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特許7243005Ｎｋｘ３．２及びその断片を有効成分として含む網膜疾患治療用の医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-13
(45)【発行日】2023-03-22
(54)【発明の名称】Ｎｋｘ３．２及びその断片を有効成分として含む網膜疾患治療用の医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20230314BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230314BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230314BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230314BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230314BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61P27/02
A61K48/00
A61K35/76
A61P3/10
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021515206
(86)(22)【出願日】2018-10-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 KR2018012428
(87)【国際公開番号】W WO2020080583
(87)【国際公開日】2020-04-23
【審査請求日】2021-09-27
(73)【特許権者】
【識別番号】519163980
【氏名又は名称】アイシーエム・カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＣＭ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３２３ Ｒｏｏｍ ４２６，５０，Ｙｏｎｓｅｉ－ｒｏ，Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ ０３７２２，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】キム， ダエ‐ウォン
(72)【発明者】
【氏名】オム， ヨン‐ナ
(72)【発明者】
【氏名】リュウ， フイ‐ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン， ダ‐ウン
(72)【発明者】
【氏名】チョイ， スン‐ウォン
【審査官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５３５３１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２３６０３５（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎｋｘ３．２又はその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物であって、前記Ｎｋｘ３．２又はその断片は、配列番号７又は１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、医薬組成物。
【請求項2】
前記網膜疾患が、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管症及び網膜浮腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記黄斑変性が、乾性黄斑変性又は湿性黄斑変性である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
Ｎｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスを有効成分として含む、網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物であって、前記Ｎｋｘ３．２又はその断片は、配列番号７又は１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、医薬組成物。
【請求項5】
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記網膜疾患が、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管症及び網膜浮腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記黄斑変性が、乾性黄斑変性又は湿性黄斑変性である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物の製造における、Ｎｋｘ３．２又はその断片の使用であって、前記Ｎｋｘ３．２又はその断片は、配列番号７又は１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、使用。
【請求項9】
前記医薬組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔、吸入、局所、直腸、経口、眼球内及び皮内からなる群から選択されるいずれか１つの経路により個体に投与される、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｎｋｘ３．２及びその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
我々の社会が高齢化社会に進入することに伴い、老化に係わる疾病及びその治療法に対して関心が高まっている。多様な加齢性疾患のうち、代表的な加齢性の眼球疾患である黄斑変性は、眼の内側の網膜中心部に位置した黄斑部に変性が起きて視力障害が生じる疾患である。
【0003】
身体の老化により黄斑機能が低下して視力が低下するか、喪失する疾患である黄斑変性は、老年期の視力喪失の主な原因である。黄斑変性は、通常５０～６０代に現れる疾病であるが、まれに若い年齢層で発病することもある。前記疾病の原因としては、身体の老化、心血管係疾病、喫煙、高い血中コレステロール、環境汚染、日光暴露などが知られている。
【0004】
黄斑変性の種類は、乾性黄斑変性と湿性黄斑変性がある。乾性黄斑変性は、網膜にドルーゼンという一種の老廃物や網膜色素上皮の萎縮のような病変が生じた場合であり、黄斑変性患者の約９０％は乾性形態の黄斑変性を有している。乾性黄斑変性では、黄斑にある視細胞が徐々に萎縮して時間の経過とともに視力が漸次低下し、深刻な視力喪失を引き起こすことはないが、湿性形態に進行し得る。湿性黄斑変性では、脈絡膜に異常に新生血管が生じ、該血管自体又は血管からの出血、滲出などにより深刻な視力損傷が発生しやすい。湿性黄斑変性は、発病後数ヶ月～数年の間に円盤状萎縮、深刻な出血などにより失明をもたらすことがある（Ｏｈ，Ｍ．Ｊ．＆Ｌｅｅ，Ｓ．Ｙ．，２０１２）。
【0005】
一方、黄斑変性によって視力障害が始まると、正視に戻すことがほぼできないため、早期に発見して治療することが重要である。黄斑変性は、黄斑変性の自己検査表であるアムスラーグリッドを用いると、早期に発見することができる。このように、黄斑変性は、早期に発見して治療すれば視力喪失を最小化することができるが、いまだ確実な治療法はないのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明者らは、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の治療剤を研究したところ、Ｎｋｘ３．２及び／又はその断片が酸化ストレスによる網膜色素上皮細胞の死滅及び網膜変性の抑制、視覚機能の保存、脈絡膜新生血管及び網膜浮腫の抑制などの網膜疾患の予防又は治療に優れた効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
