▶ ビージーアイ ジェノミクス カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-20
(45)【発行日】2023-03-29
(54)【発明の名称】ＲＮＡライブラリーの構築のための方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C40B 40/06 20060101AFI20230322BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230322BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230322BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20230322BHJP
【ＦＩ】
C40B40/06
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021512600
(86)(22)【出願日】2018-09-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-27
(86)【国際出願番号】 CN2018104143
(87)【国際公開番号】W WO2020047769
(87)【国際公開日】2020-03-12
【審査請求日】2021-05-19
(73)【特許権者】
【識別番号】521527185
【氏名又は名称】ビージーアイ ジェノミクス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ヤン， シー
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ウェンジン
(72)【発明者】
【氏名】シン， ヤンルー
(72)【発明者】
【氏名】シュウ， ジンジン
(72)【発明者】
【氏名】チェン， ファン
(72)【発明者】
【氏名】ジュー， シーダ
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７３８５０１８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６８０１０５０（ＣＮ，Ａ）
【文献】植物科学最前線 BSJ-review，2017年，8:110
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｃ４０Ｂ ４０／０６
Ｃ１２Ｑ １／６８６
Ｃ１２Ｑ １／６８６９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加し、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部である、ステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む、方法。
【請求項2】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：ＲＮＡを抽出し、断片化を実施し、前記断片化が加熱処理によって実行される、ステップ；
３’末端に尾部を付加し、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部である、ステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項4】
３’末端に尾部を付加する前記ステップが、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」前記ステップが、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：ＲＮＡを抽出し、断片化を実施し、前記断片化が加熱処理によって実行される、ステップ；
３’末端に尾部を付加し、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部である、ステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項8】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加し、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部である、ステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項9】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項10】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項11】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項12】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項13】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項14】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり、前記尾部がポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部であり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項15】
シークエンシングにおける、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項16】
シークエンシングにおける、請求項９～１４のいずれか一項に記載のキットの使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、ＲＮＡライブラリーの構築のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＮＩＰＴ（非侵襲的出生前検査）を含む、非侵襲的検査は、非常に古典的な技術であるだけでなく、新興分野でもある。血漿又は血清酵素検査及びＮＩＰＴは、身体的健康又は妊娠を予測するために、それぞれタンパク質及びＤＮＡのレベルで血漿／血清を解析する。しかしながら、血漿／血清ＲＮＡの適用はまだ始まったばかりであり、これは主に、ＲＮＡが不安定であり、血漿／血清ＲＮＡがほとんど小さな断片であり、その濃度が非常に低く、したがって、そのような低品質及び低濃度のＲＮＡのライブラリーの構築のための非常に優れた戦略がないためである。ＲＮＡライブラリーの構築の現在の技術は、長鎖ＲＮＡ又は短鎖ＲＮＡのみに向けられ、長鎖ＲＮＡ及び短鎖ＲＮＡ同時のライブラリーの構築のための好適な技術はなく、そのため、長鎖ＲＮＡと短鎖ＲＮＡの両方の同時研究は、それらの別々のライブラリーの構築を必要とする。
【0003】
ＲＮａｓｅＨ法は、長鎖ＲＮＡのライブラリーの構築のための古典的な方法である。基本ステップは：ｒＲＮＡと逆相補性であるＤＮＡオリゴを試料とアニールするステップ、ＲＮａｓｅＨによってｒＲＮＡを除去するステップ、次いでＤＮａｓｅによってＤＮＡオリゴを除去するステップ；逆転写（一本鎖ｃＤＮＡ合成）、二本鎖合成；ギャップ充填、ｄＡの付加、アダプターライゲーション、ＰＣＲを含む。以下の問題がある；プロセスが、実行するのに非常に扱いにくく、遅く、困難であること；ＲＮＡの最初の量が高い必要があること；ＲＮＡの長い断片のみが検出できること。
【0004】
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡのライブラリー構築は、以下の基本ステップ：３’アダプターをライゲートするステップ、次いで５’アダプターをライゲートするステップ、逆転写、ＰＣＲを含む。以下の問題がある：操作が困難であり、遅く、コストがかかること；ＲＮＡの最初の量が、高い必要があること；ＲＮＡの短い断片のみが検出できること；ライブラリーの構築中に深刻なバイアスが誘導されること。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、ＲＮＡライブラリー構築方法及びその特化されたキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための第１の方法（方法１）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部（ｔａｉｌｉｎｇ、テーリング）を付加するステップ
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法を提供する。
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部（ｔａｉｌｉｎｇ、テーリング）を付加するステップ
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法を提供する。
【0007】
方法１は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【0008】
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
【0009】
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される。
【0010】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【0011】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
【0012】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【0013】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【0014】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法２）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
【0015】
