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特許7246323Ｓ２又はＳ２’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-16
(45)【発行日】2023-03-27
(54)【発明の名称】Ｓ２又はＳ２’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 9/56 20060101AFI20230317BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230317BHJP
C12P 21/04 20060101ALI20230317BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20230317BHJP
【ＦＩ】
C12N9/56 ZNA
C12P21/02 C
C12P21/04
C12N15/57
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2019563434
(86)(22)【出願日】2018-05-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-16
(86)【国際出願番号】 NL2018050332
(87)【国際公開番号】W WO2018212658
(87)【国際公開日】2018-11-22
【審査請求日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】17171981.8
(32)【優先日】2017-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】517123829
【氏名又は名称】エンザイペプ ビー．ブイ．
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(72)【発明者】
【氏名】トプラク， アナ
(72)【発明者】
【氏名】ナエヘンズ， ティモ
(72)【発明者】
【氏名】クワートフリーク， ピーター ジャン レオナード マリオ
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０５６９１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第９６／０２７６７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０６０２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０７９７５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Toplak Ana et al.，Peptiligase, an Enzyme for Efficient Chemoenzymatic Peptide Synthesis and Cyclization in Water.，Advanced Synthesis & Catalysis，2016年，358(13)，2140-2147
【文献】CHANG T K et al.，Subtiligase: A tool for semisynthesis of proteins.，PNAS，1994年，91(26)，12544-12548
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００ － ９／９９
１５／００ － １５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００ － ４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログである酵素であって、該サブチリシンＢＰＮ’バリアントは、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’と比較した以下の突然変異：
－ ７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失；
－ Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異であって、前記突然変異は、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインに対応する突然変異；
－ Ｆ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ｔ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、及びＮ６２Ｙからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異；及び
－ Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ、及びＰ２２５Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異；
からなる突然変異が導入されたものであり、
前記酵素は、前記配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’に対して５００倍以上高い合成対加水分解の比を有し、
前記ホモログは、前記サブチリシンＢＰＮ’バリアントと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’と比較した前記突然変異を全て含み、
前記アミノ酸位置は、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される酵素。
【請求項2】
Ｆ１８９Ｗ又はＦ１８９Ｙに対応する前記酵素のＳ２’ポケット中の突然変異を含む、請求項１に記載の酵素。
【請求項3】
Ｎ２１８に対応する前記アミノ酸位置におけるアミノ酸が、Ｎ、Ｄ、又はＴである、請求項２に記載の酵素。
【請求項4】
Ｎ２１８Ｄ又はＮ２１８Ｔに対応する前記酵素のＳ２’ポケット中の突然変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項5】
Ｓ３３Ｄ又はＳ３３Ｔに対応する前記酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項6】
Ｓ３３Ｄに対応する前記酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含み、Ｎ６２Ｓに対応するＳ２’ポケット中の突然変異をさらに含む、請求項５に記載の酵素。
【請求項7】
Ｓ３３Ｔに対応する前記酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含み、Ｎ６２Ｗ又はＮ６２Ｖに対応するＳ２’ポケット中の突然変異をさらに含む、請求項５に記載の酵素。
【請求項8】
Ｍ２２２Ｐ、Ｙ２１７Ｈ、Ｐ２２５Ｎ、Ｆ１８９Ｗ、Ｎ２１８Ｄ及びＩ１０７Ｖに対応する突然変異をさらに含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項9】
Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｙ又はＮ６２Ｗに対応する前記酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項10】
Ｆ１８９、Ｎ２１８、Ｓ３３及びＮ６２に対応する位置の群から選択される少なくとも２つの位置が突然変異を含み、Ｆ１８９に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｆ１８９Ｙ又はＦ１８９Ｗに対応し；
Ｎ２１８に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｎ２１８Ｄ又はＮ２１８Ｔに対応し；
Ｓ３３に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｓ３３Ｄ又はＳ３３Ｔに対応し；
Ｎ６２に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ又はＮ６２Ｙに対応する、請求項１～９のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項11】
Ｆ１８９、Ｎ２１８、Ｓ３３及びＮ６２に対応する位置の群から選択される４つ全ての位置が突然変異を含み、Ｆ１８９に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｆ１８９Ｙ又はＦ１８９Ｗに対応し；
Ｎ２１８に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｎ２１８Ｄ又はＮ２１８Ｔに対応し；
Ｓ３３に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｓ３３Ｄ又はＳ３３Ｔに対応し；
Ｎ６２に対応する前記位置における前記突然変異が、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ又はＮ６２Ｙに対応する、請求項１０に記載の酵素。
【請求項12】
Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ又はＰ２２５Ｔに対応する突然変異を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項13】
配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される１～１６個の突然変異を含み、前記突然変異の１つ以上が、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項14】
ペプチドを酵素的に合成する方法であって、（ａ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル及び（ｂ）Ｎ末端無保護アミンを有するペプチド求核剤をカップリングさせることを含み、水を含む流体中で前記カップリングを実施し、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の酵素により前記カップリングを触媒する方法。
【請求項15】
前記ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステル又は前記ペプチド求核剤が、タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記タンパク質が、抗体、抗体断片、ペプチドベース受容体リガンド、アルブミン、ビオチン、成長因子、ホルモン及びナノボディの群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステル、前記ペプチド求核剤、又はその両方が、２～１００個のアミノ酸単位を有するペプチド鎖を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルが、ペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルと、ポリアルキレングリコール、脂肪酸及びポリシアル酸の群から選択される部分とのコンジュゲートであり、並びに／又は前記ペプチド求核剤が、ペプチド求核剤と、ポリアルキレングリコール、脂肪酸及びポリシアル酸の群から選択される部分とのコンジュゲートである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
少なくとも１２個のアミノ酸の環式ペプチドを酵素的に合成する方法であって、Ｎ末端無保護アミンを有するペプチドＣ末端エステル又はチオエステルを環化ステップに供することを含み、水を含む流体中で前記環化を実施し、請求項１～１３のいずれか一項に記載の酵素により前記環化を触媒する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログである酵素に関する。本発明はさらに、前記酵素を使用する、ペプチドを酵素的に合成する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチドは、多くの用途、例えば、医薬、食料若しくは飼料成分、又は化粧品成分としての用途を有する。
【0003】
ペプチドを合成する方法は、一般に、当分野において公知である。オリゴペプチドは、高度に最適化された方法を介して溶液中で又は固相上で段階的に化学的に合成することができる。しかしながら、１０～１５個のアミノ酸よりも長いペプチドは、副反応に起因して合成が極めて困難であることが多く、結果として精製が煩雑である。したがって、１０個のアミノ酸よりも長いペプチドは側鎖保護オリゴペプチド断片の固相合成の組合せにより合成されることが多く、それが続いて溶液中で、例えば、１０＋１０縮合において化学的に縮合されて２０個のアミノ酸のペプチドが作製される。化学的な側鎖保護オリゴペプチド断片縮合の主な欠点は、アシル供与体のＣ末端アミノ酸残基の活性化時にラセミ化が生じることである。対照的に、酵素触媒ペプチドカップリングはラセミ化を完全に欠き、化学的ペプチド合成と比べていくつかの他の利点、側鎖官能基上の副反応の不存在を有する。産業用途については、速度論的アプローチに基づく酵素的ペプチド合成概念、すなわち、アシル供与体Ｃ末端エステルの使用が最も魅力的である（例えば、Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．－Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，ｉｎ：“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１ｓｔ ｒｅｐｒｉｎｔ，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２参照）。
【0004】
化学－酵素的ペプチド合成は、化学的合成、発酵を使用して、又は化学及び酵素的カップリングステップの組合せにより個々に合成されたオリゴペプチド断片の酵素的カップリングを必要とし得る。水溶液中のオリゴペプチド断片の酵素的縮合に関するいくつかの報告が公開されている（Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，９，７３４；Ｂｊｏｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６，８９１；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１，２１，３３８７；Ｋｏｍｏｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１９８０，１６，４３３）。
【0005】
Ｗｅｌｌｓら（米国特許第５，４０３，７３７号明細書）により、水溶液中のオリゴペプチドの縮合は、サブチリシンＢＰＮ’、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）からのサブチリシン（配列番号２）の活性部位の変更により有意に改善され得ることが見出された。２つの突然変異、すなわち、Ｓ２２１Ｃ及びＰ２２５Ａが導入された場合、野生型サブチリシンＢＰＮ’と比較して合成対加水分解の比（Ｓ／Ｈ比）の５００倍の増加を有するサブチリガーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ）と呼ばれるサブチリシンＢＰＮ’バリアントが得られた。さらなる実験において、Ｗｅｌｌｓらは、サブチリガーゼに５つの追加の突然変異、すなわち、Ｍ５０Ｆ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ１０９Ｓ、Ｋ２１３Ｒ及びＮ２１８Ｓを追加して酵素をより安定的にした（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，１２５４４）。スタビリガーゼ（ｓｔａｂｉｌｉｇａｓｅ）と呼ばれる新たな突然変異体は、ドデカ硫酸ナトリウム及びグアニジニウム塩酸塩に適度により耐性であると考えられたが、依然として加水分解が主な副反応であった。例えば、ペプチドカルボキシアミドメチル－エステル（Ｃａｍ－エステル）が、スタビリガーゼを使用してペプチドアミンに４４％の収率でライゲートされた。この例において、１０当量のペプチドＣ末端エステルが使用され、したがって、９．５６当量のペプチドＣ末端エステルがＣ末端エステル官能基において加水分解され、０．４４当量のみがペプチドアミンにライゲートされて産物が形成された。おそらくこの理由から、本発明者らが知る限り、過去２０年間、サブチリガーゼもスタビリガーゼも酵素的ペプチド合成において産業的に適用されてこなかった。
【0006】
国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットにおいて、サブチリガーゼ又はスタビリガーゼなどの酵素が水性環境中のペプチド合成に使用される場合に直面する不所望に高い加水分解活性のための解決策が、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログを提供することにより提供され、それは、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’又はそのホモログ配列と比較した以下の突然変異：７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失、Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインである）、及び好ましくは、１つ以上のさらなる突然変異を含む。特に、前記酵素は、２つのペプチド断片の縮合により、又はペプチドの環化によりペプチドを調製する酵素法において有用であり、水性反応媒体中のサブチリシンＢＰＮ’と比較して改善された合成対加水分解（Ｓ／Ｈ）の比及び安定性を提供する。タンパク質を別のペプチドに効率的にカップリングする方法も開示される。
