
むことができる。使用することができる複数のポリヌクレオチド分子は、本願を通して記
載されている。
めに使用することができる。本方法は、複数のポリヌクレオチド分子への核酸試料のポリ
ヌクレオチド断片を曝露して、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を得るステップを含
むことができる。使用することができる複数のポリヌクレオチド分子は、本願を通して記
載されている。
【0223】
例えば、複数のポリヌクレオチド分子はそれぞれ、４０核酸塩基未満またはそれに等し
い長さとなることができ、少なくとも４核酸塩基に関して別個のバーコード配列および少
なくとも１の編集距離を有し、別個のバーコード配列のそれぞれは、複数のポリヌクレオ
チド分子のうちそれぞれ１種の末端から２０核酸塩基以内であり、複数のポリヌクレオチ
ド分子は、配列決定アダプタではない。
い長さとなることができ、少なくとも４核酸塩基に関して別個のバーコード配列および少
なくとも１の編集距離を有し、別個のバーコード配列のそれぞれは、複数のポリヌクレオ
チド分子のうちそれぞれ１種の末端から２０核酸塩基以内であり、複数のポリヌクレオチ
ド分子は、配列決定アダプタではない。
【0224】
タグ付けされたポリヌクレオチド断片は、タグ付けされたポリヌクレオチド断片の増幅
産物として増幅されたポリヌクレオチド断片を生じる条件下で核酸増幅反応に供すること
ができる。増幅後に、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配
列が決定される。一部の事例において、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片
のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用せずに決定される。
産物として増幅されたポリヌクレオチド断片を生じる条件下で核酸増幅反応に供すること
ができる。増幅後に、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片のヌクレオチド配
列が決定される。一部の事例において、増幅されたタグ付けされたポリヌクレオチド断片
のヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用せずに決定される。
【0225】
本方法は、プログラムされたコンピュータプロセッサによりヌクレオチド配列を解析し
て、対象のヌクレオチド試料における１種または複数の遺伝的バリアントを同定するステ
ップを含むことができる。塩基変化（複数可）、挿入（複数可）、反復（複数可）、欠失
（複数可）、コピー数バリエーション（複数可）、エピジェネティック修飾（複数可）、
ヌクレオソーム結合部位（複数可）、複製起点（複数可）によるコピー数変化（複数可）
およびトランスバージョン（複数可）等が挙げられるがこれらに限定されない、いかなる
遺伝子変更を同定することもできる。他の遺伝子変更として、１種または複数の腫瘍関連
遺伝子変更を挙げることができるがこれらに限定されない。
て、対象のヌクレオチド試料における１種または複数の遺伝的バリアントを同定するステ
ップを含むことができる。塩基変化（複数可）、挿入（複数可）、反復（複数可）、欠失
（複数可）、コピー数バリエーション（複数可）、エピジェネティック修飾（複数可）、
ヌクレオソーム結合部位（複数可）、複製起点（複数可）によるコピー数変化（複数可）
およびトランスバージョン（複数可）等が挙げられるがこれらに限定されない、いかなる
遺伝子変更を同定することもできる。他の遺伝子変更として、１種または複数の腫瘍関連
遺伝子変更を挙げることができるがこれらに限定されない。
【0226】
本方法の対象は、疾患であると疑われ得る。例えば、対象は、がんであると疑われ得る
。本方法は、対象から核酸試料を収集するステップを含むことができる。核酸試料は、血
液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄、痰、糞便、脳脊髄液、皮膚、毛髪、汗および／ま
たは涙から収集することができる。核酸試料は、無細胞核酸試料となり得る。一部の事例
において、核酸試料は、対象の１００ナノグラム（ｎｇ）以下の二本鎖ポリヌクレオチド
分子から収集される。
。本方法は、対象から核酸試料を収集するステップを含むことができる。核酸試料は、血
液、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄、痰、糞便、脳脊髄液、皮膚、毛髪、汗および／ま
たは涙から収集することができる。核酸試料は、無細胞核酸試料となり得る。一部の事例
において、核酸試料は、対象の１００ナノグラム（ｎｇ）以下の二本鎖ポリヌクレオチド
分子から収集される。
【0227】
ポリヌクレオチド断片は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を含むことができる。一部の事
例において、複数のポリヌクレオチド分子は、平滑末端ライゲーション、粘着末端ライゲ
ーション、分子逆位プローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションに基づ
くＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライゲーションまたは一本鎖環状化によりポ
リヌクレオチド断片にカップリングされる。
例において、複数のポリヌクレオチド分子は、平滑末端ライゲーション、粘着末端ライゲ
ーション、分子逆位プローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションに基づ
くＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、一本鎖ライゲーションまたは一本鎖環状化によりポ
リヌクレオチド断片にカップリングされる。
【0228】
本明細書に記載されている方法は、核酸の高効率タグ付けをもたらす。例えば、複数の
ポリヌクレオチド分子への核酸試料のポリヌクレオチド断片の曝露は、少なくとも３０％
、例えば、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または
９９％）の変換効率で、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生じる。少なくとも３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６
％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６
％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６
％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６
％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％の変換効率を達成することができる。
ポリヌクレオチド分子への核酸試料のポリヌクレオチド断片の曝露は、少なくとも３０％
、例えば、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または
９９％）の変換効率で、タグ付けされたポリヌクレオチド断片を生じる。少なくとも３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６
％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６
％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６
％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６
％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％の変換効率を達成することができる。
【0229】
本方法は、共通ポリヌクレオチド分子を共有するタグ付けされたポリヌクレオチド断片
をもたらすことができる。例えば、タグ付けされたポリヌクレオチド断片の少なくとも５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５
％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれかは、共通ポリヌクレオチ
ド分子を共有する。本方法は、核酸試料からポリヌクレオチド断片を生成するステップを
含むことができる。
をもたらすことができる。例えば、タグ付けされたポリヌクレオチド断片の少なくとも５
％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５
％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれかは、共通ポリヌクレオチ
ド分子を共有する。本方法は、核酸試料からポリヌクレオチド断片を生成するステップを
含むことができる。
【0230】
一部の事例において、本方法の供するステップは、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ
Ｎ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡ
Ｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、
ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、Ｆ
ＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲ
ＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、
ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ
１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ
２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ
、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ
、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１から
なる群から選択される複数の遺伝子に対応するプライマーの存在下で、タグ付けされたポ
リヌクレオチド断片を増幅するステップを含む。その上、これらの遺伝子のいずれかの組
合せを増幅することができる。例えば、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２
１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４
、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、
４８、４９、５０、５１、５２、５３種または全５４種を増幅することができる。
Ｎ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡ
Ｓ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、
ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、Ｆ
ＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲ
ＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、
ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ
１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ
２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ
、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ
、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１から
なる群から選択される複数の遺伝子に対応するプライマーの存在下で、タグ付けされたポ
リヌクレオチド断片を増幅するステップを含む。その上、これらの遺伝子のいずれかの組
合せを増幅することができる。例えば、これらの遺伝子のうち１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２
１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４
、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、
４８、４９、５０、５１、５２、５３種または全５４種を増幅することができる。
【0231】
本明細書に記載されている方法は、複数のポリヌクレオチド分子から複数の配列リード
を生成するステップを含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、標的ゲノムの
ゲノム遺伝子座を網羅することができる。例えば、ゲノム遺伝子座は、上に収載されてい
る複数の遺伝子に対応することができる。さらに、ゲノム遺伝子座は、これらの遺伝子の
いずれかの組合せとなり得る。いずれか所与のゲノム遺伝子座は、少なくとも２個の核酸
塩基を含むことができる。いずれか所与のゲノム遺伝子座は、複数の核酸塩基、例えば、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３
１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４
、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超える核酸塩基を含むこともでき
る。
を生成するステップを含むことができる。複数のポリヌクレオチド分子は、標的ゲノムの
ゲノム遺伝子座を網羅することができる。例えば、ゲノム遺伝子座は、上に収載されてい
る複数の遺伝子に対応することができる。さらに、ゲノム遺伝子座は、これらの遺伝子の
いずれかの組合せとなり得る。いずれか所与のゲノム遺伝子座は、少なくとも２個の核酸
塩基を含むことができる。いずれか所与のゲノム遺伝子座は、複数の核酸塩基、例えば、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３
１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４
、４５、４６、４７、４８、４９、５０個またはそれを超える核酸塩基を含むこともでき
る。
【0232】
本方法は、コンピュータプロセッサにより、複数の配列リードをファミリーへと群分け
するステップを含むことができる。ファミリーのそれぞれは、鋳型ポリヌクレオチドのう
ち１種に由来する配列リードを含むことができる。各ファミリーは、鋳型ポリヌクレオチ
ドのうち１種のみに由来する配列リードを含むことができる。ファミリーのそれぞれに対
し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成することができる。群分けするステ
ップは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド分子にカップリングされた別個の分子バーコード
および（ｉｉ）複数の配列リード間の類似性を同定することにより、複数の配列リードを
ファミリーへと分類するステップを含むことができ、各ファミリーは、分子バーコードお
よび類似または同一の配列リードの別個の組合せに関連する複数の核酸配列を含む。
するステップを含むことができる。ファミリーのそれぞれは、鋳型ポリヌクレオチドのう
ち１種に由来する配列リードを含むことができる。各ファミリーは、鋳型ポリヌクレオチ
ドのうち１種のみに由来する配列リードを含むことができる。ファミリーのそれぞれに対
し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成することができる。群分けするステ
ップは、（ｉ）複数のポリヌクレオチド分子にカップリングされた別個の分子バーコード
および（ｉｉ）複数の配列リード間の類似性を同定することにより、複数の配列リードを
ファミリーへと分類するステップを含むことができ、各ファミリーは、分子バーコードお
よび類似または同一の配列リードの別個の組合せに関連する複数の核酸配列を含む。
