特許 7246100 新規融合タンパク質の調製およびそのタンパク質合成の向上における使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-16

(45)【発行日】2023-03-27

(54)【発明の名称】新規融合タンパク質の調製およびそのタンパク質合成の向上における使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230317BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230317BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230317BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230317BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230317BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C07K19/00

C12N1/19

C12P21/02 C

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2020506225

(86)(22)【出願日】2017-12-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-10-01

(86)【国際出願番号】 CN2017115972

(87)【国際公開番号】W WO2019024379

(87)【国際公開日】2019-02-07

【審査請求日】2020-03-27

(31)【優先権主張番号】201710642517.4

(32)【優先日】2017-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】520037016

【氏名又は名称】康碼（上海）生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＫＡＮＧＭＡ－ＨＥＡＬＴＨＣＯＤＥ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】ＢＵＩＬＤＩＮＧ １２， １１８ ＦＵＲＯＮＧＨＵＡ ＲＯＡＤ， ＰＵＤＯＮＧ ＮＥＷ ＡＲＥＡ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２０１３２１，ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】郭 敏

(72)【発明者】

【氏名】劉 帥 龍

(72)【発明者】

【氏名】于 雪

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５４４２９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５２１１３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００１－５１４４９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／１２５０３６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】中国特許出願公開第１０３０６０３３４（ＣＮ，Ａ）

【文献】Molecular and Cellular Biology，1998年，Vol.18, No.1，p.51-57

【文献】The EMBO Journal，1999年，Vol.18, No.17，p.4865-4874

【文献】生化学，2007年，VOl.79, No.3，p.229-238

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉａの構造を有する、ことを特徴とする融合タンパク質。
Ｓ－Ａ－Ｂ－Ｃ （Ｉａ）
（式中、
Ａは酵母のＰａｂ１タンパク質であり、
Ｂは無いか、またはリンカーペプチドであり、
Ｃは酵母のｅＩＦ４Ｇタンパク質であり、
Ｓは無いか、または任意のシグナルペプチドであり、
各「－」はペプチド結合である。）

【請求項2】

請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とするベクター。

【請求項4】

請求項３に記載のベクターを含むか、またはゲノムに請求項２に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、ことを特徴とする宿主細胞。

【請求項5】

（ｉ）（ａ）酵母細胞抽出物、（ｂ）必要に応じるポリエチレングリコール、（ｃ）選択可能な外因性ショ糖、および（ｄ）水または水性溶媒である選択可能な溶媒を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系と、
（ｉｉ）請求項１に記載の融合タンパク質と、
を含む、ことを特徴とする外来性タンパク質を発現するためのインビトロタンパク質合成系。

【請求項6】

（ｉｉｉ）付加的に添加されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を更に含む、ことを特徴とする請求項５に記載のインビトロタンパク質合成系。

【請求項7】

前記ｅＩＦ４Ｇタンパク質は、構成的または誘導性プロモーターにより誘導発現される、ことを特徴とする請求項６に記載のインビトロタンパク質合成系。

【請求項8】

（ｉ）発現に適した条件で、請求項４に記載の宿主細胞を培養し、請求項１に記載の融合タンパク質を発現することと、
（ｉｉ）前記融合タンパク質を分離することと、
を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質の生産方法。

【請求項9】

インビトロタンパク質合成系のインビトロタンパク質の合成能力を向上させる製剤を調製するために用いられる、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項10】

（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系を提供することと、
（ｉｉ）タンパク質の発現に適した条件で、外来性タンパク質のテンプレートの存在下で、前記酵母によるインビトロタンパク質合成系をインキュベートし、前記外来性タンパク質を発現することと、
を含む、ことを特徴とする発現待ちの外来性タンパク質の発現方法。

【請求項11】

前記融合タンパク質は付加的に添加されたものである、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ステップ（ｉｉ）は、外来性タンパク質活性の発現活性Ｑ１を検出し、且つ、ステップ（ｉｉ）と同じ条件で野生型酵母株をインキュベートし、前記外来性タンパク質の活性Ｑ２を検出し、Ｑ１がＱ２よりも著しく高ければ、外来性タンパク質の発現効率が著しく向上したことを示すというステップ（ｉｉｉ）を更に含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

外来性タンパク質を発現するインビトロタンパク質合成系を調製するために用いられ、前記インビトロタンパク質合成系は、外来性タンパク質の発現効率を向上させるために用いられる、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、具体的には、新規融合タンパク質の調製およびそのタンパク質合成の向上における使用に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質は細胞における重要な分子であり、ほとんど細胞の全ての機能の実行に関与する。タンパク質の配列および構造の異なりにより、その機能の異なりが決まられる。細胞内において、タンパク質は酵素類として各種の生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生物体の各種の活動を協調することができ、生物形態をサポートし、エネルギーを蓄積し、分子を輸送し、生物体を動かせることができる。生物医学分野において、タンパク質抗体は標的薬剤として、癌等の疾患を治療する重要な手段である。

【0003】

細胞において、タンパク質翻訳の調節は、栄養欠乏等の外界圧力の対応、細胞発育および分化等の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。タンパク質翻訳は、翻訳開始、翻訳伸長、翻訳終止、およびリボソームリサイクルという４つのプロセスを含み、ここで、翻訳開始は最も多く制御されるプロセスである。翻訳開始の段階では、リボソーム小サブユニット（４０Ｓ）が（ｔＲＮＡ）_ｉ ^Ｍｅｔと結合し、翻訳開始因子の作用でｍＲＮＡの５’末端を識別する。小サブユニットが下流へ移動し、開始コドン（ＡＵＧ）の位置においてリボソーム大サブユニット（６０Ｓ）と結合し、完全なリボソームを形成し、翻訳伸長の段階に移行する。

【0004】

急速に分裂する酵母細胞において、タンパク質の合成速度は約１３０００個／秒である。体内で、タンパク質の合成速度はリボソーム数により制限され、細胞の平均リボソーム数は約２０００００個であり、ｍＲＮＡ分子の数は約１５０００～６００００個である。

【0005】

現在、よく実験された商業化インビトロタンパク質発現システムは、大腸菌システム（Ｅ．ｃｏｌｉ ｅｘｔｒａｃｔ、ＥＣＥ）、ウサギ網状赤血球（Ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、ＲＲＬ）、小麦胚芽（Ｗｈｅａｔｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ、ＷＧＥ）、昆虫（Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ、ＩＣＥ）およびヒト由来システムを含む。

【0006】

従来の商業化タンパク質インビトロ合成系において、原核システムの収量は～０．５ｍｇ／ｍＬに達成することができ、費用は約～１０ＲＭＢ／μｇである。真核システムにおけるＣＨＯシステムの収量は～０．７ｍｇ／ｍＬに達成することができ、費用は約～２０ＲＭＢ／μｇである。そのため、自然界中の細胞内の製造タンパク質合成系でも細胞外の製造タンパク質合成系でも、いずれも効率が低く、速度が遅いという特徴を有し、タンパク質合成の適用を大きく制限する。

【0007】

そのため、本分野では、インビトロタンパク質の合成効率を効果的に強化できるインビトロタンパク質合成系の開発が差し迫って必要となる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、インビトロタンパク質の合成効率を効果的に強化できるインビトロタンパク質合成系を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の第１態様では、式Ｉａまたは式Ｉｂの構造を有する融合タンパク質を提供する。

【数1】

（式中、
ＡはＰａｂＩエレメントであり、
Ｂは無いか、またはリンカーペプチドであり、
ＣはｅＩＦ４Ｇエレメントであり、
Ｓは任意のシグナルペプチドであり、
各「－」はペプチド結合である。）

