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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-15
(45)【発行日】2023-03-24
(54)【発明の名称】安定なペプチド製剤を調製するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/00 20060101AFI20230316BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230316BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230316BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20230316BHJP
A61K 47/40 20060101ALI20230316BHJP
A61K 38/26 20060101ALI20230316BHJP
C07K 1/34 20060101ALN20230316BHJP
C07K 14/605 20060101ALN20230316BHJP
【ＦＩ】
A61K38/00
A61K9/14
A61K47/12
A61K47/24
A61K47/40
A61K38/26
C07K1/34
C07K14/605 ZNA
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021560275
(86)(22)【出願日】2020-04-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 US2020028988
(87)【国際公開番号】W WO2020219391
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2021-11-25
(31)【優先権主張番号】62/839,246
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100139310
【弁理士】
【氏名又は名称】吉光 真紀
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，グレゴリー ネルソン
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン スコーク，クルト ガルト
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０７８５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２４９０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１４６１５６（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ａ６１Ｋ ９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチド粉末製剤を調製するための方法であって、ａ．水性担体中で、酸、リン脂質界面活性剤、およびシクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．前記第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．前記第１の濾過生成物にペプチドを添加して第２の混合物を形成し、前記第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．前記第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、前記固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記ペプチドが、グルカゴンまたはグルカゴン類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ペプチドが、グルカゴンである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記界面活性剤、前記シクロデキストリンおよび前記ペプチドが一緒になって、前記第２の混合物の約１．５重量％～約３重量％を構成する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
界面活性剤、前記シクロデキストリンおよび前記ペプチドが一緒になって、前記第２の混合物の約２．５重量％を構成する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１および前記第２の濾過ステップの両方における前記膜が、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第１および前記第２の濾過ステップの両方における前記膜が、約０．４５μｍの孔径を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記酸が、クエン酸または酢酸である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記界面活性剤が、ドデシルホスホコリン、ジデシルホスファチジルコリン、リゾラウロイルホスファチジルコリン、ジオクタノイルホスファチジルコリン、またはジラウロイルホスファチジルグリセロールである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記シクロデキストリンが、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン、またはγ－シクロデキストリンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ペプチドがグルカゴンであり、前記方法が、ａ．水性担体中で、酢酸、ドデシルホスホコリン、およびβ－シクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．前記第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．前記第１の濾過生成物にグルカゴンを添加して第２の混合物を形成し、前記第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．