特許 7244959 ボツリヌス毒素の安定化液状組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-14

(45)【発行日】2023-03-23

(54)【発明の名称】ボツリヌス毒素の安定化液状組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/02 20060101AFI20230315BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230315BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230315BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20230315BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230315BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20230315BHJP

【ＦＩ】

A61K38/02

A61K9/08

A61K47/26

A61K47/18

A61P21/00

A61P21/02

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021528885

(86)(22)【出願日】2019-11-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-20

(86)【国際出願番号】 KR2019016669

(87)【国際公開番号】W WO2020111852

(87)【国際公開日】2020-06-04

【審査請求日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】10-2018-0151983

(32)【優先日】2018-11-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0101723

(32)【優先日】2019-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】521218788

【氏名又は名称】ヒュオンス バイオファーマ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＵＯＮＳ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム、ワンソプ ポウル

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヨン－モク

(72)【発明者】

【氏名】パク、キ－シク

(72)【発明者】

【氏名】パク、ジェ－ミン

(72)【発明者】

【氏名】イ、エ－ヨン

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１３５７２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１２－５１２１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５１５７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３２７８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５２９５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０９６４４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリソルベート８０及びセリンを有効成分として含む、ボツリヌス毒素の安定化液状組成物であって、
ポリソルベート８０：セリンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：０．５２６（ｍｇ／ｍＬ）以上であり、
前記組成物は、ボツリヌス毒素４０Ｕ／ｍＬ当たり０．０１ｍｇ／ｍＬ以上のポリソルベート８０を含む、組成物。

【請求項2】

前記組成物は、メチオニンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物において、ポリソルベート８０：セリン：メチオニンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：０．５２６～５．２５５（ｍｇ／ｍＬ）：０.０３（ｍｇ／ｍＬ）であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

請求項１～請求項３のいずれかに記載のボツリヌス毒素の安定化液状組成物と、ボツリヌス毒素を有効成分として含む、液状製剤の薬剤学的組成物。

【請求項5】

セリンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり５ｍＭ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

メチオニンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.５ｍＭ未満であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記ボツリヌス毒素は、ボツリヌスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、及びＧ型からなる群から選ばれたものであることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態又は複合体化タンパク質を含有する複合体の形態であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。

【請求項9】

ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物をボツリヌス毒素に混合する段階を含む、ボツリヌス毒素の安定化方法であって、
ポリソルベート８０：セリンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：０．５２６（ｍｇ／ｍＬ）以上であり、
前記組成物は、ボツリヌス毒素４０Ｕ／ｍＬ当たり０．０１ｍｇ／ｍＬ以上のポリソルベート８０を含む、方法。

【請求項10】

ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物のボツリヌス毒素の安定化のための使用であって、
ポリソルベート８０：セリンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：０．５２６（ｍｇ／ｍＬ）以上であり、
前記組成物は、ボツリヌス毒素４０Ｕ／ｍＬ当たり０．０１ｍｇ／ｍＬ以上のポリソルベート８０を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ボツリヌス毒素の安定性の改善に効果のある安定化液状組成物及びその製造方法、並びに前記安定化液状組成物を含むボツリヌス毒素の安定性が改善された薬剤学的組成物に関する。

【0002】

本出願は、２０１８年１１月３０日付で出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０１５１９８３号及び２０１９年８月２０日付で出願された韓国特許出願第１０－２０１９－０１０１７２３号に基づく優先権を主張し、該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。

【背景技術】

【0003】

クロストリジウム属には、形態及び機能によって分類される１２７種以上が属している。嫌気性、グラム陽性バクテリア・クロストリジウム・ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、強力なポリペプチド神経毒素であるボツリヌス毒素（以下、本明細書において、「毒素」も同じ意味で使用する）を生成するが、これはヒト及び動物にボツリヌス症（ｂｏｔｕｌｉｓｍ）として知られている神経麻痺性の病気を起こす。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行障害、嚥下障害及び言語障害から呼吸器筋肉の麻痺及び死亡につながることもある。