【0010】

別の好ましい例において、前記式ＩａまたはＩｂは、Ｎ端からＣ端までの構造である。Ｎ端はＮＨ_２端であり、Ｃ端はＣＯＯＨ端である。

【0011】

別の好ましい例において、前記エレメントＡは、野生型および変異型のＰａｂＩ配列を含む。

【0012】

別の好ましい例において、前記ＰａｂＩは、酵母に由来するＰａｂＩである。

【0013】

別の好ましい例において、エレメントＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１で表される配列またはその活性断片を有し、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性（好ましくは、９０％以上の相同性、より好ましくは、９５％以上の相同性、最も好ましくは、９７％以上の相同性、例えば、９８％以上、９９％以上）を有し、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１配列と同じ活性を有するポリペプチドである。

【0014】

別の好ましい例において、前記エレメントＣは、野生型および変異型のｅＩＦ４Ｇ配列を含む。

【0015】

別の好ましい例において、前記ｅＩＦ４Ｇは、酵母に由来するｅＩＦ４Ｇである。

【0016】

別の好ましい例において、エレメントＣは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２で表される配列またはその活性断片を有し、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性（好ましくは、９０％以上の相同性、より好ましくは、９５％以上の相同性、最も好ましくは、９７％以上の相同性、例えば、９８％以上、９９％以上）を有し、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２配列と同じ活性を有するポリペプチドである。

【0017】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質は組換えタンパク質であり、酵母により発現された組換えタンパク質であることが好ましい。

【0018】

別の好ましい例において、前記酵母は、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0019】

別の好ましい例において、前記酵母は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセスマルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセスドブジャンスキー（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｂｚｈａｎｓｋｉｉ）、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0020】

別の好ましい例において、前記エレメントＡは、酵母のＰａｂＩタンパク質に由来する。

【0021】

別の好ましい例において、前記エレメントＣは、酵母のｅＩＦ４Ｇタンパク質に由来する。

【0022】

別の好ましい例において、前記ペプチドリンカーの長さは０～５０アミノ酸であり、１０～４０個のアミノ酸であることが好ましく、１５～２５個のアミノ酸であることがより好ましい。

【0023】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、
（Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（Ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性（好ましくは、９０％以上の相同性、より好ましくは、９５％以上の相同性、最も好ましくは、９７％以上の相同性、例えば、９８％以上、９９％以上）を有し、且つ、外来性タンパク質の発現効率を向上させる機能または活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のいずれかで表されるアミノ酸配列を、１～１５（好ましくは、２～１０、より好ましくは、３～８）個のアミノ酸残基により置換、欠失、または付加することで形成され、外来性タンパク質の発現効率を向上させる機能または活性を有する誘導されたポリペプチド、
の群から選ばれる。

【0024】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すとおりである。

【0025】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質は、
（ａ）外来性タンパク質の発現効率を向上させるという特性、
（ｂ）インビトロ翻訳効率を向上させるという特性、
の群から選ばれる１つまたは複数を有する。

【0026】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質は、蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ突然変異、α－アミラーゼ、エンテロシンＡ、ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンα Ａ、インターロイキン－１β、リゾチーム、血清アルブミン、一本鎖抗体セグメント（ｓｃＦＶ）、トランスサイレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0027】

本発明の第２態様では、本発明の第１態様に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0028】

別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列の群から選ばれる。

【0029】

別の好ましい例において、前記ＤＮＡ配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列の群から選ばれる。

【0030】

別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり、且つ、前記ポリヌクレオチドは式ＩＩで表される構造を有する。

【数2】

（式中、
Ａ１は、上記Ａエレメントをコードするヌクレオチド配列であり、
Ｃ１は、上記Ｃエレメントをコードするヌクレオチド配列であり、
「－」は、エレメントＡ１とエレメントＣ１との間の結合手である。）

【0031】

別の好ましい例において、前記エレメントＡ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４で表される配列を有する。

【0032】

別の好ましい例において、前記エレメントＣ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５で表される配列を有する。

【0033】

本発明の第３態様では、本発明の第２態様に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0034】

本発明の第４態様では、本発明の第３態様に記載のベクターを有するか、またはゲノムに本発明の第２態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている宿主細胞を提供する。

【0035】

別の好ましい例において、前記宿主細胞は、本発明の第３態様に記載の発現ベクターまたは本発明の第２態様に記載のポリヌクレオチドを導入して相同組換えにより形成され、それにより、ゲノムまたは染色体に本発明の第１態様に記載の融合タンパク質のコード配列が組み込まれている。

【0036】

別の好ましい例において、前記宿主細胞は、クルイベロマイセス、サッカロマイセスセレビシエ、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0037】

別の好ましい例において、前記宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス、クルイベロマイセスマルシアヌス、クルイベロマイセスドブジャンスキー、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0038】

別の好ましい例において、前記宿主細胞はクルイベロマイセスラクティスである。

【0039】

本発明の第５態様では、
（ｉ）（ａ）酵母細胞抽出物、（ｂ）必要に応じるポリエチレングリコール、（ｃ）必要に応じる外因性ショ糖、および（ｄ）水または水性溶媒である必要に応じる溶媒を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系と、
（ｉｉ）本発明の第１態様に記載の融合タンパク質と、
を含む外来性タンパク質を発現するためのインビトロタンパク質合成系を提供する。

【0040】

別の好ましい例において、前記反応系は、（ｉｉｉ）付加的に添加されたｅＩＦ４Ｇタンパク質を更に含む。

【0041】

別の好ましい例において、前記ｅＩＦ４Ｇタンパク質は、構成的または誘導性プロモーターにより誘導発現される。

【0042】

別の好ましい例において、前記構成的または誘導性プロモーターは酵母に由来する。

【0043】

別の好ましい例において、前記酵母は、クルイベロマイセス、サッカロマイセスセレビシエ、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0044】

別の好ましい例において、前記構成的または誘導性プロモーターは、ｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１、ｐＫｌＰＧＫ１、ｐＳｃＡＤＨ１、ｐＳｃＴＰＩ１、ｐＳｃＴＤＨ３、ｐＫｌＡＤＨ１、ｐＫｌＴＰＩ１、ｐＫｌＴＤＨ３、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0045】

本発明の第６態様では、
（ｉ）発現に適した条件で、本発明の第４態様に記載の宿主細胞を培養し、本発明の第１態様に記載の融合タンパク質を発現することと、
（ｉｉ）前記融合タンパク質を分離することと、
を含む本発明の第１態様に記載の融合タンパク質の生産方法を提供する。

【0046】

本発明の第７態様では、外来性タンパク質を発現するインビトロタンパク質合成系を調製するために用いられ、前記インビトロタンパク質合成系は、外来性タンパク質の発現効率を向上させるために用いられる本発明の第１態様に記載の融合タンパク質の使用を提供する。

【0047】

別の好ましい例において、前記反応系は、付加的なｅＩＦ４Ｇタンパク質を更に含む。

【0048】

本発明の第８態様では、本発明の第１態様に記載の融合タンパク質の、インビトロタンパク質合成系のインビトロタンパク質の合成能力を向上させる製剤の調製における使用を提供する。

【0049】

本発明の第９態様では、
（ｉ）本発明の第１態様に記載の融合タンパク質を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系を提供することと、
（ｉｉ）タンパク質の発現に適した条件で、前記外来性タンパク質のテンプレートの存在下で、前記酵母によるインビトロタンパク質合成系をインキュベートし、前記外来性タンパク質を発現することと、
を含む発現待ちの外来性タンパク質の発現方法を提供する。

【0050】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質は付加的に添加されたものである。

【0051】

別の好ましい例において、前記融合タンパク質および前記酵母によるインビトロタンパク質合成系における他のタンパク質は、同じ酵母の抽出物に由来する。

【0052】

別の好ましい例において、前記方法は、非診断的および非治療的なものである。

【0053】

別の好ましい例において、前記ステップ（ｉｉ）は、外来性タンパク質活性の発現活性Ｑ１を検出し、且つ、ステップ（ｉｉ）と同じ条件で野生型酵母株をインキュベートし、前記外来性タンパク質の活性Ｑ２を検出し、Ｑ１がＱ２よりも著しく高ければ、外来性タンパク質の発現効率が著しく向上したことを示すというステップ（ｉｉｉ）を更に含む。