前記第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、前記固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ドデシルホスホコリン、前記β－シクロデキストリンおよび前記グルカゴンが一緒になって、前記第２の混合物の約２．５重量％を構成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第１および前記第２の濾過ステップの両方における前記膜が、ＰＶＤＦ膜を含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記第１および前記第２の濾過ステップの両方における前記膜が、約０．４５μｍの孔径を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記酢酸が、１Ｍの濃度である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ペプチドを含む粉末製剤を調製するための改善された方法を提供する。本発明はさらに、グルカゴンまたはグルカゴン類似体を含む粉末製剤を調製するための改善された方法を提供し、当該粉末製剤は経鼻投与に適している。
【背景技術】
【0002】
ペプチドは、製造プロセスの間および後に凝集等の物理的不安定性を有する傾向がある。凝集は、いくつかの異なる機構によって生じる複雑なプロセスである。凝集は、小さな可溶性の凝集体を形成する、いくつかのペプチドまたはタンパク質の核形成によって誘発され、次いでそれらは、その後により大きな不溶性凝集体が成長するための核形成中心として機能する。核形成－成長プロセスは、時間、温度、タンパク質濃度、およびその他のパラメータによって増加し得る。製造中、タンパク質は、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、選択的吸収クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、凍結乾燥、透析、および沈殿または「塩析」等の様々な手段を用いて精製および濃縮される。そのような濃縮プロセスは、凝集を引き起こし得る（Ｍａｇｇｉｏ、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００８；６（１０）：５８－６５）。これらの凝集体を除去または可溶化するには追加の処理ステップが必要であるが、それは高価であり得、また製品全体の収率を低下させる可能性がある。凝集の影響には、材料の損失、有効性の低下、薬物動態の変化、安定性および製品の貯蔵寿命の低下、ならびに望ましくない免疫原性の誘導が含まれる。
【0003】
特に、現在の高濃度溶液への傾向によってタンパク質間相互作用の可能性が高くなり、それによって凝集が促進されるため、凝集はバイオ医薬品メーカーにとって大きな問題となっている。（Ｍａｇｇｉｏ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００８；６（１０）：５８－６５）。限定されないが、ｐＨ、緩衝液条件、イオン強度の調整、および／またはシクロデキストリン等の他の賦形剤の添加を含む、ペプチドの凝集を制限するための様々な手法が研究されてきた。
【0004】
グルカゴンは、水溶液中で凝集する傾向があることで知られており（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＳ．，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；４（６）：１３５７－１３６７；Ｂｅａｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６９；１１（１）：３７－４２；Ｍａｔｉｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００９；（３６）：４１２－４２０）、グルカゴン粉末製剤の製造中に問題を引き起こし得る。経鼻投与に適したグルカゴン粉末製剤を調製する以前の方法は、ＷＯ２０１６／１３３８６３に開示されている。
【0005】
ペプチド粉末製剤、特にグルカゴンまたはグルカゴン類似体粉末製剤を調製するための代替方法の必要性が存在する。特に、水溶液中のペプチドの凝集を低減または排除する方法が必要である。凝集を低減するか、または好ましくは排除することにより、最終粉末製剤は、非常に高いパーセンテージの活性ペプチドを保持することとなり、非常に有利である。好ましくは、方法は、乾燥前に、長期間、例えば最大２４時間、物理的および化学的に安定な水溶液をもたらす。この拡張された安定性により、プロセスが大規模製造にはるかに適したものとなる。さらに、長い貯蔵寿命、好ましくは最大約２４ヶ月を有する最終粉末製剤をもたらす方法が必要である。
【0006】
したがって、本発明は、粉末製剤の製造中にペプチドの凝集を低減する、改善された費用効果の高い方法を提供する。この方法には、二重濾過ステップが組み込まれている。本発明で使用されるそのようなペプチドの１つは、グルカゴンまたはグルカゴン類似体である。本発明の方法に従って調製される粉末製剤は、経鼻投与に特に適している。
【発明の概要】
【0007】
本発明の一態様によれば、ペプチド粉末製剤を調製するための方法が提供される。この方法は、以下のステップを含む：
ａ．水性担体中で、酸、リン脂質界面活性剤、およびシクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にペプチドを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
ａ．水性担体中で、酸、リン脂質界面活性剤、およびシクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にペプチドを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
【0008】
一実施形態において、ペプチドは、グルカゴンまたはグルカゴン類似体である。特に、それはグルカゴンである。
【0009】
一実施形態において、酸は、クエン酸または酢酸である。特に、それは酢酸である。より具体的には、酢酸は、１Ｍの濃度である。
【0010】
一実施形態において、界面活性剤、シクロデキストリンおよびペプチドが一緒になって、第２の混合物の約１．５重量％～約３重量％を構成する。特定の実施形態において、それらは、第２の混合物の約２重量％を構成する。さらなる実施形態において、それらは、第２の混合物の約２．５重量％を構成する。