【0007】
断片縮合又は環化によるペプチドの酵素的合成において使用することができるさらなる酵素が必要とされ続けている。一般に、このような必要性は、特に、規定のペプチドを作製するためのツールのパレットを広げるために存在する。
【0008】
特に、ペプチドアシル供与体及びペプチド求核剤についての広い基質範囲を提供する一方、Ｓ／Ｈ比を維持し、又は改善するさらなるサブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログを提供することが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
目下、この必要性は、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログのカップリング部位に対して２残基目のポケット中、すなわち、Ｓ２’ポケット中及び／又はＳ２ポケット中の１つ以上の規定の突然変異を有する酵素を提供することにより満たされることが見出された。特に、Ｓ２’ポケット中の１つ以上の規定の突然変異は、ペプチド求核剤のＰ２’位についてだけでなく、ペプチド求核剤のＰ１’位についても基質範囲を広げる。特に、Ｓ２ポケット中の１つ以上の規定の突然変異は、ペプチドアシル供与体のＰ２位についてだけでなく、ペプチド求核剤のＰ１’及びＰ２’位についても基質範囲を広げる。
【0010】
したがって、本発明は、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログである酵素であって、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’又はそのホモログ配列と比較した以下の突然変異：
－ ７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失；
－ Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインであり、好ましくは、Ｓ２２１Ｃである）；
－ Ｆ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ｔ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、及びＮ６２Ｙ
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異；
及び
好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異；
を含み、
アミノ酸位置は、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される酵素に関する。
－ ７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失；
－ Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、Ｓ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステインであり、好ましくは、Ｓ２２１Ｃである）；
－ Ｆ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ｔ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、及びＮ６２Ｙ
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異；
及び
好ましくは、Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異；
を含み、
アミノ酸位置は、配列番号２により表されるサブチリシンＢＰＮ’の配列に従って定義される酵素に関する。
【0011】
本発明による酵素は、触媒として有用である。酵素は、一般に、ペプチド結合の形成に関する触媒活性（縮合活性）を有する。特に、酵素は、リガーゼ活性又はシクラーゼ活性を有する。
【0012】
したがって、本発明はさらに、ペプチドを酵素的に合成する方法であって、（ａ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステル及び（ｂ）Ｎ末端無保護アミンを有するペプチド求核剤をカップリングさせることを含み、
水を含む流体中でカップリングを実施し、本発明による酵素によりカップリングを触媒する方法に関する。
水を含む流体中でカップリングを実施し、本発明による酵素によりカップリングを触媒する方法に関する。
【0013】
したがって、本発明はさらに、少なくとも１２個のアミノ酸の環式ペプチドを酵素的に合成する方法であって、Ｎ末端無保護アミンを有するペプチドＣ末端エステル又はチオエステルを環化ステップに供することを含み、水を含む流体中で前記環化を実施し、本発明による酵素により環化を触媒する方法に関する。
【0014】
本発明は、ペプチドにより拡張されたタンパク質及びペプチドコンジュゲートを含むペプチドを調製する公知の方法の有用な代替法を提供する。
【0015】
特に、本発明による酵素は、特に水を含む反応媒体、より特に水性媒体中の、典型的には１超、好ましくは、２以上、特に５以上の高いＳ／Ｈ比でペプチド結合の形成における触媒活性を有する。この引用の上限値は重要でなく；実際、それは、例えば、１００以下、特に２０以下であり得る。
【0016】
本発明は特に、（より）広い基質範囲を有する一方、特に水性反応媒体中のＳ／Ｈ比を少なくとも実質的に維持し、又は改善する酵素を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】ＢＳ１４９－ＤＭＧＦ及びＢＳ１４９－ＤＭＧＦ＋Ｆ１８９Ｗ／ＹのＰ２’基質範囲を示す。
【図1B】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨ＋Ｆ１８９ＷのＰ２’基質範囲を示す。
【図1C】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９ＷのＰ２’基質範囲を示す。
【図1D】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９ＷのＰ１’基質範囲を示す。
【図2】ＢＳ１４９－ＤＭＧＦＮ及びＢＳ１４９－ＤＭＧＦＮ＋Ｎ２１８Ｄ／ＴについてのＰ２’基質範囲を示す。
【図3】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ＋Ｓ３３Ｄ／ＴについてのＰ２基質範囲を示す。
【図4】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ＋Ｎ６２Ｄ／Ｓ／Ｗ／ＹについてのＰ２基質範囲を示す。
【図5】ＢＳ１４９－ＤＭ ＰＨＮ Ｆ１８９Ｗ及びＢＳ１４９－ＤＭ ＰＨＮ Ｆ１８９Ｗ＋Ｎ２１８ＤについてのＰ２’基質範囲を示す。
【図6】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｄ、ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｎ６２Ｓ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｄ＋Ｎ６２ＳについてのＰ２基質範囲を示す。
【図7】ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｔ、ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｎ６２Ｖ／Ｗ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｗ／ＶについてのＰ２基質範囲を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の目的のため、「合成対加水分解の比」（Ｓ／Ｈ比）は、酵素的に合成された（オリゴ）ペプチド産物の量を、エステル又はチオエステル基が加水分解された（オリゴ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルの量により割ったものを意味する。Ｓ／Ｈ比の決定に関するさらなる詳細については、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットを参照されたい。
【0019】
本発明による酵素のＳ／Ｈ比をサブチリシンＢＰＮ’のＳ／Ｈ比により割ったものは、少なくとも本実施例に記載の条件下で、通常、１００超、好ましくは、２５０以上、より好ましくは、５００以上、特に１０００以上である。この引用の上限値は重要でなく；それは、ほぼ無限であり得る。
【0020】
本明細書において使用される用語「又は」は、それが特に規定されない限り、又はそれが「・・・又は・・・のいずれか」を意味する文脈に従わない限り、「及び／又は」と定義される。
【0021】
本明細書において使用される用語「ａ」又は「ａｎ」は、それが特に規定されない限り、又はそれが単数形のみを指すべき文脈に従わない限り、「少なくとも１つ」と定義される。
【0022】
単数形の名詞（例えば、化合物、添加剤など）に言及する場合、それが単数形のみを指すべき文脈にそれが続かない限り、その複数形が含まれることを意味する。
【0023】
本出願に関して、用語「約」は、特に所与の値からの１０％以下、より特に５％以下、いっそうより特に３％以下のずれを意味する。
【0024】
用語「本質的（に）」又は「（少なくとも）実質的（に）」は、一般に、それが規定されるものの一般的特徴又は機能を有することを示すために本明細書において使用される。定量可能な特徴部に言及する場合、この用語は、特にそれがその特徴部の最大の少なくとも７５％、より特に９０％超、いっそうより特に９８％超であることを示すために使用される。用語「本質的に有さない」は、一般に、物質が存在しない（有効出願日時に利用可能な分析的方法により達成可能な検出限界未満）、又はそれが前記物質を本質的に有さない産物の特性に有意に影響しないような少量で存在することを示すために本明細書において使用される。実際、定量的観点において、産物は、通常、物質の含有率が、それが存在する産物の総重量に対して０～０．１重量％、特に０～０．０１質量％、より特に０～０．００５重量％である場合、物質を本質的に有さないとみなされる。
【0025】
立体異性体が存在する化合物に言及する場合、化合物は、そのような立体異性体のいずれか又はそれらの混合物であり得る。したがって、例えば、エナンチオマーが存在するアミノ酸に言及する場合、そのアミノ酸は、Ｌ－エナンチオマー、Ｄ－エナンチオマー又はそれらの混合物であり得る。天然立体異性体が存在する場合、化合物は、好ましくは、天然立体異性体である。
【0026】
用語「ｐＨ」は、見かけのｐＨ、すなわち、標準的な較正ｐＨ電極により計測されるｐＨについて本明細書において使用される。
【0027】
本発明の目的のため、「ペプチド」は、２つ以上のアミノ酸から構成される任意の鎖を意味する。したがって、ペプチドは、一般に、水の形式的損失を伴うあるもののカルボニル炭素から別のものの窒素原子への共有結合の形成により２つ以上のアミノカルボン酸分子（すなわち、アミノ酸）から少なくとも概念的に構成されるアミドである。用語「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む。用語「ペプチド」は、通常、アルファ－アミノ酸から形成される構造に適用されるが、ペプチドは、他のアミノ酸、例えば、１つ以上のベータ－アミノ酸及び／又は１つ以上のガンマ－アミノ酸を含み得る。ペプチドは、直鎖、分枝鎖又は環状であり得る。ペプチドは、２つ以上のアミノ酸から構成される単一鎖を有し得、又はペプチドは、複数の鎖を有し得る（すなわち、キメラペプチド）。ペプチドが２つ以上の鎖から構成される場合、それぞれの鎖は、一般に、３つ以上のアミノ酸分子から構成される。
【0028】
ペプチドのアミノ酸配列は、一次構造と称される。
【0029】
一実施形態において、ペプチドは、二次構造を本質的に有さず、三次構造を本質的に有さない。
【0030】
さらなる実施形態において、ペプチドは、二次構造を有する。二次構造は、一般に、個々のアミノ酸及びペプチド骨格の間の相互作用による高度に規則的な局所下位構造、例えば、アルファ－ヘリックス及びベータ－シート（又はベータ－ストランド）である。
【0031】
一実施形態において、ペプチド（キメラペプチドであり得る）は、三次構造を有する。三次構造は、一般に、複数の相互作用、とりわけ、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、イオン相互作用及びジスルフィド結合により形成される。二次構造も三次構造に寄与し得る。三次構造は、三次元形状（安定的環境中で、例えば、温度変化の不存在下及びペプチドが存在する媒体の変化の不存在下などで本質的に固定される）を提供する。当業者が理解するとおり、三次構造は任意の固定三次元構造を欠くランダムコイルペプチド鎖と異なる。インスリン、アルブミン、抗体、ペプチドベース受容体リガンドなどのタンパク質が、三次構造を有するペプチドの例である。種々のペプチドベースホルモンも三次構造を有する。その例としては、エリスロポエチンＥＰＯ及びペプチドベース成長因子が挙げられる。
【0032】
ジスルフィド結合（ジスルフィド架橋）は、典型的には、（酸化により形成される）２つのシステイン単位間の結合である。したがって、同一ペプチド鎖（アミノ酸配列）中の２つのアミノ酸は、それらがアミノ酸配列中で隣接アミノ酸でない場合でも共有結合し得る。また、同一又は異なるアミノ酸配列を有し得る、第１のペプチド鎖の第１のシステイン及び第２のペプチド鎖の第２のシステインの間のジスルフィド結合が形成されてペプチドが形成され得る。このようなペプチドは、２つ以上のペプチド鎖を含む。異なる鎖がジスルフィド結合を介して結合している２つ以上のペプチド鎖から構成されるペプチドの一例は、インスリンである。
【0033】
一実施形態において、カップリング又は環化される（させるべき）ペプチドは、本質的にアミノ酸単位からなる。さらなる実施形態において、カップリング又は環化される（させるべき）ペプチドは、本質的にアミノ酸単位及び保護基からなる。
【0034】
一実施形態において、カップリング又は環化させるべきペプチドは、２つ以上のアミノ酸のペプチド鎖と、別の残基、例えば、炭水化物又は脂肪酸とのコンジュゲートである。これらのペプチドは、それぞれ糖ペプチド及びリポペプチドと呼ばれる。脂肪酸は、例えば、溶解度を変化させるために使用することができる。好適な脂肪酸の例は、Ｃ８～Ｃ２４飽和脂肪酸及びＣ８～Ｃ２４不飽和脂肪酸である。
【0035】
さらなる実施形態において、カップリング又は環化される（させるべき）ペプチドは、合成親水性ポリマー、例えば、ポリアルキレングリコールにより修飾されたペプチドである。特に好ましいポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。このようなポリマーは、例えば、（例えば、血漿中の）溶解度又はインビボ半減期を増加させるために使用することができる。
【0036】
さらなる実施形態において、カップリング又は環化される（させるべき）ペプチドは、ペプチドとポリシアル酸とのコンジュゲートである。
【0037】
カップリング又は環化される（させるべき）ペプチドは、ペプチドと、イメージング剤、放射線治療剤、毒素又は別の非ペプチド剤、例えば、キレート剤若しくは非ペプチド生物活性部分とのコンジュゲートであり得る。
【0038】
一実施形態において、ペプチドＣ末端（チオ）エステル及び／又はペプチド求核剤は、生物活性ペプチド、例えば、インスリン受容体リガンド又はホルモンである。好ましいインスリン受容体リガンドは、ヒトインスリン、ブタインスリン、Ｈｕｍａｌｏｇ、アスパルト、インスリングルリシン、インスリンデテミル、インスリンデグルデク、及びグラルギンインスリンである。
【0039】
好ましいホルモンは、成長因子である。
【0040】
さらに、本発明により合成することができる、又は本発明によりカップリング反応における基質として使用することができる生物活性ペプチドの好ましい例としては、エキセナチド、エキセナチドアナログ（例えば、Ｇｌｐ－１、テデュグルチド、グルカゴン、リキシセナチド、リラグルチド及びセマグルチドの群から選択されるアナログ）、チモシン－アルファ－１、チモシン－アルファ－１アナログ、テリパラチド、それらのいずれかの配列及び１つ以上のさらなるアミノ酸単位を含むペプチドが挙げられる。エキセナチド、リキシセナチド又はそのアナログを含むコンジュゲートは、２型糖尿病の治療において、特に補助療法として使用し、メトホルミンを服用しているが、適切な血糖管理を達成していない２型糖尿病を有する患者における血糖管理を改善することができる。チモシン－アルファ－１又はそのアナログを含むコンジュゲートは、細胞媒介免疫の向上から利益を受ける患者において使用することができる。これらの医薬ペプチド１つ以上のための本発明による特に好適な合成方法は、任意選択的に、ＰＣＴ／ＮＬ２０１６／０５０５０１号明細書又は国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットとの組合せで本開示に基づき得る。
【0041】
一実施形態において、ペプチドを酵素的に合成する方法は、イメージング剤部分（例えば、発色、蛍光、リン光、放射性）、放射線治療部分又は生物活性ペプチドを含有し、規定部位への、例えば、規定の器官組織への第１のペプチドの標的送達のためのタンパク質を含有するペプチドを合成するために使用される。このような実施形態において、タンパク質は、イメージング剤部分、放射線治療部分又は生物活性ペプチドを含有する別のペプチドとカップリングさせる。これらのいずれか１つは、ペプチド求核剤、又はペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルであり得る。
【0042】
このような目的に好適なタンパク質の周知の例は、抗体、特に免疫グロブリン又はその一部、例えば、免疫グロブリンの抗原結合断片（Ｆａｂ）又は単一ドメイン抗体（ナノボディ）である。本発明によりカップリングさせることができる抗体の具体例は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤである。