【0233】
統合したら、コンセンサス配列をゲノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座において
コールすることができる。いずれか所与のゲノム遺伝子座において、次のうちいずれかを
決定することができる：ｉ）コールの中の遺伝的バリアント；ｉｉ）コールの中の遺伝子
変更の頻度；ｉｉｉ）コールの総数；およびｉｖ）コールの中の変更の総数。コールは、
所与のゲノム遺伝子座における少なくとも１個の核酸塩基のコールを含むことができる。
コールは、所与のゲノム遺伝子座における複数の核酸塩基のコールを含むことができる。
一部の事例において、コールは、系統発生解析、投票（例えば、偏った投票）、秤量、フ
ァミリーにおける遺伝子座における各リードへの確率の割り当て、または最高確率による
塩基のコールを含むことができる。コンセンサス配列は、配列リードのそれぞれの定量的
尺度または統計的有意性レベルを評価することにより生成することができる。定量的尺度
が行われる場合、本方法は、二項分布、指数関数的分布、ベータ分布または経験的分布の
使用を含むことができる。しかし、特定の位置における塩基の頻度は、コールするために
使用することもでき、例えば、リードの５１％またはそれ超が、この位置において「Ａ」
である場合、塩基は、該特定の位置において「Ａ」とコールすることができる。本方法は
、コンセンサス配列を標的ゲノムにマッピングするステップをさらに含むことができる。
コールすることができる。いずれか所与のゲノム遺伝子座において、次のうちいずれかを
決定することができる：ｉ）コールの中の遺伝的バリアント；ｉｉ）コールの中の遺伝子
変更の頻度；ｉｉｉ）コールの総数；およびｉｖ）コールの中の変更の総数。コールは、
所与のゲノム遺伝子座における少なくとも１個の核酸塩基のコールを含むことができる。
コールは、所与のゲノム遺伝子座における複数の核酸塩基のコールを含むことができる。
一部の事例において、コールは、系統発生解析、投票（例えば、偏った投票）、秤量、フ
ァミリーにおける遺伝子座における各リードへの確率の割り当て、または最高確率による
塩基のコールを含むことができる。コンセンサス配列は、配列リードのそれぞれの定量的
尺度または統計的有意性レベルを評価することにより生成することができる。定量的尺度
が行われる場合、本方法は、二項分布、指数関数的分布、ベータ分布または経験的分布の
使用を含むことができる。しかし、特定の位置における塩基の頻度は、コールするために
使用することもでき、例えば、リードの５１％またはそれ超が、この位置において「Ａ」
である場合、塩基は、該特定の位置において「Ａ」とコールすることができる。本方法は
、コンセンサス配列を標的ゲノムにマッピングするステップをさらに含むことができる。
【0234】
本方法は、ゲノム遺伝子座の中の追加的なゲノム遺伝子座においてコンセンサスコール
を行うステップをさらに含むことができる。本方法は、所与のゲノム遺伝子座および追加
的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム
遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリエーションを決定するステップを含むことが
できる。
を行うステップをさらに含むことができる。本方法は、所与のゲノム遺伝子座および追加
的なゲノム遺伝子座における計数に基づき、所与のゲノム遺伝子座および追加的なゲノム
遺伝子座のうち１種におけるコピー数のバリエーションを決定するステップを含むことが
できる。
【0235】
本明細書に記載されている方法は、反応容器に鋳型ポリヌクレオチド分子およびアダプ
タポリヌクレオチド分子のライブラリーを用意するステップを含むことができる。アダプ
タポリヌクレオチド分子は、２～１，０００種の異なるバーコード配列を有することがで
き、一部の事例において、配列決定アダプタではない。アダプタポリヌクレオチド分子の
他のバリエーションは、本願を通して記載されており、本方法においてこれを使用するこ
ともできる。
タポリヌクレオチド分子のライブラリーを用意するステップを含むことができる。アダプ
タポリヌクレオチド分子は、２～１，０００種の異なるバーコード配列を有することがで
き、一部の事例において、配列決定アダプタではない。アダプタポリヌクレオチド分子の
他のバリエーションは、本願を通して記載されており、本方法においてこれを使用するこ
ともできる。
【0236】
アダプタのポリヌクレオチド分子は、同じ試料タグを有することができる。アダプタポ
リヌクレオチド分子は、鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリングすることができ
る。本方法は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％または９９％）の効率で、アダプタポリヌクレオチド分子を鋳
型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、４～１，０００，０００種の異
なるタグ付け組合せの中のタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タ
グ付けされたポリヌクレオチド分子を産生するステップを含むことができる。一部の事例
において、反応は、単一の反応容器内で起こることができる。カップリング効率は、少な
くとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５
５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６
５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７
５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８
５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％となることもできる。タグ付けは、非特有タ
グ付けとなり得る。
リヌクレオチド分子は、鋳型ポリヌクレオチド分子の両端にカップリングすることができ
る。本方法は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％
、８０％、９０％、９５％または９９％）の効率で、アダプタポリヌクレオチド分子を鋳
型ポリヌクレオチド分子にカップリングし、これにより、４～１，０００，０００種の異
なるタグ付け組合せの中のタグ付け組合せを各鋳型ポリヌクレオチドにタグ付けして、タ
グ付けされたポリヌクレオチド分子を産生するステップを含むことができる。一部の事例
において、反応は、単一の反応容器内で起こることができる。カップリング効率は、少な
くとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５
５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６
５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７
５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８
５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％となることもできる。タグ付けは、非特有タ
グ付けとなり得る。
【0237】
次に、タグ付けされたポリヌクレオチド分子は、タグ付けされたポリヌクレオチド分子
の増幅産物として増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅反応に供する
ことができる。鋳型ポリヌクレオチド分子は、二本鎖となり得る。さらに、鋳型ポリヌク
レオチド分子は、平滑末端となり得る。一部の事例において、増幅反応は、タグ付けされ
たポリヌクレオチド分子を非特異的に増幅するステップを含む。増幅反応は、タグ付けさ
れたポリヌクレオチド分子のそれぞれを増幅するためにプライミング部位を使用するステ
ップを含むこともできる。プライミング部位は、プライマー、例えば、ユニバーサルプラ
イマーとなり得る。プライミング部位は、ニックとなることもできる。
の増幅産物として増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅反応に供する
ことができる。鋳型ポリヌクレオチド分子は、二本鎖となり得る。さらに、鋳型ポリヌク
レオチド分子は、平滑末端となり得る。一部の事例において、増幅反応は、タグ付けされ
たポリヌクレオチド分子を非特異的に増幅するステップを含む。増幅反応は、タグ付けさ
れたポリヌクレオチド分子のそれぞれを増幅するためにプライミング部位を使用するステ
ップを含むこともできる。プライミング部位は、プライマー、例えば、ユニバーサルプラ
イマーとなり得る。プライミング部位は、ニックとなることもできる。
【0238】
本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子を配列決定するステップを含むこともでき
る。配列決定するステップは、（ｉ）増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物として
追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅されたポリヌクレオチ
ド分子を追加的な増幅反応に供するステップおよび／または（ｉｉ）追加的な増幅された
ポリヌクレオチド分子を配列決定するステップを含むことができる。追加的な増幅は、フ
ローセルに結合することができるポリヌクレオチド分子を産生するフローセル配列を含む
プライマーの存在下で行うことができる。追加的な増幅は、ヘアピン形アダプタのための
配列を含むプライマーの存在下で行うこともできる。ヘアピン形アダプタをポリヌクレオ
チド断片の両端に取り付けて、複数回配列決定することができる環状分子を生成すること
ができる。本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺伝的バリアン
トを同定するステップをさらに含むことができる。
る。配列決定するステップは、（ｉ）増幅されたポリヌクレオチド分子の増幅産物として
追加的な増幅されたポリヌクレオチド分子を生じる条件下で、増幅されたポリヌクレオチ
ド分子を追加的な増幅反応に供するステップおよび／または（ｉｉ）追加的な増幅された
ポリヌクレオチド分子を配列決定するステップを含むことができる。追加的な増幅は、フ
ローセルに結合することができるポリヌクレオチド分子を産生するフローセル配列を含む
プライマーの存在下で行うことができる。追加的な増幅は、ヘアピン形アダプタのための
配列を含むプライマーの存在下で行うこともできる。ヘアピン形アダプタをポリヌクレオ
チド断片の両端に取り付けて、複数回配列決定することができる環状分子を生成すること
ができる。本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子の配列決定の際に遺伝的バリアン
トを同定するステップをさらに含むことができる。
【0239】
本方法は、増幅されたポリヌクレオチド分子から、１種または複数の所与の配列を含む
ポリヌクレオチド分子を分離して、濃縮されたポリヌクレオチド分子を産生するステップ
をさらに含むことができる。本方法は、フローセル配列を含むプライマーにより、濃縮さ
れたポリヌクレオチド分子を増幅するステップを含むこともできる。フローセル配列を含
むプライマーによるこの増幅は、フローセルに結合することができるポリヌクレオチド分
子を産生するであろう。増幅は、ヘアピン形アダプタのための配列を含むプライマーの存
在下で行うこともできる。ヘアピン形アダプタをポリヌクレオチド断片の両端に取り付け
て、複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる。
ポリヌクレオチド分子を分離して、濃縮されたポリヌクレオチド分子を産生するステップ
をさらに含むことができる。本方法は、フローセル配列を含むプライマーにより、濃縮さ
れたポリヌクレオチド分子を増幅するステップを含むこともできる。フローセル配列を含
むプライマーによるこの増幅は、フローセルに結合することができるポリヌクレオチド分
子を産生するであろう。増幅は、ヘアピン形アダプタのための配列を含むプライマーの存
在下で行うこともできる。ヘアピン形アダプタをポリヌクレオチド断片の両端に取り付け
て、複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる。
【0240】
フローセル配列またはヘアピン形アダプタは、かかる配列のライゲーション等、非増幅
方法により付加することができる。ハイブリダイゼーション方法等の他の技法、例えば、
ヌクレオチドオーバーハングを使用することができる。
方法により付加することができる。ハイブリダイゼーション方法等の他の技法、例えば、
ヌクレオチドオーバーハングを使用することができる。
【0241】
本方法は、タグ付けされたポリヌクレオチド分子をアリコートにすることなく行うこと
ができる。例えば、タグ付けされたポリヌクレオチド分子を作製したら、増幅および配列
決定は、さらに調製することなく、同じチューブ内で起こることができる。
ができる。例えば、タグ付けされたポリヌクレオチド分子を作製したら、増幅および配列
決定は、さらに調製することなく、同じチューブ内で起こることができる。
【0242】
本明細書に記載されている方法は、単一ヌクレオチドバリエーション（ＳＮＶ）、コピ
ー数バリエーション（ＣＮＶ）、挿入、欠失および／または再編成の検出において有用と
なり得る。一部の事例において、ＳＮＶ、ＣＮＶ、挿入、欠失および／または再編成は、
疾患、例えば、がんに関連することができる。
ー数バリエーション（ＣＮＶ）、挿入、欠失および／または再編成の検出において有用と
なり得る。一部の事例において、ＳＮＶ、ＣＮＶ、挿入、欠失および／または再編成は、
疾患、例えば、がんに関連することができる。
【0243】
Ｎ．患者の状態のモニタリング
【0244】
本明細書に開示されている方法を使用して、患者の疾患状態をモニタリングすることも
できる。対象の疾患を経時的にモニタリングして、疾患の進行（例えば、退縮）を決定す
ることができる。疾患を示すマーカーは、無細胞ＤＮＡ試料等、対象の生物学的試料にお
いてモニタリングすることができる。
できる。対象の疾患を経時的にモニタリングして、疾患の進行（例えば、退縮）を決定す
ることができる。疾患を示すマーカーは、無細胞ＤＮＡ試料等、対象の生物学的試料にお
いてモニタリングすることができる。
【0245】
例えば、対象のがん状態のモニタリングは、（ａ）１種もしくは複数のＳＮＶの量また
は複数の遺伝子（例えば、エクソンにおける）のコピー数の決定、（ｂ）異なる時点にお
けるかかる決定の反復、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）の間でＳＮＶの数、ＳＮＶの
レベル、ゲノム再編成の数もしくはレベルまたはコピー数に差があるかに関する決定を含
むことができる。遺伝子は、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲ
ＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴ
ＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳ
Ｆ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、
ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ
２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ
、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、Ｓ
ＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣ
Ａ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ
１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、
ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択され得る
。遺伝子は、この群における遺伝子のうちいずれか５、１０、１５、２０、３０、４０、
５０種または全種から選択することができる。
は複数の遺伝子（例えば、エクソンにおける）のコピー数の決定、（ｂ）異なる時点にお