【0054】

別の好ましい例において、前記「～よりも著しく高い」とは、Ｑ１／Ｑ２≧２であることを意味し、好ましくは≧３、より好ましくは≧４であることを意味する。

【0055】

別の好ましい例において、前記酵母によるインビトロタンパク質合成系は、遺伝子組換えされたクルイベロマイセスインビトロタンパク質合成系（好ましくは、クルイベロマイセスラクティスインビトロタンパク質合成系）である。

【0056】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質のコード配列は、原核生物、真核生物に由来する。

【0057】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質のコード配列は、動物、植物、病原体に由来する。

【0058】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質のコード配列は哺乳動物に由来し、好ましくは、ヒト、マウス、ラットを含む霊長類動物、齧歯類動物に由来する。

【0059】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質のコード配列は、蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域をコードする外因性ＤＮＡ、ルシフェラーゼ変異体のＤＮＡ、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0060】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質は、蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ突然変異、α－アミラーゼ、エンテロシンＡ、ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンα Ａ、インターロイキン－１β、リゾチーム、血清アルブミン、一本鎖抗体セグメント（ｓｃＦＶ）、トランスサイレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0061】

本発明の範囲内において、本発明の上記各技術的特徴と後（例えば、実施例）で具体的に説明する各技術的特徴との間は、互いに組み合わせて新しいまたは好ましい技術案を構成できることを理解すべきである。紙面の都合のために、ここで説明を省略する。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌｅＩＦ４Ｇのプラスミドマップを示す。

【図2】ｐＫＭ－ｐＳｃＴＥＦ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図3】ｐＫＭ－ｐＳｃＰＧＫ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図4】ｐＫＭ－ｐＫｌＴＥＦ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図5】ｐＫＭ－ｐＫｌＰＧＫ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図6】ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＴＤＨ３－１のプラスミドマップを示す。

【図7】ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＴＤＨ３－２のプラスミドマップを示す。

【図8】ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－１－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図9】ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－２－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図10】ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＰａｂ１のプラスミドマップを示す。

【図11】ｐＫＭ－ＫｌＰａｂ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤのプラスミドマップを示す。

【図12】操作された株のインビトロ翻訳活性を測定する模式図を示す。蛍光タンパク質の強度を用いてシステムのタンパク質の発現能力を指示する。

【発明を実施するための形態】

【0063】

鋭意検討を行ったところ、大量のスクリーニングおよび模索により、式Ｉａまたは式Ｉｂの構造を有する融合タンパク質が初めて意外と見出され、本発明の融合タンパク質は、インビトロ翻訳効率を大幅に向上させることができる。また、本発明は、ｅＩＦ４Ｇの前に構成的または誘導性プロモーター（例えば、ｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１、ｐＫｌＰＧＫ１、ｐＳｃＡＤＨ１、ｐＳｃＴＰＩ１、ｐＳｃＴＤＨ３、ｐＫｌＡＤＨ１、ｐＫｌＴＰＩ１、ｐＫｌＴＤＨ３等）を挿入することにより、インビトロタンパク質の合成能力を著しく強化できることを更に見出した。

【0064】

且つ、本発明者は、本発明の融合タンパク質がインビトロ翻訳効率を向上させる際に、本発明の融合タンパク質のエレメントｅＩＦ４Ｇの発現量が増加しないことを更に見出した。

【0065】

具体的には、本発明の融合タンパク質を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系において、合成されたルシフェラーゼ活性の相対光単位値は１．５０×１０^９と高く、ｅＩＦ４Ｇの前に構成的または誘導性プロモーターを挿入することにより合成されたルシフェラーゼ活性の相対光単位値は１．５７×１０^９と高く、野生型酵母株（例えば、Ｙ１１４０）により合成されたルシフェラーゼの相対光単位値（４．１１×１０^８）よりも遥かに高い。これに基づき、本発明者は本発明を完成した。

【0066】

ｅＩＦ４Ｆエレメント

【0067】

真核生物では、複数種の翻訳開始因子はタンパク質翻訳開始プロセス（表１）に関与する。ここで、ｅＩＦ４Ｆは「キャップ構造」の識別および下流翻訳開始因子とリボソームの応募を担当する。ｅＩＦ４Ｆは、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ４Ａという３つのタンパク質サブユニットからなる。ｅＩＦ４Ｅは「キャップ構造」と特異的に結合し、ｅＩＦ４ＦをｍＲＮＡの５’端の非翻訳領域にアンカーする。ｅＩＦ４Ａは１種のＲＮＡヘリカーゼであり、ｅＩＦ４Ｇは、ほぼ翻訳開始プロセス全体にわたる足場タンパク質であり、複数種の翻訳開始因子と相互作用でき、下流因子の応募プロセスにおいて重要な作用を有する。

【0068】

【表1】

【0069】

本発明において、ｅＩＦ４Ｇの前に酵母由来（例えば、サッカロマイセスセレビシエ、クルイベロマイセス等）の構成的または誘導性プロモーター（例えば、ｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１、ｐＫｌＰＧＫ１、ｐＳｃＡＤＨ１、ｐＳｃＴＰＩ１、ｐＳｃＴＤＨ３、ｐＫｌＡＤＨ１、ｐＫｌＴＰＩ１、ｐＫｌＴＤＨ３等）を挿入することにより、インビトロタンパク質の合成能力を強化する。

【0070】

１つの好ましい実施形態において、前記ｅＩＦ４Ｇのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５示すとおりであり、前記ｅＩＦ４Ｇのタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示すとおりである。

【0071】

【数3】

【0072】

【数4】

【0073】

Ｐａｂ１エレメント（Ｐａｂ１タンパク質）
本発明において、「Ｐａｂ１」と「ＰａｂＩ」は、同じ意味を有し、交換使用可能なものである。

【0074】

Ｐａｂ１は１つの７１ｋＤａのＲＮＡ結合タンパク質であり、４つのＲＲＭ（ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ １～４）ドメインおよび１つのＭＬＬＥドメインからなる。各ＲＲＭドメインにいずれも２つの保存的ＲＮＰ構造（ＲＮＰ１／２）が含まれ、ＲＮＡとの結合を担当する。

【0075】

１つの好ましい実施形態において、前記Ｐａｂ１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示すとおりであり、前記Ｐａｂ１のタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示すとおりである。

【0076】

【数5】

【0077】

【数6】

【0078】

融合タンパク質

【0079】

本明細書で使用されるように、「本発明の融合タンパク質」、「本発明のＰａｂＩ－ｅＩＦ４Ｇ融合タンパク質」および「ＰａｂＩ－ｅＩＦ４Ｇ融合タンパク質」という用語は、相互に交換して使用することができ、ＰａｂＩエレメントとｅＩＦ４Ｇエレメントとが融合して形成した融合タンパク質を指す。本発明の融合タンパク質において、ＰａｂＩエレメントとｅＩＦ４Ｇエレメントとの間に、リンカーペプチドまたはフレキシブルジョイントが含まれても含まれなくてもよい。また、前記融合タンパク質には開始のＭｅｔが含まれても含まれなくてもよく、シグナルペプチドが含まれても含まれなくてもよく、タグ配列（例えば、６Ｈｉｓ等）が含まれても含まれなくてもよい。

【0080】

１つの好ましい実施形態において、本発明に係る融合タンパク質は、上記式Ｉａまたは式Ｉｂ構造を有する。好ましくは、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示すとおりである。

【0081】

【数7】

【0082】

本発明において、本発明の融合タンパク質は、無細胞のインビトロタンパク質合成系（特に、酵母によるインビトロタンパク質合成系）のインビトロタンパク質の合成能力を著しく向上させることができる。