【0043】
一実施形態において、別の（生物活性）ペプチドの血漿半減期を増加させるために好適なタンパク質を、特にその（生物活性）ペプチドの半減期を増加させるため、他の（生物活性）ペプチドにカップリングさせる。アルブミンは、別の（生物活性）ペプチドの半減期を増加させるためにカップリングさせることができるタンパク質の例である。これらのいずれか１つは、ペプチド求核剤、又はペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステルであり得る。
【0044】
典型的には、ペプチド（この用語は、オリゴペプチド、タンパク質及びキメラペプチドを含む）は、最大約３５０００個のアミノ酸単位、特に３～２００００個のアミノ酸単位、より特に４～５０００個のアミノ酸単位、好ましくは、６～１０００個のアミノ酸単位を含む。具体的に好ましい実施形態において、ペプチドは、５００個以下のアミノ酸単位、特に２００個以下、より特に１００個以下を含む。具体的に好ましい実施形態において、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸単位、より具体的には少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸又は少なくとも４０個のアミノ酸を含む。
【0045】
「オリゴペプチド」は、本発明に関して、２～２００個のアミノ酸単位から構成され、特に５～１００個のアミノ酸単位から構成され、より特に１０～５０個のアミノ酸単位から構成されるペプチドを意味する。
【0046】
本発明の目的のため、「ペプチド結合」は、（ｉ）１つのアルファ－アミノ酸のアルファ－アミノ末端又は１つのベータ－アミノ酸のベータ－アミノ末端のいずれかと、（ｉｉ）１つの他のアルファ－アミノ酸のアルファ－カルボキシル末端又は１つの他のベータ－アミノ酸のベータ－カルボキシル末端のいずれかとの間のアミド結合を意味する。好ましくは、ペプチド結合は、１つのアルファ－アミノ酸のアルファ－アミノ末端と、別のアルファ－アミノ酸のアルファ－カルボキシル末端との間にある。
【0047】
本発明の目的のため、「環式ペプチド」は、分枝鎖又は直鎖ペプチドのアルファ－アミノ末端及びアルファ－カルボキシル末端がペプチド結合を介して結合しており、それにより少なくとも１２個のアミノ酸単位の環構造を形成するペプチド鎖を意味する。環式ペプチドは、特に１２～２００個のアミノ酸単位から構成され、より特に１２～１００個のアミノ酸単位から構成され、好ましくは、１２～５０個のアミノ酸単位から構成される。
【0048】
本発明に関して、「アミノ酸側鎖」は、任意のタンパク質構成又は非タンパク質構成アミノ酸側鎖を意味する。
【0049】
タンパク質構成アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸である。タンパク質構成アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）が挙げられる。セレノシステイン（Ｓｅｃ、Ｕ）は、構造がシステインに対応するが、それが硫黄原子の代わりにセレンを含有するアミノ酸である。タンパク質構成アミノ酸は、前記アミノ酸（立体異性形態を有さないグリシンを除く）のＬ－立体異性体である。
【0050】
非タンパク質構成アミノ酸は、特にＤ－アミノ酸、Ｌ－若しくはＤ－フェニルグリシン、ＤＯＰＡ（３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン）、ベータ－アミノ酸、４－フルオロ－フェニルアラニン、又はＣα－アルキル化アミノ酸のうちから選択することができる。
【0051】
用語「（チオ）エステル」は、語句「エステル又はチオエステル」の短縮形として本明細書において使用される。
【0052】
タンパク質又はポリペプチド、特に酵素に関して本明細書において使用される用語「突然変異された」又は「突然変異」は、野生型又は天然存在タンパク質又はポリペプチド配列中の少なくとも１つのアミノ酸が、それらのアミノ酸をコードする核酸の突然変異誘発を介して異なるアミノ酸により置き換えられ、その配列中に挿入され、付加され、又はそれから欠失されたことを意味する。突然変異誘発は当分野における周知の方法であり、それとしては、例えば、ＰＣＲによる、又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１－３（１９８９）に記載のオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を介する部位特異的突然変異誘発が挙げられる。遺伝子に関して本明細書において使用される用語「突然変異された」又は「突然変異」は、その遺伝子の核酸配列又はその調節配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが、突然変異誘発を介して異なるヌクレオチドにより置き換えられ、その配列中に挿入され、付加され、又はそれから欠失され、定性又は定量的に変更された機能を有するタンパク質配列の転写をもたらし、又はその遺伝子のノックアウトをもたらすことを意味する。
【0053】
本明細書において、アミノ酸置換を示すための短縮形は、置換されるアミノ酸の一文字アミノ酸コードを用い、それにタンパク質アミノ酸配列中で置換が行われる箇所を指定する数字が続く。この数字は、野生型アミノ酸配列のアミノ酸位置である。したがって、突然変異されたアミノ酸配列について、それは野生型酵素におけるその数字を有する位置に対応するアミノ酸位置である。より数が小さい位置における１つ以上の他の突然変異（付加、挿入、欠失など）に起因して、実際の位置は同一である必要はない。当業者は、一般に公知のアラインメント技術、例えば、ＮＥＥＤＬＥを使用して対応位置を決定することができる。この数字には、そこで野生型アミノ酸と置き換わるアミノ酸の一文字コードが続く。例えば、Ｆ１８９Ｗは、１８９位に対応する位置におけるフェニルアラニンのトリプトファンへの置換を示す。Ｘは、置換させるべきアミノ酸以外の任意の他のタンパク質構成アミノ酸を示すために使用される。例えば、Ｆ１８９Ｘは、１８９位に対応する位置におけるフェニルアラニンの任意の他のタンパク質構成アミノ酸への置換を示す。
【0054】
用語「リガーゼ」は、第１のペプチドのＣ末端及び別のペプチドのＮ末端をカップリングさせることによるペプチド結合の形成を触媒することによる２つのペプチドのカップリングにおける触媒活性を有する酵素について本明細書において使用される。
【0055】
Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒにより定義されるとおり、プロテアーゼ、例として、リガーゼ中の活性部位残基は、サブサイトと称される連続ポケットから構成される。それぞれのサブサイトポケットは、本明細書において配列位置と称されるペプチド基質配列中の対応残基に結合する。この定義によれば、基質配列中のアミノ酸残基は、開裂部位から外側に連続的に－Ｐ４－Ｐ３－Ｐ２－Ｐ１－Ｐ１’－Ｐ２’－Ｐ３’－Ｐ４’－．．．（被切断結合は、Ｐ１及びＰ１’位の間に局在する）とナンバリングされる一方、活性部位中のサブサイト（ポケット）は、それに対応して－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ１’－Ｓ２’－Ｓ３’－Ｓ４’－と標識される（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７ Ａｐｒ ２０；２７（２）：１５７－６２））。全てのプロテアーゼが前記サブサイトの全てを有するわけではないことに留意すべきである。例えば、Ｓ３’及び／又はＳ４’ポケットは、本発明によるサブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログ中で不存在であり得る。
【0056】
本発明の目的のため、「Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４ポケット」は、ペプチドアシル供与体のアミノ酸と相互作用するプロテアーゼ（特にリガーゼ）のアミノ酸を意味する。アシル供与体ペプチドのＣ末端アミノ酸（１番目のアミノ酸；Ｐ１）は、プロテアーゼのＳ１ポケット中のアミノ酸と相互作用する。アシル供与体ペプチドの２残基目のアミノ酸（Ｃ末端から２番目のアミノ酸；Ｐ２）は、プロテアーゼのＳ２ポケット中のアミノ酸と相互作用し、３番目のアミノ酸（Ｐ３）はＳ３と相互作用し、４番目のアミノ酸（Ｐ４）はＳ４ポケットと相互作用する。プロテアーゼのＳ１～Ｓ４結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造中で遠位であり得るが、三次元空間中で近位であるいくつかのアミノ酸により定められる。本発明の目的のため、Ｓ１’及びＳ２’ポケットは、ペプチド求核剤のＮ末端アミノ酸と相互作用するプロテアーゼのアミノ酸を意味する。ペプチド求核剤のＮ末端アミノ酸は、プロテアーゼのＳ１’ポケット中のアミノ酸と相互作用する。ペプチド求核剤のＮ末端から２残基目のアミノ酸は、プロテアーゼのＳ２’ポケット中のアミノ酸と相互作用する。プロテアーゼのＳ１’及びＳ２’結合ポケットは、プロテアーゼの一次構造中で遠位であり得るが、三次元空間中で近位であるいくつかのアミノ酸により定められる。
【0057】
酵素が括弧間で酵素クラス（ＥＣ）に関して挙げられる場合、その酵素クラスは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／において命名法を見出すことができるＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）により提供されるＥｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに基づき酵素が分類され、又は酵素を分類することができるクラスである。規定クラスに（今のところ）分類されていないが、それ自体分類され得る他の好適な酵素が含まれることを意味する。
【0058】
ホモログは、典型的には、ペプチド又は酵素と共通する目的の機能を有し、そのうち、それは、例えば、同一反応、特に本発明による方法の酵素的カップリング又は環化反応を触媒し得るホモログである。
【0059】
アミノ酸又はヌクレオチド配列は、あるレベルの類似性を示す場合、相同であると言われる。２つの相同配列が近縁で関連するかより遠縁で関連するかは、それぞれ高い又は低い「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」により示される。
【0060】
用語「相同性」、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」又は「類似性パーセント」は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的のため、本明細書において、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するため、完全配列が最適な比較目的についてアラインされることが定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するため、比較される２つの配列のいずれかにギャップを導入することができる。このようなアラインメントは、比較される配列の全長にわたり実施される。或いは、アラインメントは、より短い長さにわたり、例えば、約２０、約５０、約１００個以上の核酸又はアミノ酸にわたり実施することができる。同一性の割合は、報告されるアライン領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。
【0061】
２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者は、２つの配列をアラインし、２つの配列間の相同性を決定するためにいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識する（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１－４４ Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，ｐｐ４４３－４５３）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥ中に実装されている。本発明の目的のため、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６－２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列について、ＥＢＬＯＳＵＭ６２は、置換行列について使用される。他の行列を規定することができる。アミノ酸配列のアラインメントに使用される任意選択パラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び０．５のギャップ延長ペナルティである。当業者は、これら全ての異なるパラメータがわずかに異なる結果を生じさせることを認識するが、異なるアルゴリズムを使用する場合、２つの配列の同一性の割合全体が有意に変更されないことを認識する。
【0062】
２つのアライン配列間の相同性又は同一性は、以下のとおり計算される：両方の配列中の同一アミノ酸を示すアラインメント中の対応位置の数字を、アラインメント中のギャップの総数の減算後のアラインメントの全長により割る。本明細書において定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによりＮＥＥＤＬＥから得ることができ、「最長同一性」としてプログラムの出力で標識される。本明細書の目的のため、２つの配列間の同一性（相同性）のレベルは、プログラムＮＥＥＤＬＥを使用することにより実施することができる「最長同一性」の定義により計算される。
【0063】
ポリペプチド配列、特に酵素配列は、配列データベースに対する検索を実施するため、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するための「クエリ配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介して公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列に使用される。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして以下を使用する：
－オープンギャップのコスト：デフォルト＝タンパク質について１１
－延長ギャップのコスト：デフォルト＝タンパク質について１
－予測値：デフォルト＝１０
－ワードサイズ：デフォルト＝ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３。
－オープンギャップのコスト：デフォルト＝タンパク質について１１
－延長ギャップのコスト：デフォルト＝タンパク質について１
－予測値：デフォルト＝１０
－ワードサイズ：デフォルト＝ｍｅｇａｂｌａｓｔについて２８／タンパク質について３。
【0064】
さらに、アミノ酸配列クエリ及び検索相同配列の間の局所同一性（相同性）の程度は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定される。しかしながら、ある閾値を超えるマッチを与えるそれらの配列セグメントのみが比較される。したがって、プログラムは、それらのマッチングセグメントについてのみ同一性を計算する。したがって、このように計算される同一性は、局所同一性と称される。
【0065】
用語「ホモログ」は、ホモログペプチド又は酵素が比較されるペプチド、特に酵素と少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、特にペプチドについて、より特に酵素について本明細書において使用される。明らかに、配列同一性は、１００％未満である。配列同一性の割合は、ホモログが比較されるペプチド（酵素）の突然変異の数及び長さに依存する。「最長同一性」において、アラインメント欠失は考慮されない。
【0066】
本発明の目的のため、「縮合」は、あるペプチド）のＣ末端カルボン酸官能基と、特定の別のペプチドの求核剤のＮ末端アミン官能基との間の新たなアミド結合の形成を意味する。
【0067】
ペプチドの用語「アナログ」は、特に前記ペプチドの構造的アナログ及び／又は機能的アナログであるペプチドについて使用される。機能的アナログは、同一のインビボ標的（例えば、細胞膜上の同一の標的受容体）を有し；構造的アナログは、アミノ酸配列における高い類似性を有する。ペプチドの機能的アナログは、例えば、完全アミノ酸配列にわたる約５０％以下の比較的低いアミノ酸配列同一性を有し得るが、アミノ酸配列のセグメントにおいて、例えば、Ｎ末端部分付近又はＣ末端部分付近でそれらがアナログであるペプチドと高い配列同一性（及びしたがって、高い構造的類似性）を有する。構造的アナログは、特にペプチドがアナログであるペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、より特に少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0068】
明確性及び正確な説明の目的のため、特徴部は、同一又は別個の実施形態の一部として本明細書において記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴部の全て又は一部の組合せを有する実施形態を含み得ることが認識される。本明細書において具体的に定義されない、本明細書において使用される用語は、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットに定義されるとおりであり、又は、それに定義されていない場合、共通一般知識に従って使用される。
【0069】
ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルは、典型的には、活性化（チオ）エステルであり、すなわち、それは、酵素的カップリング反応に関与し得るカルボキシエステル又はカルボキシチオエステル基を含有する。原則として、任意の（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール（チオ）エステルを使用することができる。酵素的カップリング反応に関与し得る（チオ）エステルの典型例は、メチル－、エチル、プロピル－、イソプロピル－、フェニル－、ベンジル－（例えば、ｐ－カルボキシ－ベンジル－）、２，２，２－トリクロロエチル－、２，２，２－トリフルオロエチル－、シアノメチル－及びカルボキシアミドメチル－（チオ）エステルである。
【0070】
式ペプチド－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＸ１Ｘ２－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ－Ｒ１Ｒ２により表されるカルボキシアミドメチル型エステルについて特に良好な結果が得られた。ここで、それぞれのＸ１及びＸ２は、独立して、水素原子又はアルキル基を表す。Ｘ１及びＸ２の両方が水素原子である場合（ペプチド－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ－Ｒ１Ｒ２）に良好な結果が達成された。ここで、Ｒ１は、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基又はアミノ酸の側鎖官能基上で、若しくはアミノ酸の側鎖官能基上の１つ以上で任意選択的に保護されているＣ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す。ここで、それぞれのアルキル基は、独立して、（置換又は非置換）Ｃ１～Ｃ７アルキル基、好ましくは、（置換又は非置換）直鎖Ｃ１～Ｃ６アルキル基、より好ましくは、（置換又は非置換）直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキル基、最も好ましくは、メチル基を表し得る。Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子を表し、又はＲ１が水素原子を表し、Ｒ２がアミノ酸の側鎖官能基上で、若しくはアミノ酸の側鎖官能基上の１つ以上で任意選択的に保護されているＣ末端カルボキシアミド又はカルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す本発明の方法において特に良好な結果が達成された。Ｃａｍ－エステル（Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１及びＲ２は、水素原子である）を使用した場合に特に良好な結果が達成された。
【0071】
カルボキシル置換ベンジルエステルについても、特に式ペプチド－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＯ２Ｅ（式中、Ｅは、水素原子、正荷電塩イオン、例えば、アンモニウムイオン、又はアミノ酸の側鎖官能基上で、若しくはアミノ酸の側鎖官能基上の１つ以上で任意選択的に保護されているＣ末端カルボキシアミド若しくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸若しくはペプチド残基を表す）により表されるｐ－カルボキシル置換ベンジルエステルについても特に良好な結果が得られた。式ペプチド－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＯ２Ｅにより表されるｐ－カルボキシル置換ベンジルエステル（式中、Ｅは、上記のとおり定義され、フェニル環（上記式中のＣ６Ｈ４）中の１つ以上の水素原子は、置換基、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ又はハロゲンにより置き換えられている）についても良好な結果が得られた。
【0072】
ペプチドＣ末端（チオ）エステルは、Ｎ末端無保護でもＮ末端保護でもよい。
【0073】
用語「Ｎ末端保護」は、ペプチドのＮ末端アミン基が、一般に、別のペプチドの、又は同一ペプチド分子のＣ末端カルボン酸基へのＮ末端アミン基のカップリングを少なくとも実質的に保護する保護基とともに提供されることを示すために本明細書において使用される。
【0074】
特に、保護側鎖官能基を有さないペプチドＣ末端（チオ）エステルについて良好な結果が得られた。
【0075】
一実施形態において、１つ以上の側鎖官能基（特にヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミン基）、例えば、全ての側鎖官能基は、保護基とともに提供される。好ましい実施形態において、ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＰ４及びＰ１位におけるアミノ酸の側鎖官能基（特にヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミン基）のみが、保護基とともに提供される。好適な保護基は、当業者に公知である。カルボン酸基は、例えば、シクロヘキシル、ベンジル又はアリル基により保護することができ；アミン官能基は、例えば、アリルオキシカルボニル基又はトリフルオロアセチル基により保護することができる。
【0076】
ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化Ｃ末端（チオ）エステル基は、固相合成を使用して高い収率及び純度でラセミ化なしで合成することができる。カルボキシアミドメチル型の（チオ）エステル（式中、Ｒ１は、水素原子を表し、Ｒ２は、アミノ酸の側鎖官能基上で、又はアミノ酸の側鎖官能基上の１つ以上で任意選択的に保護されているＣ末端カルボン酸官能基を有するアミノ酸又はペプチド残基を表す）の使用の追加の利点は、安価で産業的に利用可能な２－クロロトリチルクロリド樹脂を使用してそれらの活性化Ｃ末端エステル又はチオエステル基を合成することができることである。
【0077】
ペプチドＣ末端（チオ）エステルの活性化Ｃ末端（チオ）エステル基は、液相合成又は微生物を使用する発酵により合成することもできる。発酵を使用するペプチド（チオ）エステルを得る信頼性が高い方法は、いわゆるインテイン発現を介する（例えば、Ｅ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，９，１１－１８参照）。様々なインテイン発現系キットが市販されている（例えば、ＩＭＰＡＣＴ（商標）キット）。ペプチド（チオ）エステルの発酵生産のための他の方法は、当分野において公知である。
【0078】
ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端アミノ酸及びペプチドＣ末端（チオ）エステルの他のアミノ酸は、原則として、任意のタンパク質構成又は非タンパク質構成アミノ酸であり得る。ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端部分のアミノ酸配列が、カップリング酵素のアミノ酸優先性に起因して、及び／又はペプチドの二次若しくは三次構造に起因してカップリング酵素により不十分に認識され、又はそれに接近不可能である場合、一次構造（アミノ酸配列）をＣ末端において伸長させることができる。本質的には、ペプチドＣ末端（チオ）エステルのＣ末端は、多数のアミノ酸により伸長させて酵素的カップリング反応のために酵素による良好な認識及び酵素中への接近性を確保する。当業者は、本明細書に開示の情報及び共通一般知識に基づきどのようにペプチドＣ末端（チオ）エステルを伸長させるかを理解する。通常、伸長のためのアミノ酸の数は、１～１０個の範囲内であるが、原則としてそれは、それよりも多くてよい。４つのアミノ酸残基によるペプチドＣ末端（チオ）エステルの伸長、例えば、－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－（チオ）エステルにより良好な結果が得られた。
【0079】
特に、（任意選択的にＮ末端保護されている）ペプチドＣ末端（チオ）エステルは、式Ｉの化合物により表すことができる。
【化1】
【0080】
ここで、Ｑは、ＯＲ又はＳＲ部分を表す。Ｒは、（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール基を表し得る。
【0081】
ここで、Ｐ１は、水素又はＮ末端保護基を意味する。好適なＮ末端保護基は、ペプチドの合成に使用することができるＮ保護基である。このような基は、当業者に公知である。好適なＮ保護基の例としては、カルバメート又はアシル型保護基、例えば、「Ｃｂｚ」（ベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（ホルミル）、「Ｆｍｏｃ」（９－フルオレニルメトキシカルボニル）、「ＰｈＡｃ」（フェナセチル）及び「Ａｃ」（アセチル）が挙げられる。Ｆｏｒ、ＰｈＡｃ及びＡｃの基を導入し、それぞれ酵素ペプチドデホルミラーゼ、ＰｅｎＧアシラーゼ又はアシラーゼを使用して酵素的に開裂させることができる。化学開裂法は、一般に、当分野において公知である。
【0082】
ここで、ｎは、少なくとも２の整数である。ｎは、特に少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも１０であり得る。原則として、ｎの上限値は存在しないが、一般に、ｎは、特に１０．０００以下、１０００以下、５００以下、例えば、１００以下、５０以下又は４０以下であり得る。
【0083】
ここで、それぞれのＲＡ及びそれぞれのＲＢは、独立して、水素原子又は有機部分、好ましくは、アミノ酸側鎖を表す。したがって、ＲＡが全てのｎ個のアミノ酸単位中で同一であることは要求されない。同様に、ＲＢが全てのｎ個のアミノ酸単位中で同一であることは要求されない。任意選択的に、側鎖官能基の１つ以上は保護基を含有し得る。
【0084】
ペプチド求核剤のアミノ酸単位は、原則として、任意のタンパク質構成又は非タンパク質構成アミノ酸から選択することができる。
【0085】
特に、ペプチド求核剤は、式ＩＩの化合物により表すことができる。
【化2】
【0086】
用語「Ｃ末端保護」は、ペプチドのＣ末端カルボン酸基が、一般に、別のペプチドの、又は同一ペプチド分子のＮ末端アミン基へのカルボン酸基のカップリングを実質的に保護する保護基とともに提供されることを示すために本明細書において使用される。
【0087】
ここで、ｎ、ＲＡ及びＲＢは、上記定義のとおりである。
【0088】
ここで、Ｐ２は、アミン部分又はＯＲ部分を表す。
【0089】
Ｐ２がアミン部分を表す場合、アミン部分は、式ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ個々に、任意の（置換又は非置換）アルキル又は（置換又は非置換）アリール基を表し得る）により表すことができる。特に、Ｒ３及びＲ４のうち一方は水素原子であり、他方は（置換又は非置換）アルキル基である。特に、Ｒ３及びＲ４の両方が水素原子である場合に良好な結果が得られた。
【0090】
Ｐ２がＯＲ部分を表す場合、Ｒは、Ｃ末端保護基又はカチオン、例えば、一価カチオン、例えば、三又は四置換アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオン又はＨを表し得る。
【0091】
ＲがＣ末端保護基である場合、これは、特に任意選択的に置換されているアルキル基であり得る。好ましくは、これはｔ－アルキル基であるが、原則として、それは、当業者に公知の任意の他の保護エステルであってもよい。ｔ－アルキルは、原則として、任意の保護第三級アルキル基であり得る。好ましくは、ｔ－アルキルは、ｔ－ブチル（２－メチル－２－プロピル）、ｔ－ペンチル（２－メチル－２－ブチル）及びｔ－ヘキシル（２，３－ジメチル－２－ブチル）の群から選択される。
【0092】
一実施形態において、ペプチド求核剤は、Ｃ末端保護されている。別の実施形態において、これはＣ末端保護されていない。
【0093】
特に、保護側鎖官能基を有さないペプチド求核剤について良好な結果が達成された。
【0094】
一実施形態において、ペプチド求核剤の１つ以上の側鎖官能基（特に、１つ以上のヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミン基）は、保護基とともに提供される。好適な保護基は、当業者に公知である。カルボン酸基は、例えば、シクロヘキシル、ベンジル又はアリル基により保護することができ；アミン官能基は、例えば、アリルオキシカルボニル基又はトリフルオロアセチル基により保護することができる。
【0095】
ペプチド求核剤は、当分野において公知の方法、例えば、固相合成、液相合成を使用して、又は微生物を使用する発酵により合成することができる。ペプチド求核剤のＮ末端アミノ酸及びペプチド求核剤の他のアミノ酸は、原則として、任意のタンパク質構成又は非タンパク質構成アミノ酸であり得る。ペプチド求核剤のＮ末端部分のアミノ酸配列が、カップリング酵素のアミノ酸優先性に起因して、又はペプチド求核剤の二次若しくは三次構造に起因してカップリング酵素により不十分に認識され、又はそれに接近不可能である場合、一次構造（アミノ酸配列）をＮ末端において伸長させることができる。本質的には、ペプチド求核剤のＮ末端は、多数のアミノ酸により伸長させて酵素的カップリング反応のためにカップリング酵素による良好な認識及びそれへの接近性を確保する。当業者は、本明細書に開示の情報及び共通一般知識に基づきどのようにペプチド求核剤を伸長させるかを理解する。通常、伸長のためのアミノ酸の数は、１～１０個の範囲内であるが、原則としてそれは、それよりも多くてよい。３つのアミノ酸残基によるペプチド求核剤の伸長、例えば、Ｈ－Ｓｅｒ－Ｔｙｒ－Ａｒｇにより良好な結果が得られた。
【0096】
本発明による酵素は、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログである。
【0097】
特に、本発明は、（生物中で産生された場合、発現された生物（典型的には、組換え生物）から、又は合成された反応媒体から単離された）単離酵素を提供する。
【0098】
特に、本発明の酵素は、本発明の目的のため、粗製形態又は、任意の好適な技術、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０（１９８８）に開示の単一ステップ精製法などにより実質的に精製された形態のいずれかで、単離されたとみなされる。
【0099】
本発明の酵素は、少なくとも実質的に純粋な形態（例えば、７５重量％超、８０重量％超）で、又は１つ以上の他の構成成分との混合物で、例えば、原液の形態で、特に水性緩衝溶液で提供することができる。
【0100】
本開示は、特にサブチリシンＢＰＮ’バリアントとみなされる本発明の酵素の種々の例を提供する。既に上記のとおり、本発明の酵素は、少なくとも以下を含むべきである。
－ サブチリシンＢＰＮ’中の７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失；
－ Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、サブチリシンＢＰＮ’中のＳ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステイン、好ましくは、Ｓ２２１Ｃである）；
－ サブチリシンＢＰＮ’中のＦ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ｔ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、及びＮ６２Ｙ
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異。
－ サブチリシンＢＰＮ’中の７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失；
－ Ｓ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異（この突然変異は、サブチリシンＢＰＮ’中のＳ２２１Ｃ又はＳ２２１セレノシステイン、好ましくは、Ｓ２２１Ｃである）；
－ サブチリシンＢＰＮ’中のＦ１８９Ｗ、Ｆ１８９Ｙ、Ｓ３３Ｄ、Ｓ３３Ｔ、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ、Ｎ２１８Ｅ、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、及びＮ６２Ｙ
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異。
【0101】
Ｆ１８９Ｗ又はＦ１８９Ｙに対応する突然変異は、（より）広い基質範囲について、特にペプチド求核剤のＰ２’及びＰ１’位のアミノ酸に関して非常に好ましい一方、十分なＳ／Ｈ比が維持され、又はＳ／Ｈ比が改善される。これら２つの突然変異のうち、Ｆ１８９Ｗが特に好ましい。有利には、Ｆ１８９Ｗ又はＦ１８９Ｙに対応する突然変異、特にＦ１８９Ｗに対応する突然変異を有する酵素は、Ｎ２１８Ｄに対応する突然変異も有する。有利には、Ｎ２１８Ｄに対応する突然変異及びＦ１８９Ｗ又はＦ１８９Ｙに対応する突然変異を有する酵素は、Ｍ２２２Ｐ、Ｙ２１７Ｈ又はＰ２２５Ｎに対応する少なくとも１つの突然変異、好ましくは、それらのそれぞれをさらに有する。
【0102】
Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ又はＮ２１８Ｅに対応する突然変異は、ペプチド求核剤のＰ２’位及び／又はＰ１’位のアミノ酸に関して（より）広い基質範囲に好ましい一方、十分なＳ／Ｈ比が維持され、又はＳ／Ｈ比が改善される。これらの突然変異のうち、Ｎ２１８Ｄが特に好ましい。
【0103】
Ｓ３３Ｄ又はＳ３３Ｔに対応する突然変異は、特にペプチドＣ末端（チオ）エステルのＰ２位の、並びに／又はペプチド求核剤のＰ１’位及び／若しくはＰ２’位のアミノ酸に関して（より）広い基質範囲に非常に好ましい一方、十分なＳ／Ｈ比が維持され、又はＳ／Ｈ比が改善される。これら２つの突然変異のうち、Ｓ３３Ｄが特に好ましい。
