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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-14
(45)【発行日】2023-03-23
(54)【発明の名称】抗ＣＤ２５抗体及びその適用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230315BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230315BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230315BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230315BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230315BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230315BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 D
A61K39/395 N
C12P21/08
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021560469
(86)(22)【出願日】2020-06-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-02
(86)【国際出願番号】 CN2020094919
(87)【国際公開番号】W WO2020248938
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2021-10-05
(31)【優先権主張番号】201910495614.4
(32)【優先日】2019-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910495626.7
(32)【優先日】2019-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521442039
【氏名又は名称】山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＢＯＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３９， Ｋｅｊｉ Ａｖｅｎｕｅ， Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ， Ｙａｎｔａｉ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】宋徳勇
(72)【発明者】
【氏名】劉秀
(72)【発明者】
【氏名】韓静
【審査官】進士 千尋
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１６７１０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許第０６５２１２３０（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２００４／０４５５１２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Walker, K.W. et al.，Pharmacokinetic comparison of a diverse panel of non-targeting human antibodies as matched IgG1 and IgG2 isotypes in rodents and non-human primates，PLoS One，14(5)，2019年05月23日，e0217061
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
３つの重鎖相補性決定領域であって、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１４によって表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１５によって表され、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１６によって表される、３つの重鎖相補性決定領域と、
３つの軽鎖相補性決定領域であって、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１１によって表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１２によって表され、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１３によって表される、３つの軽鎖相補性決定領域とを含み、
ＣＤ２５に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号４によって表される重鎖可変領域及び配列番号３によって表される軽鎖可変領域を含み、ＣＤ２５に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗体又は抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片又はｄｓＦｖ断片を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
ヒトＣＤ２５に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
核酸であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項6】
細胞であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現する細胞。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項５に記載の核酸、又は請求項６に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項５に記載の核酸を含むキット。
【請求項9】
疾患の治療、予防、検出又は診断のための薬剤であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項５に記載の核酸を含み、前記疾患は、癌である、薬剤。
【請求項10】
疾患の治療、予防、検出又は診断のための薬剤であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項５に記載の核酸を含み、前記疾患は、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病及びリンパ腫である、薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、生物医学分野に関し、より具体的には、ＣＤ２５に結合する抗体及びその適用に関する。
【背景技術】
【0002】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫恒常性の媒介において極めて重要な役割を果たし、末梢性トレランスの確立及び維持を促進し得る。しかしながら、癌に関連して、その役割は、一層複雑になる。癌細胞は、その独自の腫瘍関連抗原を発現するため、エフェクター細胞の応答を抑制するＴｒｅｇの存在は、腫瘍進行を促進し得る。従って、確立された腫瘍におけるＴｒｅｇの浸潤は、有効性にとって大きい障害の１つである。抑制機構を用いるＴｒｅｇは、現行の治療法、特に抗腫瘍応答の誘導又は増強に依存する免疫療法の限界、更に不成功の大きい一因をなすと考えられる（Ｏｎｉｓｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．３２，９９７－１００３）。Ｔｒｅｇの腫瘍浸潤は、幾つかの予後不良のヒト癌とも関連性がある（Ｓｈａｎｇ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．５：１５１７９）。Ｔｒｅｇ細胞がマウスモデルにおいて腫瘍の確立及び進行に寄与すること及びそれが存在しない場合に腫瘍進行の遅延につながることが分かっている。ヒトでは、腫瘍Ｔｒｅｇ細胞の高い浸潤比率、更に重要なことにエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の対Ｔｒｅｇ細胞比の低下は、様々なヒト癌の予後不良と関連している（Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0003】
ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ枯渇を実現する可能性のある分子標的の１つである。ＣＤ２５は、インターロイキン－２高親和性受容体α鎖（ＩＬ－２Ｒα）としても知られる。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇに高度に発現するが、ＴｅｆｆにはＣＤ２５が存在しないか又は低発現である。