【0083】

インビトロタンパク質合成系

【0084】

本発明の融合タンパク質は、インビトロタンパク質合成系のタンパク質の合成能力を向上させるために使用できる。

【0085】

典型的なインビトロタンパク質合成系は酵母によるインビトロタンパク質合成系である。

【0086】

酵母（ｙｅａｓｔ）は、培養が簡単であり、タンパク質の折り畳みが効率的であり、翻訳後に修飾するという利点を兼ね備える。ここで、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、複雑な真核タンパク質および膜タンパク質を発現するモデル生物であり、酵母はインビトロ翻訳システムを調製する原料としてもよい。

【0087】

クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）は子嚢胞子酵母であり、その中のクルイベロマイセスマルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびクルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）は、工業的に広く使用される酵母である。例えば、クルイベロマイセスラクティスは、乳酸をその唯一の炭素源およびエネルギー源とすることができる酵母である。他の酵母と比べ、クルイベロマイセスラクティスは、超強い分泌能力、良好な大規模発酵特性と食品安全のレベル、およびタンパク質を翻訳した後に修飾する能力を同時に有する等のような多くの利点を有し、宿主系として製剤タンパク質を発現することにも巨大な潜在力を示す。

【0088】

本発明において、酵母によるインビトロタンパク質合成系は特に限定されず、１つの好ましい酵母によるインビトロタンパク質合成系は、クルイベロマイセス発現システム（より好ましくは、クルイベロマイセスラクティス発現システム）である。

【0089】

本発明において、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセスラクティス）は特に限定されず、タンパク質の合成効率を向上させることができる任意のクルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセスラクティス）株を含む。

【0090】

１つの好ましい実施形態において、本発明の酵母によるインビトロタンパク質合成系は、遺伝子組換えされた酸クルイベロマイセス発現システムである。

【0091】

１つの好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）必要に応じる外因性ショ糖と、
（ｄ）水または水性溶媒である必要に応じる溶媒と、
を含むインビトロの無細胞のタンパク質合成系を提供する。

【0092】

別の好ましい例において、前記ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３３５０、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0093】

別の好ましい例において、前記ポリエチレングリコールは、分子量（Ｄａ）が２００～１００００であるポリエチレングリコール、好ましくは、分子量が３０００～１００００であるポリエチレングリコールを含む。

【0094】

別の好ましい例において、前記タンパク質合成系で、前記タンパク質合成系の総体積で計算し、成分（ａ）の濃度（ｖ／ｖ）は２０％～７０％であり、好ましくは、３０～６０％であり、より好ましくは、４０％～５０％である。

【0095】

別の好ましい例において、前記タンパク質合成系で、成分（ｂ）の濃度（ｗ／ｖ、例えば、ｇ／ｍｌ）は０．１～８％であり、好ましくは、０．５～４％であり、より好ましくは、１～２％である。

【0096】

別の好ましい例において、前記タンパク質合成系で、前記タンパク質合成系の全重量で計算し、成分（ｃ）の濃度は０．０３～４０ｗｔ％、好ましくは、０．０８～１０ｗｔ％であり、より好ましくは、０．１～５ｗｔ％である。

【0097】

特に好ましい実施形態において、本発明に係るインビトロタンパク質合成系は、酵母細胞抽出物、４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデニンヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ）、グアニンヌクレオシド三リン酸（ＧＴＰ）、シトシンヌクレオシド三リン酸（ＣＴＰ）、チミンヌクレオシド三リン酸（ＴＴＰ）、アミノ酸混合物、ホスホクレアチン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ホスホクレアチンキナーゼ、ＲＮＡ酵素阻害剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを含む。

【0098】

本発明において、ＲＮＡポリメラーゼは特に限定されず、１種または複数種のＲＮＡポリメラーゼから選ばれてもよく、典型的なＲＮＡポリメラーゼはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。

【0099】

本発明において、前記酵母細胞抽出物のインビトロタンパク質合成系における割合は特に限定されず、通常、前記酵母細胞抽出物のインビトロタンパク質合成系に占める体系体積は２０～７０％であり、好ましくは、３０～６０％であり、より好ましくは、４０～５０％である。

【0100】

本発明において、前記酵母細胞抽出物は、完全な細胞を含まず、典型的な酵母細胞抽出物は、タンパク質翻訳用のリボソーム、トランスファーＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、タンパク質の合成に必要な開始因子と伸長因子、および終止放出因子を含む。また、酵母抽出物には、いくつかの酵母細胞由来の細胞質における他のタンパク質、特に可溶性タンパク質が含まれる。

【0101】

本発明において、前記酵母細胞抽出物に含まれるタンパク質の含有量は２０～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、５０～１００ｍｇ／ｍＬである。前記タンパク質の含有量を測定する方法はクーマシーブリリアントブルー測定方法である。

【0102】

本発明において、前記酵母細胞抽出物の調製方法は限定されず、１つの好ましい調製方法は、
（ｉ）酵母細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）酵母細胞を洗浄処理し、洗浄された酵母細胞を取得するステップと、
（ｉｉｉ）洗浄された酵母細胞を細胞破砕処理し、酵母粗抽出物を取得するステップと、
（ｉｖ）前記酵母粗抽出物を固液分離し、液体部分、すなわち、酵母細胞抽出物を取得するステップと、
を含む。

【0103】

本発明において、前記固液分離の形態は特に限定されず、１つの好ましい形態は遠心である。

【0104】

１つの好ましい実施形態において、前記遠心は液体状態下で行われる。

【0105】

本発明において、前記遠心条件は特に限定されず、１つの好ましい遠心条件は５０００～１０００００ｇであり、より好ましくは、８０００～３００００ｇである。

【0106】

本発明において、前記遠心時間は特に限定されず、１つの好ましい遠心時間は０．５ｍｉｎ～２ｈであり、より好ましくは、２０～５０ｍｉｎである。

【0107】

本発明において、前記遠心の温度は特に限定されず、好ましくは、前記遠心は１～１０℃で行われ、より好ましくは、２～６℃で行われる。

【0108】

本発明において、前記洗浄処理の形態は特に限定されず、１つの好ましい洗浄処理の形態は、洗浄液を用いてｐＨ７～８（好ましくは、７．４）で処理し、前記洗浄液は特に限定されず、典型的な前記洗浄液は、４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0109】

本発明において、前記細胞破砕処理の形態は特に限定されず、１つの好ましい前記細胞破砕処理は、高圧破砕、凍結融解（例えば、低温液体窒素）破砕を含む。

【0110】

前記インビトロタンパク質合成系におけるヌクレオシド三リン酸混合物は、アデニンヌクレオシド三リン酸、グアニンヌクレオシド三リン酸、シトシンヌクレオシド三リン酸、およびウラシルヌクレオシド三リン酸である。本発明において、各種のモノヌクレオチドの濃度は特に限定されず、通常、それぞれのモノヌクレオチドの濃度は０．５～５ｍＭであり、好ましくは、１．０～２．０ｍＭである。

【0111】

前記インビトロタンパク質合成系におけるアミノ酸混合物は、天然または非天然のアミノ酸を含んでもよく、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸を含んでもよい。代表的なアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジンという２０種の天然アミノ酸を含む（これらに限定されない）。それぞれのアミノ酸の濃度は、通常、０．０１～０．５ｍＭであり、好ましくは、０．０２～０．２ｍＭであり、例えば、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８ｍＭである。

【0112】

好ましい例において、前記インビトロタンパク質合成系には、ポリエチレングリコールまたはその類似体が更に含まれる。ポリエチレングリコールまたはその類似体の濃度は特に限定されず、前記タンパク質合成系の全重量で計算し、通常、ポリエチレングリコールまたはその類似体の濃度（ｗ／ｖ）は０．１～８％であり、好ましくは、０．５～４％であり、より好ましくは、１～２％である。代表的なＰＥＧの例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００、およびＰＥＧ３３５０を含む（これらに限定されない）。本発明の系は、他の様々な分子量のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００等）を更に含んでもよいことを理解すべきである。

