(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-20
(45)【発行日】2023-03-29
(54)【発明の名称】タマネギべと病発病リスクの判定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20230322BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230322BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20230322BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230322BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/06
C12N15/31
C12N15/53
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021024410
(22)【出願日】2021-02-18
(65)【公開番号】P2022126376
(43)【公開日】2022-08-30
【審査請求日】2021-11-18
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、農林水産省、ＡＩを活用した土壌病害診断技術の開発委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】592167411
【氏名又は名称】香川県
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】西村 文宏
(72)【発明者】
【氏名】中島 千晴
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】Jpn. J. Phytopathol., 2020年，Vol.86, No.1，p.65
【文献】Plant Disease, 2020年，Vol.104，p.3183-3191
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
圃場のタマネギべと病発病リスクの判定方法であって、（１）圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、定量的ＰＣＲを行うこと、
（２）工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定すること、
を含み、
プライマーペアが、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを使用する、方法。
【請求項2】
０．０１～０．１ｇの土壌から得られたＤＮＡを鋳型とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
土壌が、圃場の面積１～１０００ｍ２に対して１箇所の割合で採取されたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程（２）において、土壌１ｇ当たり１個以上のＣＯＸＩＩ遺伝子が定量された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーペアを含み、プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、圃場のタマネギべと病発病リスクを判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、タマネギべと病発病リスクの判定方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
タマネギべと病は、タマネギの伝染病であり、発病株では光合成が阻害され、結球不良となり、大幅な収量の低下をもたらす。原因菌であるタマネギべと病菌（ペロノスポラ・デストラクター（Peronospora destructor））は、植物に感染後、成熟すると植物組織内に卵胞子を形成する。自然落葉や収穫作業などにより卵胞子を伴った罹病葉が土壌中に鋤きこまれ、越夏後、タマネギが圃場に播種または定植されると、土壌中の卵胞子は根を通じて全身感染し、一次伝染源となる。よって、生産現場では、タマネギべと病の予防のために、過剰な土壌消毒や薬剤散布が行われることがある。
【0003】
本願発明者らは、ＣＯＸＩＩ遺伝子配列に基づいてタマネギべと病菌を特異的に検出できることを報告した（非特許文献１）。しかしながら、土壌中にどの程度の量の卵胞子が存在すればタマネギべと病の発症に至るのかは不明であり、生産現場では依然として過剰な土壌消毒や薬剤散布を行わざるを得ない。適切な栽培管理のために、タマネギべと病の発病リスクを判定する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】日本植物病理学会報２０２０年８６巻１号ｐ．６５、関西部会講演要旨
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示の目的は、タマネギべと病発病リスクの判定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、土壌中のタマネギべと病菌の卵胞子を高感度で検出することに成功し、土壌中にタマネギべと病菌の卵胞子が存在すると、それが非常に低密度であっても、タマネギべと病の発病リスクが高いことを見出した。