けるかかる決定の反復、ならびに（ｃ）（ａ）および（ｂ）の間でＳＮＶの数、ＳＮＶの
レベル、ゲノム再編成の数もしくはレベルまたはコピー数に差があるかに関する決定を含
むことができる。遺伝子は、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲ
ＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴ
ＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳ
Ｆ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、
ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ
２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ
、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、Ｓ
ＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣ
Ａ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ
１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、
ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択され得る
。遺伝子は、この群における遺伝子のうちいずれか５、１０、１５、２０、３０、４０、
５０種または全種から選択することができる。
【0246】
Ｏ．感度および特異性
【0247】
本明細書に開示されている方法を使用して、高度な一致で、例えば、高感度および／ま
たは特異性で、試料におけるがんポリヌクレオチドおよび対象におけるがんを検出するこ
とができる。例えば、かかる方法は、少なくとも９９％、９９．９％、９９．９９％、９
９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９９％の特異性で、５％、１％、０
．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％未満の濃度で、試料におけるがんポリヌ
クレオチド（例えば、稀なＤＮＡ）を検出することができる。かかるポリヌクレオチドは
、がんまたは他の疾患を示すことができる。さらに、かかる方法は、少なくとも９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９
％、９９．９９％、９９．９９９％または９９．９９９９％の陽性的中率で、試料におけ
るがんポリヌクレオチドを検出することができる。
たは特異性で、試料におけるがんポリヌクレオチドおよび対象におけるがんを検出するこ
とができる。例えば、かかる方法は、少なくとも９９％、９９．９％、９９．９９％、９
９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９９％の特異性で、５％、１％、０
．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％未満の濃度で、試料におけるがんポリヌ
クレオチド（例えば、稀なＤＮＡ）を検出することができる。かかるポリヌクレオチドは
、がんまたは他の疾患を示すことができる。さらに、かかる方法は、少なくとも９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９
％、９９．９９％、９９．９９９％または９９．９９９９％の陽性的中率で、試料におけ
るがんポリヌクレオチドを検出することができる。
【0248】
現実に陽性である、検査で陽性として同定される対象は、真陽性（ＴＰ）と称される。
現実には陰性である、検査で陽性として同定される対象は、偽陽性（ＦＰ）と称される。
現実に陰性である、検査で陰性として同定される対象は、真陰性（ＴＮ）と称される。現
実には陽性である、検査で陰性として同定される対象は、偽陰性（ＦＮ）と称される。感
度は、検査で陽性として同定される実際の陽性のパーセンテージである。これは、例えば
、がん遺伝的バリアントを見出すべきおよび見出した事例を含む（感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋
ＦＮ））。特異性は、検査で陰性として同定される実際の陰性のパーセンテージである。
これは、例えば、がん遺伝的バリアントを見出すべきでないおよび見出さなかった事例を
含む。特異性は、次の方程式を使用して計算することができる：特異性＝ＴＮ／（ＴＮ＋
ＦＰ）。陽性的中率（ＰＰＶ）は、真陽性である、検査陽性の対象のパーセンテージによ
って測定することができる。ＰＰＶは、次の方程式を使用して計算することができる：Ｐ
ＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）。感度（例えば、検出される実際の陽性の確率）および／ま
たは特異性（例えば、実際の陰性を陽性と間違えない確率）を増加させることにより、陽
性的中率を増加させることができる。
現実には陰性である、検査で陽性として同定される対象は、偽陽性（ＦＰ）と称される。
現実に陰性である、検査で陰性として同定される対象は、真陰性（ＴＮ）と称される。現
実には陽性である、検査で陰性として同定される対象は、偽陰性（ＦＮ）と称される。感
度は、検査で陽性として同定される実際の陽性のパーセンテージである。これは、例えば
、がん遺伝的バリアントを見出すべきおよび見出した事例を含む（感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋
ＦＮ））。特異性は、検査で陰性として同定される実際の陰性のパーセンテージである。
これは、例えば、がん遺伝的バリアントを見出すべきでないおよび見出さなかった事例を
含む。特異性は、次の方程式を使用して計算することができる：特異性＝ＴＮ／（ＴＮ＋
ＦＰ）。陽性的中率（ＰＰＶ）は、真陽性である、検査陽性の対象のパーセンテージによ
って測定することができる。ＰＰＶは、次の方程式を使用して計算することができる：Ｐ
ＰＶ＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）。感度（例えば、検出される実際の陽性の確率）および／ま
たは特異性（例えば、実際の陰性を陽性と間違えない確率）を増加させることにより、陽
性的中率を増加させることができる。
【0249】
ポリヌクレオチドからアダプタタグ付けされたポリヌクレオチドへの低変換率は、稀な
ポリヌクレオチド標的を変換、したがって、検出する確率を減少させるため、感度を損な
い得る。検査におけるノイズは、検査において検出される偽陽性の数を増加させるため、
特異性を損ない得る。低変換率およびノイズの両方は、真陽性のパーセンテージを減少さ
せ、偽陽性のパーセンテージを増加させるため、陽性的中率を損なう。
ポリヌクレオチド標的を変換、したがって、検出する確率を減少させるため、感度を損な
い得る。検査におけるノイズは、検査において検出される偽陽性の数を増加させるため、
特異性を損ない得る。低変換率およびノイズの両方は、真陽性のパーセンテージを減少さ
せ、偽陽性のパーセンテージを増加させるため、陽性的中率を損なう。
【0250】
本明細書に開示されている方法は、高レベルの一致、例えば、感度および特異性を達成
することができ、高い陽性的中率をもたらす。感度を増加させる方法は、試料におけるポ
リヌクレオチドからアダプタタグ付けされたポリヌクレオチドへの高効率変換を含む。特
異性を増加させる方法は、例えば、分子追跡により配列決定エラーを低下させるステップ
を含む。
することができ、高い陽性的中率をもたらす。感度を増加させる方法は、試料におけるポ
リヌクレオチドからアダプタタグ付けされたポリヌクレオチドへの高効率変換を含む。特
異性を増加させる方法は、例えば、分子追跡により配列決定エラーを低下させるステップ
を含む。
【0251】
本開示の方法を使用して、少なくとも９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９
９％、９９．９９９９％または９９．９９９９９％の特異性で、５％、１％、０．５％、
０．１％、０．０５％または０．０１％未満の濃度で、非特有にタグ付けされた初期出発
遺伝的材料における遺伝的バリエーション（例えば、稀なＤＮＡ）を検出することができ
る。一部の態様において、本方法は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも
３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％または少なくとも９０％の効率で、初期出発材料におけるポリヌクレオ
チドを変換するステップをさらに含むことができる。タグ付けされたポリヌクレオチドの
配列リードをその後追跡して、２％、１％、０．１％または０．０１％以下のエラー率で
、ポリヌクレオチドのコンセンサス配列を生成することができる。
９％、９９．９９９９％または９９．９９９９９％の特異性で、５％、１％、０．５％、
０．１％、０．０５％または０．０１％未満の濃度で、非特有にタグ付けされた初期出発
遺伝的材料における遺伝的バリエーション（例えば、稀なＤＮＡ）を検出することができ
る。一部の態様において、本方法は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも
３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％または少なくとも９０％の効率で、初期出発材料におけるポリヌクレオ
チドを変換するステップをさらに含むことができる。タグ付けされたポリヌクレオチドの
配列リードをその後追跡して、２％、１％、０．１％または０．０１％以下のエラー率で
、ポリヌクレオチドのコンセンサス配列を生成することができる。
【0252】
２．プール方法
【0253】
被験試料における１種または複数の遺伝子座におけるコピー数バリエーションおよび／
または配列バリアントを検出する方法が本明細書に開示されている。図８に一実施形態を
示す。典型的には、コピー数バリエーションの検出は、被験試料のゲノムにおける目的の
遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの定量的尺度（例えば、絶対または相対数
）の決定と、対照試料における該遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの定量的
尺度に対するこの数の比較とに関与する。ある特定の方法において、定量的尺度は、目的
の遺伝子座にマッピングされる被験試料における分子の数と、参照配列、例えば、野生型
の倍数性で存在することが予想される配列にマッピングされる被験試料における分子の数
とを比較することにより決定される。一部の例において、参照配列は、ＨＧ１９、ｂｕｉ
ｌｄ ３７またはｂｕｉｌｄ ３８である。比較は、例えば、比の決定に関与し得る。次
に、この尺度は、対照試料において決定される類似の尺度と比較される。そこで、例えば
、被験試料が、目的の遺伝子座対参照遺伝子座に関して１．５：１の比を有し、対照試料
が、同遺伝子座に関して１：１の比を有する場合、被験試料が、目的の遺伝子座において
倍数性を示すと結論することができる。
または配列バリアントを検出する方法が本明細書に開示されている。図８に一実施形態を
示す。典型的には、コピー数バリエーションの検出は、被験試料のゲノムにおける目的の
遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの定量的尺度（例えば、絶対または相対数
）の決定と、対照試料における該遺伝子座にマッピングされるポリヌクレオチドの定量的
尺度に対するこの数の比較とに関与する。ある特定の方法において、定量的尺度は、目的
の遺伝子座にマッピングされる被験試料における分子の数と、参照配列、例えば、野生型
の倍数性で存在することが予想される配列にマッピングされる被験試料における分子の数
とを比較することにより決定される。一部の例において、参照配列は、ＨＧ１９、ｂｕｉ
ｌｄ ３７またはｂｕｉｌｄ ３８である。比較は、例えば、比の決定に関与し得る。次
に、この尺度は、対照試料において決定される類似の尺度と比較される。そこで、例えば
、被験試料が、目的の遺伝子座対参照遺伝子座に関して１．５：１の比を有し、対照試料
が、同遺伝子座に関して１：１の比を有する場合、被験試料が、目的の遺伝子座において
倍数性を示すと結論することができる。
【0254】
被験試料および対照試料が、別々に解析される場合、ワークフローは、対照および被験
試料における最終的な数の間に歪みを導入し得る。
試料における最終的な数の間に歪みを導入し得る。
【0255】
本明細書に開示されている一方法において（例えば、フローチャート８００）、ポリヌ
クレオチドが、被験および対照試料から用意される（８０２）。被験試料におけるポリヌ
クレオチドおよび対照試料におけるポリヌクレオチドは、被験または対照試料に起源をも
つとポリヌクレオチドを同定するタグ（供給源タグ）をタグ付けされる（８０４）。タグ
は、例えば、供給源を明確に同定するポリヌクレオチド配列またはバーコードとなり得る
。
クレオチドが、被験および対照試料から用意される（８０２）。被験試料におけるポリヌ
クレオチドおよび対照試料におけるポリヌクレオチドは、被験または対照試料に起源をも
つとポリヌクレオチドを同定するタグ（供給源タグ）をタグ付けされる（８０４）。タグ
は、例えば、供給源を明確に同定するポリヌクレオチド配列またはバーコードとなり得る
。
【0256】
対照および被験試料のそれぞれにおけるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのあら
ゆる増幅後代によって保有される識別子タグをタグ付けすることもできる。ポリヌクレオ
チドの開始および終止配列ならびに識別子タグからの情報は、本来の親分子から増幅され
たポリヌクレオチドから配列リードを同定することができる。各分子は、試料における他
の分子と比較して、特有にタグ付けすることができる。あるいは、各分子は、試料におけ
る他の分子と比較して、特有にタグ付けする必要はない。すなわち、異なる識別子配列の
数は、試料における分子の数よりも少なくなることができる。識別子情報を開始／停止配
列情報と組み合わせることにより、同じ開始／停止配列を有する２分子を混同する確率は
、有意に縮小される。
ゆる増幅後代によって保有される識別子タグをタグ付けすることもできる。ポリヌクレオ
チドの開始および終止配列ならびに識別子タグからの情報は、本来の親分子から増幅され
たポリヌクレオチドから配列リードを同定することができる。各分子は、試料における他
の分子と比較して、特有にタグ付けすることができる。あるいは、各分子は、試料におけ
る他の分子と比較して、特有にタグ付けする必要はない。すなわち、異なる識別子配列の
数は、試料における分子の数よりも少なくなることができる。識別子情報を開始／停止配
列情報と組み合わせることにより、同じ開始／停止配列を有する２分子を混同する確率は
、有意に縮小される。
【0257】
核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ）のタグ付けに使用される異なる識別子の数は、異なる一倍
体ゲノム当量の数に依存し得る。異なる識別子を使用して、少なくとも２、少なくとも１
０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少な
くとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９
００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくと
も４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、
少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００種またはそれを
超える異なる一倍体ゲノム当量にタグ付けすることができる。したがって、５００～１０
，０００種の異なる一倍体ゲノム当量の核酸試料、例えば、無細胞ＤＮＡのタグ付けに使
用される異なる識別子の数は、１、２、３、４および５と、１００、９０、８０、７０、
６０、５０、４０または３０以下のいずれかの間となり得る。例えば、５００～１０，０
００種の異なる一倍体ゲノム当量の核酸試料のタグ付けに使用される異なる識別子の数は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４