【0004】

ボツリヌス毒素の１ユニット（ｕｎｉｔ）は、それぞれ約１８－２０ｇで計量される雌のスイスウェブスターマウスに腹腔内注射時のＬＤ_５０と定義される。ボツリヌス毒素の１ユニットは、雌のスイスウェブスターマウスのグループの５０％を殺すボツリヌス毒素の量である。

【0005】

免疫学的に区別される７種のボツリヌス神経毒素の特徴が分析され、これらは、それぞれボツリヌス神経毒素血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧであり、これらのそれぞれは、類型－特異性抗体で中和して区別される。ボツリヌス毒素の異なる血清型によって、これらが影響を及ぼす動物種及びこれらが引き起こす麻痺の重症度及び持続期間において差がある。ボツリヌス毒素は、高い親和性でコリン作動性モーターニューロンに明らかに結合し、神経細胞へ位置を移し、アセチルコリンのシナプス前放出を遮断する。

【0006】

ボツリヌス毒素は、例えば、活動亢進性骨格筋を特徴とする神経筋肉障害の治療のための臨床的な状況において使用されてきた。ボツリヌス毒素Ａ型は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって１２歳以上の患者の本態性眼瞼けいれん、斜視及び片側顔面けいれんに対して承認され、頸部筋緊張異常症及び眉間（顔面）シワ治療と多汗症の治療に対して承認された。ＦＤＡは、さらに頸部筋緊張異常症及び眉間（顔面）シワの治療に対してボツリヌス毒素Ｂ型を承認した。

【0007】

ボツリヌス毒素Ａ型は、ｐＨ４－６.８の希水溶液に溶解性であることが知られている。約７以上のｐＨにおいて安定化非－毒素タンパク質が神経毒素から分離され、その結果、毒性が漸進的に失われるが、特にｐＨ及び温度が上昇するにつれてそうである。酵素が一般的にそうであるように、ボツリヌス毒素（これは細胞内ペプチデイズである）の生物学的活性は、その三次元形状に、最低限部分的に依存的である。毒素の量をミリリットル当たりミリグラムから数ナノグラムを含有する溶液で希釈することは、例えば、毒素が表面に付着して可用毒素の量を減少させる傾向のようなかなりの困難性がある。また、毒素は、毒素含有薬剤学的組成物が製剤化されてから数ヶ月又は数年後に使用されることもあるが、タンパク質の特性上、容易に酸化されたり、小さな断片に分解されるという問題がある。そこで、安定化剤により毒素を安定化する必要がある。

【0008】

そこで、従来には、前記問題を解決するためにボツリヌス毒素タンパク質の薬剤化過程において、安定化剤として、主にアルブミン、スクロース、トレハロース及び／又はゼラチンが使用されてきた。

【0009】

例えば、後述するように、ボツリヌス毒素含有薬剤学的組成物には、安定化剤としてアルブミンを用いている。

【0010】

商用化されて入手可能なボツリヌス毒素含有薬剤学的組成物は、カリフォルニア州のアーバイン所在のＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃから商用化されて入手可能な商標名ＢＯＴＯＸ（ボツリヌス毒素Ａ型精製された神経毒素複合体）として販売される。それぞれのＢＯＴＯＸの１００ユニットバイアルは、約５nｇの精製されたボツリヌス毒素Ａ型複合体、０.５ｍｇのヒト血清アルブミン、及び０.９ｍｇの塩化ナトリウムから構成され、真空－乾燥形態であり、保存剤なしに（０.９％塩化ナトリウム注入）滅菌生理食塩水として復元されるように製造される。他の商用化されて入手可能なボツリヌス毒素－含有薬剤学的組成物には、Ｄｙｓｐｏｒｔ（ボツリヌス毒素薬剤学的組成物中にラクトース及びヒト血清アルブミンを有するクロストリジウムボツリヌスＡ型毒素ヘマグルチニン複合体、英国のバークシャー所在のＩｐｓｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄから商用化されて入手可能、使用前に０.９％塩化ナトリウムとして復元されるべき粉末）、及びＭｙｏＢｌｏｃ^ＴＭ（ボツリヌス毒素Ｂ型、ヒト血清アルブミン、コハク酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムを含む約ｐＨ５６注射溶液、カリフォルニア州のサンディエゴ所在のＳｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商用化されて入手可能）が含まれる。神経毒性成分（１５０ｋＤａ毒素分子）及びボツリヌス毒素複合体（３００ｋＤａ～９００ｋＤａ）は、例えば、カリフォルニア州のキャンベル所在のＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ；英国のポートンダウン所在のｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｗａｋｏ（日本、大阪）、またミズーリ州のセントルイス所在のＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能である。