【0007】
従って、ある態様では、本開示は、圃場のタマネギべと病発病リスクの判定方法であって、
（１）圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行うこと、および、
（２）工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定すること、
を含む方法を提供する。
（１）圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行うこと、および、
（２）工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定すること、
を含む方法を提供する。
【0008】
別の態様では、本開示は、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであるプライマーペアを含む、圃場のタマネギべと病発病リスクを判定するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【0009】
本開示により、タマネギべと病の発病リスクを判定できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】タマネギ栽培圃場の模式図である。土壌採取を行った場所を円で示す。
【図2】タマネギべと病菌卵胞子を添加した土壌からの卵胞子回収試験の結果を示す。
【図3】タマネギべと病菌卵胞子を添加した灰色低地土および黒ボク土からの卵胞子回収試験の結果を示す。
【図4】タマネギべと病菌の菌密度および一次伝染株率を圃場別に示す。
【図5】薬剤散布をしていない圃場について、タマネギべと病菌の菌密度および一次伝染株率を圃場別に示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、生化学、分子生物学、微生物学、植物生理学、植物病理学、農学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
【0012】
＜タマネギべと病発病リスクの判定方法＞
本開示の方法の工程（１）では、圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行う。
本開示の方法の工程（１）では、圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行う。
【0013】
典型的には、タマネギの栽培を予定している圃場から土壌を採取する。圃場は、過去にタマネギを栽培したことがあってもなくてもよい。タマネギ収穫後、かつ／または、タマネギを播種または定植する前の圃場から土壌を採取し得る。タマネギの播種または定植後に土壌を採取してもよい。土壌の種類は特に限定されず、黒ボク土、灰色低地土、赤・黄色土、褐色森林土、未熟土などであり得、特に、黒ボク土または灰色低地土、とりわけ灰色低地土である。
【0014】
土壌は、圃場の面積１～１０００ｍ２、好ましくは５～５００ｍ２、より好ましくは８～３５０ｍ２に対して１箇所の割合で採取する。１つの圃場につき、例えば１～２０箇所、好ましくは５～１５箇所、より好ましくは８～１０箇所、例えば９箇所から土壌を採取する。複数の箇所で土壌を採取する場合、採取箇所間の距離が均等になるように採取することが好ましい。複数の箇所から採取した土壌を混合してもよい。ＤＮＡの抽出に用いる土壌の量は限定されず、例えば０．１～１ｇ、好ましくは０．２～０．８ｇ、より好ましくは０．３～０．５ｇの土壌を用いることができる。
【0015】
土壌に含まれる微生物からＤＮＡを抽出するために、界面活性剤の使用、高温処理、凍結融解、またはビーズを用いた機械的破壊等、様々な方法が当分野で知られている。処理された試料から、マトリックス吸着、シリカ膜吸着、クロロホルム／イソプロパノール処理後のエタノール沈殿、ゲルろ過後のエタノール沈殿などの方法により、ＤＮＡを抽出し得る。例えば、農業環境技術研究所のＰＣＲ－ＤＧＧＥマニュアルに従って土壌からＤＮＡを抽出し得る。また、土壌からＤＮＡを抽出するためのキット（例えば、Fast DNA SPIN Kit for soil（Q-BIOgene）、ISOIL for Beads Beating（NIPPON GENE）、Soil DNA Isolation kit（Norgen Biotek Corp.）が開発されており、いかなるキットを利用してもよい。ＤＮＡの抽出効率を高める物質、例えば、スキムミルクまたはＲＮＡをＤＮＡ抽出用のバッファーに添加してもよい。土壌から抽出したＤＮＡの全部または一部を使用して、例えば、０．０１～０．１ｇ、好ましくは０．０３～０．０９ｇ、より好ましくは０．０５～０．０７ｇの土壌から得られるＤＮＡを鋳型とし得る。
【0016】