本発明の目的は、Ｎｋｘ３．２及び／又はその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記の目的を達成するために、本発明は、Ｎｋｘ３．２又はその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0009】
また、本発明は、前記Ｎｋｘ３．２断片が下記式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドである、網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドである、網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0010】
前記式（Ｉ）において、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～４２個のアミノ酸が連続的に欠失することができ、
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～２３個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～４２個のアミノ酸が連続的に欠失することができ、
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～２３個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。
【0011】
また、本発明は、前記Ｎｋｘ３．２及び／又はその断片であるポリペプチドを個体に投与することを含む網膜疾患の予防又は治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係るＮｋｘ３．２及び／又はその断片は、酸化ストレスによる網膜変性を抑制し、視覚機能を保存する。また、前記Ｎｋｘ３．２及び／又はその断片は、網膜色素上皮細胞の酸化ストレスによる細胞死滅を抑制し、脈絡膜新生血管及び網膜浮腫を抑制する。したがって、前記Ｎｋｘ３．２及び／又はその断片を有効成分として含む組成物は、網膜疾患の予防又は治療に有利に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図3】図３は、ウエスタンブロット分析法を用いてヒト網膜色素上皮細胞におけるＮｋｘ３．２タンパク質の発現を示す図である。このとき、ＷＢ ａｂｓは、ウエスタンブロット抗体（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の略語である。
【図7】図７は、網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスを作製するための方法を図式化して示す図である。図７に示す略語の意味は、以下の通りである：ｃｉ－Ｎｋｘ３．２，Ｃｒｅ誘導Ｎｋｘ３．２（Ｃｒｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｎｋｘ３．２）；ｃｉＴｇ－Ｎｋｘ３．２、Ｃｒｅ誘導Ｎｋｘ３．２トランスジェニック（Ｃｒｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｎｋｘ３．２ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；ｔｐＡ、転写の停止（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｔｏｐ）。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0015】
本発明の一態様において、Ｎｋｘ３．２又はその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0016】
本明細書で用いられる用語「Ｎｋｘ３．２」は、ＮＫ３ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２とも呼ばれ、ＮＫファミリー（ｆａｍｉｌｙ）のホメオボックスを含むタンパク質の一つである。Ｎｋｘ３．２は、骨格発達及び機関分化に重要な役割を果たす。特に、Ｎｋｘ３．２は、軟骨細胞への分化を促進させ、軟骨細胞の肥大を遅延させ、軟骨細胞の自滅を抑制させると知られている。前記Ｎｋｘ３．２は、ヒト来由のタンパク質であってもよい。このとき、Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有してもよく、これは配列番号８の塩基配列によってコードすることができる。
【0017】
本明細書で用いられるＮｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列に対して実質的な同一性を示すアミノ酸配列を含むことができる。前記実質的な同一性を有するＮｋｘ３．２タンパク質は、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％の相同性を示すアミノ酸配列を意味する。
【0018】
また、本発明で用いられたＮｋｘ３．２タンパク質は、その天然型アミノ酸配列を有するタンパク質だけではなく、そのアミノ酸配列の変異体がさらに本発明の範囲に含まれ得る。このとき、Ｎｋｘ３．２タンパク質の変異体とは、Ｎｋｘ３．２タンパク質の天然アミノ酸配列と、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換、又はこれらの組み合わせにより異なる配列を有するタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当該分野において公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も一般的に起きる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。また、前記Ｎｋｘ３．２タンパク質は、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化又はファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などによって修飾され得る。
【0019】
前記Ｎｋｘ３．２タンパク質又はその変異体は、天然で抽出するか、合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．８５：２１４９－２１５６，１９６３）又はＤＮＡ配列を基本とする組換え方法によって製造することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）。
【0020】
本明細書で用いられる用語「Ｎｋｘ３．２断片」は、下記式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドであってもよい。
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドであってもよい。
【0021】
前記式（Ｉ）において、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～４２個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。また、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号５の２４位のアミノ酸から始めてＣ末端からＮ末端方向に１個～２３個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。
【0022】
本明細書で用いられる用語「コアドメイン」は、全長のＮｋｘ３．２タンパク質の１６６位から３０９位までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記全長のＮｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有することができる。前記コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有することができ、これは配列番号２の塩基配列によってコードすることができる。
【0023】