【0004】
先行技術の中には、ＭＡ２５１（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４（２）９１－１０２、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０（４），３７３－３８８）など、ＣＤ２５に結合するが、ＩＬ２によるＣＤ２５への結合を遮断しない抗体があるが、しかし、それらには、不十分なＣＤ２５結合活性、ＰＢＭＣ活性化の阻害及び全般的な薬物動態性能などの欠点が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
疾患治療のための医薬への患者の要求、特に抗体薬物への要求に直面して、結合活性がより高い抗ＣＤ２５抗体を提供することは、臨床上、依然として喫緊に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の全文において、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、ＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）、ＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３に関する様々な実施形態は、個別に又は任意の組み合わせで実施され得る。
【0007】
本発明のある態様において、本発明は、３つの重鎖相補性決定領域であって、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１４によって表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１５によって表され、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１６によって表される、３つの重鎖相補性決定領域を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。更に、抗体又はその抗原結合断片は、３つの軽鎖相補性決定領域であって、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１１によって表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１２によって表され、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１３によって表される、３つの軽鎖相補性決定領域を更に含む。
【0008】
本発明のある態様において、本発明で提供される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４によって表される重鎖可変領域を含み；好ましくは配列番号３によって表される軽鎖可変領域を更に含む。
【0009】
本発明のある態様において、本発明は、３つの軽鎖相補性決定領域であって、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５によって表され、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６によって表され、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７によって表される、３つの軽鎖相補性決定領域；及び／又は３つの重鎖相補性決定領域であって、ＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号８によって表され、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号９によって表され、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１０によって表される、３つの重鎖相補性決定領域を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0010】
別の態様において、本発明は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域及び／又は配列番号２によって表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0011】
本発明のある態様によれば、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片の軽鎖定常領域の配列は、配列番号２０である。
【0012】
本発明のある態様によれば、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片の重鎖定常領域の配列は、配列番号１７である。
【0013】
具体的には、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、配列番号３によって表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、配列番号４によって表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域、配列番号２０によって表されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域及び配列番号１７によって表されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。
【0014】
具体的には、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、配列番号１によって表されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、配列番号２によって表されるアミノ酸配列の重鎖可変領域、配列番号２０によって表されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域及び配列番号１７によって表されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。
【0015】
本発明のある態様によれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ２５、好ましくはヒトＣＤ２５に結合する。
【0016】
本発明のある態様によれば、本発明は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片又はｄｓＦｖ断片などを含む、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0017】
本発明のある態様によれば、本発明は、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【0018】
本発明のある態様によれば、本発明は、前出の態様の核酸を含むベクターに関するか、又はこのベクターは、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片を発現することができる。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターであり得；好ましくは、ウイルスベクターとしては、限定はされないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどが挙げられ；好ましくは、ベクターは、非ウイルスベクターであり得；好ましくは、ベクターは、哺乳類細胞発現ベクターであり得；好ましくは、発現ベクターは、細菌発現ベクターであり得；及び好ましくは、発現ベクターは、真菌発現ベクターであり得る。
【0019】
本発明のある態様によれば、本発明は、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片の細胞を発現することができる細胞に関する。好ましくは、細胞は、細菌細胞であり；好ましくは、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などであり；好ましくは、細胞は、真菌細胞であり；好ましくは、真菌細胞は、酵母細胞であり；好ましくは、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞などであり；好ましくは、細胞は、哺乳類細胞であり；好ましくは、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞（２９３）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＤＣ細胞又はＮＫ細胞などである。
【0020】
本発明のある態様によれば、本発明は、前出の態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター又は細胞を含む医薬組成物に関し、好ましくは、この医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を更に含み、及び薬学的に許容可能なベクターは、好ましくは、以下：薬学的に許容可能な溶媒、分散剤、添加剤、可塑剤などの１つ以上を含む。
