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特許7248984敗血症の治療のための、ワルトンジェリーから取得された間葉系幹細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-22
(45)【発行日】2023-03-30
(54)【発明の名称】敗血症の治療のための、ワルトンジェリーから取得された間葉系幹細胞
(51)【国際特許分類】
A61K 35/51 20150101AFI20230323BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230323BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230323BHJP
【ＦＩ】
A61K35/51
A61P31/04
C12N5/0775
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2019547350
(86)(22)【出願日】2018-02-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-03-26
(86)【国際出願番号】 FR2018050472
(87)【国際公開番号】W WO2018158542
(87)【国際公開日】2018-09-07
【審査請求日】2021-02-12
(31)【優先権主張番号】1751649
(32)【優先日】2017-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】515061558
【氏名又は名称】ユニバーシティ デ ロライン
(73)【特許権者】
【識別番号】519310698
【氏名又は名称】センター ホスピタリエ リージョナル ユニバーシタイア デ ナンシー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ベンソウサン，ダニエレ
(72)【発明者】
【氏名】ジボット，セバスチャン
(72)【発明者】
【氏名】レッペル，ロイク
(72)【発明者】
【氏名】ラロイ，キャロライン
(72)【発明者】
【氏名】ブーフェンツァー，アミール
(72)【発明者】
【氏名】アヴェルセンク，レノア
(72)【発明者】
【氏名】フーゼルシュタイン，セリーヌ
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１０１８３４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Stem Cells Translational Medicine, 2016, Vol.5, pp.1048-1057
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワルトンジェリー由来の解凍されたヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、敗血症の治療における使用のための医薬組成物であって、
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣは、
そのＣＤ４４の発現レベルが、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣにおけるＣＤ４４の発現レベルより少なくとも２０％低いこと；または
そのＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６もしくはＣＦＵ－Ｆの発現レベルが、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣにおけるＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６もしくはＣＦＵ－Ｆの発現レベルより少なくとも１０％低いこと；または
凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣよりも少なくとも１．５倍多くインスリンを分泌すること；
を特徴とする、
医薬組成物。
【請求項2】
敗血症が敗血症性ショックである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－ＡＢＣからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣにおいて、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより少なくとも１０％低いことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
マーカーＣＤ９０の発現レベルが、前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣにおいて、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣにおけるマーカーＣＤ９０の発現レベルより少なくとも１０％低いことを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣが、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ１、ＣＡＰＺＢ、ＬＡＳＰ１、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ３、ＰＳＡ３、ＲＳ１２、およびＳＹＷＣからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣが、ＡＣＴＳ、ＡＬ１Ｂ１、ＡＮＸ１０、ＧＢＢ１、ＧＢＢ２、ＧＰＲＩＮ１、ＤＴＮＡ、ＭＩＰＯ１、ＰＳＢ３、およびＰＳＤＥからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現しないことを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣが、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣより少なくとも１．２倍多くＶＥＧＦを分泌することを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣが、凍結／解凍サイクルに供されていないワルトンジェリー由来ヒトＭＳＣと比較して、少なくとも５％、患者における血清中のＶＥＧＦの濃度の増大を誘導することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ワルトンジェリー由来の前記ヒトＭＳＣが、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；
のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来するヒト臍帯組織に由来することを特徴とする、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトＭＳＣが、非ヒト動物由来の物質と接触していないＭＳＣであることを特徴とする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に敗血症の治療のための、ワルトンジェリー由来のヒトの間葉系幹細胞、それらを調製するための方法、およびそれらの治療での使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ほとんど知られてはいないが、敗血症性ショックは、心筋梗塞と並び、世界で１１番目に多い死因を表している。この主因は、心臓発作ではない蘇生室（ｎｏｎ－ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）における入院および死亡であり（その発生率は、１００，０００人の住人あたり５０～１００症例である）、近年増加し続けている（Ｄｏｍｂｒｏｖｓｋｉｙ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。平均余命の増加、増加する多剤耐性細菌の数、およびより高頻度な診断が、この現象の原因である。
【0003】
敗血症性ショックの生理的病態は、特に複合的であり（Ｉｓｋａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方を同時に含み、かつ、免疫抑制状態（ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｌｙｓｉｓ）を含む。従来の薬学的分子は、免疫系を強化しつつ、炎症的な態様および抗炎症的な態様の両方に作用することができないため、敗血症性ショックに特有の治療は存在しない。
【0004】
しかしながら、内毒血症および腹膜炎のマウスモデルを使用した多くの研究が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の、ＩＬ６、ＩＬ１β、ＩＬ１２、ＩＬ２、およびＩＬ１７の血漿中レベルを低下させる特性（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ａ； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｐｅｄｒａｚｚａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）、ならびに、肺、肝臓、および腸（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９）または気管支肺胞洗浄液（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ａ）においてＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１β、ＩＬ１２の組織中の濃度を低下させる特性を明らかにした。
【0005】
組織における好中球の遊走を限定するＭＳＣの特性は、組織に及ぼす有害な炎症作用の緩和を支援する（Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。盲腸結紮穿刺（ｃａｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ：ＣＬＰ）により多微生物性敗血症に供したマウス、または内毒血症により敗血症に供したマウスの組織切片の研究は、ＭＳＣで処理した際に、肺および腎臓の組織の炎症の低減を示す（Ｋｒａｓｎｏｄｅｍｂｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。同様に、これらのマウスは、生理食塩水溶液により処理されたマウスよりも有意に良好である、アミラーゼ血症（ａｍｙｌａｓｅｍｉａ）、クレアチニン血症（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅｍｉａ）、ビリルビン血症、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）などの機能的な臓器の生物学的なマーカーを提示する（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｐｅｄｒａｚｚａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。
【0006】
組織の変化を限定する特性に加え、ＭＳＣは、敗血症性ショックの間に細菌のクリアランスを増大させることができる。実際に、いくつかのチームは、敗血症のマウスへのＭＳＣの注射が、単球、マクロファージ、および好中球の食作用の活性を増大させることにより、同様にＭＳＣ自身によるＬＬ－３７およびヘプシジンなどの抗菌性ペプチドの合成および分泌を介して、菌血症の低減をもたらすことを示した（Ａｌｃａｙａｇａ－Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｄｅｖａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１３； Ｋｒａｓｎｏｄｅｍｂｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ｂ）。
【0007】
さらにＭＳＣは、肝臓、腎臓、および肺などの損傷を受けた臓器に向かい、ケモカインの勾配に沿って遊走する傾向を自身に提供する固有の「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」の特性を呈する。この損傷した組織に到達する特性は、敗血症性ショックなどの臓器不全の病態の観点から、特に注目されているＭＳＣの特性である（Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。
【0008】
最後に、重篤な敗血症のマウスモデルにおけるＭＳＣの注射を介した組織病変の低減は、生存率を高める。多くの研究が、敗血症の前後にＭＳＣにより処置された動物の死亡率の有意な低下を明らかにしている（Ａｌｃａｙａｇａ－Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｄｅｖａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ｋｒａｓｎｏｄｅｍｂｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。よって、超炎症（ｈｙｐｅｒ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を制御し、組織病変を緩和する特性を介して、ＭＳＣは、敗血症性ショック後の生存率を有意に向上できると思われる。
【0009】
３つの主要なＭＳＣの供給源：骨髄（ＢＭ）、脂肪組織、および臍帯のワルトンジェリー（ＷＧ）が存在する。ＢＭ由来のＭＳＣと比較して、麻酔を用いることなく単純で非侵襲的な方法で得られるＷＧ由来のＭＳＣは、ＢＭの回収に関連するリスクを打開することにより、ＭＳＣの提供をより一般的に使用することを可能にする。しかしながら、ＢＭ由来のＭＳＣまたは脂肪組織由来のＭＳＣは、敗血症性ショックの動物モデルにおいて研究されてきたが、ワルトンジェリー由来のＭＳＣのこの点に関する可能性は、依然として報告が不十分である。
【0010】
今日まで、５つの刊行物のみが、ＣＬＰのマウスモデルを使用することにより敗血症性ショックに関するＷＧ－ＭＳＣの治療上の可能性を解析していた（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ａ； Ｃｏｎｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。しかしながら、これらの研究で使用された細胞は、未処理の（ｆｒｅｓｈ）細胞である。恐らくは一般的な知識である幹細胞の薬理的および免疫調節的な可能性に及ぼす凍結および解凍の影響のため、敗血症性ショックの症状において解凍された（ｔｈａｗｅｄ）ＷＧ－ＭＳＣに関連する研究は、今まで公開されていない（Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０１２．１４（２）：１４７－５２； Ｃｈｉｎｎａｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｍｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。
【0011】
さらに、ＭｅｚｅｙおよびＮｅｍｅｔｈ（２０１５）は、後に注射する場合のＭＳＣの抗菌的特性の低減を記載していた。
【0012】
その結果、現在、これらの技術的な制約は、治療的な処置に関する臨床条件の下でのＷＧ－ＭＳＣの使用を妨げている。
【0013】
全ての予想を裏切り、本発明の発明者らは、解凍されたＷＧ－ＭＳＣがその治療上の潜在能力を保持しており、敗血症の治療に使用できることを最初に示した。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、敗血症（特に敗血症性ショック）の治療に使用するための、ワルトンジェリー由来の解凍されたヒトの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。
【0015】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－ＡＢＣから選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、ワルトンジェリー由来の未処理のヒトのＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより少なくとも１０％低いことを特徴とする。
【0016】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、マーカーＣＤ９０の発現レベルが、ワルトンジェリー由来の未処理のヒトのＭＳＣにおけるマーカーＣＤ９０の発現レベルより少なくとも１０％低いことを特徴とする。
【0017】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ＡＣＴＢ、ＡＮＸＡ１、ＣＡＰＺＢ、ＬＡＳＰ１、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ３、ＰＳＡ３、ＲＳ１２、およびＳＹＷＣを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現することを特徴とする。
【0018】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ＡＣＴＳ、ＡＬ１Ｂ１、ＡＮＸ１０、ＧＢＢ１、ＧＢＢ２、ＧＰＲＩＮ１、ＤＴＮＡ、ＭＩＰＯ１、ＰＳＢ３、およびＰＳＤＥを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質を実質的に発現しないことを特徴とする。
【0019】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＢＭＰ－７、ＩＧＦＢＰ－１、インスリン、ＦＧＦ－７、ＮＴ－４、およびＶＥＧＦ－Ｄから選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌することを特徴とする。
【0020】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＢＭＰ－７およびＴＧＦβ３から選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌することを特徴とする。
【0021】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＩＧＦＢＰ－１を実質的に分泌しないことを特徴とする。
【0022】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ワルトンジェリー由来の未処理のヒトのＭＳＣより少なくとも１．２倍多くＶＥＧＦを分泌することを特徴とする。
【0023】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、ワルトンジェリー由来の未処理のヒトのＭＳＣと比較して、少なくとも５％、患者における血清中のＶＥＧＦの濃度の増大を誘導することを特徴とする。
【0024】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記細胞が、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌａｂｏｕｒ）により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来するヒトの臍帯組織から得られることを特徴とする。