本明細書で用いられる用語「Ｎ末端伸長ドメイン」とは、上述のコアドメインのＮ末端に結合するドメインであって、全長のＮｋｘ３．２タンパク質の１２３位から１６５位までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有することができ、これは配列番号４の塩基配列によってコードすることができる。
【0024】
前記Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドの１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個若しくは４２個のアミノ酸残基が欠失したものであってもよい。
【0025】
本明細書で用いられる用語「Ｃ末端伸長ドメイン」とは、上述のコアドメインのＣ末端に結合するドメインであって、全長のＮｋｘ３．２タンパク質の３１０位から３３３位までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有することができ、これは配列番号６の塩基配列によってコードすることができる。
【0026】
前記Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記ポリペプチドの２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個若しくは２３個のアミノ酸残基が欠失したものであってもよい。
【0027】
前記アミノ酸残基の欠失は、Ｎ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインのいずれか一方又は両方のドメインの全部で発生し得る。具体的には、本発明におけるポリペプチドは、配列番号１、３、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を有することができる。
【0028】
前記ポリペプチドは、Ｎｋｘ３．２タンパク質の断片であって、生体内には存在しない。しかし、前記ポリペプチドは、天然型のＮｋｘ３．２タンパク質と同一の活性を有しつつも、生体内に容易に分解されず、天然型のＮｋｘ３．２タンパク質に比べて体内に長い間存在することによって、さらに優れた活性を示すことができる。
【0029】
一実施形態において、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片を提供する。前記断片は、配列番号２０の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～８７個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。また、前記断片は、配列番号２０の３２０２０９位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～３９個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。
【0030】
前記アミノ酸の欠失は、配列番号２０のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方の全部で発生し得る。
【0031】
本発明の一実施態様において、酸化ストレスによるＮｋｘ３．２全長及びその断片の網膜色素上皮細胞の死滅抑制能を評価するために、網膜色素上皮細胞株にＮｋｘ３．２全長及びその断片のＤＮＡプラスミドをそれぞれ形質導入させ、酸化ストレスを誘導した。その結果、Ｎｋｘ３．２全長及びその断片のすべてが網膜色素上皮細胞の死滅を抑制することを確認した。
【0032】
本発明の他の態様において、Ｎｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0033】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、前記ＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、非ウイルス性ベクターに積載されてもよい。前記非ウイルス性ベクターは、プラスミド、リポソーム、陽イオン性高分子、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、エマルジョン、固体脂質ナノ粒子（ｓｏｌｉｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【0034】
さらに、本発明の他の態様において、Ｎｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスを有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0035】
前記Ｎｋｘ３．２断片が下記式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドであってもよい。
Ｎ末端伸長ドメイン－コアドメイン－Ｃ末端伸長ドメイン（Ｉ）
で表されるポリペプチドであってもよい。
【0036】
前記式（Ｉ）において、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～４２個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。また、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～２３個のアミノ酸が連続的に欠失することができる。このとき、前記コアドメイン、Ｎ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインは、前述の通りであり、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよい。
【0037】
前記ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ））、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。具体的には、前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。前記アデノ随伴ウイルスは、特定の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に限定されず、好ましくは、ＡＡＶ１～ＡＡＶ９のいずれか１つであってもよい。
【0038】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞に感染することができ、多様な種類の細胞に感染する能力を有しているので、本発明の遺伝子伝達システムとして適合する。ＡＡＶベクターの製造及び用途に係る詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に詳細に開示されている。
【0039】
典型的には、ＡＡＶウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復に隣接する目的の遺伝子配列を含むプラスミド及び末端反復のない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドを同時に形質導入させることにより製造され得る。
【0040】
本明細書で用いられる用語「網膜疾患」とは、老化、疾病などの理由で網膜に発生した損傷による疾病をいい、黄斑変性、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管症及び網膜浮腫からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【0041】
前記黄斑変性は、老化の進行とともに黄斑機能が低下して視力が落ちるか、喪失する疾病であって、この疾病により視力が落ちてきたら、正視に戻すことができない。前記疾病は、加齢性黄斑変性と呼ばれ、老年期の視力喪失の主な原因である。前記黄斑変性は、乾性黄斑変性及び湿性黄斑変性の二種類に分けられる。黄斑変性に病んでいる患者の約９０％は乾性黄斑変性であり、これは老廃物が網膜の下に蓄積するか、網膜色素上皮の萎縮のような病変が生じた場合である。黄斑にある視細胞が徐々に破壊されるので、時間の経過とともに黄斑機能が低下し、中心部の視力が低下するようになる。湿性黄斑変性は、黄斑部の下層を構成する脈絡膜に異常に新たな血管が多く生成されて症状が発生する。湿性黄斑変性は、乾性黄斑変性に比べて進行が早くて視力が急激に低下することができ、２ヶ月～３年の間に失明する可能性がある。