【0021】
一部の実施形態において、医薬組成物は、他の療法剤を更に含み得る。一部の実施形態において、他の療法剤は、化学療法剤、免疫療法剤又はホルモン療法剤を含む。抗体又はその抗原結合断片と他の療法剤との併用投与は、療法剤の治療効果を亢進させることができる。
【0022】
一部の実施形態において、「治療効果を亢進させる」とは、他の療法剤又は治療法の治療効果を亢進させることを指す。本発明において提供される抗体又は抗原結合断片は、個別に又は他の療法剤若しくは治療法と併用して投与することができる。一部の実施形態において、他の療法剤又は治療法は、化学療法剤、免疫療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法及び手術を含む。
【0023】
本発明のある態様によれば、本発明の抗体若しくはその抗原結合断片を含むか、又は抗体若しくはその抗原結合断片をコードする核酸を含むキットが提供される。
【0024】
本発明のある態様によれば、本発明は、疾患の治療又は予防用医薬品の調製における、前出の態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター又は細胞の適用に関する。
【0025】
本発明のある態様によれば、本発明は、診断又は検出キットの調製における、前出の態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片又は核酸の適用に関する。
【0026】
本発明のある態様では、疾患を治療又は予防する方法であって、必要としている対象に本発明の抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【0027】
本発明のある態様では、診断又は検出方法であって、必要としている対象又は試料に本発明の抗体若しくは抗原結合断片、核酸又はキットを投与することを含む方法が提供される。好ましくは、方法は、疾患を診断又は検出する方法である。
【0028】
本発明のある態様によれば、本発明は、疾患の治療又は予防のための、前出の態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用に関する。
【0029】
本発明のある態様によれば、本発明は、検出又は診断のための、前出の態様のいずれか１つの抗体若しくはその抗原結合断片、核酸又はキットの使用に関する。好ましくは、この使用は、疾患を診断又は検出するためのものである。
【0030】
本発明のある態様によれば、疾患は、癌である。
【0031】
本発明のある態様によれば、癌は、胃癌、食道癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫などを含む。
【0032】
本発明のある態様によれば、本発明は、前出の態様のいずれか１つの抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、上記のベクターを細胞にトランスフェクトすることと、トランスフェクト細胞によって抗体又はその抗原結合断片を発現させることとを含むか；又は上記の細胞で抗体又はその抗原結合断片を発現させることを含む方法に関する。
【0033】
本発明のある態様によれば、本発明において提供される抗体又はその抗原結合断片は、以下の利点：亢進したＣＤ２５タンパク質結合活性、亢進したＣＤ２５タンパク質親和性、亢進したＣＤ２５発現細胞殺傷能力、減少したＰＢＭＣ活性化阻害、亢進したインビボ腫瘍増殖阻害能力、亢進したインビボ腫瘍殺傷能力、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させる亢進した能力又はエフェクターＴ細胞数を増加させる亢進した能力の１つ以上を有する。
【0034】
本発明の具体的な実施形態又は先行技術における技術的解決法を更に明確に説明するため、具体的な実施形態又は先行技術の記載に必要な図面を以下に手短に記載する。当然ながら、以下の記載中にある図面は、本発明の一部の実施形態であり、当業者は、発明の能力を行使することなく、これらの図面に基づいて他の図面を入手することができる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】７回の免疫後における実施例１の免疫スキームのＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１マウスの血清力価（６２５００倍希釈）を示す。
【図2A】実施例３のＥＬＳＩＡ検出によるＣＤ２５抗体とＣＤ２５との結合感受性を示す。
【図2B】実施例３のＥＬＳＩＡ検出によるＣＤ２５抗体とＣＤ２５との結合感受性を示す。
【図2C】実施例３のＥＬＳＩＡ検出によるＣＤ２５抗体とＣＤ２５との結合感受性を示す。
【図2D】実施例３のＥＬＳＩＡ検出によるＣＤ２５抗体とＣＤ２５との結合感受性を示す。
【図2E】実施例３のＥＬＳＩＡ検出によるＣＤ２５抗体とＣＤ２５との結合感受性を示す。
【図3A】実施例３の候補抗体の模擬殺傷活性の検出結果を示す。
【図3B】実施例３の候補抗体の模擬殺傷活性の検出結果を示す。
【図4】実施例３の候補抗体の細胞遮断活性の検出結果を示す。
【図5】実施例４のＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１がアカゲザルのＴｒｅｇ細胞含有量の減少に及ぼす効果を示す。
【図6】実施例４のカニクイザルにおける候補抗体の薬物代謝を示す。
【図8A】実施例５．２のＣＤ３中のＣＤ８＋細胞（Ｔｅｆｆ）含有量を示す。
【図8B】実施例５．２のＣＤ３中のＣＤ２５＋ Ｆｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量を示す。
【図8C】実施例５．２のＣＤ４中のＦｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
以下では、本発明の技術的解決法を図面と併せて明確且つ完全に記載し、当然ながら、記載される実施形態は、本発明の実施形態の一部であるが、しかし全ての実施形態であるわけではない。本発明の実施形態に基づき、当業者が発明の能力を行使することなく達成する他のあらゆる実施形態が本発明の範囲内にある。
【0037】
本発明の全文を通して記載される種々の実施形態に関わる技術的特徴は、互いに組み合わせて実施することができる。
【実施例】
【0038】
実施例１ 抗ＣＤ２５モノクローナル抗体の作製
１．１ 免疫スキーム
ＣＤ２５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１６５－Ｈ０８Ｈ）をフロイントアジュバントと乳化させて、Ｂｏａｎ ｂｉｏの完全ヒト抗体トランスジェニックマウスＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載される方法のとおりに調製される）を免疫する。初回免疫には、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ５８８１－１０ＭＬ）を使用し、２回目の免疫～６回目の免疫には、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ５５０６－１０ＭＬ）を使用し、現時点で合計１４匹のマウスを免疫した。血清力価が高い７匹のマウスをブースター免疫に選択し、３日後にマウスを犠牲死させて、続く実験のために脾臓を摘出した。マウスの血清力価（６２５００倍希釈）を図１に示す。
１．１ 免疫スキーム
ＣＤ２５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１６５－Ｈ０８Ｈ）をフロイントアジュバントと乳化させて、Ｂｏａｎ ｂｉｏの完全ヒト抗体トランスジェニックマウスＢｏＡｎ－ｈＭａｂ１（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載される方法のとおりに調製される）を免疫する。初回免疫には、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ５８８１－１０ＭＬ）を使用し、２回目の免疫～６回目の免疫には、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｆ５５０６－１０ＭＬ）を使用し、現時点で合計１４匹のマウスを免疫した。血清力価が高い７匹のマウスをブースター免疫に選択し、３日後にマウスを犠牲死させて、続く実験のために脾臓を摘出した。マウスの血清力価（６２５００倍希釈）を図１に示す。
【0039】
１．２ ファージライブラリの構築
１．１の免疫化マウスの脾臓細胞からＲＮＡを抽出し、次にｃＤＮＡに逆転写し、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記載される方法を参照してファージライブラリの構築ステップを実施し、ｃＤＮＡからＰＣＲ法によって重鎖及び軽鎖の可変領域を入手し、次に重鎖及び軽鎖の可変領域のオーバーラップ伸長ＰＣＲによってｓｃＦｖを入手し、ｓｃＦｖをプラスミドｐＣＯＭＢ３ｘと消化後にライゲートし、次にライゲーション産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１コンピテント細胞にエレクトロトランスフェクションし、ファージを加えてインキュベーション後にＴＧ１を感染させて、濃縮した培養液の上清が、本発明のファージライブラリである。