【0011】

上述したように、主にアルブミンが多く用いられる理由は、アルブミンは、薬剤学的組成物においてタンパク質の活性成分を安定化できるだけでなく、ヒト患者に注射される場合、免疫原性が無視できるほどであるという長所があるからである。しかし、アルブミンのような血液製品は、患者が血液由来の病原菌又は伝染性微生物に感染する潜在的な危険性をもたらすことができ、特にウイルスの感染やタンパク質によって伝達されるクロイツフェルト－ヤコブ病のような疾病の媒介を完全に排除することができず、これまで知られていなかった病原物質に感染する危険性さえもある。そこで、上述のアルブミンを安定化剤として使用する場合、このような感染物質の伝染のリスクを減少させるため、製造工程中において、供与者や供与部位の選別が行われるとともに、感染物質の除去及び／又は不活性化させる過程が含まれなければならない。

【0012】

この他にゼラチンを用いる場合もあるが、これも動物から得られるタンパク質であるため、アルブミンと同様に疾病を媒介することができ、薬剤化過程においても使用しないことが勧告されている。

【0013】

ボツリヌス毒素タンパク質の薬剤化の過程において、動物源に由来しない安定化剤を用いる技術として、大韓民国登録特許公報第１０－０７９９４００号には、酵母から生産される組換えアルブミン（ｒＳＡ）を薬剤化に用いる方法が開示されているが、組換えアルブミン（ｒＳＡ）の生産及び分離回収の過程で新たな抗原性構造であるネオエピトープ（Ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）が発生し、薬剤の収容者に免疫反応を誘発する可能性を完全に排除できない。

【0014】

また、大韓民国登録特許公報第１０－０６６５４６９号には、ボツリヌス毒素、多糖類（ヒドロキシエチルデンプンを含む）、及びアミノ酸として、リシン、グリシン、ヒスチジン、又はアルギニンを含む薬剤学的組成物が開示されている。しかし、前記特許の薬剤学的組成物は、凍結乾燥形態の製剤のための組成物であり、保管条件も冷凍又は冷蔵に限られている。凍結乾燥形態のボツリヌス毒素は、使用直前に凍結された製剤を溶かしたり、希釈する過程が必要であり、この過程で誤差が生じることもある。また、凍結乾燥形態のボツリヌス毒素は、使用上の不便さがあり、プレフィルドシリンジ形態（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ ｔｙｐｅ）で開発することが不可能であるという問題点が存在する。

【0015】

ボツリヌス毒素を安定化させるための組成物に関連して、米国公開特許公報第２００７－０１３４１９９号には、ポリソルベートを含む非イオン性界面活性剤、及びアミノ酸としてグルタミンとグルタミン酸又はアスパラギンとアスパラギン酸を含む組成物が開示されている。前記特許の液状組成物にボツリヌス毒素を希釈して冷蔵条件である４℃で保管する場合、８ヶ月が経っても安定しているが、常温の３７℃で保管する場合、１ヶ月以内に活性が減少する結果を示し、常温でボツリヌス毒素を含む薬剤学的液状組成物を安定化させるには限界がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明が解決しようとする課題は、動物源に由来しないので、人体に安全であり、室温の条件でもボツリヌス毒素の活性が維持されるようボツリヌス毒素液の安定性を向上させる安定化液状組成物及び安定性が向上されたボツリヌス毒素液を提供することにある。