【0113】

好ましい例において、前記インビトロタンパク質合成系はショ糖を更に含む。ショ糖の濃度は特に限定されず、前記タンパク質合成系の全重量で計算し、通常、ショ糖の濃度は０．０３～４０ｗｔ％であり、好ましくは、０．０８～１０ｗｔ％であり、より好ましくは、０．１～５ｗｔ％である。

【0114】

１つの特に好ましいインビトロタンパク質合成系には、酵母抽出物に加え、２２ｍＭのｐＨ７．４の４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、３０～１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０～５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．５～４ｍＭのヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８～０．２４ｍＭのアミノ酸混合物、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオスレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬのホスホクレアチンキナーゼ、１％～４％のポリエチレングリコール、０．５％～２％のショ糖、８～２０ｎｇ／μｌのホタルルシフェラーゼのＤＮＡ、０．０２７～０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが更に含まれる。

【0115】

１つの好ましい実施形態において、本発明の酵母によるインビトロタンパク質合成系には、（ａ）本発明に係る融合タンパク質、すなわち、ＰａｂＩ－ｅＩＦ４Ｇ融合タンパク質が更に含まれる。

【0116】

１つの好ましい実施形態において、本発明の酵母によるインビトロタンパク質合成系には、ｅＩＦ４Ｇタンパク質が更に含まれ、ここで、本発明のｅＩＦ４Ｇタンパク質は、酵母（例えば、サッカロマイセスセレビシエ、クルイベロマイセス等）由来の構成的または誘導性プロモーター（例えば、ｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１、ｐＫｌＰＧＫ１、ｐＳｃＡＤＨ１、ｐＳｃＴＰＩ１、ｐＳｃＴＤＨ３、ｐＫｌＡＤＨ１、ｐＫｌＴＰＩ１、ｐＫｌＴＤＨ３等）により誘導発現される。

【0117】

本発明において、本発明の融合タンパク質を含む酵母によるインビトロタンパク質合成系は、インビトロタンパク質の合成能力を著しく強化することができる。また、本発明の融合タンパク質とｅＩＦ４Ｇタンパク質とを合わせて使用する酵母によるインビトロタンパク質合成系は、より高いインビトロタンパク質の合成能力を有する。

【0118】

１つの好ましい酵母によるインビトロタンパク質合成系は、本発明者の先願ＣＮ２０１７１０１２５６１９．９に記載されている。本明細書において、該特許文献は引用により全て本明細書に援用される。該文献における酵母によるインビトロタンパク質合成系は、本発明に係る融合タンパク質を採用しない。

【0119】

典型的には、本発明の酵母によるインビトロタンパク質合成系は、（ａ）酵母細胞抽出物と、（ｂ）必要に応じるポリエチレングリコールと、（ｃ）必要に応じる外因性ショ糖と、（ｄ）水または水性溶媒である必要に応じる溶媒と、（ｉｉ）本発明に係る融合タンパク質とを含む。

【0120】

別の好ましい例において、前記無細胞のタンパク質合成系は、
（ｅ１）ＲＮＡを合成するための基質、
（ｅ２）タンパク質を合成するための基質、
（ｅ３）マグネシウムイオン、
（ｅ４）カリウムイオン、
（ｅ５）緩衝剤、
（ｅ６）ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｅ７）エネルギー再生システム、
の群から選ばれる１種または複数種の成分を含む。

【0121】

別の好ましい例において、前記タンパク質合成系において、成分（ｅ１）の濃度は０．１～５ｍＭであり、好ましくは、０．５～３ｍＭであり、より好ましくは、１～１．５ｍＭである。

【0122】

別の好ましい例において、前記酵母細胞抽出物は、酵母細胞に対する水性抽出物である。

【0123】

別の好ましい例において、前記酵母細胞抽出物は酵母内因性の長鎖核酸分子を含まない。

【0124】

別の好ましい例において、前記合成ＲＮＡの基質は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド三リン酸、またはその組み合わせを含む。

【0125】

別の好ましい例において、前記合成タンパク質の基質は、１～２０種の天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。

【0126】

別の好ましい例において、前記マグネシウムイオンはマグネシウムイオン源に由来し、前記マグネシウムイオン源は、酢酸マグネシウム、グルタミン酸マグネシウム、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0127】

別の好ましい例において、前記カリウムイオンは、カリウムイオン源に由来し、前記カリウムイオン源は、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0128】

別の好ましい例において、前記エネルギー再生システムは、ホスホクレアチン／ホスホクレアチンキナーゼシステム、糖分解経路およびその中間生成物エネルギーシステム、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0129】

別の好ましい例において、前記無細胞のタンパク質合成系は、（ｆ１）人工的に合成されたｔＲＮＡを更に含む。

【0130】

別の好ましい例において、前記緩衝剤は、４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、またはその組み合わせの群から選ばれる。

【0131】

別の好ましい例において、前記無細胞のタンパク質合成系は、（ｇ１）外因性のタンパク質合成指導用のＤＮＡ分子を更に含む。

【0132】

別の好ましい例において、前記ＤＮＡ分子は線形である。

【0133】

別の好ましい例において、前記ＤＮＡ分子は環状である。

【0134】

別の好ましい例において、前記ＤＮＡ分子は、外来性タンパク質をコードする配列を含む。

【0135】

別の好ましい例において、前記外来性ンパク質をコードする配列は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列を含む。

【0136】

別の好ましい例において、前記外来性タンパク質をコードする配列は、プロモーター配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列を更に含む。

【0137】

本発明の主な利点は以下を含む。
（ａ）本発明は、初めて遺伝子組換え技術により、効率的な細胞形質転換ステージを介して、細胞内の遺伝子を組換え、翻訳システムのタンパク質の合成効率を向上させる。
（ｂ）本発明は、インビトロタンパク質の合成能力を著しく強化できる融合タンパク質を初めて見出した。
（ｃ）本発明は、ｅＩＦ４Ｇの前に構成的または誘導性プロモーター（例えば、ｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１、ｐＫｌＰＧＫ１、ｐＳｃＡＤＨ１、ｐＳｃＴＰＩ１、ｐＳｃＴＤＨ３、ｐＫｌＡＤＨ１、ｐＫｌＴＰＩ１、ｐＫｌＴＤＨ３等）を挿入することにより、インビトロタンパク質の合成能力を著しく強化することができることを初めて見出した。
（ｄ）本発明は、初めてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術によりｅＩＦ４Ｇを組換え、インビトロタンパク質の合成能力を著しく強化する。
（ｅ）本発明は、本発明の融合タンパク質がインビトロ翻訳システムの効率を向上させる際に、本発明の融合タンパク質のエレメントｅＩＦ４Ｇの発現量が増加しないことを初めて見出した。

【0138】

実施例１ 遺伝子組換えによりタンパク質合成を向上させる理論モデル

【0139】

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける翻訳開始因子ｅＩＦ４ＧおよびＰａｂ１を最適化し、無細胞のインビトロ翻訳システムの効率を向上させた。

【0140】

実施例２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により翻訳開始因子を組換え、インビトロ翻訳システムの効率を向上させる

【0141】

２．１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術により、翻訳開始因子ＫｌｅＩＦ４Ｇの前に強力なプロモーターを加える

【0142】

２．１．１ ＫｌｅＩＦ４Ｇ配列の検索およびＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の確定

【0143】

ｅＩＦ４Ｇは翻訳開始プロセスにおける重要な因子である。現在の記事では、遺伝子編集技術により内因性ｅＩＦ４Ｇ発現を最適化し、インビトロ翻訳活性を向上させるケースが見られなかった。本発明は、実施例１における理論モデルに従い、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、翻訳開始因子ＫｌｅＩＦ４Ｇの発現を組換え、無細胞インビトロ翻訳システムの効率を向上させた。

