▶ プロキューアール セラピューティクス ツー ベスローテン フェンノートシャップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-14
(45)【発行日】2023-03-23
(54)【発明の名称】化学修飾された一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230315BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230315BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20230315BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
A61K31/7115
A61K31/712
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2019511856
(86)(22)【出願日】2017-08-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-09-19
(86)【国際出願番号】 EP2017071912
(87)【国際公開番号】W WO2018041973
(87)【国際公開日】2018-03-08
【審査請求日】2020-08-28
(31)【優先権主張番号】1614858.7
(32)【優先日】2016-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1616374.3
(32)【優先日】2016-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1621467.8
(32)【優先日】2016-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1703034.7
(32)【優先日】2017-02-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1707508.6
(32)【優先日】2017-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】517299054
【氏名又は名称】プロキューアール セラピューティクス ツー ベスローテン フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100135943
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 規樹
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】トゥルネン，ジャネ ユハ
(72)【発明者】
【氏名】アールト，アンティ
(72)【発明者】
【氏名】クライン，バート
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン シント フィート，レンカ
(72)【発明者】
【氏名】ブデ，ジュリアン オーギュスト ジェルマン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１６４８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３４４２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３１８８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０９７２１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５２３０８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３５７８５６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Angew. Chem. Int. Ed., 2014, Vol.53, pp.6267-6271
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, Vol.92, pp.8298-8302
【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2013, Vol.110, pp.18285-18290
【文献】ACS Chem. Biol., 2013, Vol.8, No.4, pp.832-839
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を含む、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための組成物であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、前記ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にし、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有さず、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合できる分子内ステム－ループ構造を形成できる部分を含まない、組成物。
【請求項2】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが２’－Ｏ－アルキル修飾を有しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記セントラルトリプレットの１または２個のヌクレオチドが、イノシンで置換されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記セントラルトリプレットにおける中央のヌクレオチド以外の１または２個のヌクレオチドがイノシンで置換されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記糖修飾が、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記ＡＯＮが、ホスホロチオエート、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデートおよび２’－５’ホスホジエステルからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間連結修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結している、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ＡＯＮの前記５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結している、および／またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記塩基修飾が、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、およびシュードウリジンからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドが、シチジンまたはウリジンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＡＯＮ中の前記セントラルトリプレットの外側の１つまたは複数のヌクレオチドが、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチル基などの２’－Ｏ－アルキル基、２’－Ｏ－ＭＯＥ基、２’－Ｆ基、２’－ＮＨ2基、およびＬＮＡ；またはそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記ＡＯＮが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長く、前記ＡＯＮが１００ヌクレオチドよりも短い、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記ＡＯＮが６０ヌクレオチドよりも短い、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記ＡＯＮが１８～７０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＡＯＮが１８～６０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＡＯＮが１８～５０ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項19】
前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ、ＣＥＰ２９０、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ）、もしくはＬＲＲＫ２をコードするか、または前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記標的ＲＮＡ配列が、ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＡ１ＡＴをコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を有するＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、
請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物であって、医薬的に許容される担体を含み、医薬組成物である、組成物。
【請求項22】
細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンの脱アミノ化のためのインビトロの方法であって：（ｉ）請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に提供するステップ；
（ｉｉ）前記組成物中の前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；および
（ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ
を含む、方法。
【請求項23】
（ｖ）前記ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ステップ（ｖ）が：ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；
ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または
ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ、ＣＥＰ２９０、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ）、もしくはＬＲＲＫ２をコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記標的ＲＮＡ配列が、ｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＡ１ＡＴをコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を有するＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学の分野に関する。特に、本発明はＲＮＡ編集の分野に関し、それによりＲＮＡ配列は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化され、遺伝子変異を修正および／または特定の標的ＲＮＡの配列を変化する。より具体的には、本発明は、オリゴヌクレオチドをより安定にし、それらのＲＮＡ編集効率を高める一本鎖ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの化学修飾に関する。
【背景技術】
【0002】
ＲＮＡ編集は、真核生物細胞が、しばしば部位特異的かつ正確な方法で、それらのＲＮＡ分子の配列を変化させ、それによってゲノムにコードされたＲＮＡのレパートリーを数桁増加させる自然プロセスである。ＲＮＡ編集酵素は、動物および植物界全体にわたって真核生物種について記載されており、これらのプロセスは、最も単純な生活形態、例えば、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）からヒトまでの後生動物における細胞ホメオスタシスの管理において重要な役割を果たす。ＲＮＡ編集の例は、それぞれアデノシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼと呼ばれる酵素を介する、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への変換およびシチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）への変換である。最も広く研究されているＲＮＡ編集システムは、アデノシンデアミナーゼ酵素である。
【0003】
アデノシンデアミナーゼは、認識ドメインおよび触媒ドメインを含むマルチドメインタンパク質である。認識ドメインは特異的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）配列および／またはコンフォメーションを認識するが、触媒ドメインは核酸塩基の脱アミノ化によって、多かれ少なかれあらかじめ定義された標的ＲＮＡ内の近くの位置でアデノシンをイノシンに変換する。イノシンは、細胞の翻訳機構によってグアノシンとして読み取られ、編集されたアデノシンがｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのコード領域にある場合、タンパク質配列を再コードすることができることを意味する。
【0004】
ＡからＩへの変換はまた、標的ｍＲＮＡの５’非コード配列において生じ、Ｎ末端に伸長したタンパク質を生じる元の開始部位の上流に新しい翻訳開始部位を生成し得る。編集イベントは３’ＵＴＲでも発生し、ｍｉＲＮＡベースの制御およびポリアデニル化に影響を及ぼす可能性がある。さらに、ＡからＩへの変換はプレｍＲＮＡのイントロンまたはエキソンにおけるスプライス要素内で起き、それによりスプライシングのパターンを変えることがある。結果として、エキソンが含まれるか、またはスキップされ得る。アデノシンデアミナーゼは、ヒトデアミナーゼｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２およびｈＡＤＡＲ３を含むＲＮＡ（ＡＤＡＲ）に作用するアデノシンデアミナーゼと呼ばれる酵素ファミリーの一部である。
【0005】
アデノシンデアミナーゼを適用する標的ＲＮＡを編集するためのオリゴヌクレオチドの使用は当技術分野において公知である。Montiel-Gonzalezら（PNAS 2013.110(45):18285～18290）は、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を認識するバクテリオファージ・ラムダＮタンパク質に融合された、ｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む、遺伝子操作された融合タンパク質を用いた標的ＲＮＡの編集を記載した。天然のＡＤＡＲの基質認識特性を除去するために、ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインで置き換えて、ｈＡＤＡＲ２の天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを除いた。著者らは、Ｎドメイン－デアミナーゼ融合タンパク質による配列特異的認識のためのｂｏｘＢ部分に融合された、編集のための標的配列に相補的な「ガイドＲＮＡ」部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。このようにすることにより、ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドがアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質を標的部位に忠実に方向付けて、標的ＲＮＡのガイドＲＮＡにより方向付けられた部位特異的なＡからＩへの編集がもたらされることがうまく示された。Montiel-Gonzalezら（2013）に開示されたガイドＲＮＡは、長さ５０ヌクレオチドより長い。治療法におけるこの方法の欠点は、切断型天然ＡＤＡＲタンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインに遺伝的に融合したバクテリオファージ・ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインからなる融合タンパク質の必要性である。これは、標的細胞が、大きな障害である融合タンパク質で形質導入されるか、または標的細胞が、発現のために操作されたアデノシンデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸構築物でトランスフェクトされることを必要とする。後者の必要条件は、遺伝子疾患を修正するためのヒト疾患に対する治療などの、多細胞生物における編集が達成される場合には、ささやかな障害ではない。
【0006】
Vogelら（2014. Angewandte Chemie Int Ed 53:267～271）は、ベンジルグアノシン置換ガイドＲＮＡおよびＳＮＡＰタグドメインに遺伝的に融合された（ｄｓＲＮＡ結合ドメインを欠く）ＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作された融合タンパク質（遺伝子操作されたＯ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）を用いた、ｅＣＦＰおよび第Ｖ因子ライデンをコードするＲＮＡの編集を開示した。遺伝子操作された人工デアミナーゼ融合タンパク質は、５’末端Ｏ６－ベンジルグアノシン修飾を介してガイドＲＮＡに共有結合したそのＳＮＡＰタグドメインを介して、培養中のＨｅＬａ細胞の標的ＲＮＡ中の所望の編集部位を標的とすることができるものの、このシステムは、まずＡＤＡＲに遺伝的な修飾を施すことなくシステムを適用し、続いて標的ＲＮＡを有する細胞をトランスフェクションまたは形質導入して、この遺伝子操作されたタンパク質を細胞に提供する方法が明確ではない点で、Montiel-Gonzalezら（2013）によって記載された遺伝子操作されたＡＤＡＲと同様の欠点を有する。明らかに、このシステムは、例えば治療の場において人間への使用には容易に適用できない。
【0007】
Woolfら（1995. Proc Natl Acad Sci USA 92:8298～8302）は、比較的長い一本鎖アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド（長さ２５～５２ヌクレオチド）を使用したより単純な手法を開示しており、そこでは、標的ＲＮＡおよびハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの二本鎖の性質のために、より長いオリゴヌクレオチド（３４－ｍｅｒおよび５２ｍｅｒ）が内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進できた。標的ＲＮＡ配列に１００％相補的であったWoolfら（1995）のオリゴヌクレオチドは、細胞抽出物またはマイクロインジェクションによる両生類（アフリカツメガエル）卵母細胞において機能するようにしか見えず、特異性の重大な欠如に悩まされた：アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的であった標的ＲＮＡ鎖中のほぼ全てのアデノシンが編集された。各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む長さ３４ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが試験され、不活性であることがWoolfら（1995）において示された。ヌクレアーゼに対する安定性を提供するために、５個の５’および３’末端ヌクレオチドにおいて２’－Ｏ－メチル修飾ホスホロチオエートヌクレオチドで修飾された３４－ｍｅｒ ＲＮＡもまた試験された。このオリゴヌクレオチドの中央非修飾領域は、末端修飾がエキソヌクレアーゼ分解に対する保護を提供しつつ、内在性ＡＤＡＲによる標的ＲＮＡの編集を促進することができることが示された。Woolfら（1995）は、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンの脱アミノ化を達成していなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドの未修飾ヌクレオチドの反対側のほぼ全てのアデノシンが編集された（したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５個の５’および３’末端ヌクレオチドが修飾されている場合は、中央非修飾領域のヌクレオチドの反対側のほぼ全てのアデノシン、またはヌクレオチドが修飾されていない場合は、標的ＲＮＡ鎖中のほぼ全てのアデノシン）。ＡＤＡＲはあらゆる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に作用する。「無作為編集」とも呼ばれるプロセスを通じて、この酵素はｄｓＲＮＡの複数のアデノシンを編集する。したがって、そのような無作為編集を回避し、標的ＲＮＡ配列中の特定のアデノシンのみを標的とする方法および手段が必要とされている。Vogelら（2014）は、オリゴヌクレオチド中の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを編集すべきではないアデノシンの反対側の位置で使用し、非修飾ヌクレオチドを標的ＲＮＡ上の特異的に標的化されたアデノシンのすぐ反対側で使用することにより、そのようなオフターゲット編集を抑制することができることを示した。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドと特異的に共有結合を形成する組換えＡＤＡＲ酵素を使用することなく、標的ヌクレオチドにおける特定の編集効果が、その物に起こることは示されていない。
【0008】
国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、ＲＮＡの標的編集のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を開示し、ここでＡＯＮは標的ＲＮＡ配列に相補的な配列によって特徴付けられ（そこでは「標的化部分（targeting portion）」と呼ばれる）、およびステム－ループ構造（そこでは「リクルートメント部分（recruitment portion）」と呼ばれる）の存在によって特徴付けられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、「アキシオマー（axiomer）ＡＯＮ」または「自己ループ化ＡＯＮ」と呼ばれる。リクルートメント部分は、標的配列と標的部分とのハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡに細胞中に存在する天然のＡＤＡＲ酵素をリクルートする際に働く。リクルートメント部分のおかげで、コンジュゲートされた主体または修飾された組換えＡＤＡＲ酵素の存在は必要ない。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、リクルートメント部分が、ＡＤＡＲ酵素のｄｓＲＮＡ結合領域によって認識されることが知られている天然基質（例えば、ＧｌｕＢ受容体）またはＺ－ＤＮＡ構造のいずれかを模倣するステム－ループ構造であると説明している。ステムループ構造は、単一の核酸鎖内に形成された２つの別個の核酸鎖または分子内ステムループ構造によって形成される分子間ステムループ構造であり得る。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているリクルートメント部分のステム－ループ構造は、分子内ステム－ループ構造であり、ＡＯＮ自体内で成され、ＡＤＡＲを誘引することができる。
【0009】
オリゴヌクレオチドを使用するさらに別の編集技術はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとして知られているが、この編集複合体はＤＮＡに作用する。後者の方法は、ガイドオリゴヌクレオチドと共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９酵素の標的細胞またはそれをコードする発現構築物への同時送達が必要であるため、上に記載の操作されたＡＤＡＲシステムと同じ欠点もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記に鑑み、内在性細胞経路および天然に利用可能なＡＤＡＲ酵素を利用して、哺乳動物細胞の内在性核酸を、生物全体においてもなお、先行技術の方法に付随する問題を起こすことなく、特異的に編集できる新しい技術および化合物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、一実施形態では、細胞、好ましくはヒト細胞内で標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いた、前記細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による前記標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のためのＲＮＡ編集への標的手法を提供することによって、先行技術による方法の欠点を排除する；ここで、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレット（Central Triplet）を含み、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドはセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有しておらず；前記セントラルトリプレットの１、２または３個のヌクレオチドは、糖修飾および／または塩基修飾および／またはホスホジエステル修飾（例えば、ホスホロ（ジ）チオエートまたはアミデート）を含む。本発明のＡＯＮは、その基本構造において、一本鎖オリゴリボヌクレオチドであることが好ましい。
【0012】