【0017】

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記記載から本発明が属する技術分野における通常の知識を持つ者に明確に理解されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0018】

前記のような目的を達成するため、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを有効成分として含む、ボツリヌス毒素の安定化液状組成物を提供する。

【0019】

本発明の一具現例として、ポリソルベート８０に対してセリンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：５（ｍＭ）以上であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0020】

本発明のさらに他の具現例として、組成物は、メチオニンをさらに含むことを特徴とする、組成物を提供する。

【0021】

本発明のさらに他の具現例として、組成物においてポリソルベート８０：セリン：メチオニンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：５～５０（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0022】

また、本発明は、ボツリヌス毒素の安定化液状組成物と、ボツリヌス毒素を有効成分として含む液状製剤の薬剤学的組成物を提供する。

【0023】

本発明の一具現例として、ポリソルベート８０の濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり、０.００１ｍｇ以上であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0024】

本発明の一具現例として、セリンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり５ｍＭ以上であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0025】

本発明の一具現例として、メチオニンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり、０.５ｍＭ未満であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0026】

本発明の一具現例として、ボツリヌス毒素は、ボツリヌスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、及びＧ型からなる群から選ばれたものであることを特徴とする、組成物を提供する。

【0027】

好ましくは、前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態又は複合体化タンパク質を含有する複合体の形態であることを特徴とする、組成物を提供する。

【0028】

また、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物をボツリヌス毒素に混合する段階を含む、ボツリヌス毒素の安定化方法を提供する。

【0029】

また、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物のボツリヌス毒素の安定化の用途を提供する。

【0030】

また、本発明は、ボツリヌス毒素の安定化のために使用される薬剤を生産するためのポリソルベート８０及びセリンの用途を提供する。

【発明の効果】

【0031】

本発明は、動物源に由来しない安定化剤を用いるため、ボツリヌス毒素薬剤学的組成物が投与された患者が血液由来病原菌又は伝染性微生物に感染する潜在的な危険性から安定性が保障されうる。また、本発明は、常温条件下でも長期間ボツリヌス毒素の活性が維持されるため、保管及び流通の安定性が確保されうる。また、凍結乾燥過程が不要であるので、製造の利便性が向上した効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0032】

図１は、ポリソルベート８０の濃度変化に伴い、ボツリヌス毒素液投与時の死亡率の変化を示したグラフである。
図２は、セリンの濃度変化に伴い、ボツリヌス毒素液投与時の死亡率の変化を示したグラフである。
図３は、メチオニンの追加によるセリンの濃度変化に伴い、ボツリヌス毒素液投与時の死亡率の変化を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0033】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものだけで、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

【0034】

本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを有効成分として含む、ボツリヌス毒素の安定化液状組成物と、そして、前記ボツリヌス毒素の安定化液状組成物及びボツリヌス毒素を有効成分として含む液状製剤の薬剤学的組成物に関する。

【0035】

また、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを用いてボツリヌス毒素の安定性を向上させる方法に関する。

【0036】

本発明者らは、動物由来のタンパク質を使用しないため安全性が確保され、メチオニンとポリソルベート２０組み合わせのボツリヌス毒素の安定化液状組成物の代替剤として室温条件又は冷蔵保管でも長期間安定性を有する安定化剤を確保するための実験を行った。その結果、セリンとポリソルベート８０の組み合わせが室温条件下でもボツリヌス毒素の活性を長期間維持することに優れた効果があることを確認し、本発明を完成した。