【0042】
前記糖尿病性網膜症は、糖尿病による末梢循環障害によって目の網膜に発生する合併症である。前記疾病は、初期には症状がないものの黄斑部への侵入が起きながら視力低下の症状を呈し得る。前記糖尿病性網膜症は、進行段階に応じて単純網膜症、増殖前網膜症及び増殖網膜症に分けられる。
【0043】
前記脈絡膜新生血管症は、異常血管が生じることにより脈絡膜が損傷されて視力障害が発生する疾病である。前記脈絡膜新生血管症は、世界中で不可逆的な視力損失の主な原因の一つであり、様々な治療の試みにもかかわらず、視力の予後は、ほとんどの患者において良くない。
【0044】
前記網膜浮腫は、網膜が腫れていることを意味する。様々な理由によって網膜又は黄斑内の毛細血管のような微細な血管に変性又は異常が発生することにより出血が生じ、その結果、網膜浮腫が発生し得る。網膜に浮腫が発生するようになると、視力低下を含めた多様な症状が呈し得る。
【0045】
前記Ｎｋｘ３．２又はその断片を含む医薬組成物は、医薬組成物の全重量に対して有効成分である本発明に係るＮｋｘ３．２の断片のポリペプチドを１０～９５重量％で含むことができる。また、本発明の医薬組成物は、前記有効成分に加えて同一又は類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含むことができる。本発明に係る医薬組成物は、投与のために上記の有効成分以外にさらに薬学的に許容可能な担体を１種以上含むことができる。
【0046】
また、Ｎｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスを有効成分として含む医薬組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、医薬組成物に含有された有効成分並びに他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、治療期間、並びに同時に使用される薬物を含めた多様な因子によって調節され得る。
【0047】
しかしながら、所望の効果のために、本発明に係る医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、成人の場合１日につき１．０×１０５～１．０×１０１５ウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）の量で投与されてもよい。具体的には、本発明の医薬組成物の投与量は、成人の場合１日につき１．０×１０５～１．０×１０１５、１．０×１０７～１．０×１０１３、１．０×１０８～１．０×１０１２、又は１．０×１０９～１．０×１０１０の量で投与してもよい。
【0048】
また、本発明は、Ｎｋｘ３．２又はその断片、若しくはＮｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスを有効成分として含む医薬組成物を個体に投与することを含む網膜疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0049】
本発明に係るＮｋｘ３．２又はその断片であるポリペプチド、若しくはＮｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスの投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、医薬組成物に含有された有効成分並びに他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、治療期間、並びに同時に使用される薬物を含めた多様な因子によって調節され得る。
【0050】
しかしながら、所望の効果のために、本発明に係るＮｋｘ３．２又はその断片を有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物に含まれるＮｋｘ３．２の断片であるポリペプチドの有効量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇでもよい。このとき、投与は、１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【0051】
また、所望の効果のために、本発明に係るＮｋｘ３．２又はその断片をコードするポリヌクレオチドが含まれた組換えウイルスを有効成分として含む網膜疾患の予防又は治療用の医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、成人の場合１日につき１．０×１０５～１．０×１０１５ウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）の量で投与されてもよい。具体的には、本発明の医薬組成物の投与量は、成人の場合１日につき１．０×１０５～１．０×１０１５、１．０×１０７～１．０×１０１３、１．０×１０８～１．０×１０１２、又は１．０×１０９～１．０×１０１０の量で投与してもよい。
【0052】
また、本発明の医薬組成物は、当業界における公知の多様な方法でこれを必要とする個体に投与され得る。前記個体は、哺乳動物、具体的には、ヒトであってもよい。前記投与経路は、投与方法、体液の容積、粘度などを考慮して通常の技術者が適切に選択することができる。具体的には、前記投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻腔、吸入、局所、直腸、経口、眼球内及び皮内からなる群から選択されるいずれか１つの経路により行われる。
【0053】
本発明の他の態様において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端領域、Ｃ末端領域及びその組み合わせからなる群から選択されたいずれか１つの領域を欠失させる段階を含む、体内安定性が向上したＮｋｘ３．２断片を製造する方法を提供する。
【0054】
前記Ｎ末端領域の欠失は、配列番号７の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～１９９個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。一実施形態において、前記Ｎ末端領域の欠失は、配列番号７の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に４１個、９８個、１１１個又は１２２個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。前記配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端領域が欠失したＮｋｘ３．２断片は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を有することができる。具体的には、前記欠失は、配列番号７の１００位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に１個～９９個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。
【0055】
前記Ｃ末端領域の欠失は、配列番号７の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～５２個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。一実施形態において、前記Ｃ末端領域の欠失は、配列番号７の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１３個又は２６個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。前記配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端領域が欠失したＮｋｘ３．２断片は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を有することができる。具体的には、前記欠失は、配列番号７の３２０位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に１個～３９個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。