【0144】

ｉ．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母におけるｅＩＦ４Ｇ遺伝子配列に基づいた。ＮＣＢＩデータベースにおいて、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子でＢＬＡＳＴアライメント分析を行い、クルイベロマイセスラクティスにおけるｅＩＦ４Ｇ相同的遺伝子配列を確定し、ＫｌｅＩＦ４Ｇ（染色体Ａの４２１８６３・・・・・・４２４９２８に位置する）と命名した。ここで、この遺伝子の尾部に１セグメントの標識ＤＮＡが挿入されることを例とし、他のターゲット遺伝子または挿入位置、配列は、いずれも類似する方法で操作することができる。
ｉｉ．ＫｌｅＩＦ４Ｇ遺伝子開始コドンで、近接するＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を探索し、ｇＲＮＡ配列を確定した。ＧＣ含有量が適当であり、本発明の標準はＧＣ含有量が４０％～６０％であること、およびｐｏｌｙ Ｔ構造の存在を回避することをｇＲＮＡ選択の原則とした。最終的には、本発明で確定した最適化されたＫｌｅＩＦ４ＧのｇＲＮＡ配列はＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６）であり、染色体Ａの４２４９２７・・・・・・４２４９３６部位に位置する。

【0145】

２．１．２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により媒介されるＫｌｅＩＦ４Ｇの前に強力なプロモーターを挿入するプラスミド構築

【0146】

ＫｌｅＩＦ４Ｇの過剰発現を実現するために、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術によりＫｌｅＩＦ４Ｇ遺伝子の前にｐＳｃＴＥＦ１、ｐＳｃＰＧＫ１、ｐＫｌＴＥＦ１およびｐＫｌＰＧＫ１プロモーターをそれぞれ挿入した。プラスミド構築および形質転換方法は以下のとおりである。

【0147】

ｉ．ＣＲＩＳＰＲのプラスミド構築

【0148】

プライマーＰＦ１：ＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７）、ＰＲ１：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８）を用い、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅産物を混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌｅＩＦ４Ｇ（図１）と命名した。

【0149】

ｉｉ．供与体ＤＮＡのプラスミド構築および増幅

【0150】

線形供与体ＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明は、まず、供与体ＤＮＡをｐＭＤ１８プラスミドに挿入し、その後、ＰＣＲ増幅により線形供与体ＤＮＡ配列を得た。

【0151】

クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ２：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡ ＡＴＴＴＴＡＣＣＡＴＴＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９）およびＰＲ２：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣｇＡＴＣＴＴＧＴＴＡＧＴＡＡＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＣＧＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０）でＰＣＲ増幅を行い、ｐＭＤ１８プラスミドをテンプレートとし、プライマーｐＭＤ１８－Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１）およびｐＭＤ１８－Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２）でＰＣＲ増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤと命名した。

【0152】

ｐＫＭ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤプラスミドをテンプレートとし、プライマーＰＦ３：ＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３）およびＰＲ３：ＡＴＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４）でＰＣＲ増幅を行い、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ４：ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１５）およびＰＲ４：ＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＣＴＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６）でＰＣＲ増幅（ｐＳｃＴＥＦ１プロモーター増幅）を行い、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ５：ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７）およびＰＲ５：ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８）でＰＣＲ増幅（ｐＳｃＰＧＫ１プロモーター増幅）を行い、クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ６：ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１９）およびＰＲ６：ＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）でＰＣＲ増幅（ｐＫｌＴＥＦ１プロモーター増幅）を行い、クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ７：ＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２１）およびＰＲ７：ＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２２）でＰＣＲ増幅（ｐＫｌＰＧＫ１プロモーター増幅）を行った。ＰＦ３／ＰＲ３増幅産物をそれぞれＰＦ４／ＰＲ４、ＰＦ５／ＰＲ５、ＰＦ６／ＰＲ６およびＰＦ７／ＰＲ７増幅産物と混合し、それぞれｐＫＭ－ｐＳｃＴＥＦ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ、ｐＫＭ－ｐＳｃＰＧＫ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ、ｐＫＭ－ｐＫｌＴＥＦ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤおよびｐＫＭ－ｐＫｌＰＧＫ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ（例えば、図２、３、４、５）を構築した。具体的なステップは以下のとおりである。２種のＰＣＲ生成物をそれぞれ８．５μＬ混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存した。

【0153】

２．１．３ クルイベロマイセスラクティスの形質転換および陽性同定

【0154】

ｉ．クルイベロマイセスラクティス菌液をＹＰＤ固体培地上にストリークしてモノクローナルを選別し、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地で一晩振とう培養し、２ｍＬの菌液を５０ｍＬの液体２×ＹＰＤ培地に入れて２～８ｈ振とう培養し続けた。２０℃の条件において３０００ｇで５ｍｉｎ遠心して酵母細胞を採取し、５００μＬの滅菌水を加えて再懸濁し、同様の条件で遠心して細胞を採取した。コンピテント細胞溶液（５％のｖ／ｖグリセロール、１０％のｖ／ｖ ＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞を５００μＬの該溶液に溶解した。５０μＬを１．５ｍＬの遠心管に分注し、－８０℃で保存した。

【0155】

コンピテント細胞を３７℃で置いて１５～３０ｓ融解させ、１３０００ｇで２ｍｉｎ遠心して上清を除去した。形質転換緩衝液を以下のように調製した。ＰＥＧの３３５０（５０％（ｗ／ｖ））２６０μＬ、ＬｉＡｃ（１．０Ｍ）３６μＬ、ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５．０ｍｇの／ｍＬ）２０μＬ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド１５μＬ、供与体ＤＮＡ １０μＬに、最終体積が３６０μＬとなるまで滅菌水を加えた。熱ショック後、１３０００ｇで３０ｓ遠心して上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液体培地を加えて２～３ｈ培養し、２００μＬを吸い取って固体ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）培地に塗布し、単一コロニーが出現するまで２～３日間培養した。

【0156】

ｉｉ．クルイベロマイセスラクティスが形質転換した後のプレート上で１０～２０個のモノクローナルを選別し、１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）液体培地に置いて一晩振とう培養し、菌液をテンプレートとし、ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｈｅｃｋをプライマー対とし、対応するサンプルをＰＣＲ検出した。ＰＣＲ結果が陽性でシーケンシングを経た菌株が陽性菌株であると確定した。

【0157】

２．２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によりＫｌｅＩＦ４Ｇと高発現遺伝子とを融合する

【0158】

２．２．１ ＫｌＴＤＨ３配列検出およびＣＲＩＳＰＲｇ ＲＮＡ配列確定

【0159】

サッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ＴＤＨ３はテトラマーの形で存在し、糖分解経路における触媒反応に関与する。そのプロモーターｐＴＤＨ３は遺伝子工学に広く使用される持続型強力なプロモーターである。クルイベロマイセスラクティスにおけるＫｌｅＩＦ４Ｇの十分な発現を実現し、翻訳開始機能を実行する際に局所的な高濃度を形成するために、本発明は、ＫｌｅＩＦ４Ｇ遺伝子をクルイベロマイセスラクティスＴＤＨ３遺伝子のＯＲＦ ３’端に連結した。

【0160】

ｉ．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母におけるＴＤＨ３遺伝子配列に基づいた。ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＴＤＨ３遺伝子でＢＬＡＳＴアライメント分析を行い、クルイベロマイセスラクティスにおけるＴＤＨ３相同的遺伝子配列を確定した。アライメントにより、クルイベロマイセスラクティスゲノムに２つのＴＤＨ３相同的遺伝子が存在し、本発明においてそれぞれＫｌＴＤＨ３－１（染色体Ａの１０２４２９７・・・・・・１０２５２９２に位置する）およびＫｌＴＤＨ３－２（染色体Ｆの１９６０４１７・・・・・・１９６１４０６に位置する）と命名されたことが見出された。ここで、この遺伝子の尾部に１セグメントの標識ＤＮＡが挿入されることを例とし、他のターゲット遺伝子または挿入位置、配列は、いずれも類似する方法で操作することができる。