タマネギべと病菌（ペロノスポラ・デストラクター（Peronospora destructor））は、タマネギべと病の原因となる糸状菌であり、世界各地に分布している。ＣＯＸＩＩ（シトクロムＣオキシダーゼサブユニット２）は、ミトコンドリア膜貫通タンパク質複合体を構成するサブユニットの１つである。タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアは、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計し得る。タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子の代表的なヌクレオチド配列は、GenBankアクセッション番号KJ654195として登録されている。香川産のタマネギべと病菌から単離されたＣＯＸＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
【0017】
プライマーペアは、ＣＯＸＩＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物が増幅と定量に適する長さ、例えば、約３０～１０００、約４０～５００、約５０～２５０または約６０～１５０ヌクレオチド長を有するように設計し得る。ＰＣＲに適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
【0018】
プライマーペアは、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を、土壌中に存在し得る他の微生物のＣＯＸＩＩ遺伝子に対して特異的に増幅するものが好ましく、特に、フィトフトラ・カクトラム（Phytophthora cactorum）、フィトフトラ・ニコチアネ（Phytophthora nicotianae）、フィトフトラ・グローバー（Phytophthora glovera）、フィトフトラ・ラクツカエ（Phytophthora pseudolactuae）、ピシウム・アンシヌラツム（Pythium uncinulatum）、ピシウム・ウリチマム（Pythium ultimum）、ピシウム・アファニデルマタム（Pythium aphanidermatum）、フィトピシウム・ヘリコイデス（Phytopythium heliconides）、プラスモパラ・ハルステディイ（Plasmopara halstedii）、ブレミア・ラクツカエ（Bremia lactucae）、ペロノスポラ・ファリノーサ（Peronospora farinose）などの他の植物病原体のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅しないものが好ましい。タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を特異的に増幅するプライマーペアは、土壌中に存在し得る各種微生物のＣＯＸＩＩ遺伝子をアラインメントし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子に特異的なヌクレオチド配列を選択することにより設計できる。アラインメントには、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）を利用し得る。
【0019】
例えば、プライマーペアは、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅できる、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。ある実施態様では、プライマーペアは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【0020】
ＰＣＲのために、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学実験等に使用可能な公知の任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、またはこれらの誘導体を使用し得る。
【0021】
ＰＣＲ反応は、当分野において通常用いられるサーマルサイクラー、例えばタカラバイオＴＰ６００を用いて行うことができる。例えば、ＰＣＲ反応は、次のサイクル条件で行うことができる：［５０℃で５分間］を１回、［９５℃で２０秒間］を１回、次いで［９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間］のサイクルを４０回反復する。
【0022】
ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ、例えば定量リアルタイムＰＣＲであってもよい。定量リアルタイムＰＣＲには、各種の蛍光ＰＣＲ技術を用い得る。蛍光ＰＣＲ技術としては、例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉなどの蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法、ＤＮＡポリメラーゼの５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性および専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限定されない。
【0023】
ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブ法により定量リアルタイムＰＣＲを行う。一般的に、ＴａｑＭａｎプローブ法では、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える。ＴａｑＭａｎプローブは、ＣＯＸＩＩ遺伝子由来のＰＣＲ産物のどちらの鎖に結合してもよく、どこに結合してもよく、当分野で周知の方法により設計し得る。また、任意の蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせを使用し得る。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【0024】
定量リアルタイムＰＣＲにおいて、既知濃度のＤＮＡを含む標準液と未知濃度のＤＮＡ（検体）を同時に増幅し、横軸に増幅サイクル数、縦軸にレポーター色素の蛍光強度（対数変換値）をプロットした蛍光増幅曲線を作成してもよい。その場合、蛍光強度（対数変換値）が直線となる指数関数的増幅領域（定量領域）の中心付近に横軸と平行な線（crossing line）を引き、そのラインと増幅曲線の交点である増幅サイクル数を求め、横軸に各標準液の濃度（対数変換値）、縦軸に標準液の増幅サイクル数をプロットした標準曲線を作成し、この標準曲線上に検体の増幅サイクル数を当てはめることにより、検体のＤＮＡ濃度を算出し得る。
【0025】
工程（１）で用いた土壌にタマネギべと病菌の卵胞子が含まれていると、ＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅される。また、本願の実施例で立証される通り、土壌中にタマネギべと病菌の卵胞子が含まれていると、その密度が低くても、タマネギべと病が発病する可能性が高い。従って、本開示の方法の工程（２）では、工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定する。
【0026】
ＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅されたことは、公知のいかなる核酸検出方法を用いて判定してもよい。例えば、増幅後の核酸の電気泳動、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法、インターカレーター性蛍光色素による二本鎖ＤＮＡの染色、蛍光プローブ法などにより、判定し得る。
【0027】
例えば、タマネギべと病菌のＤＮＡを試料とし、プライマーペアとして配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、通常、９０ｂｐの増幅産物が得られる。但し、同一種内での変異等により増幅産物のサイズは変動し得る。ＤＮＡ増幅産物の配列を解読することにより、目的の配列が増幅されたか否かを確認してもよい。
【0028】
上記の通り、工程（１）において定量的ＰＣＲを行ってもよく、その場合、例えば、土壌１ｇ当たり１個以上のＣＯＸＩＩ遺伝子が定量された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定し得る。
【0029】
＜タマネギべと病発病リスクを判定するためのキット＞
ある態様では、本開示は、上記の方法を実施するために使用し得るキットを提供する。キットは、少なくとも、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを含む。キットは、さらに、定量的ＰＣＲ用のプローブを含んでもよい。プライマーペアおよびプローブの詳細は上記の通りである。
ある態様では、本開示は、上記の方法を実施するために使用し得るキットを提供する。キットは、少なくとも、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを含む。キットは、さらに、定量的ＰＣＲ用のプローブを含んでもよい。プライマーペアおよびプローブの詳細は上記の通りである。
【0030】
キットは、さらに、標準品、例えば、既知量のタマネギべと病菌ＤＮＡを含み得る。キットは、さらに、上記の方法の実施に必要な試薬、例えば、ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどを含んでもよい。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、書面または記憶媒体等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含んでもよい。
【0031】
キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、チューブ、プレート、マルチウェルプレート等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの多様な材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。
【0032】
例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］圃場のタマネギべと病発病リスクの判定方法であって、
（１）圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行うこと、および、
（２）工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定すること、
を含む方法。
［２］プライマーペアが、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１項に記載の方法。