方法２は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【0016】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【0017】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
【0018】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【0019】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【0020】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法３）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も提供する。
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も提供する。
【0021】
方法３は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【0022】
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
【0023】
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を尾部することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される。
【0024】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【0025】
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
【0026】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【0027】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【0028】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法４）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
【0029】
方法４は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【0030】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【0031】
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
【0032】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【0033】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【0034】
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
【0035】
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
【0036】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５～配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
【0037】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５～配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
【0038】
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
【0039】
前述の逆転写のいずれか１つは、配列表の配列番号２に示されるように逆転写プライマーを使用する。
【0040】
前述のＰＣＲのいずれか１つは、２つのプライマーを使用し、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
【0041】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット１）も保護しようとする。
【0042】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット２）も保護しようとする。
【0043】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット３）も保護しようとする。
【0044】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット４）も保護しようとする。
【0045】
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット５）も保護しようとする。
【0046】
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット６）も保護しようとする。
【0047】
構成要素Ａは、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せである。
【0048】
構成要素Ｂは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せである。
【0049】
構成要素Ｃは、ＤＮＡプローブ混合物である。ＤＮＡプローブ混合物は、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される。
【0050】
構成要素Ｄは、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せである。
【0051】
構成要素Ｅは、逆転写のための試薬又は試薬の組合せである。
【0052】
構成要素Ｆは、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである。
【0053】
構成要素Ｇは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せである。
【0054】
構成要素Ｈは、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せである。
【0055】
構成要素Ｉは、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せである。
【0056】
前述のキットのいずれか１つは、構成要素Ｊをさらに含む；構成要素Ｊは、ＲＮＡを抽出するための試薬又は試薬の組合せである。
【0057】
構成要素Ａは、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰである。構成要素Ａは、ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリＡポリメラーゼである。
【0058】
構成要素Ｂは、アダプター及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ１である。
【0059】
構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ及びＤＮａｓｅである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ、ＣａＣｌ２及びＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液である。
【0060】
構成要素Ｅは、逆転写プライマー及びＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴである。構成要素Ｅは、逆転写プライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ緩衝液及びＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴである。
【0061】
構成要素Ｆは、増幅プライマー対である。構成要素Ｆは、増幅プライマー対及びＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｍｉｘである。
【0062】
構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ１である。構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、ＡＴＰ、ＰＥＧ８０００、ＲＮａｓｅ阻害剤、アルカリホスファターゼ及びＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液である。
【0063】
構成要素Ｈは、Ｔ４ ＰＮＫである。
【0064】
構成要素Ｉは、ポリＡポリメラーゼ、ＡＴＰ及びＴ４ＰＮＫである。構成要素Ｉは、ＲＮａｓｅ Ｈ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、Ｔ４ ＰＮＫ及びポリＡポリメラーゼである。
【0065】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【0066】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【0067】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【0068】
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
【0069】
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
【0070】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５～配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