４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７
、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、
７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８
４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７
、９８、９９、１００またはそれに満たなくてよい。
体ゲノム当量の数に依存し得る。異なる識別子を使用して、少なくとも２、少なくとも１
０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少な
くとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９
００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくと
も４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、
少なくとも８，０００、少なくとも９，０００、少なくとも１０，０００種またはそれを
超える異なる一倍体ゲノム当量にタグ付けすることができる。したがって、５００～１０
，０００種の異なる一倍体ゲノム当量の核酸試料、例えば、無細胞ＤＮＡのタグ付けに使
用される異なる識別子の数は、１、２、３、４および５と、１００、９０、８０、７０、
６０、５０、４０または３０以下のいずれかの間となり得る。例えば、５００～１０，０
００種の異なる一倍体ゲノム当量の核酸試料のタグ付けに使用される異なる識別子の数は
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４
４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７
、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、
７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８
４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７
、９８、９９、１００またはそれに満たなくてよい。
【0258】
ポリヌクレオチドは、増幅前に、タグまたは識別子を含むアダプタのライゲーションに
よってタグ付けすることができる。ライゲーションは、酵素、例えば、リガーゼを使用し
て行うことができる。例えば、タグ付けは、ＤＮＡリガーゼを使用して行うことができる
。ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼおよび／ま
たは哺乳動物リガーゼとなり得る。哺乳動物リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガ
ーゼＩＩＩまたはＤＮＡリガーゼＩＶとなり得る。リガーゼは、熱安定性リガーゼとなる
こともできる。タグは、ポリヌクレオチドの平滑末端にライゲーションすることができる
（平滑末端ライゲーション）。あるいは、タグは、ポリヌクレオチドの粘着末端にライゲ
ーションすることができる（粘着末端ライゲーション）。ポリヌクレオチドは、アダプタ
（例えば、フォーク形末端を有するアダプタ）を使用した平滑末端ライゲーションにより
タグ付けすることができる。高効率のライゲーションは、大過剰のアダプタ（例えば、１
．５×超、２×超、３×超、４×超、５×超、６×超、７×超、８×超、９×超、１０×
超、１１×超、１２×超、１３×超、１４×超、１５×超、２０×超、２５×超、３０×
超、３５×超、４０×超、４５×超、５０×超、５５×超、６０×超、６５×超、７０×
超、７５×超、８０×超、８５×超、９０×超、９５×超または１００超）を使用して達
成することができる。
よってタグ付けすることができる。ライゲーションは、酵素、例えば、リガーゼを使用し
て行うことができる。例えば、タグ付けは、ＤＮＡリガーゼを使用して行うことができる
。ＤＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼおよび／ま
たは哺乳動物リガーゼとなり得る。哺乳動物リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガ
ーゼＩＩＩまたはＤＮＡリガーゼＩＶとなり得る。リガーゼは、熱安定性リガーゼとなる
こともできる。タグは、ポリヌクレオチドの平滑末端にライゲーションすることができる
（平滑末端ライゲーション）。あるいは、タグは、ポリヌクレオチドの粘着末端にライゲ
ーションすることができる（粘着末端ライゲーション）。ポリヌクレオチドは、アダプタ
（例えば、フォーク形末端を有するアダプタ）を使用した平滑末端ライゲーションにより
タグ付けすることができる。高効率のライゲーションは、大過剰のアダプタ（例えば、１
．５×超、２×超、３×超、４×超、５×超、６×超、７×超、８×超、９×超、１０×
超、１１×超、１２×超、１３×超、１４×超、１５×超、２０×超、２５×超、３０×
超、３５×超、４０×超、４５×超、５０×超、５５×超、６０×超、６５×超、７０×
超、７５×超、８０×超、８５×超、９０×超、９５×超または１００超）を使用して達
成することができる。
【0259】
ポリヌクレオチドの供給源を同定するタグをタグ付けしたら、異なる供給源（例えば、
異なる試料）由来のポリヌクレオチドをプールすることができる。プール後に、異なる供
給源（例えば、異なる試料）由来のポリヌクレオチドは、定量的測定のいずれかのプロセ
スを含む、タグを使用したいずれかの測定により識別することができる。例えば、（８０
６）に示す通り（図８）、対照試料および被験試料由来のポリヌクレオチドをプールする
ことができる。プールされた分子は、配列決定（８０８）およびバイオインフォマティク
スワークフローに供することができる。両者を、プロセスにおける同じバリエーションに
供し、したがって、いかなる差次的バイアスも低下される。対照および被験試料に起源を
もつ分子は、異なってタグ付けされるため、定量的測定のいずれかのプロセスにおいて識
別することができる。
異なる試料）由来のポリヌクレオチドをプールすることができる。プール後に、異なる供
給源（例えば、異なる試料）由来のポリヌクレオチドは、定量的測定のいずれかのプロセ
スを含む、タグを使用したいずれかの測定により識別することができる。例えば、（８０
６）に示す通り（図８）、対照試料および被験試料由来のポリヌクレオチドをプールする
ことができる。プールされた分子は、配列決定（８０８）およびバイオインフォマティク
スワークフローに供することができる。両者を、プロセスにおける同じバリエーションに
供し、したがって、いかなる差次的バイアスも低下される。対照および被験試料に起源を
もつ分子は、異なってタグ付けされるため、定量的測定のいずれかのプロセスにおいて識
別することができる。
【0260】
プールされた対照および被験試料の相対量は、変動し得る。対照試料の量は、被験試料
の量と同じになることができる。対照試料の量は、被験試料の量よりも多くなることもで
きる。あるいは、対照試料の量は、被験試料の量よりも少なくてよい。総計に対し１試料
の相対量が少ないほど、本来のタグ付けプロセスにおいて必要とされる同定タグ数は少な
くなる。数値は、同じ開始／終了配列を有する２種の親分子が、同じ同定タグを有する確
率を許容されるレベルまで低下させるように選択することができる。この確率は、１０％
未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満となり得る。確率は、２５％、２４
％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４
％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２
％または１％未満となり得る。
の量と同じになることができる。対照試料の量は、被験試料の量よりも多くなることもで
きる。あるいは、対照試料の量は、被験試料の量よりも少なくてよい。総計に対し１試料
の相対量が少ないほど、本来のタグ付けプロセスにおいて必要とされる同定タグ数は少な
くなる。数値は、同じ開始／終了配列を有する２種の親分子が、同じ同定タグを有する確
率を許容されるレベルまで低下させるように選択することができる。この確率は、１０％
未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満となり得る。確率は、２５％、２４
％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４
％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２
％または１％未満となり得る。
【0261】
本明細書に開示されている方法は、配列リードを群分けするステップを含むこともでき
る。例えば、バイオインフォマティクスワークフローは、（８１０）に示す通り（図８）
、単一の親分子の後代から産生された配列リードの群分けを含むことができる。これは、
本明細書に記載されている冗長性低下方法のいずれかに関与し得る。被験および対照試料
から供給された分子は、それらが保有する供給源タグに基づき区別することができる（８
１２）。標的遺伝子座にマッピングされる分子は、被験供給および対照供給分子の両方の
ために定量化される（８１２）。これは、例えば、標的遺伝子座における数が、参照遺伝
子座における数に対し正規化される、本明細書に記されている正規化方法を含むことがで
きる。
る。例えば、バイオインフォマティクスワークフローは、（８１０）に示す通り（図８）
、単一の親分子の後代から産生された配列リードの群分けを含むことができる。これは、
本明細書に記載されている冗長性低下方法のいずれかに関与し得る。被験および対照試料
から供給された分子は、それらが保有する供給源タグに基づき区別することができる（８
１２）。標的遺伝子座にマッピングされる分子は、被験供給および対照供給分子の両方の
ために定量化される（８１２）。これは、例えば、標的遺伝子座における数が、参照遺伝
子座における数に対し正規化される、本明細書に記されている正規化方法を含むことがで
きる。
【0262】
被験および対照試料由来の標的遺伝子座における正規化された（または未加工の）分量
を比較して、コピー数バリエーションの存在を決定する（８１４）。
を比較して、コピー数バリエーションの存在を決定する（８１４）。
【0263】
３．コンピュータ制御システム
【0264】
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ制御システム
を提供する。図６は、本開示の方法を実施するようにプログラムまたは他の仕方で構成さ
れたコンピュータシステム１５０１を示す。コンピュータシステム１５０１は、試料調製
、配列決定および／または解析の様々な態様を調節することができる。一部の例において
、コンピュータシステム１５０１は、核酸配列決定を含む試料調製および試料解析を行う
ように構成されている。コンピュータシステム１５０１は、ユーザーの電子装置または該
電子装置に対して遠隔に位置するコンピュータシステムとなり得る。電子装置は、モバイ
ル電子装置となり得る。
を提供する。図６は、本開示の方法を実施するようにプログラムまたは他の仕方で構成さ
れたコンピュータシステム１５０１を示す。コンピュータシステム１５０１は、試料調製
、配列決定および／または解析の様々な態様を調節することができる。一部の例において
、コンピュータシステム１５０１は、核酸配列決定を含む試料調製および試料解析を行う
ように構成されている。コンピュータシステム１５０１は、ユーザーの電子装置または該
電子装置に対して遠隔に位置するコンピュータシステムとなり得る。電子装置は、モバイ
ル電子装置となり得る。
【0265】
コンピュータシステム１５０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサまたは
並列処理のための複数のプロセッサとなり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書において
同様に、「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）１５０５を含む。コンピュ
ータシステム１５０１は、メモリまたはメモリ場所１５１０（例えば、ランダムアクセス
メモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶ユニット１５１５（例え
ば、ハードディスク）と、１個または複数の他のシステムと連絡するための通信インター
フェイス１５２０（例えば、ネットワークアダプター）と、キャッシュ、他のメモリ、デ
ータ記憶および／または電子表示アダプター等の周辺装置１５２５も含む。メモリ１５１
０、記憶ユニット１５１５、インターフェイス１５２０および周辺装置１５２５は、マザ
ーボード等、コミュニケーションバス（実線）を介してＣＰＵ１５０５と連絡している。
記憶ユニット１５１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリ
ポジトリ）となり得る。コンピュータシステム１５０１は、通信インターフェイス１５２
０の助けにより、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１５３０に作動可能に
カップリングすることができる。ネットワーク１５３０は、インターネット、インターネ
ットおよび／またはエクストラネット、あるいはインターネットと連絡したイントラネッ
トおよび／またはエクストラネットとなり得る。ネットワーク１５３０は、一部の事例に
おいて、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１５３０は、
クラウドコンピューティング等、分散コンピューティングを可能にし得る１個または複数
のコンピュータサーバーを含むことができる。ネットワーク１５３０は、一部の事例にお
いて、コンピュータシステム１５０１の助けにより、コンピュータシステム１５０１にカ
ップリングされた装置が、クライアントまたはサーバーとして挙動することを可能にし得
る、ピアツーピアネットワークを実施することができる。
並列処理のための複数のプロセッサとなり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書において
同様に、「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）１５０５を含む。コンピュ
ータシステム１５０１は、メモリまたはメモリ場所１５１０（例えば、ランダムアクセス
メモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶ユニット１５１５（例え
ば、ハードディスク）と、１個または複数の他のシステムと連絡するための通信インター
フェイス１５２０（例えば、ネットワークアダプター）と、キャッシュ、他のメモリ、デ
ータ記憶および／または電子表示アダプター等の周辺装置１５２５も含む。メモリ１５１
０、記憶ユニット１５１５、インターフェイス１５２０および周辺装置１５２５は、マザ
ーボード等、コミュニケーションバス（実線）を介してＣＰＵ１５０５と連絡している。
記憶ユニット１５１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリ
ポジトリ）となり得る。コンピュータシステム１５０１は、通信インターフェイス１５２
０の助けにより、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１５３０に作動可能に
カップリングすることができる。ネットワーク１５３０は、インターネット、インターネ
ットおよび／またはエクストラネット、あるいはインターネットと連絡したイントラネッ
トおよび／またはエクストラネットとなり得る。ネットワーク１５３０は、一部の事例に
おいて、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１５３０は、
クラウドコンピューティング等、分散コンピューティングを可能にし得る１個または複数
のコンピュータサーバーを含むことができる。ネットワーク１５３０は、一部の事例にお
いて、コンピュータシステム１５０１の助けにより、コンピュータシステム１５０１にカ
ップリングされた装置が、クライアントまたはサーバーとして挙動することを可能にし得
る、ピアツーピアネットワークを実施することができる。
【0266】
ＣＰＵ１５０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化され得る機械可読命