［３］プライマーペアが、配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］０．０１～０．１ｇの土壌から得られたＤＮＡを鋳型とする、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］土壌が、圃場の面積１～１０００ｍ２に対して１箇所の割合で採取されたものである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］土壌が、１つの圃場につき、１～２０箇所から採取されたものである、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］土壌が黒ボク土または灰色低地土である、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］土壌が黒ボク土である、第１項～第７項のいずれかに記載の方法。
［９］土壌からＤＮＡを抽出する工程をさらに含む、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］ＤＮＡ抽出にスキムミルクを使用する、第９項に記載の方法。
［１］圃場のタマネギべと病発病リスクの判定方法であって、
（１）圃場の土壌から得られたＤＮＡを鋳型とし、タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて、ＰＣＲを行うこと、および、
（２）工程（１）によりＣＯＸＩＩ遺伝子が増幅された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定すること、
を含む方法。
［２］プライマーペアが、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１項に記載の方法。
［３］プライマーペアが、配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］０．０１～０．１ｇの土壌から得られたＤＮＡを鋳型とする、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］土壌が、圃場の面積１～１０００ｍ２に対して１箇所の割合で採取されたものである、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］土壌が、１つの圃場につき、１～２０箇所から採取されたものである、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］土壌が黒ボク土または灰色低地土である、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］土壌が黒ボク土である、第１項～第７項のいずれかに記載の方法。
［９］土壌からＤＮＡを抽出する工程をさらに含む、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］ＤＮＡ抽出にスキムミルクを使用する、第９項に記載の方法。
【0033】
［１１］ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、第１項～第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する、第１１項に記載の方法。
［１３］プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する、第１１項または第１２項に記載の方法。
［１４］工程（２）において、土壌１ｇ当たり１個以上のＣＯＸＩＩ遺伝子が定量された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定する、第１１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１２］プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する、第１１項に記載の方法。
［１３］プローブとして、配列番号３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する、第１１項または第１２項に記載の方法。
［１４］工程（２）において、土壌１ｇ当たり１個以上のＣＯＸＩＩ遺伝子が定量された場合に、圃場のタマネギべと病発病リスクが高いと判定する、第１１項～第１３項のいずれかに記載の方法。
【0034】
［１５］タマネギべと病菌のＣＯＸＩＩ遺伝子を増幅するプライマーペアを含む、圃場のタマネギべと病発病リスクを判定するためのキット。
［１６］プライマーペアが、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１５項に記載のキット。
［１７］プライマーペアが、配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１５項または第１６項に記載のキット。
［１８］定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、第１５項～第１７項のいずれかに記載のキット。
［１９］プローブが、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１８項に記載のキット。