【0025】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記ＭＳＣが、臨床グレードの細胞であることを特徴とする。
【0026】
一実施形態では、本発明のワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣは、上記細胞が、解凍後に再度培養することなく解凍から直接得られることを特徴とする。
【0027】
また本発明は、敗血症の治療に使用するための、本発明に係るワルトンジェリー由来の解凍されたヒトのＭＳＣと薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0028】
また本発明は、ワルトンジェリーから臨床グレードの間葉系幹細胞を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞接着のために臨床グレードの培養培地でワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、接着細胞をインキュベートするステップと、
を含み、
前記組織が、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来することを特徴とする、
方法に関する。
（ｉ）細胞接着のために臨床グレードの培養培地でワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、接着細胞をインキュベートするステップと、
を含み、
前記組織が、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来することを特徴とする、
方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
本発明では、以下の用語を、以下の様式で定義する。
本発明では、以下の用語を、以下の様式で定義する。
【0030】
「新生児障害の不存在」は、新生児が、未熟児の兆候を呈さず、子宮内胎児発育遅延の兆候を呈さず、かつ胎児仮死（ｆｏｅｔａｌ ｄｉｓｔｒｅｓｓ）の兆候を呈していない事実を意味する。未熟児は、無月経の週数により決定される。子宮内胎児発育遅延は、出生時の体重、出生時の大きさ、および頭囲により決定される。胎児仮死は、臍帯血の動脈のｐＨと、Ａ＝見かけ（皮膚の色）、Ｐ＝心拍数、Ｇ＝渋面（刺激に対する反射）、Ａ＝活動性（筋緊張）、Ｒ＝呼吸（呼吸努力）により定義されるアプガー指数とによって決定される。新生児が新生児障害を呈していないことを決定するためのこれらのパラメータに関する閾値は、当業者によく知られている。
【0031】
「正期産を行うこと」は、少なくとも３９．５週の無月経の後に、３．２ｋｇ超の出生時の体重を有する新生児を出産し、分娩時の胎盤の重量が５５０グラム超である分娩を意味する。
【0032】
「管理された分娩により出産を行うこと」は、オキシトシンの投与または羊膜腔の人工的な破水を行うことにより支援される分娩を意味する。
【0033】
「臨床グレードの細胞」は、細胞の単離、培養、凍結保存、および解凍の間に、非ヒト動物の血清などの非ヒトの動物由来の物質と接触していない細胞を意味する。臨床グレードの細胞は、ヒトでの使用に適合しており、Ｇｏｏｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに準拠した培養条件下で産生された細胞である。
【0034】
「凍結保存された幹細胞」は、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保護物質溶液の存在下で、非常に低温、好ましくは－１５０℃～－１９６℃で保存された幹細胞を意味する。
【0035】
「間葉系幹細胞」は、骨髄、脂肪組織、および臍帯などの成体の生物の様々な組織で見いだされる、中胚葉性組織に由来する多分化性幹細胞を意味する。これらの間質細胞は、自己再生でき、少なくとも、限定するものではないが骨、軟骨、脂肪組織、ならびに髄質性間質（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｓｔｒｏｍａ）、平滑筋、靭帯、および腱の細胞を含む、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の系統に分化することができる。
【0036】
「解凍されたヒトの間葉系幹細胞」は、ヒト組織から単離されており、凍結保存された幹細胞の解凍プロセスを経た、間葉系幹細胞を意味する。
【0037】
「未処理のヒトの間葉系幹細胞」は、ヒト組織から単離されており、凍結－解凍プロセスを経ていない、間葉系幹細胞を意味する。
【0038】
「ワルトンジェリー」は、胚外中胚葉由来の結合組織を意味し、２つの臍動脈と臍静脈とを覆うことによって臍帯を保護する。
【0039】
「敗血症」は、病原微生物、特に細菌による、生物の一般的であり重篤な感染症を意味する。敗血症は、感染症に対する生物の不適切な応答に続発する臓器不全として定義される。重症度に応じて、敗血症状態は、２つのオーダー：狭義の敗血症（ｓｅｐｓｉｓ ｓｔｒｉｃｔｏ ｓｅｎｓｕ）および敗血症性ショックに分類することができる（“Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ （Ｓｅｐｓｉｓ－３）”， ＪＡＭＡ． ２０１６； ３１５（８）： ８０１－８１０）。最も狭い定義による敗血症は、２以上のＳＯＦＡスコア（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ）を伴う感染症、または臓器不全が感染症の前に存在した場合は２ポイント以上のＳＯＦＡスコアの増加を伴う感染症に、臨床的に関連する。敗血症性ショックは、適切な血液充填を行っても、ＭＡＰ［平均動脈圧］≧６５ｍｍＨｇとするのに十分に（ｑ．ｓ．ｆ）昇圧剤の使用を必要とし、および／または乳酸塩血症（ｌａｃｔａｔｅｍｉａ）＞２ｍｍｏｌ／Ｌ（すなわち１８ｍｇ／ｄＬ）を呈する、敗血症に関連している。
【0040】
詳細な説明
本発明は、敗血症、特に敗血症性ショックの治療に使用するための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。
本発明は、敗血症、特に敗血症性ショックの治療に使用するための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に関する。
【0041】
一実施形態では、ＭＳＣは、動物の幹細胞、好ましくは哺乳類の幹細胞、より好ましくはヒトの幹細胞である。特定の実施形態では、ＭＳＣは、ヒトの幹細胞である。
【0042】
一実施形態では、ＭＳＣは、ワルトンジェリー由来、骨髄由来、および／または脂肪組織由来である。一実施形態では、ＭＳＣは、ワルトンジェリー由来である。一実施形態では、ＭＳＣは、骨髄由来である。一実施形態では、ＭＳＣは、脂肪組織由来である。好ましくは、ＭＳＣは、ワルトンジェリー由来である。
【0043】
一実施形態では、ＭＳＣは解凍されており、すなわち凍結－解凍プロセスを経ている。
【0044】
よってより具体的には、本発明は、敗血症、特に敗血症性ショックの治療に使用するための、解凍された、ワルトンジェリー由来のヒトの間葉系幹細胞（ＷＧ－ＭＳＣ）に関する。
【0045】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣとは異なる表現型の特性を有する。
【0046】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、
細胞の少なくとも６０％が、以下の抗原：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４を発現し；
細胞の少なくとも８０％が、以下のマーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲを発現せず；
細胞の少なくとも１０％がマーカーＣＤ１０６を発現する
ことを特徴とする。
細胞の少なくとも６０％が、以下の抗原：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４を発現し；
細胞の少なくとも８０％が、以下のマーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲを発現せず；
細胞の少なくとも１０％がマーカーＣＤ１０６を発現する
ことを特徴とする。
【0047】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、
細胞の少なくとも６０％が、以下の抗原：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４を発現し；
細胞の少なくとも８０％が、以下のマーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４４、ＨＬＡ－ＤＲを発現せず；
細胞の少なくとも１０％がマーカーＣＤ１０６を発現する
ことを特徴とする。
細胞の少なくとも６０％が、以下の抗原：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４を発現し；
細胞の少なくとも８０％が、以下のマーカー：ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４４、ＨＬＡ－ＤＲを発現せず；
細胞の少なくとも１０％がマーカーＣＤ１０６を発現する
ことを特徴とする。
【0048】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＨＬＡ－ＡＢＣから選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0049】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ９０の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ９０の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0050】
「ＣＤ９０」は、膜糖タンパク質のＴｈｙ－１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０４２１６のヒトのタンパク質ＣＤ９０がある。
【0051】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ７３の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ７３の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0052】
「ＣＤ７３」は、エクト－５’－ヌクレオチダーゼの酵素（またはＮＴ５Ｅ）を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２１５８９のヒトのタンパク質ＣＤ７３がある。
【0053】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ１０５の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ１０５の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0054】
「ＣＤ１０５」は、膜糖タンパク質のエンドグリンを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１７８１３のヒトのタンパク質ＣＤ１０５がある。
【0055】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ２９の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ２９の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0056】
「ＣＤ２９」は、タンパク質のインテグリンβ－１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０５５５６のヒトのタンパク質ＣＤ２９がある。
【0057】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ４４の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ４４の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0058】
「ＣＤ４４」は、ヒアルロナン受容体を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１６０７０のヒトのタンパク質ＣＤ４４がある。
【0059】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ１４６の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ１４６の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0060】
「ＣＤ１４６」は、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ）を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ４３１２１のヒトのタンパク質ＣＤ１４６がある。
【0061】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ１６６の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ１６６の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0062】
「ＣＤ１６６」は、活性化白血球細胞接着分子（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＡＬＣＡＭ）を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ１３７４０のヒトのタンパク質ＣＤ１６６がある。
【0063】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＨＬＡ－ＡＢＣの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＨＬＡ－ＡＢＣの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0064】
「ＨＬＡ－ＡＢＣ」は、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩの表面の受容体を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｏ１９６８９のヒトのＨＬＡ－ＡＢＣがある。
【0065】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＣＤ１３およびＳｏｘ－２から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0066】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＣＤ１３の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ１３の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0067】
「ＣＤ１３」は、膜のアラニルアミノペプチダーゼを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１５１４４のヒトのタンパク質ＣＤ１３がある。
【0068】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、マーカーＳｏｘ－２の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＳｏｘ－２の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0069】
「Ｓｏｘ－２」は、転写因子ＳＲＹボックス２（ＳＲＹ－ｂｏｘ ２）を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ４８４３１のヒトのタンパク質Ｓｏｘ－２がある。
【0070】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、ＣＤ４４およびＳＳＥＡ－４から選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0071】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、マーカーＣＤ４４の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ４４の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0072】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、マーカーＳＳＥＡ－４の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＳＳＥＡ－４の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上低いことを特徴とする。
【0073】
「ＳＳＥＡ－４」は、末端のシアル酸残基を含むスフィンゴ糖脂質からなる膜のガングリオシド（期に特異的な胚性抗原４：Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ４）を意味する。
【0074】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、およびＨＬＡ－ＡＢＣから選択される少なくとも１つのマーカーの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおける同マーカーの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0075】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、マーカーＣＤ９０の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ９０の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0076】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、マーカーＣＤ１６６の発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＣＤ１６６の発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0077】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、マーカーＨＬＡ－ＡＢＣの発現レベルが、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣにおけるマーカーＨＬＡ－ＡＢＣの発現レベルより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、またはそれ以上高いことを特徴とする。