【0104】
Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ、Ｎ６２Ｙに対応する突然変異は、特にペプチドＣ末端（チオ）エステルのＰ２位の、並びに／又はペプチド求核剤のＰ１’及び／若しくはＰ２’位のアミノ酸に関して（より）広い基質範囲に好ましい一方、十分なＳ／Ｈ比が維持され、又はＳ／Ｈ比が改善される。これらの突然変異のうち、Ｎ６２Ｄが特に好ましい。
【0105】
特に、Ｓ３３Ｄに対応するアミノ酸位置における酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含み、Ｎ６２Ｓに対応するＳ２’ポケット中の突然変異をさらに含む酵素について良好な結果が達成された。さらに、Ｓ３３Ｔに対応するアミノ酸位置における酵素のＳ２ポケット中の突然変異を含み、Ｎ６２Ｗ又はＮ６２Ｖに対応するＳ２’ポケット中の突然変異をさらに含む酵素について特に良好な結果が達成された。Ｓ３３に対応する位置における規定のアミノ酸及びＮ６２に対応する位置における規定のアミノ酸のこのような組合せを有する酵素は、Ｓ３３位における規定のアミノ酸（Ｄ又はＴ）又はＮ６２位における規定のアミノ酸（Ｗ又はＶ）のいずれかを有する同等の酵素と比べて区別される基質特異性を有することが見出された。さらに、この組合せは、Ｓ／Ｈ比及び酵素的カップリング活性に関して相乗効果を提供することが見出された。好ましくは、相乗効果及び／又は区別される基質特異性の提供のため、Ｓ３３Ｄ＋Ｎ６２Ｓに、又はＳ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｗに、又はＳ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｖに対応する突然変異を有する前記酵素は、Ｍ２２２Ｐ、Ｙ２１７Ｈ及びＩ１０７Ｖに対応する突然変異、より好ましくは、Ｍ２２２Ｐ、Ｙ２１７Ｈ、Ｐ２２５Ｎ、Ｆ１８９Ｗ、Ｎ２１８Ｄ及びＩ１０７Ｖに対応する突然変異をさらに含む。
【0106】
特に好ましい実施形態において、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログは、Ｆ１８９、Ｎ２１８、Ｓ３３及びＮ６２に対応する位置の群から選択される位置における少なくとも２つ、いっそうより好ましくは、少なくとも３つ、最も好ましくは、４つの突然変異を含む。本明細書において、最も好ましくは、Ｆ１８９に対応する位置における突然変異は、Ｆ１８９Ｙ又はＦ１８９Ｗに対応し、Ｎ２１８に対応する位置における突然変異は、Ｎ２１８Ｄ、Ｎ２１８Ｔ又はＮ２１８Ｅに対応し、Ｓ３３に対応する位置における突然変異は、Ｓ３３Ｄ又はＳ３３Ｔに対応し、Ｎ６２に対応する位置における突然変異は、Ｎ６２Ｄ、Ｎ６２Ｓ、Ｎ６２Ｗ又はＮ６２Ｙに対応する。
【0107】
本発明の酵素は、サブチリシンＢＰＮ’と比較したさらなる突然変異、特に、本明細書の他箇所に記載の１つ以上のさらなる突然変異を有し得、但し、それがペプチドの調製において酵素的断片縮合活性（カップリング活性）又は環化活性を有することを条件とする。
【0108】
本発明による酵素、特に本発明のサブチリシンＢＰＮ’バリアントのホモログを突然変異誘発により誘導することができるテンプレート酵素としての、サブチリシンＢＰＮ’の代替物は、他のサブチリシン、特にサブチリシンＢＰＮ’と少なくとも５０％の相同性を有するサブチリシンである。
【0109】
好適なサブチリシンの配列は、２０１４年８月１１日に利用可能なＵＮＩＰＲＯＴ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）から、サブチリシンＢＰＮ’（配列番号２）をクエリとして用いてデータベースをＢＬＡＳＴ処理することにより検索することができる。しかしながら、配列検索は、ＵＮＩＰＲＯＴにも日付にも限定されない。当業者は、どのように代替配列寄託機関にクエリを行うか又はシーケンシングにより追加のホモログ配列を回収するかを理解する（例えば、Ｚｏｏｍｉｎｇ ｉｎ ｏｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ ｉｎ ｓｏｉｌ．Ｇａｂｏｒ Ｅ，Ｎｉｅｈａｕｓ Ｆ，Ａｅｈｌｅ Ｗ，Ｅｃｋ Ｊ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｐｒ ２０；４１８（１－２）：１６－２０参照）。特に、本発明はさらに、サブチリシンＢＰＮ’のＬ７５からＧ８３まで（Ｇ８３を含む）に対応するアミノ酸の少なくとも前記欠失、サブチリシンＢＰＮ’中の２２１位に対応する位置におけるシステイン又はセレノシステイン及び請求項１に記載の前記さらなる突然変異の少なくとも１つを有するバリアントに関する。
【0110】
サブチリシンＢＰＮ’の配列を配列番号２（成熟形態）に挙げる。サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸－１０７～２７５をコードする遺伝子を配列番号１に挙げる。サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はホモログは、国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットによる酵素をベースとし得、但し、それが上記に挙げた突然変異を有することを条件とする。
【0111】
配列番号３は、Ｃａ２＋結合ループの欠失、Ｓ２２１突然変異（Ｓ２２１Ｘと示す）、位置Ｓ３３、Ｎ６２、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｆ１８９、Ｎ２１８（全てＸと標識し、任意のタンパク質構成アミノ酸を示し、但し、少なくとも１つが突然変異であることを条件とする）、及びＸと標識されるＰ２２５位（任意のタンパク質構成アミノ酸、好ましくは、本明細書の他箇所に定義の突然変異）を有する本発明によるサブチリシンＢＰＮ’バリアントを示す。さらに好ましい酵素は、１つ以上の追加の突然変異、特に本明細書の他箇所又は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットに同定される１つ以上のさらなる突然変異を含み得る。
【0112】
本発明による酵素のＳ２２１に対応するアミノ酸位置における突然変異は、好ましくは、Ｓ２２１Ｃである。
【0113】
Ｐ２２５に対応するアミノ酸位置における突然変異は、通常、目的のカップリング又は環化反応についてのＳ／Ｈ比に有利である。突然変異は、通常、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ、Ｐ２２５Ｇ、Ｐ２２５Ａ、Ｐ２２５Ｔ、Ｐ２２５Ｖ、Ｐ２２５Ｉ、Ｐ２２５Ｌ、Ｐ２２５Ｈ、Ｐ２２５Ｑの群から、好ましくは、Ｐ２２５Ｎ、Ｐ２２５Ｄ、Ｐ２２５Ｓ、Ｐ２２５Ｃ及びＰ２２５Ｇの群から、より好ましくは、Ｐ２２５Ｎ又はＰ２２５Ｄから選択される。
【0114】
良好な酵素安定性のため、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログは、好ましくは、配列番号２のＱ２、Ｓ３、Ｐ５、Ｓ９、Ｉ３１、Ｋ４３、Ｍ５０、Ａ７３、Ｅ１５６、Ｇ１６６、Ｇ１６９、Ｓ１８８、Ｑ２０６、Ｎ２１２、Ｎ２１８、Ｔ２５４及びＱ２７１に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される１つ以上の突然変異を含む。本明細書の他箇所に記載のとおり、Ｎ２１８における規定の突然変異は、Ｓ／Ｈ比及び／又は基質範囲に関してさらに有利である。一実施形態において、Ｎ２１８に対応する位置は突然変異されていない一方、酵素安定性はこの位置が突然変異された酵素と比較して少なくとも実質的に維持される。
【0115】
好ましくは、（良好な酵素安定性に好ましい）前記１つ以上の突然変異は、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される。特に好ましい実施形態において、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログは、Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅの群から選択される前記突然変異の少なくとも６つ、好ましくは、少なくとも８つ、より特に少なくとも１２個を含む。
【0116】
好ましい実施形態において、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログは、配列番号２のＧ１００、Ｓ１２５、Ｌ１２６、Ｇ１２７、Ｐ１２９、及びＮ１５５に対応するアミノ酸位置における１つ以上の突然変異を含む。
【0117】
具体的な実施形態において、サブチリシンＢＰＮ’バリアント又はそのホモログは、Ｍ２２２及びＹ２１７に対応するアミノ酸位置における突然変異を含み、この突然変異は、
－ Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｈ；
－ Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｇ；
－ Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆ；又は
－ Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｇ
である。
－ Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｈ；
－ Ｍ２２２Ｐ及びＹ２１７Ｇ；
－ Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｆ；又は
－ Ｍ２２２Ｇ及びＹ２１７Ｇ
である。
【0118】
さらなる実施形態において、サブチリシンＢＰＮ’又はそのホモログは、配列番号２のＹ１０４、Ｉ１０７、Ｓ１０１、Ｇ１０２、１２８、Ｌ１３５及びＰ１６８に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される少なくとも１つの突然変異を含み、１つ又は複数の突然変異は、特にＹ１０４Ｆ、Ｙ１０４Ｓ、Ｉ１０７Ｖ、Ｉ１０７Ａ、Ｌ１３５Ｎ、Ｌ１３５Ｓ、Ｌ１３５Ｄ又はＬ１３５Ａの群から選択することができる。
【0119】
本発明の方法において、酵素的カップリング反応、又は酵素的環化反応は、典型的には、水を含む流体中で実施される。好ましくは、反応は、緩衝流体中で実施される。含水率は、通常、総液体に対して１０～１００容量％、好ましくは、２０容量％以上、好ましくは、４０容量％以上、特に５０容量％以上、特に６０容量％以上である。７０～１００容量％の水、より特に９０～１００容量％、９５～１００容量％又は９８～１００容量％の水を含む反応媒体中で特に良好な結果が達成された。用語「水性」は、少なくとも実質的に水からなる媒体について使用される。
【0120】
原則として、任意の緩衝液が好適である。良好な緩衝液は、当業者に公知である。例えば、Ｄａｖｉｄ Ｓｈｅｅｈａｎ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００９；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｏｒｅ－ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｂｕｆｆｅｒｓ／ｌｅａｒｎｉｎｇ－ｃｅｎｔｅｒ／ｂｕｆｆｅｒ－ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｈｔｍｌ参照。
【0121】
ペプチド断片縮合のための緩衝液のｐＨは、少なくとも５、特に少なくとも６、好ましくは、少なくとも７であり得る。望ましいｐＨは、通常、１１未満、特に１０未満、いっそうより好ましくは、９未満である。通常、酵素断片縮合のための最適ｐＨは、７～９である。環化反応については、最適ｐＨは異なり得る。環化反応のためのｐＨは、少なくとも３、特に少なくとも４、好ましくは、少なくとも５であり得る。望ましいｐＨは、通常、１１未満、特に１０未満、好ましくは、９未満である。通常、酵素的環化反応のための最適ｐＨは、５～９である。
【0122】
高いＳ／Ｈ比に起因して、大過剰のペプチドＣ末端エステル若しくはチオエステル又はペプチド求核剤は、一般に、縮合反応における高収率に到達するためには必要でない。通常、（ａ）ペプチドＣ末端エステル又はチオエステルと、（ｂ）ペプチド求核剤との比は、１：５～５：１、好ましくは、１：３～３：１の範囲内、より好ましくは、１．０：２．５～２．５：１．０の範囲内、特に１：２～２：１の範囲内、より特に１：１．５～１．５：１の範囲内である。ほぼ化学量論比が特に有効であることが見出された。
【0123】
本発明の方法において、反応を実施する流体に添加剤を添加してペプチド断片の溶解度を改善し、又は反応収率を改善することが有利であり得る。このような添加剤は、塩又は有機分子、例えば、グアニジニウム塩酸塩、尿素、ドデカ硫酸ナトリウム又はＴｗｅｅｎであり得る。
【0124】
反応は、完全水性液体中で、又は水及び水混和共溶媒、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチル－ピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、エーテル、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２－メチル－テトラヒドロフラン（Ｍｅ－ＴＨＦ）若しくは１，２－ジメトキシエタン、若しくは（ハロゲン化）アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロイソプロパノールの混合物、又はそれらの有機溶媒の混合物中で実施することができる。サブチリシンＢＰＮ’バリアントの安定性及びペプチド基質の溶解度に応じて、共溶媒の量は、好ましくは、７０容量％未満、より好ましくは、６０容量％未満、いっそうより好ましくは、５０容量％未満、最も好ましくは、４０％未満である。
【0125】
原則として、酵素的断片縮合又は環化の間の温度は、使用すべき酵素が十分な活性及び安定性を示す温度が選択される限り重要でない。このような温度は、定型的に決定することができる。一般に、温度は、少なくとも－１０℃、特に少なくとも０℃又は少なくとも１０℃であり得る。一般に、温度は、７０℃以下、特に６０℃以下又は５０℃以下であり得る。最適温度条件は、規定の酵素的断片縮合又は環化のための規定の酵素について当業者により共通一般知識及び本明細書に開示の情報に基づく定型的な実験を介して容易に同定することができる。一般に、温度は、有利には、２０～５０℃の範囲内である。
【0126】
本発明の酵素は、一般に、組換え法により、特に酵素的に活性な本発明のサブチリシンＢＰＮ’バリアントを発現時にもたらすように突然変異させたサブチリシンＢＰＮ’ＤＮＡの発現により産生される。
【0127】
したがって、本発明はさらに、本発明による酵素を調製する組換え法であって、
ａ）酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を提供すること；
ｂ）酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で前記宿主細胞を培養すること；及び
ｃ）前記微生物宿主から発現された酵素を回収すること
を含む方法に関する。
ａ）酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を提供すること；
ｂ）酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で前記宿主細胞を培養すること；及び
ｃ）前記微生物宿主から発現された酵素を回収すること
を含む方法に関する。
【0128】
本発明はさらに、本発明による酵素をコードする配列を含む組換えポリヌクレオチドに関する。
【0129】
本発明はさらに、酵素を発現し得る本発明によるポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【0130】
本発明に対する触媒としての本発明による酵素の使用は、ペプチドの環化、又はペプチド求核剤、例えば、上記のものへのペプチドＣ末端エステル又はチオエステルのカップリングを超えて拡大する。
【0131】
酵素は、ペプチド結合以外のアミド結合の形成において使用することができるが、ペプチド結合の形成の触媒における使用は、酵素の特に好ましい使用である。
【0132】
目下、本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【実施例】
【0133】
本発明による（使用のための）酵素の産生
突然変異誘発、クローニング及び発現
ＢＳ１４９－ＤＭと示される酵素は、７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含む配列番号２に対応する。Ｈｉｓタグを有するＢＳ１４９－ＤＭをコードする遺伝子を、ｐＵＢ－１１０ベース大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクター（すなわち、ｐＢＳ４２又はｐＢＥＳ（国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットも参照）中にクローニングした。対応するアミノ酸配列を、サブチリシンＢＰＮ’ナンバリングスキームに従ってナンバリングする。アミノ酸－１０７～－１は、完全成熟時に開裂除去されるシグナル配列、プレ配列及びプロ配列を含む。アミノ酸１～２７５は、完全触媒活性を示す成熟酵素を含む。迅速で効率的な精製を可能とするため、アミノ酸２７５の後にＣ末端Ｈｉｓタグを付着させる。カルシウム結合部位の除去の結果として、ＢＳ１４９－ＤＭは、サブチリシンＢＰＮ’中のＬ７５、Ｎ７６、Ｎ７７、Ｓ７８、Ｉ７９、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｌ８２及びＧ８３に対応するアミノ酸を含むサブチリシンＢＰＮ’と比較した９つのアミノ酸の欠失を含有する。ＢＳ１４９－ＤＭについてのサブチリシンＢＰＮ’ナンバリングを維持するため、ナンバリングを７４から８３まで飛ばす。シャトルベクター中で、遺伝子の発現はａｐｒＥプロモーターの制御下である。得られたプラスミドｐＢＥＳ－ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０中で繁殖させ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＸ４９３５（ｔｒｐＣ２ ｍｅｔＢ１０ ｌｙｓ－３ΔｎｐｒＥΔａｐｒＥ）中に形質転換した。ｐＢＥＳ－ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳをテンプレートとして使用して、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法（Ａｇｉｌｅｎｔ）により突然変異誘発を実施した。或いは、当分野において公知の部位特異的突然変異誘発の他の方法を使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。或いは、ＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡにより合成し、それぞれのシャトルベクター中に取り込んだ。
