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特許7246524医薬品としての３，５－ビス（フェニル）－１Ｈ－ヘテロアリール誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-16
(45)【発行日】2023-03-27
(54)【発明の名称】医薬品としての３，５－ビス（フェニル）－１Ｈ－ヘテロアリール誘導体
(51)【国際特許分類】
C07F 9/6518 20060101AFI20230317BHJP
C07F 9/6503 20060101ALI20230317BHJP
A61K 31/66 20060101ALI20230317BHJP
A61K 33/26 20060101ALI20230317BHJP
A61K 50/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230317BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230317BHJP
【ＦＩ】
C07F9/6518 CSP
C07F9/6503
A61K31/66
A61K33/26
A61K50/00 200
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021573819
(86)(22)【出願日】2020-06-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-29
(86)【国際出願番号】 CZ2020050045
(87)【国際公開番号】W WO2020253895
(87)【国際公開日】2020-12-24
【審査請求日】2021-12-10
(31)【優先権主張番号】19180438.4
(32)【優先日】2019-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521543532
【氏名又は名称】インスティテュート オブ バイオテクノロジー シーエーエス，ヴィ．ヴィ．アイ．
(73)【特許権者】
【識別番号】515296840
【氏名又は名称】スマート ブレイン エス．アール．オー．
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】トルクサ，ヤロスラフ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルナー，ルーカス
(72)【発明者】
【氏名】シュトゥルサ，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ブラシュコヴァー，クリスティナ
(72)【発明者】
【氏名】サンドヴァル アクーニャ，クリスティアン エイドリアン
【審査官】安藤 倫世
(56)【参考文献】
【文献】特表２００８－５０５０９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１５５６７９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ｃ０７Ｆ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式Ｉの化合物であって、【化1】
式中、
Ｚは、６～１６個の炭素原子を含むアルキレンから選択される直鎖状ヒドロカルビル鎖であり、
ここで、
－前記ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には、－ＣＨ２－基）は、任意で、１つ以上のフェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンによって置き換えられていてもよく、および／または
－前記ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には、－ＣＨ２－基）は、任意で、１つ以上のヘテロ原子、またはＯ、Ｓ、及びＮＨから選択される部分を含むヘテロ原子－によって置き換えられていてもよく、および／または
－前記ヒドロカルビル鎖原子は、＝Ｏ、及び＝Ｓからなる群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていなくてもよく、置換されていてもよく；
Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ のそれぞれは、独立して、Ｃ６～Ｃ１２アリール、及びＣ３～Ｃ８シクロアルキルから選択され；
Ｒ ４ 、Ｒ ５ およびＲ ６ のそれぞれは、ＣＨおよびＮから選択され、Ｒ ４ 、Ｒ ５ およびＲ ６ のうち少なくとも２つは、Ｎであり；
Ｘ－は、薬学的に許容可能なアニオンであり；
Ｙは、独立して、ＯＨ、及びＳＨからなる群から選択されるそれぞれの事象である、化合物。
【請求項2】
Ｚの前記アルキレンは、６～１４個の炭素原子、８～１２個の炭素原子、または１０～１５個の炭素原子を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｚは、アルキレン；１個の炭素原子が、フェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンによって置き換えられているアルキレン；１個の炭素原子が、ＮＨによって置き換えられているアルキレン；１個の炭素原子が、フェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンによって置き換えられ、１個の炭素原子が、ＮＨによって置き換えられ、１個の炭素原子が、＝Ｏによって置き換えられており、従って－（ヘテロ）－アリール－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－構造を形成するアルキレン；である、請求項１に記載の化合物。
【請求項4】
Ｒ
６
は、Ｎであり、Ｒ
４
およびＲ
５
のうち少なくとも１つもまた、Ｎである、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項5】
医薬品として使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項6】
癌の治療の方法において使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項7】
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、ＧＩＴ癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、中皮腫、肺癌および白血病から選択される癌の治療の方法において使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項8】
少なくとも１つの請求項１～４のいずれか１項に記載の一般式Ｉの化合物と、担体、溶媒、フィラー、バインダ、崩壊剤、被覆剤、グリダント、潤滑剤、防腐剤、香料、及び着色料からなる群から選択される少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む薬学的組成物。
【請求項9】
少なくとも１つの請求項１～４のいずれか１項に記載の一般式Ｉの化合物と、遷移金属および周期表のＩＩＩＡおよびＩＶＡ族の金属から選択される金属と、を含む、薬学的組成物。
【請求項10】
前記金属は、鉄である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
診断用の造影剤として使用するための、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
インビボでの癌を視覚化する方法において使用するための、請求項９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、新規な３，５－ビス（フェニル）－１Ｈ－ヘテロアリール誘導体、およびその医薬品としての使用、特に癌の治療のための使用に関する。
本発明は、新規な３，５－ビス（フェニル）－１Ｈ－ヘテロアリール誘導体、およびその医薬品としての使用、特に癌の治療のための使用に関する。
【0002】
〔背景技術〕
癌は、異常な細胞増殖に関する疾患である。癌の治療は、費用がかかる上、癌がかなりの頻度で標準的な化学療法による治療に耐性を示すために、常に成功するものではない。抗癌薬物療法が作用し得る作用メカニズムは多数存在する。これらのメカニズムには、抗増殖活性、アポトーシス誘導（または細胞死誘導）活性、鉄キレート活性、および抗遊走活性、ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生が含まれる。
癌は、異常な細胞増殖に関する疾患である。癌の治療は、費用がかかる上、癌がかなりの頻度で標準的な化学療法による治療に耐性を示すために、常に成功するものではない。抗癌薬物療法が作用し得る作用メカニズムは多数存在する。これらのメカニズムには、抗増殖活性、アポトーシス誘導（または細胞死誘導）活性、鉄キレート活性、および抗遊走活性、ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生が含まれる。
【0003】
細胞のＤＮＡ合成、代謝、成長、および増殖のために、全ての細胞が鉄を必要とする。鉄は、デオキシリボヌクレオチドの合成のためのリボヌクレオチドレダクターゼの触媒活性等の多くの酵素反応のために必要とされる、不可欠な微量元素である。鉄は、電子を授受して電子伝達系に関与することによって、ミトコンドリア内膜中に電気化学勾配を発生させるという能力のために、ミトコンドリアの呼吸にとっても不可欠である。癌細胞は、その増殖性および改変された代謝要求のために、鉄をより多く必要とするので、腫瘍増殖および進行において、鉄が重要な役割を担うことが予測される。近年、腫瘍始原細胞での鉄代謝における著しい変化および特定の鉄代謝に関する遺伝子シグネチャーが報告され、癌幹細胞様細胞における鉄の重要な役割が実証されている（(Rychtarcikova et al. (2017) Tumor-initiating cells of breast and prostate origin show alterations in the expression of genes related to iron metabolism. Oncotarget 8, 6376-6398）。
【0004】
重要なことには、癌細胞は、ＲＯＳの基底レベルが元来高いこと、および抗酸化防御メカニズムがほぼ飽和状態であることから、ＲＯＳ産生化合物に対してより敏感に反応すると思われる。従って、抗酸化防御を増加させる能力が非常に限られている癌細胞にとって、ＲＯＳの増加はいずれも有害であり、このアプローチが、抗癌療法を設計するために使用されている（Kim et al. (2016). ROS homeostasis and metabolism: a critical liaison for cancer therapy. Exp Mol Med 48, e269; Truksa et al. (2015). Mitochondrially targeted vitamin e succinate modulates expression of mitochondrial DNA transcripts and mitochondrial biogenesis. Antioxid Redox Signal 22, 883-900）。
【0005】
さらに、ヘムとＦｅＳとのクラスターを補因子として必要とする全てのタンパク質にとって、ミトコンドリアは、ヘムとＦｅＳとのクラスターの産生における代表的で重要な細胞小器官であることから（(Paul and Lill (2015). Biogenesis of cytosolic and nuclear iron-sulfur proteins and their role in genome stability. Biochim Biophys Acta 1853, 1528-1539）、ミトコンドリアの機構への障害のいずれも、代謝活性、呼吸およびＤＮＡ修復能力の低下をもたらし、それによって、細胞周期を停止させ、細胞がアポトーシスを行わず、生存している場合でも、増殖することを不可能にする。
【0006】
さらに、鉄と、マイトファジー（mitophagy）と呼ばれるプロセスを介したミトコンドリアの再利用と、の関連が引き起こされ、適応免疫系の活性化につながることから、鉄ハンドリングおよびマイトファジーが、発癌性プロセスを緩和し得ることが示唆される（Ziegler et al. (2018). Mitophagy in Intestinal Epithelial Cells Triggers Adaptive Immunity during Tumorigenesis. Cell 174, 88-101 e116）。
【0007】
近年、Novartisが、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（ＤＦＸ、Ｅｘｊａｄｅ、Ｄｅｓｉｒｏｘ、Ｄｅｆｒｉｊｅｔ、Ｄｅｓｉｆｅｒ、ＲａｓｉｒｏｘｐｉｎｅおよびＪａｄｅｎｕとして市販される）として知られる、新規のキレート剤を発表しており、これは２００５年に米国のＦＤＡによって承認されている（Tyagi et al. (2005). Deferasirox (ICL670; Exjade(R)), a Novel Orally Available Iron Chelator for Correction of Transfusion-Associated Iron Overload. Support Cancer Ther 2, 208-211）。ＤＦＸは、抗癌活性を有することが示されており、この抗癌活性はインビトロならびにインビボにおいて実証されている（Tury et al. (2018). The iron chelator deferasirox synergises with chemotherapy to treat triple-negative breast cancers. J Pathol 246, 103-114）。
【0008】
本発明の目的は、望ましくない全身的な効果を示すことなく、非常に低いレベル（ｎＭ）での細胞静止作用と、より高い濃度（μＭ）での細胞傷害効果と、を有する化合物を提供することである。本化合物の効果は、多様な作用機序に基づくべきである。
【0009】
〔本発明の開示〕
本発明は、一般式Ｉの新規の化合物を提供し、
本発明は、一般式Ｉの新規の化合物を提供し、
【0010】
【化1】
【0011】
式中、