【0078】
一実施形態では、マーカーの発現レベルは、当業者によく知られている方法により測定される。一実施形態では、マーカーの発現レベルは、フローサイトメトリーにより測定される。一実施形態では、マーカーの発現レベルは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定される。
【0079】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣと比較して差次的なタンパク質の発現を特徴とする。
【0080】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＡＣＴＢ（細胞質内アクチン１）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）、ＣＡＰＺＢ（Ｆ－アクチンキャップタンパク質サブユニットβ）、ＬＡＳＰ１（ＬＩＭおよびＳＨ３のドメインタンパク質１）、ＰＲＤＸ２（ペルオキシレドキシン－２）、ＰＲＤＸ３（ミトコンドリアのチオレドキシン依存性ペルオキシドレダクターゼ）、ＰＳＡ３（プロテアソームのサブユニットα３型）、ＲＳ１２（４０Ｓのリボソームタンパク質Ｓ１２）、およびＳＹＷＣ（細胞質内のトリプトファン－ｔＲＮＡリガーゼ）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【0081】
一実施形態では、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣは、ＡＣＴＢ（細胞質内アクチン１）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）、ＣＡＰＺＢ（Ｆ－アクチンキャップタンパク質サブユニットβ）、ＬＡＳＰ１（ＬＩＭおよびＳＨ３のドメインタンパク質１）、ＰＲＤＸ２（ペルオキシレドキシン－２）、ＰＲＤＸ３（ミトコンドリアのチオレドキシン依存性ペルオキシドレダクターゼ）、ＰＳＡ３（プロテアソームのサブユニットα３型）、ＲＳ１２（４０Ｓのリボソームタンパク質Ｓ１２）、およびＳＹＷＣ（細胞質内のトリプトファン－ｔＲＮＡリガーゼ）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現しないか、または実質的に発現しない。
【0082】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍多く、ＡＣＴＢ（細胞質内アクチン１）、ＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）、ＣＡＰＺＢ（Ｆ－アクチンキャップタンパク質サブユニットβ）、ＬＡＳＰ１（ＬＩＭおよびＳＨ３のドメインタンパク質１）、ＰＲＤＸ２（ペルオキシレドキシン－２）、ＰＲＤＸ３（ミトコンドリアのチオレドキシン依存性ペルオキシドレダクターゼ）、ＰＳＡ３（プロテアソームのサブユニットα３型）、ＲＳ１２（４０Ｓのリボソームタンパク質Ｓ１２）、およびＳＹＷＣ（細胞質内のトリプトファン－ｔＲＮＡリガーゼ）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【0083】
「ＡＣＴＢ」は、タンパク質の細胞質内アクチン１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６０７０９のヒトのＡＣＴＢがある。
【0084】
「ＡＮＸＡ１」は、タンパク質のアネキシン１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０４０８３のヒトのＡＮＸＡ１がある。
【0085】
「ＣＡＰＺＢ」は、Ｆ－アクチンキャップタンパク質サブユニットβを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ４７７５６のヒトのＣＡＰＺＢがある。
【0086】
「ＬＡＳＰ１」は、ＬＩＭおよびＳＨ３のドメインタンパク質１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ１４８４７のヒトのＬＡＳＰ１がある。
【0087】
「ＰＲＤＸ２」は、ペルオキシレドキシン２を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３２１１９のヒトのＰＲＤＸ２がある。
【0088】
「ＰＲＤＸ３」は、ペルオキシレドキシン３（ミトコンドリアのチオレドキシン依存性ペルオキシドレダクターゼ）を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３００４８のヒトのＰＲＤＸ３がある。
【0089】
「ＰＳＡ３」は、プロテアソームのサブユニットα３型を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２５７８８のヒトのＰＳＡ３がある。
【0090】
「ＲＳ１２」は、４０Ｓのリボソームタンパク質Ｓ１２を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２５３９８のヒトのＲＳ１２がある。
【0091】
「ＳＹＷＣ」は、細胞質内のトリプトファン－ｔＲＮＡリガーゼを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２３３８１のヒトのＳＹＷＣがある。
【0092】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＡＣＴＳ（骨格筋のαアクチン）、ＡＬ１Ｂ１（ミトコンドリアのアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ）、ＡＮＸ１０（アネキシンＡ１０）、ＧＢＢ１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－１）、ＧＢＢ２（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－２）、ＧＰＲＩＮ１（神経突起成長のＧタンパク質調節型のインデューサー１：Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ １）、ＤＴＮＡ（ジストロブレビンα）、ＭＩＰＯ１（鏡像の多指症遺伝子１のタンパク質）、ＰＳＢ３（プロテアソームサブユニットβ３型）、およびＰＳＤＥ（２６Ｓのプロテアソームの非ＡＴＰａｓｅ調節サブユニット１４）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現しないかまたは実質的に発現しない。
【0093】
一実施形態では、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣは、ＡＣＴＳ（骨格筋のαアクチン）、ＡＬ１Ｂ１（ミトコンドリアのアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ）、ＡＮＸ１０（アネキシンＡ１０）、ＧＢＢ１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－１）、ＧＢＢ２（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－２）、ＧＰＲＩＮ１（神経突起成長のＧタンパク質調節型のインデューサー１）、ＤＴＮＡ（ジストロブレビンα）、ＭＩＰＯ１（鏡像の多指症遺伝子１のタンパク質）、ＰＳＢ３（プロテアソームサブユニットβ３型）、およびＰＳＤＥ（２６Ｓのプロテアソームの非ＡＴＰａｓｅ調節サブユニット１４）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【0094】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍少なく、ＡＣＴＳ（骨格筋のαアクチン）、ＡＬ１Ｂ１（ミトコンドリアのアルデヒドデヒドロゲナーゼＸ）、ＡＮＸ１０（アネキシンＡ１０）、ＧＢＢ１（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－１）、ＧＢＢ２（グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－２）、ＧＰＲＩＮ１（神経突起成長のＧタンパク質調節型のインデューサー１）、ＤＴＮＡ（ジストロブレビンα）、ＭＩＰＯ１（鏡像の多指症遺伝子１のタンパク質）、ＰＳＢ３（プロテアソームサブユニットβ３型）、およびＰＳＤＥ（２６Ｓのプロテアソームの非ＡＴＰａｓｅ調節サブユニット１４）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【0095】
「ＡＣＴＳ」は、タンパク質の骨格筋のαアクチンを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６８１３３のヒトのＡＣＴＳがある。
【0096】
「ＡＬ１Ｂ１」は、ミトコンドリアのアルデヒドデヒドロゲナーゼＸを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３０８３７のヒトのＡＬ１Ｂ１がある。
【0097】
「ＡＮＸ１０」は、アネキシンＡ１０を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ９ＵＪ７２のヒトのＡＮＸ１０がある。
【0098】
「ＧＢＢ１」は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６２８７３のヒトのＧＢＢ１がある。
【0099】
「ＧＢＢ２」は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットβ－２を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６２８７９のヒトのＧＢＢ２がある。
【0100】
「ＧＰＲＩＮ１」は、神経突起成長のＧタンパク質調節型のインデューサー１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ７Ｚ２Ｋ８のヒトのＧＰＲＩＮ１がある。
【0101】
「ＤＴＮＡ」は、ジストロブレビンαを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ９Ｙ４Ｊ８のヒトのＤＴＮＡがある。
【0102】
「ＭＩＰＯ１」は、鏡像の多指症遺伝子１のタンパク質を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ８ＴＤ１０のヒトのＭＩＰＯ１がある。
【0103】
「ＰＳＢ３」は、プロテアソームサブユニットβ３型を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ４９７２０のヒトのＰＳＢ３がある。
【0104】
「ＰＳＤＥ」は、２６Ｓのプロテアソームの非ＡＴＰａｓｅ調節サブユニット１４を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｏ００４８７のヒトのＰＳＤＥがある。
【0105】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍多く、ＡＭＰＭ２（メチオニンアミノペプチダーゼ２）、ＤＪＢ１１（ｄｎａＪホモログサブファミリーＢのメンバー１１）、Ｋ１Ｃ１８（ケラチン（Ｉ型細胞骨格性）１８）、Ｋ１Ｃ１９（ケラチン（Ｉ型細胞骨格性）１９）、Ｋ２Ｃ８（ケラチン（ＩＩ型細胞骨格性）８）、ＬＹＳＣ（リゾチームＣ）、ＰＤＩＡ３（タンパク質のジスルフィドイソメラーゼＡ３）、ＴＣＴＰ（翻訳上制御された腫瘍タンパク質）、およびＴＧＭ２（タンパク質－グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼ２）を含むかまたはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を、発現する。
【0106】
「ＡＭＰＭ２」は、メチオニンアミノペプチダーゼ２を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ５０５７９であるヒトのＡＭＰＭ２がある。
【0107】
「ＤＪＢ１１」は、ｄｎａＪホモログサブファミリーＢのメンバー１１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ９ＵＢＳ４であるヒトのＤＪＢ１１がある。
【0108】
「Ｋ１Ｃ１８」は、ケラチン（Ｉ型細胞骨格性）１８を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０５７８３であるヒトのＫ１Ｃ１８がある。
【0109】
「Ｋ１Ｃ１９」は、ケラチン（Ｉ型細胞骨格性）１９を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０８７２７のヒトのＫ１Ｃ１９がある。
【0110】
「Ｋ２Ｃ８」は、ケラチン（ＩＩ型細胞骨格性）８を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０５７８７のヒトのＫ２Ｃ８がある。
【0111】
「ＬＹＳＣ」は、リゾチームＣを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６１６２６のヒトのＬＹＳＣがある。
【0112】
「ＰＤＩＡ３」は、タンパク質のジスルフィドイソメラーゼＡ３を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３０１０１のヒトのＰＤＩＡ３がある。
【0113】
「ＴＣＴＰ」は、翻訳上制御された腫瘍タンパク質を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１３６９３のヒトのＴＣＴＰがある。
【0114】
「ＴＧＭ２」は、酵素のタンパク質－グルタミン γグルタミルトランスフェラーゼ２を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２１９８０のヒトのＴＧＭ２がある。
【0115】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、継代培養における少なくとも１回の継代後に、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍少なく、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ）、ＨＳＰ７Ｃ（ヒートショックコグネイト７１ｋＤａタンパク質：ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｃｏｇｎａｔｅ ７１ ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＳＰＢ１（ヒートショックプロテインβ－１）、ＬＥＧ１（ガレクチン－１）、Ｓ１０ＡＢ（タンパク質Ｓ１００－Ａ１１）、およびＵＢＥ２Ｎ（ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｎ）を含むか、またはこれらからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を発現する。
【0116】
「ＧＳＴＰ１」は、酵素のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＰを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０９２１１のヒトのＧＳＴＰ１がある。
【0117】
「ＨＳＰ７Ｃ」は、ヒートショックコグネイト７１ｋＤａタンパク質を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１１１４２のヒトのＨＳＰ７Ｃがある。
【0118】
「ＨＳＰＢ１」は、ヒートショックプロテインβ－１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０４７９２のヒトのＨＳＰＢ１がある。
【0119】
「ＬＥＧ１」は、ガレクチン－１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０９３８２のヒトのＬＥＧ１がある。
【0120】
「Ｓ１０ＡＢ」は、タンパク質Ｓ１００－Ａ１１を意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３１９４９のヒトのＳ１０ＡＢがある。
【0121】
「ＵＢＥ２Ｎ」は、ユビキチン結合酵素Ｅ２ Ｎを意味し、一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ６１０８８のヒトのＵＢＥ２Ｎがある。
【0122】
一実施形態では、タンパク質の発現は、当業者によく知られている方法により測定される。一実施形態では、タンパク質の発現は、質量分析により測定される。
【0123】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＢＭＰ－７、ＩＧＦＢＰ－１、インスリン、ＦＧＦ－７、ＮＴ－４、およびＶＥＧＦ－Ｄから選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌する。
【0124】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件における未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍多く、ＢＭＰ－７、ＩＧＦＢＰ－１、インスリン、ＦＧＦ－７、ＮＴ－４、およびＶＥＧＦ－Ｄから選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌する。
【0125】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＢＭＰ－７を、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0126】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＩＧＦＢＰ－１を、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0127】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、インスリンを、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１７５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２７５ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0128】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＦＧＦ－７を、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0129】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＮＴ－４を、少なくとも４５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上分泌する。
【0130】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件および／または非炎症性の条件において、ＶＥＧＦ－Ｄを、少なくとも５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上分泌する。