令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１５１０等、メモリ場所におい
て記憶され得る。命令は、ＣＰＵ１５０５に向けることができ、これはその後、本開示の
方法を実施するようにＣＰＵ１５０５をプログラムまたは他の仕方で構成することができ
る。ＣＰＵ１５０５によって行われる演算の例として、フェッチ、デコード、実行および
ライトバックを挙げることができる。
令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１５１０等、メモリ場所におい
て記憶され得る。命令は、ＣＰＵ１５０５に向けることができ、これはその後、本開示の
方法を実施するようにＣＰＵ１５０５をプログラムまたは他の仕方で構成することができ
る。ＣＰＵ１５０５によって行われる演算の例として、フェッチ、デコード、実行および
ライトバックを挙げることができる。
【0267】
ＣＰＵ１５０５は、集積回路等、回路の一部となり得る。システム１５０１の１種また
は複数の他の構成成分は、回路に含まれていてよい。一部の事例において、回路は、特定
用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
は複数の他の構成成分は、回路に含まれていてよい。一部の事例において、回路は、特定
用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【0268】
記憶ユニット１５１５は、ドライバ、ライブラリーおよびセーブされたプログラム等、
ファイルを記憶することができる。記憶ユニット１５１５は、ユーザーデータ、例えば、
ユーザー選択およびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム
１５０１は、一部の事例において、イントラネットまたはインターネットを介してコンピ
ュータシステム１５０１と連絡した遠隔サーバーに位置する等、コンピュータシステム１
５０１に対し外部である、１個または複数の追加的なデータ記憶ユニットを含むことがで
きる。
ファイルを記憶することができる。記憶ユニット１５１５は、ユーザーデータ、例えば、
ユーザー選択およびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム
１５０１は、一部の事例において、イントラネットまたはインターネットを介してコンピ
ュータシステム１５０１と連絡した遠隔サーバーに位置する等、コンピュータシステム１
５０１に対し外部である、１個または複数の追加的なデータ記憶ユニットを含むことがで
きる。
【0269】
コンピュータシステム１５０１は、ネットワーク１５３０を介して１個または複数の遠
隔コンピュータシステムと連絡することができる。例えば、コンピュータシステム１５０
１は、ユーザー（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと連絡することが
できる。遠隔コンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポー
タブルＰＣ）、スレート（slate）もしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録
商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電
話、スマートフォン（Smart phone）（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（
登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応装置、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））またはパー
ソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１５３０を介して
コンピュータシステム１５０１にアクセスすることができる。
隔コンピュータシステムと連絡することができる。例えば、コンピュータシステム１５０
１は、ユーザー（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと連絡することが
できる。遠隔コンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポー
タブルＰＣ）、スレート（slate）もしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録
商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電
話、スマートフォン（Smart phone）（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（
登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応装置、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））またはパー
ソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１５３０を介して
コンピュータシステム１５０１にアクセスすることができる。
【0270】
本明細書に記載されている方法は、例えば、メモリ１５１０または電子記憶ユニット１
５１５等のコンピュータシステム１５０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コ
ンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能ま
たは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用の際に、コー
ドは、プロセッサ１５０５によって実行され得る。一部の事例において、コードは、記憶
ユニット１５１５から検索され、プロセッサ１５０５による即時アクセスのためにメモリ
１５１０に記憶され得る。一部の状況において、電子記憶ユニット１５１５が妨げられる
場合があり、機械実行可能命令は、メモリ１５１０に記憶される。
５１５等のコンピュータシステム１５０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コ
ンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能ま
たは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用の際に、コー
ドは、プロセッサ１５０５によって実行され得る。一部の事例において、コードは、記憶
ユニット１５１５から検索され、プロセッサ１５０５による即時アクセスのためにメモリ
１５１０に記憶され得る。一部の状況において、電子記憶ユニット１５１５が妨げられる
場合があり、機械実行可能命令は、メモリ１５１０に記憶される。
【0271】
コードは、コードの実行に適応されたプロセッサを有する機械による使用のために事前
にコンパイルおよび構成され得る、あるいはランタイムにおいてコンパイルされ得る。コ
ードは、事前にコンパイルされたまたはアズコンパイルされた（as-compiled）様式での
コードの実行を可能にするために選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
にコンパイルおよび構成され得る、あるいはランタイムにおいてコンパイルされ得る。コ
ードは、事前にコンパイルされたまたはアズコンパイルされた（as-compiled）様式での
コードの実行を可能にするために選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【0272】
コンピュータシステム１５０１等、本明細書に提供されているシステムおよび方法の態
様は、プログラミングにおいて具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的に
、ある種類の機械可読媒体において保有または具体化される機械（またはプロセッサ）実
行可能コードおよび／または関連するデータの形態の「産物」または「製造品」であると
考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ラ
ンダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等、電子記憶ユニット
に記憶され得る。「記憶」型の媒体は、ソフトウェアプログラミングのいずれかの時点で
非一過性記憶を提供できる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブそ
の他等、コンピュータ、プロセッサその他の有形的メモリ、またはその関連するモジュー
ルのいずれかまたは全てを含むことができる。ソフトウェアの全体または部分は、時に、
インターネットまたは様々な他の遠隔通信ネットワークを介して連絡することができる。
かかる連絡は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたは
プロセッサへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーション
サーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得
る。よって、ソフトウェアエレメントを有することができる別の種類の媒体は、ローカル
装置間の物理インターフェイスを通して使用される、有線および光固定電話回線ネットワ
ークを介する、ならびに様々なエアリンクを通す等、光、電気および電磁波を含む。有線
または無線リンク、光リンクその他等、かかる波を保有する物理的エレメントも、ソフト
ウェアを有する媒体として考慮することができる。本明細書において、非一過性、有形的
「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」等の用語は、実
行のためのプロセッサへの命令の提供に関与するいずれかの媒体を指す。
様は、プログラミングにおいて具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的に
、ある種類の機械可読媒体において保有または具体化される機械（またはプロセッサ）実
行可能コードおよび／または関連するデータの形態の「産物」または「製造品」であると
考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ラ
ンダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等、電子記憶ユニット
に記憶され得る。「記憶」型の媒体は、ソフトウェアプログラミングのいずれかの時点で
非一過性記憶を提供できる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブそ
の他等、コンピュータ、プロセッサその他の有形的メモリ、またはその関連するモジュー
ルのいずれかまたは全てを含むことができる。ソフトウェアの全体または部分は、時に、
インターネットまたは様々な他の遠隔通信ネットワークを介して連絡することができる。
かかる連絡は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたは
プロセッサへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーション
サーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得
る。よって、ソフトウェアエレメントを有することができる別の種類の媒体は、ローカル
装置間の物理インターフェイスを通して使用される、有線および光固定電話回線ネットワ
ークを介する、ならびに様々なエアリンクを通す等、光、電気および電磁波を含む。有線
または無線リンク、光リンクその他等、かかる波を保有する物理的エレメントも、ソフト
ウェアを有する媒体として考慮することができる。本明細書において、非一過性、有形的
「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」等の用語は、実
行のためのプロセッサへの命令の提供に関与するいずれかの媒体を指す。
【0273】
したがって、コンピュータ実行可能コード等、機械可読媒体は、有形的記憶媒体、搬送
波媒体または物理的伝送媒体等が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形態を採る
ことができる。不揮発性記憶媒体は、図面に示されている、データベース等の実施に使用
できる等、いずれかのコンピュータ（複数可）その他における記憶装置のいずれか等、例
えば、光または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、かかるコンピュータプラットフ
ォームのメインメモリ等、動的メモリを含む。有形的伝送媒体は、コンピュータシステム
内のバスを含むワイヤーを含む、同軸ケーブル；銅線および光ファイバーを含む。搬送波
伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナル、またはラジオ周波数（ＲＦ）および赤外線（Ｉ
Ｒ）データコミュニケーションにおいて生成されるもの等、音波もしくは光波の形態を採
ることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば：フロッ
ピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の
いずれかの磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、他のいずれかの光
媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンによる他のいずれかの物理的記憶媒体、ＲＡ
Ｍ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモ
リチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、かかる搬送波を
輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータが、プログラミングコードおよび
／またはデータを読み取ることができる他のいずれかの媒体を含む。コンピュータ可読媒
体のこれらの形態のうち多くは、実行のためのプロセッサへの１種または複数の命令の１
種または複数のシーケンスの保有に関与し得る。
波媒体または物理的伝送媒体等が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形態を採る
ことができる。不揮発性記憶媒体は、図面に示されている、データベース等の実施に使用
できる等、いずれかのコンピュータ（複数可）その他における記憶装置のいずれか等、例
えば、光または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、かかるコンピュータプラットフ
ォームのメインメモリ等、動的メモリを含む。有形的伝送媒体は、コンピュータシステム
内のバスを含むワイヤーを含む、同軸ケーブル；銅線および光ファイバーを含む。搬送波
伝送媒体は、電気もしくは電磁シグナル、またはラジオ周波数（ＲＦ）および赤外線（Ｉ
Ｒ）データコミュニケーションにおいて生成されるもの等、音波もしくは光波の形態を採
ることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば：フロッ
ピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の
いずれかの磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、他のいずれかの光
媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンによる他のいずれかの物理的記憶媒体、ＲＡ
Ｍ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモ
リチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、かかる搬送波を
輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータが、プログラミングコードおよび
／またはデータを読み取ることができる他のいずれかの媒体を含む。コンピュータ可読媒
体のこれらの形態のうち多くは、実行のためのプロセッサへの１種または複数の命令の１