［２０］プローブが、配列番号３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１８項または第１９項に記載のキット。
［１６］プライマーペアが、ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド、および、ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１５項に記載のキット。
［１７］プライマーペアが、配列番号１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１５項または第１６項に記載のキット。
［１８］定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、第１５項～第１７項のいずれかに記載のキット。
［１９］プローブが、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１８項に記載のキット。
［２０］プローブが、配列番号３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである、第１８項または第１９項に記載のキット。
【0035】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【0036】
１）供試菌株
供試した病原菌を表１に示す。
供試した病原菌を表１に示す。
【表1】
【0037】
２）ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブの設計
香川県内タマネギ圃場からべと病菌を分離し、ＣＯＸＩＩのヌクレオチド配列を決定した（配列番号４）。この配列は、GenBankアクセッション番号KJ654195として登録されているドイツ産タマネギベと病菌のＣＯＸＩＩの配列と９９．８２％同一であった。この配列に基づいて、ｑＰＣＲ用プライマー及びＴａｑＭａｎプローブを作成した（表２）。
香川県内タマネギ圃場からべと病菌を分離し、ＣＯＸＩＩのヌクレオチド配列を決定した（配列番号４）。この配列は、GenBankアクセッション番号KJ654195として登録されているドイツ産タマネギベと病菌のＣＯＸＩＩの配列と９９．８２％同一であった。この配列に基づいて、ｑＰＣＲ用プライマー及びＴａｑＭａｎプローブを作成した（表２）。
【表2】
【0038】
３）ＤＮＡ抽出
プライマー及びプローブの特異性評価において、改変塩化ベンジル法を用いて、ＤＮＡ抽出を行った。２．０ｍｌチューブに８０μｌの２０％（ｗ／ｖ）のスキムミルク、２５０μｌの抽出バッファー（１０ｍｌ １Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ９．０、８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、８２ｍｌ 蒸留水）、５０μｌの１０％ＳＤＳ、１５０μｌの塩化ベンジル、直径１ｍｍ ０．２ｇのガラスビーズを加えた。その後、タマネギべと病菌及びレタスベと病菌は罹病葉の蒸留水懸濁液０．４ｍｌ、その他の菌株はＰＤＡ培地上で生育させた菌糸を培地ごと５ｍｍ角に切り取った断片を加えた。シェイクマスター（ｂｍｓ製）により、１，１００ｒｐｍで３分間処理し、６０℃のヒートブロックで１５分間静置し、１５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加え、４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ． ４℃）後、３００μｌの上清を回収した。以後は MagExtracter (TOYOBO) のマニュアルに従った。すなわち、上清３００μｌに対して、吸着液６００μｌと磁気ビーズ４０μｌを加えて、１分間ボルテックスを行った。磁気スタンド (Magical Trapper(TOYOBO)) にセットし、５回転倒混和後３０秒間静置し、その後上清を除去した。７０％エタノール９００μｌを加えて、１０秒間ボルテックスを行った後、磁気スタンドにセットし、５回転倒混和後３０秒間静置して上清を除去した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ． ２５℃）後、磁性スタンドにセットして３０秒後、エタノールを２００μｌピペットで除去した。エバポレーターで乾燥後、ＴＥ５０μｌを加えてボルテックス後、磁気スタンドにセットして、底にあるＤＮＡ抽出液をテンプレートとした。