本発明はまた、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、およびがんからなる群から選択される遺伝的障害の治療または予防における使用のための本発明によるＡＯＮに関する。
【0013】
本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する特定の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって、前記方法は、本発明によるＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；前記ＡＯＮを細胞に取り込ませるステップ；前記ＡＯＮを標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素が、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ；および任意選択で、ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップを含む方法に関する。
【0014】
本発明の好ましい実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａの変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；または１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ；例えば、５４８Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、またはＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５変異を編集するため）をコードするか、または標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】標的アデノシンＡを太字で示した、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ；上鎖）のヒト変異ＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡ配列（下鎖；配列番号１）に対する相補性を示す図である。ここでは、ＡＤＡＲ６０シリーズのＡＯＮの配列がＡＯＮのセントラルトリプレットに下線を引いて、（図２に示されている方向と対比させて）３’から５’に示されている。提供されている例に記載されているように修飾されたセントラルトリプレット内の位置は、文字ＹＸＺで示されている。
【図2-1】本明細書に開示されるＲＮＡ編集および安定性評価を試験するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）およびセンスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）を示す表である。独立した配列は、示される配列番号を有する。特定のＹＸＺ塩基修飾は第３カラムに記載されている。小文字のヌクレオチドはＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチル修飾である。括弧で囲まれたＤＮＡである［ＮＮＮ］ヌクレオチドを除いて、大文字のヌクレオチドはＲＮＡである。（ｎｎｎ）として描かれている小文字のヌクレオチドは、２’－フルオロＲＮＡ修飾ヌクレオチドである。＜ｎｎｎ＞として描かれている小文字のヌクレオチドは、２’－ＮＨ2ＲＮＡ修飾ヌクレオチドである。｛Ｎ｝として示されるヌクレオチドは、アンロックド核酸（Unlocked Nucleic Acid；ＵＮＡ）である。ｉｄＴは、分解に対する耐性を高め、ＰＣＲ増幅中のＡＯＮの３’末端の伸長をブロックする３’インバーテッドＴ修飾も示す。＊＝ホスホロチオエート連結。’＝３’－メチレンホスホネート連結；”＝５’－メチレンホスホネート連結；＾＝３’－ホスホロアミデート連結；＃＝２’－５’ホスホジエステル連結。
【図2-2】同上
【図2-3】同上
【図2-4】同上
【図3】ＦＢＳ含有培地（ＲＸで示す）中でインキュベートした後に変性ゲル電気泳動によりアッセイした、ＡＯＮのヌクレアーゼ耐性を示す図である。対照はＰＢＳ（ＣＴＬ）中でインキュベートした。ＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－１からＡＤＡＲ６０－２１）のアイデンティティはパネルの上に示されている（６０－１から６０－２１と省略、図２も参照）。下のバンド（矢印で示す）はＡＯＮの切断から生じる分解生成物であり、上のバンドは全長のＡＯＮである。マーカーレーンは、５ｎｔ（１０ｎｔ～５０ｎｔ）および１０ｎｔ（５０ｎｔ～１００ｎｔ）の増分で１４個のオリゴヌクレオチドフラグメントを有する、１０～１００ｎｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の低分子量マーカーを含む。分解に対する感受性はバンドの比率によって示され、より低い生成物のより高い蔓延はより低い安定性を示唆する。
【図4】標的アデノシンＡを太字で示した、ヒト変異ＩＤＵＡ標的ＲＮＡ配列（下鎖；配列番号２）に対するＡＯＮ（上鎖）の相補性を示す図である。ここでは、ＡＤＡＲ６８シリーズのＡＯＮの配列がＡＯＮのセントラルトリプレットに下線を引いて、（図２に示されている方向と対比させて）３’から５’に示されている。提供されている例に記載されているように修飾されたセントラルトリプレット内の位置は、文字ＸＸＹで示されている。
【図5】ＦＢＳ含有培地中でインキュベートした後に変性ゲル電気泳動によってアッセイした、変異マウスＩｄｕａ遺伝子（Ｈｕｒｌｅｒモデル）に対するオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６５－１、－１８、－２０、－２１、および－２２の安定性を示す図である。対照はＰＢＳ中でインキュベートした。矢印は分解生成物を指す。上のバンドは全長ＡＯＮである。マーカーレーン（Ｍ）は、５ｎｔ（１０ｎｔ～５０ｎｔ）および１０ｎｔ（５０ｎｔ～１００ｎｔ）の増分で１４個のオリゴヌクレオチドフラグメントを有する、低分子量マーカー、１０～１００ｎｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含む。２つの異なる時間のインキュベーション（２時間および１８時間）にわたる分解に対するＡＯＮ感受性はバンドの比によって示され、より低い生成物のより高い蔓延は安定性の減少を示唆する。
【図7】４つのＡＤＡＲ９３オリゴヌクレオチドの安定性を示す図である。その中でＡＤＡＲ９３－２はセントラルトリプレットに修飾されていないＲＮＡを含み、代わりに他の３つ（ＡＤＡＲ９３－６、－８、および－９）はセントラルトリプレットに２つまたは３つのＤＮＡヌクレオチドを有する。さらなる修飾の違いは、図２に示すとおりである。安定性は、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ、単一ドナーヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）および混合ジェンダーヒト肝臓リソソーム（Ｌｙｓｏ）（Mixed Gender Human Liver Lysosomes）中で２時間、２４時間または３日間インキュベートした後、変性ゲル電気泳動によってアッセイした。
【図8】過剰発現されたＡＤＡＲ２を有するＨＥＫ２９３細胞溶解物およびＳＥＲＰＩＮＡ１変異体ｓｓＲＮＡ標的を用いたインビトロ編集アッセイ後にＲＴ－ＰＣＲによって生成されたＰＣＲフラグメントのサンガー配列決定分析を示す図である。ＡＤＡＲ６０－１（Ａ）およびＡＤＡＲ６０－１５（Ｂ）を使用した。図２を参照。陰性対照は、細胞溶解物を含まないことを除いてＡＤＡＲ６０－１５と同一のアッセイであり（Ｃ）、ＡＯＮの非存在下でＨＥＫ２９３細胞溶解物（ＡＤＡＲ２過剰発現を含む）を用いた同一のアッセイであった（Ｄ）。全てのパネルの上の配列は配列番号３５である。
【図9】ＧＦＰ Ｗ５７Ｘ構築物を安定に発現し、ＡＤＡＲ２および２つのオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ５９～２およびＡＤＡＲ５９～１０）で別々にトランスフェクトされた細胞からのＲＴ－ＰＣＲ増幅ＧＦＰ ＲＮＡの配列決定結果を示す図である。ここで、ＡＤＡＲ５９－１０のセントラルトリプレットのアデニンは、２－アミノプリンである。ＡＤＡＲ５９－２はその修飾を有していない。図２を参照。それは、ＲＮＡ編集効率に対するこの特定の修飾の増強効果を示す。両方のパネルの上の配列は配列番号３６である。
【図10-1】トランスフェクトされていない（ＮＴ、左パネル）か、または非標的化対照オリゴヌクレオチド（ＮＴＯ、中央パネル）またはマウスＳｎｒｐａ ｍＲＮＡの終止コドンを編集するためのＡＤＡＲ９４－１（右パネル）を用いてトランスフェクトされた、マウスＨＥＰＡ１－６細胞（Ａ）およびＣＭＴ６４細胞（Ｂ）から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを介して生成されたＰＣＲ産物の配列決定結果を示す図である。バックグラウンドレベルを明らかに上回るＲＮＡ編集が矢印で示される位置で観察される。ＡおよびＢにおける３つの全てのパネルの上の配列は配列番号３７である。
【図10-2】同上
【図11】図１０に記載のように、ＡＤＡＲ９４－１単独またはＡＤＡＲ９４－１をＳＯＮ２と組み合わせてトランスフェクトしたマウスＨＥＰＡ１－６細胞から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを介して生成したＰＣＲ産物の配列決定結果を示す図である。両パネルの上の配列は配列番号３８である。
【図12】トランスフェクションされていない（ＮＴ、左パネル）か、保護センスオリゴヌクレオチドＳＯＮ２にアニールされた対照オリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ８７－１）（中央パネル）または、ＳＯＮ２にアニールされたマウスＳｎｒｐａ ＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ９４－１）（右パネル）を用いてトランスフェクトされた、初代マウス肺細胞から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを介して生成されたＰＣＲ産物の配列決定結果を示す図である。Ｇシグナルの明らかな増加が、ＡＤＡＲ９４－１＋ＳＯＮ２でのトランスフェクション後に見られ（矢印で示す位置）、これは、ｅｘ ｖｉｖｏ初代細胞において非常に特異的かつ有意なＲＮＡ編集が内在性標的上の内在性ＡＤＡＲを用いて達成できることを示す。３つの全てのパネルの上の配列は、図１０と同一の配列番号３７である。
【図13】ｄｄＰＣＲによって測定された全標的ＲＮＡ中の編集されたｍＲＮＡの百分率としてのＡＯＮの編集能力を示す図である。ＮＴ：無処理。
【図14】ＲＮＡ編集ＡＯＮでトランスフェクションした時のＲＮＡ編集の結果であるｗｔ Ｉｄｕａ ｍＲＮＡの存在の指標である、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼアッセイで測定した酵素活性（全タンパク質濃度に対して正規化した相対蛍光単位として）を示す図である。変異Ｉｄｕａ遺伝子を有するマウス胚性線維芽細胞に、マウス変異Ｉｄｕａ遺伝子も発現する発現プラスミドをトランスフェクトし、続いて示したようにＡＯＮをトランスフェクトした。２つの重複測定からの平均活性および標準偏差が各ＡＯＮについて示されている。ＮＴ：ＡＯＮでトランスフェクションされていない。
【発明を実施するための形態】
【0016】
上述のように、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、ＲＮＡの標的化編集のためのＡＯＮを開示し、ここでＡＯＮは、「標的化部分」および「リクルートメント部分」によって特徴付けられる。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットは、天然基質（例えば、ＧｌｕＢ受容体）またはＡＤＡＲ酵素のｄｓＲＮＡ結合領域によって認識されることが知られているＺ－ＤＮＡ構造のいずれかを模倣するステム－ループ構造であるとしてリクルートメント部分を記載している。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されるようなリクルートメント部分のステム－ループ構造は、ＡＯＮ自体の内部に形成され、そしてＡＤＡＲを誘引することができる分子内ステム－ループ構造である。製造上の問題、安定性、副作用など、そのような構造のために非常に長いＡＯＮを有することには潜在的な不都合があり、それらはより短いバージョンよりも作成するのに費用がかかる。
【0017】
本発明のＡＯＮは、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載されているリクルートメント部分を含まない。本発明のＡＯＮは、分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まない。本発明のＡＯＮはより短く、生成するのがより安く、使用が容易で製造が容易である。さらに、ＡＤＡＲ酵素を細胞内の正常な機能から潜在的に隔離するという欠点を有していない。予期しないことに、ＡＯＮが相補的であるが重要なことに、上記のようなリクルートメント部分を欠いている標的ＲＮＡ配列中に存在する標的アデノシンを脱アミノ化するための標的ＲＮＡに相補的であるＡＯＮは、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素をなお利用して標的アデノシンを編集することができるようであることが見出された。好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、標的アデノシンの位置にミスマッチを含み、反対側のヌクレオチドはシチジンである。また、ウリジンが標的アデノシンの反対側の場合（実際にはミスマッチではないが）、ＡＯＮは標的アデノシンの脱アミノ化を引き起こすことができる。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７は、さらなるミスマッチ（形成されたｄｓＲＮＡ中で、ワトソン－クリック塩基対合則に従って標的ＲＮＡと完全な塩基対を形成しないＡＯＮ中のヌクレオチドにより生じる、いわゆる「バルジ」をもたらす）は許容可能であり、ある場合には好ましいが、標的ＲＮＡ配列の特定の標的編集には必須ではないことを記載している。ＡＯＮ中のバルジの数（そのＲＮＡ標的配列にハイブリダイズする場合）は、ＡＯＮの長さ依存して、１つ（通常、標的アデノシン位置に形成されるバルジ）またはそれ以上であり得る。追加のバルジ誘導性ミスマッチは、標的アデノシンの上流および下流にあり得る。バルジは、単一ミスマッチバルジ（１つのミスマッチ塩基対によって引き起こされる）またはマルチミスマッチバルジ（２つ以上の連続するミスマッチ塩基対によって、好ましくは２つまたは３つの連続するミスマッチ塩基対によって引き起こされる）であり得る。
【0018】
本発明によるＡＯＮは、本発明のＡＯＮを（かなり）短くすることを可能にするヘアピンまたはステムループ構造を必要としないという点で、国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットおよびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７に記載されているオリゴヌクレオチドを超える特定の利点を有する。国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットに記載のオリゴヌクレオチドは、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素を隔離する潜在的な危険性を有する。この文脈で隔離するということは、天然ＡＤＡＲタンパク質が、オリゴヌクレオチドの標的化部分と標的ＲＮＡとの間にｄｓＲＮＡ複合体が形成されていなくても、オリゴヌクレオチドに結合し得ることを意味する。分子内ステム－ループ構造の存在による、オリゴヌクレオチドへのＡＤＡＲのこの直接的な結合は、標的ＲＮＡ配列の非存在下で、分子内ステムループ構造を形成することができる部分を含まない本発明のＡＯＮを用いる場合には起こらない。多くの場合はヘアピンおよび／または（ステム）ループ構造の存在が好ましくは回避される。
【0019】
ＡＯＮが１つまたは複数の糖修飾を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含むことは本発明の重要な態様である。それによって、ＡＯＮの単一ヌクレオチドは、１つまたは複数の糖修飾を有することができる。ＡＯＮ内では、１つまたは複数のヌクレオチドがそのような糖修飾を有することができる。
【0020】
編集が必要なヌクレオチドの反対側の本発明のＡＯＮ内のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含まないこと（本明細書および他の箇所でしばしば２’－ＯＭｅ基、２’－Ｏ－メチル化、または２’－Ｏ－メチル基と呼ばれる）は本発明の重要な態様である。このヌクレオチドの３’および５’に直接隣接するヌクレオチド（セントラルトリプレットにおける「隣接ヌクレオチド」）もそのような化学修飾を欠いていることが好ましいが、隣接ヌクレオチドの一方または両方が２’－Ｏ－アルキル基（２’－Ｏ－メチル基など）を含み得ることが許容されると考えられる。セントラルトリプレットの一方または両方の隣接ヌクレオチドまたは３つの全てのヌクレオチドは、２’－ＯＨまたは（本明細書で定義されているような）互換性のある置換基であり得る。
【0021】
本発明のＡＯＮの別の重要な態様は、それがＡＯＮ自体を、生理学的条件下で潜在的にＡＤＡＲを隔離する構造として作用し得る分子内ヘアピンまたは他のタイプの（ステム－）ループ構造（本明細書においては、「自動ルーピング」または「自己ルーピング」とも呼ぶ）に折りたたむことを可能にする部分（これは標的配列または標的アデノシンを含む領域に相補的ではない）を有さないことである。好ましい態様では、本発明の一本鎖ＡＯＮは、標的ＲＮＡと完全に相補的であるが、場合によってはいくつかの位置、特に標的アデノシンの位置でミスマッチがあってもよい。
【0022】
本発明の好ましいＡＯＮは、Vogelら（2014）とは対照的に、５’末端Ｏ６－ベンジルグアノシンまたは５’末端アミノ修飾を含まず、ＳＮＡＰタグドメイン（操作されたＯ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ）に共有結合していない。ＳＮＡＰタグドメインは、ヒトＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に由来し、Ｏ６－ベンジルグアノシン誘導体を用いて生細胞中で共有結合的に標識することができる。Vogelら（2014）は、全長２０または１７ヌクレオチドのガイドＲＮＡを開示しており、５’末端の最初の３ヌクレオチドは標的ＲＮＡ配列に結合しないが、ガイドＲＮＡをＳＮＡＰタグドメインに結合している。標的ＲＮＡ配列に結合するガイドＲＮＡの部分は、したがって１４または１７ヌクレオチドの長さである。５’末端Ｏ６－ベンジルグアノシン修飾の代わりに５’末端アミノ修飾を有する、同じ長さのガイドＲＮＡもまたVogelら（2014）に開示されているが、しかしながら、非常にわずか、または全く脱アミノ化または標的ＲＮＡ配列が検出されなかった。一実施形態では、本発明のＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列との０、１、２または３個のミスマッチを含み、ここで単一のミスマッチは複数の連続したヌクレオチドを含み得る。
【0023】
同様に、Montiel-Gonzalezら（2013）とは対照的に、本発明の好ましいＡＯＮは、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列を含まない。Montiel-Gonzalezら（2013）で使用されているｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列は、バクテリオファージ・ラムダＮ－タンパク質によって認識される、１７ヌクレオチドの短い一続きのＲＮＡである。バクテリオファージの初期オペロンにおける下流遺伝子の転写は、ｎｕｔとして知られるプロモーター近位エレメントを必要とする。この部位はＲＮＡの形でシスに作用して、バクテリオファージ・ラムダＮタンパク質および宿主因子からなる転写抗終結複合体を組み立てる。ｎｕｔ部位ＲＮＡは、ｂｏｘＢと呼ばれる小さなステムループ構造を含む。ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列は、ヘアピン（ステム－ループ）構造を形成する可能性を有する中断パリンドロームとして当該技術分野において知られている。その配列は、異なるゲノム特異的Ｎホモログをコードするバクテリオファージ・ラムダの類縁体間で異なる。Vogelら（2014）もMontiel-Gonzalezら（2013）も細胞内に存在する哺乳動物のＡＤＡＲ酵素を使用していないが、そのＡＤＡＲ酵素は野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む。Vogelら（2014）は、ＳＮＡＰタグドメインに融合したＡＤＡＲ１または２のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作融合タンパク質を使用し、Montiel-Gonzalezらは、バクテリオファージ・ラムダＮタンパク質のｂｏｘＢ認識ドメインに融合した、ｈＡＤＡＲ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼドメインを含む遺伝子操作融合タンパク質を使用している。先行技術とは対照的に、本発明のＡＯＮは、野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む、細胞内に存在する哺乳動物のＡＤＡＲ酵素を使用している。したがって、ＡＤＡＲのリクルートメントを可能にするために、ｂｏｘＢ ＲＮＡヘアピン配列、５’末端Ｏ６－ベンジルグアノシン、５’末端アミノ修飾、またはＳＮＡＰタグドメインを本発明のＡＯＮに組み込む必要はない。したがって、本発明によるＡＯＮは、Vogelら（2014）およびMontiel-Gonzalezら（2013）に記載のオリゴヌクレオチドに対して特定の長所を有する。本発明によるＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンを特異的に編集するために、内在性細胞経路と天然に入手可能なＡＤＡＲ酵素を利用することができる。一実施形態では、本発明のＡＯＮは、ヒトＯ６－アルキルグアノシン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼに共有結合していない。好ましくは、本発明のＡＯＮはポリペプチドに共有結合していない。本発明のＡＯＮの別の態様では、ＡＯＮは５’キャップを有しない。真核生物において、５’キャップは、５’から５’三リン酸連結を介してＲＮＡに接続したグアノシンヌクレオチドからなる。このグアノシンは７位がメチル化されており、７－メチルグアノシンと呼ばれる。
【0024】
本発明のＡＯＮは、標的ＲＮＡ配列中の特定の標的アデノシンヌクレオチドを脱アミノ化が可能である。したがって、理想的には１つのアデノシンのみが脱アミノ化される。あるいは、例えば標的アデノシンが互いに極めて接近している場合、１、２、または３個のアデノシンヌクレオチドが脱アミノ化される。その時、単一のＡＯＮ内に２つ以上の「セントラルトリプレット」の存在が必要であり、距離によってはこれを使用することができる。しかしながら、距離が大きすぎて単一のＡＯＮによって複数の標的アデノシンをカバーすることができない場合、ＡＯＮは、好ましくは、特定の単一の標的アデノシンの反対側に１つのセントラルトリプレットのみを含む。
【0025】
本発明のＡＯＮの特徴を踏まえると、修飾された組換えＡＤＡＲ発現の存在は不要であり、ＡＯＮに結合したコンジュゲート主体、または標的ＲＮＡ配列に相補的ではない長いリクルートメント部分の存在は不要である。それに加えて、本発明のＡＯＮは、野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む天然のＡＤＡＲ酵素による、標的ＲＮＡ配列に存在する標的アデノシンのイノシンへの特異的脱アミノ化を、ｄｓＲＮＡ複合体における他の場所での無作為編集の危険無く、可能にする。
【0026】
標的部位へのシチジンデアミナーゼのリクルートメントは、アデノシンデアミナーゼｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２の場合と同じように機能する。しかしながら、シチジンデアミナーゼは異なる結合要件を有し、シチジンの編集を決定するそれらの標的ＲＮＡ配列中の異なる構造を認識する。１つの特によく研究されているシチジンデアミナーゼはヒトＡｐｏｂｅｃ１である。オリゴヌクレオチド構築物を用いて編集部位を標的とし、常在性の天然に存在する編集主体をリクルートするためのＲＮＡ編集の一般原則は、シチジンデアミナーゼについて同じであり、本明細書に開示および請求される発明の一部である。
【0027】
ＡＤＡＲ酵素の天然標的の解析により、これらが一般に、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２によって編集されたＲＮＡらせんを形成する２本の鎖間にミスマッチを含むことが示された。これらのミスマッチは編集反応の特異性を高めることが示唆されている（Stefl et al. 2006. Structure 14(2):345-355; Tian et al. 2011. Nucleic Acids Res 39(13):5669-5681）。ＡＯＮと標的ＲＮＡとの間の対合／ミスマッチヌクレオチドの最適パターンの特徴付けもまた、効率的なＡＤＡＲベースのＡＯＮ療法の開発にとって極めて重要であると思われる。
【0028】
本発明のＡＯＮの別の改善された特徴は、安定性ならびに適切なＡＤＡＲ結合および活性を確証するために所定の箇所で特定のヌクレオチド修飾を使用することである。これらの変化は変動してもよく、そしてＡＯＮの骨格、ヌクレオチドの糖部分、ならびに核酸塩基またはホスホジエステル連結における修飾を含んでもよい。それらはまた、ＡＯＮの配列全体にわたって様々に分布し得る。ＡＤＡＲ酵素のＲＮＡ結合ドメイン内、ならびにデアミナーゼドメイン内の異なるアミノ酸残基の相互作用を支援するために、特定の修飾が必要となり得る。例えば、ヌクレオチド間のホスホロチオエート連結、または２’－Ｏ－メチル修飾は、ＡＯＮのいくつかの部分では許容され得るが、他の部分では、リン酸および２’－ＯＨ基と酵素との重要な相互作用を乱さないように避けるべきである。これらの設計規則の一部は、公開されているＡＤＡＲ２の構造に基づいているが、その他は経験的に定義される必要がある。ＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２とは異なる嗜好性が存在するかもしれない。修飾はまた、それらがＡＯＮの分解を防ぐように選択されるべきである。
【0029】