Ｚは、２～２０個の炭素原子、好ましくは６～１６個の炭素原子、より好ましくは６～１４個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１２個の炭素原子、もっとも好ましくは１０個の炭素原子、または好ましくは８～１６個もしくは１０～１５個の炭素を含む、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンから選択される、直鎖状のヒドロカルビル鎖であり、
ここで、
－ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には－ＣＨ２－基）は、任意で、１つ以上の５員または６員の、芳香環またはヘテロ原子Ｏ、Ｓおよび／またはＮを含むヘテロ芳香環、によって置き換えられてもよく、前記芳香環またはヘテロ芳香環は、好ましくはフェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンから選択され、および／または
－ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には－ＣＨ２－基）は、任意で、
１つ以上のヘテロ原子、またはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ－ＯＨから選択される部分を含むヘテロ原子－、によって置き換えられていてもよく、および／または
－ヒドロカルビル鎖の原子は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ４アシルオキシ、Ｎ（ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキル）２（ここでアルキルは同じかまたは異なる）、フェニル、ベンジル、ＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、＝Ｎ－ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含む群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、置換されていなくてもよく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のそれぞれは、独立して、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ６～Ｃ１２－アリール－Ｃ１～Ｃ２－アルキル、Ｃ５～Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルを含む群から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のそれぞれは、任意で、（および他から独立して）、Ｃ１～Ｃ４アルキル；Ｃ１～Ｃ４アルコキシ；Ｃ１～Ｃ４アルキルチオ；Ｎ（ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキル）２（ここでアルキルは同じかまたは異なる）；ＯＨ；＝Ｏ；ＳＨ；＝Ｓ；＝Ｎ－ＯＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉを含む群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、ＣＨおよびＮから選択され、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうち少なくとも２つは、Ｎであり；
Ｘ－は、薬学的に許容可能なアニオンであり；
Ｙは、独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＨを含む群から選択されるそれぞれの事象である。
Ｚは、２～２０個の炭素原子、好ましくは６～１６個の炭素原子、より好ましくは６～１４個の炭素原子、さらにより好ましくは８～１２個の炭素原子、もっとも好ましくは１０個の炭素原子、または好ましくは８～１６個もしくは１０～１５個の炭素を含む、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンから選択される、直鎖状のヒドロカルビル鎖であり、
ここで、
－ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には－ＣＨ２－基）は、任意で、１つ以上の５員または６員の、芳香環またはヘテロ原子Ｏ、Ｓおよび／またはＮを含むヘテロ芳香環、によって置き換えられてもよく、前記芳香環またはヘテロ芳香環は、好ましくはフェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンから選択され、および／または
－ヒドロカルビル鎖中の１個以上の炭素原子（典型的には－ＣＨ２－基）は、任意で、
１つ以上のヘテロ原子、またはＯ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ－ＯＨから選択される部分を含むヘテロ原子－、によって置き換えられていてもよく、および／または
－ヒドロカルビル鎖の原子は、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ４アシルオキシ、Ｎ（ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキル）２（ここでアルキルは同じかまたは異なる）、フェニル、ベンジル、ＯＨ、＝Ｏ、ＳＨ、＝Ｓ、＝Ｎ－ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含む群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく、置換されていなくてもよく；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のそれぞれは、独立して、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ６～Ｃ１２－アリール－Ｃ１～Ｃ２－アルキル、Ｃ５～Ｃ１２ヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルを含む群から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のそれぞれは、任意で、（および他から独立して）、Ｃ１～Ｃ４アルキル；Ｃ１～Ｃ４アルコキシ；Ｃ１～Ｃ４アルキルチオ；Ｎ（ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキル）２（ここでアルキルは同じかまたは異なる）；ＯＨ；＝Ｏ；ＳＨ；＝Ｓ；＝Ｎ－ＯＨ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉを含む群から独立して選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよく；
Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、ＣＨおよびＮから選択され、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうち少なくとも２つは、Ｎであり；
Ｘ－は、薬学的に許容可能なアニオンであり；
Ｙは、独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＨを含む群から選択されるそれぞれの事象である。
【0012】
式Ｉの定義は、任意の、塩、溶媒和物、異性体および異性体の混合物を含むことを意図する。
【0013】
Ｘ－は、典型的には、無機酸または有機酸のアニオンから選択され、特に、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、炭酸塩、重炭酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホナート、安息香酸塩、ベシレート、重酒石酸塩、カンシラート、クエン酸塩、デカン酸塩、エデト酸塩、エシレート、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、ヘキサノエート、ヒドロキシナフトエート、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオネート、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデレート、メシレート、メチル硫酸塩、ムケート（mucate）、ナプシラート、オクタノエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモエート, パントテン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、テオクラート、トシラートが適しているが、任意の薬学的に許容可能な酸のアニオンが使用され得る。
【0014】
好ましい実施形態において、Ｒ６はＮであり、Ｒ４およびＲ５のうち少なくとも１つもまた、Ｎである。
【0015】
好ましい実施形態において、Ｚは、アルキレン：１個の炭素原子が５員または６員の、芳香環またはヘテロ原子Ｏ、Ｓおよび／またはＮを含むヘテロ芳香環、によって置き換えられているアルキレン；１個の炭素原子が、フェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンによって置き換えられているアルキレン；１個の炭素原子が、ＮＨによって置き換えられているアルキレン；１個の炭素原子が、フェニレン、トリアゾリレンまたはピリジレンによって置き換えられ、１個の炭素原子が、ＮＨによって置き換えられ、かつ１個の炭素原子が、＝Ｏによって置換されている、従って好ましくは－（ヘテロ）アリール－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－構造を形成しているアルキレン、から選択される。この好ましい実施形態において、Ｚは、任意でさらに置換されていてもよい。
【0016】
好ましい実施形態において、ＹはＨ、ＯＨ、ＦまたはＳＨである。最も好ましくは、ＹはＯＨである。
【0017】
さらに、本発明は、医薬品として使用するための、特に、癌の治療に使用するための、化合物を提供する。癌とは、例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、ＧＩＴ癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、中皮腫、肺癌および白血病を含み得る。
【0018】
本発明の化合物は、いくつかの独立したメカニズムによって作用する。これにより、化合物が、耐性を示す癌を含む多様なタイプの癌の治療に適するようになる。式Ｉの化合物の作用のメカニズムは、抗増殖活性、アポトーシス誘導（または細胞死誘導）活性、金属キレート活性、特に鉄キレート活性、および抗遊走活性を含む。これらの活性は、悪性細胞に対して選択性を有する。耐性を示す癌は、典型的には、特定の作用のメカニズムを介して作用する医薬品に対して耐性を示す。複数の作用の様式を有する本発明の化合物は、癌細胞が敏感に反応する異なる作用の様式を介して作用することで、これらの耐性を克服し得る。
【0019】
構造上部分的に類似する物質である、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して、本発明の代表的な化合物は、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘのＩＣ５０よりも３～４桁小さい、悪性細胞に対するＩＣ５０を示す。構造上類似する化合物である、タモキシフェンのトリフェニルホスホニウムデシル誘導体（ｍｉｔｏＴＡＸ、WO2014/173374）と比較して、本発明の代表的な化合物は、ｍｉｔｏＴＡＸの悪性細胞に対するＩＣ５０よりも１～２桁小さい、悪性細胞に対するＩＣ５０を示す。
【0020】
本発明の目的はまた、少なくとも１つの一般式Ｉの化合物と、担体、溶媒、フィラー、バインダ、崩壊剤、被覆剤、グリダント（glidant）、潤滑剤、防腐剤、香料、着色料等の少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む薬学的組成物である。
【0021】
さらに、本発明は、少なくとも１つの式Ｉの化合物と、金属と、を含む薬学的に許容可能な組成物を含む。前記金属は、好ましくは、遷移金属（周期表のＢ族、ランタニド、アクチニド）並びに周期表のＩＩＩＡおよびＩＶＡ族の金属から選択される。前記金属は、放射性核種または例えば放射線療法、バイオセンシング、バイオイメージング、薬物送達、遺伝子送達、光線力学療法のための、診断用薬剤または治療用薬剤としての使用に適した金属（特に、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、鉄、ガリウム、銅等の金属）であり得る。製剤中に存在する金属の総量の少なくとも一部分と、式Ｉの化合物の総量の少なくとも一部分とが、キレート錯体を形成し得る。
【0022】
よって、本発明の目的は、医薬品としての使用、特に癌の治療方法における使用のための、一般式Ｉの化合物、または少なくとも１つの式Ｉの化合物と金属（好ましくはガリウム）とを含む医薬製剤、である。
【0023】
本発明のさらなる目的は、癌の治療のための医薬品を製造するための、一般式Ｉの化合物の使用、または少なくとも１つの式Ｉの化合物と金属（好ましくはガリウム）とを含む医薬製剤の使用である。
【0024】
さらに、本発明の目的は、癌を患う対象に１つ以上の一般式Ｉの化合物を投与する、ヒトを含む哺乳類の治療方法である。
【0025】
本発明の目的はまた、診断に使用される造影剤として使用するための、特に、癌をインビボで視覚化する方法において使用するための、少なくとも１つの式Ｉの化合物と金属（好ましくはガリウム）とを含む、薬学的組成物である。このような製剤は、例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって視覚化され得る。
【0026】
〔本発明を実施するための実施例〕
［実施例１］
＝（１０－（４－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物１）＝
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３ｍｌ）中で、Ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（１１４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、１０－アミノデシルホスホニウムクロライドハイドロクロライド（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）（８８ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３２ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）と溶解させ、反応物を７２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、混合物をメタノール（ＭｅＯＨ）中に溶解し、クエン酸（５％）、ブラインおよびジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて抽出した。カラムクロマトグラフィ（２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって、淡黄色の発泡体として、２つの回転異性体として単離された式１の純粋な生成物を得た（２５ｍｇ、１０％）。