【0011】
一実施形態において、界面活性剤は、ドデシルホスホコリン（ＤＰＣ）、ジデシルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）、リゾラウロイルホスファチジルコリン（ＬＬＰＣ）、ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ｄ８ＰＣ）、またはジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）である。特に、界面活性剤はＤＰＣである。
【0012】
一実施形態において、シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン、またはγ－シクロデキストリンである。特に、シクロデキストリンは、β－シクロデキストリンである。
【0013】
一実施形態において、最終粉末製剤中のペプチドの９８％超が、逆相ＨＰＬＣによって測定される非凝集ペプチドである。好ましくは、ペプチドの９９％超が非凝集ペプチドである。より好ましくは、ペプチドの１００％が非凝集ペプチドである。
【0014】
本発明の別の態様によれば、以下のステップを含むペプチド粉末製剤を調製するための方法が提供される：
ａ．水性担体中で、リン脂質界面活性剤とシクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にペプチドを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
ａ．水性担体中で、リン脂質界面活性剤とシクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にペプチドを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
【0015】
一実施形態において、界面活性剤、シクロデキストリンおよびペプチドが一緒になって、第２の混合物の約１．５重量％～約３重量％を構成する。特定の実施形態において、それらは、第２の混合物の約２重量％を構成する。さらなる実施形態において、それらは、第２の混合物の約２．５重量％を構成する。
【0016】
一実施形態において、界面活性剤は、ＤＰＣ、ＤＤＰＣ、ＬＬＰＣ、Ｄ８ＰＣ、またはＤＬＰＧである。特に、界面活性剤はＤＰＣである。
【0017】
一実施形態において、シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン、またはγ－シクロデキストリンである。特に、シクロデキストリンは、β－シクロデキストリンである。
【0018】
一実施形態において、最終粉末製剤中のペプチドの９８％超が、逆相ＨＰＬＣによって測定される非凝集ペプチドである。好ましくは、ペプチドの９９％超が非凝集ペプチドである。より好ましくは、ペプチドの１００％が非凝集ペプチドである。
【0019】
本発明の別の態様によれば、以下のステップを含むグルカゴン粉末製剤を調製するための方法が提供される。
ａ．水性担体中で、酢酸、ＤＰＣ、およびβ－シクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にグルカゴンを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
ａ．水性担体中で、酢酸、ＤＰＣ、およびβ－シクロデキストリンの第１の混合物を形成するステップと、
ｂ．第１の混合物を第１の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｃ．第１の濾過生成物にグルカゴンを添加して第２の混合物を形成し、第２の混合物を第２の濾過ステップに供するステップであって、フィルターが、約０．４μｍ～約０．５μｍの孔径を有する膜を含む、ステップと、
ｄ．第２の濾過生成物を乾燥させて固体製剤を形成し、固体製剤を処理して最終粉末製剤を製造するステップ。
【0020】
一実施形態において、グルカゴン、ＤＰＣおよびβ－シクロデキストリンは一緒になって、第２の混合物の約１．５重量％～約３重量％を構成する。特定の実施形態において、それらは、第２の混合物の約２重量％を構成する。さらなる実施形態において、それらは、第２の混合物の約２．５重量％を構成する。
【0021】
一実施形態において、酢酸は、１Ｍの濃度である。
【0022】
一実施形態において、最終粉末製剤中のグルカゴンの９８％超が、逆相ＨＰＬＣによって測定される非凝集グルカゴンである。好ましくは、グルカゴンの９９％超が非凝集グルカゴンである。より好ましくは、グルカゴンの１００％が非凝集グルカゴンである。
【0023】
本発明はさらに、本発明の方法に従って調製される粉末製剤を提供する。
【0024】
特定の実施形態において、第２の濾過生成物の乾燥は、フリーズドライ（凍結乾燥）または噴霧乾燥によって実施することができる。
【0025】
特定の実施形態において、第１および第２の濾過ステップの両方におけるフィルター膜は、限定されないが、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標））、ポリ塩化ビニル、ポリエーテルスルホン、またはｃＧＭＰ製造環境での使用に適した他の濾材を含む。好ましい実施形態において、フィルター膜はＰＶＤＦを含む。
【0026】
特定の実施形態において、第１および第２の濾過ステップの両方におけるフィルター膜は、約０．４５μｍの孔径を有する膜である。好ましい実施形態において、フィルター膜は、０．４５μｍの孔径を有するＰＶＤＦ膜である。
【0027】
一実施形態において、本発明の方法の間、溶液のｐＨは２～３に維持される。
【0028】
一実施形態において、本発明の方法の液相は、１５～３０℃、好ましくは１８～２５℃、より好ましくは約２０℃付近の温度で実施される。
【0029】
本発明の方法は、粉末製剤の製造中に凝集する傾向があるペプチドに使用することができる。特に、この方法は、限定されないが、アミリン、アミリン類似体、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒｆＶＩＩ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、カルシトニン、ＧＬＰ－１類似体、ＧＬＰ－１－ＧＬＰデュアルアゴニスト、ＧＩＰアゴニスト、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、オクタペプチドＣＣＲ５阻害剤Ｄ－Ａｌａ－ペプチドＴ－アミリン、組換えヒトインスリン、インスリン類似体、ＰＴＨ １－３１環状ペプチド類似体、インターフェロン－β、インターフェロンβ－１ａおよびβ－１ｂ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、酢酸プラムリンチド、およびウロキナーゼ等の酵素を含むペプチドに使用することができる。