突然変異誘発、クローニング及び発現
ＢＳ１４９－ＤＭと示される酵素は、７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含む配列番号２に対応する。Ｈｉｓタグを有するＢＳ１４９－ＤＭをコードする遺伝子を、ｐＵＢ－１１０ベース大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクター（すなわち、ｐＢＳ４２又はｐＢＥＳ（国際公開第２０１６／０５６９１３号パンフレットも参照）中にクローニングした。対応するアミノ酸配列を、サブチリシンＢＰＮ’ナンバリングスキームに従ってナンバリングする。アミノ酸－１０７～－１は、完全成熟時に開裂除去されるシグナル配列、プレ配列及びプロ配列を含む。アミノ酸１～２７５は、完全触媒活性を示す成熟酵素を含む。迅速で効率的な精製を可能とするため、アミノ酸２７５の後にＣ末端Ｈｉｓタグを付着させる。カルシウム結合部位の除去の結果として、ＢＳ１４９－ＤＭは、サブチリシンＢＰＮ’中のＬ７５、Ｎ７６、Ｎ７７、Ｓ７８、Ｉ７９、Ｇ８０、Ｖ８１、Ｌ８２及びＧ８３に対応するアミノ酸を含むサブチリシンＢＰＮ’と比較した９つのアミノ酸の欠失を含有する。ＢＳ１４９－ＤＭについてのサブチリシンＢＰＮ’ナンバリングを維持するため、ナンバリングを７４から８３まで飛ばす。シャトルベクター中で、遺伝子の発現はａｐｒＥプロモーターの制御下である。得られたプラスミドｐＢＥＳ－ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０中で繁殖させ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧＸ４９３５（ｔｒｐＣ２ ｍｅｔＢ１０ ｌｙｓ－３ΔｎｐｒＥΔａｐｒＥ）中に形質転換した。ｐＢＥＳ－ＢＳ１４９ＤＭＨＩＳをテンプレートとして使用して、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法（Ａｇｉｌｅｎｔ）により突然変異誘発を実施した。或いは、当分野において公知の部位特異的突然変異誘発の他の方法を使用することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。或いは、ＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，ＵＳＡにより合成し、それぞれのシャトルベクター中に取り込んだ。
【0134】
Ｈｉｓ－タグを担持する合成サブチリシンＢＰＮ’バリアントの産生及び精製：
目的サブチリシンバリアント遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単一微生物コロニーを、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を有する５ｍＬのＬＢ中で３７℃において振盪インキュベーター中で植菌した。抗生物質（カナマイシン１０μｇ／ｍＬ）及びアミノ酸（１００ｍｇ／ＬのＴｒｐ、１００ｍｇ／ＬのＭｅｔ及び１００ｍｇ／ＬのＬｙｓ）が補給された３０ｍＬのテリフィックブロスに、０．６ｍＬの一晩培養物を添加した。細胞を３７℃において振盪インキュベーター（２００ｒｐｍ）中で４８時間成長させた。細胞を遠心分離（３０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）により回収した。培地（３０ｍＬ）をデカントし、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（１５ｍｌ、１０ｋＤａのＭＷのカットオフ）上で２回の遠心分離ステップ（１５分間、４０００ｒｐｍ、４℃）において濃縮した。次いで、濃縮した培地（０．５ｍｌ）を緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ）と、３回の洗浄／濃縮ステップ（１４ｍｌの緩衝液Ａ、１０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）で交換した。Ｈｉｓタグ精製のため、Ｔａｌｏｎ樹脂（２．５ｍｌ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をプラスチックカラムカートリッジに添加した。樹脂を５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水により洗浄し、５ｍＬの緩衝液Ａにより平衡化した。粗製酵素をカラム上に負荷し、オービタルシェーカーにおいて４℃において一晩インキュベートした。インキュベーション後、樹脂を２５ｍＬの緩衝液Ａにより洗浄した。酵素を１５ｍＬの緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのイミダゾール）により溶出させた。溶出物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（１５ｍｌ、１０ｋＤａのＭＷのカットオフ）上で遠心分離（３０分間、４０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮し、緩衝液を２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５に、３回の洗浄／濃縮ステップ（１５ｍｌの緩衝液、１０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）で交換した。
目的サブチリシンバリアント遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の単一微生物コロニーを、カナマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を有する５ｍＬのＬＢ中で３７℃において振盪インキュベーター中で植菌した。抗生物質（カナマイシン１０μｇ／ｍＬ）及びアミノ酸（１００ｍｇ／ＬのＴｒｐ、１００ｍｇ／ＬのＭｅｔ及び１００ｍｇ／ＬのＬｙｓ）が補給された３０ｍＬのテリフィックブロスに、０．６ｍＬの一晩培養物を添加した。細胞を３７℃において振盪インキュベーター（２００ｒｐｍ）中で４８時間成長させた。細胞を遠心分離（３０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）により回収した。培地（３０ｍＬ）をデカントし、Ａｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（１５ｍｌ、１０ｋＤａのＭＷのカットオフ）上で２回の遠心分離ステップ（１５分間、４０００ｒｐｍ、４℃）において濃縮した。次いで、濃縮した培地（０．５ｍｌ）を緩衝液Ａ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ）と、３回の洗浄／濃縮ステップ（１４ｍｌの緩衝液Ａ、１０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）で交換した。Ｈｉｓタグ精製のため、Ｔａｌｏｎ樹脂（２．５ｍｌ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をプラスチックカラムカートリッジに添加した。樹脂を５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水により洗浄し、５ｍＬの緩衝液Ａにより平衡化した。粗製酵素をカラム上に負荷し、オービタルシェーカーにおいて４℃において一晩インキュベートした。インキュベーション後、樹脂を２５ｍＬの緩衝液Ａにより洗浄した。酵素を１５ｍＬの緩衝液Ｂ（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのイミダゾール）により溶出させた。溶出物をＡｍｉｃｏｎ遠心分離ユニット（１５ｍｌ、１０ｋＤａのＭＷのカットオフ）上で遠心分離（３０分間、４０００ｒｐｍ、４℃）により濃縮し、緩衝液を２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５に、３回の洗浄／濃縮ステップ（１５ｍｌの緩衝液、１０分間、４，０００ｒｐｍ、４℃）で交換した。
【0135】
純度及び酵素濃度は、上記のとおり決定した。純度は９０％超であった。約０．１～２ｍｇ／ｍｌの得られた酵素を含有する得られた水溶液（２５ｍＭのトリシン、ｐＨ７．５）を、オリゴペプチド断片縮合及び環化にそのまま使用した。
【0136】
参考文献
Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，Ｌ，Ｊ Ｔｏｍ，Ｊ Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｋ Ａ Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ａ Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，ａｎｄ Ｊ Ａ Ｗｅｌｌｓ．１９９１．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１７）（Ａｐｒｉｌ ３０）：４１５１－９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２０２１６０６．
Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ＳＲ，Ｆｉｓｈｅｒ ＫＥ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｂｙ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ａｌｐｈａ－ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６ Ｍａｒ；１６５（３）：７９６－８０４
Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｆｕｊｉｏ，ａｎｄ Ｒｏｙ Ｈ．Ｄｏｉ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ Ｏｃｔ；１６０（１）：４４２－４
Ｒｕａｎ，Ｂｉａｏ，Ｖｉｋｔｏｒｉｙａ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ Ｔｒａｖｉｓ Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐ Ｎ Ｂｒｙａｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍｕｔａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００８ Ｊｕｎ ２４；４７（２５）：６６２８－３６．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
Ｗｅｌｌｓ，Ｊａｍｅｓ Ａ，Ｅｕｇｅｎｉｏ Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｄｅｎｎｉｓ Ｊ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄａｖｉｄ Ａ Ｅｓｔｅｌｌ，ａｎｄ Ｅｌｌｓｏｎ Ｙ Ｃｈｅｎ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３ Ｎｏｖ ２５；１１（２２）：７９１１－２５．
Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，Ｌ，Ｊ Ｔｏｍ，Ｊ Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｋ Ａ Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ａ Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ，ａｎｄ Ｊ Ａ Ｗｅｌｌｓ．１９９１．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１７）（Ａｐｒｉｌ ３０）：４１５１－９．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２０２１６０６．
Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ＳＲ，Ｆｉｓｈｅｒ ＫＥ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｂｙ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ａｌｐｈａ－ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８６ Ｍａｒ；１６５（３）：７９６－８０４
Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｆｕｊｉｏ，ａｎｄ Ｒｏｙ Ｈ．Ｄｏｉ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ Ｏｃｔ；１６０（１）：４４２－４
Ｒｕａｎ，Ｂｉａｏ，Ｖｉｋｔｏｒｉｙａ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ Ｔｒａｖｉｓ Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐ Ｎ Ｂｒｙａｎ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍｕｔａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００８ Ｊｕｎ ２４；４７（２５）：６６２８－３６．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．
Ｗｅｌｌｓ，Ｊａｍｅｓ Ａ，Ｅｕｇｅｎｉｏ Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｄｅｎｎｉｓ Ｊ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄａｖｉｄ Ａ Ｅｓｔｅｌｌ，ａｎｄ Ｅｌｌｓｏｎ Ｙ Ｃｈｅｎ．
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３ Ｎｏｖ ２５；１１（２２）：７９１１－２５．
【0137】
酵素的断片縮合及び環化の実施例
材料及び方法
特に記述のない限り、化学薬品は市販源から入手し、さらに精製することなく使用した。逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、１５０×４．６ｍｍ）を使用するＨＰ１０９０液体クロマトグラフ上で４０℃において分析的ＨＰＬＣを実施した。２２０ｎｍにおいてＵＶ－ＶＩＳ２０４リニア分光光度計を使用してＵＶ検出を実施した。勾配プログラムは、以下のとおりであった：０から２５分間まで、５％から９８％の溶出剤Ｂのリニア勾配ランプ及び２５．１から３０分間まで、５％の溶出剤Ｂ（溶出剤Ａ：Ｈ２Ｏ中０．５ｍＬ／Ｌのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）、溶出剤Ｂアセトニトリル中０．５ｍＬ／ＬのＭＳＡ）。流速は、０から２５．１分間まで、１ｍＬ／分及び２５．２から２９．８分間まで、２ｍＬ／分、次いで３０分間における停止まで再び１ｍＬ／分であった。インジェクション容量は、２０μＬであった。固定相カラム（Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ、Ｃ１８、１０μｍの粒子サイズ、５００×４１．４ｍｍ）を使用するＶａｒｉａｎ ＰｒｅｐＳｔａｒシステム上で分取ＨＰＬＣを実施した。逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、１５０×４．６ｍｍ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ液体クロマトグラフ上で４０℃においてＬＣ－ＭＳを実施した。ＵＶ検出及び勾配プログラムは、分析的ＨＰＬＣについて記載のとおりであった。Ａｇｉｌｅｎｔ ６１３０四重極ＬＣ／ＭＳシステムを使用して分子量を決定した。
材料及び方法