［実施例１］
＝（１０－（４－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物１）＝
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３ｍｌ）中で、Ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（１１４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、１０－アミノデシルホスホニウムクロライドハイドロクロライド（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）（８８ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３２ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）と溶解させ、反応物を７２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、混合物をメタノール（ＭｅＯＨ）中に溶解し、クエン酸（５％）、ブラインおよびジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて抽出した。カラムクロマトグラフィ（２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって、淡黄色の発泡体として、２つの回転異性体として単離された式１の純粋な生成物を得た（２５ｍｇ、１０％）。
【0027】
【化2】
【0028】
1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) δ 10.96 (bs, OH, 1H), 10.16 (bs, OH, 1H), 8.40 (bs, NH, 1H), 8.12 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.79 - 7.68 (m, 6H), 7.65 (s, 7H), 7.42 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 26.3, 7.7 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.00 (m, 2H), 6.74 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 3.46 (m, 4H), 1.79 - 1.48 (m, 6H), 1.26 (m, 10H)。
13C NMR (126 MHz, クロロホルム-d) δ 166.48, 159.61, 157.18, 156.65, 152.14, 139.81, 135.84, 135.10, 133.52 (d, J = 9.9 Hz), 132.60, 131.39, 130.52 (d, J = 12.4 Hz), 129.14, 128.79, 127.31, 124.61, 119.65, 19.24, 118.15 (d, J = 85.74 Hz), 117.95, 117.05, 113.65, 111.91, 40.17, 30.19, 30.06, 29.69, 29.00, 28.59, 28.50, 28.46, 26.61, 22.83, 22.51, 22.47。
Ｃ４９Ｈ５０Ｏ３Ｎ４Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値７７３．３６１５０、実測値７７３．３６１２８。
13C NMR (126 MHz, クロロホルム-d) δ 166.48, 159.61, 157.18, 156.65, 152.14, 139.81, 135.84, 135.10, 133.52 (d, J = 9.9 Hz), 132.60, 131.39, 130.52 (d, J = 12.4 Hz), 129.14, 128.79, 127.31, 124.61, 119.65, 19.24, 118.15 (d, J = 85.74 Hz), 117.95, 117.05, 113.65, 111.91, 40.17, 30.19, 30.06, 29.69, 29.00, 28.59, 28.50, 28.46, 26.61, 22.83, 22.51, 22.47。
Ｃ４９Ｈ５０Ｏ３Ｎ４Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値７７３．３６１５０、実測値７７３．３６１２８。
【0029】
［実施例２］
＝（１０－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（化合物２）＝
（１０－ブロモデシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（７５０ｍｇ、１．３３４ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン（６ｍｌ）と共に、２時間加熱した。反応混合物を、実験室の温度まで冷却し、Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）で希釈し、ＤＣＭで２回抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。粗物質を、濃縮し、真空下で乾燥し、エタノール（６ｍｌ）で希釈した。２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（３７７ｍｇ、１．５７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１．５時間還流した。反応混合物を真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（トルエン：メタノール、勾配１００：５～１００：１５）によって精製して、淡黄色の発泡体として、式２の生成物を得た（３３０ｍｇ、３０％）。
＝（１０－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（化合物２）＝
（１０－ブロモデシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（７５０ｍｇ、１．３３４ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン（６ｍｌ）と共に、２時間加熱した。反応混合物を、実験室の温度まで冷却し、Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）で希釈し、ＤＣＭで２回抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。粗物質を、濃縮し、真空下で乾燥し、エタノール（６ｍｌ）で希釈した。２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（３７７ｍｇ、１．５７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１．５時間還流した。反応混合物を真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（トルエン：メタノール、勾配１００：５～１００：１５）によって精製して、淡黄色の発泡体として、式２の生成物を得た（３３０ｍｇ、３０％）。
【0030】
【化3】
【0031】
1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 10.55 (s, 1H), 8.06 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.83 - 7.70 (m, 9H), 7.65 (td, J = 8.0, 3.4 Hz, 6H), 7.48 - 7.43 (m, 2H), 7.35 (ddd, J = 8.5, 7.2, 1.6 Hz, 1H), 7.31 - 7.25 (m, 2H), 7.22 - 7.16 (m, 1H), 6.99 (ddd, J = 7.3, 6.5, 1.0 Hz, 2H), 6.95 (td, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.64 (td, J = 12.6, 5.1 Hz, 2H), 1.96 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 - 1.50 (m, 4H), 1.35 - 1.28 (m, 2H), 1.28 - 1.10 (m, 8H)。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 159.10, 156.71, 156.55, 152.15, 134.96 (d, J = 3.0 Hz), 133.58 (d, J = 10.7 Hz), 132.20, 130.85, 130.43 (d, J = 12.5 Hz), 128.23, 126.93, 119.48, 119.40, 118.27 (d, J = 85.8 Hz), 117.97, 116.90, 114.28, 112.61, 50.23, 30.12 (d, J = 15.8 Hz), 29.28, 28.73 (オーバーラップ), 28.68 (d, J = 1.1 Hz), 26.18, 22.80, 22.51, 22.48 (オーバーラップ), 22.47。
Ｃ４２Ｈ４５Ｏ２Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５４．３２４３９、実測値６５４．３２４４３。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 159.10, 156.71, 156.55, 152.15, 134.96 (d, J = 3.0 Hz), 133.58 (d, J = 10.7 Hz), 132.20, 130.85, 130.43 (d, J = 12.5 Hz), 128.23, 126.93, 119.48, 119.40, 118.27 (d, J = 85.8 Hz), 117.97, 116.90, 114.28, 112.61, 50.23, 30.12 (d, J = 15.8 Hz), 29.28, 28.73 (オーバーラップ), 28.68 (d, J = 1.1 Hz), 26.18, 22.80, 22.51, 22.48 (オーバーラップ), 22.47。
Ｃ４２Ｈ４５Ｏ２Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５４．３２４３９、実測値６５４．３２４４３。
【0032】
［実施例３］
＝２，２’－（１－（９－ヒドロキシノニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－３，５－ジイル）ジフェノール（化合物３）＝
１０－ブロモー１－ノナノール（１１７ｍｇ、０．５２４ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン（２ｍｌ）と混合し、８０℃で２時間、勢いよく撹拌した。反応物を、実験室の温度まで冷却し、水（２０ｍｌ）を加えた。混合物を、ＤＣＭ（１５ｍｌ）で３回抽出した。粗物質を、真空下で濃縮し、エタノール（４ｍｌ）で希釈して、２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（１８７ｍｇ、０．７８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、８０℃で３時間加熱した。粗生成物を、真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール、勾配１００：０～１００：１）によって精製して、淡黄色の発泡体として、式３の生成物を得た（７０ｍｇ、２４％）。
＝２，２’－（１－（９－ヒドロキシノニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－３，５－ジイル）ジフェノール（化合物３）＝
１０－ブロモー１－ノナノール（１１７ｍｇ、０．５２４ｍｍｏｌ）を、ヒドラジン（２ｍｌ）と混合し、８０℃で２時間、勢いよく撹拌した。反応物を、実験室の温度まで冷却し、水（２０ｍｌ）を加えた。混合物を、ＤＣＭ（１５ｍｌ）で３回抽出した。粗物質を、真空下で濃縮し、エタノール（４ｍｌ）で希釈して、２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（１８７ｍｇ、０．７８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、８０℃で３時間加熱した。粗生成物を、真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール、勾配１００：０～１００：１）によって精製して、淡黄色の発泡体として、式３の生成物を得た（７０ｍｇ、２４％）。
【0033】
【化4】
【0034】
1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 11.18 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.10 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 7.46 (ddd, J = 8.3, 7.3, 1.6 Hz, 1H), 7.37 (ddd, J = 8.3, 7.2, 1.7 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 8.3, 1.1 Hz, 1H), 7.04 (qd, J = 7.9, 1.1 Hz, 2H), 4.47 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.11 - 1.99 (m, 2H), 1.61 - 1.54 (m, 2H), 1.47 - 1.41 (m, 2H), 1.40 - 1.28 (m, 8H)。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 158.47, 157.54, 156.30, 151.80, 132.53, 131.33, 127.29, 126.67, 119.76, 119.46, 118.33, 116.94, 113.72, 110.93, 62.97, 50.81, 32.65, 29.51, 29.24, 29.16, 28.87, 26.38, 25.60。