標的配列がＡＤＡＲ編集に最適ではない場合には、基質ＲＮＡに対する編集活性を高めるために特定のヌクレオチド修飾もまた必要であり得る。特定の配列コンテキストが編集により適していることが以前の研究により確証されている。例えば、標的配列５’－ＵＡＧ－３’（中央に標的Ａを有する）はＡＤＡＲ２にとって最も好ましい最近傍ヌクレオチドを含むが、一方、５’－ＣＡＡ－３’標的配列は好まれない（Schneider et al. 2014. Nucleic Acids Res 42(10):e87）。標的トリヌクレオチドの反対側のヌクレオチドを慎重に選択することによって編集が高まる可能性が、ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの最近の構造解析により示唆された。例えば、（中央に形成されたＡ－Ｃミスマッチを有する）反対鎖上の３’－ＧＣＵ－５’配列と対になった５’－ＣＡＡ－３’標的配列は、グアノシン塩基がＡＤＡＲ２のアミノ酸側鎖と立体的に衝突するため好ましくない。しかしながら、ここでは、イノシンなどのより小さな核酸塩基が、対抗するシトシンに対する塩基対合能力を依然として保持しながら、立体衝突を引き起こすことなく潜在的にこの位置によりよく適合することができると仮定される。最適以下の配列の活性を高めることができる修飾には、ＡＯＮの柔軟性を増大させるか、または逆にそれを編集に有利な立体配座に強制する骨格修飾の使用を含む。
【0030】
本明細書で使用される用語の定義
本明細書で使用および定義される「セントラルトリプレット」は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの反対側の３つのヌクレオチドであり、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは標的アデノシンの直接反対側である。セントラルトリプレットは、ＡＯＮの中心（中央）である必要はなく、どちらが特定の標的として好ましくともＡＯＮの３’側と５’側のどちらに配置してもかまいない。したがって、この態様の中心は、化学修飾および標的アデノシンを標的とすることに関しては、触媒活性の中心にあるトリプレットの意味をより多く有する。また、特に標的配列が５’から３’に表示されている場合は、ＡＯＮが３’から５’に表示されることがあることに留意されたい。しかしながら、本明細書においてＡＯＮ内のヌクレオチドの順序が論じられるときは、それはいつでもＡＯＮの５’から３’である。例えば、ＡＤＡＲ６０－１のセントラルトリプレットの最初のヌクレオチドは、５’－ＵＣＧ－３’トリプレットのＵである。その位置は、５’から３’への方向性をなお遵守しながら、ＡＯＮ内の特定のヌクレオチドに関して表現することもでき、その場合、前記ヌクレオチドの他の５’ヌクレオチドは負の位置としてマークされ、その３’は正の位置としてマークされる。例えば、セントラルトリプレットのＣは標的アデノシンの反対側のヌクレオチド（０位）であり、Ｕはこの場合－１ヌクレオチドであり、そしてＧは＋１ヌクレオチドである、などである。
本明細書で使用および定義される「セントラルトリプレット」は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの反対側の３つのヌクレオチドであり、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは標的アデノシンの直接反対側である。セントラルトリプレットは、ＡＯＮの中心（中央）である必要はなく、どちらが特定の標的として好ましくともＡＯＮの３’側と５’側のどちらに配置してもかまいない。したがって、この態様の中心は、化学修飾および標的アデノシンを標的とすることに関しては、触媒活性の中心にあるトリプレットの意味をより多く有する。また、特に標的配列が５’から３’に表示されている場合は、ＡＯＮが３’から５’に表示されることがあることに留意されたい。しかしながら、本明細書においてＡＯＮ内のヌクレオチドの順序が論じられるときは、それはいつでもＡＯＮの５’から３’である。例えば、ＡＤＡＲ６０－１のセントラルトリプレットの最初のヌクレオチドは、５’－ＵＣＧ－３’トリプレットのＵである。その位置は、５’から３’への方向性をなお遵守しながら、ＡＯＮ内の特定のヌクレオチドに関して表現することもでき、その場合、前記ヌクレオチドの他の５’ヌクレオチドは負の位置としてマークされ、その３’は正の位置としてマークされる。例えば、セントラルトリプレットのＣは標的アデノシンの反対側のヌクレオチド（０位）であり、Ｕはこの場合－１ヌクレオチドであり、そしてＧは＋１ヌクレオチドである、などである。
【0031】
本明細書に概説したように、そして本明細書に開示したＡＯＮのほとんどの例において、セントラルトリプレットの外側のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾されている。しかしながら、これは本発明のＡＯＮの要件ではない。それらのヌクレオチドにおける２’－Ｏ－メチル化の使用は、ＡＯＮのそれらの部分の適切な安定性を確証するが、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾などの他の修飾も同様に適用され得る。
【0032】
本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」（イノシン中の核酸塩基）という用語は、そのような核酸塩基を指す。
【0033】
「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。
【0034】
「ヌクレオシド」という用語は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。
【0035】
「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基－（デオキシ）リボシル－ホスホリンカー、ならびにそのリボース部分またはホスホ基の任意の化学修飾を指す。したがって、この用語は、固定化リボシル部分（メチレン基または任意の他の基を含む２’－４’架橋を含む、当技術分野で周知である）を含むヌクレオチド、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートリンカーなどを含むリンカーを含むヌクレオチドを含む。
【0036】
アデノシンとアデニン、グアノシンとグアニン、シトシンとシチジン、ウラシルとウリジン、チミンとチミジン、イノシンとヒポキサンチンという用語は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指すために互換的に使用されることがある。
【0037】
文脈が異なることが明らかに必要でない限り、核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は互換的に使用されることがある。
【0038】
「オリゴヌクレオチド」に言及するときはいつでも、文脈がそうでないことを指示しない限り、オリゴリボヌクレオチドおよびデオキシオリゴリボヌクレオチドの両方が意味される。「オリゴリボヌクレオチド」に言及するときはいつでも、それは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＩを含み得る。「デオキシオリゴリボヌクレオチド」に言及するときはいつでも、それは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＩを含み得る。好ましい態様では、本発明のＡＯＮは化学修飾を含み得るオリゴリボヌクレオチドである。
【0039】
オリゴヌクレオチド構築物中でシトシンなどのヌクレオチドが言及されるときはいつでも、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、ピロロシチジン、およびβ－Ｄ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシンが含まれ；アデニンが言及されるときは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、Ｎ６－メチルアデニンおよび７－メチルアデニンが含まれ；ウラシルが言及されるときは、５－メトキシウラシル、５－メチルウラシル、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、およびチエノウラシル、ジヒドロウラシル、４－チオウラシルおよび５－ヒドロキシメチルウラシルが含まれ；グアノシンが言及されるときは、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシンおよび１－メチルグアノシンが含まれる。
【0040】
ヌクレオシドまたはヌクレオチドに言及するときはいつでも、例えば２’－デオキシ、２’－ヒドロキシ、２－フルオロリボース、および２’－Ｏ－メチルなどの２’－Ｏ－置換変異体などのリボフラノース誘導体、ならびに２’－４’架橋変異体を含む他の修飾が含まれる。
【0041】
オリゴヌクレオチドについて言及するときはいつでも、２つのモノヌクレオチド間の連結はホスホジエステル連結ならびに、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロ（ジ）チオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデートリンカーなどを含むその修飾であってもよい。
【0042】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」および「からなる（consisting）」を包含する。例えば、「Ｘを含む」組成物は、Ｘのみからなってもよく、または例えばＸ＋Ｙのようにさらなる何かを含んでもよい。
【0043】
数値ｘに関して「約」という用語は任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【0044】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではない。例えば、「Ｙを実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。関連する場合には、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略されることがある。
【0045】
核酸配列に関して「下流」という用語は、さらに３’方向に配列に沿うことを意味し；「上流」という用語はその逆を意味する。したがって、ポリペプチドをコードする任意の配列において、開始コドンはセンス鎖において終止コドンの上流にあるが、アンチセンス鎖において終止コドンの下流にある。
【0046】
「ハイブリダイゼーション」への言及は典型的には特異的ハイブリダイゼーションを指し、非特異的ハイブリダイゼーションを除外する。プローブと標的との間の安定な相互作用の大部分が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性をプローブと標的とが有する場合であることが確実であるように、当技術分野において周知の技術を用いて、選択した実験条件下で特異的ハイブリダイゼーションを起こすことができる。
【0047】
「ミスマッチ」という用語は、ワトソン－クリック型塩基対合則に従って完全な塩基対を形成しない、二本鎖ＲＮＡ複合体中の対向するヌクレオチドを指すために本明細書中で使用される。ミスマッチ塩基対は、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ塩基対である。いくつかの実施形態では、本発明のＡＯＮは、０、１、２または３個のミスマッチを含み、ここで単一のミスマッチはいくつかの連続したヌクレオチドを含み得る。ゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｕ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ａ、およびＩ－Ｃ塩基対である。
【0048】
本発明によるＡＯＮは、例えば、すべてのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル化糖部分（２’－ＯＭｅ）を提供することによって、ほぼ完全に化学修飾されていてもよい。しかしながら、標的アデノシンの反対側のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を含まず、そしてなおさらなる好ましい態様において、標的アデノシンの反対側のヌクレオチドに隣り合う２つの隣接ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは２’－Ｏ－メチル修飾を含まない。ＡＯＮ内の全てのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾（セントラルトリプレットを含む）を保持する完全修飾は、おそらくそれが標的位置でのＡＤＡＲ活性を妨げるため、ＲＮＡ編集に関する限り非機能的オリゴヌクレオチドをもたらす。一般に、標的ＲＮＡ中のアデノシンは、反対側のヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル基を有する提供することによって、編集から保護することができ、または対向する塩基としてグアノシンもしくはアデノシンを提供することによってもまた、これらの２つの核酸塩基は対向するアデノシンの編集を減少させることができる。
【0049】
本発明に従って容易に使用することができるオリゴヌクレオチドの分野において様々な化学的性質および修飾が知られている。ヌクレオチド間の通常のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル結合のモノチオール化またはジチオール化によって、それぞれホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルを生じることによって改変され得る。アミド化およびペプチドリンカーを含む、ヌクレオシド間連結の他の修飾が可能である。好ましい態様において、本発明のＡＯＮは、ＡＯＮの最末端のヌクレオチド間（したがって、好ましくは５’および３’末端の両方）に１、２、３、４またはそれ以上のホスホロチオエート連結を有し、４つのホスホロチオエート連結の場合、最終的に５つのヌクレオチドがそれに応じて結合されることを意味する。そのような連結の数は、標的配列に応じて、または毒性などの他の態様に基づいて、各末端で異なり得ることが当業者には理解されよう。
【0050】
リボース糖は、低級アルキル（２’－Ｏ－メチルなどのＣ１－４）、アルケニル（Ｃ２－４）、アルキニル（Ｃ２－４）、メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、－Ｈ（ＤＮＡにおけるように）または他の置換基による２’－Ｏ部分の置換によって修飾されてもよい。２’－ＯＨ基の好ましい置換基は、メチル、メトキシエチルまたは３，３’－ジメチルアリル基である。後者は、その嵩高さのためにヌクレアーゼ感受性を阻害する一方で、ハイブリダイゼーションの効率を改善するというその性質で知られている（Angus & Sproat 1993 FEBS Vol. 325, no. 1, 2, 123-7）。あるいは、リボース環の内側に２’－４’分子内架橋（通常２’酸素と４’炭素の間のメチレン架橋）連結を含む、ロックド核酸配列（ＬＮＡ）を適用してもよい。プリン核酸塩基および／またはピリミジン核酸塩基は、例えば複素環式環のアミノ化または脱アミノ化によってそれらの特性を変えるように修飾することができる。正確な化学的性質およびフォーマットは、オリゴヌクレオチド構築物ごとに、および用途ごとに異なってもよく、そして当業者の希望および好みに従って解決してもよい。オリゴヌクレオチド中の４個以上の連続したＤＮＡヌクレオチド（４個の連続デオキシリボース）がいわゆるギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）を生成し、それらがそれらのＲＮＡ同族配列にアニーリングすると、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を誘導すると当該技術分野では考えられている。本発明によれば、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断は一般にできるだけ避けるべきである。
【0051】
本発明によるＡＯＮは、通常、１０ヌクレオチドより長く、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６より多く、さらにより好ましくは１７ヌクレオチドより多くあるべきである。一実施形態では、本発明によるＡＯＮは、２０ヌクレオチドより長い。本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは１００ヌクレオチドより短く、さらにより好ましくは６０ヌクレオチドより短い。一実施形態では、本発明によるＡＯＮは、５０ヌクレオチドより短い。好ましい態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、１８～７０ヌクレオチドを含み、より好ましくは１８～６０ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは１８～５０ヌクレオチドを含む。したがって、最も好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドを含む。
【0052】
（ヒトＡＤＡＲ酵素などの）ＲＮＡ編集主体が、いくつかの要因に依存して異なる特異性でｄｓＲＮＡ構造を編集することは、当技術分野において公知である。１つの重要な要因は、ｄｓＲＮＡ配列を構成する二本鎖の相補性の程度である。二本鎖の完全な相補性は通常、ｈＡＤＡＲの触媒ドメインに非識別的にアデノシンを脱アミノ化させ、遭遇するあらゆるアデノシンと多かれ少なかれ反応する。ｈＡＤＡＲ１および２の特異性は、ｄｓＲＮＡ中にいくつかのミスマッチを確実にすることによって増加させることができ、それはおそらく明らかに定義されていない方法でｄｓＲＮＡ結合ドメインを配置するのを助ける。さらに、脱アミノ化反応それ自体は、編集されるべきアデノシンの反対側のミスマッチを含むＡＯＮを提供することによって増強され得る。ミスマッチは、好ましくは、編集されるべきアデノシンの反対側にシチジンを有する標的部分を提供することによって作り出される。代替として、ウリジンもアデノシンの反対側に使用することができるが、これは、当然のことながら、ＵとＡが対になっているため、「ミスマッチ」を生じないと予想される。標的鎖のアデノシンが脱アミノ化されると、標的鎖はイノシンを得るが、これは、ほとんどの生化学的プロセスで、細胞の生化学的機構によってＧとして「読み取られる」ことになる。したがって、Ｉは本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の標的部分における反対側のＣと完全に塩基対合することができるので、ＡからＩへの変換後、ミスマッチは解決される。ミスマッチが編集により解決された後、基質が解放され、そしてオリゴヌクレオチド構築物－編集主体複合体が標的ＲＮＡ配列から解放され、それは次にスプライシングおよび翻訳などの下流生化学プロセスに利用可能になる。
【0053】
標的ＲＮＡ配列編集の特異性の所望のレベルは、用途ごとに異なってもよい。本特許出願の指示に従って、当業者は、それらの必要性に従ってオリゴヌクレオチドの相補的部分を設計することができ、そして、いくらかの試行錯誤で、所望の結果を得ることができる。
【0054】
本発明のオリゴヌクレオチドは通常、通常のヌクレオチドＡ、Ｇ、ＵおよびＣを含むが、例えば１つまたは複数のＧヌクレオチドの代わりにイノシン（Ｉ）も含み得る。
【0055】
オリゴヌクレオチド構築物と重複する領域における標的ＲＮＡ配列中のアデノシンの望ましくない編集を防ぐために、オリゴヌクレオチドを化学的に修飾することができる。標的ＲＮＡ配列中のアデノシンの反対側のヌクレオシドのリボシル部分の２’－Ｏ－メチル化は、ＡＤＡＲによるそのアデノシンの脱アミノ化を劇的に減少させることが当該技術分野において示されている（Vogelら、2014）。これは、治療環境においてそのようなＡＯＮを使用することに対する重大な欠点であり、ＡＯＮ中にそれを分解し易くする未修飾ＲＮＡヌクレオチドを有するという問題を少なくとも部分的に解決することが本発明の目的である。
【0056】
細胞内のＲＮＡ編集分子は、通常、哺乳動物を含む後生動物に見られるＡＤＡＲ酵素のように、本質的にタンパク質性と予想される。好ましくは、編集主体は酵素、より好ましくはアデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼ、さらにより好ましくはアデノシンデアミナーゼである。最も興味深いものは、ヒトＡＤＡＲ、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２であり、それらの任意のアイソフォーム、例えばｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０およびｐ１５０が含まれる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を都合よく設計できるようにするための、当技術分野において公知のＲＮＡ編集酵素には、ヒトまたはヒト細胞におけるｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２などのＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ならびにシチジンデアミナーゼが含まれる。ヒトＡＤＡＲ３（ｈＡＤＡＲ３）は先行技術に記載されているが、デアミナーゼ活性を有さないと報告されている。ｈＡＤＡＲ１は２つのアイソフォームで存在することが知られている；共通のプレｍＲＮＡからのオルタナティブスプライシングにより産生される、長い１５０ｋＤａのインターフェロン誘導型およびより短い１００ｋＤａ型である。その結果、細胞内に存在する１５０ｋＤａアイソフォームのレベルは、インターフェロン、特にインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）によって影響を受ける可能性がある。ｈＡＤＡＲ１はＴＮＦ－アルファによっても誘導される。これは併用療法を開発する機会を提供し、それによってインターフェロン－ガンマまたはＴＮＦ－アルファおよび本発明によるオリゴヌクレオチドは、組み合わせ製品として、または別々の製品として、同時または引き続き任意の順序で患者に投与される。特定の病状は、患者の特定の組織におけるＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－アルファのレベルの増加とすでに同時発生している可能性があり、編集を罹患組織に対してより特異的にするさらなる機会を創出している。
【0057】
本発明のＡＯＮにおける化学修飾の例は、糖（リボース）部分内の架橋置換基（例えば、ロックド核酸：ＬＮＡにおけるような）によるもの、２’－Ｏ原子を、上記で特定したような長さを有するアルキル（例えば、２’－Ｏ－メチル）、アルキニル（２’－Ｏ－アルキニル）、アルケニル（２’－Ｏ－アルケニル）、アルコキシアルキル（例えば、メトキシエチル：２’－Ｏ－ＭＯＥ）基で置換することによるものなどを含む糖部分の修飾である。さらに、骨格のホスホジエステル基は、チオール化、ジチオール化、アミド化などによって修飾されて、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどのヌクレオシド間連結を生じ得る。ヌクレオシド間連結は、ペプチド核酸配列などをもたらすために、ペプチド連結によって完全にまたは部分的に置き換えられてもよい。あるいは、またはさらに、核酸塩基は、イノシンまたは２’６’－ジアミノプリンなどをもたらすために、（脱）アミノ化によって修飾されてもよい。さらなる修飾は、ヌクレオチドのシチジン部分におけるＣ５のメチル化であってもよく、ＣｐＧ配列に関連していることが知られている潜在的な免疫特性を減少させる。
【0058】
ｄｓＲＮＡ複合体が標的ＲＮＡ配列の中のＡをＩに脱アミノ化するためにＡＤＡＲ酵素をリクルートする場合、編集されるアデノシンと反対側のヌクレオチドとの間の塩基対、ミスマッチ、バルジまたはゆらぎは、アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン残基を含み得るが、好ましくはシチジン残基を含み得る。（ウリジンが適用されていない場合）編集部位の反対側の潜在的なミスマッチを除いて、ＡＯＮの残りの部分は標的ＲＮＡと完全に相補的であり得る。しかしながら、本明細書に示されるように、特定の態様において、本発明は、限られた数の不完全マッチを含むＡＯＮに関する。細胞内の編集主体が他の標的部位にリダイレクトされる程度は、編集分子の認識ドメインに対する本発明によるオリゴヌクレオチドの親和性を変えることによって調節することができることを、当該技術分野の当業者は理解すると予想される。正確な修飾は、いくつかの試行錯誤によって、および／またはオリゴヌクレオチドと編集分子の認識ドメインとの間の構造的相互作用に基づくコンピューター計算方法によって決定することができる。
【0059】
さらに、あるいは代替的に、細胞内に存在する編集主体のリクルートおよびリダイレクトの程度は、オリゴヌクレオチドの投与量および投与計画によって調節することができる。これは実験者（インビトロ）または臨床医によって、通常は第Ｉ相および／または第ＩＩ相臨床試験で決定されるものである。本発明は真核生物、好ましくは後生動物、より好ましくは哺乳動物細胞における標的ＲＮＡ配列の修飾に関する。原則として、本発明は任意の哺乳動物種由来の細胞と共に使用することができるが、好ましくはヒト細胞と共に使用される。
【0060】
本発明は、例えば、皮膚、肺、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、腸、筋肉、腺、眼、脳、血液など任意の器官由来の細胞と共に使用することができる。本発明は、（ヒト）対象の罹患状態に関与する細胞、組織または器官における配列を修飾することに特に適している。そのような細胞には、肺または胃腸管の上皮細胞、生殖器官の細胞、筋肉細胞、眼の細胞、皮膚の細胞、肝臓、腎臓、膵臓などの組織および器官由来の細胞、免疫細胞、がん性細胞、腺細胞、脳細胞などが含まれるがこれらに限定されない。本発明はまた、生物体中に天然には存在しない哺乳動物細胞、例えば、細胞株またはＥＳ細胞を用いることができる。本発明は、多能性幹細胞、全能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などを含む様々な種類の幹細胞を使用することができる。細胞はインビトロまたはインビボに位置し得る。本発明の１つの利点は、生体内にインサイツで細胞を使用することができるが、培養中の細胞を使用することもできることである。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボで処理され、次いで生体内に導入される（例えば、それらが元々由来した生物に再導入される）。本発明はまた、いわゆるオルガノイド内の細胞内の標的ＲＮＡ配列を編集するためにも使用することができる。オルガノイドは、三次元インビトロ由来組織と考えることができるが、個々の単離された組織を生成するために特定の条件を用いて駆動される（例えば、Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 no. 6194 1247125参照）。治療環境では、それらは患者の細胞からインビトロで誘導することができるので有用であり、そしてオルガノイドは通常の移植片より拒絶される可能性が低い自己由来物質として患者に再導入することができる。したがって、別の好ましい実施形態によれば、本発明は、患者から採取された組織試料から（例えば、彼らの胃腸管から；Sala et al. J Surg Res. 2009；156(2)：205-12また、Sato et al. Gastroenterology 2011；141：1762-72参照）成長したオルガノイドに対して実践することができる；本発明によるＲＮＡ編集の際に、オルガノイド、またはオルガノイド内に存在する幹細胞は、臓器機能を改善するために患者に移植し戻すために使用され得る。