特に記述のない限り、化学薬品は市販源から入手し、さらに精製することなく使用した。逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、１５０×４．６ｍｍ）を使用するＨＰ１０９０液体クロマトグラフ上で４０℃において分析的ＨＰＬＣを実施した。２２０ｎｍにおいてＵＶ－ＶＩＳ２０４リニア分光光度計を使用してＵＶ検出を実施した。勾配プログラムは、以下のとおりであった：０から２５分間まで、５％から９８％の溶出剤Ｂのリニア勾配ランプ及び２５．１から３０分間まで、５％の溶出剤Ｂ（溶出剤Ａ：Ｈ２Ｏ中０．５ｍＬ／Ｌのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）、溶出剤Ｂアセトニトリル中０．５ｍＬ／ＬのＭＳＡ）。流速は、０から２５．１分間まで、１ｍＬ／分及び２５．２から２９．８分間まで、２ｍＬ／分、次いで３０分間における停止まで再び１ｍＬ／分であった。インジェクション容量は、２０μＬであった。固定相カラム（Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲｓ、Ｃ１８、１０μｍの粒子サイズ、５００×４１．４ｍｍ）を使用するＶａｒｉａｎ ＰｒｅｐＳｔａｒシステム上で分取ＨＰＬＣを実施した。逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃ１８、５μｍの粒子サイズ、１５０×４．６ｍｍ）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズ液体クロマトグラフ上で４０℃においてＬＣ－ＭＳを実施した。ＵＶ検出及び勾配プログラムは、分析的ＨＰＬＣについて記載のとおりであった。Ａｇｉｌｅｎｔ ６１３０四重極ＬＣ／ＭＳシステムを使用して分子量を決定した。
【0138】
プロトコル１：オリゴペプチド－ＯＣａｍ－Ｌｅｕ－ＯＨエステルを下記のとおり合成した：
１グラムのＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｗａｎｇ樹脂（０．７２ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）による洗浄後、ＤＣＭ（４５分間、１０ｍＬ）中でＤＣＣ（４当量）及びＨＯＡｔ（４当量）を使用してヨード酢酸（４当量）を樹脂にカップリングさせた。ＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＴＨＦ（２×２分間、１０ｍＬ）による洗浄後、ＤＭＦ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）中で４当量のＦｍｏｃ－Ｘｘｘ－ＯＨ及び１０当量のＤｉＰＥＡを使用して５０℃において２０時間、樹脂にＦｍｏｃ保護アミノ酸を負荷した。ここで、及び本開示の他の部分において、「Ｘｘｘ」は、１つのアミノ酸（以下の実施例に属する図面に示される可変部）を意味する。
１グラムのＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ｗａｎｇ樹脂（０．７２ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。ＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）による洗浄後、ＤＣＭ（４５分間、１０ｍＬ）中でＤＣＣ（４当量）及びＨＯＡｔ（４当量）を使用してヨード酢酸（４当量）を樹脂にカップリングさせた。ＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＴＨＦ（２×２分間、１０ｍＬ）による洗浄後、ＤＭＦ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）中で４当量のＦｍｏｃ－Ｘｘｘ－ＯＨ及び１０当量のＤｉＰＥＡを使用して５０℃において２０時間、樹脂にＦｍｏｃ保護アミノ酸を負荷した。ここで、及び本開示の他の部分において、「Ｘｘｘ」は、１つのアミノ酸（以下の実施例に属する図面に示される可変部）を意味する。
【0139】
ＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）による洗浄後、標準的ＳＰＰＳプロトコルに従ってペプチドを伸長させた（Ｗｅｎｇ Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ，ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）により２回洗浄し、次いでアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。
【0140】
プロトコル２：オリゴペプチドＣ末端アミド求核剤を下記のとおり合成した：
１グラムのＲｉｎｋ樹脂（４－（（２，４－ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ－アミノ）メチル）フェノキシアルキルリンカー、０．６４ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。標準的ＳＰＰＳプロトコルに従ってペプチドを伸長させた（Ｗｅｎｇ Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ，ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）により２回洗浄し、次いでアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。
１グラムのＲｉｎｋ樹脂（４－（（２，４－ジメトキシフェニル）（Ｆｍｏｃ－アミノ）メチル）フェノキシアルキルリンカー、０．６４ｍｍｏｌ／グラムの負荷）をＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用してＦｍｏｃ脱保護した。標準的ＳＰＰＳプロトコルに従ってペプチドを伸長させた（Ｗｅｎｇ Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ，ＯＵＰ Ｏｘｆｏｒｄ，２０００）。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）により２回洗浄し、次いでアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。
【0141】
プロトコル３：Ｎ－アセチル保護オリゴペプチド活性化エステルを下記のとおり合成した：
プロトコル１の１つによる所望の配列のＳＰＰＳ後、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用して樹脂結合ペプチドをＦｍｏｃ脱保護した。樹脂をＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、Ａｃ２Ｏ（１０容量％）、ＤｉＰＥＡ（５容量％）、ＨＯＢｔ（０．２重量％）のＤＭＦ（２×１０分間、１０ｍＬ）中混合物を使用してペプチドＮ末端アミン官能基をアセチル化した。樹脂をＤＭＦ（３×２分間、１０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×２分間、１０ｍＬ）により洗浄した。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）により２回洗浄し、次いでアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。
プロトコル１の１つによる所望の配列のＳＰＰＳ後、ピペリジン／ＤＭＦ（１／４、ｖ／ｖ、２×８分間、１０ｍＬ）を使用して樹脂結合ペプチドをＦｍｏｃ脱保護した。樹脂をＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）、ＤＣＭ（２×２分間、１０ｍＬ）及びＤＭＦ（２×２分間、１０ｍＬ）により洗浄し、Ａｃ２Ｏ（１０容量％）、ＤｉＰＥＡ（５容量％）、ＨＯＢｔ（０．２重量％）のＤＭＦ（２×１０分間、１０ｍＬ）中混合物を使用してペプチドＮ末端アミン官能基をアセチル化した。樹脂をＤＭＦ（３×２分間、１０ｍＬ）及びＤＣＭ（３×２分間、１０ｍＬ）により洗浄した。ＴＦＡ／ＴＩＳ／水の混合物（９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ／ｖ、１５ｍＬ）を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を１２０分間実施した。ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、ＭＴＢＥ／ｎ－ヘプタン（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）により２回洗浄し、次いでアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、５０ｍＬ）から凍結乾燥させた。
【0142】
カップリング実施例
注：ＢＳ１４９－ＤＭと示される酵素は、７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含む配列番号２に対応する。実施例１～５において使用される全ての他の酵素は、ＢＳ１４９－ＤＭのそれら全ての突然変異と、実施例に挙げられる追加の突然変異を有する。上記の技術を使用してＢＳ１４９－ＤＭ及びさらなる突然変異を有する酵素を産生した。
注：ＢＳ１４９－ＤＭと示される酵素は、７５～８３位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Ｑ２Ｋ、Ｓ３Ｃ、Ｐ５Ｓ、Ｓ９Ａ、Ｉ３１Ｌ、Ｋ４３Ｎ、Ｍ５０Ｆ、Ａ７３Ｌ、Ｅ１５６Ｓ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６９Ａ、Ｓ１８８Ｐ、Ｑ２０６Ｃ、Ｎ２１２Ｇ、Ｙ２１７Ｌ、Ｎ２１８Ｓ、Ｓ２２１Ｃ、Ｐ２２５Ａ、Ｔ２５４Ａ及びＱ２７１Ｅを含む配列番号２に対応する。実施例１～５において使用される全ての他の酵素は、ＢＳ１４９－ＤＭのそれら全ての突然変異と、実施例に挙げられる追加の突然変異を有する。上記の技術を使用してＢＳ１４９－ＤＭ及びさらなる突然変異を有する酵素を産生した。
【0143】
実施例１
Ｐ２’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性のマッピング：
様々な突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性を決定するため、以下の２つの標準反応を実施した。８００μＬのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を、１００μＬのトリペプチドＣ末端アミド原液（３００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌの、Ｐ１’ポケットについてのＨ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ及びＰ２’ポケットについてのＨ－Ａｌａ－Ｘｘｘ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ）及び１００μＬのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル原液（１２００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ）の混合物に添加した。この混合物に、５．５μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の５５０μＬのアリコートを抜き取り、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。
Ｐ２’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性のマッピング：
様々な突然変異体のＰ１’及びＰ２’ポケット基質特異性を決定するため、以下の２つの標準反応を実施した。８００μＬのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を、１００μＬのトリペプチドＣ末端アミド原液（３００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌの、Ｐ１’ポケットについてのＨ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ及びＰ２’ポケットについてのＨ－Ａｌａ－Ｘｘｘ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ）及び１００μＬのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル原液（１２００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ）の混合物に添加した。この混合物に、５．５μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の５５０μＬのアリコートを抜き取り、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。
【0144】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｇ＋２１７Ｆ（ＢＳ１４９－ＤＭＧＦ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｇ＋２１７Ｆ＋１８９Ｗ／Ｙ（ＢＳ１４９－ＤＭＧＦ＋１８９Ｗ／Ｙ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋１８９Ｗ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨ＋１８９Ｗ）についてのＰ２’基質範囲を、それぞれ図１Ａ及び１Ｂに示す。
【0145】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ＋Ｆ１８９Ｗ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋１８９Ｗ）についてのＰ２’及びＰ１’基質範囲を、それぞれ図１Ｃ及び１Ｄに示す。
【0146】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｇ＋２１７Ｆ＋２２５Ｎ＋２１８Ｎ（ＢＳ１４９－ＤＭＧＦＮ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｇ＋２１７Ｆ＋２２５Ｎ＋Ｎ２１８Ｄ／Ｔ（ＢＳ１４９－ＤＭＧＦＮ＋Ｎ２１８Ｄ／Ｔ）についてのＰ２’基質範囲を、図２に示す。
【0147】
結論：突然変異Ｆ１８９Ｗ及びＦ１８９Ｙは、Ｐ２’基質範囲及びカップリング効率に関して望ましい効果を有する（図１Ａ～１Ｃ）。
【0148】
Ｐ２’突然変異Ｆ１８９Ｗは、Ｐ１’基質範囲及びカップリング効率に関して明らかに望ましい効果を有する（図１Ｄ）。
【0149】
突然変異Ｎ２１８Ｄ及びＮ２１８Ｔは、Ｐ２’基質範囲及びカップリング効率に関して望ましい効果を有する（図２）。
【0150】
実施例２
Ｐ２’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２’ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２’ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス（２０μｌ）を、１０ｍＭのペンタペプチドＣａｍ－エステルＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ及び１５ｍＭのＣ末端アミドＨ－Ａｌａ－Ｘｘｘ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＤＮＰ）Ｌｙｓ－ＮＨ２．２ＴＦＡ（ＤＮＰは、ジニトロフェニル保護基である）の最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）が補給された１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ８．５中の２０μｌの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計０．４μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の１０μＬのアリコートを抜き取り、１５０μＬのＭＳＡ／水（２／９８、ｖ／ｖ）によりクエンチし、３５０μｌの水により希釈し、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。データをスクリーニングにおいて得られた最大変換率に関して１００％に正規化した。
Ｐ２’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２’ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２’ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス（２０μｌ）を、１０ｍＭのペンタペプチドＣａｍ－エステルＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ及び１５ｍＭのＣ末端アミドＨ－Ａｌａ－Ｘｘｘ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＤＮＰ）Ｌｙｓ－ＮＨ２．２ＴＦＡ（ＤＮＰは、ジニトロフェニル保護基である）の最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）が補給された１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ８．５中の２０μｌの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計０．４μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の１０μＬのアリコートを抜き取り、１５０μＬのＭＳＡ／水（２／９８、ｖ／ｖ）によりクエンチし、３５０μｌの水により希釈し、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。データをスクリーニングにおいて得られた最大変換率に関して１００％に正規化した。