【0056】
前記アミノ酸の欠失は、Ｎ末端領域及びＣ末端領域の一方又は両方で発生し得る。一実施形態において、前記アミノ酸の欠失は、配列番号７の１位のアミノ酸から開始してＮ末端方向からＣ末端方向に９８個～１６４個、具体的には９８個、１０４個、１０９個、１１１個、１２２個、１２９個、１４９個、１５２個、１５５個、１５８個、１６１個又は１６４個のアミノ酸が連続的に欠失され、同時に配列番号７の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に３個～２３個、具体的には３個、６個、９個、１３個、１５個、１７個、１９個、２１個又は２３個のアミノ酸が連続的に欠失したものであってもよい。
【0057】
前記Ｎ末端領域及びＣ末端領域の両方ともにアミノ酸の欠失が発生したＮｋｘ３．２断片は、配列番号１５～配列番号２８のアミノ酸配列を有することができる。Ｎ末端領域及びＣ末端領域の両方で前記アミノ酸残基の欠失は、当業者により適切な方法で行われる。
【実施例】
【0058】
以下、本発明を下記実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するだけであり、本発明は、それに限定されるものではない。
【0059】
準備例１．実験眼組職の準備
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入し、承認された動物施設で特定の無菌状態で保管した。所定の実験プロトコルによって正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼球を摘出して組職を分離した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入し、承認された動物施設で特定の無菌状態で保管した。所定の実験プロトコルによって正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼球を摘出して組職を分離した。
【0060】
また、ヒトの眼組織を購入し、承認された施設で特定の無菌状態で保管した。
【0061】
実験例１．網膜色素上皮細胞でＮｋｘ３．２発現の確認
眼球網膜色素上皮層においてＮｋｘ３．２タンパク質の発現が報告されていないので、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＩＨＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウエスタンブロット分析法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いてこれに対する検証を行った。
眼球網膜色素上皮層においてＮｋｘ３．２タンパク質の発現が報告されていないので、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＩＨＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウエスタンブロット分析法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いてこれに対する検証を行った。
【0062】
【0063】
また、前記準備例１で準備されたヒトの眼組職から角膜（ｃｏｒｎｅａ）と網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）を分離し、タンパク質を抽出してウエスタンブロット分析法によりＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。その結果を図３に示した。
【0064】
図１及び図２に示すように、網膜色素上皮細胞において特異的な発現を示すＲＰＥ６５タンパク質とともにＣ５７ＢＬ／６マウス及びヒトの眼組職でＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。また、図３に示すように、眼球の前側（ｆｒｏｎｔａｌ，Ｆ）に比べてＲＰＥ６５の発現が高い眼球の後側（ｈｉｎｄ，Ｈ）でＮｋｘ３．２タンパク質がより高く発現することを確認した。
【0065】
実験例２．酸化ストレスによる網膜変性モデルでＮｋｘ３．２の発現の確認
免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＩＨＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウエスタンブロット分析法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて酸化ストレスによる網膜変性モデルにおけるＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。
免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＩＨＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）及びウエスタンブロット分析法（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて酸化ストレスによる網膜変性モデルにおけるＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。
【0066】
ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ３）を用いて前記準備例１で準備したＣ５７ＢＬ／６マウスの眼球に酸化ストレスを誘導することにより網膜変性マウスモデルを構築した。その後、顕微鏡を用いて網膜変性マウスモデルでの病変を観察した。また、免疫組織化学染色を用いて前記網膜変性マウスモデルにおけるＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。その結果を図４及び図５に示した。
【0067】
また、前記網膜変性マウスモデルの組職からタンパク質を抽出してウエスタンブロット分析法によりＮｋｘ３．２タンパク質の発現を確認した。その結果を図６に示した。
【0068】
図４に示すように、ＮａＩＯ３を用いて酸化ストレスを誘導することにより網膜変性マウスモデルで網膜色素上皮の病変を確認した。また、図５に示すように、網膜色素上皮の病変が確認された網膜変性マウスモデルでＮｋｘ３．２タンパク質が減少することを確認した。
【0069】
また、図６に示すように、酸化ストレスによる網膜変性モデルでＮｋｘ３．２タンパク質の発現が確かに減少することを確認し、これは網膜色素上皮のマーカーであるＲＰＥ６５の減少より先行する初期的変化であることを確認した。
【0070】
実験例３．網膜色素上皮細胞でＮｋｘ３．２を過剰発現するマウスの作製
本研究チームは、先行論文でＣｒｅ依存的Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスを発表した（Ｊｅｏｎｇ，Ｄａ－Ｕｎ，Ｊｅ－Ｙｏｎｇ Ｃｈｏｉ，ａｎｄ Ｄａｅ－Ｗｏｎ Ｋｉｍ．“Ｃａｒｔｉｌａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｃｒｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｋｘ３．２ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃａｕｓｅｓ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｂｙ Ｄｅｌａｙｉｎｇ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２３２．１（２０１７）：７８－９０．）。これに基づいて網膜色素上皮細胞に特異的なＣｒｅ発現を示すＢＥＳＴ１－Ｃｒｅマウスを用いて、Ｃｒｅ遺伝子組換え酵素によるＮｋｘ３．２過剰発現がただ網膜色素上皮細胞のみで起こるようにした。当該マウスの作製戦略を図式化して図７に示した。