【0131】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＢＭＰ－７およびＴＧＦβ３から選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌する。
【0132】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件における未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍多く、ＢＭＰ－７およびＴＧＦβ３から選択される少なくとも１つの増殖因子を分泌する。
【0133】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＢＭＰ－７を、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７５０ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0134】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＴＧＦβ３を、少なくとも２０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｐｇ／ｍＬ、またはそれ以上、分泌する。
【0135】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＩＧＦＢＰ－１を分泌しないかまたは実質的に分泌しない。
【0136】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件における未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍少なく、ＩＧＦＢＰ－１を分泌する。
【0137】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＩＧＦＢＰ－１を、２０ｐｇ／ｍＬ未満、少なくとも１５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１ｐｇ／ｍＬ、またはそれより少なく、分泌する。
【0138】
「ＢＭＰ－７」は、骨形成タンパク質７を意味する。ＢＭＰ－７の一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１８０７５のヒトのＢＭＰ－７タンパク質がある。
【0139】
「ＩＧＦＢＰ－１」は、インスリン様増殖因子結合タンパク質１を意味する。ＩＧＦＢＰ－１の一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０８８３３のヒトのＩＧＦＢＰ－１タンパク質がある。
【0140】
「インスリン」は、血中グルコースの吸収を促進するタンパク質のホルモンを意味する。インスリンの一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ０１３０８のヒトのインスリンがある。
【0141】
「ＦＧＦ－７」は、線維芽細胞増殖因子７を意味する。ＦＧＦ－７の一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ２１７８１のヒトのＦＧＦ－７タンパク質がある。
【0142】
「ＮＴ－４」は、ニューロトロフィン４を意味する。ＮＴ－４の一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ３４１３０のヒトのＮＴ－４タンパク質がある。
【0143】
「ＶＥＧＦ－Ｄ」は、血管内皮増殖因子Ｄを意味する。ＶＥＧＦ－Ｄの一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｏ４３９１５のヒトのＶＥＧＦ－Ｄタンパク質がある。
【0144】
「ＴＧＦβ３」は、トランスフォーミング増殖因子β３を意味する。ＴＧＦβ３の一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１０６００のヒトのＴＧＦβ３タンパク質がある。
【0145】
「ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件」は、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、生きている生物の外側、好ましくは患者の外側にある条件を意味する。
【0146】
「ｉｎ ｖｉｖｏの条件」は、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、生きている生物の内側、好ましくは患者の内側にあり、すなわちこれらが患者に投与された後である条件を意味する。
【0147】
「非炎症性の条件」は、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、限定するものではないがＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γを含む炎症性サイトカインにより刺激されない条件を意味する。特に、非炎症性の条件は、ｉｎ ｖｉｖｏの条件、好ましくは、健常または実質的に健常、すなわち敗血症を罹患していない患者の内側の条件として、定義することができる。
【0148】
「炎症性の条件」は、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、限定するものではないがＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γを含む炎症性サイトカインにより刺激される条件を意味する。特に、炎症性の条件は、ｉｎ ｖｉｖｏの条件、好ましくは敗血症を罹患している患者の内側の条件として、定義することができる。
【0149】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＶＥＧＦを分泌する。
【0150】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍多く、ＶＥＧＦを分泌する。
【0151】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＶＥＧＦを、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１．７５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２ｎｇ／ｍＬ、またはそれ以上分泌する。
【0152】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＶＥＧＦを分泌しないかまたは実質的に分泌しない。
【0153】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣより、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、７．５倍、１０．０倍、１５．０倍、２０．０倍、３０．０倍、４０．０倍、５０．０倍少なく、ＶＥＧＦを分泌する。
【0154】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ＶＥＧＦを、５００ｐｇ／ｍＬ未満、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬ、またはそれより少なく、分泌する。
【0155】
「ＶＥＧＦ」は、血管内皮増殖因子を意味する。ＶＥＧＦの一例として、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ１５６９２のヒトのＶＥＧＦタンパク質がある。
【0156】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件および／または炎症性の条件において、ＶＥＧＦの分泌を誘導する。
【0157】
いくつかの細胞は、ＶＥＧＦを分泌する。このような細胞の例として、限定するものではないが、マクロファージ、単球、内皮細胞、筋線維芽細胞、軟骨細胞、および造血系細胞が挙げられる。
【0158】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上の、血清中のＶＥＧＦの濃度の増大を誘導する。
【0159】
一実施形態では、解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、未処理のＭＳＣ、好ましくは未処理のＷＧ－ＭＳＣと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上の、ＶＥＧＦの血漿中濃度の増大を誘導する。
【0160】
一実施形態では、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、非常に低温で保存される。一実施形態では、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、約－２０℃、好ましくは約－８０℃、好ましくは－１５０℃～－１９６℃で保存される。一実施形態では、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、凍結保護物質溶液の存在下で保存される。細胞用の凍結保護物質溶液は、当業者によく知られている。一実施形態では、凍結保護物質溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ホルムアミド、ブテンジオール、およびそれらの混合物から選択される少なくとも１種の凍結保護物質を含む。
【0161】
一実施形態では、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、従来の解凍プロトコルにより解凍される。例として、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、３７℃のウォーターバスで解凍され、次に、ＮａＣｌ、アルブミン、およびＡＣＤ－Ａ（ａｃｉｄ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｆｏｒｍｕｌａ Ａ）を含む洗浄溶液の存在下で洗浄される。
【0162】
本発明の特定の実施形態は、適切な血液充填にも関わらず、動脈性低血圧の発症もしくは持続、および／または末梢循環不全の兆候により定義される敗血症の最も重篤な形態である、敗血症性ショックの治療に使用するための、上述のように解凍されたＷＧ－ＭＳＣに関する。
【0163】
好適な実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、解凍後再度培養されることなく、解凍から直接得られる。
【0164】
解析される細胞が凍結または解凍に供されておらず早期に敗血症性ショックのモデルの動物に投与される未処理の細胞であった従来の研究とは対照的に、本発明の結果は、臨床条件に適合する条件下のＷＧ－ＭＳＣ、すなわち敗血症の発症における解凍されたＷＧ－ＭＳＣの後期での投与の有効性のエビデンスを、初めて提供する。
【0165】
本発明は、解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、骨髄から単離された解凍済みのＭＳＣ細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）と比較できるレベルで、免疫調節および抗菌性の特性を保持しており、さらにＷＧ－ＭＳＣの投与が、ＢＭ－ＭＳＣで処理したマウスの生存率と比較して、敗血症性ショックを罹患したマウスの生存率の増大を可能にすることを証明している。
【0166】
これらの結果は、解凍されたＷＧ－ＭＳＣが、敗血症性ショックの治療に関する臨床条件下での即座の使用に適切であることを示している。
【0167】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、解凍後に洗浄されている。一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、解凍後に懸濁液に戻されている。一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、ヒドロキシエチルスターチ溶液での解凍後に、懸濁液に戻されている。一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、アルブミン溶液において解凍後に懸濁液に戻される。一実施形態では、アルブミン溶液は、４％のアルブミン溶液である。一実施形態では、アルブミン溶液はまた、ＮａＣｌおよび／またはＡＣＤ－Ａを含む。
【0168】
また本発明において、本発明者らは、初めて、分娩因子（ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ ｆａｃｔｏｒ）とＷＧ－ＭＳＣの増殖との間の有意な相関を観測し、より良好な増殖能を有するＷＧ－ＭＳＣを得るための臍帯の選択に関する基準を提供する。
【0169】
本発明の１つの目的は、これらの基準を満たすヒトの臍帯組織由来のＷＧ－ＭＳＣに関する。
【0170】
これら基準は、（特に継代Ｐ１における）細胞数の倍加時間を低減することにより、細胞増殖を向上させることが観察されている。これらの基準はまた、短い倍加時間でより多数の細胞を取得することを可能にする。
【0171】
好適な実施形態では、本発明で使用されるＷＧ－ＭＳＣは、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来するヒトの臍帯組織に由来する。
【0172】
本発明者らは、これらの分娩因子が、ＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣの細胞増殖にプラスの影響を与え、良好な増殖特性を伴うＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣを選択することを可能にすることを観測した。
【0173】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、臨床グレードの細胞である。
【0174】
結果的に、本発明に使用されるいずれかの培養培地または試薬は、非ヒトの動物由来の物質を全く含まない。一実施形態では、使用されるいずれの培養培地および試薬も、非ヒトの動物由来の血清を含まない。一実施形態では、使用されるいずれの培養培地および試薬も、いずれの起源の血清、さらにはヒトの血清を含まない。
【0175】
好適には、細胞接着のために本発明に使用される培養培地は、ヒトの血小板のライセートを含む。
【0176】
本発明の別の目的は、敗血症の治療に使用するための、上述の解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣを含む組成物である。
【0177】
本発明の別の目的は、敗血症の治療に使用するための、たとえば上述されたものなどの、ワルトンジェリー由来の臨床グレードの解凍された間葉系幹細胞を有効成分として含む医薬組成物である。
【0178】
また上記組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0179】
本発明では、薬学的に許容される賦形剤は、非ヒトの動物由来の物質を含まず、毒性、刺激作用、または誘導型のアレルギー性の応答を伴うことない、ヒトの個体の細胞との接触での使用に適している賦形剤である。当業者は、本組成物の本草薬物的処方（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）およびその投与方法に応じて、薬学的に許容される賦形剤を選択する方法を承知している。
【0180】
例として、上記賦形剤は、４％のアルブミン、またはヒドロキシエチルスターチ溶液（ＨＥＡ）１３０／０．４２である。
【0181】
上記医薬組成物は、注入製品の形態とすることができ、注入バッグにパッケージングすることができる。
【0182】
本発明の別の目的は、敗血症の治療に使用するための、上述の解凍されたＭＳＣ、好ましくは解凍されたＷＧ－ＭＳＣを含む医薬である。
【0183】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、全身的または局所的に、患者に投与することができる。
【0184】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、静脈内、血管内、脳内、非経口的、腹腔内、硬膜外、脊髄内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）、関節内、滑膜内、髄腔内、動脈内、心臓内、または筋肉内の経路により、患者に投与することができる。
【0185】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、ボーラス注射（急速注射（ｒａｐｉｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）とも呼ばれる）または連続注入（遅行注射（ｓｌｏｗ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）とも呼ばれる）により、患者に投与することができる。
【0186】
好ましい実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、静脈内投与される。
【0187】
本発明では、上述した臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、体重１ｋｇあたり約０．３×１０６～３×１０６個の細胞、特に体重１ｋｇあたり１×１０６個の細胞の用量で、敗血症を罹患した患者に投与することができる。当業者は、感染症の重症度、患者の体重、投与の回数または頻度によってこの用量を調節することができる。
【0188】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１０３～１０９ＭＳＣ／ｋｇ、好ましくは１０４～１０８ＭＳＣ／ｋｇ、好ましくは１０５～１０７ＭＳＣ／ｋｇの範囲の用量で、患者に投与することができる。
【0189】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、２×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、３×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、４×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、５×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、６×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、７×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、８×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、９×１０５ＭＳＣ／ｋｇ、１×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、２×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、３×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、４×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、５×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、６×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、７×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、８×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、９×１０６ＭＳＣ／ｋｇ、１×１０７ＭＳＣ／ｋｇの用量で、患者に投与することができる。