【0030】
特に、本発明の方法は、グルカゴン粉末製剤を調製するために用いることができる。グルカゴンは、病院内および病院外の両方で、重度の低血糖症の非常に効果的な治療である。グルカゴンは、注射による投与の直前に希釈剤と混合しなければならない粉末製剤として入手可能である。グルカゴンの液体製剤も知られている（Ｐｏｎｔｉｒｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ（Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｅｄ）１９８３；２８７：４６２－４６３）。重度の低血糖症の治療のための経鼻投与用のグルカゴン粉末が開発され、ＷＯ２０１６／１３３８６３に記載されているが、これは最近、Ｂａｑｓｉｍｉ（商標）の名称で米国およびヨーロッパで承認された。
【0031】
本発明の方法に従って製造されるグルカゴンまたはグルカゴン類似体製剤は、経鼻投与に特に適している。好ましい実施形態において、本発明の方法に従って製造される製剤は、以下のうちの１つまたは複数を有する：
●肺に到達する可能性のある小さな粒子の低い割合
●一方の鼻孔への単回投与として治療効果を達成するために必要な薬物の総用量を提供するのに十分な薬物含有量
●数十ミリグラムの総用量、または送達デバイスによって可能な最大量を送達するのに十分な薬物含有量
●アレルギーまたは風邪に伴い得る鼻づまりがあるにもかかわらず効果的であるために十分な薬物含有量および吸収特性
●長期間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間の、周囲条件下での保存中の安定性
●良好な安全性および耐容性プロファイル
●肺に到達する可能性のある小さな粒子の低い割合
●一方の鼻孔への単回投与として治療効果を達成するために必要な薬物の総用量を提供するのに十分な薬物含有量
●数十ミリグラムの総用量、または送達デバイスによって可能な最大量を送達するのに十分な薬物含有量
●アレルギーまたは風邪に伴い得る鼻づまりがあるにもかかわらず効果的であるために十分な薬物含有量および吸収特性
●長期間、好ましくは少なくとも２４ヶ月間の、周囲条件下での保存中の安定性
●良好な安全性および耐容性プロファイル
【0032】
本明細書で使用される場合、「凝集」という用語は、ペプチド等の小さなオリゴマー前駆体の種核、核形成中心、原繊維、またはゲルの、蓄積、凝集、集塊、二量体化、重合、または形成を指す。凝集体のサイズは、可溶性二量体および他の多量体（見かけの球径で約５～１０ｎｍ）から、肉眼では見ることができない粒子および目に見える粒子として識別される、より大きな不溶性種（見かけの直径で約２０～５０μｍ）までに及ぶ。可溶性凝集体群から、高分子量種等のより大きなものは、有害な臨床転帰をもたらす可能性のある免疫原性応答を誘発することが可能であり得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、「種核」または「核形成中心」という用語は、より大きな凝集体が形成される最小の凝集体サイズを指す。
【0034】
逆相ＨＰＬＣを用いて、最終粉末製剤中の非凝集ペプチドの量を決定することができる。当業者に既知の標準的な条件、例えば、以下の実施例に記載されている条件を使用することができる。
【0035】
本明細書で使用される場合、「グルカゴン」は、配列
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１）のポリペプチドを指す。
グルカゴンは、化学的に合成するか、組換えＤＮＡ技術によって生成するか、または天然資源から抽出することができる。「グルカゴン類似体」という用語は、インビボで血糖の増加を刺激する能力を保持するこの配列の変異体を指す。
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１）のポリペプチドを指す。
グルカゴンは、化学的に合成するか、組換えＤＮＡ技術によって生成するか、または天然資源から抽出することができる。「グルカゴン類似体」という用語は、インビボで血糖の増加を刺激する能力を保持するこの配列の変異体を指す。
【0036】
天然配列の１つのアミノ酸がアラニンで置換されているグルカゴン類似体、および複数の置換を有する類似体の例は、Ｃｈａｂｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４；３：２９３－３００に開示されている。増強された生物学的活性を有するグルカゴン類縁体を生じるように３個のアミノ酸が修飾された例示的な類似体は、［Ｌｙｓ１７，１８，Ｇ１ｕ２１］グルカゴンであるＺｅａｌａｎｄ Ｐｈａｒｍａは、例えば、米国特許公開第２０１４００８０７５７号、２０１４００１７３３号、２０１３０３１６９４１号、２０１３０１５７９３５号、２０１３０１５７９２９号、２０１２０１７８６７０号、２０１１０２９３５８６号、２０１１０２８６９８２号、２０１１０２８６９８１号、および２０１００２０４１０５号に、多数のグルカゴン類似体を開示している。これらの類似体は、グルカゴン受容体よりもＧＬＰ受容体に対して高い結合親和性を有すると報告されているが、それでもなおグルカゴンの活性を保持している。Ｚｅａｌａｎｄ Ｐｈａｒｍａは、ＺＰ４２０７と呼ばれる低血糖症の治療のためのグルカゴン類似体の臨床試験も開始している。米国特許公開第２０１３／００５３３１０号は、低血糖症の治療に有用な他のグルカゴン類似体を開示している。
【0037】
リン脂質界面活性剤は、鼻粘膜を含む人体の細胞および組織の一部である生体膜に広範に分布する成分である。細胞内で最も一般的なリン脂質界面活性剤は、ホスファチジルコリンおよびホスホコリン（ＰＣ）であるが、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は生体膜の重要な成分である。アシル基の１つを除去することによりジアシルＰＣまたはＰＧに由来するリゾホスリン脂質も使用することができる。
【0038】