【0071】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５～配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
【0072】
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
【0073】
前述の逆転写プライマーのいずれか１つは、配列表の配列番号２に示される。
【0074】
前述の増幅プライマー対のいずれか１つについては、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
【0075】
本発明は、シークエンシングの前述の方法のいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
【0076】
本発明は、シークエンシングの前述のキットのいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
【0077】
本発明は、ポリＡ尾部付加及び５’末端ライゲーションを組み合わせている。システムのＲＮＡ含量は、ポリＡ尾部付加によって急速に増加し、それにより、続く精製による損失を避けることができる。特定の配列を除去することは都合がよい。断片化及び改変（Ｔ４ ＰＮＫ処理）により、全ての型のＲＮＡが同様の化学的状態に入り、同時にライブラリーへと構築され得る。
【図面の簡単な説明】
【0078】
【発明を実施するための形態】
【0079】
以下の実施例は、本発明のより良い理解を容易にするが、本発明を限定はしない。以下の実施例の実験方法は、他に特定しない限り、従来の方法である。以下の実施例で使用する試験材料は、他に特定しない限り、従来の生化学試薬店から全て購入される。以下の実施例の定量的検査は全て、３回の反復実験を設定し、結果は平均される。
【0080】
１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＲＮａｓｅＨ：ＮＥＢ Ｍ０２９７Ｌ。ＲＮａｓｅ阻害剤：Ｔｈｅｒｍｏ ＥＯ０３８２。Ｔ４ ＰＮＫ：ＮＥＢ Ｍ０２０１。ポリＡポリメラーゼ：ＮＥＢ Ｍ０２７６。１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１：ＮＥＢ Ｍ０２０４。実施例で使用したアルカリホスファターゼは、ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼであった：Ｔｈｅｒｍｏ ＥＦ０６５１。Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ：Ｔｈｅｒｍｏ ＡＭ２２３８。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ：ＮＥＢ Ｍ０３０３。ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ Ｎ４１１。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ Ｎ４１２。ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ、５×ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ緩衝液：Ｖａｚｙｍｅ Ｒ２０１。２×ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｍｉｘ：ＫＡＰＡ ＫＫ２６０２。Ｑｕｂｉｔ ＨＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ３２８５４。
【0081】
小さなＲＮＡ断片は、１８ｎｔ～３００ｎｔのサイズを有するＲＮＡ分子を指す（１８ｎｔと３００ｎｔを含む）。一般的な小さなＲＮＡ断片は、限定はされないが、マイクロＲＮＡ、短鎖非コードＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む。
【0082】
大きなＲＮＡ断片は、３００ｎｔよりも大きなサイズを有するＲＮＡ分子を指す。一般的な大きなＲＮＡ断片は、限定はされないが、ｍＲＮＡ及びＬｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）を含む。
【0083】
配列表の配列番号５～配列番号２０８では、ＲはＡ又はＧを表す。
【実施例】
【0084】
実施例１：試料としてＣｆＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリー（小さなＲＮＡ断片の情報を含有する）を構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを、３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを、３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
【0085】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得たＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得たＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【表1】
【0086】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
【0087】
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
【表2】
【0088】
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５～配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【0089】
３．除去されると予想されるＤＮＡ及びＲＮＡの除去
（１）ステップ２の完了後、システムに１μＬの５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＨ及び４μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで表３に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置いた。
（１）ステップ２の完了後、システムに１μＬの５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＨ及び４μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで表３に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置いた。
【表3】
【0090】
（２）ステップ（１）の完了後、システムに精製のため７０μＬのＲＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（１×）を添加し、精製産物を１５μＬのＤＥＰＣ水で回収し、１２．５μＬの上澄み液を新しいヌクレアーゼフリー遠心チューブに注意深くピペットした。
【0091】
４．逆転写及びＰＣＲ
（１）ステップ３（２）の遠心チューブを取り、１μＬの５μＭ Ａｄ１５３Ｒ－２５ｄＴ－ＶＮを添加し、６５℃で５分間反応させ、次いで氷上に２分間置き、次いで表４に記載の試薬を添加し、次いで逆転写にかけ（逆転写プログラム：５０℃、４０分）、次いで２５μＬの３ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加し、十分に混合し、８５℃で１５分間反応させた。
（１）ステップ３（２）の遠心チューブを取り、１μＬの５μＭ Ａｄ１５３Ｒ－２５ｄＴ－ＶＮを添加し、６５℃で５分間反応させ、次いで氷上に２分間置き、次いで表４に記載の試薬を添加し、次いで逆転写にかけ（逆転写プログラム：５０℃、４０分）、次いで２５μＬの３ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加し、十分に混合し、８５℃で１５分間反応させた。
【表4】
【0092】
Ａｄ１５３Ｒ－２５ｄＴ－ＶＮ（配列表の配列番号２）：
5'-GACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
Ａｄ１５３Ｒ－２５ｄＴ－ＶＮでは、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。
5'-GACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
Ａｄ１５３Ｒ－２５ｄＴ－ＶＮでは、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。
【0093】
（２）ステップ（１）の完了後、２１μＬの産物を取り、表５に記載の試薬を添加し、次いでＰＣＲ増幅にかけ（ＰＣＲ増幅反応プログラム：９４℃で３分；９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒、２０サイクル；７２℃で５分；１６℃で保存）。
【表5】
【0094】
Ａｄ１５３－ＲＴ－Ｂａｒｃｏｄｅ－Ｎ（配列表の配列番号３）：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'
Ａｄ１５３－ＲＴ－Ｂａｒｃｏｄｅ－Ｎでは、文字枠でマークした１０個の「Ｎ」は、試料バーコードであり、各試料はユニークな試料バーコードを有した。
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'
Ａｄ１５３－ＲＴ－Ｂａｒｃｏｄｅ－Ｎでは、文字枠でマークした１０個の「Ｎ」は、試料バーコードであり、各試料はユニークな試料バーコードを有した。
【0095】
Ｐｉ－Ａｄ１５３Ｆ－ＦＬ（配列表の配列番号４）：
5'-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'
5'-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'
【0096】