【0190】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１０３～１０９ＭＳＣ／ｋｇ／日、好ましくは１０４～１０８ＭＳＣ／ｋｇ／日、好ましくは１０５～１０７ＭＳＣ／ｋｇ／日の範囲の用量で、患者に投与することができる。
【0191】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、２×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、３×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、４×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、５×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、６×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、７×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、８×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、９×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、１×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、２×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、３×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、４×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、５×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、６×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、７×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、８×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、９×１０６ＭＳＣ／ｋｇ／日、１×１０７ＭＳＣ／ｋｇ／日の用量で、患者に投与することができる。
【0192】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１０３～１０９ＭＳＣ／日、好ましくは１０４～１０８ＭＳＣ／日、好ましくは１０５～１０７ＭＳＣ／日の範囲の用量で、患者に投与することができる。
【0193】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１×１０５ＭＳＣ／ｋｇ／日、２×１０５ＭＳＣ／日、３×１０５ＭＳＣ／日、４×１０５ＭＳＣ／日、５×１０５ＭＳＣ／日、６×１０５ＭＳＣ／日、７×１０５ＭＳＣ／日、８×１０５ＭＳＣ／日、９×１０５ＭＳＣ／日、１×１０６ＭＳＣ／日、２×１０６ＭＳＣ／日、３×１０６ＭＳＣ／日、４×１０６ＭＳＣ／日、５×１０６ＭＳＣ／日、６×１０６ＭＳＣ／日、７×１０６ＭＳＣ／日、８×１０６ＭＳＣ／日、９×１０６ＭＳＣ／日、１×１０７ＭＳＣ／日の用量で、患者に投与することができる。
【0194】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、単回投与、または経時的に間隔をあけた複数回の投与で、投与することができる。
【0195】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１日あたり１回、１日あたり２回、１日あたり３回、またはそれ以上投与することができる。
【0196】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごとに投与することができる。
【0197】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１週間あたり１回、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごとに、投与することができる。
【0198】
一実施形態では、本発明で使用されるＭＳＣ、好ましくはＷＧ－ＭＳＣは、１ケ月あたり１回、１ケ月ごと、２ケ月ごと、３ケ月ごと、４ケ月ごと、５カ月ごと、６ケ月またはそれ以上の日数ごとに、投与することができる。
【0199】
本発明では、上述した、解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、たとえば４％のアルブミン溶液（４ｇ／１００ｍＬ）またはヒドロキシエチルスターチ溶液（ＨＥＡ）１３０／０．４２といった適切な賦形剤において、使用する前に希釈することができる。
【0200】
本発明に係る敗血症の治療のための解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、単独で使用することができ、あるいは、別の敗血症の治療、特に、抗菌薬による治療の前、間、または後に使用することができる。
【0201】
一実施形態では、敗血症の治療は、当業者によく知られており、限定するものではないが、抗菌薬による治療、抗真菌薬による治療、血液充填、昇圧剤の投与、および副腎皮質ステロイド療法（ｃｏｒｔｉｃｏｔｈｅｒａｐｙ）が挙げられる。
【0202】
好適な実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、抗菌薬による治療下にある敗血症を罹患した患者に、投与される。
【0203】
一実施形態では、患者は、少なくとも１種の抗菌薬で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも２種の抗菌薬で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも３種以上の抗菌薬で治療されている。
【0204】
敗血症の治療用の抗菌薬の例として、限定するものではないが、アンピシリン、アジスロマイシン、アズトレオナム、セファゾリン、セフェピム、クリンダマイシン、レボフロキサシン、リネゾリド、メロペネム、メトロニダゾール、ピペラシリン、タゾバクタム、トブラマイシン、およびバンコマイシンが挙げられる。
【0205】
一実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、抗真菌薬による治療下にある敗血症を罹患した患者に、投与される。
【0206】
一実施形態では、患者は、少なくとも１種の抗真菌薬で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも２種の抗真菌薬で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも３種以上の抗真菌薬で治療されている。
【0207】
敗血症の治療用の抗真菌薬の例として、限定するものではないが、アムホテリシンＢデオキシコール酸塩、アニデュラファンギン、カスポファンギン、フルコナゾール、イトラコナゾール、ミカファンギン、およびボリコナゾールが挙げられる。
【0208】
一実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、血液充填下にある敗血症を罹患した患者に、投与される。
【0209】
血液充填は、血管内の容量を回復させることにより、血液量減少を訂正し、平均動脈圧を６５ｍｍＨｇ超に維持し、低灌流の臨床兆候を限定することを可能にする。血液充填は、溶質を用いて行われる。
【0210】
敗血症の治療における血液充填用の溶質の例として、限定するものではないが、コロイドおよび晶質が挙げられる。
【0211】
一実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、昇圧剤での治療下にある敗血症を罹患した患者に、投与される。
【0212】
一実施形態では、患者は、少なくとも１種の昇圧剤で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも２種の昇圧剤で治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも３種以上の昇圧剤で治療されている。
【0213】
敗血症の治療用の昇圧剤の例として、限定するものではないが、カテコールアミン（ノルアドレナリンおよびアドレナリンを含む）、ならびにバソプレシンが挙げられる。
【0214】
一実施形態では、敗血症の治療に使用するための臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣは、副腎皮質ステロイドによる治療下にある敗血症を罹患した患者に、投与される。
【0215】
一実施形態では、患者は、少なくとも１種の副腎皮質ステロイドで治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも２種の副腎皮質ステロイドで治療されている。一実施形態では、患者は、少なくとも３種以上の副腎皮質ステロイドで治療されている。
【0216】
敗血症の治療用の副腎皮質ステロイドの例として、限定するものではないが、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、およびプレドニゾンが挙げられる。
【0217】
他の治療の中には、敗血症に適切なものがあり、当業者によく知られている。このような治療の例として、限定するものではないが、ＡＢ１０３、組み換え型アルカリホスファターゼｒｅｃＡＰ、ＣａＣＰ２９、活性型ドロトレコギン・アルファ、ＥＡ－２３０、エリトラン、エスモロール、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、レネルセプト、レボシメンダン、ＬＲ１２、セレプレッシン（ｓｅｌｅｐｒｅｓｓｉｎ）、タラクトフェリンアルファ（ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ａｌｐｈａ）、およびヒト組み換え型トロンボモジュリンが挙げられる。
【0218】
本発明の別の態様は、ワルトンジェリーから臨床グレードの間葉系幹細胞を調製するための方法に関する。本発明の方法は、良好な増殖能を有するＷＧ－ＭＳＣを産生させることを目標とする。
【0219】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明で定義されるＷＧ－ＭＳＣを産生させることを目標とする。一実施形態では、本発明の方法は、敗血症の治療に使用するための本発明で定義されるＷＧ－ＭＳＣを産生させることを目標とする。
【0220】
上記方法は、以下のステップ：
（ｉ）細胞接着のため、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含む。
（ｉ）細胞接着のため、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含む。
【0221】
上記方法は、以下のステップ：
（ｉ）細胞接着のための培養培地で、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含む。
（ｉ）細胞接着のための培養培地で、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含む。
【0222】
一実施形態では、上記方法は、以下のステップ：
（ｉ）細胞接着のための臨床グレードの培養培地で、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含み、
前記組織が、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来することを特徴とする。
（ｉ）細胞接着のための臨床グレードの培養培地で、ワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織を培養するステップと、
（ｉｉ）血小板のライセートを含む培地で、ステップ（ｉ）で入手した前記接着細胞をインキュベートするステップと
を含み、
前記組織が、以下の基準：出産の間にオキシトシンの投与を受けた；管理された分娩により出産を行った；正期産を行った；妊娠中に子癇前症を呈さず、その小児が新生児障害を呈さなかった；および妊娠中に煙草の煙を摂取した；のうちの少なくとも１つを満たす母体に由来することを特徴とする。
【0223】
母体に関連して臍帯を選択するための上述の基準は、より良好な増殖特性を有するＷＧ－ＭＳＣを入手することを可能にする。
【0224】
本発明では、ヒトの臍帯組織は、上記基準を満たす母体から分娩の直後に産科病棟で回収される。
【0225】
一実施形態では、ヒトの臍帯は、選択され、培養される。一実施形態では、臍動脈および臍静脈は、臍帯の培養前に除去される。一実施形態では、臍動脈および臍静脈は、臍帯の培養前に除去されない。
【0226】
一実施形態では、臍帯は、培養前に洗浄される。一実施形態では、臍帯は、α－ＭＥＭ溶液、好ましくは臨床グレードのα－ＭＥＭ溶液ですすぐ。一実施形態では、α－ＭＥＭ溶液、好ましくは臨床グレードのα－ＭＥＭ溶液は、少なくとも１種の抗菌薬および／または少なくとも１種の抗真菌薬をさらに含む。一実施形態では、上記少なくとも１種の抗菌薬は、ゲンタマイシン、アモキシシリン、およびバンコマイシンから選択される。一実施形態では、上記少なくとも１種の抗真菌薬は、アムホテリシンＢである。
【0227】
一実施形態では、臍帯を、培養前にすすぐ。一実施形態では、臍帯を、ＰＢＳの溶液ですすぐ。
【0228】
一実施形態では、細胞接着に関するワルトンジェリーを含むヒトの臍帯組織の培養物は、乾燥した培養物である。一実施形態では、ステップ（ｉ）で使用される細胞接着のための培養培地、好ましくは臨床グレードの培養培地は、α－ＭＥＭ培地である。
【0229】
一実施形態では、ステップ（ｉｉ）で使用される血小板のライセートを含む培地は、α－ＭＥＭ培地である。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）で使用される血小板のライセートを含む培地は、１～２０％の血小板のライセート、好ましくは１％～１５％、好ましくは１％～１０％、好ましくは２．５％～７．５％、好ましくは約５％の血小板のライセートをさらに含む。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）で使用される血小板のライセートを含む培地は、さらに少なくとも１種の抗菌薬を含む。一実施形態では、上記少なくとも１種の抗菌薬は、ゲンタマイシンである。一実施形態では、ステップ（ｉｉ）で使用される血小板のライセートを含む培地は、さらにヘパリンを含む。
【0230】
一実施形態では、本発明に係る方法のステップ（ｉｉ）は、低酸素の条件下、好ましくは５％のＣＯ２／５％のＯ２で行われる。一実施形態では、本発明に係る方法のステップ（ｉｉ）は、３７℃で行われる。
【0231】
一実施形態では、本発明に係る方法のステップ（ｉｉ）の実施の間、細胞を、最大８０％±１０％のコンフルエンスで培養する。
【0232】
好適には、上記方法のステップ（ｉｉ）は、数回、特に２回または３回、反復される。本発明では、「継代」は、本方法のステップ（ｉｉ）の各反復を意味する。たとえば、本方法のステップ（ｉｉ）の最初の実施は、継代Ｐ０に対応し；その最初の反復は、第１の継代（または継代Ｐ１）に対応し；その第２の反復は、第２の継代（または継代Ｐ２）に対応し、その他の形態も同様である。
【0233】
本発明では、ステップ（ｉｉ）を、８０％±１０％のコンフルエンスに達した後に反復する場合、当業者に知られているいずれかの技術、特に、臨床グレードのトリプシンの作用により、細胞を剥離する。
【0234】
本発明では、ステップ（ｉｉ）の終了時に回収した細胞は、約－２０℃、好ましくは約－８０℃、好ましくは－１５０℃～－１９６℃、好ましくは約－１５０℃で凍結保存される。
【0235】
本発明を、後述の図面および実施例で、より詳細に例示する。
【図面の簡単な説明】
【0236】
【図1】図１Ａおよび図１Ｂ：これらの図面はそれぞれ、嫌気条件（図１Ａ）または好気条件（図１Ｂ）での脾臓１ｍｇあたりのＣＦＵの平均数を示す。これらの結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。ｎ＝グループあたり７～１２匹のマウス。＊ｐ＜０．０５ ＭＳＣ対ＰＢＳ
【図2】図２Ａおよび図２Ｂ：これらの図面はそれぞれ、嫌気条件（図２Ａ）または好気条件（図２Ｂ）での血液１ｍＬあたりのＣＦＵの数を示す。これらの結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。ｎ＝グループあたり７～１２匹のマウス。＊ｐ＜０．０５ ＭＳＣ対ＰＢＳ
【図3-1】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ：これらの図面はそれぞれ、肺（図３Ａ）、脾臓（図３Ｂ）、肝臓（図３Ｃ）、および大腿（図３Ｄ）における好中球の動態を示す。これらの結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。ｎ＝グループあたり４～６匹のマウス。＊ｐ＜０．０５ ＭＳＣ対ＰＢＳ；＊＊ｐ＜０．０１ ＭＳＣ対ＰＢＳ；＊＊＊ｐ＜０．００１ ＭＳＣ対ＰＢＳ
【図3-2】同上。
【図4-1】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ：これらの図面はそれぞれ、肺（図４Ａ）および大腿（図４Ｂ）における単球の動態、または肺（図４Ｃ）および大腿（図４Ｄ）における炎症性単球の動態を示す。これらの結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。ｎ＝グループあたり４～６匹のマウス。＊ｐ＜０．０５ ＭＳＣ対ＰＢＳ；＊＊ｐ＜０．０１ ＭＳＣ対ＰＢＳ；＃＃ｐ＜０．０１ ＢＭ－ＭＳＣ対ＷＧ－ＭＳＣ
【図4-2】同上。
【図5】この図面は、ＷＧ－ＭＳＣで処置したマウス、ＢＭ－ＭＳＣで処置したマウス、および未処置のマウスの、盲腸結紮穿刺後の生存率を示す。この結果は、カプランマイヤー曲線として示される。ｎ＝グループあたり１８～２５匹のマウス。＊ｐ＜０．０５ ＭＳＣ対ＰＢＳ