本研究チームは、先行論文でＣｒｅ依存的Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスを発表した（Ｊｅｏｎｇ，Ｄａ－Ｕｎ，Ｊｅ－Ｙｏｎｇ Ｃｈｏｉ，ａｎｄ Ｄａｅ－Ｗｏｎ Ｋｉｍ．“Ｃａｒｔｉｌａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ Ｃｒｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｋｘ３．２ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃａｕｓｅｓ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｂｙ Ｄｅｌａｙｉｎｇ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２３２．１（２０１７）：７８－９０．）。これに基づいて網膜色素上皮細胞に特異的なＣｒｅ発現を示すＢＥＳＴ１－Ｃｒｅマウスを用いて、Ｃｒｅ遺伝子組換え酵素によるＮｋｘ３．２過剰発現がただ網膜色素上皮細胞のみで起こるようにした。当該マウスの作製戦略を図式化して図７に示した。
【0071】
また、前記作製したＮｋｘ３．２過剰発現マウスの網膜色素上皮細胞でＮｋｘ３．２の発現を免疫組織化学染色により確認し、その結果を図８に示した。
【0072】
図８に示すように、Ｃｒｅ遺伝子組換え酵素によるＮｋｘ３．２過剰発現がただ網膜色素上皮細胞のみで起こるように作製したマウスの網膜色素上皮細胞でＮｋｘ３．２タンパク質の過剰発現が検証された。
【0073】
実験例４．Ｎｋｘ３．２過剰発現による網膜色素上皮細胞の抑制効果の確認
前記実験例３で作製した網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスでＮａＩＯ３を用いて酸化ストレスによる網膜変性を誘導した。
前記実験例３で作製した網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスでＮａＩＯ３を用いて酸化ストレスによる網膜変性を誘導した。
【0074】
実験例４．１．網膜フラットマウント（Ｆｌａｔ ｍｏｕｎｔ）
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの半球形の網膜をフラットマウントして網膜変性の病変を確認した。その結果を図９に示した。
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの半球形の網膜をフラットマウントして網膜変性の病変を確認した。その結果を図９に示した。
【0075】
図９に示すように、Ｎｋｘ３．２タンパク質非過剰発現（ｃｉ－Ｎｋｘ３．２）マウスで酸化ストレスによって網膜変性が明らかに観察された。一方、Ｎｋｘ３．２過剰発現（ｃｉＴｇ－Ｎｋｘ３．２）マウスでは酸化ストレスによって網膜変性が観察されなかった。
【0076】
実験例４．２．眼底画像撮影（Ｆｕｎｄｕｓ ｉｍａｇｅ）
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を眼底画像撮影方法により分析した。その結果を図１０に示した。
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を眼底画像撮影方法により分析した。その結果を図１０に示した。
【0077】
図１０に示すように、正常対照群（Ｎｏｒｍ）は、視神経を中心に均一で一様な形態の網膜曲面を示し、正常な網膜反射を示した。一方、Ｎｋｘ３．２非過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ）は、分裂した網膜色素上皮を示し、低反射パターンを示した。これに対し、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ＋Ｎｋｘ３．２）は、正常対照群と類似する網膜構造を示した。
【0078】
実験例４．３．光干渉断層撮影
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を光干渉断層撮影方法により分析した。その結果を図１１に示した。
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を光干渉断層撮影方法により分析した。その結果を図１１に示した。
【0079】
図１１に示すように、正常対照群（Ｎｏｒｍ）は、網膜の多層構造をよく示しているのに対し、Ｎｋｘ３．２非過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ）は、深刻な網膜変性で網膜の多層構造が深刻に損傷した。これに対し、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ＋Ｎｋｘ３．２）は、正常対照群と類似する網膜構造を示した。
【0080】
実験例４．４．組織病理学的解析
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を組職学的に分析した。その結果を図１２に示した。
酸化ストレスによって網膜変性が誘導されたマウスの眼球網膜構造を組職学的に分析した。その結果を図１２に示した。
【0081】
図１２に示すように、正常対照群（Ｎｏｒｍ）は、網膜の正常構造と網膜色素上皮層の正常な膜構造が観察された。一方、Ｎｋｘ３．２非過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ）は、網膜色素上皮層が深刻な損傷を受けて消失した。これに対し、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ＋Ｎｋｘ３．２）は、正常対照群と類似する網膜構造及び網膜色素上皮層のパターンが観察された。
【0082】
実験例５．Ｎｋｘ３．２過剰発現による視覚機能の保存効果の確認
網膜電図検査（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ，ＥＲＧ）によってＮｋｘ３．２過剰発現による視覚機能の保存効果を確認した。
網膜電図検査（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ，ＥＲＧ）によってＮｋｘ３．２過剰発現による視覚機能の保存効果を確認した。
【0083】
前記実験例４において、酸化ストレスによって網膜変性が誘導された網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスの視覚機能をＥＲＧにより分析した。その結果を図１３に示した。
【0084】
図１３に示すように、正常対照群（Ｎｏｒｍａｌ）は、網膜の外部光刺激に対して正常な網膜電図の変化を示した。一方、Ｎｋｘ３．２非過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ）は、外部光刺激に対する網膜電図の変化が完全に消失した。これに対し、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスの網膜変性群（ＡＭＤ＋Ｎｋｘ３．２）は、正常対照群と類似する網膜電図の変化を示した。
【0085】
実験例６．酸化ストレスを誘導するＨ２Ｏ２濃度による細胞生存率、細胞死滅率、Ｎｋｘ３．２タンパク質の発現の確認
ヒト網膜色素上皮細胞に４００μＭ、６００μＭ、８００μＭ、１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）をそれぞれ処理して酸化ストレスを誘導した。その後、ＷＳＴ分析手法（ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ ａｓｓａｙ）を用いて酸化ストレスを誘導するＨ２Ｏ２濃度による細胞生存率を測定した。その結果を図１４に示した。
ヒト網膜色素上皮細胞に４００μＭ、６００μＭ、８００μＭ、１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）をそれぞれ処理して酸化ストレスを誘導した。その後、ＷＳＴ分析手法（ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ ａｓｓａｙ）を用いて酸化ストレスを誘導するＨ２Ｏ２濃度による細胞生存率を測定した。その結果を図１４に示した。