（３）ステップ（２）の完了後、システムに精製のため９０μＬのＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（１．８×）を添加し、精製産物を２０μＬの１×ＴＥ溶液で回収し、それがライブラリー溶液であった。
【0097】
５．ライブラリーの品質管理
ライブラリー溶液の定量は、Ｑｕｂｉｔ ＨＳで実行し、ライブラリー濃度は２ｎｇ／μＬより高いべきである。
ライブラリー溶液の定量は、Ｑｕｂｉｔ ＨＳで実行し、ライブラリー濃度は２ｎｇ／μＬより高いべきである。
【0098】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
【0099】
使用した装置は、ＢＧＩ－ＳＥＱ５００ＲＳであった。
【0100】
パラメーター設定は：ＳＥ３５；４プール１；他の設定はＢＧＩ－ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
【0101】
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
【0102】
実施例２：効果の比較
血漿試料は３０人のヒト血漿試料であった。
血漿試料は３０人のヒト血漿試料であった。
【0103】
ＲＮＡライブラリーは、実施例１に記載の方法に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は５８．７２％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３９．５９％であった。
【0104】
ライブラリーは、ＲＮａｓｅＨ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／１１ｂｆ８７１ｄ－ｃ６６ｃ－４０ｃｃ－ａｄｂｅ－３１７ａ７８ａｆ２１７０．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は６２．４４％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は２６．９９％であった（ここでアライメント率は、ミトコンドリアｒＲＮＡによる人工物であり、実際のアライメント率は約３％であった）。
【0105】
ライブラリーは、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／３２ａｂ９ｂ８９－８０７９－４９６１－ｂ５７１－ｄａｆ９６４ｃ０２ａ４６．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は４．３８％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は１．７７％であった。
【0106】
ライブラリーは、ＳＭＡＲＴｅｒ（ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ－Ｐｉｃｏ Ｉｎｐｕｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は３５．１０％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３７．２３％であった。
【0107】
実施例３：試料としてＣｆＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する（大きなＲＮＡ断片の情報と小さなＲＮＡ断片の情報の両方を含有する）
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
【0108】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
【0109】
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
【0110】
ステップＩで得られたＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【表6】
【0111】
ステップ２～５は、実施例１のステップＩＩのステップ２～５と同じであった。
【0112】
３．ハイスループットシークエンシング
実施例１のステップＩＩＩと同じ。
実施例１のステップＩＩＩと同じ。
【0113】
実施例４．試料として全ＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、組織又は細胞から抽出した。
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、組織又は細胞から抽出した。
【0114】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
【0115】
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
【0116】
ステップＩで得られた全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【0117】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション。
【0118】
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
【0119】
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
【0120】
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５～配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成した。
【0121】
ステップ３～５は、実施例１のステップＩＩのステップ３～５と同じであった。
【0122】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
【0123】
使用した装置は、ＢＧＩ－ＳＥＱ５００ＲＳであった。
【0124】
パラメーター設定は：ＳＥ５０；４プール１；他の設定はＢＧＩ－ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
【0125】
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
【0126】
ＲＮＡ－ＲｅｆＳｅｑアライメントを実施し、短鎖非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びＬｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｒｄｉｎｇのアライメントを別々に実施し、ＲＰＫＭを計算した。
【0127】
実施例５：試料として全ＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、組織又は細胞から抽出した。
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、組織又は細胞から抽出した。
【0128】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得た全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得た全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【0129】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
実施例４のステップＩＩのステップ２と同じ。
実施例４のステップＩＩのステップ２と同じ。
【0130】
ステップ３～５は、実施例１のステップＩＩのステップ３～５と同じであった。
【0131】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
実施例４のステップＩＩＩと同じ
実施例６：効果の比較
試料は、胎盤組織試料及びヒト不死化白血球（ＥＢウイルス法による）試料であった。
実施例４のステップＩＩＩと同じ
実施例６：効果の比較
試料は、胎盤組織試料及びヒト不死化白血球（ＥＢウイルス法による）試料であった。
【0132】
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は６６．３２％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．３２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２７．７６％であった。
【0133】
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は７９．１８％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２１．５４％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は９．５０％であった。
【0134】
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は７３．０７％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．２２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２８．５２％であった。
【0135】
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は８６．８５％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２．４１％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２０．４０％であった。
【産業上の利用可能性】
【0136】
本発明は、以下の利点を有する：ライブラリー構築が高効率と高感度である；プロセスは簡略化され、大幅に加速される；非常に低コストであり、１つの反応材料は３０元以下である；操作が簡単である；カスタマイズが容易であり、モジュールは異なるニーズに合うように調整され得る；高品質のシークエンシングをもたらす；長鎖ＲＮＡ断片及び短鎖ＲＮＡ断片を同時に検出することができる。
【図1】
【配列表】