種または複数のシーケンスの保有に関与し得る。
【0274】
コンピュータシステム１５０１は、ユーザーインターフェイス（ＵＩ）１５４０を含む
電子表示１５３５を含む、またはこれと連絡することができる。ＵＩは、ユーザーに、本
明細書に記載されている方法のための様々な条件、例えば、ＰＣＲまたは配列決定条件を
設定させることができる。ＵＩの例として、グラフィカルユーザーインターフェイス（Ｇ
ＵＩ）およびウェブに基づくユーザーインターフェイスを限定することなく挙げられる。
電子表示１５３５を含む、またはこれと連絡することができる。ＵＩは、ユーザーに、本
明細書に記載されている方法のための様々な条件、例えば、ＰＣＲまたは配列決定条件を
設定させることができる。ＵＩの例として、グラフィカルユーザーインターフェイス（Ｇ
ＵＩ）およびウェブに基づくユーザーインターフェイスを限定することなく挙げられる。
【0275】
本開示の方法およびシステムは、１種または複数のアルゴリズムによって実施すること
ができる。アルゴリズムは、中央処理装置１５０５による実行により、ソフトウェアによ
って実施することができる。アルゴリズムは、例えば、リードを処理して、結果的に配列
を生成することができる。
ができる。アルゴリズムは、中央処理装置１５０５による実行により、ソフトウェアによ
って実施することができる。アルゴリズムは、例えば、リードを処理して、結果的に配列
を生成することができる。
【0276】
図７は、対象由来の核酸を含む試料を解析するための別のシステムを模式的に図解する
。本システムは、シーケンサーと、バイオインフォマティクスソフトウェアと、例えば、
ハンドヘルド装置またはデスクトップコンピュータによる報告解析のためのインターネッ
ト接続とを含む。
。本システムは、シーケンサーと、バイオインフォマティクスソフトウェアと、例えば、
ハンドヘルド装置またはデスクトップコンピュータによる報告解析のためのインターネッ
ト接続とを含む。
【0277】
対象の標的核酸分子を解析するためのシステムであって、標的ゲノムのゲノム遺伝子座
を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リードを受け取る通信インターフェイ
スと、通信インターフェイスによって受け取られた複数のポリヌクレオチド分子の核酸配
列リードを記憶するコンピュータメモリと、通信インターフェイスおよびメモリに作動可
能にカップリングされ、（ｉ）複数の配列リードを、各ファミリーが、鋳型ポリヌクレオ
チドのうち１種に由来する配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉｉ）ファミリ
ーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、（ｉｉｉ）ゲ
ノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコールし、（ｉｖ
）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、コールの中の遺伝子
変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出するようにプ
ログラムされたコンピュータプロセッサとを含み、ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、
ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯ
ＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢ
Ｌ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２
、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、
ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、Ｍ
ＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ
４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、Ｃ
ＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５
３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ
２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およ
びＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に対応するシステムが本明細書に開
示されている。本システムの各構成成分の異なるバリエーションは、方法および組成物内
の開示を通して記載されている。これらの個々の構成成分およびそのバリエーションも、
本システムにおいて適用できる。
を網羅する複数のポリヌクレオチド分子の核酸配列リードを受け取る通信インターフェイ
スと、通信インターフェイスによって受け取られた複数のポリヌクレオチド分子の核酸配
列リードを記憶するコンピュータメモリと、通信インターフェイスおよびメモリに作動可
能にカップリングされ、（ｉ）複数の配列リードを、各ファミリーが、鋳型ポリヌクレオ
チドのうち１種に由来する配列リードを含むファミリーへと群分けし、（ｉｉ）ファミリ
ーのそれぞれに対し、配列リードを統合して、コンセンサス配列を生成し、（ｉｉｉ）ゲ
ノム遺伝子座の中の所与のゲノム遺伝子座においてコンセンサス配列をコールし、（ｉｖ
）所与のゲノム遺伝子座において、コールの中の遺伝的バリアント、コールの中の遺伝子
変更の頻度、コールの総数およびコールの中の変更の総数のいずれかを検出するようにプ
ログラムされたコンピュータプロセッサとを含み、ゲノム遺伝子座が、ＡＬＫ、ＡＰＣ、
ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯ
ＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢ
Ｌ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２
、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、
ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、Ｍ
ＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ
４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、Ｃ
ＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５
３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ
２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およ
びＮＴＲＫ１からなる群から選択される複数の遺伝子に対応するシステムが本明細書に開
示されている。本システムの各構成成分の異なるバリエーションは、方法および組成物内
の開示を通して記載されている。これらの個々の構成成分およびそのバリエーションも、
本システムにおいて適用できる。
【0278】
４．キット
【0279】
本明細書に記載されている組成物を含むキット。キットは、本明細書に記載されている
方法の実施において有用となり得る。ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦ
Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３Ｃ
Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ
１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧ
ＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１
、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤ
ＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、Ｓ
ＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１
、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、
ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、Ａ
ＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択
される少なくとも（least）５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０種または全遺
伝子に選択的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットが本
明細書に開示されている。オリゴヌクレオチドプローブが選択的にハイブリダイズできる
遺伝子の数は、変動し得る。例えば、遺伝子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、
３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４
９、５０、５１、５２、５３または５４を含むことができる。キットは、複数のオリゴヌ
クレオチドプローブを含む容器と、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うため
の説明書とを含むことができる。
方法の実施において有用となり得る。ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦ
Ｒ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３Ｃ
Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ
１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧ
ＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１
、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤ
ＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、Ｓ
ＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１
、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、
ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、Ａ
ＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫ１からなる群から選択
される少なくとも（least）５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０種または全遺
伝子に選択的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットが本
明細書に開示されている。オリゴヌクレオチドプローブが選択的にハイブリダイズできる
遺伝子の数は、変動し得る。例えば、遺伝子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２
、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、
３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４
９、５０、５１、５２、５３または５４を含むことができる。キットは、複数のオリゴヌ
クレオチドプローブを含む容器と、本明細書に記載されている方法のいずれかを行うため
の説明書とを含むことができる。
【0280】
オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子、例えば、少なくとも５種の遺伝子のエクソン
領域に選択的にハイブリダイズすることができる。一部の事例において、オリゴヌクレオ
チドプローブは、遺伝子、例えば、少なくとも５種の遺伝子の少なくとも３０種のエクソ
ンに選択的にハイブリダイズすることができる。一部の事例において、複数のプローブは
、少なくとも３０種のエクソンのそれぞれに選択的にハイブリダイズすることができる。
各エクソンにハイブリダイズするプローブは、少なくとも１種の他のプローブと重複する
配列を有することができる。一部の実施形態において、オリゴプローブは、本明細書に開
示されている遺伝子の非コード領域、例えば、遺伝子のイントロン領域に選択的にハイブ
リダイズすることができる。オリゴプローブは、本明細書に開示されている遺伝子のエク
ソンおよびイントロン領域の両方を含む遺伝子の領域に選択的にハイブリダイズすること
もできる。
領域に選択的にハイブリダイズすることができる。一部の事例において、オリゴヌクレオ
チドプローブは、遺伝子、例えば、少なくとも５種の遺伝子の少なくとも３０種のエクソ
ンに選択的にハイブリダイズすることができる。一部の事例において、複数のプローブは
、少なくとも３０種のエクソンのそれぞれに選択的にハイブリダイズすることができる。
各エクソンにハイブリダイズするプローブは、少なくとも１種の他のプローブと重複する
配列を有することができる。一部の実施形態において、オリゴプローブは、本明細書に開
示されている遺伝子の非コード領域、例えば、遺伝子のイントロン領域に選択的にハイブ
リダイズすることができる。オリゴプローブは、本明細書に開示されている遺伝子のエク
ソンおよびイントロン領域の両方を含む遺伝子の領域に選択的にハイブリダイズすること
もできる。
【0281】
オリゴヌクレオチドプローブによっていずれかの数のエクソンを標的とすることができ
る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、
３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１
００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１
５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２
００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２
５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３
００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００種またはそれを超
えるエクソンを標的とすることができる。
る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、
３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１
００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１
５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２
００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２
５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３
００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００種またはそれを超
えるエクソンを標的とすることができる。
【0282】
キットは、別個の分子バーコードおよび同一の試料バーコードを有する、少なくとも４
、５、６、７または８種の異なるライブラリーアダプタを含むことができる。ライブラリ
ーアダプタは、配列決定アダプタであるでなくてもよい。例えば、ライブラリーアダプタ
は、フローセル配列または配列決定のためのヘアピンループの形成を可能にする配列を含