プライマー及びプローブの特異性評価において、改変塩化ベンジル法を用いて、ＤＮＡ抽出を行った。２．０ｍｌチューブに８０μｌの２０％（ｗ／ｖ）のスキムミルク、２５０μｌの抽出バッファー（１０ｍｌ １Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ９．０、８ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ、８２ｍｌ 蒸留水）、５０μｌの１０％ＳＤＳ、１５０μｌの塩化ベンジル、直径１ｍｍ ０．２ｇのガラスビーズを加えた。その後、タマネギべと病菌及びレタスベと病菌は罹病葉の蒸留水懸濁液０．４ｍｌ、その他の菌株はＰＤＡ培地上で生育させた菌糸を培地ごと５ｍｍ角に切り取った断片を加えた。シェイクマスター（ｂｍｓ製）により、１，１００ｒｐｍで３分間処理し、６０℃のヒートブロックで１５分間静置し、１５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加え、４℃の冷蔵庫に１５分間静置し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ １０ｍｉｎ． ４℃）後、３００μｌの上清を回収した。以後は MagExtracter (TOYOBO) のマニュアルに従った。すなわち、上清３００μｌに対して、吸着液６００μｌと磁気ビーズ４０μｌを加えて、１分間ボルテックスを行った。磁気スタンド (Magical Trapper(TOYOBO)) にセットし、５回転倒混和後３０秒間静置し、その後上清を除去した。７０％エタノール９００μｌを加えて、１０秒間ボルテックスを行った後、磁気スタンドにセットし、５回転倒混和後３０秒間静置して上清を除去した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ． ２５℃）後、磁性スタンドにセットして３０秒後、エタノールを２００μｌピペットで除去した。エバポレーターで乾燥後、ＴＥ５０μｌを加えてボルテックス後、磁気スタンドにセットして、底にあるＤＮＡ抽出液をテンプレートとした。
【0039】
土壌からのＤＮＡ抽出は、農業環境技術研究所のＰＣＲ－ＤＧＧＥマニュアルに基づいて行った。すなわち、０．４ｇの土壌を入れたキットチューブに８１８μｌのリン酸バッファー、１２２μｌのＭＴバッファー、８０μｌの２０％（ｗ／ｖ）スキムミルクを添加し、シェイクマスター（ｂｍｓ製）により、１，１００ｒｐｍで３分間処理した。１４，０００ｘＧで１分間遠心し、上清を新しい１．５ｍｌチューブに移した。２５０μｌのＰＰＳを加え、転倒混和後、上清を１４，０００ｘＧで５分間遠心し、上清を新しい１５ｍｌチューブに移し、１ｍｌのBinding Matrix Suspensionを添加して混和後、１４，０００ｘＧで５分間遠心し、上清を５００μｌ除去した。Binding Matrix Suspensionを再懸濁して、６００μｌをSPIN Filterに移し、１４，０００ｘＧで１分間遠心し、流下液を捨て、残りのBinding Matrix Suspensionを再懸濁して前述と同様にSPIN Filterに移して回収した。回収したBinding Matrixに５００μｌのＳＥＷＳ－Ｍを加え１４，０００ｘＧで１分間遠心し、流下液を捨てたのち、再度１４，０００ｘＧで２分間遠心し、SPIN Filterをキャッチチューブに載せ替えた。Matrixを風乾した後、６０μＬのＤＥＳを加えて穏やかに懸濁後、１４，０００ｘＧで１分間遠心してＤＮＡテンプレートとした。
【0040】
４）遺伝子の増幅および検出
ＤＮＡ増幅は TaqMan Environmental Master Mix（Life Technologies）を用いて行った。８．８μｌのＤＮＡ抽出液をテンプレートとして、１０μｌの２×Fast Advanced Master Mix、０．４μＭの各プライマー及びプローブを用いて２０μｌの反応系で反応させた。反応条件は、５０℃ ５分間、９５℃ ２０秒間、（９５℃ ３秒間、６０℃ ３０秒間）×４０回であった。サーマルサイクラーおよび検出器はタカラバイオＴＰ６００を用いた。スタンダードは、タマネギべと病菌卵胞子懸濁液を土壌に添加後、前述の方法で抽出したテンプレートＤＮＡを蒸留水で段階希釈したものを用いた。
ＤＮＡ増幅は TaqMan Environmental Master Mix（Life Technologies）を用いて行った。８．８μｌのＤＮＡ抽出液をテンプレートとして、１０μｌの２×Fast Advanced Master Mix、０．４μＭの各プライマー及びプローブを用いて２０μｌの反応系で反応させた。反応条件は、５０℃ ５分間、９５℃ ２０秒間、（９５℃ ３秒間、６０℃ ３０秒間）×４０回であった。サーマルサイクラーおよび検出器はタカラバイオＴＰ６００を用いた。スタンダードは、タマネギべと病菌卵胞子懸濁液を土壌に添加後、前述の方法で抽出したテンプレートＤＮＡを蒸留水で段階希釈したものを用いた。
【0041】
５）土壌からの卵胞子添加回収試験
既報に基づき、植物体から卵胞子を抽出して供試した。タマネギべと病発病葉表面を水道水で洗浄後、蒸留水を加えながら２５０μｍメッシュにこすりつけ、５０μｍメッシュおよび２０μｍメッシュでろ過した。２０μｍメッシュ上を蒸留水で懸濁して卵胞子懸濁液を得た。タマネギ類の作付け歴の無い香川県農業試験場内米麦連作圃場の土壌（灰色低地土）および茨城県つくば市の圃場土壌（黒ボク土）を採取し、風乾後、２ｍｍメッシュを通し十分に乾燥させた。２ｍｌのチューブに０．４ｇの上記土壌を入れ、濃度調整した卵胞子懸濁液（２．０×１０１～２．０×１０４個／ｍｌ）を１００μｌ添加し、菌密度が５～５×１０３個／ｇ乾土相当の土壌サンプルとした。
既報に基づき、植物体から卵胞子を抽出して供試した。タマネギべと病発病葉表面を水道水で洗浄後、蒸留水を加えながら２５０μｍメッシュにこすりつけ、５０μｍメッシュおよび２０μｍメッシュでろ過した。２０μｍメッシュ上を蒸留水で懸濁して卵胞子懸濁液を得た。タマネギ類の作付け歴の無い香川県農業試験場内米麦連作圃場の土壌（灰色低地土）および茨城県つくば市の圃場土壌（黒ボク土）を採取し、風乾後、２ｍｍメッシュを通し十分に乾燥させた。２ｍｌのチューブに０．４ｇの上記土壌を入れ、濃度調整した卵胞子懸濁液（２．０×１０１～２．０×１０４個／ｍｌ）を１００μｌ添加し、菌密度が５～５×１０３個／ｇ乾土相当の土壌サンプルとした。