【0151】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ（ＢＳ１４９－ＤＭ ＰＨＮ Ｆ１８９Ｗ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ（ＢＳ１４９－ＤＭ ＰＨＮ Ｆ１８９Ｗ＋Ｎ２１８Ｄ）についてＰ２’基質範囲を、図５に示す。
【0152】
結論：Ｓ２’ポケット中で同定された単一の望ましい突然変異の組合せが相加効果を有し、さらにカップリング収率及びＰ２’基質範囲を改善する。
【0153】
実施例３
Ｐ２ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２ポケット基質特異性を決定するため、以下の標準反応を実施した。８００μＬのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を、１００μＬのトリペプチドＣ末端アミド原液（３００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＨ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ）及び２００μＬのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル原液（１．２ｍＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ＋１ｍＬのアセトニトリル）の混合物に添加した。Ｘｘｘ位におけるアミノ酸が異なるこれら全てのペプチドエステルとのカップリングを実施した。
Ｐ２ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２ポケット基質特異性を決定するため、以下の標準反応を実施した。８００μＬのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）を、１００μＬのトリペプチドＣ末端アミド原液（３００μＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＨ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ＮＨ２．２ＴＦＡ）及び２００μＬのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル原液（１．２ｍＬの水中の０．０１ｍｍｏｌのＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ＋１ｍＬのアセトニトリル）の混合物に添加した。Ｘｘｘ位におけるアミノ酸が異なるこれら全てのペプチドエステルとのカップリングを実施した。
【0154】
この混合物に、５．５μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の５５０μＬのアリコートを抜き取り、５００μＬのＭＳＡ／水（１／９９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。
【0155】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋１０７Ｖ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋１０７Ｖ＋Ｓ３３Ｄ／Ｔ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ＋Ｓ３３Ｄ／Ｔ）についてのＰ２基質範囲を、図３に示す。
【0156】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋１０７Ｖ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋１０７Ｖ＋Ｎ６２Ｄ／Ｓ／Ｗ／Ｙ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ＋Ｎ６２Ｄ／Ｓ／Ｗ／Ｙ）についてのＰ２基質範囲を、図４に示す。
【0157】
結論：突然変異Ｓ３３Ｄ及びＳ３３Ｔは、Ｐ２基質範囲及びカップリング効率に関して望ましい効果を有する。Ｓ３３Ｔと比較してＳ３３Ｄが良好である（図３）。
【0158】
突然変異Ｎ６２Ｄ及びＮ６２Ｓは、Ｐ２基質範囲及びカップリング効率に関して望ましい効果を有する。突然変異Ｎ６２Ｗ及びＮ６２Ｙは、規定の基質の集合についての優先性を有する（図４）。
【0159】
実施例４
Ｐ２ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス（１５μｌ）を、１０ｍＭのペンタペプチドＣａｍ－エステルＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ及び１０ｍＭのＣ末端アミドＨ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＤＮＰ）－Ｌｙｓ－ＮＨ２．２ＴＦＡの最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）が補給された１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ８．５中の５０μｌの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計０．２５μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の２５μＬのアリコートを抜き取り、４７５μＬのＭＳＡ／水（２／９８、ｖ／ｖ）によりクエンチし、５００μｌの水により希釈し、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。
Ｐ２ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのＰ２ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のＰ２ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス（１５μｌ）を、１０ｍＭのペンタペプチドＣａｍ－エステルＡｃ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｘｘｘ－Ｌｅｕ－ＯＣａｍ．ＴＦＡ及び１０ｍＭのＣ末端アミドＨ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＤＮＰ）－Ｌｙｓ－ＮＨ２．２ＴＦＡの最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、ＴＣＥＰ（トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、０．１ｍｇ／ｍｌ）が補給された１Ｍのトリシン緩衝液ｐＨ８．５中の５０μｌの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計０．２５μｇの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた（１５０ｒｐｍ）。３０分後、反応混合物の２５μＬのアリコートを抜き取り、４７５μＬのＭＳＡ／水（２／９８、ｖ／ｖ）によりクエンチし、５００μｌの水により希釈し、ＬＣ－ＭＳにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルピークを積分した。面積％産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステル及び残りのペンタペプチドＣ末端Ｃａｍ－エステルの量の合計により割ったものと定義する。
【0160】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｓ３３Ｄ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｄ）、ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｎ６２Ｓ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｎ６２Ｓ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｓ３３Ｄ＋Ｎ６２Ｓ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｄ＋Ｎ６２Ｓ）についてのＰ２基質範囲を、図６に示す。
【0161】
結論：Ｓ２ポケット中の突然変異（３３及び６２位）の組合せは、明らかな相乗効果を示す。Ｓ３３Ｄ＋Ｎ６２Ｓの組合せは、単一のＳ３３Ｄ又はＮ６２Ｓバリアントよりも優れている。さらに、組合せ突然変異体は、区別される特異性プロファイルも有する。
【0162】
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｓ３３Ｔ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｔ）、ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｎ６２Ｖ／Ｗ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｎ６２Ｖ／Ｗ）及びＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１８９Ｗ＋２１８Ｄ＋１０７Ｖ＋Ｓ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｖ／Ｗ（ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＷＤＶ Ｓ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｖ／Ｗ）についてのＰ２基質範囲を、図７に示す。
【0163】
結論：３３及び６２位の突然変異の組合せは、Ｐ２基質範囲に関して相乗効果を有する。Ｓ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｖ及びＳ３３Ｔ＋Ｎ６２Ｗの組合せは、単一のＳ３３Ｔ、Ｎ６２Ｖ又はＮ６２Ｗバリアントよりも優れている。
【0164】
実施例５
ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗを使用する２つの断片からのエキセナチドの合成
２つ組（ｄｕｐｌｏ）において、３００ｍｇのＨ－Ｈｉｓ１－Ｇｌｙ２－Ｇｌｕ３－Ｇｌｙ４－Ｔｈｒ５－Ｐｈｅ６－Ｔｈｒ７－Ｓｅｒ８－Ａｓｐ９－Ｌｅｕ１０－Ｓｅｒ１１－Ｌｙｓ１２－Ｇｌｎ１３－Ｍｅｔ１４－Ｇｌｕ１５－Ｇｌｕ１６－Ｇｌｕ１７－Ａｌａ１８－Ｖａｌ１９－Ａｒｇ２０－Ｌｅｕ２１－ＯＣａｍ－Ｌｅｕ－ＯＨ．３ＴＦＡ及び２００ｍｇのＨ－Ｐｈｅ２２－Ｉｌｅ２３－Ｇｌｕ２４－Ｔｒｐ２５－Ｌｅｕ２６－Ｌｙｓ２７－Ａｓｎ２８－Ｇｌｙ２９－Ｇｌｙ３０－Ｐｒｏ３１－Ｓｅｒ３２－Ｓｅｒ３３－Ｇｌｙ３４－Ａｌａ３５－Ｐｒｏ３６－Ｐｒｏ３７－Ｐｒｏ３８－Ｓｅｒ３９－ＮＨ２．２ＴＦＡを１ｍＬのリン酸緩衝液（０．２Ｍ）中で溶解させ、水性ＮａＯＨ（５Ｍ）を使用してｐＨを８．３に調整した。この混合物に、１００μＬのＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ（１ｍｇ／ｍＬ、実験１）又は１００μＬのＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗ（１ｍｇ／ｍＬ、実験２）を添加し、反応混合物を３７℃において振盪させた（２００ｒｐｍ）。６０分後、反応混合物を９ｍＬのＭＳＡ／水（１／９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。Ｃａｍ－エステル出発材料、加水分解したＣ末端Ｃａｍ－エステル及びエキセナチド産物ピークを積分した。エキセナチド産物の量は、ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ（実験１）について８９％（１１％の加水分解）及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗ（実験２）について９７％（３％の加水分解）であった。
ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗを使用する２つの断片からのエキセナチドの合成
２つ組（ｄｕｐｌｏ）において、３００ｍｇのＨ－Ｈｉｓ１－Ｇｌｙ２－Ｇｌｕ３－Ｇｌｙ４－Ｔｈｒ５－Ｐｈｅ６－Ｔｈｒ７－Ｓｅｒ８－Ａｓｐ９－Ｌｅｕ１０－Ｓｅｒ１１－Ｌｙｓ１２－Ｇｌｎ１３－Ｍｅｔ１４－Ｇｌｕ１５－Ｇｌｕ１６－Ｇｌｕ１７－Ａｌａ１８－Ｖａｌ１９－Ａｒｇ２０－Ｌｅｕ２１－ＯＣａｍ－Ｌｅｕ－ＯＨ．３ＴＦＡ及び２００ｍｇのＨ－Ｐｈｅ２２－Ｉｌｅ２３－Ｇｌｕ２４－Ｔｒｐ２５－Ｌｅｕ２６－Ｌｙｓ２７－Ａｓｎ２８－Ｇｌｙ２９－Ｇｌｙ３０－Ｐｒｏ３１－Ｓｅｒ３２－Ｓｅｒ３３－Ｇｌｙ３４－Ａｌａ３５－Ｐｒｏ３６－Ｐｒｏ３７－Ｐｒｏ３８－Ｓｅｒ３９－ＮＨ２．２ＴＦＡを１ｍＬのリン酸緩衝液（０．２Ｍ）中で溶解させ、水性ＮａＯＨ（５Ｍ）を使用してｐＨを８．３に調整した。この混合物に、１００μＬのＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ（１ｍｇ／ｍＬ、実験１）又は１００μＬのＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗ（１ｍｇ／ｍＬ、実験２）を添加し、反応混合物を３７℃において振盪させた（２００ｒｐｍ）。６０分後、反応混合物を９ｍＬのＭＳＡ／水（１／９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。Ｃａｍ－エステル出発材料、加水分解したＣ末端Ｃａｍ－エステル及びエキセナチド産物ピークを積分した。エキセナチド産物の量は、ＢＳ１４９－ＤＭＰＨＶ（実験１）について８９％（１１％の加水分解）及びＢＳ１４９－ＤＭＰＨＮＶ＋Ｆ１８９Ｗ（実験２）について９７％（３％の加水分解）であった。
【0165】
結論：突然変異Ｆ１８９Ｗは、カップリング効率及び反応収率に対して望ましい効果を有する。
【0166】
実施例６
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ＋１８９Ｗを使用するシクロチドＭｃｏＴＩ－ＩＩの合成
１ｍｇのＨ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－ＯＣａｍ－Ｌｅｕ－ＯＨを１ｍＬのリン酸緩衝液（１Ｍ）中で溶解させ、水性ＮａＯＨ（５Ｍ）を使用してｐＨを８．３に調整した。この混合物に、１０μＬのＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ＋１８９Ｗ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応混合物を周囲温度において静置しておいた。６０分後、反応混合物を９ｍＬのＭＳＡ／水（１／９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。Ｃａｍ－エステル出発材料、加水分解したＣａｍ－エステル及び環式ＭｃｏＴＩ－ＩＩ産物ピークを積分した。環式産物の量は、９３％（７％の加水分解）であった。
ＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ＋１８９Ｗを使用するシクロチドＭｃｏＴＩ－ＩＩの合成
１ｍｇのＨ－Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－ＯＣａｍ－Ｌｅｕ－ＯＨを１ｍＬのリン酸緩衝液（１Ｍ）中で溶解させ、水性ＮａＯＨ（５Ｍ）を使用してｐＨを８．３に調整した。この混合物に、１０μＬのＢＳ１４９－ＤＭ＋２２２Ｐ＋２１７Ｈ＋２２５Ｎ＋１０７Ｖ＋１８９Ｗ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応混合物を周囲温度において静置しておいた。６０分後、反応混合物を９ｍＬのＭＳＡ／水（１／９、ｖ／ｖ）によりクエンチし、ＬＣ－ＭＳにより分析した。Ｃａｍ－エステル出発材料、加水分解したＣａｍ－エステル及び環式ＭｃｏＴＩ－ＩＩ産物ピークを積分した。環式産物の量は、９３％（７％の加水分解）であった。
【0167】
配列
配列番号１：サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸－１０７～２７５をコードする野生型遺伝子
ＥＮＡ｜Ｋ０２４９６｜Ｋ０２４９６．１ Ｂ．サブチリシンＢＰＮ’バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
配列番号１：サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸－１０７～２７５をコードする野生型遺伝子
ＥＮＡ｜Ｋ０２４９６｜Ｋ０２４９６．１ Ｂ．サブチリシンＢＰＮ’バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）
【化3】
【0168】
配列番号２：野生型サブチリシンＢＰＮ’（成熟型）
＞ＳＵＢＴ＿ＢＡＣＡＭ サブチリシンＢＰＮ’バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）成熟型１～２７５
＞ＳＵＢＴ＿ＢＡＣＡＭ サブチリシンＢＰＮ’バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）成熟型１～２７５
【化4】
【0169】
配列番号３：Ｃａ２＋結合ループの欠失、Ｓ２２１突然変異（Ｓ２２１Ｘ）、Ｓ３３、Ｎ６２、Ｆ１８９、Ｎ２１８突然変異位置及びＰ２２５突然変異位置を有するサブチリシンＢＰＮ’バリアント
【化5】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】