【0086】
また、アネキシンＶ－ＦＩＴＣアポトーシスキット（ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、上記のように濃度別にＨ２Ｏ２を処理して酸化ストレスが誘導されたヒト網膜色素上皮細胞の細胞死滅率を測定した。また、ウエスタンブロット分析法により細胞死滅率の上昇によるＮｋｘ３．２タンパク質の発現レベルの変化を測定した。その結果を図１５及び図１６に示した。
【0087】
図１４に示すように、Ｈ２Ｏ２濃度の上昇につれて細胞生存率が減少した。また、図１５に示すように、Ｈ２Ｏ２濃度の上昇につれて細胞死滅率が上昇した。図１６に示すように、Ｈ２Ｏ２濃度の上昇につれて細胞死滅のマーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰタンパク質の発現が上昇した。すなわち、細胞死滅のマーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰタンパク質の発現の増加が細胞死滅を発生させることをタンパク質水準で検証した。また、前記Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰタンパク質の発現の増加につれてＮｋｘ３．２タンパク質の発現が減少することを確認した。
【0088】
実験例７．Ｎｋｘ３．２タンパク質発現ウイルスの投与後の細胞死滅率の測定
ヒト網膜色素上皮細胞に８００μＭのＨ２Ｏ２を処理して酸化ストレスを誘導し、前記酸化ストレスが誘導された細胞を２つのグループに分けた。１つのグループにはＮｋｘ３．２発現ウイルス（Ｌｅｎｔｉ－Ｎｋｘ３．２）を投与し、他のグループにはＮｋｘ３．２発現抑制ウイルス（ｓｈ－Ｎｋｘ３．２）を投与した。その後、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ死滅キットを用いて各ウイルスの投与によるヒト網膜色素上皮細胞の酸化ストレスによる細胞死滅率を測定した。その結果を図１７及び図１８に示した。
ヒト網膜色素上皮細胞に８００μＭのＨ２Ｏ２を処理して酸化ストレスを誘導し、前記酸化ストレスが誘導された細胞を２つのグループに分けた。１つのグループにはＮｋｘ３．２発現ウイルス（Ｌｅｎｔｉ－Ｎｋｘ３．２）を投与し、他のグループにはＮｋｘ３．２発現抑制ウイルス（ｓｈ－Ｎｋｘ３．２）を投与した。その後、アネキシンＶ－ＦＩＴＣ死滅キットを用いて各ウイルスの投与によるヒト網膜色素上皮細胞の酸化ストレスによる細胞死滅率を測定した。その結果を図１７及び図１８に示した。
【0089】
図１７に示すように、ヒト網膜色素上皮細胞にＮｋｘ３．２発現ウイルス（Ｌｅｎｔｉ－Ｎｋｘ３．２）を投与した場合、Ｈ２Ｏ２による細胞死滅率が対照群ウイルス（Ｌｅｎｔｉ－Ｃｔｒｌ）の投与群に比べて減少した。また、図１８に示すように、ヒト網膜色素上皮細胞にＮｋｘ３．２発現抑制ウイルス（ｓｈ－Ｎｋｘ３．２）を投与する場合、Ｈ２Ｏ２による細胞死滅率が対照群ウイルス（ｓｈ－Ｃｔｒｌ）の投与群に比べて上昇した。
【0090】
実験例８．Ｎｋｘ３．２タンパク質及びその断片の酸化ストレスによる網膜色素上皮細胞の死滅抑制能の評価
実験例８．１．酸化ストレスによるＮｋｘ３．２全長及びその断片の網膜色素上皮細胞の死滅抑制能の評価
Ｎｋｘ３．２全長及びその断片が酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される網膜色素上皮細胞の死滅を抑制する機能を有しているかどうかを評価するために、ＡＲＰＥ１９細胞が播種された１２ウェルプレート（３Ｅ＋４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）にｈＮｋｘ３．２全長（配列番号７）、及び配列番号９（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１～３２０）、配列番号１０（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１～３０７）、配列番号１２（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸９９～３３３）、配列番号１３（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１１２～３３３）、配列番号２０（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１１２～３２０）、配列番号２１（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１２３～３２０）、配列番号２３（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１５０～３２０）及び配列番号２８（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１６５～３１０）のアミノ酸配列を有するｈＮｋｘ３．２の断片をコードするＤＮＡプラスミドを各０．６ｕｇずつ形質導入した。
実験例８．１．酸化ストレスによるＮｋｘ３．２全長及びその断片の網膜色素上皮細胞の死滅抑制能の評価
Ｎｋｘ３．２全長及びその断片が酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される網膜色素上皮細胞の死滅を抑制する機能を有しているかどうかを評価するために、ＡＲＰＥ１９細胞が播種された１２ウェルプレート（３Ｅ＋４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）にｈＮｋｘ３．２全長（配列番号７）、及び配列番号９（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１～３２０）、配列番号１０（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１～３０７）、配列番号１２（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸９９～３３３）、配列番号１３（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１１２～３３３）、配列番号２０（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１１２～３２０）、配列番号２１（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１２３～３２０）、配列番号２３（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１５０～３２０）及び配列番号２８（ｈＮｋｘ３．２全長配列のアミノ酸１６５～３１０）のアミノ酸配列を有するｈＮｋｘ３．２の断片をコードするＤＮＡプラスミドを各０．６ｕｇずつ形質導入した。
【0091】
形質導入してから３６時間後、０．３ｍＭのＨ２Ｏ２を３７℃の温度でＣＯ２インキュベーターで１５時間反応させた。各ウェルに水溶性テトラゾリウム塩を５０ｕｌずつ添加した後、３７℃の温度でＣＯ２インキュベーターで９０分間反応させた。各ウェルで１５０ｕｌの上層液を取って９６ウェルプレートに移した。マイクロプレートリーダー装置を用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図１９に示した。
【0092】
図１９に示すように、Ｎｋｘ３．２全長を含めてＮｋｘ３．２断片は、Ｈ２Ｏ２によるＡＲＰＥ１９の細胞死滅を対照群に比べて少なくとも８％から最大１７％程度まで抑制した。
【0093】
実験例８．２．Ｎｋｘ３．２全長及びその断片の形質導入の効率の評価
形質導入の特性上、１００％の効率が現れないため、前記実験例の細胞生存能の分析でＮｋｘ３．２全長及びその断片のＨ２Ｏ２による網膜色素上皮細胞の死滅抑制能が低評価された可能性がある。そこで、Ｎｋｘ３．２全長及びその断片に対する形質導入の効率を免疫細胞化学技術を用いて評価した。まず、スライドガラスが載せられている１２ウェルプレートにＡＲＥＰ１９細胞を２Ｅ＋４個ずつ播種した。ｈＮｋｘ３．２全長又はその断片をコードするＤＮＡプラスミドをそれぞれ０．６ｕｇずつ形質導入した。４８時間後、各ウェルに２％のパラホルムアルデヒドを入れて常温で１５分間反応させて細胞を固定した。その後、各ウェルに０．１％クエン酸ナトリウム内０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を入れて常温で３０分間反応させ、抗体が細胞内に侵入しやすい状態に作った。その後、ＰＢＳで２回洗浄した。