１．１の免疫化マウスの脾臓細胞からＲＮＡを抽出し、次にｃＤＮＡに逆転写し、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌに記載される方法を参照してファージライブラリの構築ステップを実施し、ｃＤＮＡからＰＣＲ法によって重鎖及び軽鎖の可変領域を入手し、次に重鎖及び軽鎖の可変領域のオーバーラップ伸長ＰＣＲによってｓｃＦｖを入手し、ｓｃＦｖをプラスミドｐＣＯＭＢ３ｘと消化後にライゲートし、次にライゲーション産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１コンピテント細胞にエレクトロトランスフェクションし、ファージを加えてインキュベーション後にＴＧ１を感染させて、濃縮した培養液の上清が、本発明のファージライブラリである。
【0040】
１．３ ファージライブラリスクリーニング（２つの方法）
（１）プレートスクリーニング：プレートをＣＤ２５タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０１６５－Ｈ０８Ｈ）によって１μｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置し、翌日、プレートを２％ＢＳＡで１時間封止し、ファージライブラリ（２×１０１２）に加えて２時間インキュベートし、ＣＤ２５に特異的に結合したファージを溶出緩衝液（４．２ｍｌの濃塩酸（Ｃｏｍｅｏ）を５００ｍｌの超純水に加え、グリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ、ＢＧ０６１７－５００）でｐＨを２．２に調整する）又は１５μｇ／ｍＬ ＭＡ２５１で４～１０回の洗浄後に溶出させる。
（１）プレートスクリーニング：プレートをＣＤ２５タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０１６５－Ｈ０８Ｈ）によって１μｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置し、翌日、プレートを２％ＢＳＡで１時間封止し、ファージライブラリ（２×１０１２）に加えて２時間インキュベートし、ＣＤ２５に特異的に結合したファージを溶出緩衝液（４．２ｍｌの濃塩酸（Ｃｏｍｅｏ）を５００ｍｌの超純水に加え、グリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ、ＢＧ０６１７－５００）でｐＨを２．２に調整する）又は１５μｇ／ｍＬ ＭＡ２５１で４～１０回の洗浄後に溶出させる。
【0041】
（２）磁気ビーズスクリーニング：一般的なステップに従い、ＣＤ２５－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０１６５－Ｈ０２Ｈ）をビオチン化し、Ｔｈｅｒｍｏの磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ストレプトアビジン、００３５５８７１）に結合させて、次にファージライブラリとインキュベートし、ＣＤ２５に特異的に結合したファージを溶出緩衝液（ｐＨ２．２）又は１５μｇ／ｍＬ ＭＡ２５１で４～１０回の洗浄後に溶出させる。
【0042】
スクリーニングしたファージクローンにｓｃＦｖを発現させて、ｓｃＦｖとＣＤ２５との結合を検出し、ｓｃＦｖによるＩＬ２／ＣＤ２５結合の遮断を検出して、ＣＤ２５に良好に結合し、且つＣＤ２５を遮断しないｓｃＦｖを続く構築に選択する。
【0043】
ｓｃＦｖとＣＤ２５との結合のＥＬＩＳＡ検出：ＣＢＳ緩衝液の調製：１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ、１００１９２６０）及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を秤量する。また、蒸留水を加えて１Ｌにすることにより、ＣＢＳ緩衝液を調製した。ＣＤ２５（１０１６５－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）タンパク質をｐＨ９．６ ＣＢＳで０．２μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、３％脱脂粉乳を使用して３７℃で１時間封止した。プレートを洗浄した後、８０μＬのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を加える。また、次に２０μＬのｓｃＦｖペリプラズムを加えて、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、抗ｆｌａｇ二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、カタログ番号：ＨＲＰ－６６００８）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ（Ｍａｋｅｗｏｎｄｅｒ、カタログ番号１００１）基質を加えて発色させて、１０分後、各ウェルに５０μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取った。
【0044】
ｓｃＦｖによるＣＤ２５／ＩＬ２結合の遮断のＥＬＩＳＡ検出：ＣＤ２５（１０１６５－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）タンパク質をｐＨ９．６ ＣＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、３％脱脂粉乳を使用して３７℃で１時間封止した。プレートを洗浄した後、各ウェルに５０μＬのｓｃＦｖペリプラズムを加えた。次に、ビオチン標識ＩＬ２タンパク質（最終濃度は、０．０２μｇ／ｍＬである）を５０μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＰＢＳＴで希釈したＳＴＲＥＰ／ＨＲＰを１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、各ウェルに１００μＬのＴＭＢを加えて発色させて、１０分後、各ウェルに５０μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止させて、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取った。
【0045】
実施例２ 候補抗体の分子構成及び作製
磁気ビーズスクリーニング後のクローンＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ３＼ＢＡ９＼ＢＡ１２５、ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２、ＣＤ２５Ｑ１１－ＢＡ４０２＼ＢＡ４０６＼ＢＡ４１０＼ＢＡ４１５＼ＢＡ４２２＼ＢＡ４２８及びＣＤ２５Ｑ１４－ＢＡ４４３＼ＢＡ４４８＼ＢＡ４５８並びにプレートスクリーニング後のクローンＣＤ２５Ｑ１１－ＣＡ３５＼ＣＡ３６＼ＣＴ８４８及びＣＤ２５Ｑ１４－ＣＡ７０５＼ＣＡ７０７＼ＣＡ７２１をシーケンシングのためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄに送った。各クローンの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を表１に示す。
磁気ビーズスクリーニング後のクローンＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ３＼ＢＡ９＼ＢＡ１２５、ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２、ＣＤ２５Ｑ１１－ＢＡ４０２＼ＢＡ４０６＼ＢＡ４１０＼ＢＡ４１５＼ＢＡ４２２＼ＢＡ４２８及びＣＤ２５Ｑ１４－ＢＡ４４３＼ＢＡ４４８＼ＢＡ４５８並びにプレートスクリーニング後のクローンＣＤ２５Ｑ１１－ＣＡ３５＼ＣＡ３６＼ＣＴ８４８及びＣＤ２５Ｑ１４－ＣＡ７０５＼ＣＡ７０７＼ＣＡ７２１をシーケンシングのためにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄに送った。各クローンの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を表１に示す。
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