【0161】

ｉｉ．ＫｌＴＤＨ３遺伝子終止コドン付近で、ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を探索し、ＫｌＴＤＨ３ｇのＲＮＡ配列（ＫｌＴＤＨ３－１：ＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２３）は、染色体Ａの１０２４２７２・・・・・・１０２４２９１部位に位置し、ＫｌＴＤＨ３－２：ＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２４）は、染色体Ｆの１９６０３７８・・・・・・１９６０３９７部位に位置する）を確定した。

【0162】

２．２．２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により媒介されるＫｌｅＩＦ４ＧをＫｌＴＤＨ３部位に組み込むプラスミド構築

【0163】

ＣＲＩＳＰＲのプラスミド構築

【0164】

ｉ．ＫｌＴＤＨ３－１に対し、プライマーＰＦ８：ＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２５）、ＰＲ８：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２６）を用い、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅産物を混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＴＤＨ３－１（例えば、図６）と命名した。

【0165】

ｉｉ．ＫｌＴＤＨ３－２に対し、プライマーＰＦ９：ＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２７）、ＰＲ９：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＣＧＡＣＡＡＣＴＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２８）を用い、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅産物を混合し１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＴＤＨ３－２（例えば、図７）と命名した。

【0166】

２．２．３ 供与体ＤＮＡのプラスミド構築および増幅

【0167】

線形供与体ＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明は、まず、供与体ＤＮＡをｐＭＤ１８プラスミドに挿入し、その後、ＰＣＲ増幅により線形供与体ＤＮＡ配列を得た。

【0168】

ｉ．ＫｌＴＤＨ３－１に対し、クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１０：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２９）およびＰＲ１０：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３０）でＰＣＲ増幅を行い、ｐＭＤ１８プラスミドをテンプレートとし、プライマーｐＭＤ１８－Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３１）およびｐＭＤ１８－Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３２）でＰＣＲ増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－１－ＤＤと命名した。

【0169】

ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－１－ＤＤをテンプレートとし、プライマーＰＦ１１：ＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３３）およびＰＲ１１：ＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３４）で増幅を行い、Ｋ．ｌａｃｔｉｓゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１２：ＧＧＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３５）およびＰＲ１２：ＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３６）で増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと混合し、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－１－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ（図８）と命名した。

【0170】

ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－１－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤプラスミドをテンプレートとし、プライマーＭ１３－Ｆ：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３７）およびＭ１３－Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３８）で増幅を行い、線形供与体ＤＮＡを得た。

【0171】

ｉｉ．ＫｌＴＤＨ３－２に対し、クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１３：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＣＧＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３９）およびＰＲ１３：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＴＣＴＡＴＴＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４０）でＰＣＲ増幅を行い、ｐＭＤ１８プラスミドをテンプレートとし、プライマーｐＭＤ１８－Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４１）およびｐＭＤ１８－Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４２）でＰＣＲ増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－２－ＤＤと命名した。

【0172】

ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－２－ＤＤをテンプレートとし、プライマーＰＦ１４：ＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＴＴＡＡＣＧＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４３）およびＰＲ１４：ＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣｔＡＡｇＴＣａＡＣｇＡＣｃＣＴＴＴＣＡＧＡＧＴＡＡＣＣＧＴＡＴＴＣＧＴＴＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４４）で増幅を行い、クルイベロマイセスラクティスＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１５：ＧＧＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４５）およびＰＲ１５：ＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４６）で増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液と混合し、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－２－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ（図９）と命名した。

【0173】

ｐＫＭ－ＫｌＴＤＨ３－２－Ｆ－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤプラスミドをテンプレートとし、プライマーＭ１３－Ｆ：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４７）およびＭ１３－Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４８）で増幅を行い、線形供与体ＤＮＡを得た。

【0174】

２．２．４ クルイベロマイセスラクティスの形質転換および陽性同定

【0175】

ｉ．クルイベロマイセスラクティス菌液をＹＰＤ固体培地上にストリークしてモノクローナルを選別し、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地で一晩振とう培養し、２ｍＬの菌液を５０ｍＬの液体２×ＹＰＤ培地に入れて２～８ｈ振とう培養し続けた。２０℃の条件において３０００ｇで５ｍｉｎ遠心して酵母細胞を採取し、５００μＬの滅菌水を加えて再懸濁し、同様の条件で遠心して細胞を採取した。コンピテント細胞溶液（５％のｖ／ｖグリセロール、１０％のｖ／ｖ ＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞を５００μＬの該溶液に溶解した。５０μＬを１．５ｍＬの遠心管に分注し、－８０℃で保存した。

【0176】

コンピテント細胞を３７℃で置いて１５～３０ｓ融解させ、１３０００ｇで２ｍｉｎ遠心して上清を除去した。形質転換緩衝液を以下のように調製した。ＰＥＧの３３５０（５０％（ｗ／ｖ））２６０μＬ、ＬｉＡｃ（１．０ Ｍ）３６μＬ、ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド１５μＬ、供与体ＤＮＡ １０μＬに、最終体積が３６０μＬとなるまで滅菌水を加えた。熱ショック後、１３０００ｇで３０ｓ遠心して上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液体培地を加えて２～３ｈ培養し、２００μＬを吸い取って固体ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）培地に塗布し、単一コロニーが出現するまで２～３日間培養した。

【0177】

ｉｉ．クルイベロマイセスラクティスが形質転換した後のプレート上で１０～２０個のモノクローナルを選別し、１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）液体培地に置いて一晩振とう培養し、菌液をテンプレートとし、ＣＲＩＳＰＲ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ＣｈｅｃｋプライマーＫｌＴＤＨ３－１－ＣＩＣＦ１（ＫｌＴＤＨ３－１配列内のプライマー）：ＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４９）およびプライマーＫｌＴＤＨ３－２－ＣＩＣＦ１（ＫｌＴＤＨ３－２配列内のプライマー）：ＴＴＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５０）でそれぞれＰＣＲ増幅を行い、それぞれＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＣＩＣＲ２（ＫｌｅＩＦ４Ｇ配列内のプライマー）：ＴＴＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５１）とペアにしてＰＣＲを行い、ＫｌＴＤＨ３－１およびＫｌＴＤＨ３－２部位のＫｌｅＩＦ４Ｇ挿入を検出し、ＰＣＲ結果が陽性でシーケンシングを経た菌株が陽性菌株であると確定した。

【0178】

２．３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によりＫｌｅＩＦ４Ｇとその相互作用タンパク質とを融合する

【0179】

２．３．１ ＫｌＰａｂ１配列検出およびＣＲＩＳＰＲｇＲＮＡ配列確定

【0180】

前述したように、Ｐａｂ１タンパク質およびｅＩＦ４Ｇタンパク質は翻訳開始プロセスにおいて相互作用が存在する。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、ＫｌＰａｂ１とＫｌｅＩＦ４Ｇとを融合し、両者の相互作用を促進し、インビトロ翻訳効率を向上させる。

【0181】

Ｐａｂ１配列に基づき、クルイベロマイセスラクティスにおけるＫｌＰａｂ１遺伝子配列（染色体Ｃの１５５３３２２・・・・・・１５５５１００に位置する）を得た。ＫｌＰａｂ１遺伝子終止コドン付近でＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を探索し、ｇＲＮＡ配列を確定した。ＧＣ含有量が適当であり、本発明の標準はＧＣ含有量が４０％～６０％であること、およびｐｏｌｙ Ｔ構造の存在を回避することをｇＲＮＡ選択の原則とした。最終的には、本発明で確定したＫｌＰａｂ１ ｇＲＮＡ配列はＴＧＣＴＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５２）であり、染色体Ｃの１５５５０５８・・・・・・１５５５０７７部位に位置する。