まない。分子バーコードおよび試料バーコードの異なるバリエーションおよび組合せは、
本願を通して記載されており、キットに適用できる。さらに、一部の事例において、アダ
プタは、配列決定アダプタではない。その上、キットにより提供されるアダプタは、配列
決定アダプタを含むこともできる。配列決定アダプタは、１種または複数の配列決定プラ
イマーにハイブリダイズする配列を含むことができる。配列決定アダプタは、固体支持体
にハイブリダイズする配列、例えば、フローセル配列をさらに含むことができる。例えば
、配列決定アダプタは、フローセルアダプタとなり得る。配列決定アダプタは、ポリヌク
レオチド断片の一端または両端に取り付けることができる。一部の事例において、キット
は、別個の分子バーコードおよび同一の試料バーコードを有する、少なくとも８種の異な
るライブラリーアダプタを含むことができる。ライブラリーアダプタは、配列決定アダプ
タであるでなくてもよい。キットは、ライブラリーアダプタに選択的にハイブリダイズす
る第１の配列およびフローセル配列に選択的にハイブリダイズする第２の配列を有する配
列決定アダプタをさらに含むことができる。別の例において、配列決定アダプタは、ヘア
ピン形となり得る。例えば、ヘアピン形アダプタは、相補的二本鎖部分およびループ部分
を含むことができ、二本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに取り付ける（例えば、ライ
ゲーションする）ことができる。ヘアピン形配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片
の両端に取り付けて、複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる
。配列決定アダプタは、末端から末端まで最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５
６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９
、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、
８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８、９９、１００個またはそれを超える塩基となり得る。配列決定アダプタ
は、末端から末端まで２０～３０、２０～４０、３０～５０、３０～６０、４０～６０、
４０～７０、５０～６０、５０～７０塩基を含むことができる。特定の例において、配列
決定アダプタは、末端から末端まで２０～３０塩基を含むことができる。別の例において
、配列決定アダプタは、末端から末端まで５０～６０塩基を含むことができる。配列決定
アダプタは、１種または複数のバーコードを含むことができる。例えば、配列決定アダプ
タは、試料バーコードを含むことができる。試料バーコードは、既定の配列を含むことが
できる。試料バーコードを使用して、ポリヌクレオチドの供給源を同定することができる
。試料バーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
個またはそれを超える（または本願を通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基
、例えば、少なくとも８塩基となり得る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接
配列となり得る。
、５、６、７または８種の異なるライブラリーアダプタを含むことができる。ライブラリ
ーアダプタは、配列決定アダプタであるでなくてもよい。例えば、ライブラリーアダプタ
は、フローセル配列または配列決定のためのヘアピンループの形成を可能にする配列を含
まない。分子バーコードおよび試料バーコードの異なるバリエーションおよび組合せは、
本願を通して記載されており、キットに適用できる。さらに、一部の事例において、アダ
プタは、配列決定アダプタではない。その上、キットにより提供されるアダプタは、配列
決定アダプタを含むこともできる。配列決定アダプタは、１種または複数の配列決定プラ
イマーにハイブリダイズする配列を含むことができる。配列決定アダプタは、固体支持体
にハイブリダイズする配列、例えば、フローセル配列をさらに含むことができる。例えば
、配列決定アダプタは、フローセルアダプタとなり得る。配列決定アダプタは、ポリヌク
レオチド断片の一端または両端に取り付けることができる。一部の事例において、キット
は、別個の分子バーコードおよび同一の試料バーコードを有する、少なくとも８種の異な
るライブラリーアダプタを含むことができる。ライブラリーアダプタは、配列決定アダプ
タであるでなくてもよい。キットは、ライブラリーアダプタに選択的にハイブリダイズす
る第１の配列およびフローセル配列に選択的にハイブリダイズする第２の配列を有する配
列決定アダプタをさらに含むことができる。別の例において、配列決定アダプタは、ヘア
ピン形となり得る。例えば、ヘアピン形アダプタは、相補的二本鎖部分およびループ部分
を含むことができ、二本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに取り付ける（例えば、ライ
ゲーションする）ことができる。ヘアピン形配列決定アダプタは、ポリヌクレオチド断片
の両端に取り付けて、複数回配列決定することができる環状分子を生成することができる
。配列決定アダプタは、末端から末端まで最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１
６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、
４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５
６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９
、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、
８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９
６、９７、９８、９９、１００個またはそれを超える塩基となり得る。配列決定アダプタ
は、末端から末端まで２０～３０、２０～４０、３０～５０、３０～６０、４０～６０、
４０～７０、５０～６０、５０～７０塩基を含むことができる。特定の例において、配列
決定アダプタは、末端から末端まで２０～３０塩基を含むことができる。別の例において
、配列決定アダプタは、末端から末端まで５０～６０塩基を含むことができる。配列決定
アダプタは、１種または複数のバーコードを含むことができる。例えば、配列決定アダプ
タは、試料バーコードを含むことができる。試料バーコードは、既定の配列を含むことが
できる。試料バーコードを使用して、ポリヌクレオチドの供給源を同定することができる
。試料バーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１
２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５
個またはそれを超える（または本願を通して記載されているいずれかの長さの）核酸塩基
、例えば、少なくとも８塩基となり得る。バーコードは、上述の通り、近接または非近接
配列となり得る。
【0283】
ライブラリーアダプタは、平滑末端およびＹ字形となることができ、４０核酸塩基未満
またはそれに等しい長さとなり得る。他のバリエーションは、本願を通して見出すことが
でき、キットに適用できる。
またはそれに等しい長さとなり得る。他のバリエーションは、本願を通して見出すことが
でき、キットに適用できる。
【実施例】
【0284】
（実施例１）
コピー数バリエーション検出のための方法
コピー数バリエーション検出のための方法
【0285】
採血
【0286】
１０～３０ｍＬ血液試料を室温で収集する。試料を遠心分離して、細胞を除去する。遠
心分離後に血漿を収集する。
心分離後に血漿を収集する。
【0287】
ｃｆＤＮＡ抽出
【0288】
試料をプロテイナーゼＫ消化に供する。イソプロパノールでＤＮＡを沈殿させる。ＤＮ
Ａ精製カラム（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）におい
てＤＮＡを捕捉し、１００μｌ溶液中に溶出させる。Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩ磁気ビーズ
捕捉（ＰＥＧ／塩）により、５００ｂｐを下回るＤＮＡを選択する。その結果得られた生
産物を３０μｌ Ｈ２Ｏに懸濁する。サイズ分布をチェックし（主ピーク＝１６６ヌクレ
オチド；小ピーク＝３３０ヌクレオチド）、定量化する。５ｎｇの抽出されたＤＮＡは、
およそ１７００一倍体ゲノム当量（「ＨＧＥ」）を含有する。ＤＮＡの量およびＨＧＥの
間の一般的相関を次に示す：３ｐｇ ＤＮＡ＝１ ＨＧＥ；３ｎｇ ＤＮＡ＝１Ｋ ＨＧ
Ｅ；３μｇ ＤＮＡ＝１Ｍ ＨＧＥ；１０ｐｇ ＤＮＡ＝３ ＨＥ；１０ｎｇ ＤＮＡ＝
３Ｋ ＨＧＥ；１０μｇ ＤＮＡ＝３Ｍ ＨＧＥ。
Ａ精製カラム（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）におい
てＤＮＡを捕捉し、１００μｌ溶液中に溶出させる。Ａｍｐｕｒｅ ＳＰＲＩ磁気ビーズ
捕捉（ＰＥＧ／塩）により、５００ｂｐを下回るＤＮＡを選択する。その結果得られた生
産物を３０μｌ Ｈ２Ｏに懸濁する。サイズ分布をチェックし（主ピーク＝１６６ヌクレ
オチド；小ピーク＝３３０ヌクレオチド）、定量化する。５ｎｇの抽出されたＤＮＡは、
およそ１７００一倍体ゲノム当量（「ＨＧＥ」）を含有する。ＤＮＡの量およびＨＧＥの
間の一般的相関を次に示す：３ｐｇ ＤＮＡ＝１ ＨＧＥ；３ｎｇ ＤＮＡ＝１Ｋ ＨＧ
Ｅ；３μｇ ＤＮＡ＝１Ｍ ＨＧＥ；１０ｐｇ ＤＮＡ＝３ ＨＥ；１０ｎｇ ＤＮＡ＝
３Ｋ ＨＧＥ；１０μｇ ＤＮＡ＝３Ｍ ＨＧＥ。
【0289】
「単一分子」ライブラリープレップ
【0290】
平滑末端修復およびオーバーロードされたヘアピンアダプタを有する８種の異なる八量
体（octomer）（すなわち、６４通りの組合せ）とのライゲーションにより、高効率ＤＮ
Ａタグ付け（＞８０％）を行う。２．５ｎｇ ＤＮＡ（すなわち、およそ８００ ＨＧＥ
）を出発材料として使用する。各ヘアピンアダプタは、その非相補的部分にランダム配列
を含む。各ＤＮＡ断片の両端に、ヘアピンアダプタを取り付ける。各タグ付けされた断片
は、ヘアピンアダプタにおけるランダム配列および断片における１０ｐ内在性配列によっ
て同定することができる。
体（octomer）（すなわち、６４通りの組合せ）とのライゲーションにより、高効率ＤＮ
Ａタグ付け（＞８０％）を行う。２．５ｎｇ ＤＮＡ（すなわち、およそ８００ ＨＧＥ
）を出発材料として使用する。各ヘアピンアダプタは、その非相補的部分にランダム配列
を含む。各ＤＮＡ断片の両端に、ヘアピンアダプタを取り付ける。各タグ付けされた断片
は、ヘアピンアダプタにおけるランダム配列および断片における１０ｐ内在性配列によっ
て同定することができる。
【0291】
タグ付けされたＤＮＡを１０サイクルのＰＣＲによって増幅して、出発材料における８
００ ＨＧＥのそれぞれのおよそ５００コピーを含有する約１～７μｇ ＤＮＡを産生す
る。
００ ＨＧＥのそれぞれのおよそ５００コピーを含有する約１～７μｇ ＤＮＡを産生す
る。
【0292】
バッファー最適化、ポリメラーゼ最適化およびサイクル低下を行って、ＰＣＲ反応を最
適化することができる。増幅バイアス、例えば、非特異的バイアス、ＧＣバイアスおよび
／またはサイズバイアスも最適化によって低下される。ノイズ（複数可）（例えば、ポリ
メラーゼ導入のエラー）は、高忠実度ポリメラーゼを使用することにより低下される。
適化することができる。増幅バイアス、例えば、非特異的バイアス、ＧＣバイアスおよび
／またはサイズバイアスも最適化によって低下される。ノイズ（複数可）（例えば、ポリ
メラーゼ導入のエラー）は、高忠実度ポリメラーゼを使用することにより低下される。
【0293】
ライブラリーは、ＶｅｒｎｉａｔａまたはＳｅｑｕｅｎｏｍ方法を使用して調製するこ
とができる。
とができる。
【0294】
配列を次の通りに濃縮することができる：目的の領域（ＲＯＩ）を有するＤＮＡは、Ｒ
ＯＩに対するプローブによるビオチン標識ビーズを使用して捕捉する。１２サイクルのＰ
ＣＲによりＲＯＩを増幅して、２０００倍増幅を生成する。次に、その結果得られたＤＮ
Ａを変性させ、８ｐＭとなるよう希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードする。
ＯＩに対するプローブによるビオチン標識ビーズを使用して捕捉する。１２サイクルのＰ
ＣＲによりＲＯＩを増幅して、２０００倍増幅を生成する。次に、その結果得られたＤＮ
Ａを変性させ、８ｐＭとなるよう希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにロードする。
【0295】
大規模並列配列決定
【0296】
試料の０．１～１％（およそ１００ｐｇ）を配列決定のために使用する。
【0297】
デジタルバイオインフォマティクス
【0298】
配列リードを、各ファミリーが約１０種の配列リードを有するファミリーへと群分けす
る。ファミリーにおける各位置の投票（例えば、偏った投票）により、ファミリーをコン
センサス配列へと崩壊させる。８または９メンバーが一致する場合、塩基をコンセンサス
配列に対しコールする。メンバーの６０％以下が一致する場合、塩基をコンセンサス配列
に対しコールしない。
る。ファミリーにおける各位置の投票（例えば、偏った投票）により、ファミリーをコン
センサス配列へと崩壊させる。８または９メンバーが一致する場合、塩基をコンセンサス
配列に対しコールする。メンバーの６０％以下が一致する場合、塩基をコンセンサス配列
に対しコールしない。
【0299】
その結果得られたコンセンサス配列を参照ゲノムにマッピングする。コンセンサス配列
における各塩基は、約３０００種の異なるファミリーによって網羅される。配列毎の品質
スコアを計算し、それらの品質スコアに基づき配列にフィルターをかける。
における各塩基は、約３０００種の異なるファミリーによって網羅される。配列毎の品質
スコアを計算し、それらの品質スコアに基づき配列にフィルターをかける。
【0300】
各遺伝子座における塩基の分布を計数することにより、配列バリエーションを検出する
。リードの９８％が同じ塩基を有し（ホモ接合性）、２％が異なる塩基を有する場合、遺
伝子座は、おそらくがんＤＮＡ由来の配列バリアントを有する可能性がある。
。リードの９８％が同じ塩基を有し（ホモ接合性）、２％が異なる塩基を有する場合、遺
伝子座は、おそらくがんＤＮＡ由来の配列バリアントを有する可能性がある。
【0301】
遺伝子座にマッピングする配列（塩基）の総数を計数し、対照遺伝子座と比較すること
により、ＣＮＶを検出する。ＣＮＶ検出を増加させるために、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ
、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１
、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、Ａ
ＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦ
Ｒ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１
Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、
ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭ
ＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、
ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲ
ＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、
ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡまたはＮＴＲＫ
１遺伝子における領域を含む、特異的な領域においてＣＮＶ解析を行う。
により、ＣＮＶを検出する。ＣＮＶ検出を増加させるために、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ
、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１