【0037】

本発明において、「安定性又は安定化」は、ボツリヌス毒素の活性が維持されることを意味し、例えば、ボツリヌス毒素の活性が試験前又は特定の条件下にある前と比較し、１０％以上、２０％%以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％で維持されることを意味し、好ましくは、５０％以上、最も好ましくは、１００％で維持されることを意味する。例えば、ボツリヌス毒素を注入した個体数を比較し、（ボツリヌス毒素を注入した個体のうち死亡個体数／ボツリヌス毒素注入個体数）×１００の値が１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％で維持されることを意味し、好ましくは、５０％以上、最も好ましくは、１００％で維持されることを意味する。ボツリヌス毒素の活性は、当業界に公知された様々な方法により測定されてもよく、例えば、ＰｅａｒｃｅＬ.Ｂ．ｅｔ ａｌ １９９４ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１２８：６９－７７」の論文に記された致死率アッセイ方法を参考して毒素の活性を測定した。本発明の実験例によれば、製造されたボツリヌス毒素液状組成物０.１ｍＬ（３又は４ユニット／０.１ｍＬ／マウス）をそれぞれ４週齢ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）雌マウス５匹若しくは１０匹に腹腔注射後、７２時間の間観察して死亡率を確認した。また、「安定性又は安定化」される条件は、室温条件における保管や流通の安定性を意味してもよいが、これに制限されるものではない。具体的な実施例によれば、３５～４５℃／５０～８０％ＲＨの条件、好ましくは、４０℃／７０％ＲＨの条件を意味してもよい。

【0038】

本発明によるボツリヌス毒素の安定化液状組成物は、ポリソルベート８０及びセリンを有効成分として含む。

【0039】

また、本発明による液状製剤の薬剤学的組成物は、前記ボツリヌス毒素の安定化液状組成物及びボツリヌス毒素を有効成分として含む。すなわち、ポリソルベート８０及びセリンと、ボツリヌス毒素を有効成分として含む。

【0040】

本発明において、「セリン」は、化学式がＨＯ_２ＣＣＨ（ＮＨ_２）ＣＨ_２ＯＨである化合物であって、その立体異性体を含む。前記「セリン」は、当業界に公知された様々な方法により得ることができ、化学的に合成する方法、動物の体内で合成されたセリンを分離する方法、又は商業的に流通される化合物を入手する方法などがあり、例えば、３－ホスホヒドロキシパイルベイトとＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）から形成された３－ホスホグリセリン酸塩の酸化過程から始まり、グルタミン酸とのアミノ基転移反応で３－ホスホセリンとリン酸基を除去する方法でセリンを製造してもよいが、これに制限されるものではない。本発明において、液状製剤の薬剤学的組成物に含まれるセリンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり５ｍＭ以上であってもよく、好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり５～１００ｍＭであり、より好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり１５～１００ｍＭであり、最も好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり１５～５０ｍＭである。ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり５ｍＭ以下の濃度では、長期間保管時、セリンによるボツリヌス毒素の安定化効果が一定水準以下で現れることがあり、１００ｍＭを超える場合には、超過による上昇効果がこれ以上現れないことがあり、非経済的な場合がある。

【0041】

本発明において、「ポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０」は、化学式がＣ_６４Ｈ_１２４Ｏ_２６である化合物であって、非イオン性界面活性剤であり、可溶性である。モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸、エマゾール４１３０、Ｔｗｅｅｎ８０、又はツイン７９などと称し、例えば、可塑剤、ゲル化剤、界面活性剤、基剤、糖衣剤、防水剤、付着防止剤、賦形剤、分散剤、崩解剤、湿潤剤、安定化剤、軟化剤、緩衝剤、溶剤、溶解補助剤、乳化剤、腸溶皮剤、コーティング剤、脱色剤、懸濁化剤又は滑沢剤の目的で食品ないし化粧品の添加剤として使用される。当業界に公知された様々な方法で製造されてもよく、自然界で分離したり、化学的に合成してもよい。本発明において、液状製剤の薬剤学的組成物に含まれるポリソルベート８０の濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.００１ｍｇ以上であってもよく、好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.１～５ｍｇであり、より好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.１～２ｍｇであり、最も好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.５～２ｍｇである。ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.００１ｍｇ以下の濃度では、長期間保管時、ポリソルベート８０によるボツリヌス毒素の安定化効果が一定水準以下で現れることがあり、５ｍｇを超える場合には、超過による上昇効果がこれ以上現れないことがあり、非経済的な場合がある。