Ｃ２３Ｈ３０Ｏ３Ｎ３＋についてのＨＲＭＳ：計算値３９６．２２８１７、実測値３９６．２２７７１。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 158.47, 157.54, 156.30, 151.80, 132.53, 131.33, 127.29, 126.67, 119.76, 119.46, 118.33, 116.94, 113.72, 110.93, 62.97, 50.81, 32.65, 29.51, 29.24, 29.16, 28.87, 26.38, 25.60。
Ｃ２３Ｈ３０Ｏ３Ｎ３＋についてのＨＲＭＳ：計算値３９６．２２８１７、実測値３９６．２２７７１。
【0035】
［実施例４］
＝（１０－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）デシル）トリシクロヘキシルホスホニウムブロマイド＝
化合物３（４０ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍｌ）中に溶解し、０～４℃まで冷却して、トリフェニルホスフィンジブロマイド（１７１ｍｇ、０．４０４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応混合物を実験室の温度まで温め、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍｌ）を加えた。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応物を、Ｈ２Ｏ（０．２ｍｌ）でクエンチし、ＤＭＦ（２ｍｌ）を加えた。Ｈ２ＯおよびＤＩＰＥＡを、真空下で部分的に除去し、トリシクロヘキシルホスフィン（１ｇ、３．５６６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、真空下、９０℃で１時間加熱し、次いで不活性雰囲気下で、一晩加熱し続けた。反応混合物を、実験室の温度まで冷却し、冷却した混合物を、低温（４℃）のジエチルエーテル（２００ｍｌ）に滴下して加えた。白色の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、粗生成物をカラムクロマトグラフィで精製して、式４の生成物を得た（３０ｍｇ、４０％）。
＝（１０－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）デシル）トリシクロヘキシルホスホニウムブロマイド＝
化合物３（４０ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍｌ）中に溶解し、０～４℃まで冷却して、トリフェニルホスフィンジブロマイド（１７１ｍｇ、０．４０４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応混合物を実験室の温度まで温め、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍｌ）を加えた。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応物を、Ｈ２Ｏ（０．２ｍｌ）でクエンチし、ＤＭＦ（２ｍｌ）を加えた。Ｈ２ＯおよびＤＩＰＥＡを、真空下で部分的に除去し、トリシクロヘキシルホスフィン（１ｇ、３．５６６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、真空下、９０℃で１時間加熱し、次いで不活性雰囲気下で、一晩加熱し続けた。反応混合物を、実験室の温度まで冷却し、冷却した混合物を、低温（４℃）のジエチルエーテル（２００ｍｌ）に滴下して加えた。白色の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、粗生成物をカラムクロマトグラフィで精製して、式４の生成物を得た（３０ｍｇ、４０％）。
【0036】
【化5】
【0037】
1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 10.80 (s, 1H), 8.09 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.58 - 7.52 (m, 1H), 7.44 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.42 - 7.32 (m, 2H), 7.30 (ddd, J = 8.7, 7.2, 1.7 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 8.3, 1.1 Hz, 1H), 7.00 - 6.97 (m, 1H), 6.96 (dd, J = 7.5, 1.1 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.55 - 2.44 (m, 3H), 2.39 (dt, J = 19.3, 6.4 Hz, 2H), 2.02 - 1.90 (m, 8H), 1.90 - 1.83 (m, 6H), 1.81 - 1.69 (m, 4H), 1.57 - 1.16 (m, 27H)。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 159.32, 156.63, 156.55, 152.31, 132.12, 130.78, 128.52, 126.82, 119.46, 119.34, 117.85, 116.91, 114.37, 113.01, 49.96, 30.68 (d, J = 13.8 Hz), 29.90 (d, J = 40.4 Hz), 29.07, 28.36 (d, J = 17.2 Hz), 27.95, 27.17, 27.14, 26.50, 26.42, 25.76, 25.40, 22.50 (d, J = 5.4 Hz), 15.73 (d, J = 42.6 Hz)。
Ｃ４１Ｈ６１Ｏ２Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５８．４４９５９、実測値６５８．４４９４５。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 159.32, 156.63, 156.55, 152.31, 132.12, 130.78, 128.52, 126.82, 119.46, 119.34, 117.85, 116.91, 114.37, 113.01, 49.96, 30.68 (d, J = 13.8 Hz), 29.90 (d, J = 40.4 Hz), 29.07, 28.36 (d, J = 17.2 Hz), 27.95, 27.17, 27.14, 26.50, 26.42, 25.76, 25.40, 22.50 (d, J = 5.4 Hz), 15.73 (d, J = 42.6 Hz)。
Ｃ４１Ｈ６１Ｏ２Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５８．４４９５９、実測値６５８．４４９４５。
【0038】
［実施例５］
＝４－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ヒドラジンイル）安息香酸（化合物５）＝
４－ヒドラジノ安息香酸（4-hydrazinobenzoic acid）（５００ｍｇ、３．２８６ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ無水物（７２０ｍｇ、３．２９９ｍｍｏｌ、Ｂｏｃ＝ジ（ｔｅｒｔ－ブチル）ジカーボネート）を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中に溶解し、ＤＩＰＥＡ（１ｍｌ）を加えて、反応混合物を１時間撹拌した。反応混合物を、濃縮し、真空下で乾燥した。粗物質を、カラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール、１００：１０）上で精製して、黄色みがかった発泡体の状態の式５の生成物を得た（６９０ｍｇ、７９％）。
＝４－（２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ヒドラジンイル）安息香酸（化合物５）＝
４－ヒドラジノ安息香酸（4-hydrazinobenzoic acid）（５００ｍｇ、３．２８６ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ無水物（７２０ｍｇ、３．２９９ｍｍｏｌ、Ｂｏｃ＝ジ（ｔｅｒｔ－ブチル）ジカーボネート）を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中に溶解し、ＤＩＰＥＡ（１ｍｌ）を加えて、反応混合物を１時間撹拌した。反応混合物を、濃縮し、真空下で乾燥した。粗物質を、カラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール、１００：１０）上で精製して、黄色みがかった発泡体の状態の式５の生成物を得た（６９０ｍｇ、７９％）。
【0039】
【化6】
【0040】
1H NMR (600 MHz, メタノール-d4) δ 7.88 - 7.76 (m, 2H), 6.78 - 6.65 (m, 2H), 1.46 (s, 6H)。
13C NMR (151 MHz, メタノール-d4) δ 170.37, 158.67, 154.93, 132.45, 121.78, 112.01, 81.54, 28.63。
Ｃ１２Ｈ１７Ｏ４Ｎ２＋についてのＨＲＭＳ：計算値２５３．１１８２８、実測値２５３．１１７７９。
13C NMR (151 MHz, メタノール-d4) δ 170.37, 158.67, 154.93, 132.45, 121.78, 112.01, 81.54, 28.63。
Ｃ１２Ｈ１７Ｏ４Ｎ２＋についてのＨＲＭＳ：計算値２５３．１１８２８、実測値２５３．１１７７９。
【0041】
［実施例６］
＝（１０－アンモニオデシル）トリフェニルホスホニウムクロライドハイドロクロライド（化合物６）＝
（１０－ブロモデシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（９．２６ｇ、１６．４４８ｍｍｏｌ）を、メタノール中の７Ｍのアンモニア溶液（６０ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を５０℃で撹拌した。６時間後、メタノール中のアンモニア（４０ｍｌ）をさらに加えて、反応混合物を、５０℃でさらに２４時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をシリカゲル（２００ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール メタノールの勾配０～１０％）を用いて精製した。生成物をＨＣｌ（３６％、５ｍｌ）で酸性化し、クロライド形態のＤｏｗｅｘ １×８（５０ｇ）を介して濾過して、所望の式６の（１０－アミノデシル）トリフェニルホスホニウムクロライドハイドロクロライドを得た（５．１３５ｇ、６３％）。
＝（１０－アンモニオデシル）トリフェニルホスホニウムクロライドハイドロクロライド（化合物６）＝
（１０－ブロモデシル）トリフェニルホスホニウムブロマイド（９．２６ｇ、１６．４４８ｍｍｏｌ）を、メタノール中の７Ｍのアンモニア溶液（６０ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を５０℃で撹拌した。６時間後、メタノール中のアンモニア（４０ｍｌ）をさらに加えて、反応混合物を、５０℃でさらに２４時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物をシリカゲル（２００ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール メタノールの勾配０～１０％）を用いて精製した。生成物をＨＣｌ（３６％、５ｍｌ）で酸性化し、クロライド形態のＤｏｗｅｘ １×８（５０ｇ）を介して濾過して、所望の式６の（１０－アミノデシル）トリフェニルホスホニウムクロライドハイドロクロライドを得た（５．１３５ｇ、６３％）。
【0042】
【化7】
【0043】
1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) δ 7.92 - 7.85 (m, 3H), 7.85 - 7.68 (m, 12H), 3.46 - 3.37 (m, 2H), 2.90 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.72 - 1.60 (m, 4H), 1.56 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.43 -1.20 (m, 12H)
13C NMR (126 MHz, メタノール-d4) δ 136.23 (d, J = 3.0 Hz), 134.79 (d, J = 9.9 Hz), 131.51 (d, J = 12.5 Hz), 120.00 (d, J = 86.3 Hz), 40.76, 31.59 (d, J = 16.2 5 Hz), 30.29 (2C), 30.12, 29.89, 28.53, 27.42, 23.57 (d, J = 4.4 Hz), 22.68 (d, J = 51.1 Hz)。
IR (ＫＢｒペレット): ν = 3051, 3007, 2927, 2854, 2006, 1825, 1601, 1587, 1485, 1465, 1438,
1402, 1337, 1318, 1189, 1161, 1113, 996, 751, 723, 691。
Ｃ２８Ｈ３７ＮＰ＋についてのＨＲＭＳ：計算値４１８．２６５８１、実測値４１８．２６５６７。
13C NMR (126 MHz, メタノール-d4) δ 136.23 (d, J = 3.0 Hz), 134.79 (d, J = 9.9 Hz), 131.51 (d, J = 12.5 Hz), 120.00 (d, J = 86.3 Hz), 40.76, 31.59 (d, J = 16.2 5 Hz), 30.29 (2C), 30.12, 29.89, 28.53, 27.42, 23.57 (d, J = 4.4 Hz), 22.68 (d, J = 51.1 Hz)。