、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、Ａ
ＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦ
Ｒ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１
Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、
ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭ
ＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、
ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲ
ＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、
ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡまたはＮＴＲＫ
１遺伝子における領域を含む、特異的な領域においてＣＮＶ解析を行う。
【0302】
（実施例２）
試料における未観測分子の総数を決定することにより塩基コーリングを補正するための方
法
試料における未観測分子の総数を決定することにより塩基コーリングを補正するための方
法
【0303】
断片を増幅し、増幅された断片の配列を読み取り整列した後に、断片を塩基コーリング
に供する。増幅された断片および未観測の増幅された断片の数におけるバリエーションは
、塩基コーリングにエラーを導入し得る。このようなバリエーションは、未観測の増幅さ
れた断片の数を計算することにより補正される。
に供する。増幅された断片および未観測の増幅された断片の数におけるバリエーションは
、塩基コーリングにエラーを導入し得る。このようなバリエーションは、未観測の増幅さ
れた断片の数を計算することにより補正される。
【0304】
遺伝子座Ａ（任意の遺伝子座）の塩基コーリングの場合、Ｎ個の増幅された断片が存在
することが先ず想定される。配列リードアウトは、２種類の断片に由来し得る：二本鎖断
片および一本鎖断片。次に、試料における未観測分子の総数計算の理論上の例を示す。
することが先ず想定される。配列リードアウトは、２種類の断片に由来し得る：二本鎖断
片および一本鎖断片。次に、試料における未観測分子の総数計算の理論上の例を示す。
【0305】
Ｎは、試料における分子の総数である。
１０００が、検出された二重鎖の数であると想定する。
５００が、検出された一本鎖分子の数であると想定する。
Ｐは、鎖を観測する確率である。
Ｑは、鎖を検出しない確率である。
１０００が、検出された二重鎖の数であると想定する。
５００が、検出された一本鎖分子の数であると想定する。
Ｐは、鎖を観測する確率である。
Ｑは、鎖を検出しない確率である。
【0306】
Ｑ＝１－Ｐであるため、
１０００＝ＮＰ（２）
５００＝Ｎ２ＰＱ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
５００÷２ＰＱ＝Ｎ
１０００／Ｐ（２）＝５００÷２ＰＱ
１０００＊２ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００Ｑ＝５００Ｐ
２０００（１－Ｐ）＝５００Ｐ
２０００－２０００Ｐ＝５００Ｐ
２０００＝５００Ｐ＋２０００Ｐ
２０００＝２５００Ｐ
２０００÷２５００＝Ｐ
０．８＝Ｐ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
１０００÷０．６４＝Ｎ
１５６２＝Ｎ
未観測断片の数＝６２。
１０００＝ＮＰ（２）
５００＝Ｎ２ＰＱ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
５００÷２ＰＱ＝Ｎ
１０００／Ｐ（２）＝５００÷２ＰＱ
１０００＊２ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００ＰＱ＝５００Ｐ（２）
２０００Ｑ＝５００Ｐ
２０００（１－Ｐ）＝５００Ｐ
２０００－２０００Ｐ＝５００Ｐ
２０００＝５００Ｐ＋２０００Ｐ
２０００＝２５００Ｐ
２０００÷２５００＝Ｐ
０．８＝Ｐ
１０００／Ｐ（２）＝Ｎ
１０００÷０．６４＝Ｎ
１５６２＝Ｎ
未観測断片の数＝６２。
【0307】
（実施例３）
患者におけるがん関連体細胞バリアントにおける遺伝的バリアントの同定
患者におけるがん関連体細胞バリアントにおける遺伝的バリアントの同定
【0308】
アッセイを使用して遺伝子のパネルを解析して、高感度でがん関連体細胞バリアントに
おける遺伝的バリアントを同定する。
おける遺伝的バリアントを同定する。
【0309】
患者の血漿から無細胞ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによって増幅する。増幅された標的遺伝
子の大規模並列配列決定により、遺伝的バリアントを解析する。ある１セットの遺伝子に
対し、全エクソンを配列決定するが、これは、かかる配列決定被覆が、臨床的有用性を有
することを示したためである（表１）。別のセットの遺伝子に対し、配列決定被覆は、以
前に報告された体細胞突然変異を有するエクソンを含んだ（表２）。最小検出可能突然変
異体アレル（検出限界）は、患者試料の無細胞ＤＮＡ濃度に依存し、これは、末梢血１ｍ
Ｌ当たり１０未満から１，０００超のゲノム当量へと変動した。より少量の無細胞ＤＮＡ
および／または低レベル遺伝子コピー増幅では、増幅は、試料において検出されない場合
がある。低い試料品質または不適切な収集等、ある特定の試料またはバリアント特徴は、
分析感度低下をもたらした。
子の大規模並列配列決定により、遺伝的バリアントを解析する。ある１セットの遺伝子に
対し、全エクソンを配列決定するが、これは、かかる配列決定被覆が、臨床的有用性を有
することを示したためである（表１）。別のセットの遺伝子に対し、配列決定被覆は、以
前に報告された体細胞突然変異を有するエクソンを含んだ（表２）。最小検出可能突然変
異体アレル（検出限界）は、患者試料の無細胞ＤＮＡ濃度に依存し、これは、末梢血１ｍ
Ｌ当たり１０未満から１，０００超のゲノム当量へと変動した。より少量の無細胞ＤＮＡ
および／または低レベル遺伝子コピー増幅では、増幅は、試料において検出されない場合
がある。低い試料品質または不適切な収集等、ある特定の試料またはバリアント特徴は、
分析感度低下をもたらした。
【0310】
血液中を循環する無細胞ＤＮＡにおいて見出される遺伝的バリアントのパーセンテージ
は、この患者の特有の腫瘍生物学に関連する。血液中の循環無細胞ＤＮＡにおいて検出さ
れる遺伝的バリアントの量／パーセンテージに影響した要因は、腫瘍成長、ターンオーバ
ー、サイズ、異種性、血管新生、疾患進行または処置を含む。表３は、この患者において
検出される変更された循環無細胞ＤＮＡのパーセンテージまたはアレル頻度（％ｃｆＤＮ
Ａ）をアノテートする。検出された遺伝的バリアントの一部を％ｃｆＤＮＡにより降順で
収載する。
は、この患者の特有の腫瘍生物学に関連する。血液中の循環無細胞ＤＮＡにおいて検出さ
れる遺伝的バリアントの量／パーセンテージに影響した要因は、腫瘍成長、ターンオーバ
ー、サイズ、異種性、血管新生、疾患進行または処置を含む。表３は、この患者において
検出される変更された循環無細胞ＤＮＡのパーセンテージまたはアレル頻度（％ｃｆＤＮ
Ａ）をアノテートする。検出された遺伝的バリアントの一部を％ｃｆＤＮＡにより降順で
収載する。
【0311】
遺伝的バリアントは、この患者の血液検体から単離された循環無細胞ＤＮＡにおいて検
出される。これらの遺伝的バリアントは、がん関連体細胞バリアントであり、その一部は
、特異的な処置に対する臨床応答の増加または低下のいずれかに関連付けられてきた。「
軽微な変更」は、「大幅な変更」のアレル頻度の１０％未満において検出される変更とし
て定義される。これらの変更の検出されたアレル頻度（表３）およびこの患者のための関
連する処置をアノテートする。
出される。これらの遺伝的バリアントは、がん関連体細胞バリアントであり、その一部は
、特異的な処置に対する臨床応答の増加または低下のいずれかに関連付けられてきた。「
軽微な変更」は、「大幅な変更」のアレル頻度の１０％未満において検出される変更とし
て定義される。これらの変更の検出されたアレル頻度（表３）およびこの患者のための関
連する処置をアノテートする。
【0312】
表１および２に収載されているあらゆる遺伝子は、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（商標）検
査の一部として解析する。この患者の血液検体から単離された循環無細胞ＤＮＡにおいて
、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲまたはＭＥＴの増幅は検出されない。
査の一部として解析する。この患者の血液検体から単離された循環無細胞ＤＮＡにおいて
、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲまたはＭＥＴの増幅は検出されない。
【0313】
遺伝的バリアントを含む患者検査結果を表４に収載する。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0314】
（実施例４）
Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（商標）アッセイによって解析される遺伝子の患者特異的検出限
界の決定
Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０（商標）アッセイによって解析される遺伝子の患者特異的検出限
界の決定
【0315】
実施例３の方法を使用して、患者の無細胞ＤＮＡにおける遺伝子変更を検出する。これ
らの遺伝子の配列リードは、エクソンおよび／またはイントロン配列を含む。
らの遺伝子の配列リードは、エクソンおよび／またはイントロン配列を含む。
【0316】
検査の検出限界を表５に示す。検出限界値は、無細胞ＤＮＡ濃度および遺伝子毎の配列
決定被覆に依存する。
決定被覆に依存する。
【表5】
【0317】
（実施例５）
ワトソンおよびクリック配列を比較した配列エラーの補正
ワトソンおよびクリック配列を比較した配列エラーの補正
【0318】
患者の血漿から二本鎖無細胞ＤＮＡを単離する。特有のバーコードをそれぞれ含む１６
種の異なるバブル含有アダプタを使用して、無細胞ＤＮＡ断片にタグ付けする。ライゲー
ションにより、各無細胞ＤＮＡ断片の両端にバブル含有アダプタを取り付ける。ライゲー
ション後に、無細胞ＤＮＡ断片のそれぞれは、別個のバーコードの配列および無細胞ＤＮ
Ａ断片の各末端における２個の２０ｂｐ内在性配列により別個に同定することができる。
種の異なるバブル含有アダプタを使用して、無細胞ＤＮＡ断片にタグ付けする。ライゲー
ションにより、各無細胞ＤＮＡ断片の両端にバブル含有アダプタを取り付ける。ライゲー
ション後に、無細胞ＤＮＡ断片のそれぞれは、別個のバーコードの配列および無細胞ＤＮ
Ａ断片の各末端における２個の２０ｂｐ内在性配列により別個に同定することができる。
【0319】
タグ付けされた無細胞ＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅する。がん関連遺伝子の群に特異
的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを含むビーズを使用して、増幅された断片を濃
縮する。したがって、がん関連遺伝子の群由来の無細胞ＤＮＡ断片が、選択的に濃縮され
る。
的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを含むビーズを使用して、増幅された断片を濃
縮する。したがって、がん関連遺伝子の群由来の無細胞ＤＮＡ断片が、選択的に濃縮され
る。
【0320】
配列決定プライマー結合部位、試料バーコードおよびフローセル（cell-flow）配列を
それぞれ含む配列決定アダプタを、濃縮されたＤＮＡ分子に取り付ける。その結果得られ
た分子をＰＣＲによって増幅する。
それぞれ含む配列決定アダプタを、濃縮されたＤＮＡ分子に取り付ける。その結果得られ
た分子をＰＣＲによって増幅する。
【0321】
増幅された断片の両方の鎖を配列決定する。各バブル含有アダプタは、非相補的部分（
例えば、バブル）を含むため、バブル含有アダプタの一方の鎖の配列は、他方の鎖（相補
体）の配列とは異なる。したがって、本来の無細胞ＤＮＡのワトソン鎖に由来するアンプ
リコンの配列リードは、取り付けられたバブル含有アダプタ配列によって、本来の無細胞
ＤＮＡのクリック鎖由来のアンプリコンから識別することができる。
例えば、バブル）を含むため、バブル含有アダプタの一方の鎖の配列は、他方の鎖（相補
体）の配列とは異なる。したがって、本来の無細胞ＤＮＡのワトソン鎖に由来するアンプ
リコンの配列リードは、取り付けられたバブル含有アダプタ配列によって、本来の無細胞
ＤＮＡのクリック鎖由来のアンプリコンから識別することができる。
【0322】
本来の無細胞ＤＮＡ断片の鎖由来の配列リードを、本来の無細胞ＤＮＡ断片の他方の鎖
由来の配列リードと比較する。バリアントが、本来の無細胞ＤＮＡ断片の一方の鎖由来の
配列リードのみに生じるが、他方の鎖には生じない場合、このバリアントは、真の遺伝的
バリアントではなくエラー（例えば、ＰＣＲおよび／または増幅に起因する）として同定
されるであろう。
由来の配列リードと比較する。バリアントが、本来の無細胞ＤＮＡ断片の一方の鎖由来の
配列リードのみに生じるが、他方の鎖には生じない場合、このバリアントは、真の遺伝的
バリアントではなくエラー（例えば、ＰＣＲおよび／または増幅に起因する）として同定
されるであろう。
【0323】
配列リードをファミリーへと群分けする。配列リードにおけるエラーを補正する。各フ
ァミリーのコンセンサス配列を崩壊により生成する。
ァミリーのコンセンサス配列を崩壊により生成する。
【0324】
本発明の好まれる実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、かかる実施形態が単な
る一例として提示されていることは、当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内
に提示されている具体例によって限定されることは意図されていない。上述の明細書を参
照しつつ本発明を記載してきたが、本明細書における実施形態の記載および図解は、限定
的な意味で解釈されることを意味しない。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱する
ことなく、多数のバリエーション、変化および置換を思い付くことができよう。さらに、
本発明のあらゆる態様が、種々の条件および変数に依存する本明細書に表記されている特
異的な描写、構成または相対的比率に限定されないことが理解できよう。本明細書に記載
されている本発明の実施形態の様々な代替を本発明の実施において用いてよいことを理解
されたい。したがって、本発明が、いかなるかかる代替、修正、バリエーションまたは均
等も網羅することが企図される。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義すること、
また、特許請求の範囲およびその均等の範囲内の方法および構造が、これにより網羅され
ることが意図される。
る一例として提示されていることは、当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内
に提示されている具体例によって限定されることは意図されていない。上述の明細書を参
照しつつ本発明を記載してきたが、本明細書における実施形態の記載および図解は、限定
的な意味で解釈されることを意味しない。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱する
ことなく、多数のバリエーション、変化および置換を思い付くことができよう。さらに、
本発明のあらゆる態様が、種々の条件および変数に依存する本明細書に表記されている特
異的な描写、構成または相対的比率に限定されないことが理解できよう。本明細書に記載
されている本発明の実施形態の様々な代替を本発明の実施において用いてよいことを理解
されたい。したがって、本発明が、いかなるかかる代替、修正、バリエーションまたは均
等も網羅することが企図される。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義すること、
また、特許請求の範囲およびその均等の範囲内の方法および構造が、これにより網羅され
ることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