【図6-1】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ：これらの図面は、処置していないブタと比較した、ブタにおける敗血症に及ぼすＷＧ－ＭＳＣによる処置の影響を示す。図６Ａは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として酸素での静脈血飽和度を比較する（＊＊ｐ＜０．０１ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｂは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として平均動脈圧の減少を比較する（＊＊ｐ＜０．０１ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｃは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として、投与したノルアドレナリンの濃度を比較する（＊＊ｐ＜０．０００１ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｄは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として、血漿中クレアチニン濃度を比較する（＊＊ｐ＜０．０１ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｅは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、利尿を比較する。図６Ｆは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として乳酸塩血症を比較する（＊＊ｐ＜０．０１ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｇは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数としてＰａＯ２／ＦｉＯ２比を比較する（＊ｐ＜０．５ ＷＧ－ＭＳＣ対対照）。図６Ｈは、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループおよび処置を行わなかったグループにおいて、時間の関数として動物の生存率を比較する。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【図6-4】同上。
【実施例】
【0237】
実施例１：ＷＧ－ＭＳＣの産生
ＷＧ－ＭＳＣの単離
ヒトの臍帯は、ドナーの母親に情報提供し、この母親の記載済みの同意書を入手した後に、ナンシーのＲｅｇｉｏｎａｌ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ－ＣＨＲＵ）の産科病棟で回収された。臍帯を、回収培地に配置し、４℃に保存した。無菌のコンテナ（たとえばＣｒｙｏｋｉｔｓ，Ｖｅｒｒｅｒｉｅｓ Ｔａｌａｎｃｏｎｎａｉｓｅｓ）の中に置かれた回収培地は、７近くのｐＨを確保するためのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ，ＢＣ０１２００２０）、残存する血液の凝固を防止するためのヘパリン、抗菌薬（ゲンタマイシン）から構成されている。この臍帯は、回収後、輸送培地において４℃で２４時間保存することができる。
ＷＧ－ＭＳＣの単離
ヒトの臍帯は、ドナーの母親に情報提供し、この母親の記載済みの同意書を入手した後に、ナンシーのＲｅｇｉｏｎａｌ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｅｎｔｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ－ＣＨＲＵ）の産科病棟で回収された。臍帯を、回収培地に配置し、４℃に保存した。無菌のコンテナ（たとえばＣｒｙｏｋｉｔｓ，Ｖｅｒｒｅｒｉｅｓ Ｔａｌａｎｃｏｎｎａｉｓｅｓ）の中に置かれた回収培地は、７近くのｐＨを確保するためのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ，ＢＣ０１２００２０）、残存する血液の凝固を防止するためのヘパリン、抗菌薬（ゲンタマイシン）から構成されている。この臍帯は、回収後、輸送培地において４℃で２４時間保存することができる。
【0238】
受領した後、臍帯を、それぞれの最終濃度が０．５ｇ／Ｌ；１ｇ／Ｌ；１ｇ／Ｌおよび０．０５ｇ／Ｌである、臨床グレードのα－ＭＥＭ培養培地（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ，ＢＣ０１１００１０）におけるゲンタマイシン、アモキシシリン、バンコマイシン、およびアムホテリシンＢから構成された抗菌性－抗真菌性溶液に、大気温度で１時間浸漬する。この溶液槽は、回収の間のコンタミネーションに続発する、培養の間の微生物発育のリスクを下げる。
【0239】
臍帯をデコンタミネーションした後、臍帯の静脈および外側の部分は、ＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳ１０ｍＬを、シリンジを使用して臍静脈内に注射して、残存する血液を除去する。次に、この臍帯を、滅菌メスを使用して５ｃｍの断片にあらかじめ切断し、次に、微細な横断面の切片（厚さ２～３ｍｍ）を作製する。次に、これらの断片を、取り外し可能な蓋を有する培養ディッシュ（ＴＰＰ，９０５５２）に配置する。ディッシュの底部に対するこの断片の乾燥接着を１５分間行い、次に、ゲンタマイシンおよびヘパリンの存在下で、５％の血小板のライセート（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ，ＢＣ０１９００２０）により補充されたα－ＭＥＭから構成された完全培地を添加する。培養は、専用のインキュベーターで、５％のＣＯ２および低酸素（５％のＯ２）下にて、３７℃で行う。５日後に、培養培地を交換する。
【0240】
約１０日間の培養後に、ＷＧ－ＭＳＣは遊走し、培養ディッシュの底部に接着する。次に、これらの断片を、滅菌したプライヤを使用して除去し、ディッシュをＰＢＳバッファーで洗浄する。次に、細胞を、１５日～３週間（Ｄ１４～Ｄ２１）の間、コンフルエンス（＞８０％）となるまで培養する。
【0241】
ＷＧ－ＭＳＣの培養
コンフルエンスに達した後、細胞を、組み換え型トリプシンＧＭＰ（ＴｒｙｐＬＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の作用により、剥離させる。
コンフルエンスに達した後、細胞を、組み換え型トリプシンＧＭＰ（ＴｒｙｐＬＥ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の作用により、剥離させる。
【0242】
洗浄した後、この細胞を、継代１において１ｃｍ２あたり１×１０３個の細胞で、完全培地に再度播種する。ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ型である２つのステージの１２７０ｃｍ２の表面積を有する培養ユニット（ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ２，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）、およびチムニーを備えるユニバーサルなキャップ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃａｐ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｎｅｙ）（ＭＰＣ ｃａｐ，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）を使用する。播種キット（ＢＣ０４０００１１，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）は、培地の様々な成分および細胞の適用を可能にするチューブ、ならびに培養容器に接続するための接続部（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）のシステムを含む。
【0243】
コンフルエンス（＞８０％）を得るまで（培養の開始後Ｄ７～Ｄ８の間）に、１週間あたり１回、培地を交換する。このために、培地の様々な成分を適用するためのチューブ、廃棄バッグ、および培養容器に接続するための接続部のシステムを含む、培地交換キット（ＢＣ０４０００２１，Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）、およびチムニーを備えるユニバーサルなキャップを使用する。しかしながら、ほとんどの時間、継代Ｐ１は、１週間持続し、培地の交換は必要ではない。
【0244】
コンフルエンスを得た後、細胞を、マスターセルバンク（ＭＣＢ）で凍結保存する。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＭＣＢを、組織または単一細胞に由来しており、定義した条件下にてアリコートで保存された、均一な組成物である細胞の集団と定義している。
【0245】
細胞の最終的な回収
継代Ｐ１の終了時にコンフルエンスに達した後、細胞を、上述のようにトリプシンの作用により回収し、次に洗浄する。バイアビリティの確認および細胞の計数およびＰ１の様々な確認を行う（以下の表を参照）。次に、細胞を凍結する。
継代Ｐ１の終了時にコンフルエンスに達した後、細胞を、上述のようにトリプシンの作用により回収し、次に洗浄する。バイアビリティの確認および細胞の計数およびＰ１の様々な確認を行う（以下の表を参照）。次に、細胞を凍結する。
【0246】
ＭＳＣおよびＭＣＢの保存
ＭＳＣを、温度および窒素レベルを継続的にモニタリングしている（窒素蒸気中の）タンクに－１５０℃で保存する。さらに、対照を作製するための５～１０本のＭＳＣのサンプルチューブも、同様に凍結する。
ＭＳＣを、温度および窒素レベルを継続的にモニタリングしている（窒素蒸気中の）タンクに－１５０℃で保存する。さらに、対照を作製するための５～１０本のＭＳＣのサンプルチューブも、同様に凍結する。
【0247】
ＭＣＢの解凍およびＭＳＣの洗浄
ＭＳＣを、Ｓｅｐａｘ技術（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して解凍および洗浄し、次にＰ１に関するものと同じプロトコルにより、継代２および継代３の再播種を行う。
ＭＳＣを、Ｓｅｐａｘ技術（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して解凍および洗浄し、次にＰ１に関するものと同じプロトコルにより、継代２および継代３の再播種を行う。
【0248】
細胞の最終的な回収
継代Ｐ３の終了時にコンフルエンスに達した後、細胞を、上述のトリプシンの作用により回収し、次に洗浄する。バイアビリティの確認および細胞の計数および様々な産生終了の確認を行う（以下の表を参照）。次に、細胞を、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）で凍結する。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＷＣＢを、ＭＣＢの１つまたは数個のアリコートに由来する細胞の集団と定義している。ＭＣＢの細胞は、選択した継代まで段階的に継代培養することにより増殖され、この後に、細胞は、組み合わせられ、濃縮され、アリコートされる。この方法で入手されるＷＣＢの１つまたは数個のアリコートは、その使用の観点から、最終的な産物のバッチを作製するために使用することができる。
継代Ｐ３の終了時にコンフルエンスに達した後、細胞を、上述のトリプシンの作用により回収し、次に洗浄する。バイアビリティの確認および細胞の計数および様々な産生終了の確認を行う（以下の表を参照）。次に、細胞を、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）で凍結する。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ＷＣＢを、ＭＣＢの１つまたは数個のアリコートに由来する細胞の集団と定義している。ＭＣＢの細胞は、選択した継代まで段階的に継代培養することにより増殖され、この後に、細胞は、組み合わせられ、濃縮され、アリコートされる。この方法で入手されるＷＣＢの１つまたは数個のアリコートは、その使用の観点から、最終的な産物のバッチを作製するために使用することができる。
【0249】
ＷＣＢのＭＳＣの保存
ＭＳＣを、温度および窒素レベルを継続的にモニタリングしている（窒素蒸気中の）タンクに－１５０℃で保存する。さらに、対照を作製するための５～１０本のＭＳＣのサンプルチューブも、同様に凍結する。
ＭＳＣを、温度および窒素レベルを継続的にモニタリングしている（窒素蒸気中の）タンクに－１５０℃で保存する。さらに、対照を作製するための５～１０本のＭＳＣのサンプルチューブも、同様に凍結する。
【0250】
ＷＣＢのＭＳＣの解凍および洗浄、ならびにＭＳＣの輸送
ＭＳＣを、Ｓｅｐａｘ技術（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して解凍および洗浄し、次に、４％のアルブミンと共に７５ｍＬの体積で採取し、４～１０℃で保存する。ＭＳＣは、規制運用モードにしたがい標識されたバッグ（１５０ｍｌのバッグ）にパッケージングされ；上記バッグは、それ自体が標識される二次的なパッケージング（プラスチックバッグ）、次に、温度ロガー、バリデーションの証明書、注射の特記事項、および投与後の忍容性のシートを伴う輸送コンテナの中に置かれる。投与場所へのＭＳＣの輸送は、ＣＨＲＵにより承認された運搬装置により行われる。
ＭＳＣを、Ｓｅｐａｘ技術（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して解凍および洗浄し、次に、４％のアルブミンと共に７５ｍＬの体積で採取し、４～１０℃で保存する。ＭＳＣは、規制運用モードにしたがい標識されたバッグ（１５０ｍｌのバッグ）にパッケージングされ；上記バッグは、それ自体が標識される二次的なパッケージング（プラスチックバッグ）、次に、温度ロガー、バリデーションの証明書、注射の特記事項、および投与後の忍容性のシートを伴う輸送コンテナの中に置かれる。投与場所へのＭＳＣの輸送は、ＣＨＲＵにより承認された運搬装置により行われる。
【0251】
産生プロセスの過程の間に行われるクオリティコントロール
投与される産物の無菌性および安全性を保障するために、産物のコントロールを、培養プロセスの各ステップで行う。全てのクオリティコントロールを、表１に列挙する。
投与される産物の無菌性および安全性を保障するために、産物のコントロールを、培養プロセスの各ステップで行う。全てのクオリティコントロールを、表１に列挙する。
【0252】
【表1】
【0253】
細胞のコントロール
細胞の計数
産生の開始時および各細胞回収ステップ時（Ｐ０およびＰ３）に、細胞の数を、赤血球の溶解後に血球計算器を使用して決定する。
細胞の計数
産生の開始時および各細胞回収ステップ時（Ｐ０およびＰ３）に、細胞の数を、赤血球の溶解後に血球計算器を使用して決定する。
【0254】
細胞のバイアビリティ
産生の開始時および各細胞回収ステップ時に、バイアビリティを、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の終了時（ここで＞８０％であるべきである）に、７－ＡＡＤによるマーキングにより、フローサイトメトリーにより決定する。
産生の開始時および各細胞回収ステップ時に、バイアビリティを、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の終了時（ここで＞８０％であるべきである）に、７－ＡＡＤによるマーキングにより、フローサイトメトリーにより決定する。
【0255】
細胞の表現型
細胞種を特徴づける表面マーカーの発現は、モノクローナル抗体または対応するアイソタイプの対照を用いて細胞をマークした後、フローサイトメトリーにより決定する。
細胞種を特徴づける表面マーカーの発現は、モノクローナル抗体または対応するアイソタイプの対照を用いて細胞をマークした後、フローサイトメトリーにより決定する。
【0256】
細胞の少なくとも６０％は、以下の抗原：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４を発現し、細胞の８０％は、以下：ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲを発現しない（および／またはＩＭＦ＜アイソタイプの対照の２倍のＩＭＦ）はずである。マーカーＣＤ１０６は、細胞の少なくとも１０％で同定される。
【0257】
ＣＦＵ－Ｆ
クローン形成能（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、線維芽細胞前駆体の培養物（線維芽細胞のコロニー形成単位：ＣＦＵ－Ｆ）により測定される。ＣＦＵ－Ｆ（＞５０個の細胞）を、メタノールで固定しギムザで染色した後に、１０倍の倍率の倒立顕微鏡で計測する。簡潔に述べると、２．５×１０２および５×１０２個の細胞を、２５ｃｍ２のフラスコの中の培地５ｍＬに播種する。この培地を、１週間に２回、全てを新規なものと交換する。培養をＤ１０で停止させ、固定し、ギムザで染色する。次に、５０超の細胞であるコロニーを計測する。ＣＦＵ－Ｆの培養は、各継代の終了時に行う。
クローン形成能（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、線維芽細胞前駆体の培養物（線維芽細胞のコロニー形成単位：ＣＦＵ－Ｆ）により測定される。ＣＦＵ－Ｆ（＞５０個の細胞）を、メタノールで固定しギムザで染色した後に、１０倍の倍率の倒立顕微鏡で計測する。簡潔に述べると、２．５×１０２および５×１０２個の細胞を、２５ｃｍ２のフラスコの中の培地５ｍＬに播種する。この培地を、１週間に２回、全てを新規なものと交換する。培養をＤ１０で停止させ、固定し、ギムザで染色する。次に、５０超の細胞であるコロニーを計測する。ＣＦＵ－Ｆの培養は、各継代の終了時に行う。
【0258】
免疫学的なコントロール
ＭＳＣの免疫賦活能（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）の欠如を、照合する。これを行うために、混合したリンパ球の培養を、賦活剤細胞（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ ｃｅｌｌ）として産生させ照射したＭＳＣ、および２つの健常な対照の単核細胞を使用して、実現した。この免疫賦活物質を、賦活指標の測定により評価する。これらの試験は、ナンシーの細胞療法および組織バンクユニット（Ｕｎｉｔｅ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ ｅｔ ｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｔｉｓｓｕｓ－ＵＴＣＴ）の「厳密に調製した革新的な治療薬：ｐｕｎｃｔｕａｌｌｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｒｕｇｓ」のクオリティコントロールの部門（Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ “Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｉｎｎｏｖａｎｔｅ Ｐｒｅｐａｒｅｓ Ｐｏｎｃｔｕｅｌｌｅｍｅｎｔ－ＭＴＩ－ＰＰ）で行う。免疫調節作用は、従来の混合したリンパ球培養物に、第３のパートナーとしてＭＳＣを添加することにより、評価する。