【0182】

２．３．２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により媒介されるＫｌｅＩＦ４ＧをＫｌＰａｂ１部位に組み込むプラスミド構築

【0183】

ｉ．ＣＲＩＳＰＲのプラスミド構築

【0184】

プライマーＰＦ１６：ＴＧＣＴＴＡＣＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５３）、ＰＲ１６：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５４）を用い、ｐＣＡＳプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。１７μＬの増幅産物を混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ｋａｎ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＣＡＳ１．０－ＫｌＰａｂ１（図１０）と命名した。

【0185】

ｉｉ．ＫｌＰａｂ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ供与体ＤＮＡのプラスミド構築および増幅

【0186】

線形供与体ＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、まず、供与体ＤＮＡをｐＭＤ１８プラスミドに挿入し、その後、ＰＣＲ増幅により線形供与体ＤＮＡ配列を得た。

【0187】

クルイベロマイセスラクティスゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１７：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５５）およびＰＲ１７：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５６）でＰＣＲ増幅を行い、ｐＭＤ１８プラスミドをテンプレートとし、プライマーｐＭＤ１８－Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５７）およびｐＭＤ１８－Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５８）でＰＣＲ増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ混合し、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＰａｂ１－ＤＤと命名した。

【0188】

ｐＫＭ－ＫｌＰａｂ１－ＤＤをテンプレートとし、プライマーＰＦ１８：ＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５９）およびＰＲ１８：ＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣｔＴＴｔＴＴａＡＡａＴＴｃＴＣＧＴＡＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６０）で増幅を行い、クルイベロマイセスラクティスＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＰＦ１９：ＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＧＴＣＴＡＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６１）およびＰＲ１９：ＴＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６２）で増幅を行った。２回の増幅産物をそれぞれ８．５μＬ、１μＬのＤｐｎＩ、２μＬの１０×ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒと混合し、３７℃の温浴で３ｈ置いた。１０μＬのＤｐｎＩ処理後生成物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に加え、氷上で３０ｍｉｎ置き、４２℃で熱ショックを４５ｓ行った後、１ｍＬのＬＢ液体培地を加えて３７℃で１ｈ振とう培養し、Ａｍｐ耐性ＬＢ固体に塗布して培養し、３７℃で逆さまにしてモノクローナルに成長するまで培養した。５つのモノクローナルを選別してＬＢ液体培地で振とう培養し、ＰＣＲ検出が陽性でシーケンシングした後、プラスミドを抽出して保存し、ｐＫＭ－ＫｌＰａｂ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤ（図１１）と命名した。

【0189】

ｐＫＭ－ＫｌＰａｂ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＤＤプラスミドをテンプレートとし、プライマーＭ１３－Ｆ：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６３）およびＭ１３－Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６４）で増幅を行い、線形供与体ＤＮＡを得た。

【0190】

２．３．３ クルイベロマイセスラクティスの形質転換および陽性同定

【0191】

ｉ．クルイベロマイセスラクティス菌液をＹＰＤ固体培地上にストリークしてモノクローナルを選別し、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地で一晩振とう培養し、２ｍＬの菌液を５０ｍＬの液体２×ＹＰＤ培地に入れて２～８ｈ振とう培養し続けた。２０℃の条件において３０００ｇで５ｍｉｎ遠心して酵母細胞を採取し、５００μＬの滅菌水を加えて再懸濁し、同様の条件で遠心して細胞を採取した。コンピテント細胞溶液（５％のｖ／ｖグリセロール、１０％のｖ／ｖ ＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞を５００μＬの該溶液に溶解した。５０μＬを１．５ｍＬの遠心管に分注し、－８０℃で保存した。

【0192】

コンピテント細胞を３７℃で置いて１５～３０ｓ融解させ、１３０００ｇで２ｍｉｎ遠心して上清を除去した。形質転換緩衝液を以下のように調製した。ＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ））２６０μＬ、ＬｉＡｃ（１．０ Ｍ）３６μＬ、ｃａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ（５．０ｍｇの／ｍＬ）２０μＬ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド１５μＬ、供与体ＤＮＡ １０μＬに、最終体積が３６０μＬとなるまで滅菌水を加えた。熱ショック後、１３０００ｇで３０ｓ遠心して上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液体培地を加えて２～３ｈ培養し、２００μＬを吸い取って固体ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）培地に塗布し、単一コロニーが出現するまで２～３日間培養した。

【0193】

ｉｉ．クルイベロマイセスラクティスが形質転換した後のプレート上で１０～２０個のモノクローナルを選別し、１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬｇ４１８）液体培地に置いて一晩振とう培養し、菌液をテンプレートとし、プライマーＫｌＰＡＢ１－ＣＩＣＦ１（ＫｌＰＡＢ１配列内のプライマー）：ＴＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６５）およびプライマーＫｌｅＩＦ４Ｇ－ＣＩＣＲ２（ＫｌｅＩＦ４Ｇ配列内のプライマー）：ＴＴＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６６）でＰＣＲ増幅を行い、ＫｌＰＡＢ１部位のＫｌｅＩＦ４Ｇ挿入に対してＰＣＲ検出を行い、ＰＣＲ結果が陽性でシーケンシングを経た菌株が陽性菌株であると確定した。

【0194】

実施例３ 操作された株のインビトロ翻訳活性の測定

【0195】

遺伝子組換えされたクルイベロマイセスラクティス菌株をインビトロタンパク質合成系に調製し、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、 Ｆｌｕｃ）遺伝子ＤＮＡテンプレートを加えて操作された株のタンパク質翻訳能力を測定した。上記反応系を２５～３０℃の環境に置き、約２～６ｈ静置してインキュベートした。反応が終了した後、９６穴の白色プレートまたは３８４穴の白色プレートに等体積のＦｌｕｃ基質ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を加え、直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に置き、データを読み出し、Ｆｌｕｃ活性を検出し、相対光単位値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）を活性単位とした。

【0196】

組換えされた構造において、ＫｌｅＩＦ４Ｇの前にプロモーターｐＫｌＰＧＫ１が挿入された構造ｐＫｌＰＧＫ１：：ＫｌｅＩＦ４ＧおよびＫｌｅＩＦ４ＧがＫｌＰａｂ１のＣ端に連結された構造ＫｌＰａｂ１－ＫｌｅＩＦ４Ｇは、いずれも野生型酵母株Ｙ１１４０よりも強いインビトロタンパク質の合成能力を示す。それでコードして合成されたＦｌｕｃタンパク質から放出される相対光単位値はそれぞれ１．５７×１０^９および１．５０×１０^９に達することに対し、野生型酵母株Ｙ１１４０で合成されたＦｌｕｃタンパク質の相対光単位値は４．１１×１０^８だけである。これは、ＫｌｅＩＦ４Ｇに対する組換えが、酵母によるインビトロタンパク質合成系のタンパク質の合成効率を効果的に強化できることを示す（図１２）。

【0197】

具体的な効果は表２に示すとおりである。

【0198】

【表2】

【0199】

上記実験結果により、クルイベロマイセスラクティスＫｌｅＩＦ４Ｇ遺伝子に対する相関組換えにより、本発明の融合タンパク質は、酵母によるインビトロタンパク質合成系のタンパク質の生成効率を著しく強化することができる。

【0200】

本発明で言及された全ての文献は、各文献が単独で参照として引用されるように、いずれも参照として本出願に引用される。また、本発明の上記説明を閲読することで、当業者は本発明に対して様々な変更または修正を行うことができ、これらの等価形態は同様に本出願の特許請求の範囲に限定された範囲に含まれることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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