本発明で使用することができる例示的なリン脂質界面活性剤は、ドデシルホスホコリン（ＤＰＣ）、ジデシルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣまたは１，２－ジデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、リゾラウロイルホスファチジルコリン（ＬＬＰＣまたは１－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ジオクタノイルホスファチジルコリン（Ｄ８ＰＣまたは１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）およびジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧまたは１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ（１’－ｒａｃ－グリセロール）である。
【0039】
好ましいリン脂質界面活性剤は、粉末製剤の製造中に用いられる濃度で、二重層ではなく、ミセルを形成するものである。これには、ＤＰＣ、ＤＤＰＣ、ＬＬＰＣ、およびＤ８ＰＣが含まれるが、ＤＬＰＧは含まれない。最も好ましいのはＤＰＣである。
【0040】
本発明の特定の実施形態において、単一タイプのリン脂質界面活性剤が使用される。他の実施形態において、リン脂質界面活性剤成分は、例えば、上記で特定された界面活性剤の任意の２つ、３つ、または４つの組み合わせを含む、リン脂質界面活性剤の混合物から構成され得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「シクロデキストリン」という用語は、環内に６つ、７つ、または８つのグルコース残基を含み、円錐形を形成するシクロデキストリン、すなわち、以下を指す：
●α（アルファ）－シクロデキストリン：６員糖環分子
●β（ベータ）－シクロデキストリン：７員糖環分子
●γ（ガンマ）－シクロデキストリン：８員糖環分子。
●α（アルファ）－シクロデキストリン：６員糖環分子
●β（ベータ）－シクロデキストリン：７員糖環分子
●γ（ガンマ）－シクロデキストリン：８員糖環分子。
【0042】
α－ＣＤは、臨床試験でＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによって粉末製剤（ＨｙｐｏＧｏｎ（登録商標）Ｎａｓａｌ）に使用された（Ｓｔｅｎｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １９９３；３６：９３１－９３５；Ｒｏｓｅｎｆａｌｃｋ ＡＭ、ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９２；１７：４３－５０）。α－ＣＤの水溶解度は、約５重量％であると報告されている。
【0043】
一方はα－ＣＤよりも水溶解度が低く（β－ＣＤ、１．８５重量％）、もう一方はα－ＣＤよりも水溶解度が高い（ＨＰ－β－ＣＤ）他の２つのシクロデキストリンも、本発明における使用に適しており、水中で自由に可溶性であるγ－シクロデキストリンも同様である。
【0044】
製剤中のシクロデキストリンは充填剤として作用し、また鼻粘膜表面に付着してグルカゴンの吸収を補助する。鼻孔に送達されると、主成分（９０重量％～７０重量％）、すなわちシクロデキストリンは、粉末が粘膜表面に付着するのを助ける。
【0045】
シクロデキストリンは、個別に使用されてもよいか、または任意の２つ以上のシクロデキストリンの混合物として使用されてもよい。
【0046】
特定の実施形態において、本方法に従って調製されるグルカゴン粉末製剤は、グルカゴン、ＤＰＣおよびβ－シクロデキストリンを含む。好ましくは、粉末製剤は、１０：１０：８０（グルカゴン：ＤＰＣ：β－シクロデキストリン）の重量比でグルカゴン、ＤＰＣおよびβ－シクロデキストリンを含む。好ましくは、グルカゴンは、一方の鼻孔に単回用量で投与された場合に有効である治療量で存在する。一実施形態において、グルカゴンの用量は約３ｍｇである。
【0047】
混合は、静的および動的混合を含む方法によって行うことができる。動的混合は、軸に取り付けられ、モーターによって回転する、液体に挿入された刃を使用して行うことができる。静的混合は、静的ミキサー内の曲がりくねった経路に液体を流すことによって行うことができる。高速混合条件下での混合中に空気－水界面が存在すると、発泡が生じる場合がある。高速混合はまた、剪断応力に起因してタンパク質の不安定化をもたらす場合もある。発泡を最小限に抑え、好ましくはそれを排除するために、低速混合条件が好ましい。動的混合の場合、速度はスターラーの１分あたりの回転数（ｒｐｍ）によって決定される。好ましいｒｐｍ値は、５０～３００、より好ましくは５０～２５０、さらには５０～１００である。
【0048】
第２の濾過生成物を乾燥させて、溶媒を除去し、固体生成物を残す。乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、トレイ乾燥または他の技術によって実施することができる。生成物の巨視的な物理的特性は、乾燥技術に応じて変化し、凍結乾燥からの薄片状の固体または乾燥固体ケーキの形態であり得る。
【0049】
過剰な水分含有量を有する粉末は、粘着性があり、凝集塊を形成する可能性があり、その結果、投与デバイスに充填するために操作するのが困難な粉末が生じる。重要なのは、残留含水量のレベルが安定性に直接影響することである。バルク粉末の残留水分含有量レベルが５％を超えると、残留含水量が５％未満の粉末と比較して安定性が低下する。したがって、特定の実施形態において、本発明に従って調製される粉末製剤は、好ましくは５％未満の残留含水量を有する。
【0050】
特定の実施形態において、本発明に従って調製される粉末製剤中の酸の量は、１０％ｗ／ｗ未満、好ましくは６％ｗ／ｗ未満である。
【0051】
経鼻投与に適した粉末は、それらを経鼻排出デバイスに充填することを可能にするのに十分な流動性を可能にする物理的特性を必要とする。流動性は、粒径、形状、密度、表面テクスチャー、表面積、密度、凝集力、接着性、弾性、多孔性、吸湿性、および破砕性を含む様々なパラメータによって決定される。
【0052】