【0042】

本発明のボツリヌス毒素の安定化液状組成物において、ボツリヌス毒素２０ｕｎｉｔあたりポリソルベート８０に対してセリンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：５（ｍＭ）以上であってもよく、好ましくは、１（ｍｇ／ｍＬ）： ５～５０（ｍＭ）であってもよく、さらに好ましくは、１（ｍｇ／ｍＬ）：１５～５０（ｍＭ）であってもよい。ポリソルベート８０に対してセリンの組成比が１（ｍｇ／ｍＬ）：５（ｍＭ）未満の場合には、長期間保管時、ボツリヌス毒素の安定化効果が一定水準以下で現れることがある。

【0043】

本発明において、「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、及びＧ型からなる群から任意に選ばれてもよく、好ましくは、ボツリヌスＡ型であってもよい。前記ボツリヌス毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態又は複合体化タンパク質を含有する複合体形態をすべて含んでもよい。自然的に形成する複合体化タンパク質を含有せず、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧ型のクロストリジウムボツリヌスに由来するボツリヌス毒素タンパク質の分子量は、約１５０ＫＤａである。しかし、クロストリジウムボツリヌスバクテリアによって毒素タンパク質が生産されるとき、ボツリヌス毒素タンパク質は、ボツリヌス毒素タンパク質の作用を補助及び保護する様々なヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質及び非ヘマグルチニンタンパク質と様々な複合体を形成して生産される。自然的に形成する複合体化タンパク質を含有するボツリヌス毒素Ａ型は、約９００ｋＤａ、５００ｋＤａ、又は３００ｋＤａの分子量を持つ複合体の形態であり、Ｂ型とＣ型は、約５００ｋＤａの分子量を持つ複合体の形態であり、Ｄ型は、約３００ｋＤａ、又は５００ｋＤａの分子量を持つ複合体の形態であり、Ｅ型とＦ型は、約３００ｋＤａの分子量を持つ複合体の形態である。本発明において、ボツリヌス毒素１ユニット（Ｕｎｉｔ）は、体重が１８～２０ｇの雌性スイスウェブスターマウス（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ Ｍｉｃｅ）に腹腔内注射による死亡率が５０％であるＬＤ_５０と定義できる。

【0044】

本発明によるボツリヌス毒素の安定化液状組成物に有効成分として、セリン及びポリソルベート８０の他、メチオニンがさらに含まれてもよい。

【0045】

本発明において、液状製剤の薬剤学的組成物に含まれるメチオニンの濃度は、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.５ｍＭ未満であってもよく、より好ましくは、ボツリヌス毒素４０ｕｎｉｔあたり０.２～０.４ｍＭであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0046】

本発明のボツリヌス毒素の安定化液状組成物において、ボツリヌス毒素２０ｕｎｉｔあたりポリソルベート８０：セリン：メチオニンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：２.５～５０（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）であってもよく、好ましくは、１（ｍｇ／ｍＬ）：５～５０（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）であってもよく、さらに好ましくは、１（ｍｇ／ｍＬ）：７.５～３０（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）であってもよく、よりさらに好ましくは、１（ｍｇ／ｍＬ）：７.５～２５（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）であってもよい。ポリソルベート８０：セリン：メチオニンの組成比は、１（ｍｇ／ｍＬ）：２.５未満５０超過（ｍＭ）：０.２（ｍＭ）である場合には、長期間保管時、ボツリヌス毒素の安定化効果が一定水準以下で現れることもある。

【0047】

本発明によるボツリヌス毒素の安定化液状組成物又は／及びこれを含む液状製剤の薬剤学的組成物は、有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。このとき、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロフィールヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。また、前記成分の他に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。

【0048】

本発明の薬剤学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）してもよく、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選ばれてもよい。

【0049】

本発明の薬剤学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素によって決定されてもよい。

【0050】

本発明に他の薬剤学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されてもよい。併用して投与される製剤は、制限されず、例えば、前記第２の組成物は、アミノグリコシド（Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）系抗生剤又は筋肉・神経伝達を妨害する薬物（ツボクラリン系筋弛緩剤）であってもよい。