【0061】
治療される細胞は一般に遺伝的変異を有すると予想される。変異は、ヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。本発明は典型的には、ＮからＡへの変異、ここでＮはＧ、Ｃ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であってよく、好ましくはＧからＡへの変異、またはＮからＣへの変異、ここでＮはＡ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡレベルではＴ）であってよく、好ましくはＵからＣへの変異などの点突然変異を修飾するために用いられる。特定の目的の変異を含む遺伝子は以下に議論される。しかしながら、いくつかの実施形態において、本発明は、問題の疾患のための有用な研究手段を提供するために、細胞株または動物に疾患関連変異を導入することによる反対の方法で使用される。疾患モデルを作成する例として、本発明者は、ＣＥＰ２９０遺伝子に変異を作成するために、ヒト細胞における編集活性のリクルートメントを提供するオリゴヌクレオチド配列を提供し、先天性の子供の失明の最も一般的な形態である、レーバー先天黒内障（Leber's Congenital Amaurosis）の形態の基礎を形成する潜在的なスプライス部位を作成した。例えば、特定の標的ＲＮＡのスプライシングを変更して、その標的遺伝子の変異型が別の様式で翻訳され、それによって疾患を軽減するように、非変異配列がＲＮＡ編集に標的化されることも想定され得る。当業者は、多種多様な目的のために標的ＲＮＡを修飾するためのあらゆる種類の可能性を認識している。
【0062】
ＲＮＡ編集によって元に戻される変異は、染色体のレベル、またはミトコンドリアＤＮＡ、またはプレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡもしくはミトコンドリアＲＮＡを含むＲＮＡなどの他の形態のＤＮＡのレベルで生じた可能性がある。行われる変更は、細胞または対象が感染している、真菌、酵母、寄生虫、キネトプラスチド、細菌、ファージ、ウイルスなどを含む病原体の標的ＲＮＡにあってもよい。その後、そのような細胞、対象または病原体の内部の標的配列上のＲＮＡレベルで編集を行うことができる。ウイルスなどの特定の病原体は、それらの核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを感染宿主（細胞）の細胞に放出する。他の病原体は感染した宿主内に存在または循環している。本発明のオリゴヌクレオチド構築物は、感染した真核生物宿主の細胞内に存在する標的ＲＮＡ配列を編集するため、または真核生物宿主内に存在または循環する病原体の細胞内のＲＮＡ配列を編集するために、編集が行われる細胞が、それに投与されたオリゴヌクレオチド構築物と適合性のある編集主体を含む限りにおいて、使用され得る。
【0063】
理論に拘束されることを望むものではないが、ｈＡＤＡＲ１およびｈＡＤＡＲ２によるＲＮＡ編集は、例えば成熟ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｎｃＲＮＡを編集することができる、核内、転写またはスプライシング中、または細胞質内の一次転写物で起こると考えられている。編集酵素の異なるアイソフォームは異なって局在することが知られており、例えばｈＡＤＡＲ１ ｐ１１０は主に核に、ｈＡＤＡＲ１ ｐ１５０は細胞質に見られる。シチジンデアミナーゼによるＲＮＡ編集は、ｍＲＮＡレベルで起こると考えられている。成熟ｍＲＮＡにおけるミトコンドリアＲＮＡコドンまたは非コード配列の編集は排除されない。
【0064】
本発明は、編集されるべき部位を標的とし、編集反応を引き起こすために細胞内に存在するＲＮＡ編集主体をリクルートすることができるオリゴヌクレオチドの使用を通して真核細胞における標的ＲＮＡ配列に変化を生じさせるために使用される。好ましい編集反応は、アデノシンをイノシンに、シチジンをウリジンにそれぞれ変換する、アデノシン脱アミノ化およびシチジン脱アミノ化である。標的ＲＮＡの５’または３’非翻訳領域、（潜在的）スプライス部位、エキソン（標的ＲＮＡから翻訳されるタンパク質中のアミノ酸の変化、コドン使用頻度、またはエキソンスプライシングサイレンサーまたはエンハンサーの変化によるスプライシング挙動、開始または終止コドンを導入または除去することによる）、イントロン（イントロンスプライシングサイレンサーまたはイントロンスプライシングエンハンサー、分岐点を変えることによってスプライシングを変化させる）および一般にＲＮＡ安定性、構造または機能に影響を及ぼす任意の領域において、変化し得る。標的ＲＮＡ配列は、点突然変異（遷移またはトランスバージョン）などの、修正希望または変更希望の変異を含み得る。あるいは、標的ＲＮＡ配列を計画的に変異させて、変異が以前に存在しなかった場所に、変化した表現型（またはＲＮＡウイルスなどのＲＮＡベースの生物の場合は遺伝子型）を作製する。例えば、標的ＲＮＡ配列に変化（突然変異）を有する細胞系または動物を作製することができ、これはアッセイにおいて、または（動物、オルガノイドなど）モデル系として、疾患を研究し、実験化合物を疾患に対して試験することなど、使用できる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物および方法は、化合物スクリーニング、タンパク質工学などを含む、さらなる実験のために、例えば多種多様なタンパク質アイソフォームをコードする多種多様な標的ＲＮＡを有する細胞バンクを作製するための（アレイ形式の）ハイスループットスクリーニングシステムにおいて使用することができる。標的ＲＮＡは、任意の細胞性またはウイルス性ＲＮＡ配列であり得るが、より一般的にはプレｍＲＮＡまたはタンパク質コード機能を有するｍＲＮＡである。
【0065】
単に参照を容易にするために、そして本発明を限定することを意図せずに、次の表１は、本発明のオリゴヌクレオチドによって導かれるアデノシンデアミナーゼ編集によってもたらされ得る潜在的なコドン変化を説明するために提供される。表１は特に、いかなるＲＮＡ中のコード配列への本発明の適用性の限定として解釈されるべきではない；すでに指摘したように、本発明は、コード領域、イントロン、非コードエキソン（５’または３’非翻訳領域など）、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのいずれにおいても、アデノシンを含む任意のＲＮＡ標的に対して実施することができる。適用範囲の広さについての誤解を避けるために、コーディングの観点から重要でない（「サイレントな」）変更は、同じアミノ酸のいくつかのコドンが他のコドンよりも好まれるため、依然として特定のタンパク質の遺伝子発現を変える可能性があり、例えば、転写安定性または翻訳効率が異なると、コードされたタンパク質は変化がない場合よりも多かれ少なかれ豊富になることがもたらされ得る。
【0066】
【表1-1】
【0067】
【表1-2】
【0068】
本発明によるオリゴヌクレオチドを用いて編集するための特に興味深い標的アデノシンは、グリコシル化、ヒドロキシル化、ミリストイル化、プロテアーゼによるタンパク質切断（タンパク質を成熟させるため、および／または細胞内経路指定の一部として）などの同時または翻訳後修飾についての、重要な機能、または触媒部位、他のタンパク質に対する結合部位、基質による結合、局在化ドメインなどの特徴を定義するアミノ酸残基に対するコドンの一部であるものである。
【0069】
遺伝性疾患の宿主はＧからＡへの変異によって引き起こされ、変異した標的アデノシンでのアデノシン脱アミノ化は変異を野生型に戻すため、これらは好ましい標的疾患である。しかしながら、野生型への戻りは、有益な効果を得るのに必ずしも必要ではないかもしれない。野生型ヌクレオチドがＧ以外である場合、標的におけるＡからＧへの修飾もまた有益であり得る。ある状況ではこれが当てはまると予測されるかもしれず、別の状況ではこれはいくらかの試験が必要であるかもしれない。特定の状況において、標的ＲＮＡ中のＡから野生型がＧではないＧへの修飾は、サイレントであり得る（異なるアミノ酸に翻訳されない）か、そうでなければ重要ではない（例えば、アミノ酸が置換されるが、それはタンパク質の構造および機能を破壊しない保存的置換となる）か、またはそのアミノ酸は変化に対して一定の頑健性を有する機能的ドメインの一部である。本発明に従って編集することによってもたらされるＡからＧへの移行が、非コードＲＮＡ、またはＲＮＡの非コード部分にある場合、その結果もまた、重要ではないか、または元の変異よりも厳しくないかもしれない。当業者は、本発明の適用性が非常に広く、そして疾患を予防または治療することに限定さえされないことを理解すると予想される。本発明はまた、たとえ、特にそのような修飾が、例えば細胞または非ヒト動物モデルにおいて病的状態を誘導する場合であっても、その効果を研究するために転写物を修飾するためにも使用され得る。
【0070】
本発明によるオリゴヌクレオチドで予防および／または治療することができる遺伝病の好ましい例は、標的ＲＮＡ中の１つまたは複数のアデノシンの修飾が（潜在的に）有益な変化をもたらす任意の疾患である。
【0071】
特に興味深い変異を含む、本発明による潜在的な標的ＲＮＡ配列である転写ＲＮＡ配列には、ＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子）、ジストロフィン、ハンチントン、ニューロフィブロミン１、ニューロフィブロミン２、ヘモグロビンのβグロビン鎖、ＣＥＰ２９０（中心体タンパク質２９０ｋＤａ）、βヘキソサミニダーゼＡのＨＥＸＡ遺伝子、およびアッシャー症候群と呼ばれる遺伝的盲目の形態の原因であるアッシャー遺伝子のいずれか１つ（例えば、ＵｓｈｅｒｉｎをコードするＵＳＨ２Ｂ）から転写されるものが含まれるがそれらに限定されない。より広範なリストは下にさらに提示されている。標的配列はそれに応じて選択され、そしてオリゴヌクレオチド構築物は変異を修正するために所望の修飾を含むと予想される。
【0072】
ＣＦ変異の当業者は、Ｒ１１７Ｈ、Ｇ５４２Ｘ、Ｇ５５１Ｄ、Ｒ５５３Ｘ、Ｗ１２８２Ｘ、およびＮ１３０３Ｋを含む１０００から２０００の変異がＣＦＴＲ遺伝子において知られていることを認識している。
【0073】
一般に、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を用いて元に戻すことができる任意の標的ＲＮＡにおける変異は、アデノシンデアミナーゼリクルートメントの場合にはＧからＡへの変異、シチジンデアミナーゼリクルートメントの場合にはＵからＣへの変異であり、オリゴヌクレオチド構築物はそれに応じて設計することができる。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物を用いて標的とすることができる変異はまた、アデノシンデアミナーゼをリクルートする場合にはＣからＡ、ＵからＡ（ＤＮＡレベルではＴからＡ）、およびシチジンデアミナーゼをリクルートする場合にはＡからＣおよびＧからＣへの変異を含む。後者の状況でのＲＮＡ編集は必ずしも変異を野生型に戻すことはできないかもしれないが、編集されたヌクレオチドは元の変異よりも改善をもたらすかもしれない。例えば、－翻訳時に短縮型タンパク質を生じる－インフレーム終止コドンを引き起こす変異は、その位置の元のアミノ酸ではないかもしれないがアミノ酸をコードするコドンに変更されるかもしれないが、少なくともいくらかの機能性を有する、少なくとも短縮型タンパク質よりも高い機能性を有する（全長）タンパク質を生じる。
【0074】
標的配列は真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞に対して内在性である。したがって、標的配列は、例えば、細胞の歴史のある時点で人工的に導入された導入遺伝子またはマーカー遺伝子ではなく、むしろ細胞内に天然に存在する遺伝子である（突然変異型であろうと非突然変異型であろうと）。
【0075】
代わりに、本発明によるオリゴヌクレオチドを適用することによって野生型配列を変異配列に変えることが有用であり得るので、本発明は変異の修正に限定されない。野生型アデノシンを修飾することが有利であり得る一例は、例えば、エキソンのスプライシングに必要とされる分岐部位であると思われるアデノシンを修飾することによって、前記エキソンのスキップを引き起こすことである。別の例は、アデノシンがタンパク質結合のための認識配列を規定するかもしくはその一部であるか、またはＲＮＡの安定性を規定する二次構造に関与する場合である。したがって、上記のように、本発明を使用して、疾患に対する研究ツールを提供し、既存の変異などよりも有害性が低い新しい変異を導入することができる。
【0076】
投与されるオリゴヌクレオチドの量、投与量および投与計画は、細胞の種類、治療される疾患、標的集団、投与方法（例えば、全身性に対する局所性）、疾患の重篤度および副活性の許容されるレベルによって異なるが、これらはインビトロ研究中、前臨床試験中および臨床試験中での試行錯誤によって、評価することができ、またそうすべきである。修飾配列が容易に検出される表現型の変化をもたらす場合、試験は特に容易である。より高用量のオリゴヌクレオチドが細胞内の核酸編集主体（例えばＡＤＡＲ）への結合について競合する可能性があり、それによって、ＲＮＡ編集に自由に参加できる主体の量を枯渇させるが、日常的な投与試験は、所与のオリゴヌクレオチドおよび所与の標的についてのそのような影響を明らかにすると予想される。
【0077】
１つの適切な試験技術は、オリゴヌクレオチド構築物を細胞株または試験生物に送達し、その後の様々な時点で生検試料を採取することを含む。標的ＲＮＡの配列は生検試料中で評価することができ、そして修飾を有する細胞の割合は容易に追跡することができる。この試行が１回実行された後は、知識が保持され、生検試料を採取する必要なく将来の送達が実行され得る。
【0078】
したがって、本発明の方法は、細胞の標的ＲＮＡ配列における所望の変化の存在を同定し、それによって標的ＲＮＡ配列が修飾されたことを確認するステップを含み得る。このステップは、典型的には、上に記載のように、標的ＲＮＡの関連部分、またはそのｃＤＮＡコピー（または標的ＲＮＡがプレｍＲＮＡである場合は、そのスプライシング産物のｃＤＮＡコピー）の配列決定を含み、したがって、配列の変化は容易に確認できる。あるいは、変化は、タンパク質のレベル（長さ、グリコシル化、機能など）によって評価してもよいし、または何らかの機能的読み出し、例えば標的ＲＮＡ配列によってコードされるタンパク質がイオンチャネルである場合は、（ｎ）（誘導性）電流によって評価してもよい。ＣＦＴＲ機能の場合、ヒトを含む哺乳動物におけるアッシングチャンバーアッセイ（Ussing chamber assay）またはＮＰＤ試験は、機能の回復または獲得を評価するために当業者に周知である。
【0079】
細胞内でＲＮＡ編集が行われた後、例えば細胞分裂、編集されたＲＮＡの限定された半減期などのために、修飾されたＲＮＡは経時的に希釈される可能性がある。したがって、実際の治療用語では、本発明の方法は、十分な標的ＲＮＡが患者に明白な利益を提供するためにおよび／または経時的に有用性を維持するために修飾されるまで、オリゴヌクレオチド構築物の反復送達を含み得る。
【0080】
本発明のオリゴヌクレオチドは治療的使用に特に適しているので、本発明は本発明のオリゴヌクレオチドと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、医薬的に許容される担体は単に食塩水であり得る。これは、特に肺送達のためには、有用に等張性または低張性であり得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む送達装置（例えばシリンジ、吸入器、ネブライザー）を提供する。
【0081】
本発明はまた、本明細書中に記載されるように、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において標的ＲＮＡ配列を変化させるための方法において使用するための本発明のオリゴヌクレオチドを提供する。同様に、本発明は、本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において標的ＲＮＡ配列を変化させるための薬剤の製造における本発明のオリゴヌクレオチド構築物の使用を提供する。
【0082】
本発明はまた、細胞内の標的ＲＮＡ配列中に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンを脱アミノ化する方法に関し、前記方法は：本発明によるＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；前記ＡＯＮを細胞に取り込ませるステップ；前記ＡＯＮを標的ＲＮＡ配列にアニーリングを可能にするステップ；野生型酵素に見られるような天然のｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素が、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化することを可能にするステップ；および任意選択で、ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップを含む。本発明によるＡＯＮの細胞内への導入は、当業者公知の一般的な方法によって行われる。脱アミノ化後、効果の読み取り（標的ＲＮＡ配列の変化）は様々な方法でモニターすることができる。したがって、標的アデノシンの所望の脱アミノ化が実際に行われたか否かの同定ステップは、一般に、標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの位置、およびアデノシンの存在によって生じる効果（点突然変異、早期終止コドン、異常なスプライス部位、オルタナティブスプライス部位、得られたタンパク質のミスフォールディングなど）に依存する。したがって、好ましい態様では、ＡからＩへの変換の最終的な脱アミノ化効果に応じて、同定ステップは：標的ＲＮＡを配列決定するステップ；前記脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；プレｍＲＮＡのスプライシングが前記脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または、機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップを含む。ＵＡＡ終止コドンがある場合、それは両方のアデノシンが脱アミノ化される必要があることを意味する。したがって、本発明はまた、互いに隣接している２つのアデノシンが、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集酵素によって同時脱アミノ化されるオリゴヌクレオチドおよび方法に関する。この特定の場合において、ＵＡＡ終止コドンはＵＧＧ Ｔｒｐコードコドンに変換される（表１参照）。アデノシンのイノシンへの脱アミノ化は、標的位置で変異したＡにもはや被っていないタンパク質をもたらし得るため、イノシンへの脱アミノ化の同定はまた、機能的な読み取り、例えば、機能的タンパク質が存在するか否か、あるいはアデノシンの存在によって引き起こされる疾患が（部分的に）逆行しているかという評価でもあり得る。本明細書に記載の各疾患の機能評価は、一般に、当業者公知の方法に従うと予想される。標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、読み出しは、異常なスプライシングがまだ起こっているか、否か、または低いかどうかの評価であり得る。一方、標的アデノシンの脱アミノ化がスプライス部位を導入することを望まれる場合、必要な種類のスプライシングが実際に行われているか否かをチェックするために同様の手法を使用することができる。標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための非常に適切な方法は、もちろん、当業者に周知の方法を用いたＲＴ－ＰＣＲおよび配列決定である。
【0083】
本発明は、細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内、好ましくはヒト細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に関し、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレットの１、２または３個のヌクレオチドは、糖修飾および／または塩基修飾を含み、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾されていない。本発明のヌクレオチドの糖および／または塩基修飾は、糖および／または塩基修飾を有しないＡＯＮと比較して、ＡＯＮをより安定にし、および／または標的アデノシンの脱アミノ化の誘導を向上させる。好ましい実施形態では、二本鎖複合体が形成されるときに標的アデノシンと真向かいの非相補的ヌクレオチドはシチジンである。このシチジンは、ＡＯＮ中のそれの直接５’および３’にあるヌクレオチドと一緒になって、本明細書で定義されるようにセントラルトリプレットを形成する。ＡＯＮとセントラルトリプレットの外側の標的ＲＮＡ配列との間にさらなるミスマッチがあり得るが、セントラルトリプレットの中央のシチジンは、それが細胞内に存在するＡＤＡＲによって編集され得るように標的配列の標的アデノシンと少なくとも１つのミスマッチを形成する。細胞は好ましくはヒト細胞であり、そしてＡＤＡＲは好ましくはヒトＡＤＡＲ、より好ましくは該細胞中の内在性ＡＤＡＲであり、組換え手段によりそれを過剰発現させる必要はない。いずれにしても、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有せず、細胞のＲＮＡ編集酵素が作用することを可能にする。一実施形態では、中央のヌクレオチド以外のセントラルトリプレット内の１または２個のヌクレオチドは、イノシンに置き換えられる。これは、ＡＤＡＲ酵素とのより良い適合を可能にするために好ましいかもしれない。さらに別の好ましい実施形態では、ＡＯＮは、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステム－ループ構造を形成することができる部分を含まない。
【0084】
図１、２および４に例示されるように、セントラルトリプレットはＹＸＺまたはＸＸＹとして表される。異なる塩基修飾が提供される。当業者は、これらの塩基修飾がセントラルトリプレット内のヌクレオチドと反対側のヌクレオチドに、ある程度依存することを理解している。したがって、Ｘが標的アデノシンの反対側の中央のヌクレオチドであるＹＸＺの例では、Ｘはシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、ウリジン、またはピロロシチジンであり得るが、Ｙおよび／またはＺは、セントラルトリプレットの反対側のヌクレオチドに応じて、イノシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、シュードウリジン、４－チオウリジン、チエノウリジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、チエノグアノシン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－メチルアデノシン、８－メチルアデノシン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アジドアデノシンなどであり得：それゆえ、標的ＲＮＡ配列およびそれに関連する疾患に依存する。ゆえに、好ましい実施形態では、前記塩基修飾は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、およびチエノウリジンからなる群から選択される。
【0085】
別の好ましい実施形態では、糖修飾はデオキシリボース（すなわちＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される。特に好ましい態様において、本発明は、３個の連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含むＡＯＮに関し、標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドがセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、そして前記セントラルトリプレット中の１個、好ましくは２個、さらに好ましくは、３個全てのヌクレオチドは、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導において、ＡＯＮをより安定におよび／またはより効果的にするためのＤＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様では、ＡＯＮの残りの部分は、好ましくは（必ずしもそうとは限らないが）２’－Ｏ－メチル修飾されているＲＮＡヌクレオチドからなる。セントラルトリプレットの外側で他の安定化修飾を用いてもよい。本発明による標的編集と完全に互換性のある他のリボース修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、ＬＮＡ、２’－Ｆおよび２’－ＮＨ2である。セントラルトリプレットの外側のヌクレオチドの糖修飾（本明細書中に列挙されるような）の異なる組み合わせが適用され得る。別の好ましい態様では、本発明によるＡＯＮは、ホスホロチオエート、３’－メチレンホスホネート（すなわち３’－Ｏ－メチルホスホネートヌクレオチド間連結）、５’－メチレンホスホネート（すなわち５’－Ｏ－メチルホスホネートヌクレオチド間連結）、３’－ホスホロアミデート（すなわち、Ｎ－３’－ホスホロアミデートヌクレオチド間連結）および２’－５’－ホスホジエステル（すなわち、２’－５’－ホスホジエステルヌクレオチド間連結）からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間連結修飾を含む。ホスホロチオエート連結が特に好ましい。本発明によるさらに好ましいＡＯＮは、ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で結合しており、好ましくは５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドがホスホロチオエート連結で結合しているＡＯＮである。本明細書に開示されているように、セントラルトリプレット内のヌクレオチドもホスホロチオエート連結を介して結合され得るが、ＡＯＮを安定かつＲＮＡ編集において活性にするためにセントラルトリプレットにはそのような連結が１つより多く存在すると思われる。さらなる好ましい態様では、安定性を高めるためにＡＯＮを保護センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）にアニーリングし、そしてこれは二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド＋ＳＯＮ複合体のより安定した性質のために仮定される長期活性である。ＳＯＮは必ずしもアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ長さである必要はない。それはより長くても、同じ長さであっても、より短くてもよい。