適切な粒径および流動性特性を有する粉末は、小さすぎるまたは大きすぎる粒子を除去するようにバルク粉末を処理することによって製造することができる。小さすぎるまたは大きすぎる粒子を除去するようにバルク粉末を処理する方法は、バルク粉末を粉砕してより大きな粒子を分解し、ふるいにかけて所望の粒径範囲の粒子を単離することを含み得る。上下振動ふるい、水平ふるい、タップ型ふるい、超音波ふるい、および空気循環ジェットふるい等の、様々なふるい方法が実施され得る。ふるいは、一定公称開口の単一ふるいとして使用されてもよいか、または所望の粒径分布を得るように、開口が徐々に小さくなる一連のふるいを通してバルク粉末を処理してもよい。ふるいは、公称開口が２５～１０００μｍの範囲の金網メッシュふるいであってもよい。
【実施例】
【0053】
実施例１．グルカゴン粉末製剤の調製（二重濾過ステップ）
ＤＰＣを撹拌により１Ｍ酢酸溶液に溶解する。次に、β－シクロデキストリンをＤＰＣ溶液に添加し、溶解するまで撹拌して第１の溶液を形成する。第１の溶液を、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを介して第１の濾過ステップに供する。濾過生成物（賦形剤溶液）を新しいクリーンタンクに収集し、タンクの温度を２０℃±２℃に調整して、溶液への材料の溶解性を確保する。タンク内の標的温度に達したら、溶液を撹拌しながら、グルカゴンまたはグルカゴン類似体をタンクに添加する。グルカゴンが溶解したように見えたらすぐに（視覚的確認による）、撹拌を直ちに終了する。次いで、グルカゴン溶液を第２の０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、濾過された材料を第２のクリーンタンクに収集する。この第２の濾過された材料（第２の濾過生成物）は、９７．５％ｗ／ｗの１Ｍ酢酸水溶液、０．２５％ｗ／ｗのＤＰＣ、２％ｗ／ｗのβ－シクロデキストリン、および０．２５％ｗ／ｗのグルカゴン（合計２．５％ｗ／ｗの固形分重量）を含む。次いで、材料を凍結乾燥し、緻密化ステップを経て、最終的なグルカゴン粉末製剤を製造する。
ＤＰＣを撹拌により１Ｍ酢酸溶液に溶解する。次に、β－シクロデキストリンをＤＰＣ溶液に添加し、溶解するまで撹拌して第１の溶液を形成する。第１の溶液を、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを介して第１の濾過ステップに供する。濾過生成物（賦形剤溶液）を新しいクリーンタンクに収集し、タンクの温度を２０℃±２℃に調整して、溶液への材料の溶解性を確保する。タンク内の標的温度に達したら、溶液を撹拌しながら、グルカゴンまたはグルカゴン類似体をタンクに添加する。グルカゴンが溶解したように見えたらすぐに（視覚的確認による）、撹拌を直ちに終了する。次いで、グルカゴン溶液を第２の０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、濾過された材料を第２のクリーンタンクに収集する。この第２の濾過された材料（第２の濾過生成物）は、９７．５％ｗ／ｗの１Ｍ酢酸水溶液、０．２５％ｗ／ｗのＤＰＣ、２％ｗ／ｗのβ－シクロデキストリン、および０．２５％ｗ／ｗのグルカゴン（合計２．５％ｗ／ｗの固形分重量）を含む。次いで、材料を凍結乾燥し、緻密化ステップを経て、最終的なグルカゴン粉末製剤を製造する。
【0054】
比較例．グルカゴン粉末製剤の調製（単一濾過ステップ）
ＤＰＣを撹拌により１Ｍ酢酸溶液（８リットル）に溶解する。溶液を撹拌しながらグルカゴンを添加する。グルカゴンが溶解したように見えたらすぐに（視覚的確認による）、撹拌しながらβ－シクロデキストリンを添加する。添加した固体がすべて溶解したように見えたら、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを通して溶液を濾過する。単一のフィルター膜の目詰まりまたはファウリングが発生した場合、複数のフィルターの使用が必要になる場合がある。濾過された材料は、０．３％ｗ／ｗのＤＰＣ、２．４％ｗ／ｗのβ－シクロデキストリン、および０．３％ｗ／ｗのグルカゴン（合計３％％ｗ／ｗの固形分）を含む。濾過された材料を収集し、凍結乾燥する。
ＤＰＣを撹拌により１Ｍ酢酸溶液（８リットル）に溶解する。溶液を撹拌しながらグルカゴンを添加する。グルカゴンが溶解したように見えたらすぐに（視覚的確認による）、撹拌しながらβ－シクロデキストリンを添加する。添加した固体がすべて溶解したように見えたら、０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターを通して溶液を濾過する。単一のフィルター膜の目詰まりまたはファウリングが発生した場合、複数のフィルターの使用が必要になる場合がある。濾過された材料は、０．３％ｗ／ｗのＤＰＣ、２．４％ｗ／ｗのβ－シクロデキストリン、および０．３％ｗ／ｗのグルカゴン（合計３％％ｗ／ｗの固形分）を含む。濾過された材料を収集し、凍結乾燥する。
【0055】
１回目の濾過後の賦形剤溶液の安定性
賦形剤溶液（酢酸、ＤＰＣおよびβ－シクロデキストリン）を、本質的に実施例１に記載されるように、２．５％ｗ／ｗの固形分濃度で調製する。試験期間中、溶液を２５℃に維持する。データを表１にまとめる。２２時間の期間にわたって含有量に有意な変化は起きず、物質収支が確認された。
賦形剤溶液（酢酸、ＤＰＣおよびβ－シクロデキストリン）を、本質的に実施例１に記載されるように、２．５％ｗ／ｗの固形分濃度で調製する。試験期間中、溶液を２５℃に維持する。データを表１にまとめる。２２時間の期間にわたって含有量に有意な変化は起きず、物質収支が確認された。
【表1】
【0056】
グルカゴンを含む水溶液の安定性
溶液アッセイ
グルカゴン溶液を、本質的に実施例１（第２の濾過生成物）に記載されるように調製する。調製後、グルカゴン溶液を撹拌せずに静置する。溶液サンプルを所定の時間に採取し、アッセイの前に０．４５μｍフィルターを通過させる。凝集体に変換したあらゆるグルカゴンがこの濾過ステップによって除去されるため、このアッセイは凝集の程度の推定を提供する。
溶液アッセイ
グルカゴン溶液を、本質的に実施例１（第２の濾過生成物）に記載されるように調製する。調製後、グルカゴン溶液を撹拌せずに静置する。溶液サンプルを所定の時間に採取し、アッセイの前に０．４５μｍフィルターを通過させる。凝集体に変換したあらゆるグルカゴンがこの濾過ステップによって除去されるため、このアッセイは凝集の程度の推定を提供する。
【0057】
蛍光アッセイ