【0051】

また、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物をボツリヌス毒素に混合する段階を含む、ボツリヌス毒素の安定化方法を提供する。

【0052】

また、本発明は、ポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物のボツリヌス毒素の安定化の用途及びボツリヌス毒素の安定化のために使用される薬剤を生産するためのポリソルベート８０及びセリンの用途を提供する。

【0053】

また、本発明の「個体」とは、ボツリヌス毒素の投与を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非－ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、イヌ、ネコ、ウマ及びウシなどの哺乳類を意味する。

【0054】

本発明において、「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明のポリソルベート８０及びセリンを含む液状組成物と、ボツリヌス毒素を提供することを意味する。

【0055】

本発明によるボツリヌス毒素の安定化液状組成物は、セリンとポリソルベート８０を混合する段階を含んで製造される。

【0056】

また、本発明による液状製剤の薬剤学的組成物は、セリンとポリソルベート８０を混合してボツリヌス毒素の安定化液状組成物を製造する段階と、前記ボツリヌス毒素の安定化液状組成物とボツリヌス毒素を混合する段階を含んで製造される。すなわち、液状製剤の薬剤学的組成物は、安定化剤としてポリソルベート８０とセリンを含む。

【0057】

必要に応じて、前記段階の他に、一つ以上の段階がさらに含まれてもよく、順序は関係がない。例えば、前記ボツリヌス毒素の安定化液状組成物は、セリンとポリソルベート８０を混合する段階にメチオニンをさらに混合する段階が含まれてもよい。

【実施例】

【0058】

<実施例>
１.ボツリヌス毒素液状組成物の製造
適正濃度に調整されたボツリヌス毒素の安定化液状組成物を用いてボツリヌス毒素液を希釈し、最終的にボツリヌス毒素液の濃度を適正濃度に調節してボツリヌス毒素液状組成物を製造した。

【0059】

<実験例>
１.ボツリヌス毒素の安定化液状組成物の選別試験
クロストリジウムボツリヌス毒素Ａ型の安定化剤を選別するため、様々な安定化剤を用いてボツリヌス毒素の安定化液状組成物の組成を選別する実験を行った。

【0060】

下記表１に示した組成のボツリヌス毒素の安定化液状組成物を用いて、ボツリヌス毒素液の濃度を３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにボツリヌス毒素液を製造した。

【0061】

対照群は、Ｉｎｎｏｔｏｘ特許製剤のように２０ｍＭメチオニン、２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を１０％ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。そして、実験群（実施例１～実施例７）は、２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０を１０％ｓａｌｉｎｅに溶かしたものとそれぞれの２０ｍＭ安定化剤をＮｏｒｍａｌ Ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。

【0062】

製造されたボツリヌス毒素液を４０℃／７０％ＲＨの条件で安定性チャンバーに保管しながら、一定期間ごとにサンプリングした。サンプリングされたボツリヌス毒素液１ｍＬに注射用水（Ｎｏｒｍａｌ Ｓａｌｉｎｅ）９ｍＬを入れて１０倍に希釈し、希釈されたサンプルを４週齢ＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）の雌マウス５匹に３ｕｎｉｔ／０.１ｍｌで腹腔注射した（１ｕｎｉｔ＝ＬＤ_５０）。腹腔注射後に７２時間観察しながら死亡したマウスの数及びそれによる死亡率を確認した。

【0063】

その結果、表１に示したように、実施例１、４と対照群の他には、安定性が急激に低下することが確認できた。すなわち、実施例１、４と対照群においてのみ、ボツリヌス毒素の活性が長期間維持された。

【0064】

前記結果から、セリンとポリソルベート８０の組み合わせがメチオニンとポリソルベート80の組み合わせを代替できる安定化剤であることが分かった。

【0065】

【表1】

【0066】

但し、本安定性実験は生きているマウスを対象としたが、その特性上、同一組成のボツリヌス毒素の液状組成物で安定性実験を行う場合にもマウスの状態によって異なる結果を示すことができる。

【0067】

２.ポリソルベート８０の濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性試験
ボツリヌス毒素の安定化液状組成物の組成でセリンとポリソルベート８０の組み合わせを選別し、ポリソルベート８０の濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験を行った。