IR (ＫＢｒペレット): ν = 3051, 3007, 2927, 2854, 2006, 1825, 1601, 1587, 1485, 1465, 1438,
1402, 1337, 1318, 1189, 1161, 1113, 996, 751, 723, 691。
Ｃ２８Ｈ３７ＮＰ＋についてのＨＲＭＳ：計算値４１８．２６５８１、実測値４１８．２６５６７。
【0044】
［実施例７］
＝（１０－（２，４－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物７）＝
化合物５（１００ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）、化合物６（３８９ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（２５５ｍｇ、０．７９４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（０．５５ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物を、氷冷したジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）（５０ｍｌ）に滴下して加え、氷浴中で撹拌すると、フラスコの壁上に油状の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、沈殿物をメタノール（３ｍＬ）中に溶解させ、ＮＨ４Ｃｌの半飽和溶液（１０ｍＬ）で希釈した。得られた乳白色の溶液を、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。同一の抽出手順（３ｍＬのメタノール、１０ｍＬ ＮＨ４Ｃｌ、３×１５ｍＬ ＤＣＭ）を２回以上繰り返した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール メタノールの勾配０～１０％）によって精製して、黄色みがかった発泡体として、式７の生成物を得た（１７０ｍｇ、６２％）。
＝（１０－（２，４－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物７）＝
化合物５（１００ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）、化合物６（３８９ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（２５５ｍｇ、０．７９４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（０．５５ｍｌ、３．９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を２時間撹拌した。反応混合物を、氷冷したジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）（５０ｍｌ）に滴下して加え、氷浴中で撹拌すると、フラスコの壁上に油状の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、沈殿物をメタノール（３ｍＬ）中に溶解させ、ＮＨ４Ｃｌの半飽和溶液（１０ｍＬ）で希釈した。得られた乳白色の溶液を、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）抽出した。複合有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。同一の抽出手順（３ｍＬのメタノール、１０ｍＬ ＮＨ４Ｃｌ、３×１５ｍＬ ＤＣＭ）を２回以上繰り返した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール メタノールの勾配０～１０％）によって精製して、黄色みがかった発泡体として、式７の生成物を得た（１７０ｍｇ、６２％）。
【0045】
【化8】
【0046】
1H NMR (600 MHz, メタノール-d4) δ 7.93 - 7.74 (m, 15H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 - 6.75 (m, 2H), 3.44 - 3.37 (m, 2H), 1.67 (h, J = 8.2 Hz, 2H), 1.59 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.55 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.51 (s, 6H), 1.33 (d, J = 24.7 Hz, 12H)。
13C NMR (151 MHz, メタノール-d4) δ 168.69, 157.33, 152.31, 134.85, 133.39 (d, J = 10.0 Hz), 130.09 (d, J = 12.6 Hz), 128.20, 124.42, 118.88, 118.31, 110.92, 39.39, 30.11 (d, J = 16.1 Hz), 29.14, 28.93, 28.81 (d, J = 7.1 Hz), 28.34, 27.23, 26.54, 22.13 - 21.97 (m), 21.32, 20.99。
Ｃ４０Ｈ５１Ｏ３Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５２．３６６２６、実測値６５２．３６５９６。
13C NMR (151 MHz, メタノール-d4) δ 168.69, 157.33, 152.31, 134.85, 133.39 (d, J = 10.0 Hz), 130.09 (d, J = 12.6 Hz), 128.20, 124.42, 118.88, 118.31, 110.92, 39.39, 30.11 (d, J = 16.1 Hz), 29.14, 28.93, 28.81 (d, J = 7.1 Hz), 28.34, 27.23, 26.54, 22.13 - 21.97 (m), 21.32, 20.99。
Ｃ４０Ｈ５１Ｏ３Ｎ３Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値６５２．３６６２６、実測値６５２．３６５９６。
【0047】
［実施例８］
＝２－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）安息香酸（化合物８）＝
２－ヒドラジノ安息香酸ハイドロクロライド（２００ｍｇ、１．０６０ｍｍｏｌ）および２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（２３１ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を７０℃で加熱した。Ｅｔ３Ｎ（０．２８ｍｌ、２．００１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、４時間撹拌して、次いで水（５ｍｌ）を加えた。ＥｔＯＨを蒸発させ、６ＭのＨＣｌ（３ｍｌ）を加えた。粗生成物が、淡黄色の固体として沈殿した。シリカゲル（３０ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール、メタノールの勾配０～５％）を用いて、淡黄色の発泡体として、式８の純粋な生成物を得た（３３３ｍｇ、９２％）。
＝２－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）安息香酸（化合物８）＝
２－ヒドラジノ安息香酸ハイドロクロライド（２００ｍｇ、１．０６０ｍｍｏｌ）および２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（２３１ｍｇ、０．９６６ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を７０℃で加熱した。Ｅｔ３Ｎ（０．２８ｍｌ、２．００１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、４時間撹拌して、次いで水（５ｍｌ）を加えた。ＥｔＯＨを蒸発させ、６ＭのＨＣｌ（３ｍｌ）を加えた。粗生成物が、淡黄色の固体として沈殿した。シリカゲル（３０ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（クロロホルム／メタノール、メタノールの勾配０～５％）を用いて、淡黄色の発泡体として、式８の純粋な生成物を得た（３３３ｍｇ、９２％）。
【0048】
【化9】
【0049】
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.00 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H), 7.73 (td, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H), 7.66 - 7.60 (m, 2H), 7.36 (ddd, J = 8.3, 7.2, 1.7 Hz, 1H), 7.29 (ddd, J = 8.3, 7.3, 1.8 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 8.3, 1.1 Hz, 1H), 6.99 (td, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 6.87 (dd, J = 8.3, 1.0 Hz, 1H), 6.82 (td, J = 7.6, 1.1 Hz, 1H)。
13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.28, 159.63, 156.72, 156.20, 153.33, 136.99, 132.57, 131.63, 131.04 (d, J = 23.5 Hz), 130.46, 128.77, 127.10, 120.03, 119.40, 117.41, 116.71, 114.37, 113.95。
Ｃ２１Ｈ１６Ｏ４Ｎ３＋についてのＨＲＭＳ：計算値３７４．１１３５３、実測値３７４．１１３２４。
13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.28, 159.63, 156.72, 156.20, 153.33, 136.99, 132.57, 131.63, 131.04 (d, J = 23.5 Hz), 130.46, 128.77, 127.10, 120.03, 119.40, 117.41, 116.71, 114.37, 113.95。
Ｃ２１Ｈ１６Ｏ４Ｎ３＋についてのＨＲＭＳ：計算値３７４．１１３５３、実測値３７４．１１３２４。
【0050】
［実施例９］
＝（１０－（２－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物９）＝
化合物８（１２０ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）、化合物６（３２０ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２３ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．２２ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、反応物を２時間撹拌した。反応混合物を氷冷したＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）中に滴下して加えることで、粗生成物が沈殿した。粗生成物を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）およびクエン酸（５％、３ｍＬ）および半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）中で溶解し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。カラムクロマトグラフィ（トルエン／メタノール、勾配１００：５～１００：２０）によって、淡黄色の発泡体として、式９の純粋な生成物を得た（３４ｍｇ、１３％）。
＝（１０－（２－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物９）＝
化合物８（１２０ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）、化合物６（３２０ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２３ｍｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．２２ｍｌ、１．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、反応物を２時間撹拌した。反応混合物を氷冷したＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）中に滴下して加えることで、粗生成物が沈殿した。粗生成物を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）およびクエン酸（５％、３ｍＬ）および半飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）中で溶解し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。カラムクロマトグラフィ（トルエン／メタノール、勾配１００：５～１００：２０）によって、淡黄色の発泡体として、式９の純粋な生成物を得た（３４ｍｇ、１３％）。
【0051】
【化10】
【0052】