【0042】
６）タマネギ栽培圃場の解析
２０１９年１１～１２月、県内６６圃場（７５～４１１６ｍ２）について定植前又は定植直後に土壌を採取した。土壌は１圃場あたり９箇所から均等に採取し、１つにまとめて１サンプルとした（図１）。風乾後２ｍｍで篩った土壌を用いて、前述の通りに卵胞子密度を測定した。２０２０年３～４月、圃場あたり約１０，０００株について１次伝染株と２次伝染株に分けて発病株数を調査した。
２０１９年１１～１２月、県内６６圃場（７５～４１１６ｍ２）について定植前又は定植直後に土壌を採取した。土壌は１圃場あたり９箇所から均等に採取し、１つにまとめて１サンプルとした（図１）。風乾後２ｍｍで篩った土壌を用いて、前述の通りに卵胞子密度を測定した。２０２０年３～４月、圃場あたり約１０，０００株について１次伝染株と２次伝染株に分けて発病株数を調査した。
【0043】
３．結果と考察
１）ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎＭＧＢプローブの特異性
供試した卵菌類６属１２種の菌株のうち、タマネギべと病菌においてのみＤＮＡの増幅が見られ、９０ｂｐの増幅産物が得られた（表３）。また、ＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列を決定し、タマネギべと病菌由来であることを確認した（データ示さず）。このことから、プライマー及びプローブがタマネギべと病菌に特異的であることが担保された。
１）ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎＭＧＢプローブの特異性
供試した卵菌類６属１２種の菌株のうち、タマネギべと病菌においてのみＤＮＡの増幅が見られ、９０ｂｐの増幅産物が得られた（表３）。また、ＰＣＲ増幅産物のヌクレオチド配列を決定し、タマネギべと病菌由来であることを確認した（データ示さず）。このことから、プライマー及びプローブがタマネギべと病菌に特異的であることが担保された。
【0044】
【表3】
【0045】
２）添加回収試験
香川県農業試験場内のタマネギ作付履歴の無い土壌にタマネギべと病菌卵胞子を添加して抽出したＤＮＡ抽出液を段階希釈して定量を行ったところ、Ｒ２＝０．９９の高い回帰性が見られ、０．５個／ｇ乾土相当の検量線が得られた（図２）。
香川県農業試験場内のタマネギ作付履歴の無い土壌にタマネギべと病菌卵胞子を添加して抽出したＤＮＡ抽出液を段階希釈して定量を行ったところ、Ｒ２＝０．９９の高い回帰性が見られ、０．５個／ｇ乾土相当の検量線が得られた（図２）。
【0046】
様々な土壌での適応性を確認するため、香川県の灰色低地土及び茨城県の黒ボク土を用いて、添加回収試験を行った。土壌に添加したタマネギべと病菌卵胞子濃度に応じた立ち上がりが見られ、灰色低地土、黒ボク土ともにＲ２＝０．９９の高い回帰性が見られ、５個／ｇ乾土相当まで検出された（図３）。
【0047】
３）ｑＰＣＲによるタマネギ栽培圃場の解析
タマネギ圃場での適応性確認のため、香川県内６６箇所のタマネギ圃場から採取した土壌を用いて菌密度を測定した。最大で５．７個／ｇ乾土の圃場が１つあったが、残りは全て１．２個／ｇ乾土以下の低い菌密度であった（図４）。富山県および長崎県の圃場でも同様に調査したところ、富山県では最大６０個／ｇ、長崎県では最大９０個／ｇであり（データ示さず）、香川県の菌密度は低かった。卵胞子は湛水処理に弱く、香川県ではタマネギ収穫後、水稲を行う作型が一般的であることから、他県と比較して卵胞子密度が低いものと推察された。
タマネギ圃場での適応性確認のため、香川県内６６箇所のタマネギ圃場から採取した土壌を用いて菌密度を測定した。最大で５．７個／ｇ乾土の圃場が１つあったが、残りは全て１．２個／ｇ乾土以下の低い菌密度であった（図４）。富山県および長崎県の圃場でも同様に調査したところ、富山県では最大６０個／ｇ、長崎県では最大９０個／ｇであり（データ示さず）、香川県の菌密度は低かった。卵胞子は湛水処理に弱く、香川県ではタマネギ収穫後、水稲を行う作型が一般的であることから、他県と比較して卵胞子密度が低いものと推察された。
【0048】
収穫後、卵胞子陽性と判定された圃場のうち、一次伝染株発病圃場は５枚、非発病圃場は１０枚であった。卵胞子陰性と判定された圃場のうち、発病圃場は３枚、非発病圃場は４８枚であった。陽性適中率３３．３、陰性適中率９４．１、感度６２．５、特異度８２．８を示した（表３）。
【0049】
【表4】
【0050】
陰性適中率と比較して陽性適中率が大幅に低く算出された要因として、圃場での薬剤散布により発病が抑えられたことが考えられる。圃場に一次伝染株が１つでもあると大量の分生子を周辺に飛散させること、一次伝染株の陰性適中率が９４．１と高いことから、土壌中の菌密度を用いたリスク評価には、定量検定よりも定性検定を用いる方が望ましいと考えられる。
【0051】
【産業上の利用可能性】
【0052】
本開示は、タマネギべと病の発症リスクの判定に関するものであり、農業の分野で利用され得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】