【0068】

下記表２に示した組成のボツリヌス毒素の安定化液状組成物を用いて、ボツリヌス毒素液の濃度を４０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにボツリヌス毒素液を製造した。実験群は、５ｍＭセリンと０.００１～２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。具体的な実験方法は、前記実験例１に示したように同様に行った。但し、１０匹のマウスを用いており、腹腔注射する濃度は、４ｕｎｉｔ／０.１ｍｌとした。

【0069】

表２及び図１にポリソルベート８０の濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験結果を示した。ポリソルベート８０の濃度が０.１ｍｇ／ｍＬ以上であれば、すべての濃度においてある程度以上の安定性を示したが、ポリソルベート８０の濃度が０.１ｍｇ／ｍＬ、０.５ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬである場合、６週次まで死亡率が５０％以上であり、ポリソルベート８０の濃度が０.５ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬである場合、１０週次までも１０％の死亡率が確認できた。

【0070】

【表2】

【0071】

３.セリンの濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性試験
ボツリヌス毒素の安定化液状組成物の組成で選別されたセリンとポリソルベート８０の組み合わせにおいて、セリンの濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験を行った。

【0072】

下記表3に示した組成のボツリヌス毒素の安定化液状組成物を用いて、ボツリヌス毒素液の濃度を４０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにボツリヌス毒素液を製造した。対照群は、Ｉｎｎｏｔｏｘ特許製剤のように２０ｍＭメチオニン、２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を１０％ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。実験群は、０.１ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０と５～５０ｍＭセリンを１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。具体的な実験方法は、前記実験例１に記載されたように行った。但し、１０匹のマウスを用いており、腹腔注射する濃度は、４ｕｎｉｔ／０.１ｍｌとした。

【0073】

表３及び図２にセリンの濃度変化によるボツリヌス毒素の安定性実験結果を示した。セリンの濃度が５ｍＭ、１５ｍＭ及び５０ｍＭである場合、６週次まで死亡率が５０％以上であるところ、ボツリヌス毒素活性が維持されることが分かった。特に、セリンの濃度が５０ｍＭである場合、１２週次までも死亡率が５０％以上であるところ、２０ｍＭメチオニンと２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０の組み合わせと比較し、より長期間ボツリヌス毒素の安定性が維持されることが分かった。

【0074】

【表3】

【0075】

４.メチオニンの追加によるボツリヌス毒素の安定性試験
ボツリヌス毒素の安定化液状組成物の組成から選別されたセリンとポリソルベート８０の組み合わせにおいてメチオニンの追加によるボツリヌス毒素の安定性実験を行った。

【0076】

下記表４に示した組成のボツリヌス毒素の安定化液状組成物を用いて、ボツリヌス毒素液の濃度を４０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにボツリヌス毒素液を製造した。対照群は、Ｉｎｎｏｔｏｘ特許製剤のように２０ｍＭメチオニン、２ｍｇ／ｍＬポリソルベート２０を１０％ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。実験群は、２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、５～５０ｍＭセリンと０.４ｍＭメチオニンを１０％Ｎｏｒｍａｌ Ｓａｌｉｎｅに溶かして製造した。具体的な実験方法は、前記実験例１に記載されたように同様に行った。但し、１０匹のマウスを用いており、腹腔注射する濃度は、４ｕｎｉｔ／０.１ｍｌとした。

【0077】

【表4】

【0078】

その結果、表４及び図３に示したように、対照群に対して、すべての製剤のメチオニン、セリンとポリソルベート８０の組み合わせによってボツリヌス毒素液の安定性が向上することが分かった。

【0079】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を持つ者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることが分かるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての面で例示的であり、限定的ではないものと理解しなければならない。

【産業上の利用可能性】

【0080】

本発明によるポリソルベート８０及びセリンは、液状ボツリヌス毒素の安定性の向上及び投与の容易性のための組成物などに有効に用いられるものと期待される。

【図1】

【図2】

【図3】