【0086】
好ましい一態様では、セントラルトリプレットの外側のＡＯＮ中の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基、または２’－Ｏ－メトキシエチル基などの２’－Ｏ－アルキル基を含む。ＤＮＡストレッチがギャップマーを生じない限り、セントラルトリプレットの外側のヌクレオチドもＤＮＡであり得る。また、ＡＯＮは、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長く、好ましくは１００ヌクレオチドより短く、より好ましくは６０ヌクレオチドより短い。さらに別の好ましい実施形態では、ＡＯＮは１８から７０ヌクレオチドを含み、より好ましくは１８から６０ヌクレオチドを含み、さらにより好ましくは１８から５０ヌクレオチドを含む。本発明はまた、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＡＯＮと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【0087】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、任意選択で、１ｎｇ／ｍｌから１ｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度の、医薬用途に適合する添加剤、賦形剤および他の成分を含む、例えば生理食塩水などの水溶液中または懸濁液中で適切に投与される。投与量は、適切には約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、腫瘍などへの吸入（例えば噴霧による）、鼻腔内、経口、注射または注入による、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、気管内、腹腔内、直腸内、直接注射によるものであり得る。投与は、固体形態、粉末形態、丸剤形態、またはヒトにおける医薬用途に適合する他の任意の形態であり得る。
【0088】
本発明は、嚢胞性線維症、白皮症、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、様々な形態のがん（例えば、乳がんと卵巣がんとを関連付けられるＢＲＣＡ１および２）などの遺伝病の治療に特に適している。
【0089】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド構築物は全身的に送達され得るが、標的配列の表現型が見られる細胞にオリゴヌクレオチドを送達することがより典型的である。例えば、ＣＦＴＲの変異は、主に肺上皮組織に見られる嚢胞性線維症を引き起こすので、ＣＦＴＲ標的配列では、オリゴヌクレオチド構築物を特異的かつ直接的に肺に送達することが好ましい。これは吸入、例えば典型的にはネブライザーの使用による、粉末またはエアロゾルの吸収により便宜的に達成することができる。特に好ましいのは、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（Ｒａｐｉｄ）またはＲｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓからのｉ－ｎｅｂを含む、いわゆる振動メッシュを使用するネブライザーである。本発明者らは、オリゴヌクレオチド構築物の吸入使用が、オリゴヌクレオチド構築物の全身分布およびとりわけ、腸、肝臓、膵臓、腎臓および唾液腺組織における細胞による取り込みをもたらし得ることを見出した。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の吸入送達もこれらの細胞を効率的に標的化することができ、これはＣＦＴＲ遺伝子の場合、標的化は嚢胞性線維症にも関連する胃腸症状の改善をもたらし得ることが期待される。他の標的配列については、疾患および／または標的器官に依存して、投与は局所的（例えば皮膚上）、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、経口、眼内注射などであり得る。
【0090】
いくつかの疾患では、粘液層が厚くなるため、肺を介した薬の吸収の減少をもたらす。そのような疾患の１つは慢性気管支炎であり、別の例は嚢胞性線維症である。ＤＮａｓｅ、高張食塩水またはマンニトールなどの様々な形態の粘液正常化剤が利用可能であり、それらはＢｒｏｎｃｈｉｔｏｌの名称で市販されている。粘液正常化剤が、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物などのＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド構築物と組み合わせて使用される場合、それらはそれらの薬剤の有効性を増大させる可能性がある。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは粘液正常化剤、好ましくは本明細書に記載の粘液正常化剤と組み合わされる。さらに、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の投与は、増強剤化合物、例えばＫａｌｙｄｅｃｏ（ｉｖａｃａｆｔｏｒ； ＶＸ－７７０）、または中和化合物、例えばＶＸ－８０９（ｌｕｍａｃａｆｔｏｒ）および／またはＶＸ－６６１などのＣＦの治療のための小分子の投与と組み合わせることができる。ＣＦにおける他の併用療法は、ＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－アルファを使用して、アデノシンデアミナーゼの誘導剤と組み合わせた本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の使用を含み得る。
【0091】
代替的に、または粘液正常化剤と組み合わせて、粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達を、例えば肺および腸の上皮細胞へのＲＮＡ編集分子の効率的な送達のために適用することができる。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは粘液透過性粒子またはナノ粒子での送達を用いる。
【0092】
慢性および急性の肺感染症は、嚢胞性線維症などの疾患を有する患者によく見られる。抗生物質治療は、細菌感染ならびに粘液の肥厚および／またはバイオフィルムの形成などの症状を軽減する。本発明によるオリゴヌクレオチド構築物と組み合わせた抗生物質の使用は、オリゴヌクレオチド構築物のための標的細胞へのより容易な接近の機会（アクセス）のために、ＲＮＡ編集の有効性を増大させる可能性がある。したがって、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物の対象への、好ましくはヒト対象への投与は、好ましくは細菌感染ならびに粘液の肥厚および／またはバイオフィルム形成などの症状を軽減するために抗生物質治療と組み合わせる。抗生物質は全身的にまたは局所的にまたはその両方で投与することができる。
【0093】
例えば嚢胞性線維症患者に適用するために、本発明によるオリゴヌクレオチド構築物、または本発明によるパッケージ化もしくは複合化オリゴヌクレオチド構築物は、ＤＮａｓｅ、マンニトール、高張生理食塩水および／または抗生物質および／またはＣＦの治療のための小分子、例えばイバカフトール（ivacaftor）などの増強剤化合物、または例えばルマカフトール（lumacaftor）および／もしくはＶＸ－６６１などの中和化合物などの任意の粘液正常化剤と組み合わせることができる。
【0094】
標的細胞への接近の機会を増加させるために、本発明によるオリゴヌクレオチドの投与の前に、気管支肺胞洗浄（Broncheo-Alveolar Lavage；ＢＡＬ）を適用して肺を洗浄することができる。
【0095】
本発明の発明者らは、ＲＮＡを標的としそしてＡＤＡＲ酵素をリクルートするＡＯＮに対するある種の修飾が安定性を増しそしてこれによりインビボ設定においてより良好な適用性をもたらすことをここに示した。しかしながら、安定性は１つのことである。ヌクレアーゼ媒介分解を防止することによってＡＯＮを安定化することに加えて、修飾ヌクレオチドは、それらがＡＤＡＲ酵素の結合および／または触媒活性を支持し、そして好ましくは改善するように理想的に選択される。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインとｄｓＲＮＡ基質との間の相互作用の既知の構造的特徴（Matthews et al. 2016. NatStructMolBiol23:426～433に詳細に提供されている）を使用して、ＡＤＡＲ２酵素の触媒中心に最もよく適合する修飾ＡＯＮを合理的に選択することができる。Matthewsら（2016）に開示されている（色付きの）構造から、ＡＤＡＲ２がｄｓＲＮＡらせんの副溝から編集部位に接触していることが分かる；その文献の図２、パネルＡ：ｄｓＲＮＡらせん軸に垂直な複合体の構造の図。ピンク色のＲＮＡ鎖が編集鎖、青い鎖が相補鎖である。反転した標的塩基（Ｎ）は赤で表示される。タンパク質はその副溝を通じてらせんと接触する。パネルＢ：ｄｓＲＮＡのらせん軸に沿った構造の図。パネルＣ：ＡＤＡＲ２ Ｅ４８８ＱデアミナーゼドメインおよびＲＮＡ二重鎖との接触の概要。赤い色は編集された標的鎖を示し、青い色は相補鎖を示す（ここに示されているＡＯＮと同じ）。破線は、デアミナーゼドメインのアミノ酸側鎖（示されたアミノ酸同一性および位置）とＲＮＡ鎖との相互作用を示す。Matthewsら（2016）の図５Ａは、ヌクレオチド５’の（標的鎖上の）編集部位および他の鎖上の相補的ヌクレオチドへの相互作用の空間充填モデルを詳細に示す。上のパネルでは、５’ヌクレオチドはウリジンで、反対側のアデノシンとの相互作用はＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインのグリシン４８９によって安定化されている。下のパネルはＣ（編集されたヌクレオチドに対して５’）と相補的なＧのモデル化された相互作用を示している。この場合、グリシンとの相互作用は２－アミノ基との衝突を引き起こし、これは編集効率を低下させる。反対側の鎖（またはＡＯＮ）上のグアノシン塩基をイノシンで置き換えると、この立体的衝突が解決されるであろう。
【0096】
塩基修飾については、本発明の発明者らは、らせんの主溝に計画される化学修飾（SharmaおよびWatts 2015. Future Med.Chem.7(16). 2221～2242）が少なくともＡＤＡＲ２の機能を妨害すると推測した。様々なＡＯＮの詳細については、図２および以下の例を参照。ピリミジンヌクレオチドについては、そのような修飾は、４－チオウリジン（例えばＡＤＡＲ６０－１３参照）、５－メチルウリジン（例えばＡＤＡＲ６０－１４参照）、５－メトキシウリジン（例えばＡＤＡＲ６０－２６参照）、５－メチルシチジン（例えばＡＤＡＲ６０－９、－１１から１６、－２０、２６、－２７および－２９から－３２ならびにＡＤＡＲ６８－１から－６参照）および５－ヒドロキシメチルシチジン（例えばＡＤＡＲ６０－２８参照）を含む塩基の４または５位の置換基を含む。プリンヌクレオチドについては、７－メチルグアノシン、７－デアザグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－メチルアデノシン、８－メチルアデノシン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、または８－アジドアデノシン（それぞれ、ＡＤＡＲ６０－２９、－３０、－３１、－３２、およびＡＤＡＲ６８－１、－２、－３、－４および－５を参照）を含む塩基の７位および８位の置換基が同様に主溝に向けられる。
【0097】
ＡＯＮの骨格の修飾（すなわち、ヌクレオチドのリボシル部分またはヌクレオチド間連結の修飾）について、本発明の発明者らは、ＲＮＡらせんのＡ型構造を変えない修飾はＡＤＡＲ２の機能を中程度にしか妨害しないと推定した。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの構造情報は、特定の位置において、リン酸基や２’－ヒドロキシル基など、酵素のアミノ酸側鎖が接触する化学基を保持することが重要であることも示唆している。これらの特徴の保持を可能にする修飾としては、ＵＮＡ（例えば、ＡＤＡＲ６０－８および－９）、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデート、または２’－５’ホスホジエステル修飾（それぞれ、ＡＤＡＲ６０－２２、－２３、－２４および－２５を参照）が挙げられる。いくつかの場合において、ＡＤＡＲ２による直接相互作用は、特定のヌクレオチド上の所定の置換基については存在しない。そのような場合、ＡＯＮをヌクレアーゼから保護するが、ＡＤＡＲ２との立体障害を引き起こさないほど十分に小さい他の化学基、例えば、天然に存在するヒドロキシル基よりも大きくないため、２’－フルオロ修飾または２’－Ｈ（デオキシ）を使用することができる（例えばＡＤＡＲ６０－７を参照）。
【0098】
修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼからの増強された保護およびＡＤＡＲ２結合への最小限の干渉を提供するだけでなく、ＡＤＡＲ２の機能性を特異的に増加させるためにも選択され得る。標的配列がＡＤＡＲ編集に最適ではない場合、基質ＲＮＡ上の編集活性を増強するために、特定のヌクレオチド修飾が特に必要であり得る。以前の研究は、特定の配列コンテキストが編集により適していることを証明した。例えば、標的配列５’－ＵＡＧ－３’（中心に標的Ａを有する）は、ＡＤＡＲ２にとって最も好ましい最近傍ヌクレオチドを含み、一方、５’－ＣＡＡ－３’標的配列は好まれない（Schneiderら、2014）。ＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインの構造解析は、標的トリヌクレオチドの反対側のヌクレオチドを慎重に選択することによって編集を強化する可能性を示唆している（Matthewsら、2016）。例えば、（中位に形成されたＡ－Ｃミスマッチを有する）反対側の鎖上の３’－ＧＣＵ－５’配列と対になる５’－ＣＡＡ－３’標的配列は、グアノシン塩基のアミノ基がＡＤＡＲ２のアミノ酸側鎖と立体的に衝突するために好まれない。しかしながら、イノシンなどのアミノ基を欠く、より小さい核酸塩基は、反対側のシトシンに対する塩基対合能力をなお保持しながら、立体的な衝突を引き起こすことなくこの位置によりよく適合し得ると仮定される（例えばＡＤＡＲ６０－１０から－１９および－２６、－２７、－２８、および－３２参照）。イノシンはまた、異なる配列の内で使用され得る。例えば、標的配列５’－ＵＡＧ－３’をＡＯＮセントラルトリプレット配列５’－ＣＣＩ－３’と対にすることができ、したがってらせんから酵素の活性部位に飛び出し、標的アデノシンに必要とされる柔軟性の増大をもたらすことができるＵ－Ｉゆらぎ塩基対を形成することができる（例えば、ＡＤＡＲ６８－６を参照）。
【0099】
骨格修飾は、編集部位を囲むヌクレオチドの柔軟性を高めるなど、ヌクレアーゼ保護を超えるさらなる利点を有することもでき、酵素の活性部位に基質を正しく配置するための重要な要因として示唆されている。糖部分の開いた構造が運動の増加を許容するため、ＵＮＡはそのような骨格修飾の１つである（ＡＤＡＲ６０－８および－９を参照）。逆に、最適でない配列の活性を増強し得る修飾にはまた、編集に好ましい立体配座に強制する骨格修飾の使用が含まれる。
【実施例】
【0100】
[実施例１]
安定性を高めるためのヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾
未公開特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用による標的化ＡからＩへの編集のための方法を記載している。これらのＡＯＮ中のほとんどのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡであり、ホスホロチオエート連結を有するが、それらはＡＯＮの部分に、標的アデノシンの真向かいの中央のヌクレオチドおよびその２つの隣接ヌクレオチドと共に、いくつか、通常３個の未修飾ＲＮＡヌクレオチド（「セントラルトリプレット」）を含む。これは、セントラルトリプレットのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化されているとＡ－ｔｏ－Ｉ編集が強く抑制されることが以前に示されていたためである（Vogelら、2014）。しかしながら、修飾されていないＲＮＡヌクレオチドを含むＡＯＮは、これらの位置の残基を加水分解することができるヌクレアーゼのために本質的に生物学的に不安定である。これは、例えば治療薬としてＡＯＮを効率的に使用するためには、それらは標的に到達する前に分解され得るため、不利益となり得る。
安定性を高めるためのヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾
未公開特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用による標的化ＡからＩへの編集のための方法を記載している。これらのＡＯＮ中のほとんどのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡであり、ホスホロチオエート連結を有するが、それらはＡＯＮの部分に、標的アデノシンの真向かいの中央のヌクレオチドおよびその２つの隣接ヌクレオチドと共に、いくつか、通常３個の未修飾ＲＮＡヌクレオチド（「セントラルトリプレット」）を含む。これは、セントラルトリプレットのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル化されているとＡ－ｔｏ－Ｉ編集が強く抑制されることが以前に示されていたためである（Vogelら、2014）。しかしながら、修飾されていないＲＮＡヌクレオチドを含むＡＯＮは、これらの位置の残基を加水分解することができるヌクレアーゼのために本質的に生物学的に不安定である。これは、例えば治療薬としてＡＯＮを効率的に使用するためには、それらは標的に到達する前に分解され得るため、不利益となり得る。
【0101】
本発明の発明者らは、セントラルトリプレットでの未修飾ＲＮＡヌクレオチドを有するＡＯＮの安定性と、２’－Ｏ－メチル化以外の化学修飾を使用することによってそのようなＡＯＮの安定性を高めることができるか否かについて調べた。
【0102】
まず、非限定的な例として、ＲＮＡ編集のために選択された標的は、Ａ１ＡＴ欠損症（Ａ１ＡＴＤ）の原因となるＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡ中のｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異である。Ａ１ＡＴＤは、本明細書に概説したような手法を用いたＲＮＡ編集のための疾患標的の一例である。図１ＡおよびＢでは、ＳＥＲＰＩＮＡ１標的に対する例示的なＡＯＮの相補性が概略的に示されている。標的配列に対するＡＤＡＲ６０－１の相補性を図１Ａに示し、ＡＤＡＲ６０シリーズのセントラルトリプレット（５’－ＹＸＺ－３’）を図１Ｂに示す。骨格およびセントラルトリプレットのヌクレオチドの塩基に様々な修飾を有する変異体ＲＮＡを標的とするいくつかのＡＯＮを、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む細胞培養培地（ＭＥＭ）中でそれらを＋３７℃で３０分間（ＲＸ）インキュベートすることによって安定性を試験した。陰性対照として、ＡＯＮをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＣＴＬ）中でインキュベートした。次に試料を変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素を含む１５％ＰＡＧＥゲル）で分離し、続いてこれをトルイジンブルーで染色してＡＯＮおよびその断片を可視化した。そのＡＯＮをそれぞれの配列およびそれらの修飾と共に図２に示す。図３の３つのパネルは、ＡＤＡＲ６０シリーズのＡＯＮを使用した安定性アッセイの結果を示している。修飾されていない５’－ＵＣＧ－３’ ＲＮＡセントラルトリプレットを含むＡＤＡＲ６０－１は、ＦＢＳの存在下で３０分以内に効率的に切断（～分解）される（およそ５０％まで）。対照緩衝液中でＡＯＮをインキュベートした場合、いくらかの分解はさらに明らかである。３つのＲＮＡヌクレオチドの位置がシフトしても、分解速度は低下しない（ＡＤＡＲ６０－３）。重要なことに、未修飾ＲＮＡヌクレオチドの数を（３個の代わりに）２個に減らすと、分解が減少する（ＡＤＡＲ６０－２）。ここで陰性対照として働く完全な２’－Ｏ－メチル化ＡＯＮは、セントラルトリプレットがＤＮＡヌクレオチドに変更されたＡＯＮ（ＡＤＡＲ６０－６）のように、これらの条件下で安定している（ＡＤＡＲ６０－４）。これは少なくとも、セントラルトリプレットが２’－Ｏ－メチル化されていない場合、ＡＯＮは分解される傾向があり、セントラルトリプレットに少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドを付加すること、またはセントラルトリプレット全体をＤＮＡヌクレオチドに修正することによりそれを解決することができることを示している。セントラルトリプレットの３つの位置のうち２つの位置における他の糖の修飾、ロック解除核酸（ＵＮＡ）によるＲＮＡの置換は安定性の増加をもたらし（ＡＤＡＲ６０－８）、さらにトリプレットの中位における塩基修飾５－メチルシトシンと組み合わせるとさらに安定になる（ＡＤＡＲ６０－９）。セントラルトリプレットの最初の位置の後に１つのホスホロチオエート連結を含んでいても（５’－Ｕ＊ＣＧ－３、星印はホスホロチオエート連結を表す）、安定性はそれほど向上しない（ＡＤＡＲ６０－５）。ホスホロチオエート連結の数の増加に向けたさらなる実験については、下記の実施例２を参照。
【0103】
また、グアノシンをイノシンで置き換えると、分解が著しく減少する（ＡＤＡＲ６０－１０）。この修飾をシチジンの５－メチルシチジンについての置き換え（ＡＤＡＲ６０－１１）と組み合わせると、安定性は維持され、両方の修飾をウリジンのシュードウリジンについての置き換えと組み合わせると（ＡＤＡＲ６０－１２）さらに向上する。
【0104】
セントラルトリプレットの３つの全てのヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置き換えると、安定性に最大の効果があるように見えた。各位置における精密な修飾は変えることができ、これはＡＯＮの安定性に大きく影響する。ＡＤＡＲ６０－１２以外のＡＯＮでは、シュードウリジンを４－チオウリジンで置換したもの（ＡＤＡＲ６０－１３）または２，６－ジアミノプリンで置換したもの（ＡＤＡＲ６０－１６）は、同等の安定性のＡＯＮが得られるが、対照的に５－メチルウリジン（ＡＤＡＲ６０－１４）は安定性を減少させ、チエノウリジン（ＡＤＡＲ６０－１５）は、未修飾ＲＮＡトリプレットを使用した場合よりもさらに、ＡＯＮをほぼ完全に分解させる。
【0105】
セントラルトリプレットの中央のＣをピロロシチジンで置換すると、５－メチルシチジンよりもさらに有意に安定化される：ピロロシチジンおよびイノシンを有するＡＯＮは、トリプレットの最初の位置にシュードウリジンまたは未修飾ウリジンを含むか否かにかかわらず、これらの条件下でほぼ完全に安定である（それぞれＡＤＡＲ６０－１８とＡＤＡＲ６０－１７）。この場合も、ウリジンをチエノウリジン（ＡＤＡＲ６０－１９）で置き換えると安定性が減少するが、ＡＤＡＲ６０－１５と同程度ではない。
【0106】
セントラルトリプレットの他の２つの位置と同様に、最後の位置も安定化を達成するために異なる塩基修飾で修飾することができる。ここでは、イノシンの代わりに、チエノグアノシンをシュードウリジンおよび５－メチルシチジンまたはピロロシチジン（それぞれＡＤＡＲ６０－２０およびＡＤＡＲ６０－２１）と組み合わせて使用した。両方のＡＯＮはこれらの条件下で完全に安定している；チエノグアノシンによる安定性の向上は、他の点では類似のＡＤＡＲ６０－１２およびＡＤＡＲ６０－２０と比較すると顕著である。
【0107】
安定化を増大させるための同様の効果を達成するためのさらなる組み合わせとしては、例えば、グアノシンについては７－メチルグアノシン、７－デアザグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、または７－アミノメチル－７－デアザグアノシン（それぞれＡＤＡＲ６０－２９、－３０、－３１および－３２参照）、またはシチジンについては５－ヒドロキシメチルシトシン（ＡＤＡＲ６０－２８を参照）、またはウリジンでは５－メトキシウリジンまたはジヒドロウリジン（それぞれＡＤＡＲ６０－２６および－２７を参照）の置き換えが考えられる。２’－フルオロ、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデート、または２’－５’ホスホジエステル修飾（２’－５’骨格連結；それぞれＡＤＡＲ６０－７、－２２、－２３、－２４、および－２５を参照）を含むセントラルトリプレットの糖および骨格修飾によっても安定化が達成された。
【0108】
この実施例に示された結果は、全ての修飾がＲＮＡ編集アンチセンスオリゴヌクレオチドの分解を減少させるのに有用であるとは限らないが多くの修飾により安定性が実際に増すこと、そしてセントラルトリプレット内およびおそらくその周辺の修飾は慎重に選択されるべきであることを示す。セントラルトリプレットのヌクレオチドを特定の化学的性質で修飾すると、オリゴヌクレオチドの安定性が確実に高まる。全体として、この実施例に提示された結果は、セントラルトリプレットにおけるヌクレオチドの（の組み合わせ）修飾が安定性を改善させることができ、一度にいくつかの塩基の修飾が徐々に安定化をもたらすことを示す。
【0109】
[実施例２]
安定性を高めるためのマウスＩｄｕａ ＲＮＡを標的とするＡＯＮにおけるホスホロチオエート連結