1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 10.55 (s, 1H), 8.14 (dd, J = 7.8, 1.7 Hz, 1H), 7.80 (ddd, J = 19.6, 14.1, 8.1 Hz, 9H), 7.69 (td, J = 7.7, 3.3 Hz, 6H), 7.53 - 7.48 (m, 1H), 7.46 - 7.29 (m, 7H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.19 - 7.11 (m, 1H), 7.09 (dd, J = 7.9, 1.1 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 8.2, 1.1 Hz, 1H), 6.94 (ddd, J = 8.1, 7.3, 1.1 Hz, 1H), 6.81 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.19 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1.90 - 1.61 (m, 2H), 1.60 - 1.48 (m, 2H), 1.46 - 1.06 (m, 12H)。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 166.54, 160.31 , 156.76 , 156.47 , 153.04 , 135.03 (d, J = 2.9 Hz), 134.96 , 134.22 , 133.51 (d, J = 9.9 Hz), 132.01 , 131.06 , 130.43 (d, J = 12.5 Hz), 128.96 , 128.56 , 127.36 , 126.26 , 119.43 , 119.11 , 118.30 (d, J = 85.8 Hz), 117.69 , 116.94 , 113.88 , 112.87 , 39.77 , 29.69 , 29.52 (d, J = 16.0 Hz), 28.33 , 28.04 , 28.03 , 27.92 , 27.66 , 25.93 , 22.15 (d, J = 33.7 Hz)。
Ｃ４９Ｈ５０Ｏ３Ｎ４Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値７７３．３６１５０、実測値７７３．３６１３４。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 166.54, 160.31 , 156.76 , 156.47 , 153.04 , 135.03 (d, J = 2.9 Hz), 134.96 , 134.22 , 133.51 (d, J = 9.9 Hz), 132.01 , 131.06 , 130.43 (d, J = 12.5 Hz), 128.96 , 128.56 , 127.36 , 126.26 , 119.43 , 119.11 , 118.30 (d, J = 85.8 Hz), 117.69 , 116.94 , 113.88 , 112.87 , 39.77 , 29.69 , 29.52 (d, J = 16.0 Hz), 28.33 , 28.04 , 28.03 , 27.92 , 27.66 , 25.93 , 22.15 (d, J = 33.7 Hz)。
Ｃ４９Ｈ５０Ｏ３Ｎ４Ｐ＋についてのＨＲＭＳ：計算値７７３．３６１５０、実測値７７３．３６１３４。
【0053】
［実施例１０］
＝（１０－（２，４－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物１０）＝
２－ブロモ－２’－ヒドロキシアセトフェノン（１０８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、化合物６（１３８ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物を、９０℃で３時間加熱した。次いで、サリチルアルデヒド（１２２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（７７ｍｇ、１．０ｍｏｌ）を加えた。混合物を、一晩、（９０℃）で加熱した。ＴＬＣ分析（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ １００：１０：１）は、複合反応混合物の形成を示した。ここでは、５％のＦｅＣｌ３溶液によって、生成物を視覚化することができる。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で希釈した。反応槽の璧上に、褐色の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、沈殿物を、メタノール（３ｍｌ）中に溶解した。粗生成物のメタノール溶液に、塩化アンモニウムの半飽和溶液（１５ｍｌ）を添加すると、乳白色のエマルジョンが形成された。エマルジョンを、ジクロロメタン（３×５０ｍｌ）によって抽出し、複合有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。次いで、有機層を真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（１０ｍｌのシリカ、トルエン／メタノール１００：５～１００：２０）に供した。黄色の油の形態の式１０の生成物の複合画分を得た（２３ｍｇ、１１％）。
＝（１０－（２，４－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル）デシル）トリフェニルホスホニウムクロライド（化合物１０）＝
２－ブロモ－２’－ヒドロキシアセトフェノン（１０８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２ｍＬ）に、化合物６（１３８ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物を、９０℃で３時間加熱した。次いで、サリチルアルデヒド（１２２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（７７ｍｇ、１．０ｍｏｌ）を加えた。混合物を、一晩、（９０℃）で加熱した。ＴＬＣ分析（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ １００：１０：１）は、複合反応混合物の形成を示した。ここでは、５％のＦｅＣｌ３溶液によって、生成物を視覚化することができる。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で希釈した。反応槽の璧上に、褐色の沈殿物が形成された。溶媒をデカントし、沈殿物を、メタノール（３ｍｌ）中に溶解した。粗生成物のメタノール溶液に、塩化アンモニウムの半飽和溶液（１５ｍｌ）を添加すると、乳白色のエマルジョンが形成された。エマルジョンを、ジクロロメタン（３×５０ｍｌ）によって抽出し、複合有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。次いで、有機層を真空下で濃縮し、カラムクロマトグラフィ（１０ｍｌのシリカ、トルエン／メタノール１００：５～１００：２０）に供した。黄色の油の形態の式１０の生成物の複合画分を得た（２３ｍｇ、１１％）。
【0054】
【化11】
【0055】
1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d) δ 11.67 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.7, 1.6 Hz, 1H), 7.83 - 7.70 (m, 10H), 7.55 (td, J = 8.2, 3.6 Hz, 6H), 7.54 - 7.39 (m, 2H), 7.30 (ddd, J = 8.4, 7.3, 1.8 Hz, 1H), 7.30 - 7.20 (m, 2H), 7.20 - 7.16 (m, 1H), 6.83 (ddd, J = 7.1, 6.4, ≒1.0 Hz, 2H), 6.85 (td, J = 7.4, ≒1.1 Hz, 1H), 4.15 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.60 (td, J = 11.9, 5.5 Hz, 2H), 1.99 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.45 (m, 4H), 1.38 - 1.27 (m, 2H), 1.25 - 1.10 (m, 8H)。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 157.20, 154.88, 153.75, 142.61, 135.72 (d, J = 3.1 Hz), 132.33 (d, J = 11.5 Hz), 133.54, 131.62, 129.12 (d, J = 12.5 Hz), 127.47, 126.8, 119.48, 117.40, 117.16 (d, J = 87.1 Hz), 116.90, 116.22, 114.28, 113.66, 48.49, 30.69 (d, J = 16.3 Hz), オーバーラップ (28.12, 28.11, 28.05), 26.00, 23.00, 22.38, 22.28 (オーバーラップ), 21.12。
13C NMR (151 MHz, クロロホルム-d) δ 157.20, 154.88, 153.75, 142.61, 135.72 (d, J = 3.1 Hz), 132.33 (d, J = 11.5 Hz), 133.54, 131.62, 129.12 (d, J = 12.5 Hz), 127.47, 126.8, 119.48, 117.40, 117.16 (d, J = 87.1 Hz), 116.90, 116.22, 114.28, 113.66, 48.49, 30.69 (d, J = 16.3 Hz), オーバーラップ (28.12, 28.11, 28.05), 26.00, 23.00, 22.38, 22.28 (オーバーラップ), 21.12。
【0056】
［実施例１１］
＝（１０－（４－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウム（化合物１）＝
化合物６（５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１ｍｌ）中に溶解し、ＴＦＡ（１ｍｌ）を滴下して加えた。反応混合物を２．５時間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を、エタノール（２ｍｌ）中に溶解した。反応混合物に、２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（３５ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、Ｅｔ３Ｎ（０．０２ｍｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を７０℃に加熱し、２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。混合物を、ＭｅＯＨ中に溶解し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水およびＤＣＭで３回抽出した。シリカゲル（１２ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（トルエン／メタノール、メタノールの勾配０～１０％）によって、淡黄色の発泡体として、純粋な生成物を得た（３４ｍｇ、５７％）。
＝（１０－（４－（３，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）ベンズアミド）デシル）トリフェニルホスホニウム（化合物１）＝
化合物６（５０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（１ｍｌ）中に溶解し、ＴＦＡ（１ｍｌ）を滴下して加えた。反応混合物を２．５時間撹拌し、次いで、溶媒を蒸発させて、残渣を、エタノール（２ｍｌ）中に溶解した。反応混合物に、２－（２－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，３］オキサジン－４－オン（３５ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、Ｅｔ３Ｎ（０．０２ｍｌ、０．１５ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を７０℃に加熱し、２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。混合物を、ＭｅＯＨ中に溶解し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水およびＤＣＭで３回抽出した。シリカゲル（１２ｍｌ）カラムクロマトグラフィ（トルエン／メタノール、メタノールの勾配０～１０％）によって、淡黄色の発泡体として、純粋な生成物を得た（３４ｍｇ、５７％）。
【0057】
【化12】
【0058】
［実施例１２］
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（ＤＦＸ）の、エストロゲン依存性乳癌を代表する悪性乳癌ＭＣＦ７細胞を殺傷する／増殖を抑制する効力について試験した。簡潔には、ある日、９６ウェルプレート中、ウェルあたり１０．０００個の細胞を播種し、翌日、試験される化合物を添加して、４８時間、細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳで洗浄し、１％ＳＤＳ中に可溶化させた。次いで、プレートの５９５ｎｍでの吸光度を測定し、生存細胞数を定量化した。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、化合物１が、１０μＭのｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して８ｎＭと低い濃度で、増殖を５０％に抑制する細胞静止作用（ＩＣ５０）を示したこと、従って４桁小さい濃度で同じ効果を示すこと、を示している。比較を、表１に示す。
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（ＤＦＸ）の、エストロゲン依存性乳癌を代表する悪性乳癌ＭＣＦ７細胞を殺傷する／増殖を抑制する効力について試験した。簡潔には、ある日、９６ウェルプレート中、ウェルあたり１０．０００個の細胞を播種し、翌日、試験される化合物を添加して、４８時間、細胞と共にインキュベートした。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳで洗浄し、１％ＳＤＳ中に可溶化させた。次いで、プレートの５９５ｎｍでの吸光度を測定し、生存細胞数を定量化した。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、化合物１が、１０μＭのｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して８ｎＭと低い濃度で、増殖を５０％に抑制する細胞静止作用（ＩＣ５０）を示したこと、従って４桁小さい濃度で同じ効果を示すこと、を示している。比較を、表１に示す。