最後に、従来の分子生物学技法によって実施される可変領域遺伝子増幅（２＊Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、製造者：Ｖａｚｙｍｅ、品目番号：Ｐ５１５－ＡＡ、ロット番号：ＴＥ２１１ＧＢ）、シグナルペプチド及び可変領域オーバーラップ伸長、相同組換え（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製造者：Ｖａｚｙｍｅ、品目番号：Ｃ１１２－０１、ロット番号：ＴＥ２１１Ｌ８）などにより、ＶＨをコードするヌクレオチド配列断片を、抗体の重鎖定常領域アミノ酸配列、配列番号１７をコードするヌクレオチド配列と共にベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に挿入し、ＶＬをコードするヌクレオチド配列断片を、抗体の軽鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号２０）をコードするヌクレオチド配列と共にベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に挿入した。連結したベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、３７℃＼８％ＣＯ２＼１２５ｒｐｍ振盪機でインキュベートし、６～７日間一過性に発現させた後、上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製して抗ＣＤ２５抗体を得て、抗体濃度をＵＶ２８０結合吸光係数により決定した。
【0050】
対照抗体の作製：ＭＡ２５１抗体は、先行技術におけるＩＬ２とＣＤ２５との結合を遮断しない抗ヒトＣＤ２５抗体であり、ヒトＣＤ２５に対して高い親和性を有し、ＩＬ２とＣＤ２５との結合を遮断しない性能が良好である。ＭＡ２５１抗体は、ＩＬ２とＣＤ２５との結合を研究する古典的な抗体である。ＭＡ２５１抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を完全な遺伝子によって合成し、次にベクターｐＣＤＮＡ３．４に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞によって発現させて、作製された抗体をＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と名付ける（重鎖可変領域の配列は、配列番号１８であり、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１９であり、軽鎖定常領域の配列は、配列番号２０であり、及び重鎖定常領域の配列は、配列番号１７である）。
【0051】
実施例３ 候補抗体の特徴付け
３．１ 候補抗体とＣＤ２５タンパク質との結合活性のＥＬＩＳＡ検出
ＣＤ２５タンパク質（１０１６５－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＣＢＳで種々の濃度（０．０８μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、０．００５μｇ／ｍＬ、０．００１２５μｇ／ｍＬ、０．０００３１２５μｇ／ｍＬ、０．００００７８１２５μｇ／ｍＬ）に希釈し、酵素標識プレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、３％脱脂粉乳を使用して３７℃で１時間封止した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１μＬ／ｍＬに希釈した１００μＬの候補抗体を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ（ＫＰＬ、カタログ番号：５４５０－０００９）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、１０分間発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取ることにより、計算によってＥＣ５０を得た。結果を図２Ａ～図２Ｅ及び表２～表６に示す。
３．１ 候補抗体とＣＤ２５タンパク質との結合活性のＥＬＩＳＡ検出
ＣＤ２５タンパク質（１０１６５－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＣＢＳで種々の濃度（０．０８μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、０．００５μｇ／ｍＬ、０．００１２５μｇ／ｍＬ、０．０００３１２５μｇ／ｍＬ、０．００００７８１２５μｇ／ｍＬ）に希釈し、酵素標識プレートに１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄した後、３％脱脂粉乳を使用して３７℃で１時間封止した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１μＬ／ｍＬに希釈した１００μＬの候補抗体を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰ（ＫＰＬ、カタログ番号：５４５０－０００９）を加え、３７℃で１時間インキュベートし、１０分間発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を読み取ることにより、計算によってＥＣ５０を得た。結果を図２Ａ～図２Ｅ及び表２～表６に示す。
【0052】
表２に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１と抗原ＣＤ２５との結合のＥＣ５０値は、３．３２８であり、これは、１０．６３である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１のＥＣ５０値と比べて有意に低く、これは、この候補抗体の抗原結合能が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて有意に良好であることを示している。
【0053】
表６に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１と抗原ＣＤ２５との結合のＥＣ５０値は、２．２６であり、これは、２４．５である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１のＥＣ５０値と比べて有意に低く、これは、この候補抗体の抗原結合能が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて有意に良好であることを示している。
【0054】
候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１は、対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比較すると、ＣＤ２５を発現するＴｒｅｇ細胞に対してより強力なターゲティング及び結合効果を有し、より良好な殺傷効果を有し、Ｔｒｅｇ細胞によるＴｅｆｆ細胞の阻害を低減し、より良好な薬学的効果を有するものと予想される。
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
３．２ 候補抗体の模擬殺傷活性の検出
ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１００９１－１４８）とＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１８７５－０９３）とを１：９９に基づいて混合して１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を調製し、ＳＵ－ＤＨＬ－１標的細胞を収集し、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより１．２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、適切な候補抗体を取り、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより２５μｇ／ｍＬに希釈し、この濃度を初期濃度として使用した。後の使用のため、順番に合計８ポイントまで４倍勾配希釈した。エフェクター細胞ジャーカット（Ｇ７０１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を収集し、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより２．４×１０６細胞／ｍＬに希釈し、標的細胞を白色９６ウェルプレートに２５μＬ／ウェルで加えた。標的細胞で覆われたウェルに勾配希釈した抗体を２５μＬ／ウェルで加えた。エフェクター細胞ジャーカットを２５μＬ／ウェルで加え、９６ウェルプレートを細胞インキュベーターに置いて５時間培養し；且つ９６ウェルプレートを取り出し、室温に置いて、その温度が室温と平衡になることができるようにした。Ｂｉｏ－Ｇｌ発色溶液（Ｇ７９４０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を７５μＬ／ウェルで加え、１５分間反応させて、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーから発光を読み取って値を得た。結果を図３Ａ～図３Ｂ及び表７～表８に示す。
ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１００９１－１４８）とＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１８７５－０９３）とを１：９９に基づいて混合して１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を調製し、ＳＵ－ＤＨＬ－１標的細胞を収集し、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより１．２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、適切な候補抗体を取り、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより２５μｇ／ｍＬに希釈し、この濃度を初期濃度として使用した。後の使用のため、順番に合計８ポイントまで４倍勾配希釈した。エフェクター細胞ジャーカット（Ｇ７０１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を収集し、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用することにより２．４×１０６細胞／ｍＬに希釈し、標的細胞を白色９６ウェルプレートに２５μＬ／ウェルで加えた。標的細胞で覆われたウェルに勾配希釈した抗体を２５μＬ／ウェルで加えた。エフェクター細胞ジャーカットを２５μＬ／ウェルで加え、９６ウェルプレートを細胞インキュベーターに置いて５時間培養し；且つ９６ウェルプレートを取り出し、室温に置いて、その温度が室温と平衡になることができるようにした。Ｂｉｏ－Ｇｌ発色溶液（Ｇ７９４０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を７５μＬ／ウェルで加え、１５分間反応させて、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーから発光を読み取って値を得た。結果を図３Ａ～図３Ｂ及び表７～表８に示す。
【0061】
【0062】
【0063】
表７に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１の模擬殺傷活性検出のＥＣ５０値は、０．２３５６であり、これは、０．３６０６である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１のＥＣ５０値と比べて低く、これは、ＳＵ－ＤＨＬ－１に対する候補抗体の殺傷活性が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて良好であることを示している。
【0064】
上記の結果は、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１が、ＣＤ２５を発現する細胞に良好な殺傷効果を及ぼすことを示しており、このことから、この候補抗体は、ＣＤ２５を発現するＴｒｅｇ細胞及びそれによるＴｅｆｆ細胞の阻害を減少させることができ、従ってより良好な薬学的効果を有するものと予想される。
【0065】
３．３ 抗体の親和性のＢｉａＣｏｒｅ検出
抗体結合反応速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）技術に基づくＢＩＡｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して測定する。ＧＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃアミノカップリングキット（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）によって抗ヒトＩｇＧ抗体アミノをＣＭ５バイオセンサーチップに約１０００反応単位（ＲＵ）が得られるようにカップリングした。反応速度測定のため、ＣＤ２５タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０１６５－Ｈ０８Ｈ）をＨＢＳ－ＥＰ＋１×（ＧＥ、ＢＲ－１００８－２６）緩衝液で、５０ｎＭから開始して、４濃度勾配について２倍希釈し、０濃度をセットして、２倍連続希釈した。検出しようとする抗体：２μｇ／ｍｌ、試料注入時間７０秒、流量５μＬ／分、５秒間安定；ＣＤ２５タンパク質：６０秒間結合、流量３０μＬ／分、解離４５０秒間；再生：再生は３Ｍ ＭｇＣｌ２緩衝液で３０秒間実施した、始動３回。単純１対１Ｌａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．２）を使用して会合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）を計算し、比ｋｄ／ｋａによって平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。各抗体の親和性データを表９に示す。
抗体結合反応速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）技術に基づくＢＩＡｃｏｒｅ８Ｋ機器を使用して測定する。ＧＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃアミノカップリングキット（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）によって抗ヒトＩｇＧ抗体アミノをＣＭ５バイオセンサーチップに約１０００反応単位（ＲＵ）が得られるようにカップリングした。反応速度測定のため、ＣＤ２５タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０１６５－Ｈ０８Ｈ）をＨＢＳ－ＥＰ＋１×（ＧＥ、ＢＲ－１００８－２６）緩衝液で、５０ｎＭから開始して、４濃度勾配について２倍希釈し、０濃度をセットして、２倍連続希釈した。検出しようとする抗体：２μｇ／ｍｌ、試料注入時間７０秒、流量５μＬ／分、５秒間安定；ＣＤ２５タンパク質：６０秒間結合、流量３０μＬ／分、解離４５０秒間；再生：再生は３Ｍ ＭｇＣｌ２緩衝液で３０秒間実施した、始動３回。単純１対１Ｌａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．２）を使用して会合定数（ｋａ）及び解離定数（ｋｄ）を計算し、比ｋｄ／ｋａによって平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。各抗体の親和性データを表９に示す。
【0066】
【0067】
表９に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１の平衡解離定数ＫＤ値は、８．４３Ｅ－１０であり、これは、５．１９Ｅ－０９である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１のＫＤ値と比べて低く、これは、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１のＣＤ２５タンパク質の親和性が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて良好であることを示している。
【0068】
表９に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１の平衡解離定数ＫＤ値は、３．７９Ｅ－０９であり、これは、５．１９Ｅ－０９である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１のＫＤ値と比べて低く、これは、候補抗体ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１のＣＤ２５タンパク質の親和性が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて良好であることを示している。
【0069】
上記の結果から、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１は、対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比較すると、ＣＤ２５を発現するＴｒｅｇ細胞に対してより強力なターゲティング及び結合効果を有し、より良好な殺傷効果を有し、Ｔｒｅｇ細胞によるＴｅｆｆ細胞の阻害を低減し、より良好な薬学的効果を有するものと予想される。
【0070】
３．４ 候補抗体の細胞遮断活性