ＭＳＣの免疫賦活能（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ ｃａｐａｃｉｔｙ）の欠如を、照合する。これを行うために、混合したリンパ球の培養を、賦活剤細胞（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ ｃｅｌｌ）として産生させ照射したＭＳＣ、および２つの健常な対照の単核細胞を使用して、実現した。この免疫賦活物質を、賦活指標の測定により評価する。これらの試験は、ナンシーの細胞療法および組織バンクユニット（Ｕｎｉｔｅ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ ｅｔ ｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｔｉｓｓｕｓ－ＵＴＣＴ）の「厳密に調製した革新的な治療薬：ｐｕｎｃｔｕａｌｌｙ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｄｒｕｇｓ」のクオリティコントロールの部門（Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ “Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ ｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅ Ｉｎｎｏｖａｎｔｅ Ｐｒｅｐａｒｅｓ Ｐｏｎｃｔｕｅｌｌｅｍｅｎｔ－ＭＴＩ－ＰＰ）で行う。免疫調節作用は、従来の混合したリンパ球培養物に、第３のパートナーとしてＭＳＣを添加することにより、評価する。
【0259】
微生物のコントロール
ドナーの感染性マーカーのコントロール
ウイルスゲノムの診断を、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶについてドナーで行った。適合した感染性マーカーは、ＨＩＶ：複合試験 Ｐ２４ Ａｇ＋抗－ＨＩＶ Ａｂ １＋２：陰性、ＨＩＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＢＶ：ＨＢｓ Ａｇ 陰性、抗ＨＢｃ Ａｂ 陰性、ＨＢＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＣＶ：抗－ＨＣＶ Ａｂ：陰性、ＨＣＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＴＬＶ：抗－ＨＴＬＶ Ａｂ Ｉ＋ＩＩ：陰性、梅毒症：抗－ＴＰ Ａｂ：陰性、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびトキソプラズマ症：陰性のＩｇＭ、陰性または陽性のＩｇＧである。
ドナーの感染性マーカーのコントロール
ウイルスゲノムの診断を、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶについてドナーで行った。適合した感染性マーカーは、ＨＩＶ：複合試験 Ｐ２４ Ａｇ＋抗－ＨＩＶ Ａｂ １＋２：陰性、ＨＩＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＢＶ：ＨＢｓ Ａｇ 陰性、抗ＨＢｃ Ａｂ 陰性、ＨＢＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＣＶ：抗－ＨＣＶ Ａｂ：陰性、ＨＣＶ ＰＣＲ：陰性、ＨＴＬＶ：抗－ＨＴＬＶ Ａｂ Ｉ＋ＩＩ：陰性、梅毒症：抗－ＴＰ Ａｂ：陰性、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびトキソプラズマ症：陰性のＩｇＭ、陰性または陽性のＩｇＧである。
【0260】
細菌学
微生物のコントロールは、Ｂａｃｔｅｃ技術により産生された好気性血液培養物および嫌気性血液培養物由来の細胞療法産物（ＣＴＰ）について、仏国の医薬および健康製品の安全性に関する機関（Ｆｒｅｎｃｈ ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ａｇｅｎｃｅ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ ｓａｎｔｅ－ＡＮＳＭ）の推奨に従い、行う。このコントロールは、各培養ステップで行われる。解凍されたＭＳＣでは、患者にＭＳＣを注射した後に得られたコントロールの結果は、陰性でなければならない。再注射後の陽性の微生物のコントロールの事象が発生した場合、即座に臨床医に通知され、ＭＴＩ－ＰＰ部門の内部手続きに準拠したアンチバイオグラムの結果と共に、微生物の識別が通達される。
微生物のコントロールは、Ｂａｃｔｅｃ技術により産生された好気性血液培養物および嫌気性血液培養物由来の細胞療法産物（ＣＴＰ）について、仏国の医薬および健康製品の安全性に関する機関（Ｆｒｅｎｃｈ ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ａｇｅｎｃｅ ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ ｓａｎｔｅ－ＡＮＳＭ）の推奨に従い、行う。このコントロールは、各培養ステップで行われる。解凍されたＭＳＣでは、患者にＭＳＣを注射した後に得られたコントロールの結果は、陰性でなければならない。再注射後の陽性の微生物のコントロールの事象が発生した場合、即座に臨床医に通知され、ＭＴＩ－ＰＰ部門の内部手続きに準拠したアンチバイオグラムの結果と共に、微生物の識別が通達される。
【0261】
他のコントロール
ｈＴＥＲＴ転写物の非存在
テロメラーゼ活性の非存在は、培養後（Ｐ１およびＰ３終了後）のＭＳＣのｑＲＴ－ＰＣＲにより求められる。このコントロールは、凍結保存された１０６個のＭＳＣのアリコートで行われる。
ｈＴＥＲＴ転写物の非存在
テロメラーゼ活性の非存在は、培養後（Ｐ１およびＰ３終了後）のＭＳＣのｑＲＴ－ＰＣＲにより求められる。このコントロールは、凍結保存された１０６個のＭＳＣのアリコートで行われる。
【0262】
核型
これは、凍結保存前の、培養の終了時（Ｐ１およびＰ３の終了時）に得られたＭＳＣの未処理の細胞サンプルで行われる。
これは、凍結保存前の、培養の終了時（Ｐ１およびＰ３の終了時）に得られたＭＳＣの未処理の細胞サンプルで行われる。
【0263】
エンドトキシンおよびマイコプラズマの量
これは、凍結保存前の、培養の終了時（Ｐ１およびＰ３の終了時）に得られたＭＳＣの未処理であるかまたは凍結された細胞サンプルで行われる。
これは、凍結保存前の、培養の終了時（Ｐ１およびＰ３の終了時）に得られたＭＳＣの未処理であるかまたは凍結された細胞サンプルで行われる。
【0264】
ＭＳＣの投与
この方法で調製された細胞を、４％のアルブミン、ＮａＣｌ、ＡＣＤ７５ｍＬにおいて少なくとも１×１０６／ｋｇの異種性ＭＳＣの用量で、敗血症性ショックまたは敗血症を呈した蘇生中の入院患者に投与し、中心静脈経路により３０分間注入する。この治療は、中心静脈経路を介して、好ましくはＷＣＢのＭＳＣの解凍および洗浄のステップ後１０時間以内、かつＷＣＢのＭＳＣの解凍および洗浄のステップ後最大２４時間、行い投与する。
この方法で調製された細胞を、４％のアルブミン、ＮａＣｌ、ＡＣＤ７５ｍＬにおいて少なくとも１×１０６／ｋｇの異種性ＭＳＣの用量で、敗血症性ショックまたは敗血症を呈した蘇生中の入院患者に投与し、中心静脈経路により３０分間注入する。この治療は、中心静脈経路を介して、好ましくはＷＣＢのＭＳＣの解凍および洗浄のステップ後１０時間以内、かつＷＣＢのＭＳＣの解凍および洗浄のステップ後最大２４時間、行い投与する。
【0265】
敗血症性ショックのマウスモデル
敗血症性ショックを、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）により免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘導する。このモデルは、マウスの敗血症性ショックの最良のスタンダードとみなされており、ヒトの腹膜炎を模倣することができる。
敗血症性ショックを、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）により免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに誘導する。このモデルは、マウスの敗血症性ショックの最良のスタンダードとみなされており、ヒトの腹膜炎を模倣することができる。
【0266】
外科手術後、マウスを、３つのグループ：０．２５×１０６個のヒトのＷＧ－ＭＳＣを投与したグループ、同意書を提供した健常なドナー由来の骨髄の回収からの培養物により得た０．２５×１０６個のＢＭ－ＭＳＣを投与したグループ、およびＰＢＳを投与した対照のグループに、無作為化した。ＭＳＣおよびＰＢＳの投与は、敗血症性ショックの開始から２４時間後に、後眼窩洞において静脈内にて行った。
【0267】
ＷＧ－ＭＳＣおよびＢＭ－ＭＳＣは、従来の再培養を用いることなく、解凍後すぐに使用する。
【0268】
実施例２：マウスの敗血症性ショックに及ぼすＷＧ－ＭＳＣの効果
菌血症に及ぼすＷＧ－ＭＳＣの影響
プロトコル
解凍されたヒトのＷＧ－ＭＳＣを使用する。
菌血症に及ぼすＷＧ－ＭＳＣの影響
プロトコル
解凍されたヒトのＷＧ－ＭＳＣを使用する。
【0269】
敗血症性ショックの発症から４８時間後またはＭＳＣの投与から２４時間後に、マウスを、致死性の麻酔薬注射により安楽死させた。マウスの脾臓および血液を回収し、次に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計測するために播種した。
【0270】
異なるグループの比較を、クラスカルウォリス検定を使用して行った。
【0271】
結果
敗血症性ショックから２日後に、ＷＧ－ＭＳＣにより処置したマウスのみが、菌血症および脾臓のＣＦＵの数の有意な減少を示した。脾臓または血液の１ミリグラムあたりのＣＦＵの平均数を計測した。ＣＬＰの手法から４８時間後に、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループは、平均で、好気条件では脾臓１ｍｇあたり２．３×１０３ＣＦＵおよび嫌気条件では脾臓１ｍｇあたり５．８．１０３ＣＦＵを示し、対照のグループおよびＢＭ－ＭＳＣで処置したグループは、好気条件では脾臓１ｍｇあたりそれぞれ９．５×１０４および５．５×１０３のＣＦＵの平均数を有し、嫌気条件では脾臓１ｍｇ当たりそれぞれ１．３×１０５および１．１×１０４のＣＦＵの平均数を有した（図１Ａおよび１Ｂ）。
敗血症性ショックから２日後に、ＷＧ－ＭＳＣにより処置したマウスのみが、菌血症および脾臓のＣＦＵの数の有意な減少を示した。脾臓または血液の１ミリグラムあたりのＣＦＵの平均数を計測した。ＣＬＰの手法から４８時間後に、ＷＧ－ＭＳＣで処置したグループは、平均で、好気条件では脾臓１ｍｇあたり２．３×１０３ＣＦＵおよび嫌気条件では脾臓１ｍｇあたり５．８．１０３ＣＦＵを示し、対照のグループおよびＢＭ－ＭＳＣで処置したグループは、好気条件では脾臓１ｍｇあたりそれぞれ９．５×１０４および５．５×１０３のＣＦＵの平均数を有し、嫌気条件では脾臓１ｍｇ当たりそれぞれ１．３×１０５および１．１×１０４のＣＦＵの平均数を有した（図１Ａおよび１Ｂ）。
【0272】
血液で得られた結果も同様である（図２Ａおよび２Ｂ）。ワルトンジェリー由来のＭＳＣで処置したグループは、平均で、好気条件では血液１ｍＬあたり６×１０３のＣＦＵ、および嫌気条件では血液１ｍＬあたり２．１×１０４ＣＦＵを示し、対して、対照のグループおよびＢＭ－ＭＳＣで処置したグループは、好気条件では血液１ｍＬあたりそれぞれ１．３×１０７および１．１×１０５のＣＦＵの平均数を有し、嫌気条件では血液１ｍＬあたりそれぞれ７．７×１０６および３．２×１０５のＣＦＵの平均数を有した。
【0273】
結論
これらの結果は、解凍後直ちに使用する場合の、ワルトンジェリー由来のＭＳＣの敗血症性ショックに対する抗菌作用を、初めて示している。
これらの結果は、解凍後直ちに使用する場合の、ワルトンジェリー由来のＭＳＣの敗血症性ショックに対する抗菌作用を、初めて示している。
【0274】
臓器の中の細胞流入に及ぼすＷＧ－ＭＳＣの影響
プロトコル
敗血症性ショックの誘導から４８時間後または７日後に、マウスを、ペントバルビタールの腹腔内注射により安楽死させ、臓器を回収した。脾臓および肝臓をすり潰してからろ過した。骨髄を、ＰＢＳ１ｍＬを髄腔に迅速に注射することにより、大腿から抽出した。肺を、微細な切片に切断し、次に、コラゲナーゼ２ｍＬの中に、４５分間置いた後、すり潰し、ろ過させた。様々な臓器から抽出した細胞を、遠心分離により洗浄した。細胞の計測を行った。
プロトコル
敗血症性ショックの誘導から４８時間後または７日後に、マウスを、ペントバルビタールの腹腔内注射により安楽死させ、臓器を回収した。脾臓および肝臓をすり潰してからろ過した。骨髄を、ＰＢＳ１ｍＬを髄腔に迅速に注射することにより、大腿から抽出した。肺を、微細な切片に切断し、次に、コラゲナーゼ２ｍＬの中に、４５分間置いた後、すり潰し、ろ過させた。様々な臓器から抽出した細胞を、遠心分離により洗浄した。細胞の計測を行った。
【0275】
これらの細胞を、様々な臓器の中の、総単球、炎症性単球および抗炎症性単球、ならびに好中球を同定および定量化するために、５μＬの抗ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、およびＬｙ６Ｇの抗体でマークした。
【0276】
同じプロトコルを、敗血症性ショックを誘導する前の健常なマウスで行った。
【0277】
様々なグループの比較を、２元のＡＮＯＶＡ検定、次にＴｕｋｅｙ検定を行うことにより、行った。統計有意性は、ｐ＜０．０５で受け入れられた。
【0278】
結果
敗血症性ショックを誘導してから２日後に、生理食塩水溶液を静脈内投与した対照のマウスは、ＭＳＣの注射により処置したマウスよりも有意に多数の肺性の好中球を示した（図３Ａ）。Ｄ７に、有意に少ない好中球の集積が、ＢＭ－ＭＳＣおよびＷＧ－ＭＳＣにより処置されたマウスの脾臓および肝臓で明らかであった（ｐ＜０．００１）（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＣＬＰから７日後に、処置した動物の大腿に含まれていた好中球の数は、対照のグループと比較して有意に少なかった（ＰＢＳｖｓ．ＢＭ ｐ＜０．０５；ＰＢＳｖｓ．ＷＧ ｐ＜０．０１）（図３Ｄ）。
敗血症性ショックを誘導してから２日後に、生理食塩水溶液を静脈内投与した対照のマウスは、ＭＳＣの注射により処置したマウスよりも有意に多数の肺性の好中球を示した（図３Ａ）。Ｄ７に、有意に少ない好中球の集積が、ＢＭ－ＭＳＣおよびＷＧ－ＭＳＣにより処置されたマウスの脾臓および肝臓で明らかであった（ｐ＜０．００１）（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＣＬＰから７日後に、処置した動物の大腿に含まれていた好中球の数は、対照のグループと比較して有意に少なかった（ＰＢＳｖｓ．ＢＭ ｐ＜０．０５；ＰＢＳｖｓ．ＷＧ ｐ＜０．０１）（図３Ｄ）。
【0279】
敗血症性ショックを誘導してから２日後およびＭＳＣを注射してから２４時間後に、ＢＭ－ＭＳＣまたはＷＧ－ＭＳＣを投与したマウスの肺は、対照のマウスの肺よりも有意に少ない数の炎症性単球ｌｙ６Ｃｈｉｇｈを含んでいた（ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。Ｄ２で、単球の総数の有意な減少（図４Ｂ）および炎症性単球ｌｙ６Ｃｈｉｇｈの数の有意な減少（図４Ｃ）もまた、ＷＧ－ＭＳＣにより処置されたマウスの大腿において、対照のマウスと比較する場合に見いだされた（ｐ＜０．０５）。対して、対照のグループとＢＭ－ＭＳＣのグループとの間では、有意差は観察されなかった。
【0280】
敗血症性ショックを誘導してから７日後に、ＢＭ－ＭＳＣにより処置したマウス（ｐ＜０．０１）およびＰＢＳにより処置したマウス（＜０．０５）と比較して、有意に少ない数の炎症性単球ｌｙ６Ｃｈｉｇｈが、ＷＧ－ＭＳＣにより処置したマウスの脾臓で観察された（図４Ｄ）。
【0281】
この研究は、ＭＳＣが多微生物性敗血症モデルにおいて白血球浸潤物を調節できることを明らかにしている。解凍されたＷＧ－ＭＳＣの作用は、注射後の最初の４８時間に限定されないが、この４８時間以内のＷＧ－ＭＳＣは、敗血症性ショックの間の細胞の動員に関してより著しい後の効果を有することができることが示されている。
【0282】
より後の時点で有効であることに加えて、ＭＳＣはまた、白血球の輸送に関して早期に作用を有する。上記の解析された結果では、敗血症性ショックを誘導してから４８時間後に、ＭＳＣが、好中球の肺への流入を減少させることが示されている。
【0283】
これらの結果は、ＷＧ－ＭＳＣは、ＢＭ－ＭＳＣと同じく、敗血症性ショックに関連する臓器不全の発症に関与する好中球の集積を、臓器の中で低減できることを示している。実際に、好中球の異常な集積は、低酸素血症および組織の低灌流をもたらす血液の閉塞を誘導し、多量の活性酸素種の放出による微小循環の機能不全を引き起こし得ることが知られている。
【0284】
さらに、ＢＭ－ＭＳＣとは異なり、ＷＧ－ＭＳＣは、敗血症性ショックから２日後の大腿の総単球の産生、およびマウスの脾臓においてこの単球の部分集合の蓄積を少なくする、炎症促進性単球の産生の両方を、低減させる特性を有する。敗血症性ショックが、特にＳＯＦＡスコア（敗血症関連臓器不全のアセスメント）（Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００８）の増加に寄与する活性酸素種の産生の増大を誘導することにより単球の特性を変更させる場合、ＷＧ－ＭＳＣの注射により誘導される総単球および炎症促進性単球の蓄積および産生の低下が、敗血症性ショックの治療において真の利点をもたらすことができる。
【0285】
生存に及ぼすＷＧ－ＭＳＣの影響
プロトコル
ＣＬＰ技術によりＣ５７Ｂｌ／６マウスに敗血症性ショックを誘導した後、外科手術後に血液充填を可能にするために、ＮａＣｌ１５０μｌを皮下注射した。可能な限り臨床条件に近づけるために、全てのマウスに、体重１ｇあたり５０μｇの用量のイミペネムを、１２時間ごとに腹腔内投与した（Ａｌｃａｙａｇａ－Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。
プロトコル
ＣＬＰ技術によりＣ５７Ｂｌ／６マウスに敗血症性ショックを誘導した後、外科手術後に血液充填を可能にするために、ＮａＣｌ１５０μｌを皮下注射した。可能な限り臨床条件に近づけるために、全てのマウスに、体重１ｇあたり５０μｇの用量のイミペネムを、１２時間ごとに腹腔内投与した（Ａｌｃａｙａｇａ－Ｍｉｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）。
【0286】
ウィルコクソン検定を行った。有意差は、ｐ＜０．０５で承認された。
【0287】
結果
対照マウスと比較して、ＭＳＣで処置したマウスにおいて、生存率が増加した。対照動物では６４％の生存率が見られたのに対し、ＢＭ－ＭＳＣで処置した動物の８３％、ＷＧ－ＭＳＣで処置した８７％が生存した（図５）。
対照マウスと比較して、ＭＳＣで処置したマウスにおいて、生存率が増加した。対照動物では６４％の生存率が見られたのに対し、ＢＭ－ＭＳＣで処置した動物の８３％、ＷＧ－ＭＳＣで処置した８７％が生存した（図５）。
【0288】
ＷＧ－ＭＳＣは、ＢＭ－ＭＳＣと比較して、敗血症性ショックの生存の観点からより良好な結果を有している。
【0289】
実施例３：敗血症に及ぼすＷＧ－ＭＳＣの影響の試験
上記のパート１．１～１．６に記載された方法により産生された臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣの有効性を、心血管の観点からヒトに最も近い動物であるブタで解析する。
上記のパート１．１～１．６に記載された方法により産生された臨床グレードの解凍されたＷＧ－ＭＳＣの有効性を、心血管の観点からヒトに最も近い動物であるブタで解析する。
【0290】
ブタに腹膜炎を導入してから４時間後に、１×１０６／ｋｇの用量のＷＧ－ＭＳＣを、静脈内注射した。ＷＧ－ＭＳＣを、臨床グレードで産生させ、解凍直後に使用した。腹膜炎の導入後２４時間にわたり行われたこの試験は、二重盲検の試験として、熟練した蘇生に関する医師の存在下で行った。結果として、このサポートは、血液充填およびノルアドレナリン（最大１０μｇ／ｋｇ／分）による血液循環量（ｖｏｌｅｍｉａ）および平均動脈圧（＞８５ｍｍＨｇ）の維持、ならびにドブタミン（最大２０μｇ／ｋｇ／分）による適切な心拍出量（＞２ｌ／分／ｍ２）の維持を伴う患者の治療と、同一であった。