【0059】
【表1】
【0060】
［実施例１３］
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの、治療が困難であるトリプルネガティブ（triple negative）乳癌を代表する悪性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞を殺傷する／悪性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞の増殖を抑制する効力について試験した。手順は、実施例１２の手順と同一である。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの７０μＭと比較して、１３１ｎＭのＩＣ５０値を示したこと、従って、ほぼ３桁異なること、を示している。比較を、表２に示す。
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの、治療が困難であるトリプルネガティブ（triple negative）乳癌を代表する悪性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞を殺傷する／悪性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞の増殖を抑制する効力について試験した。手順は、実施例１２の手順と同一である。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの７０μＭと比較して、１３１ｎＭのＩＣ５０値を示したこと、従って、ほぼ３桁異なること、を示している。比較を、表２に示す。
【0061】
【表2】
【0062】
［実施例１４］
化合物１、２および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの、乳、膵臓および卵巣由来のいくつかの悪性細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３およびＯＶＣＡＲ３）の増殖を抑制する／殺傷する効力について試験した。手順は、実施例１２の手順と同一である。表３に実証されるように、結果は、選択性が有意に向上したことを示す。
化合物１、２および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの、乳、膵臓および卵巣由来のいくつかの悪性細胞株（ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢｘＰＣ３およびＯＶＣＡＲ３）の増殖を抑制する／殺傷する効力について試験した。手順は、実施例１２の手順と同一である。表３に実証されるように、結果は、選択性が有意に向上したことを示す。
【0063】
【表3】
【0064】
実施例１２で行われた、ＤＦＸまたは化合物１または化合物２で処理された細胞のクリスタルバイオレット染色（抗増殖効果および細胞死誘導効果が組み合わされた測定）を描写する表３に実証されるように、化合物１は、試験される全ての癌細胞の成長を抑制する能力を示した。重要なことには、新規で合成された化合物１のインビトロでのＩＣ５０値は、親ＤＦＸと比較してほぼ３桁小さく、他のミトコンドリア標的キレート剤よりも１～２桁小さい。これは、化合物１が、高い活性を有する化合物であり（表１、２）、他のミトコンドリア標的誘導体（例えば、ｍｉｔｏＴＡＸ、WO2014/173374）においてみられるような、ＤＦＸのミトコンドリア標的化が親薬物の効果を２桁高めることに基づいて予測され得る効果と比較して、高い効力を達成することを示唆する。さらに、化合物２は、１００ｎＭの範囲内でＩＣ５０値を示す。これは、化合物１よりも高いが、依然として非常に有力である。
【0065】
［実施例１５］
上記の表からわかるように、化合物１は、１０～１００ｎＭの範囲内で、癌細胞株に対して非常に高い効力を示す。この効果は、主に化合物１の細胞静止作用に基づくと考えられる。細胞を殺傷する能力を定義するために、ＤＦＸおよび化合物１の細胞死誘導効能（細胞傷害効力）を、アポトーシス／壊死の細胞死の指標として一般的に使用されるＶ／ＰＩ染色によって試験した。簡潔には、１２ウェルプレート中に、細胞を、ウェルあたり１００，０００個で播種し、選択された化合物と共に、４８時間インキュベートした。次いで、浮遊細胞をスピンし、接着細胞をトリプシン処理して同様にスピンし、その後、アネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびＰＩプローブで染色した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、蛍光活性化ソーターによって測定した。アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性を示す細胞は、死細胞と考える。表４に示されるように、化合物１は、全ての悪性乳癌細胞において、ＤＦＸと比較して著しく高い、細胞死を誘導する能力を示す。重要なことには、非悪性ＨＦＰ１細胞が、化合物１の効果に対して有意に敏感に反応せず、５μＭよりも高い濃度でのみ、試験された癌細胞の全てにおいて死細胞の深刻な割合を示す傷害効果を検知することができた（表４）。
上記の表からわかるように、化合物１は、１０～１００ｎＭの範囲内で、癌細胞株に対して非常に高い効力を示す。この効果は、主に化合物１の細胞静止作用に基づくと考えられる。細胞を殺傷する能力を定義するために、ＤＦＸおよび化合物１の細胞死誘導効能（細胞傷害効力）を、アポトーシス／壊死の細胞死の指標として一般的に使用されるＶ／ＰＩ染色によって試験した。簡潔には、１２ウェルプレート中に、細胞を、ウェルあたり１００，０００個で播種し、選択された化合物と共に、４８時間インキュベートした。次いで、浮遊細胞をスピンし、接着細胞をトリプシン処理して同様にスピンし、その後、アネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびＰＩプローブで染色した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、蛍光活性化ソーターによって測定した。アネキシンＶおよび／またはＰＩ陽性を示す細胞は、死細胞と考える。表４に示されるように、化合物１は、全ての悪性乳癌細胞において、ＤＦＸと比較して著しく高い、細胞死を誘導する能力を示す。重要なことには、非悪性ＨＦＰ１細胞が、化合物１の効果に対して有意に敏感に反応せず、５μＭよりも高い濃度でのみ、試験された癌細胞の全てにおいて死細胞の深刻な割合を示す傷害効果を検知することができた（表４）。
【0066】
本発明の化合物の生物学的効果について試験し、公知の化合物－ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較した。本発明の最も活性を有する化合物は、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの効果よりもほぼ３桁大きい効果で癌細胞を殺した。これは、前例がなく、極めて予測できない。化合物２は、１００ｎＭの範囲内でＩＣ５０値を示し、優位により高い細胞傷害活性を示し、これは、類似の化学基の他の化合物が類似の効果を示すことを示唆しており、本発明は、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ誘導体のみに制限されない。
【0067】
本発明の化合物が非悪性細胞に対して低い傷害効果を示し、かつインビボにおいて大いに許容されるために、癌細胞を殺傷することにおいてより選択性を有することは、重要な発見である。
【0068】
【表4】
【0069】
［実施例１６］
化合物１の癌細胞の増殖を抑制する能力を、細胞分析器Ｊｕｌｉ ＦＬを用いたリアルタイムモニタリングによる異なるアプローチによって試験した。簡潔には、６ウェルプレート中に、ＭＣＦ７細胞を播種し、翌日に約５％の集団に到達した。翌日、約５％の集密を有する特定の領域に器具のカメラの焦点を合わせ、細胞を連続してモニタリングし、４８時間、３０分ごとに集団および外観を記録した。次いで、実験の終点の単純な集団、または定められた期間の集団を代表する株のスロープ（slope）の値を表した（表５）。収集されたデータから、化合物１が３０ｎＭの濃度で細胞増殖を有意に阻害することがわかることは明らかである。
化合物１の癌細胞の増殖を抑制する能力を、細胞分析器Ｊｕｌｉ ＦＬを用いたリアルタイムモニタリングによる異なるアプローチによって試験した。簡潔には、６ウェルプレート中に、ＭＣＦ７細胞を播種し、翌日に約５％の集団に到達した。翌日、約５％の集密を有する特定の領域に器具のカメラの焦点を合わせ、細胞を連続してモニタリングし、４８時間、３０分ごとに集団および外観を記録した。次いで、実験の終点の単純な集団、または定められた期間の集団を代表する株のスロープ（slope）の値を表した（表５）。収集されたデータから、化合物１が３０ｎＭの濃度で細胞増殖を有意に阻害することがわかることは明らかである。
【0070】
【表5】
【0071】
［実施例１７］
Ｓｅａｈｏｒｓｅ器具を使用したＯＣＲ測定によって実証されるように、化合物１の適用は、細胞呼吸の著しい阻害をもたらす（表６）。Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析について、９６ウェルプレート中に２０．０００個の細胞を播種し、化合物１を測定前に直ちに加えるか（添加、表６）、または化合物１と共に１時間インキュベートした（プレインキュベート、表７）。その後、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ ａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent）を用いて、３分間の混合の後、３分間を、３サイクルで、混合酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。結果は、３サイクルの平均値を表す。データは、両方の条件で、ＯＣＲが有意に抑制されることを示す。
Ｓｅａｈｏｒｓｅ器具を使用したＯＣＲ測定によって実証されるように、化合物１の適用は、細胞呼吸の著しい阻害をもたらす（表６）。Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析について、９６ウェルプレート中に２０．０００個の細胞を播種し、化合物１を測定前に直ちに加えるか（添加、表６）、または化合物１と共に１時間インキュベートした（プレインキュベート、表７）。その後、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ ａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent）を用いて、３分間の混合の後、３分間を、３サイクルで、混合酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。結果は、３サイクルの平均値を表す。データは、両方の条件で、ＯＣＲが有意に抑制されることを示す。
【0072】
【表6】
【0073】
【表7】
【0074】
［実施例１８］
主にミトコンドリアのスーパーオキシドを測定し、結合すると蛍光を発する、特定のミトコンドリア標的プローブｍｉｔｏＳＯＸ（ThermoFisher Scientific）を用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対する化合物１の効果を評価した。化合物１を用いて、記載された時間処理された細胞を、プローブで染色し、次いでフローサイトメトリーを介して分析した。データは、化合物１がミトコンドリアのＲＯＳを誘導することができることを示す。
主にミトコンドリアのスーパーオキシドを測定し、結合すると蛍光を発する、特定のミトコンドリア標的プローブｍｉｔｏＳＯＸ（ThermoFisher Scientific）を用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対する化合物１の効果を評価した。化合物１を用いて、記載された時間処理された細胞を、プローブで染色し、次いでフローサイトメトリーを介して分析した。データは、化合物１がミトコンドリアのＲＯＳを誘導することができることを示す。
【0075】
【表8】
【0076】
［実施例１９］
化合物１は、鉄キレート剤であるため、化合物１と鉄とを２：１の比率でプレローディングし、次いで化合物１を細胞に適用する効果を、適用後に実施例４と同様にアネキシンＶ／ＰＩ染色を用いて測定することによって評価した。このような前処理は、このキレート剤によって細胞死の拡大を目に見えて低減し、このことは、鉄キレート特性が細胞死の誘導における鉄キレート剤の作用に対して部分的に責任を担っているが、おそらく他のメカニズムも同様に細胞死誘導効果に関与していることを確証する（表９）。
化合物１は、鉄キレート剤であるため、化合物１と鉄とを２：１の比率でプレローディングし、次いで化合物１を細胞に適用する効果を、適用後に実施例４と同様にアネキシンＶ／ＰＩ染色を用いて測定することによって評価した。このような前処理は、このキレート剤によって細胞死の拡大を目に見えて低減し、このことは、鉄キレート特性が細胞死の誘導における鉄キレート剤の作用に対して部分的に責任を担っているが、おそらく他のメカニズムも同様に細胞死誘導効果に関与していることを確証する（表９）。
【0077】
【表9】
【0078】
［実施例２０］
化合物１が耐性を有する癌細胞に対して活性があるかを試験するために、タモキシフェン耐性ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄを使用した。実施例１２と同様に行ったクリスタルバイオレットアッセイで、ＩＣ５０値を再び測定した。細胞静止作用および細胞傷害効果を誘導する化合物１の能力において、タモキシフェンに感受性の親細胞とタモキシフェンの存在下においても成長する耐性を有する細胞との間で、有意な差異がある上に（表１１）、ＩＣ５０値は、依然としてｎＭの範囲内であって、このことは、化合物１が非常に効果的であることを実証した。この観察は、ＭＢＡ－ＭＢ－２３１等のトリプルネガティブ（triple negative）乳癌細胞株においても化合物１が効果的であることを示すデータと併せると、化合物１が治療困難な特殊型の癌においても活性を有することを示す。
化合物１が耐性を有する癌細胞に対して活性があるかを試験するために、タモキシフェン耐性ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄを使用した。実施例１２と同様に行ったクリスタルバイオレットアッセイで、ＩＣ５０値を再び測定した。細胞静止作用および細胞傷害効果を誘導する化合物１の能力において、タモキシフェンに感受性の親細胞とタモキシフェンの存在下においても成長する耐性を有する細胞との間で、有意な差異がある上に（表１１）、ＩＣ５０値は、依然としてｎＭの範囲内であって、このことは、化合物１が非常に効果的であることを実証した。この観察は、ＭＢＡ－ＭＢ－２３１等のトリプルネガティブ（triple negative）乳癌細胞株においても化合物１が効果的であることを示すデータと併せると、化合物１が治療困難な特殊型の癌においても活性を有することを示す。