凍結ＰＢＭＣ（末梢血単核球、製造者：ＡＬＬＣＥＬＬＳ、品目番号：ＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を回収し、次に９６Ｕ字底プレート上で１０μｇ／ｍＬのＣＤ２５抗体と３０分間共培養し、対照群に抗体を加えず、対照群をＮｏＡｂと表示し、次にＩＬ２（０．１Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ）を加えて１０分間インキュベートすることにより（ワーキング培地：１６４０＋１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１００００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ含有）、細胞懸濁液を調製した。最終回の洗浄後、上清を廃棄し、試料をパルスボルテックスしてペレットを完全に解離させた。各ウェルに２００μＬ Ｆｏｘｐ３固定／透過処理ワーキング溶液を加えた。それを２～８℃又は室温で暗所下において３０～６０分間インキュベートした。試料を室温で５分間、４００～６００ｇで遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに２００μＬの１×膜破壊溶液を加え、試料を室温で５分間、４００～６００ｇで遠心し、上清を廃棄した。また、２回洗浄し；（ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを予め－２０℃に置いて予冷する）ＰＢＳで１回洗浄し、遠心し、上清を廃棄し；氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩをボルテックスしながらゆっくりと加え、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５０ｇで１０分間遠心して上清を廃棄した。細胞をＰＢＳ中に１０７細胞／ｍＬとなるように再懸濁し、１００μＬ／ウェルで別個に入れ、蛍光標識した抗体染色を継続し、フローサイトメトリーを実施した。生細胞を識別し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を更に識別した。リン酸化シグナルトランスデューサー及び転写アクチベーター５（ＰＳＴＡＴ５）の割合が高いほど、遮断率が低い。結果を図４及び表１０に示す。
凍結ＰＢＭＣ（末梢血単核球、製造者：ＡＬＬＣＥＬＬＳ、品目番号：ＰＢ００３Ｆ－Ｃ）を回収し、次に９６Ｕ字底プレート上で１０μｇ／ｍＬのＣＤ２５抗体と３０分間共培養し、対照群に抗体を加えず、対照群をＮｏＡｂと表示し、次にＩＬ２（０．１Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ）を加えて１０分間インキュベートすることにより（ワーキング培地：１６４０＋１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１００００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ含有）、細胞懸濁液を調製した。最終回の洗浄後、上清を廃棄し、試料をパルスボルテックスしてペレットを完全に解離させた。各ウェルに２００μＬ Ｆｏｘｐ３固定／透過処理ワーキング溶液を加えた。それを２～８℃又は室温で暗所下において３０～６０分間インキュベートした。試料を室温で５分間、４００～６００ｇで遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに２００μＬの１×膜破壊溶液を加え、試料を室温で５分間、４００～６００ｇで遠心し、上清を廃棄した。また、２回洗浄し；（ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを予め－２０℃に置いて予冷する）ＰＢＳで１回洗浄し、遠心し、上清を廃棄し；氷冷Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩをボルテックスしながらゆっくりと加え、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２５０ｇで１０分間遠心して上清を廃棄した。細胞をＰＢＳ中に１０７細胞／ｍＬとなるように再懸濁し、１００μＬ／ウェルで別個に入れ、蛍光標識した抗体染色を継続し、フローサイトメトリーを実施した。生細胞を識別し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を更に識別した。リン酸化シグナルトランスデューサー及び転写アクチベーター５（ＰＳＴＡＴ５）の割合が高いほど、遮断率が低い。結果を図４及び表１０に示す。
【0071】
表１０に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１の％ＰＳＴＡＴ５値は、２６．０９であり、これは、１８．５２である対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１の％ＰＳＴＡＴ５値と比べて有意に高く、これは、この候補抗体がＩＬ２とＰＢＭＣとの結合を遮断しない点で対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて有意に良好であることを示している。これは、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１が対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１ほどＰＢＭＣ活性化を阻害しないものであり得ることを示しており、このことから、候補抗体ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１は、ＰＢＭＣ免疫効果をより良好に実現し、より良好な薬学的効果／抗腫瘍効果を有し得るものと予想される。
【0072】
表１０に示されるとおり、候補抗体ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１の％ＰＳＴＡＴ５値は、１６．４６であり、及びＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１の％ＰＳＴＡＴ５値は、１８．５２であり、これは、ＩＬ２とＰＢＭＣとの結合を遮断しない点で候補抗体が基本的に対照群ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と同等であることを示している。このことから、候補抗体ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１は、ＰＢＭＣ免疫効果を十分に実現し、良好な薬学的効果／抗腫瘍効果を有し得るものと予想される。
【0073】
【0074】
実施例４ 候補抗体のインビボ活性
４．１ 健常アカゲザルにおけるＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１のＰＤ活性
ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１抗体を３匹のアカゲザルに１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ（商標）ＦＣ５００）を使用して投与前及び投与後の種々の時点でＴｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の含有量をフローサイトメトリーにより検出し、検出時点は、（±１分）投与前及び投与後、投与後０．５時間（±１分）、３時間（±２分）、６時間（±５分）、２４時間（±１０分）、４８時間（±２０分、２日）、９６時間（±３０分、４日）、１６８時間（±１時間、７日）、３３６時間（±１時間、１４日）であった。実験結果を図５に示す。
４．１ 健常アカゲザルにおけるＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１のＰＤ活性
ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１抗体を３匹のアカゲザルに１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ（商標）ＦＣ５００）を使用して投与前及び投与後の種々の時点でＴｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の含有量をフローサイトメトリーにより検出し、検出時点は、（±１分）投与前及び投与後、投与後０．５時間（±１分）、３時間（±２分）、６時間（±５分）、２４時間（±１０分）、４８時間（±２０分、２日）、９６時間（±３０分、４日）、１６８時間（±１時間、７日）、３３６時間（±１時間、１４日）であった。実験結果を図５に示す。
【0075】
図５を見ると分かるとおり、ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１は、その投与後、アカゲザルにおいてＴｒｅｇ細胞の含有量を有意に減少させることができ、免疫微小環境を有効に調節することができる。
【0076】
４．２ カニクイザルにおける候補抗体のＰＫ活性
各群２匹のカニクイザルとする。それらに種々のＣＤ２５抗体を静脈内注射し、投与前（０時間）及び投与後１分、３０分、３時間、６時間、１日、２日、４日、７日、１０日及び１４日の時点で静脈内から全血試料を採取し、血液試料採取チューブに入れ、アイスボックス内で自然凝固させて、血液試料を採取後８時間以内に遠心機に入れ、１０００～３０００ｇで１０分間遠心し、血清を分離し、試料保存チューブに入れ、１４日目にカニクイザルに再び種々のＣＤ２５抗体を静脈内注射し、投与前（０時間）及び投与後１分（１４日＋１分）、３０分（１４日＋３０分）、３時間（１４日＋３時間）、６時間（１４日＋６時間）、１日（１５日）、２日（１６日）、４日（１８日）及び７日（２１日）の時点で静脈内から全血試料を採取し、血液試料採取チューブに入れ、アイスボックス内で自然凝固させて、血液試料を採取後８時間以内に遠心機に入れ、１０００～３０００ｇで１０分間遠心し、血清を分離して試料保存チューブに入れ、カニクイザルにおける抗体の代謝をＥＬＩＳＡによって検出した。結果を図６及び表１１に示す。