蛍光法の基本は、グルカゴン分子中の単一トリプトファン残基の発光波長のシフトを利用することである（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＳ．，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；４（６）：１３５７－１３６７）。グルカゴン分子が、そのコンフォメーションをランダムコイルまたはαヘリックスから凝集形態に変化させると、トリプトファン分子の局所環境が発光スペクトルの青方偏移の形で変化する。したがって、ファイバー光学的に結合された後方散乱蛍光プローブを用いて、グルカゴンの発光蛍光シグナルの波長の変化を経時的に監視することにより、非凝集グルカゴンと該分子の凝集形態との発光ピークの比を計算することが、リアルタイムでの凝集を監視するためのツールとして用いられ得る。
蛍光法の基本は、グルカゴン分子中の単一トリプトファン残基の発光波長のシフトを利用することである（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＳ．，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；４（６）：１３５７－１３６７）。グルカゴン分子が、そのコンフォメーションをランダムコイルまたはαヘリックスから凝集形態に変化させると、トリプトファン分子の局所環境が発光スペクトルの青方偏移の形で変化する。したがって、ファイバー光学的に結合された後方散乱蛍光プローブを用いて、グルカゴンの発光蛍光シグナルの波長の変化を経時的に監視することにより、非凝集グルカゴンと該分子の凝集形態との発光ピークの比を計算することが、リアルタイムでの凝集を監視するためのツールとして用いられ得る。
【0058】
グルカゴン溶液を、本質的に実施例１（第２の濾過生成物）に記載されるように調製する。蛍光プローブを用いて、発光スペクトルの経時変化を監視する。溶液を撹拌せず、室温で２４時間監視する。
【0059】
小規模実験（１００ｍＬ）では、この２４時間の期間にグルカゴン蛍光比の変化は観察されなかった。
【0060】
さらなる実験において、グルカゴン溶液を、本質的に実施例１（第２の濾過生成物）に記載されるように調製し、異なる温度に維持する。比較のために、これを第２の濾過ステップを通過していないグルカゴン溶液と比較する。その結果を表２にまとめる。
【表2】
【0061】
試験の結果は、グルカゴン溶液が第２の濾過ステップを通過し、５℃または２０℃で撹拌せずに保持された場合、システムからの凝集によってグルカゴンが失われないことを示している。しかしながら、溶液を濾過しないと、２４時間にわたってグルカゴン含有量の約８％が失われる。
【0062】
本質的に実施例１に記載されるように調製したグルカゴン溶液の化学的安定性はまた、本質的に以下に記載されるように逆相ＨＰＬＣを用いて試験することができる。
【0063】
１００リットル（２．５％ｗ／ｗ固形分）規模の量の二重濾過により、本質的に上記のように実施された調製では、驚くべきことに、第２の濾過ステップ後に収集された溶液は、検出可能な凝集もなく、２４時間まで物理的および化学的に安定であることが分かった（上記の方法の１つまたは複数によって決定される）。一方、１回の濾過ステップのみに供されたグルカゴン溶液材料（比較例、８リットルおよび３％ｗ／ｗ固形分）は、グルカゴンの添加から約１５分以内に目に見える凝集を示した。
【0064】
経鼻グルカゴン粉末製剤のＨＰＬＣによる化学的安定性分析
明確に定義された外部参照標準に対する、実施例１に従って調製された経鼻グルカゴン粉末製剤の安定性は、日常的ＲＰ－ＨＰＬＣ技術を用いて決定される。簡単に述べると、ＨＰＬＣ逆相カラムＣ１８（内径３．０ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ）を、２１４ｎｍのＵＶ検出波長で、リン酸カリウム緩衝液：アセトニトリル移動相とともに用いる。勾配移動相の組成は、５４％、８０：２０の１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：アセトニトリルで３分間保持することで開始し、７０％、６０：４０のリン酸カリウム緩衝液：アセトニトリルの組成で８分かけて終了する。
明確に定義された外部参照標準に対する、実施例１に従って調製された経鼻グルカゴン粉末製剤の安定性は、日常的ＲＰ－ＨＰＬＣ技術を用いて決定される。簡単に述べると、ＨＰＬＣ逆相カラムＣ１８（内径３．０ｍｍ×１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ）を、２１４ｎｍのＵＶ検出波長で、リン酸カリウム緩衝液：アセトニトリル移動相とともに用いる。勾配移動相の組成は、５４％、８０：２０の１５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液：アセトニトリルで３分間保持することで開始し、７０％、６０：４０のリン酸カリウム緩衝液：アセトニトリルの組成で８分かけて終了する。
【0065】
表３に示すように、本質的に上記のように実施された実験において、実施例１（１００Ｌ）に従って調製された経鼻グルカゴン粉末製剤の３つの異なるバッチからの代表的なサンプルは、実験精度内で約１００％のグルカゴン活性を保持した。
【0066】
経鼻グルカゴン粉末製剤の効力バイオアッセイ
グルカゴンの細胞表面受容体とＣＲＥ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を安定に発現するように操作された胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３を用いて、最終的な経鼻グルカゴン製剤製品の相対的効力を決定する。この細胞ベースのアッセイでは、ＣＲＥプロモーターからのルシフェラーゼの転写は、内因性サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シグナル伝達経路に沿った応答をトリガーすることによって制御される。したがって、グルカゴンの細胞表面受容体への結合は、ｃＡＭＰ産生を誘導する。これにより、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化および活性化がもたらされ、その結果、ＣＲＥ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子によるルシフェラーゼの発現が起こる。ルシフェラーゼ産生は、ルシフェリン基質を反応混合物に添加し、ルミノメーターを使用してルシフェリンの酸化を定量化することによって決定される。発光シグナルは、存在するルシフェラーゼの量に比例し、それは細胞を誘導するために使用されるグルカゴンの量に正比例する。試験サンプルの相対的効力は、参照標準の典型的な８ポイント用量反応曲線をサンプルのそれと比較することによって決定される。応答データを、４パラメータロジスティックモデルに適合させ、参照標準のＥＣ５０およびサンプルのＥＣ５０を決定する（これらのＥＣ５０値の比は、試験材料の相対的効力を表す）。