前の例では、セントラルトリプレット内の最初の位置の後に１つのホスホロチオエート連結を含ませても、安定性はそれほど向上しないことが示された（図３Ａ；ＡＤＡＲ６０－５）。これをより深く調査するために、セントラルトリプレット領域内により多くのホスホロチオエート連結を含むことがなおも影響を及ぼしそして安定性を高めることができるか否かを試験した。
安定性を高めるためのマウスＩｄｕａ ＲＮＡを標的とするＡＯＮにおけるホスホロチオエート連結
前の例では、セントラルトリプレット内の最初の位置の後に１つのホスホロチオエート連結を含ませても、安定性はそれほど向上しないことが示された（図３Ａ；ＡＤＡＲ６０－５）。これをより深く調査するために、セントラルトリプレット領域内により多くのホスホロチオエート連結を含むことがなおも影響を及ぼしそして安定性を高めることができるか否かを試験した。
【0110】
このために、本発明の発明者らは、ヒトにおいてＩＤＵＡ遺伝子のｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異によって引き起こされる、ムコ多糖症Ｉ型－ハーラー（mucopolysaccharidosis type I-Hurler；ＭＰＳ Ｉ－Ｈ）としても知られるモデル系としてハーラー症候群（Hurler syndrome）を選択した。変異ヒト遺伝子の標的配列は５’－ＵＡＧ－３’（中位に標的Ａ、図４Ａ参照）であり、そしてＡＯＮのセントラルトリプレットは５’－ＣＣＡ－３’（中央のミスマッチＣを含む；５’－ＸＸＹ－３’表記については図４Ｂを参照）または５’－ＣＵＡ－３’であろう。この変異についてのマウスモデルも存在し（Ｗ３９２Ｘ）、そこではＩｄｕａ遺伝子が変異している。Ｈｕｒｌｅｒマウスモデルはまた、さらなるインビボ実験にも使用された（下記参照）。シリアル番号ＡＤＡＲ６５を有するオリゴヌクレオチド（図２参照）は、変異マウスＩｄｕａ遺伝子を標的とするように設計された。さらなるホスホロチオエート連結がオリゴヌクレオチドの安定性を増すか否かを見るために、ＡＤＡＲ６５－１、ＡＤＡＲ６５－１８、ＡＤＡＲ６５－２０、ＡＤＡＲ６５－２１、およびＡＤＡＲ６５－２２を試験した。驚くべきことに、セントラルトリプレット領域に３つ以上のホスホロチオエートを含めると、ＡＯＮの安定性が向上した（図５）。ＡＤＡＲ６５－１にはセントラルトリプレット領域にさらなるホスホロチオエート連結がなく、明らかに分解されているが、ＡＤＡＲ６５－２２にはセントラルトリプレット領域内およびその周辺に６個のホスホロチオエート連結があり、ＦＢＳで１８時間インキュベートした後も明らかにより安定である。同様に、セントラルトリプレット領域に５および３個のホスホロチオエート連結をそれぞれ有するＡＤＡＲ６５－２０およびＡＤＡＲ６５－２１の安定性は、（ＡＤＡＲ６５－１のように）オリゴヌクレオチドの末端連結を除いてセントラルトリプレット領域にさらなるホスホロチオエートを有さないＡＤＡＲ６５－１８と比較したとき、増加した。
【0111】
５－メチルシチジンおよびデオキシ２－アミノプリンなどの塩基修飾を、デオキシリボース（ＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロおよびリン酸骨格（ホスホロチオエート連結）などのリボース修飾と組み合わせた。ＡＤＡＲ６５－１３、－１４、－１５、－１６、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、および－３０（図２）を上に記したものと同じアッセイを用いて安定性について試験した。図６に示される結果は、ＦＢＳ中で１８時間インキュベートした後でも、安定性を得るために様々な組み合わせを使用できることを示している。
【0112】
これに加えて、セントラルトリプレットにＲＮＡ（ＡＤＡＲ９３－２）またはＤＮＡ（ＡＤＡＲ９３－６、ＡＤＡＲ９３－８、ＡＤＡＲ９３－９）のいずれか、および様々な数のホスホロチオエートヌクレオチド（ＡＤＡＲ９３－２においては２８、ＡＤＡＲ９３－６においては８、ＡＤＡＲ９３－８においては２１、ＡＤＡＲ９３－９においては２２）を含むＡＯＮを様々な生物学的溶液中で安定性について分析した。ＰＢＳを陰性対照として使用した。ＡＯＮが血液および中枢神経系供せられ得る生理学的条件を模倣するために、ＡＯＮをそれぞれ、１５％ＦＢＳを含有する細胞培養培地（ＤＭＥＭ）または単一ドナーヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中でインキュベートした。リソソームおよびその中のヌクレアーゼの酸性微小環境がＡＯＮ安定性に影響を及ぼすか否かを評価するために、オリゴヌクレオチドもまた混合ジェンダーヒト肝臓リソソーム（Ｌｙｓｏ）中でインキュベートした。２００ｐｍｏｌのＡＯＮを各条件で２時間、２４時間または３日間インキュベートし、その後試料を変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍ尿素を含む１２％ＰＡＧＥゲル）に溶解した。ゲルをトルイジンブルー溶液で染色し、水中で脱色してＡＯＮおよびその断片を可視化した。結果は図７に示されており、セントラルトリプレットに修飾を加えずにＲＮＡを含むオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ９３－２）はＦＢＳ、ＣＳＦおよびＬｙｓｏ中で非常に分解されやすいことを示している（再び）。ほとんど全てのオリゴヌクレオチドはこれらの異なる状況下で急速に切断されるためであるが、一方でＰＢＳ単独においては比較的安定のままである。しかしながら、２つか３つのＤＮＡヌクレオチドを含むようにセントラルトリプレットを変更すると、３日間までも、３つの異なる環境におけるオリゴヌクレオチドの安定性が大幅に向上する。
【0113】
ヒトＩＤＵＡ遺伝子のｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を潜在的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６８、ＡＤＡＲ６８－１、－２、－３、－４、および－５（図２参照）もまた設計した。修飾されたセントラルトリプレットは、例えば、７－メチルアデノシン、８－メチルアデノシン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、または８－アジドアデノシンなどの（図２のＡＤＡＲ６８－１、－２、－３、－４および－５）、アデノシンを置換したヌクレオチドと組み合わせた２つの５－メチルシチジンからなることができる。しかしながら、アデノシンは、イノシンなどの反対側のウリジンとゆらぎ塩基対を形成することができる修飾塩基によっても置換することができる（ＡＤＡＲ６８－６）。これらのＡＯＮは、安定性ならびに標的配列のＲＮＡを編集するそれらの能力について試験される。
【0114】
[実施例３]
セントラルトリプレットにおける化学塩基修飾を組み合わせたＡＯＮのＲＮＡ編集活性
ヌクレオチドホスホジエステル、糖および塩基修飾は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を高めるために使用される。重要なことには、そのような化学的ヌクレオチド修飾は、より良好な認識を得るためにおよび／またはＡＯＮとその特異的な標的ＲＮＡ配列との二本鎖複合体において作用するタンパク質の酵素活性を高めるために、それらの標的ＲＮＡに対するＡＯＮの結合の増加などの他の目的にも使用できることが本発明の本発明者によって考えられた。
セントラルトリプレットにおける化学塩基修飾を組み合わせたＡＯＮのＲＮＡ編集活性
ヌクレオチドホスホジエステル、糖および塩基修飾は、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性を高めるために使用される。重要なことには、そのような化学的ヌクレオチド修飾は、より良好な認識を得るためにおよび／またはＡＯＮとその特異的な標的ＲＮＡ配列との二本鎖複合体において作用するタンパク質の酵素活性を高めるために、それらの標的ＲＮＡに対するＡＯＮの結合の増加などの他の目的にも使用できることが本発明の本発明者によって考えられた。
【0115】
本発明者らは、ＡＯＮのセントラルトリプレットにおけるヌクレオチド塩基化学修飾の組み合わせがＡＤＡＲ２の編集活性を増強し得るか否かを最初に知りたかった。このために、ＡＤＡＲ６０－１およびＡＤＡＲ６０－１５（図２および３参照）を使用して、ヒト変異ＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡ分子に対するＡＤＡＲ２酵素の編集活性の増強に対するそのような影響を調べた。これら２つのＡＯＮは同じ配列と長さを共有し、どちらもセントラルトリプレットの外側にリン酸基の化学的ホスホロチオエート修飾およびリボース糖の２’－Ｏ－メチル修飾を有する。図２に示すように、ＡＤＡＲ６０－１のセントラルトリプレットのヌクレオチドは修飾されていないが、ＡＤＡＲ６０－１５のセントラルトリプレットのヌクレオチド塩基は化学修飾されている。５－メチルシチジンは編集のための標的アデノシンの反対側である。ＡＤＡＲ６０－１とＡＤＡＲ６０－１５の両方を、ＡＤＡＲ２の過剰発現されたアイソフォーム２（ＡＤＡＲ２ａ）を有するＨＥＫ２９３細胞溶解物、およびｃ．１０９６Ｇ＞Ａ変異を有するＳＥＲＰＩＮＡ１標的ＲＮＡを用いたインビトロ編集アッセイで試験した。細胞溶解物を含まないＡＤＡＲ６０－１５、および過剰発現させたＡＤＡＲ２ａを含むが、オリゴヌクレオチドを含まないＨＥＫ２９３細胞溶解物を陰性対照として用いた。ＳＥＲＰＩＮＡ１テンプレートｓｓＲＮＡは、Ｔ１プロモーターＦ１フォワードプライマー（５’－ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ－３’；配列番号３）およびＳｅｒｐｉｎａ１－Ｒ２リバースプライマー（５’－ＣＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣ－３’；配列番号４）を用いて当業者に公知の一般的技術を適用し、製造業者のプロトコールに従って、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて５００ｎｇのＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ＤＮＡ配列（ＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片からＰＣＲによって増幅された）のインビトロ転写によって得られた。ＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ＤＮＡテンプレートは、以下の配列を有する（標的アデノシンを太字の下線付きで示す）：
【0116】
【化1】
【0117】
標的ｓｓＲＮＡは以下の配列を有する（標的アデノシンは太字の下線付きで示す）：
【0118】
【化2】
【0119】
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて標的ｓｓＲＮＡをゲル精製した。溶解物を得るために、ＨＥＫ２９３細胞を、最初にリポフェクタミン３０００を用いて５００ｎｇのＡＤＡＲＢ１発現プラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ）と共に一晩トランスフェクトした。次に細胞をＬｙｓｉｓ－Ｍ試薬を用いて溶解した。２００ｎＭのＡＯＮおよび９０ｎＭのＳＥＲＰＩＮＡ１テンプレートｓｓＲＮＡを、インビトロ編集アッセイ緩衝液中、３０℃で３０分間一緒にプレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞溶解物を添加し（１０μｌ）、反応混合物を３０℃で３０分間、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、標的化ＲＮＡをフェノールクロロホルム抽出により抽出し、そして製造業者のプロトコールを用いて、Ｓｅｒｐｉｎａ１－Ｆ２フォワードプライマー（５’－ＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＴＡＡＧＧ－３’；配列番号７）およびＳｅｒｐｉｎａ１－Ｒ２リバースプライマー（上記参照）を用いて、Ｍａｘｉｍａ ＲＴ試薬を用いて逆転写した。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、Ｓｅｒｐｉｎａ１－Ｒ１プライマー（５’－ＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＴＧＧ－３’；配列番号８）を用いたサンガー配列決定により分析した。
【0120】
図８は、ＡＤＡＲ６０－１をＳＥＲＰＩＮＡ１ｍｕｔ ｓｓＲＮＡ標的とインキュベートした場合、ＡからＧへの変化が検出されないことを示している（パネルＡ、矢印で示す位置）。しかしながら、対照的に、ＡＤＡＲ６０－１５を使用すると（パネルＢ）、明らかに検出可能で有意なＡからＧへの変化を示し、標的ＳＥＲＰＩＮＡ１ ＲＮＡの編集を裏付ける。陰性対照反応（パネルＣおよびＤ）は、ＡからＧへの編集を示さない。ＡＤＡＲ６０－１５におけるヌクレオチド塩基の化学修飾は、そのような修飾を有さないオリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ６０－１）と比較して、ＡＤＡＲ２のＲＮＡ編集活性を増強することができると結論づけられる。
【0121】
[実施例４]
セントラルトリプレットにおける２－アミノプリン修飾を含むＡＯＮを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異のＲＮＡ編集
細胞ゲノムに安定に組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現構築物を含む細胞においてＲＮＡ編集も調べた（詳細および構築物については国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットを参照）。この構築物において、終止コドン（ＴＡＧ）がコドン位置５７に導入され、標的ＲＮＡ中にトリプレットＵＡＧをもたらした。このトリプレットの中央にあるアデノシンでのＲＮＡの編集は、最終的にはＴｒｐをコードするコドンを生じさせ、その後、全長タンパク質を発現させるであろう。構築物および細胞株（安定に組み込まれたＧＦＰ Ｗ５７Ｘプラスミドを含む細胞）は、当業者に知られている技術を使用して生成された。標的ＲＮＡ内の他のアデノシンが編集されないようにするために、終止コドンの反対側のＡＯＮ内の３つのヌクレオチド（オリゴヌクレオチド内の５’－ＣＣＡ－３’、中央のミスマッチＣと共に、図２のＡＤＡＲ５９－２およびＡＤＡＲ５９－１０参照）は２’－Ｏ－メチル修飾を含まないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の他の全てのヌクレオチドは含む。さらに、試験した全てのオリゴヌクレオチドの両側の末端の５つのヌクレオチドはホスホロチオエート連結によってつながっているが、残りの連結は正常な連結であった。ＡＤＡＲ５９－１０では、オリゴヌクレオチドのセントラルトリプレットのＡが２－アミノプリンになるように化学修飾されているが、ＡＤＡＲ５９－２にはそのような特別な修飾はない。Matthewsら（2016）の図５Ｂは、この位置での２－アミノプリン修飾が、活性化の減少（しかし消滅しない）をもたらすことを示す。しかしながら、修飾は、例えば増強されたヌクレアーゼ耐性を潜在的に提供すること、または細胞プロセスを増強することによって、依然として間接的にＲＮＡ編集を増強することができる。
セントラルトリプレットにおける２－アミノプリン修飾を含むＡＯＮを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異のＲＮＡ編集
細胞ゲノムに安定に組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現構築物を含む細胞においてＲＮＡ編集も調べた（詳細および構築物については国際公開第２０１６／０９７２１２号パンフレットを参照）。この構築物において、終止コドン（ＴＡＧ）がコドン位置５７に導入され、標的ＲＮＡ中にトリプレットＵＡＧをもたらした。このトリプレットの中央にあるアデノシンでのＲＮＡの編集は、最終的にはＴｒｐをコードするコドンを生じさせ、その後、全長タンパク質を発現させるであろう。構築物および細胞株（安定に組み込まれたＧＦＰ Ｗ５７Ｘプラスミドを含む細胞）は、当業者に知られている技術を使用して生成された。標的ＲＮＡ内の他のアデノシンが編集されないようにするために、終止コドンの反対側のＡＯＮ内の３つのヌクレオチド（オリゴヌクレオチド内の５’－ＣＣＡ－３’、中央のミスマッチＣと共に、図２のＡＤＡＲ５９－２およびＡＤＡＲ５９－１０参照）は２’－Ｏ－メチル修飾を含まないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の他の全てのヌクレオチドは含む。さらに、試験した全てのオリゴヌクレオチドの両側の末端の５つのヌクレオチドはホスホロチオエート連結によってつながっているが、残りの連結は正常な連結であった。ＡＤＡＲ５９－１０では、オリゴヌクレオチドのセントラルトリプレットのＡが２－アミノプリンになるように化学修飾されているが、ＡＤＡＲ５９－２にはそのような特別な修飾はない。Matthewsら（2016）の図５Ｂは、この位置での２－アミノプリン修飾が、活性化の減少（しかし消滅しない）をもたらすことを示す。しかしながら、修飾は、例えば増強されたヌクレアーゼ耐性を潜在的に提供すること、または細胞プロセスを増強することによって、依然として間接的にＲＮＡ編集を増強することができる。
【0122】
安定なＧＦＰ Ｗ５７Ｘ含有細胞を最初に１μｇのＡＤＡＲ２過剰発現プラスミドでトランスフェクトし（先の実施例を参照）、次いで２４時間後に別々のバッチで１５０ｎＭの各オリゴをトランスフェクトした（両方ともリポフェクタミン２０００を用いる）。その後、ＡＯＮトランスフェクションの２４時間後、ＲＮＡをｃＤＮＡ合成およびその後のＲＴ－ＰＣＲのために単離し、そして配列決定を行ってＲＮＡ編集が起こったか否かを明らかにした。
【0123】
図９に示すように、ＡＤＡＲ５９－１０で観察された編集レベルは、２－アミノプリン修飾の無いコントロール（ＡＤＡＲ５９－２）よりも改善されている。このことは、触媒活性自体への悪影響にもかかわらず、ＡＯＮの修飾は間接的な手段によって全体的な編集レベルに良い影響を及ぼし得ることを示している。そのような修飾を安定性および／または編集活性の増強を支持する他の修飾ヌクレオチドと組み合わせることにより（ここに開示されるように）、ＲＮＡ編集を効率的に活性化するＡＯＮを安定に作成することが今や可能である。
【0124】
[実施例５]
セントラルトリプレットにおけるＤＮＡ修飾を含むＡＯＮを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異の編集
前の実施例に記載されているものと同様に、ＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミドを用いた効率的なＲＮＡ編集のために、ＡＯＮにおける他のいくつかの修飾を調べた。このために、オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ５９－２、ＡＤＡＲ５９－１０およびＡＤＡＲ５９－２２を、対照オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６５－１およびいかなるオリゴヌクレオチドのトランスフェクションもしない対照条件と比較した（図２参照）。詳細には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に６ウェルプレートの１ウェルあたり０．３×１０6ＭＣＦ－７細胞を播種した。２４時間後、リポフェクタミン２０００を用いて、５０ｎｇのＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミドを細胞にトランスフェクトした。再び２４時間後、選択された細胞試料に、リポフェクタミン２０００を使用して１００ｎＭの各ＡＯＮをトランスフェクトした。再度２４時間後、ＲＮＡを溶解細胞から単離し、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。これは、５００ｎｇのＲＮＡを加えることによりＭａｘｉｍａ ｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。これらの試料は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた定量的編集分析に使用された。核酸標的配列の絶対定量のためのｄｄＰＣＲアッセイは、Ｂｉｏ－ＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを使用して行った。ＲＴ－ＰＣＲから得られた１μｌのｃＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｎｏ ｄＵＴＰ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、Ｔａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせた適切なフォワード・リバースプライマーと共に含む２０μｌの反応混合物の全混合物中で使用した：
フォワードプライマー：５’－ＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡ－３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’－ＣＡＣＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＡ－３’（配列番号１０）
野生型プローブ－ＦＡＭ ＮＦＱ標識：５’－ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣ－３’（配列番号１１）
変異プローブ－ＶＩＣ ＮＦＱ標識：５’－ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＡＣ－３’（配列番号１２）
セントラルトリプレットにおけるＤＮＡ修飾を含むＡＯＮを用いたＧＦＰ標的ＲＮＡにおける非センス変異の編集
前の実施例に記載されているものと同様に、ＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミドを用いた効率的なＲＮＡ編集のために、ＡＯＮにおける他のいくつかの修飾を調べた。このために、オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ５９－２、ＡＤＡＲ５９－１０およびＡＤＡＲ５９－２２を、対照オリゴヌクレオチドＡＤＡＲ６５－１およびいかなるオリゴヌクレオチドのトランスフェクションもしない対照条件と比較した（図２参照）。詳細には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に６ウェルプレートの１ウェルあたり０．３×１０6ＭＣＦ－７細胞を播種した。２４時間後、リポフェクタミン２０００を用いて、５０ｎｇのＧＦＰｓｔｏｐ５７プラスミドを細胞にトランスフェクトした。再び２４時間後、選択された細胞試料に、リポフェクタミン２０００を使用して１００ｎＭの各ＡＯＮをトランスフェクトした。再度２４時間後、ＲＮＡを溶解細胞から単離し、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。これは、５００ｎｇのＲＮＡを加えることによりＭａｘｉｍａ ｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。これらの試料は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた定量的編集分析に使用された。核酸標的配列の絶対定量のためのｄｄＰＣＲアッセイは、Ｂｉｏ－ＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを使用して行った。ＲＴ－ＰＣＲから得られた１μｌのｃＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｎｏ ｄＵＴＰ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）、Ｔａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせた適切なフォワード・リバースプライマーと共に含む２０μｌの反応混合物の全混合物中で使用した：
フォワードプライマー：５’－ＡＣＣＣＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡ－３’（配列番号９）
リバースプライマー：５’－ＣＡＣＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＡ－３’（配列番号１０）
野生型プローブ－ＦＡＭ ＮＦＱ標識：５’－ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣ－３’（配列番号１１）
変異プローブ－ＶＩＣ ＮＦＱ標識：５’－ＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＡＡＣ－３’（配列番号１２）
【0125】
ｃＤＮＡを含む全量２０μｌのＰＣＲ混合液を、マルチチャンネルピペットを用いてｄｄＰＣＲカートリッジ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）の中央列に充填した。複製物は２つのカートリッジに分けられた。一番下の列をプローブ用の液滴生成油（Ｂｉｏ Ｒａｄ）７０μｌで満たした。ゴムガスケットの交換後、ＱＸ２００液滴発生器で液滴を生成させた。カートリッジの最上列から４０μｌの油エマルジョンを９６ウェルＰＣＲプレートに移した。ＰＣＲプレートを１７０℃で４秒間ＰＸ１プレートシーラーを使用してスズ箔で密封し、続けて以下のＰＣＲプログラムを行った：１サイクルの９５℃で１０分間の酵素活性化、４０サイクルの９５℃で３０秒間の変性および５９．７℃で１分間のアニーリング／伸長、１サイクルの９８℃で１０分間の酵素失活、続けて８℃での保存。ＰＣＲ後、プレートを読み取り、ＱＸ２００液滴リーダーで分析した。ＧＦＰｓｔｏｐ５７由来のＲＮＡについて上述したように異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡ編集した後に得られたｃＤＮＡ上のｄｄＰＣＲの結果を表２に提供する。これは、ＰＣＲ産物の集団において、プラスミド単独または対照オリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクション後、ｗｔコピーが検出できなかったことを示している。しかしながら、ＡＤＡＲ５９－２、ＡＤＡＲ５９－１０、およびＡＤＡＲ５９－２２によるトランスフェクションでは、総母集団で有意な量の野生型コピーが得られた。ＡＤＡＲ５９－２２（標的アデノシンの反対側のＣを囲む２つのＤＮＡヌクレオチドを有する）を用いると、８．３％ｗｔコピーまでのＲＮＡ編集をもたらした。この実験ではさらなるＲＮＡ編集酵素を使用しなかったため、セントラルトリプレット内のＤＮＡヌクレオチドの使用は、内在性ＡＤＡＲ酵素を使用する効率的なＲＮＡ編集に有益であることを示している。