形質導入の特性上、１００％の効率が現れないため、前記実験例の細胞生存能の分析でＮｋｘ３．２全長及びその断片のＨ２Ｏ２による網膜色素上皮細胞の死滅抑制能が低評価された可能性がある。そこで、Ｎｋｘ３．２全長及びその断片に対する形質導入の効率を免疫細胞化学技術を用いて評価した。まず、スライドガラスが載せられている１２ウェルプレートにＡＲＥＰ１９細胞を２Ｅ＋４個ずつ播種した。ｈＮｋｘ３．２全長又はその断片をコードするＤＮＡプラスミドをそれぞれ０．６ｕｇずつ形質導入した。４８時間後、各ウェルに２％のパラホルムアルデヒドを入れて常温で１５分間反応させて細胞を固定した。その後、各ウェルに０．１％クエン酸ナトリウム内０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を入れて常温で３０分間反応させ、抗体が細胞内に侵入しやすい状態に作った。その後、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0094】
各ウェルに５％ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）内０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を入れて常温で３０分間反応させ、抗体の非特異的染色を減少させた。その後、ＰＢＳ内０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で２回洗浄した。１次抗体（Ｎｋｘ３．２－ラビット）を１：５００の割合で希釈して４℃で１６時間反応させ、ＰＢＳＴで５回洗浄した。２次抗体（ＦＩＴＣ－抗－ラビット）を１：３００の割合で希釈して常温で３０分間反応させ、ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＤＡＰＩを１：５００の割合で希釈して常温で１０分間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した。スライドガラスを７０％ＥｔＯＨで拭いた後、ａｎｔｉ－ｆａｄｉｎｇマウント溶液でマウント（ｍｏｕｎｇｔｉｎｇ）して暗室で２４時間乾燥した。その後、正立（ｕｐｒｉｇｈｔ）顕微鏡で各サンプルを撮影した。各サンプルごとに列セクションで撮影してＤＡＰＩ染色分に形質導入されたＮｋｘ３．２タンパク質の個数を数えて平均値を求めた。その結果を図２０ａ～図２０ｃに示した。
【0095】
図２０ａは、免疫細胞化学技術を用いて形質導入されたＮｋｘ３．２とＤＡＰＩに染色された核を示した。図２０ｂ及び図２０ｃに示すように、Ｎｋｘ３．２全長及びその断片のＡＲＰＥ１９細胞に対する形質導入の効率は、１５～３１％の間である。
【0096】
実験例８．３．Ｎｋｘ３．２全長及びその断片の形質導入の効率に応じて酸化ストレスによる網膜色素上皮細胞の死滅抑制能の再評価
Ｎｋｘ３．２全長及びその断片の形質導入の効率を考慮し、Ｈ２Ｏ２によるＡＲＰＥ１９細胞死滅を抑制することができるか否かを再評価した。その結果を下記表１に示した。
表１に示したように、Ｎｋｘ３．２全長を含めたＮｋｘ３．２断片は、Ｈ２Ｏ２によるＡＲＰＥ１９細胞死滅を対照群に比べて少なくとも３０％から最大７５％程度まで抑制した。
Ｎｋｘ３．２全長及びその断片の形質導入の効率を考慮し、Ｈ２Ｏ２によるＡＲＰＥ１９細胞死滅を抑制することができるか否かを再評価した。その結果を下記表１に示した。
【表1】
表１に示したように、Ｎｋｘ３．２全長を含めたＮｋｘ３．２断片は、Ｈ２Ｏ２によるＡＲＰＥ１９細胞死滅を対照群に比べて少なくとも３０％から最大７５％程度まで抑制した。
【0097】
実験例９．Ｎｋｘ３．２過剰発現による脈絡膜新生血管の抑制効果の確認
網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスにレーザーを照射して脈絡膜新生血管（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）を誘導した。９日後、マウスに造影剤を腹腔注射して網膜血管に対して眼底造影法（ｆｕｎｄｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ，ＦＡＡ）を施した。前記眼底造影法から確保した画像に基づいて脈絡膜新生血管の病変のＣＴＦを測定し、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）マウスとＮｋｘ３．２過剰発現マウスとの間の脈絡膜新生血管の病変の大きさの差を比較した。その結果を図２１ａ及び図２１ｂに示した。
網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスにレーザーを照射して脈絡膜新生血管（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）を誘導した。９日後、マウスに造影剤を腹腔注射して網膜血管に対して眼底造影法（ｆｕｎｄｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ，ＦＡＡ）を施した。前記眼底造影法から確保した画像に基づいて脈絡膜新生血管の病変のＣＴＦを測定し、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）マウスとＮｋｘ３．２過剰発現マウスとの間の脈絡膜新生血管の病変の大きさの差を比較した。その結果を図２１ａ及び図２１ｂに示した。
【0098】
図２１ａ及び図２１ｂに示すように、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウス（Ｇ２）の脈絡膜新生血管の病変に対するＣＴＦ数値（２９４１４．８±４３２００．４７）が野生型マウス（Ｇ１）のＣＴＦ数値（１２４９４２．３±９１７４３．７４）より有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。これにより、Ｎｋｘ３．２は、脈絡膜新生血管を抑制することに重要な役目を果たすことが分かった。
【0099】
実験例１０．Ｎｋｘ３．２過剰発現による網膜浮腫の抑制効果の確認
網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスでレーザーを照射して脈絡膜新生血管を誘導した後、９日目に脈絡膜新生血管を誘導した網膜領域に対して光干渉断層撮影方法を施した。前記光干渉断層撮影から確保した画像に基づいて野生型マウスとＮｋｘ３．２過剰発現マウスとの間の脈絡膜新生血管の病変で引き起こされた網膜浮腫のパターンの差を比較した。その結果を図２２ａ及び図２２ｂに示した。
網膜色素上皮細胞に特異的なＮｋｘ３．２過剰発現マウスでレーザーを照射して脈絡膜新生血管を誘導した後、９日目に脈絡膜新生血管を誘導した網膜領域に対して光干渉断層撮影方法を施した。前記光干渉断層撮影から確保した画像に基づいて野生型マウスとＮｋｘ３．２過剰発現マウスとの間の脈絡膜新生血管の病変で引き起こされた網膜浮腫のパターンの差を比較した。その結果を図２２ａ及び図２２ｂに示した。
【0100】
図２２ａ及び図２２ｂに示すように、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウス（Ｇ２）で脈絡膜新生血管の病変の網膜の厚さ（２２０．６±１０．４７ ｍｉｃｒｏｎｓ）がｗｉｌｄ ｔｙｐｅマウス（Ｇ１）の網膜の厚さ（２５９．８±１３．０８ｍｉｃｒｏｎｓ）より有意に減少した（Ｐ＜０．０１）。これにより、脈絡膜新生血管を誘導する過程で破壊された血液網膜障壁により二次的に引き起こされた網膜浮腫は、Ｎｋｘ３．２過剰発現マウスで野生型マウスより有意に減少することを確認することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20a】
【図20b】
【図20c】
【図21a】
【図21b】
【図22a】
【図22b】
【配列表】