グルカゴンの細胞表面受容体とＣＲＥ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方を安定に発現するように操作された胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３を用いて、最終的な経鼻グルカゴン製剤製品の相対的効力を決定する。この細胞ベースのアッセイでは、ＣＲＥプロモーターからのルシフェラーゼの転写は、内因性サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シグナル伝達経路に沿った応答をトリガーすることによって制御される。したがって、グルカゴンの細胞表面受容体への結合は、ｃＡＭＰ産生を誘導する。これにより、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化および活性化がもたらされ、その結果、ＣＲＥ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子によるルシフェラーゼの発現が起こる。ルシフェラーゼ産生は、ルシフェリン基質を反応混合物に添加し、ルミノメーターを使用してルシフェリンの酸化を定量化することによって決定される。発光シグナルは、存在するルシフェラーゼの量に比例し、それは細胞を誘導するために使用されるグルカゴンの量に正比例する。試験サンプルの相対的効力は、参照標準の典型的な８ポイント用量反応曲線をサンプルのそれと比較することによって決定される。応答データを、４パラメータロジスティックモデルに適合させ、参照標準のＥＣ５０およびサンプルのＥＣ５０を決定する（これらのＥＣ５０値の比は、試験材料の相対的効力を表す）。
【0067】
ＨＥＫ２９３細胞を、増殖培地（１．０ｍｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｅｃｉｎ（登録商標）および１２５μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）。ペニシリンおよびストレプトマイシンが１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンの最終濃度で添加されてもよい）に播種し、３７℃で３０分～２．５時間付着させる。増殖培地を洗浄し、ＤＭＥＭ中の０．２５％ＦＢＳと、０．５％ウシ血清アルブミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、および０．０００３２ｎｇ／ｍＬ～２５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のグルカゴンとからなるアッセイ培地と交換する。プレートを３７℃で４．５時間インキュベートする。ウェルごとに１００μＬのＳｔｅａｄｙＧｌｏ（登録商標）を添加し、次いで、ウェルを周囲温度で３０分間継続的に撹拌する。プレートをルミノメーターで読み取る。
【0068】
表３に示すように、本質的に上記のように実施された実験では、細胞ベースのアッセイによって測定されたグルカゴンの相対的効力のパーセントは、９４％～１０２％であることがわかり、実施例１（１００Ｌ）による製剤の調製中に凝集が起こっていなかったことが示される。これらの結果は、同じ参照標準を使用したグルカゴン化学物質ベースのアッセイ結果と同等であった。
【0069】
経鼻グルカゴン粉末製剤の不純物分析
経鼻グルカゴン粉末製剤中の潜在的な不純物の同定および定量化は、日常的ＲＰ－ＨＰＬＣ技術を用いて行われる。不純物は、製造プロセス、または最終製剤中の材料の化学分解に起因して発生し得る。方法は、ＵＳＰ４１－ＮＦ３６に概説されている条件に基づいている。この分析は、グルカゴン粉末製剤の安定性の指標を提供する。
経鼻グルカゴン粉末製剤中の潜在的な不純物の同定および定量化は、日常的ＲＰ－ＨＰＬＣ技術を用いて行われる。不純物は、製造プロセス、または最終製剤中の材料の化学分解に起因して発生し得る。方法は、ＵＳＰ４１－ＮＦ３６に概説されている条件に基づいている。この分析は、グルカゴン粉末製剤の安定性の指標を提供する。
【0070】
表３に示すように、本質的に上記のように実施された実験では、バッチ出荷時の総不純物レベルは約０．４％～約０．５６％の範囲である。さらに、実施例１に従って調製された経鼻グルカゴン粉末製剤について提案された貯蔵寿命仕様分析は、最大約２４ヶ月間、約２０％（ａ／ａ）以下の総不純物レベルを有する。驚くべきことに、経鼻グルカゴン粉末製剤は、現在のＵＳＰモノグラフ（ＵＳＰ４１－ＮＦ３６）が、３１％（ａ／ａ）以下の総不純物および関連化合物が存在することという制限を規定する、現在市販されているグルカゴン緊急キットに推奨されるレベルよりも大幅に低い総不純物レベルを有する。
【表3】
【0071】
経鼻グルカゴン粉末製剤の臨床的有効性
実施例１の２段階濾過プロセスを用いた、大規模な品質管理された製造バッチからの経鼻グルカゴン粉末製剤の臨床的有効性は、ＮＣＴ０３３３９４５３臨床試験研究（Ｓｕｉｃｏら、ＥＡＳＤ－２００８；要約１５０）において研究された。簡単に述べると、経鼻グルカゴン粉末製剤（ＮＧ）の有効性および安全性を、制御されたインスリン誘発性低血糖の間に、１型糖尿病の成人患者における筋肉内グルカゴン（ＩＭＧ）と比較した。経鼻グルカゴン粉末製剤は、３．０ｍｇの用量で一方の鼻孔に送達するためのデバイスに充填される。
実施例１の２段階濾過プロセスを用いた、大規模な品質管理された製造バッチからの経鼻グルカゴン粉末製剤の臨床的有効性は、ＮＣＴ０３３３９４５３臨床試験研究（Ｓｕｉｃｏら、ＥＡＳＤ－２００８；要約１５０）において研究された。簡単に述べると、経鼻グルカゴン粉末製剤（ＮＧ）の有効性および安全性を、制御されたインスリン誘発性低血糖の間に、１型糖尿病の成人患者における筋肉内グルカゴン（ＩＭＧ）と比較した。経鼻グルカゴン粉末製剤は、３．０ｍｇの用量で一方の鼻孔に送達するためのデバイスに充填される。
【0072】
表４に示す結果は、患者の１００％がＮＧまたはＩＭＧのいずれかで成功裏に治療されたこと、およびＮＧ活性がこの研究でＩＭＧ活性に匹敵することを示している。
【表4】
【0073】
配列
（配列番号１）
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ
（配列番号１）
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ
【配列表】