各群２匹のカニクイザルとする。それらに種々のＣＤ２５抗体を静脈内注射し、投与前（０時間）及び投与後１分、３０分、３時間、６時間、１日、２日、４日、７日、１０日及び１４日の時点で静脈内から全血試料を採取し、血液試料採取チューブに入れ、アイスボックス内で自然凝固させて、血液試料を採取後８時間以内に遠心機に入れ、１０００～３０００ｇで１０分間遠心し、血清を分離し、試料保存チューブに入れ、１４日目にカニクイザルに再び種々のＣＤ２５抗体を静脈内注射し、投与前（０時間）及び投与後１分（１４日＋１分）、３０分（１４日＋３０分）、３時間（１４日＋３時間）、６時間（１４日＋６時間）、１日（１５日）、２日（１６日）、４日（１８日）及び７日（２１日）の時点で静脈内から全血試料を採取し、血液試料採取チューブに入れ、アイスボックス内で自然凝固させて、血液試料を採取後８時間以内に遠心機に入れ、１０００～３０００ｇで１０分間遠心し、血清を分離して試料保存チューブに入れ、カニクイザルにおける抗体の代謝をＥＬＩＳＡによって検出した。結果を図６及び表１１に示す。
【0077】
これらの結果は、ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１が対照抗体ＣＤ２５－ＭＡ２５１－ＩｇＧ１と比べて高いバイオアベイラビリティを有し、良好な薬物動態学的性能を有することを示している。
【0078】
【0079】
実施例５ インビボ腫瘍モデルにおける候補抗体の有効性
５．１ Ｂ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウスＭＣ３８結腸癌動物モデルにおける候補抗体の有効性試験
Ｂ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を体重によって５群に分け、ここでは、１０匹のマウスがＧ１陰性対照群であり、８匹のマウスがＧ２～Ｇ４治療群の各々であった。群分け当日から個別投与を実施し（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．、ＢＩＷ）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、週２回）、翌日、ＰＢＳに再懸濁したＭＣ３８細胞をＢ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウスの右側腹皮下に５×１０５細胞／０．１ｍＬの濃度で０．１ｍＬ／マウスとして接種した。腫瘍容積及び動物の体重を週２回測定し、測定値を記録し、腫瘍容積（ｍｍ３）＝０．５×長径×短径２とした。結果を図７Ａ及び図７Ｂ並びに表１２及び表１３に示す。
５．１ Ｂ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウスＭＣ３８結腸癌動物モデルにおける候補抗体の有効性試験
Ｂ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）を体重によって５群に分け、ここでは、１０匹のマウスがＧ１陰性対照群であり、８匹のマウスがＧ２～Ｇ４治療群の各々であった。群分け当日から個別投与を実施し（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｉ．Ｐ．、ＢＩＷ）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、週２回）、翌日、ＰＢＳに再懸濁したＭＣ３８細胞をＢ－ｈＩＬ２Ｒαヒト化マウスの右側腹皮下に５×１０５細胞／０．１ｍＬの濃度で０．１ｍＬ／マウスとして接種した。腫瘍容積及び動物の体重を週２回測定し、測定値を記録し、腫瘍容積（ｍｍ３）＝０．５×長径×短径２とした。結果を図７Ａ及び図７Ｂ並びに表１２及び表１３に示す。
【0080】
図７Ａに示されるとおり、マウスの体重は、着実に増加し、これは、ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１、ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ１１－ＣＴ８４８－ＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ＢＩＷ）にマウスに対する毒性及び副作用がないことを示している。
【0081】
図７Ｂに示されるとおり、対照群と比較して、ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１、ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ１１－ＣＴ８４８－ＩｇＧ１は、マウスＭＣ３８の腫瘍の成長を有意に阻害することができ、そのうちのＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１がより良好な抗腫瘍効果を示す。
【0082】
【0083】
【0084】
５．２ 投与後のＭＣ３８腫瘍に対する免疫細胞浸潤効果のＦＡＣＳ検出
５．１における試験マウスの５回目の投与後（群分けから１６日後）、陰性対照群から４匹のマウスを取り、各治療群から３匹のマウスを取り、それらのマウスを殺処分し、腫瘍を切り刻み、そこに消化酵素を加え、３７℃で４０分間インキュベートして消化させ、ろ過及び洗浄後に単一細胞懸濁液として再懸濁した。９６ウェル丸底プレートの各ウェルに２５μＬの封止及び生死判別色素溶液並びに２５μＬの細胞懸濁液を加え、十分に混合し、暗所下において４℃で１５分間インキュベートした。各ウェルに５０μＬの表面色素を加え、十分に混合し、暗所下において４℃で３０分間インキュベートした。各ウェルに１５０μＬのＦＡＣＳ溶液を加え、２回洗浄し、４℃、５００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。２００μＬの固定溶液に再懸濁した細胞を各ウェルに加え、十分に混合した後、室温で３０分間固定した。固定後、４℃、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに２００μＬの膜透過処理溶液を加え、４℃、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに１００μＬの細胞内色素溶液を加え、室温で暗所下において３０分間インキュベートした。各ウェルに１５０μＬの膜透過処理溶液を加え、２回洗浄し、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。細胞を２５０μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＣＤ３中のＣＤ８＋細胞（Ｔｅｆｆ）含有量、ＣＤ３中のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量及びＣＤ４中のＦｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量を機械で検出した。結果を図８Ａ～図８Ｃに示す。
５．１における試験マウスの５回目の投与後（群分けから１６日後）、陰性対照群から４匹のマウスを取り、各治療群から３匹のマウスを取り、それらのマウスを殺処分し、腫瘍を切り刻み、そこに消化酵素を加え、３７℃で４０分間インキュベートして消化させ、ろ過及び洗浄後に単一細胞懸濁液として再懸濁した。９６ウェル丸底プレートの各ウェルに２５μＬの封止及び生死判別色素溶液並びに２５μＬの細胞懸濁液を加え、十分に混合し、暗所下において４℃で１５分間インキュベートした。各ウェルに５０μＬの表面色素を加え、十分に混合し、暗所下において４℃で３０分間インキュベートした。各ウェルに１５０μＬのＦＡＣＳ溶液を加え、２回洗浄し、４℃、５００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。２００μＬの固定溶液に再懸濁した細胞を各ウェルに加え、十分に混合した後、室温で３０分間固定した。固定後、４℃、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに２００μＬの膜透過処理溶液を加え、４℃、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。各ウェルに１００μＬの細胞内色素溶液を加え、室温で暗所下において３０分間インキュベートした。各ウェルに１５０μＬの膜透過処理溶液を加え、２回洗浄し、１４００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄した。細胞を２５０μＬのＰＢＳで再懸濁し、ＣＤ３中のＣＤ８＋細胞（Ｔｅｆｆ）含有量、ＣＤ３中のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量及びＣＤ４中のＦｏｘｐ３＋細胞（Ｔｒｅｇ）含有量を機械で検出した。結果を図８Ａ～図８Ｃに示す。
【0085】
図８Ａ～図８Ｃに示されるとおり、対照群ヒトＩｇＧ１κアイソタイプと比較して、ＣＤ２５Ｑ２－ＢＡ９－ＩｇＧ１、ＣＤ２５Ｑ８－ＢＴ９４２－ＩｇＧ１及びＣＤ２５Ｑ１１－ＣＴ８４８－ＩｇＧ１は、マウスＭＣ３８の腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の割合を減少させ、Ｔｅｆｆ細胞の浸潤を増加させることができ、従って腫瘍殺傷能力が向上している。
【図1】
【図2A-2B】
【図2C-2E】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A-7B】
【図8A-8C】
【配列表】