【0126】
【表2】
【0127】
したがって、好ましい実施形態では、本発明はまた、セントラルトリプレットのヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドであり、より好ましくはセントラルトリプレットの標的アデノシンの反対側のＣの両側の２つのヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドである本発明によるＡＯＮに関する。
【0128】
[実施例６]
インビトロでの内在性標的に対する内在性ＡＤＡＲを用いたＲＮＡ編集
次に、内在性標的上で内在性ＡＤＡＲタンパク質を用いて、つまりいずれも過剰発現させることなくＲＮＡ編集を達成することが可能であるか否かを調べた。マウスの小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（ＳＮＲＰＡ）をコードするＲＮＡは、その中程度の豊富さで遍在的な発現のために内在性の標的として選択された。ＳＮＲＰＡは、前駆体ｍＲＮＡの５’スプライス部位に結合し、そしてスプライシングに必要とされるＵ１小核リボ核タンパク質のステムループＩＩと会合する。このタンパク質は、二量体化を介してそれ自身のｍＲＮＡ前駆体のポリアデニル化阻害によってそれ自体を自己調節し、そしてスプライシングとポリアデニル化とのカップリングに関与している。ＡＯＮはマウスＳｎｒｐａ（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡの野生型終止コドン（ＵＡＧ）を編集するように設計されており、次いで、それはメッセンジャーの伸長をもたらす可能性があり、下流の配列によってコードされる２５アミノ酸の増加を伴うより大きなタンパク質をもたらす。ＳＮＲＰＡタンパク質の元のサイズはおよそ３１．６８ｋＤａであり、そして拡大されたタンパク質は約３４．４３ｋＤａと計算される。図２は、セントラルトリプレットの３つのＤＮＡヌクレオチドを含むＡＤＡＲ９４－１の配列を示しているが、他の全てのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡである。両端の５つの末端ヌクレオチドはホスホロチオエート連結で結合している。セントラルトリプレットの外側の標的配列と比較してバルジを含むＡＤＡＲ９４－１（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７参照）をＨＥＰＡ１－６およびＣＭＴ－６４細胞株で試験した。ＨＥＰＡ１－６は、Ｃ５７／Ｌマウスに発生したＢＷ７７５６マウス肝がん由来である。ＣＭＴ－６４は、Ｃ５７ＢＬ／ｌｃｒｆマウスの原発性肺胞癌腫塊から単離された。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＰＡ１－６については１．７５×１０5細胞／ウェル、ＣＭＴ－６４については１．５×１０5細胞／ウェルの密度で細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。両方の細胞株を通常の培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、非トランスフェクト（ＮＴ対照）、無関係の非標的オリゴ（ＮＴＯ対照；２００ｎＭの５０量体オリゴヌクレオチド）でトランスフェクトする、あるいは最終濃度１００ｎＭのＡＤＡＲ９４－１とＡＯＮをさらに安定化させると考えられるマウス特異的Ｓｎｒｐａ関連センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ２、図２参照）でトランスフェクトした。未公開特許出願ＧＢ１７００９３９．０は、ＲＮＡ編集においてアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を安定化するための保護センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）の使用をさらに記載している。ＡＤＡＲ９４－１とＳＯＮ２を１００μＭストックに希釈し、１：１の比率に混合し、以下のアニーリングプログラムでインキュベートした：６０℃５分、５５℃５分、５０℃５分、４５℃５分、４０℃５分、３５℃５分、３０℃５分、２０℃５分、使用するまで１０℃。トランスフェクションの前に、培地を１．７ｍＬ／ウェルの新鮮な培地に交換し、トランスフェクション混合物（３００μｌ）を添加し、合計２ｍＬ／ウェルにした。トランスフェクションの２４時間後、２ｍＬの新鮮培地を各ウェルに加えた。細胞をさらに２４時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで細胞溶解のために３５０μｌのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに添加した。次いで溶解した細胞を回収し、製造業者によって提供された取扱説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。このキットのオンカラムＤＮＡｓｅを使用せずに、代わりにＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（登録商標）キットをＲＮＡ試料のＤＮＡｓｅ処理に使用した。このために、０．５μｌのＲＮＡｓｅインヒビターを各試料に添加し、そして残りのステップを製造業者の取扱説明書に従って行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ濃度を測定し、製造業者のプロトコールを用いてＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｃＤＮＡ合成に４００ｎｇのＲＮＡを用いた。フォワードプライマーＦｗ１＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡ－３’ 配列番号１３）およびリバースプライマーＲｅｖ１＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＡＣＡＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴ－３’ 配列番号１４）を用いて当業者に一般的に知られている方法を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてチェックし、Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。精製した生成物を配列決定プライマーＳｎｒｐ－１－Ｆｗ１（５’－ＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴ－３’ 配列番号１５）を用いて配列決定した。
インビトロでの内在性標的に対する内在性ＡＤＡＲを用いたＲＮＡ編集
次に、内在性標的上で内在性ＡＤＡＲタンパク質を用いて、つまりいずれも過剰発現させることなくＲＮＡ編集を達成することが可能であるか否かを調べた。マウスの小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡ（ＳＮＲＰＡ）をコードするＲＮＡは、その中程度の豊富さで遍在的な発現のために内在性の標的として選択された。ＳＮＲＰＡは、前駆体ｍＲＮＡの５’スプライス部位に結合し、そしてスプライシングに必要とされるＵ１小核リボ核タンパク質のステムループＩＩと会合する。このタンパク質は、二量体化を介してそれ自身のｍＲＮＡ前駆体のポリアデニル化阻害によってそれ自体を自己調節し、そしてスプライシングとポリアデニル化とのカップリングに関与している。ＡＯＮはマウスＳｎｒｐａ（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡの野生型終止コドン（ＵＡＧ）を編集するように設計されており、次いで、それはメッセンジャーの伸長をもたらす可能性があり、下流の配列によってコードされる２５アミノ酸の増加を伴うより大きなタンパク質をもたらす。ＳＮＲＰＡタンパク質の元のサイズはおよそ３１．６８ｋＤａであり、そして拡大されたタンパク質は約３４．４３ｋＤａと計算される。図２は、セントラルトリプレットの３つのＤＮＡヌクレオチドを含むＡＤＡＲ９４－１の配列を示しているが、他の全てのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ＲＮＡである。両端の５つの末端ヌクレオチドはホスホロチオエート連結で結合している。セントラルトリプレットの外側の標的配列と比較してバルジを含むＡＤＡＲ９４－１（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７参照）をＨＥＰＡ１－６およびＣＭＴ－６４細胞株で試験した。ＨＥＰＡ１－６は、Ｃ５７／Ｌマウスに発生したＢＷ７７５６マウス肝がん由来である。ＣＭＴ－６４は、Ｃ５７ＢＬ／ｌｃｒｆマウスの原発性肺胞癌腫塊から単離された。トランスフェクションの２４時間前に、ＨＥＰＡ１－６については１．７５×１０5細胞／ウェル、ＣＭＴ－６４については１．５×１０5細胞／ウェルの密度で細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。両方の細胞株を通常の培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、非トランスフェクト（ＮＴ対照）、無関係の非標的オリゴ（ＮＴＯ対照；２００ｎＭの５０量体オリゴヌクレオチド）でトランスフェクトする、あるいは最終濃度１００ｎＭのＡＤＡＲ９４－１とＡＯＮをさらに安定化させると考えられるマウス特異的Ｓｎｒｐａ関連センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ２、図２参照）でトランスフェクトした。未公開特許出願ＧＢ１７００９３９．０は、ＲＮＡ編集においてアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を安定化するための保護センスオリゴヌクレオチド（ＳＯＮ）の使用をさらに記載している。ＡＤＡＲ９４－１とＳＯＮ２を１００μＭストックに希釈し、１：１の比率に混合し、以下のアニーリングプログラムでインキュベートした：６０℃５分、５５℃５分、５０℃５分、４５℃５分、４０℃５分、３５℃５分、３０℃５分、２０℃５分、使用するまで１０℃。トランスフェクションの前に、培地を１．７ｍＬ／ウェルの新鮮な培地に交換し、トランスフェクション混合物（３００μｌ）を添加し、合計２ｍＬ／ウェルにした。トランスフェクションの２４時間後、２ｍＬの新鮮培地を各ウェルに加えた。細胞をさらに２４時間インキュベートした。その後、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、次いで細胞溶解のために３５０μｌのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに添加した。次いで溶解した細胞を回収し、製造業者によって提供された取扱説明書に従ってＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。このキットのオンカラムＤＮＡｓｅを使用せずに、代わりにＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（登録商標）キットをＲＮＡ試料のＤＮＡｓｅ処理に使用した。このために、０．５μｌのＲＮＡｓｅインヒビターを各試料に添加し、そして残りのステップを製造業者の取扱説明書に従って行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ濃度を測定し、製造業者のプロトコールを用いてＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｃＤＮＡ合成に４００ｎｇのＲＮＡを用いた。フォワードプライマーＦｗ１＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡ－３’ 配列番号１３）およびリバースプライマーＲｅｖ１＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＡＣＡＣＡＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴ－３’ 配列番号１４）を用いて当業者に一般的に知られている方法を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてチェックし、Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。精製した生成物を配列決定プライマーＳｎｒｐ－１－Ｆｗ１（５’－ＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴ－３’ 配列番号１５）を用いて配列決定した。
【0129】
ＨＥＰＡ１－６細胞についての配列決定結果を図１０Ａに示し、ＣＭＴ６４細胞についての配列決定結果を図１０Ｂに示す。明らかに、非トランスフェクト（ＮＴ、左パネル）および非標的オリゴヌクレオチド（ＮＴＯ、中央パネル）対照は、終止コドン（矢印で示される終止コドンの中央位置）で検出可能なＲＮＡ編集を示さない。しかしながら、右パネルに明らかに見られるように、ＣＭＴ６４細胞やＨＥＰＡ１－６細胞においても、ＡＤＡＲ９４－１オリゴヌクレオチドを（ここでは保護ＳＯＮ２オリゴヌクレオチドと組み合わせて）使用した場合に検出可能な有意なＲＮＡ編集がある。図１１は、このＳＮＲＰＡ ＲＮＡ編集が保護的なＳＯＮなしでも達成され得るが、ＳＯＮの追加がＲＮＡ編集のレベルを高めたことを示す。この＋／－ＳＯＮ実験の手順は、上記のものと同様であり、ＨＥＰＡ１－６細胞において行われた。
【0130】
これらの結果は、この非限定的な例において、Ｓｎｒｐａ標的ＲＮＡをモデルとして使用して、ＲＮＡ編集が内在性標的ＲＮＡ配列上で内在性ＡＤＡＲ酵素によって達成され得ることを示す。重要なことには、ＡＯＮのセントラルトリプレットが３つの連続したＤＮＡヌクレオチドからなる場合（一方で残りのＡＯＮが好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾されたＲＮＡヌクレオチドからなる場合）、非常にクリアで有意なレベルのＲＮＡ編集が達成される。
【0131】
したがって、好ましい態様において、本発明は、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含むＲＮＡ編集ＡＯＮに関し、標的アデノシンの反対側のヌクレオチドがセントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１つ、より好ましくは２つ、さらにより好ましくは、３つの全てのヌクレオチドは、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導において、ＡＯＮをより安定におよび／またはより効果的にするためのＤＮＡヌクレオチドである。もう１つの好ましい態様において、ＡＯＮの残りは、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾されているＲＮＡヌクレオチドからなる。
【0132】
[実施例７]
内在性標的上の内在性ＡＤＡＲによるｅｘ ｖｉｖｏでのＲＮＡ編集
先の実施例に記載したようにＳｎｒｐａ標的配列のインビトロＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集の証拠を見出した後、同じＡＤＡＲ９４－１オリゴヌクレオチドを用い、マウス野生型初代肺細胞において内在性ＡＤＡＲタンパク質によりエクスビボでＲＮＡ編集を達成することが可能か否かを調べた（図２および実施例６参照）。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのマウス肺解離キット（商品番号１３０－０９５－９２７）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するマウスから細胞を単離した。手短に述べると、全ての試薬は製造業者に従って無菌条件下で調製した。マウスをＣＯ2窒息により屠殺し、ＰＢＳで灌流した。次にマウスの肺を体から切開し、氷上でＰＢＳを含む５０ｍｌチューブに移した。続いてマウスの肺を単一葉に解剖し、キット特異的酵素混合物を含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ－チューブに移した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳプログラム３７Ｃ＿ｍ＿ＬＤＫ＿１を用いて組織を処理した。プログラム終了後、試料をＭＡＣＳ ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒ（７０μｍ）に適用し、４℃で１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、計数し、そしてその後の処理まで適切な培養フラスコ中で培養した。トランスフェクションのために、細胞を３．０×１０5細胞／ウェルの密度でプレーティングした。実施例６に記載のように、オリゴヌクレオチドをＳＯＮ２にアニールした。細胞を製造業者のプロトコールに従ってＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、非トランスフェクト（ＮＴ）、ヒトＳＮＲＰＡ配列を標的とする最終濃度１００ｎＭオリゴ（ＡＤＡＲ８７－１＋ＳＯＮ２）でトランスフェクト、またはマウスＳｎｒｐａ配列を標的とする最終濃度１００ｎＭオリゴ（ＡＤＡＲ９４－１＋ＳＯＮ２）でトランスフェクトした。ＡＤＡＲ８７－１のシーケンスについては、図２を参照（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７もまた参照）。トランスフェクションの６時間後、培地を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと交換し、細胞をトランスフェクション後、合計で４８時間培養した。これらの４８時間後、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解のために３５０μｌのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに添加した。製造業者のプロトコールに従って、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ濃度を測定し、製造業者のプロトコールに従ってＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。フォワードプライマーＦｗ２＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣ－３’ 配列番号１６）およびリバースプライマーＲｅｖ２＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ－３’ 配列番号１７）を用いて当業者に一般的に知られている方法を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒでチェックし、Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。精製生成物を、配列決定プライマーＳｎｒｐ－１－Ｆｗ１を用いて配列決定した（上記参照）。配列決定結果を図１２に示す。ＴＡＧ終止コドン中の標的Ａは矢印で示されている。ＡＤＡＲを介した編集は、ＴＡＧコドンのＡピークの下のＧピークとしてＤＮＡ配列に表示される。非トランスフェクト（ＮＴ、左）および非標的対照オリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ８７－１＋ＳＯＮ２、中央）は、ＴＡＧ終止コドンで検出可能なＲＮＡ編集を示さない。しかしながら、細胞にＡＤＡＲ９４－１＋ＳＯＮ２をトランスフェクトすると（右パネル）、ＴＡＧ終止コドンに明瞭に検出可能な編集が観察される。
内在性標的上の内在性ＡＤＡＲによるｅｘ ｖｉｖｏでのＲＮＡ編集
先の実施例に記載したようにＳｎｒｐａ標的配列のインビトロＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集の証拠を見出した後、同じＡＤＡＲ９４－１オリゴヌクレオチドを用い、マウス野生型初代肺細胞において内在性ＡＤＡＲタンパク質によりエクスビボでＲＮＡ編集を達成することが可能か否かを調べた（図２および実施例６参照）。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのマウス肺解離キット（商品番号１３０－０９５－９２７）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドを有するマウスから細胞を単離した。手短に述べると、全ての試薬は製造業者に従って無菌条件下で調製した。マウスをＣＯ2窒息により屠殺し、ＰＢＳで灌流した。次にマウスの肺を体から切開し、氷上でＰＢＳを含む５０ｍｌチューブに移した。続いてマウスの肺を単一葉に解剖し、キット特異的酵素混合物を含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃ－チューブに移した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳプログラム３７Ｃ＿ｍ＿ＬＤＫ＿１を用いて組織を処理した。プログラム終了後、試料をＭＡＣＳ ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒ（７０μｍ）に適用し、４℃で１０分間、３００×ｇで遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、計数し、そしてその後の処理まで適切な培養フラスコ中で培養した。トランスフェクションのために、細胞を３．０×１０5細胞／ウェルの密度でプレーティングした。実施例６に記載のように、オリゴヌクレオチドをＳＯＮ２にアニールした。細胞を製造業者のプロトコールに従ってＴｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、非トランスフェクト（ＮＴ）、ヒトＳＮＲＰＡ配列を標的とする最終濃度１００ｎＭオリゴ（ＡＤＡＲ８７－１＋ＳＯＮ２）でトランスフェクト、またはマウスＳｎｒｐａ配列を標的とする最終濃度１００ｎＭオリゴ（ＡＤＡＲ９４－１＋ＳＯＮ２）でトランスフェクトした。ＡＤＡＲ８７－１のシーケンスについては、図２を参照（ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４６７もまた参照）。トランスフェクションの６時間後、培地を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと交換し、細胞をトランスフェクション後、合計で４８時間培養した。これらの４８時間後、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解のために３５０μｌのＴｒｉｚｏｌを各ウェルに添加した。製造業者のプロトコールに従って、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡミニプレップ（Ｚｙｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ濃度を測定し、製造業者のプロトコールに従ってＭａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、５００ｎｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成に用いた。フォワードプライマーＦｗ２＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣ－３’ 配列番号１６）およびリバースプライマーＲｅｖ２＿ｍＳＮＲＰＡ（５’－ＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧ－３’ 配列番号１７）を用いて当業者に一般的に知られている方法を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒでチェックし、Ｎｕｃｌｅｏ－Ｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。精製生成物を、配列決定プライマーＳｎｒｐ－１－Ｆｗ１を用いて配列決定した（上記参照）。配列決定結果を図１２に示す。ＴＡＧ終止コドン中の標的Ａは矢印で示されている。ＡＤＡＲを介した編集は、ＴＡＧコドンのＡピークの下のＧピークとしてＤＮＡ配列に表示される。非トランスフェクト（ＮＴ、左）および非標的対照オリゴヌクレオチド（ＡＤＡＲ８７－１＋ＳＯＮ２、中央）は、ＴＡＧ終止コドンで検出可能なＲＮＡ編集を示さない。しかしながら、細胞にＡＤＡＲ９４－１＋ＳＯＮ２をトランスフェクトすると（右パネル）、ＴＡＧ終止コドンに明瞭に検出可能な編集が観察される。
【0133】
モデルとして内在性Ｓｎｒｐａ標的ＲＮＡを使用して内在性ＡＤＡＲによってＲＮＡ編集が達成され得ると結論される。さらに、この実施例で使用される細胞はマウスから直接単離されたので、（治療用）オリゴヌクレオチドを用いて、内在性標的上の内在性ＡＤＡＲによる部位特異的なＲＮＡ編集がインビボで実行可能であることが示される。これに加えて、そして実施例６に既に示されているように、それは標的ＡＯＮのセントラルトリプレットが３つの連続したＤＮＡヌクレオチドからなるとき（ＡＯＮの残りは、好ましくは２’－Ｏ－メチル修飾されたＲＮＡヌクレオチドからなる）、内在性レベルのＡＤＡＲを使用すると、非常にクリアで有意なレベルのＲＮＡ編集が達成できることが示されている。
【0134】
[実施例８]
ｄｄＰＣＲにより測定したマウスＷＴ初代肺細胞におけるＳｎｒｐａ（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ上のＲＮＡ編集
さらに、ＲＮＡ編集能力のさらなる改善のために、いわゆるセントラルトリプレットの外側の位置におけるヌクレオシドの化学修飾を調べた。これまでの例で説明したように、ＡＤＡＲ８９－１０、－１５、および－２０を使用して、Ｓｎｒｐａモデルにおいても試験した。－１位のヌクレオシドのリボースは２’－Ｏ－メチル修飾されており、＋２位および＋３位のヌクレオシドは以下のように修飾されていた：ＡＤＡＲ８９－１０においては２’－Ｏ－メチル、ＡＤＡＲ８９－１５においてはデオキシリボース（ＤＮＡ）、およびＡＤＡＲ８９－２０においては２’－ＮＨ2（図２）。これらのＡＯＮの編集能力は、前の実施例に記載されるように初代肺細胞アッセイにおいて試験され、以下のようにｄｄＰＣＲ技術によって分析された。核酸標的配列の絶対定量は、ＢｉｏＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを用いて行った。ＲＴ－ＰＣＲから得られた１μｌのｃＤＮＡ（１／１０希釈）を、関連するフォワードおよびリバースプライマーを以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせて用いるＴａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイ、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｎｏ ｄＵＴＰ（ＢｉｏＲａｄ）を含む２０μｌ反応ミックスの総量混合液中で使用した：
フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡ－３’（配列番号１８）
リバースプライマー：５’－ＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＡＣＴＣ－３’（配列番号１９）
ｗｔプローブ（ＨＥＸ ＩＢＦＱ標識）５’－ＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴ－３’（配列番号２０）
変異プローブ（ＦＡＭ ＩＢＦＱ標識）５’－ＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴ－３’（配列番号２１）
ｄｄＰＣＲにより測定したマウスＷＴ初代肺細胞におけるＳｎｒｐａ（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡ上のＲＮＡ編集
さらに、ＲＮＡ編集能力のさらなる改善のために、いわゆるセントラルトリプレットの外側の位置におけるヌクレオシドの化学修飾を調べた。これまでの例で説明したように、ＡＤＡＲ８９－１０、－１５、および－２０を使用して、Ｓｎｒｐａモデルにおいても試験した。－１位のヌクレオシドのリボースは２’－Ｏ－メチル修飾されており、＋２位および＋３位のヌクレオシドは以下のように修飾されていた：ＡＤＡＲ８９－１０においては２’－Ｏ－メチル、ＡＤＡＲ８９－１５においてはデオキシリボース（ＤＮＡ）、およびＡＤＡＲ８９－２０においては２’－ＮＨ2（図２）。これらのＡＯＮの編集能力は、前の実施例に記載されるように初代肺細胞アッセイにおいて試験され、以下のようにｄｄＰＣＲ技術によって分析された。核酸標的配列の絶対定量は、ＢｉｏＲａｄのＱＸ－２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを用いて行った。ＲＴ－ＰＣＲから得られた１μｌのｃＤＮＡ（１／１０希釈）を、関連するフォワードおよびリバースプライマーを以下の遺伝子特異的プローブと組み合わせて用いるＴａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型アッセイ、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｎｏ ｄＵＴＰ（ＢｉｏＲａｄ）を含む２０μｌ反応ミックスの総量混合液中で使用した：
フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡ－３’（配列番号１８）
リバースプライマー：５’－ＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＡＣＴＣ－３’（配列番号１９）
ｗｔプローブ（ＨＥＸ ＩＢＦＱ標識）５’－ＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴ－３’（配列番号２０）
変異プローブ（ＦＡＭ ＩＢＦＱ標識）５’－ＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴ－３’（配列番号２１）
【0135】
ｃＤＮＡを含む総量２０μｌのＰＣＲミックスを、マルチチャンネルピペットを用いてｄｄＰＣＲカートリッジ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）の中央列に充填した。複製物は２つのカートリッジに分けられた。一番下の列をプローブ用の液滴生成油（Ｂｉｏ Ｒａｄ）７０μｌで満たした。ゴムガスケットの交換後、ＱＸ２００液滴発生器で液滴を生成させた。カートリッジの最上列から４０μｌの油エマルジョンを９６ウェルＰＣＲプレートに移した。ＰＣＲプレートを１７０℃で４秒間ＰＸ１プレートシーラーを使用してスズ箔で密封し、直後に続けて以下のＰＣＲプログラムを行った：１サイクルの９５℃で１０分間の酵素活性化、４０サイクルの９５℃で３０秒間の変性および６３．８℃で１分間のアニーリング／伸長、１サイクルの９８℃で１０分間の酵素失活、続けて８℃での保存。ＰＣＲプログラムの後、プレートを読み取り、ＱＸ２００液滴リーダーを用いて以下の設定で分析した：絶対定量、プローブｎｏ ｄＵＴＰ用Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、Ｃｈ１ ＦＡＭ野生型およびＣＨ２ ＨＥＸ変異体。図１３により提供される結果は、標的ＲＮＡの有意な編集が全てのＡＯＮによって達成され、ＡＤＡＲ８９－２０が最高の実績であったことを示している。
【0136】
[実施例９]
ＲＮＡ編集のためのマウスＩＤＵＡ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾
次に、本発明者らは、安定化をもたらした修飾をさらに組み合わせることができるか否か、およびそのような組み合わせを有するＡＯＮがＨｕｒｌｅｒモデルにおけるＲＮＡ編集において機能的であるか否かを検証した（実施例２もまた参照）。野生型配列の復帰におけるこれらのＡＯＮの効果を、マウスＩｄｕａ遺伝子によってコードされるアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の活性を測定するアッセイで試験した。このために、Ｗ３９２Ｘ変異マウス由来の不死化マウス胚性線維芽細胞（１試料あたり７００００個）を増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）中で培養し、リポフェクタミン３０００を用いて全長Ｉｄｕａ Ｗ３９２Ｘ ｃＤＮＡを有する発現プラスミド１μｇをトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＡＤＡＲ６５シリーズの各ＡＯＮをそれぞれ１００ｎＭ（最終濃度）で同様にトランスフェクトし（安定性の結果については図５および６を参照）、さらに４８時間培養した。次いで細胞を回収し、そしてｍＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８５０１）中で溶解した。細胞断片を遠心分離により溶解物から除去し、そして２５μｌの上清を酵素５アッセイに使用した：２５μｌの３６０μＭ ４－メチルウンベリフェリルアルファ－Ｌ－イズロニド（０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中）を溶解物試料に添加し、その後、３７℃で２時間インキュベートした。２００μｌの０．１７Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．９）を添加することによって反応を停止させ、次いで得られた蛍光強度を測定した（励起波長３６５ｎｍおよび発光４５０ｎｍ）。結果は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって１０測定されるように、試料の総タンパク質濃度に対して正規化させた。
ＲＮＡ編集のためのマウスＩＤＵＡ ＲＮＡを標的とするＡＯＮの化学修飾
次に、本発明者らは、安定化をもたらした修飾をさらに組み合わせることができるか否か、およびそのような組み合わせを有するＡＯＮがＨｕｒｌｅｒモデルにおけるＲＮＡ編集において機能的であるか否かを検証した（実施例２もまた参照）。野生型配列の復帰におけるこれらのＡＯＮの効果を、マウスＩｄｕａ遺伝子によってコードされるアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の活性を測定するアッセイで試験した。このために、Ｗ３９２Ｘ変異マウス由来の不死化マウス胚性線維芽細胞（１試料あたり７００００個）を増殖培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）中で培養し、リポフェクタミン３０００を用いて全長Ｉｄｕａ Ｗ３９２Ｘ ｃＤＮＡを有する発現プラスミド１μｇをトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＡＤＡＲ６５シリーズの各ＡＯＮをそれぞれ１００ｎＭ（最終濃度）で同様にトランスフェクトし（安定性の結果については図５および６を参照）、さらに４８時間培養した。次いで細胞を回収し、そしてｍＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃７８５０１）中で溶解した。細胞断片を遠心分離により溶解物から除去し、そして２５μｌの上清を酵素５アッセイに使用した：２５μｌの３６０μＭ ４－メチルウンベリフェリルアルファ－Ｌ－イズロニド（０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中）を溶解物試料に添加し、その後、３７℃で２時間インキュベートした。２００μｌの０．１７Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９．９）を添加することによって反応を停止させ、次いで得られた蛍光強度を測定した（励起波長３６５ｎｍおよび発光４５０ｎｍ）。結果は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって１０測定されるように、試料の総タンパク質濃度に対して正規化させた。
【0137】
図１４に提供された結果は、トランスフェクトされたＡＤＡＲ６５オリゴヌクレオチドの全てが、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性を非トランスフェクト（ＮＴ）レベルを超えて増加させることができたことを示しており、標的（ｐｒｅ－）ｍＲＮＡが編集されたことを示す。実際に適用されたＡＯＮのほとんどは、標的ＲＮＡを非常に効率的に編集しているようである。安定性アッセイ（図５および６）と比較して分かるように、多くのＡＯＮ（特にＡＤＡＲ６５－２３からＡＤＡＲ６５－３０）は高い安定性を示し、そしてまたアルファ－Ｌ－イズロニダーゼの酵素活性を回復する良好な能力を示している。このことは、ＤＮＡヌクレオチドの使用、ならびにセントラルトリプレット内のホスホロチオエート連結および２’－フルオロ修飾が有用であり、したがって本発明の好ましい実施形態を示す。
本出願は例えば以下の発明を提供する。
[１] 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内、好ましくはヒト細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、前記ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にし、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、ＡＯＮ。
[２] 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、[１]に記載のＡＯＮ。
[３] 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが２’－Ｏ－アルキル修飾を有しない、[１]または[２]に記載のＡＯＮ。
[４] 前記セントラルトリプレットの１または２個のヌクレオチド、好ましくは中央のヌクレオチド以外のものが、イノシンで置換されている、[１]～[３]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[５] 前記ＡＯＮが、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステム－ループ構造を形成することができる部分を含まない、[１]～[４]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[６] 前記糖修飾が、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される、[１]～[５]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[７] 前記ＡＯＮが、ホスホロチオエート、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデートおよび２’－５’ホスホジエステルからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間連結修飾を含む、[１]～[６]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[８] 前記ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結しており、好ましくは５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエートおよび／またはＬＮＡ連結で連結している、[７]に記載のＡＯＮ。
[９] 前記塩基修飾が、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、およびシュードウリジンからなる群から選択される、[１]～[８]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１０] 前記セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドが、シチジンまたはウリジンである、[１]～[９]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１１] 前記ＡＯＮ中の前記セントラルトリプレットの外側の１つまたは複数のヌクレオチドが、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチル基などの２’－Ｏ－アルキル基、２’－Ｏ－ＭＯＥ基、２’－Ｆ基、２’－ＮＨ 2 基、およびＬＮＡ；またはそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、[１]～[１０]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１２] 前記ＡＯＮが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長く、前記ＡＯＮが１００ヌクレオチドよりも短く、好ましくは６０ヌクレオチドよりも短い、[１]～[１１]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１３] １８～７０ヌクレオチドを含む、好ましくは１８～６０ヌクレオチドを含む、より好ましくは１８～５０ヌクレオチドを含む、[１２]に記載のＡＯＮ。
[１４] [１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
[１５] 遺伝的障害の治療または予防における使用のためのものであり、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、およびがんからなる群から選択される、[１]～[１３]のいずれかに記載のＡＯＮ。
[１６] 遺伝的障害の治療または予防のための薬剤の製造における[１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮの使用であって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、およびがんからなる群から選択される、ＡＯＮの使用。
[１７] 細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって：
（ｉ）[１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；
（ｉｉ）前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；
（ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および
（ｖ）任意選択で、前記ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップ
を含む方法。
[１８] ステップ（ｖ）が：
ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；
ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または
ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ
を含む、[１７]に記載の方法。
[１９] 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａの変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；または１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ；例えば、５４８Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、もしくはＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５Ａ変異を編集するため）をコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、[１]～[１８]のいずれか一項に記載のＡＯＮまたは方法。
本出願は例えば以下の発明を提供する。
[１] 細胞内に存在するＡＤＡＲ酵素による標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンの脱アミノ化のための、細胞内、好ましくはヒト細胞内の標的ＲＮＡ配列と二本鎖複合体を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であって、前記ＡＯＮは、３つの連続したヌクレオチドのセントラルトリプレットを含み、前記標的アデノシンの真向かいのヌクレオチドは、セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドであり、前記セントラルトリプレット中の１、２または３個のヌクレオチドは糖修飾および／または塩基修飾を含み、前記ＡＯＮをより安定に、および／または、標的アデノシンの脱アミノ化の誘導をより効果的にし、ただし中央のヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、ＡＯＮ。
[２] 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を有しない、[１]に記載のＡＯＮ。
[３] 前記セントラルトリプレットの２または３個のヌクレオチドが２’－Ｏ－アルキル修飾を有しない、[１]または[２]に記載のＡＯＮ。
[４] 前記セントラルトリプレットの１または２個のヌクレオチド、好ましくは中央のヌクレオチド以外のものが、イノシンで置換されている、[１]～[３]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[５] 前記ＡＯＮが、哺乳動物のＡＤＡＲ酵素に結合することができる分子内ステム－ループ構造を形成することができる部分を含まない、[１]～[４]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[６] 前記糖修飾が、デオキシリボース（ＤＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ）および２’－フルオロリボースからなる群から選択される、[１]～[５]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[７] 前記ＡＯＮが、ホスホロチオエート、３’－メチレンホスホネート、５’－メチレンホスホネート、３’－ホスホロアミデートおよび２’－５’ホスホジエステルからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシド間連結修飾を含む、[１]～[６]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[８] 前記ＡＯＮの５’および３’末端の２、３、４、５、または６個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結で連結しており、好ましくは５’および３’末端の５個の末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエートおよび／またはＬＮＡ連結で連結している、[７]に記載のＡＯＮ。
[９] 前記塩基修飾が、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、３－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、７－メチルアデノシン、８－アジドアデノシン、８－メチルアデノシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシチジン、ピロロシチジン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－デアザグアノシン、７－メチルグアノシン、８－アザ－７－デアザグアノシン、チエノグアノシン、イノシン、４－チオ－ウリジン、５－メトキシウリジン、ジヒドロウリジン、およびシュードウリジンからなる群から選択される、[１]～[８]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１０] 前記セントラルトリプレットの中央のヌクレオチドが、シチジンまたはウリジンである、[１]～[９]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１１] 前記ＡＯＮ中の前記セントラルトリプレットの外側の１つまたは複数のヌクレオチドが、ＤＮＡ、２’－Ｏ－メチル基などの２’－Ｏ－アルキル基、２’－Ｏ－ＭＯＥ基、２’－Ｆ基、２’－ＮＨ 2 基、およびＬＮＡ；またはそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、[１]～[１０]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１２] 前記ＡＯＮが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドより長く、前記ＡＯＮが１００ヌクレオチドよりも短く、好ましくは６０ヌクレオチドよりも短い、[１]～[１１]のいずれか一項に記載のＡＯＮ。
[１３] １８～７０ヌクレオチドを含む、好ましくは１８～６０ヌクレオチドを含む、より好ましくは１８～５０ヌクレオチドを含む、[１２]に記載のＡＯＮ。
[１４] [１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮおよび医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
[１５] 遺伝的障害の治療または予防における使用のためのものであり、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、およびがんからなる群から選択される、[１]～[１３]のいずれかに記載のＡＯＮ。
[１６] 遺伝的障害の治療または予防のための薬剤の製造における[１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮの使用であって、前記遺伝的障害は、好ましくは、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、遠位型脊髄性筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連疾患、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーＩ型およびＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、一次繊毛障害、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異などのプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全、スタージ－ウェーバー症候群、およびがんからなる群から選択される、ＡＯＮの使用。
[１７] 細胞内の標的ＲＮＡ配列に存在する少なくとも１つの特定の標的アデノシンの脱アミノ化のための方法であって：
（ｉ）[１]～[１３]のいずれか一項に記載のＡＯＮを前記細胞に提供するステップ；
（ｉｉ）前記ＡＯＮを前記細胞に取り込ませるステップ；
（ｉｉｉ）前記ＡＯＮを前記標的ＲＮＡ配列にアニーリングさせるステップ；
（ｉｖ）野生型酵素に見出されるような天然ｄｓＲＮＡ結合ドメインを含む哺乳動物のＡＤＡＲ酵素により、前記標的ＲＮＡ配列中の前記標的アデノシンをイノシンに脱アミノ化させるステップ；および
（ｖ）任意選択で、前記ＲＮＡ配列中の前記イノシンの存在を同定するステップ
を含む方法。
[１８] ステップ（ｖ）が：
ａ）前記標的ＲＮＡ配列を配列決定するステップ；
ｂ）脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＧＡまたはＵＡＧ終止コドン内に前記標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｃ）両方の標的アデノシンの脱アミノ化によってＵＧＧコドンに編集されたＵＡＡ終止コドン内に２つの標的アデノシンが位置する場合、機能的な、伸長した、全長のおよび／または野生型のタンパク質の存在を評価するステップ；
ｄ）プレｍＲＮＡのスプライシングが脱アミノ化によって変化したか否かを評価するステップ；または
ｅ）機能的読み出しを使用するステップであって、ここで前記脱アミノ化後の前記標的ＲＮＡが、機能的な、全長の、伸長したおよび／または野生型のタンパク質をコードする、ステップ
を含む、[１７]に記載の方法。
[１９] 前記標的ＲＮＡ配列が、ＣＦＴＲ（例えば、１７８４Ｇ＞Ａの変異を編集するため）、ＣＥＰ２９０（例えば、ｃ．２９９１＋１６５５Ａ＞Ｇ変異を編集するため）、アルファ１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ；例えば、９９８９Ｇ＞Ａ変異；または１０９６Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＮＡＱ；例えば、５４８Ｇ＞Ａ変異を編集するため）、もしくはＬＲＲＫ２（例えば、Ｇ６０５５Ａ変異を編集するため）をコードするか、または前記標的ＲＮＡが、ＩＤＵＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ｃ．１２０５Ｇ＞Ａ（Ｗ４０２Ｘ）変異を編集するため）、[１]～[１８]のいずれか一項に記載のＡＯＮまたは方法。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】