【0291】
この試験は、ＷＧ－ＭＳＣの投与が、静脈での酸素の飽和度を有意に改善することを示すことにより、処置した動物におけるＯ２の取り込みとＯ２の消費との間の良好な一致を示した（図６Ａ）。
【0292】
ＷＧ－ＭＳＣの投与は、処置した動物における平均動脈圧（ＭＡＰ）の改善および後のノルアドレナリンの投与により明らかであるように、心血管の機能を改善する（図６Ｂ、６Ｃ）。ＷＧ－ＭＳＣの投与は、腎機能を改善する：処置した動物は、クレアチニンの増大が小さくなり、利尿が多くなることが示された（図６Ｄ、６Ｅ）。
【0293】
さらに、ＷＧ－ＭＳＣの静脈内注射は、乳酸塩血症を有意に低減し、２ｍｍｏｌ／Ｌ超であるこの産生は、組織の低酸素を示すものである（図６Ｆ）。
【0294】
またＷＧ－ＭＳＣの静脈内注射は、急性呼吸窮迫症候群の強度を反映する、ＰａＯ２／ＦｉＯ２比をも増加させる（図６Ｇ）。処置した動物におけるこの増加は、未処置の動物よりも肺機能不全が少ないことを示すものである。
【0295】
この実験において、未処置の動物と比較した処置した動物の生存率の増加は、約６０％であることが観察される（図６Ｈ）。
【0296】
実施例４：分娩因子の解析
５０の臍帯を、異なる分娩のパラメータを関連付けることにより解析した。ＷＧ－ＭＳＣは、上記のパート１．１～６に記載した方法により、これらの組織から単離する。
５０の臍帯を、異なる分娩のパラメータを関連付けることにより解析した。ＷＧ－ＭＳＣは、上記のパート１．１～６に記載した方法により、これらの組織から単離する。
【0297】
データの抽出後に、２７の分娩因子（そのうちの１４個が母体に関連し、６個が新生児に関連し、７個が分娩に関連する）を、これらの分娩のパラメータと、８個の細胞増殖（集団の倍加）の生物学的な指標との間の相関に関して、解析した。各変数を、二変量の線形回帰（ＢＬＲ）に供した。ＢＬＲにおいて０．１５の閾値で有意な関連を有する因子のみが、多変量の線形回帰（ＭＬＲ）による解析の候補であった。モデルの入力閾値が０．１であり、モデルの出力閾値が０．０５で、変数を選択するための段階的な方法を使用した。
【0298】
多変量の線形回帰解析により、分娩時のオキシトシンの投与が、第１の継代Ｐ１の間に、倍加時間を減少させることにより（６１．６±５．２時間ｖｓ．１１２．０±１９．５時間、ｐ＝０．０１５９）、ＷＧ－ＭＳＣの増殖に正の影響を示した（図７Ａ）。またオキシトシンの投与は、短い倍加時間（＜１００時間）で多数の細胞を得ることを可能にした（５７．９％ｖｓ．２５％、ｐ＝０．０４６９）。Ｐ１において１００時間未満の倍加時間を伴うサンプルのみを考慮することにより、いくつかの因子は、倍加時間に正の影響を示した：管理された分娩（３４．２％ｖｓ．０％、ｐ＝０．０１８５）、出生時の無月経の週数（３９．８５ｖｓ．３７．９２、ｐ＝０．０２１２）、母親の喫煙（４２．１％ｖｓ．８．３％、ｐ＝０．０３１３）、および胎盤の重量（５５２．２４ｖｓ．４８１．９２、ｐ＝０．０４４６）。第２の継代（Ｐ２）では、出生時の体重、無月経の週数、胎盤の重量、正常妊娠および子癇前症の不存在が、細胞増殖に正の影響を示した（図７Ｂ）。これらの因子は全て、正期産の概念と関連しており、良好な健康状態にあり正期産であった新生児から生じるＷＧ－ＭＳＣが、より著しい増殖能を呈することを示すことが可能である。また、喫煙した母親の臍帯由来のＷＧ－ＭＳＣが、増殖能を増大させたことが観察されている。
【0299】
ＷＧ－ＭＳＣの増殖を促進するこれら因子の同定は、最良の増殖特性を有するＷＧ－ＭＳＣを含む臍帯の選択に有用である。
【0300】
参照文献
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Ｃｈａｏ， Ｙ．－Ｈ．， Ｗｕ， Ｈ．－Ｐ．， Ｗｕ， Ｋ．－Ｈ．， Ｔｓａｉ， Ｙ．－Ｇ．， Ｐｅｎｇ， Ｃ．－Ｔ．， Ｌｉｎ， Ｋ．－Ｃ．， Ｃｈａｏ， Ｗ．－Ｒ．， Ｌｅｅ， Ｍ．－Ｓ．， ａｎｄ Ｆｕ， Ｙ．－Ｃ． （２０１４ａ）． Ａｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｐｓｉｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９， ｅ１１０３３８．
Ｃｈｉｎｎａｄｕｒａｉ， Ｒ．， Ｃｏｐｌａｎｄ， Ｉ． Ｂ．， Ｇａｒｃｉａ， Ｍ． Ａ．， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｃ． Ｔ．， Ｌｅｗｉｓ， Ｃ． Ｎ．， Ｗａｌｌｅｒ， Ｅ． Ｋ．， Ｋｉｒｋ， Ａ． Ｄ．， ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ， Ｊ． （２０１６）． Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｗｈｉｃｈ Ｉｓ Ｐａｒｔｌｙ Ｒｅｓｃｕｅｄ ｂｙ ＩＦＮγ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ３４（９）， ２４２９－２４４２．
Ｃｏｎｄｏｒ， Ｊ．Ｍ．， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ， Ｃ．Ｅ．， Ｓｏｕｓａ Ｍｏｒｅｉｒａ， Ｒ． ｄ．， Ｃａｎａｌｅ， Ｄ．， Ｖｏｌｐｉｎｉ， Ｒ．Ａ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｍ．Ｈ．Ｍ．， Ｃａｍａｒａ， Ｎ．Ｏ．Ｓ．， Ｎｏｒｏｎｈａ， Ｉ． ｄ． Ｌ．， ａｎｄ Ａｎｄｒａｄｅ， Ｌ． （２０１６）． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｗｈａｒｔｏｎｓ Ｊｅｌｌｙ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｓｅｐｓｉｓ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｊｕｒｙ， ａｎｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ５， １０４８－１０５７．
Ｄｅｖａｎｅｙ， Ｊ．， Ｈｏｒｉｅ， Ｓ．， Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ， Ｃ．， Ｅｌｌｉｍａｎ， Ｓ．， Ｂａｒｒｙ， Ｆ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｔ．， Ｃｕｒｌｅｙ， Ｇ．Ｆ．， Ｏ’Ｔｏｏｌｅ， Ｄ．， ａｎｄ Ｌａｆｆｅｙ， Ｊ．Ｇ． （２０１５）． Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ． Ｔｈｏｒａｘ ７０， ６２５－６３５．
Ｄｏｍｂｒｏｖｓｋｉｙ， Ｖ．Ｙ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ａ．Ａ．， Ｓｕｎｄｅｒｒａｍ， Ｊ．， ａｎｄ Ｐａｚ， Ｈ．Ｌ． （２００７）． Ｒａｐｉｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ： Ａ ｔｒｅｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ １９９３ ｔｏ ２００３＊： Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ３５， １２４４－１２５０．
Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｍ， Ｃｏｐｌａｎｄ ＩＢ， Ｙｕａｎ Ｓ， Ｒｏｍｉｅｕ－Ｍｏｕｒｅｚ Ｒ， Ｗａｌｌｅｒ ＥＫ， Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ （２０１２）． Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ． １４（２）：１４７－５２．
Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｅｙ， Ｅ．， Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐ．， Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ．Ａ．， Ｒｉｃｏ， Ｌ．， Ｂｕｓｃｈｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｄｅｌｇａｄｏ， Ｍ． （２００９）． Ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｓｅｐｓｉｓ． Ｇｕｔ ５８， ９２９－９３９．
Ｉｓｋａｎｄｅｒ， Ｋ．Ｎ．， Ｏｓｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ｍ．Ｆ．， Ｓｔｅａｒｎｓ－Ｋｕｒｏｓａｗａ， Ｄ．Ｊ．， Ｋｕｒｏｓａｗａ， Ｓ．， Ｓｔｅｐｉｅｎ， Ｄ．， Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ， Ｃ．， ａｎｄ Ｒｅｍｉｃｋ， Ｄ．Ｇ． （２０１３）． Ｓｅｐｓｉｓ： Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ， Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ａｎｄ Ｅｖｏｌｖｉｎｇ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ９３， １２４７－１２８８．
Ｋｉｍ， Ｈ．， Ｄａｒｗｉｓｈ， Ｉ．， Ｍｏｎｒｏｙ， Ｍ．－Ｆ．， Ｐｒｏｃｋｏｐ， Ｄ．Ｊ．， Ｌｉｌｅｓ， Ｗ．Ｃ．， ａｎｄ Ｋａｉｎ， Ｋ．Ｃ． （２０１４）． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ （ｓｔｅｍ） ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｆａｉｌ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｔｏｘｉｃ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５， １．
Ｋｒａｓｎｏｄｅｍｂｓｋａｙａ， Ａ．， Ｓｏｎｇ， Ｙ．， Ｆａｎｇ， Ｘ．， Ｇｕｐｔａ， Ｎ．， Ｓｅｒｉｋｏｖ， Ｖ．， Ｌｅｅ， Ｊ．－Ｗ．， ａｎｄ Ｍａｔｔｈａｙ， Ｍ．Ａ． （２０１０）． Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ Ｐａｒｔ ｆｒｏｍ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬ－３７． ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ２８， ２２２９－２２３８．
Ｌｕｏ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｆ．， Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｇｅｎｇ， Ｙ．， Ｌｉ， Ｑ．， Ｈｏｎｇ， Ｑ．， Ｆｕ， Ｂ．， Ｚｈｕ， Ｆ．， Ｃｕｉ， Ｓ．， Ｆｅｎｇ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ Ｓｅｐｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ： Ｓｈｏｃｋ ４１， １２３－１２９．
Ｍｅｉ， Ｓ．Ｈ．， ＭｃＣａｒｔｅｒ， Ｓ．Ｄ．， Ｄｅｎｇ， Ｙ．， Ｐａｒｋｅｒ， Ｃ．Ｈ．， Ｌｉｌｅｓ， Ｗ．Ｃ．， ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｄ．Ｊ． （２００７）． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ １． ＰＬｏＳ Ｍｅｄ． ４， ｅ２６９．
Ｍｅｚｅｙ， Ｅ．， Ｎｅｍｅｔｈ Ｋ． （２０１５）． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｓｍａｒｔｅｒ ｔｈａｎ ｄｒｕｇｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６８（２）， ２０８－２１４．
Ｍｏｌｌ， Ｇ．， Ｇｅｉβｌｅｒ， Ｓ．， Ｃａｔａｒ， Ｒ．， Ｉｇｎａｔｏｗｉｃｚ， Ｌ．， Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｓｔｒｕｎｋ， Ｄ．， Ｂｉｅｂａｃｋ， Ｋ．， ａｎｄ Ｒｉｎｇｄｅｎ， Ｏ． （２０１６）． Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｏｒ Ｆｒｅｓｈ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ｏｎｌｙ ａ Ｍａｔｔｅｒ ｏｆ Ｔａｓｔｅ ｏｒ Ｋｅｙ ｔｏ Ｕｎｌｅａｓｈ ｔｈｅ Ｆｕｌｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＭＳＣ Ｔｈｅｒａｐｙ？ Ｉｎ Ｆ． Ｋａｒｉｍｉ－Ｂｕｓｈｅｒｉ ＆ Ｍ． Ｗｅｉｎｆｅｌｄ （Ｅｄｓ．）， Ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． （Ｖｏｌ． ９５１， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ．， ｐｐ． ７７－９８）． Ｃｈａｍ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．
Ｎｅｍｅｔｈ， Ｋ．， Ｌｅｅｌａｈａｖａｎｉｃｈｋｕｌ， Ａ．， Ｙｕｅｎ， Ｐ．Ｓ．Ｔ．， Ｍａｙｅｒ， Ｂ．， Ｐａｒｍｅｌｅｅ， Ａ．， Ｄｏｉ， Ｋ．， Ｒｏｂｅｙ， Ｐ．Ｇ．， Ｌｅｅｌａｈａｖａｎｉｃｈｋｕｌ， Ｋ．， Ｋｏｌｌｅｒ， Ｂ．Ｈ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２００９）． Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｓｅｐｓｉｓ ｖｉａ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｏｓｔ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １５， ４２－４９．
Ｐｅｄｒａｚｚａ， Ｌ．， Ｌｕｎａｒｄｅｌｌｉ， Ａ．， Ｌｕｆｔ， Ｃ．， Ｃｒｕｚ， Ｃ．Ｕ．， ｄｅ Ｍｅｓｑｕｉｔａ， Ｆ．Ｃ．， Ｂｉｔｅｎｃｏｕｒｔ， Ｓ．， Ｎｕｎｅｓ， Ｆ．Ｂ．， ａｎｄ ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ， Ｊ．Ｒ． （２０１４）． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｓｅｐｓｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ． Ｉｎｆｌａｍｍ． Ｒｅｓ． ６３， ７１９－７２８．
Ｒｏｊａｓ， Ｍ．， Ｃａｒｄｅｎｅｓ， Ｎ．， Ｋｏｃｙｉｌｄｉｒｉｍ， Ｅ．， Ｔｅｄｒｏｗ， Ｊ．Ｒ．， Ｃａｃｅｒｅｓ， Ｅ．， Ｄｅａｎｓ， Ｒ．， Ｔｉｎｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｂｅｒｍｕｄｅｚ， Ｃ． （２０１４）． Ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｓｈｅｅｐ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ． ５， ４２．
Ｗｕ， Ｋ．－Ｈ．， Ｗｕ， Ｈ．－Ｐ．， Ｃｈａｏ， Ｗ．－Ｒ．， Ｌｏ， Ｗ．－Ｙ．， Ｔｓｅｎｇ， Ｐ．－Ｃ．， Ｌｅｅ， Ｃ．－Ｊ．， Ｐｅｎｇ， Ｃ．－Ｔ．， Ｌｅｅ， Ｍ．－Ｓ．， ａｎｄ Ｃｈａｏ， Ｙ．－Ｈ． （２０１５）． Ｔｉｍｅ－Ｓｅｒｉｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｓｅｐｔｉｃ Ｍｉｃｅ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： ＳＨＯＣＫ １．
Ｚｈａｏ， Ｘ．， Ｌｉｕ， Ｄ．， Ｇｏｎｇ， Ｗ．， Ｚｈａｏ， Ｇ．， Ｌｉｕ， Ｌ．， Ｙａｎｇ， Ｌ．， ａｎｄ Ｈｏｕ， Ｙ． （２０１４）． Ｔｈｅ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ Ｌｉｇａｎｄ， Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）， Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｓｅｐｓｉｓ ｖｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＭｉＲ－１４３： Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ） Ｉｍｐｒｏｖｅｓ ＭＳＣｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ３２， ５２１－５３３．
Ｍｅｒｖｙｎ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｃｌｉｆｆｏｒｄ Ｓ． Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｗａｒｒｅｎ Ｓｅｙｍｏｕｒ， Ｍａｎｕ Ｓｈａｎｋａｒ－Ｈａｒｉ， Ｄｊｉｌｌａｌｉ Ａｎｎａｎｅ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂａｕｅｒ， Ｒｉｎａｌｄｏ Ｂｅｌｌｏｍｏ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｒ． Ｂｅｒｎａｒｄ， Ｊｅａｎ－Ｄａｎｉｅｌ Ｃｈｉｃｈｅ， Ｃｒａｉｇ Ｍ． Ｃｏｏｐｅｒｓｍｉｔｈ， Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓ． Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｍ． Ｌｅｖｙ， Ｊｏｈｎ Ｃ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｇｒｅｇ Ｓ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｓｔｅｖｅｎ Ｍ． Ｏｐａｌ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ． Ｒｕｂｅｎｆｅｌｄ， Ｔｏｍ ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ， Ｊｅａｎ－Ｌｏｕｉｓ Ｖｉｎｃｅｎｔ， ａｎｄ Ｄｅｒｅｋ Ｃ． Ａｎｇｕｓ． （２０１６）． Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ （Ｓｅｐｓｉｓ－３）． ＪＡＭＡ． ２０１６；３１５（８）：８０１－８１０
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】