【0079】
【表10】
【0080】
［実施例２１］
他の耐性癌細胞タイプの生存率および増殖に対する化合物１の効果を試験するために、インビトロで培養可能な癌幹細胞様細胞、いわゆるマンモスフィア（mammosphere）のモデルを使用した。当該細胞は、３Ｄの微小腫瘍（microtumor）として成長し、多くの公知の化学療法用薬物に耐性を示す。このアッセイにおいて、ＭＣＦ７スフィア（sphere）を単一の細胞／小スフィアに解離し、Ｍａｍｍｏｃｕｌｔ培地（幹細胞技術）中で接着しない特別な細胞培養プラスチック上に、ウェルあたり１０，０００個の細胞を播種し、化合物１および化合物２を１μＭで加えた。これは、細胞傷害性を示さない濃度を代表する。細胞を静置して、１４０時間、成長させてスフィアを生成させた。次いで、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄ試薬（Promega）によって、細胞量を測定した。Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄ試薬は、３Ｄ培養細胞の細胞計数を、化学発光アッセイによって決定される３Ｄ培養細胞のＡＴＰ含有量の関数として決定する。明らかに、両方の化合物は、腫瘍スフィアの形成および成長を阻害する能力を有しており、これらの化合物は癌幹細胞様細胞に対して活性を有することが示唆される。
他の耐性癌細胞タイプの生存率および増殖に対する化合物１の効果を試験するために、インビトロで培養可能な癌幹細胞様細胞、いわゆるマンモスフィア（mammosphere）のモデルを使用した。当該細胞は、３Ｄの微小腫瘍（microtumor）として成長し、多くの公知の化学療法用薬物に耐性を示す。このアッセイにおいて、ＭＣＦ７スフィア（sphere）を単一の細胞／小スフィアに解離し、Ｍａｍｍｏｃｕｌｔ培地（幹細胞技術）中で接着しない特別な細胞培養プラスチック上に、ウェルあたり１０，０００個の細胞を播種し、化合物１および化合物２を１μＭで加えた。これは、細胞傷害性を示さない濃度を代表する。細胞を静置して、１４０時間、成長させてスフィアを生成させた。次いで、Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄ試薬（Promega）によって、細胞量を測定した。Ｃｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄ試薬は、３Ｄ培養細胞の細胞計数を、化学発光アッセイによって決定される３Ｄ培養細胞のＡＴＰ含有量の関数として決定する。明らかに、両方の化合物は、腫瘍スフィアの形成および成長を阻害する能力を有しており、これらの化合物は癌幹細胞様細胞に対して活性を有することが示唆される。
【0081】
【表11】
【0082】
［実施例２２］
細胞レベルに対する効果を定義するために、薬物が細胞傷害性を示さない濃度（１μＭ）での化合物１および化合物２の細胞周期に対する効果を詳細に調べた。細胞を、化合物と共に２４時間および４８時間培養し、次いでＤＮＡと結合するＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ＶｉｏｌｅｔＲｅａｄｙ Ｆｌｏｗ試薬（ThermoFisher Scientific）で染色し、フローサイトメトリーおよびＫａｌｕｚａプログラムによって分析して、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ相の割合を定義した。細胞周期が後期の時点でより顕著である場合、両方の化合物が、Ｇ１相の細胞の蓄積をもたらすことは明白である（表１２、１３）。これは、化合物が細胞周期に対する有力な阻害物質であることを示し、化合物の細胞静止活性の分子的メカニズムを説明している。
細胞レベルに対する効果を定義するために、薬物が細胞傷害性を示さない濃度（１μＭ）での化合物１および化合物２の細胞周期に対する効果を詳細に調べた。細胞を、化合物と共に２４時間および４８時間培養し、次いでＤＮＡと結合するＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ＶｉｏｌｅｔＲｅａｄｙ Ｆｌｏｗ試薬（ThermoFisher Scientific）で染色し、フローサイトメトリーおよびＫａｌｕｚａプログラムによって分析して、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２／Ｍ相の割合を定義した。細胞周期が後期の時点でより顕著である場合、両方の化合物が、Ｇ１相の細胞の蓄積をもたらすことは明白である（表１２、１３）。これは、化合物が細胞周期に対する有力な阻害物質であることを示し、化合物の細胞静止活性の分子的メカニズムを説明している。
【0083】
【表12】
【0084】
【表13】
【0085】
［実施例２３］
ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウスに注射されたトリプルネガティブ（triple negative）乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）の異種移植片モデルにおいて、インビボでの腫瘍の成長に対する化合物１の効果を評価した。１×１０６個の細胞を、それぞれのマウスに皮下注射した。腫瘍の体積が約１０ｍｍ３になった時に、動物を２つの群に無作為に分け、化合物１（コーンオイル中、２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（コーンオイル中、２．５％ＤＭＳＯ）のいずれかを、２１日間、１週間に２回、腹膜内に注射した。Ｖｅｖｏ ３１００ 前臨床撮像システム（VisualSonics）を用いて、超音波によって腫瘍の大きさを決定した。表１４に示されるデータは、化合物１が、腫瘍の成長を有意に遅らせることを示す。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンママウスに注射されたトリプルネガティブ（triple negative）乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）の異種移植片モデルにおいて、インビボでの腫瘍の成長に対する化合物１の効果を評価した。１×１０６個の細胞を、それぞれのマウスに皮下注射した。腫瘍の体積が約１０ｍｍ３になった時に、動物を２つの群に無作為に分け、化合物１（コーンオイル中、２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（コーンオイル中、２．５％ＤＭＳＯ）のいずれかを、２１日間、１週間に２回、腹膜内に注射した。Ｖｅｖｏ ３１００ 前臨床撮像システム（VisualSonics）を用いて、超音波によって腫瘍の大きさを決定した。表１４に示されるデータは、化合物１が、腫瘍の成長を有意に遅らせることを示す。
【0086】
【表14】
【0087】
［実施例２４］
いくつかの活性種を測定し、酸化すると蛍光を示す細胞浸透性ＲＯＳプローブ２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ－ＤＡ；Sigma-Aldrich）を用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対する化合物１の効果を、評価した。化合物１または化合物２（５μＭ）で、記載された時間処理した細胞を、プローブで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。表１５のデータは、化合物１および化合物２が、細胞のＲＯＳレベルを有意に高めることを示す。
いくつかの活性種を測定し、酸化すると蛍光を示す細胞浸透性ＲＯＳプローブ２’，７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ－ＤＡ；Sigma-Aldrich）を用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対する化合物１の効果を、評価した。化合物１または化合物２（５μＭ）で、記載された時間処理した細胞を、プローブで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。表１５のデータは、化合物１および化合物２が、細胞のＲＯＳレベルを有意に高めることを示す。
【0088】
【表15】
【0089】
［実施例２５］
レポータータンパク質ＫＥＩＭＡを用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、マイトファジーの誘導に対する化合物１および化合物２の効果を評価した。ＫＥＩＭＡの励起スペクトルは、ミトコンドリアのｐＨに応じて変化し、ｐＨ＞６のとき４４０ｎｍで、ｐＨ＜５のとき５８６で励起ピークを有し、第２の励起ピークは、６２０ｎｍで一定のままである。従って、４４０ｎｍ／５８６ｎｍの蛍光比率の低下は、ミトコンドリアの酸性化を示す。ＫＥＩＭＡで安定してトランスフェクションされたＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、化合物１と２４時間培養して、両方の励起波長におけるそれらの蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。表１６のデータは、化合物１が、マイトファジー誘導の明確なマーカであるミトコンドリアの酸性化を誘導することを示す。
レポータータンパク質ＫＥＩＭＡを用いて、ＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、マイトファジーの誘導に対する化合物１および化合物２の効果を評価した。ＫＥＩＭＡの励起スペクトルは、ミトコンドリアのｐＨに応じて変化し、ｐＨ＞６のとき４４０ｎｍで、ｐＨ＜５のとき５８６で励起ピークを有し、第２の励起ピークは、６２０ｎｍで一定のままである。従って、４４０ｎｍ／５８６ｎｍの蛍光比率の低下は、ミトコンドリアの酸性化を示す。ＫＥＩＭＡで安定してトランスフェクションされたＭＣＦ７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、化合物１と２４時間培養して、両方の励起波長におけるそれらの蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。表１６のデータは、化合物１が、マイトファジー誘導の明確なマーカであるミトコンドリアの酸性化を誘導することを示す。
【0090】
【表16】
【0091】
［実施例２６］
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（ＤＦＦＸ）の、いくつかの白血病細胞を殺傷する／いくつかの白血病細胞の増殖を抑制する効力について試験した。簡潔には、ある日、９６ウェルプレート中に、ウェルあたり１０．０００個の細胞を播種し、翌日に、試験される化合物を加えて、細胞と共に４８時間インキュベートした。細胞生存率は、プローブａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存率試薬を低減する能力として決定された。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、増殖を５０％に抑制する細胞静止作用（ＩＣ５０）を、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの５～８０μＭと比較して、２０～２００ｎＭの濃度で示したこと、従って、４０～４０００倍の少ない濃度で同様の効果を示すこと、を示す。比較を表１７に示す。
化合物１および比較用化合物ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ（ＤＦＦＸ）の、いくつかの白血病細胞を殺傷する／いくつかの白血病細胞の増殖を抑制する効力について試験した。簡潔には、ある日、９６ウェルプレート中に、ウェルあたり１０．０００個の細胞を播種し、翌日に、試験される化合物を加えて、細胞と共に４８時間インキュベートした。細胞生存率は、プローブａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）細胞生存率試薬を低減する能力として決定された。結果は、化合物１が、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘと比較して非常に効果的であり、増殖を５０％に抑制する細胞静止作用（ＩＣ５０）を、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの５～８０μＭと比較して、２０～２００ｎＭの濃度で示したこと、従って、４０～４０００倍の少ない濃度で同様の効果を示すこと、を示す。比較を表１７に示す。
【0092】
【表17】
【0093】
［実施例２７］
上記の表からわかるように、白血病細胞株に対して、化合物１は、２０～２００ｎＭの範囲内で非常に高い効力を示す。この効果は、主に、化合物１の細胞静止作用に基づくと考えられる。細胞を殺傷する能力を定義するために、アポトーシス／壊死の細胞死の測定として一般的に使用されるアネキシンＶ／ＰＩ染色によって、ＤＦＸおよび化合物１の細胞死誘導効能（細胞傷害性効力）を試験した（実施例１５、参照）。表１８に示されるように、白血病癌細胞の全てにおいて、化合物１は、ＤＦＸと比較して顕著に高い細胞死を誘導する能力を示す。化合物１は、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの効果よりもほぼ３桁大きい効果で癌細胞を殺傷した。このような結果は、前例がなく、極めて予測できない。
上記の表からわかるように、白血病細胞株に対して、化合物１は、２０～２００ｎＭの範囲内で非常に高い効力を示す。この効果は、主に、化合物１の細胞静止作用に基づくと考えられる。細胞を殺傷する能力を定義するために、アポトーシス／壊死の細胞死の測定として一般的に使用されるアネキシンＶ／ＰＩ染色によって、ＤＦＸおよび化合物１の細胞死誘導効能（細胞傷害性効力）を試験した（実施例１５、参照）。表１８に示されるように、白血病癌細胞の全てにおいて、化合物１は、ＤＦＸと比較して顕著に高い細胞死を誘導する能力を示す。化合物１は、ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘの効果よりもほぼ３桁大きい効果で癌細胞を殺傷した。このような結果は、前例がなく、極めて予測できない。
【0094】
【表18】
