(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-22
(45)【発行日】2023-03-30
(54)【発明の名称】抗菌性アミノグリコシド誘導体
(51)【国際特許分類】
C07H 15/224 20060101AFI20230323BHJP
A61K 31/7036 20060101ALI20230323BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230323BHJP
【ＦＩ】
C07H15/224 CSP
A61K31/7036
A61P31/04
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021571459
(86)(22)【出願日】2020-05-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-28
(86)【国際出願番号】 CN2020093436
(87)【国際公開番号】W WO2020239096
(87)【国際公開日】2020-12-03
【審査請求日】2021-11-29
(31)【優先権主張番号】201910463155.1
(32)【優先日】2019-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010299506.2
(32)【優先日】2020-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521521231
【氏名又は名称】卓和薬業集団股▲ふん▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】湯 東東
(72)【発明者】
【氏名】黄 志剛
(72)【発明者】
【氏名】李 程
(72)【発明者】
【氏名】丁 照中
(72)【発明者】
【氏名】陳 曙輝
【審査官】神野 将志
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／１４７８３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／１３２７６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／０６７６９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２０／０６９１３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０２０／０１７２５７９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Khalid Eljaaly et al.，Drugs，79(13)，pp.243-269，doi: 10.1007/s40265-019-1054-3
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式（ＩＩ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化1】
(式（ＩＩ）中、Ｒ’は
【化2】
Ｌは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－であり、
Ｒ１はＨ又はＣ１－３アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
【化3】
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。）
【請求項2】
前記化合物は、下記の式（Ｉ）で表される構造を有する請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化4】
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
【化5】
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。）
【請求項3】
前記化合物は下記の式（Ｉ－１）で表される構造を有する請求項２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化6】
【請求項4】
Ｒ１はＨ又は－ＣＨ３である請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
前記化合物は、下記の式（Ｉ－２）で表される構造を有する請求項４に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化7】
【請求項6】
各Ｒはそれぞれ独立してＦ又はＣｌである請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３又は－ＣＨ２ＣＨ３であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＣＨ３は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよい請求項１～３、５のいずれか１項に記載の前記的化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３、－ＣＨ（Ｒ）２、－ＣＨ２ＣＨ３又は－ＣＨ２ＣＨ（Ｒ）２である請求項７に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ又は【化8】
【請求項10】
Ｒ２はＨ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３又は【化9】
【請求項11】
Ｒ２は【化10】
【化11】
【請求項12】
構造単位【化12】
【化13】
【請求項13】
構造単位【化14】
【化15】
又は
【化16】
である請求項１２に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項14】
【化17】
【化18】
又は
【化19】
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項15】
有効成分とする治療有効量の請求項１から１４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項16】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩又は請求項１５に記載の医薬組成物からなる、細菌感染関連疾患用治療薬。
【請求項17】
前記の細菌は、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌である請求項１６に記載の細菌感染関連疾患用治療薬。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、中国特許出願ＣＮ２０１９１０４６３１５５．１（出願日２０１９年０５月３０日）及び中国特許出願ＣＮ２０２０１０２９９５０６．２（出願日２０２０年０４月１６日）の優先権を主張し、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、医薬品分野に関し、具体的には新しいアミノグリコシド誘導体、その薬学的に許容される塩又はその異性体、その薬学的に許容される組成物、及び細菌感染関連疾患の治療薬の製造におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
現代医学では、ＲＮＡを結合することによって機能する新しい低分子経口バイオアベイラブル薬の開発が特に注目されている。ＤＮＡとタンパク質の間のメッセンジャーとして、ＲＮＡは、かつては、構造が著しく複雑になることなく完全に柔軟な分子として考えられている。最近の研究では、ＲＮＡはＤＮＡのような単純な配列ではなく、複雑な構造を持つ競合タンパク質を持っていることが示されている。ゲノム配列決定により、タンパク質の配列とタンパク質をコードするｍＲＮＡが明らかになった。タンパク質はＲＮＡテンプレートを使用して合成されるため、ｍＲＮＡの翻訳を妨害してタンパク質の生成を防ぐことでタンパク質を阻害することができる。タンパク質とＲＮＡの両方が潜在的な薬物標的部位であるため、ゲノム配列決定によって明らかになった標的の数は効果的に倍になる。これらの観察は製薬業界に小分子標的ＲＮＡを使用する新たな幕を開いた。
【0004】
現代の生化学と分子生物学の研究により、細菌リボソーム３０ＳサブユニットとｔＲＮＡの結合はタンパク質合成にとって重要なステップの一つであることが明らかになった。現在までに、少なくとも２種類の細菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリボソーム３０Ｓサブユニットの結晶構造が報告されている。その結晶構造からｔＲＮＡと結合する３つの部位（アミノアシル部位Ａ（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ）、ペプチド部位Ｐ（Ｐｅｐｔｉｔｅ）、Ｅ（Ｅｘｉｔ）部位）を明確に識別することができる。アミノグリコシド系薬物は、細菌リボソームの３０Ｓサブユニットの１６Ｓ ｒＲＮＡデコード領域のＡ部位に特異的に結合してｍＲＮＡの誤翻訳を引き起こすことによりタンパク質合成を妨害して病原性細菌を殺す。アミノグリコシド系薬物は非常に効果的な広域抗生物質であり、最も一般的に使用されている抗感染症薬である。ほとんどのアミノグリコシド系薬物は、期待される薬物動態特性を持っており、他の抗感染症薬と相乗的に作用して生命を脅かす感染症を治療するための優れた品種になることができる。過去数十年においてこのような抗生物質の多くの種類が、臨床的に人気があった。
【0005】
アミノグリコシド系薬物は、１９４４年のストレプトマイシンの発見に端を発し、その後、一連の画期的な化合物（カナマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン）の販売に成功し、アミノグリコシド系薬物のグラム陰性細菌感染症の治療における地位が確立された。１９７０年代から１９９０年代にかけて、半合成アミノグリコシド系抗生物質のジベカシン、アミカシン、ネチルマイシン、イセパマイシン、エチミシンが次々と登場し、半合成経路により初期の抗生物質耐性菌に対して有効で副作用の少ないアミノグリコシド系抗生物質が成功に得られることを示している。しかし、アミノグリコシド系抗生物質の発展は遅れている。また、アミノグリコシド類薬物に対して広範な基礎と臨床研究を行った。特に、殺菌メカニズムと耐性メカニズムに関する研究は、このような抗生物質に対する理解を深めただけでなく、臨床的に合理的な投薬、耐性菌の減少、新しい耐性菌に対するアミノグリコシド類の設計に理論的基礎を提供した。
【0006】
アミノグリコシド系薬物は、アミノ糖とアミノ環状アルコールが酸素架橋を介して結合したグリコシドである。ストレプトマイシン由来のストレプトマイシンなど、ミニモナス由来のゲンタマイシンなどの天然アミノグリコシド系薬物、及びエチメシン、アミカシンなどの半合成アミノグリコシド系薬物はいずれも広域抗菌薬である。アミノグリコシド系薬物は、主に敏感な好気性グラム陰性桿菌による全身感染症に使用される。近年、様々なセファロスポリンやキノロン系薬物が臨床的に広く使用されているが、アミノグリコシド系薬物は緑膿菌、肺炎菌、大腸菌などによく見られるグラム陰性桿菌に対してＰＡＥが長いため、好気性グラム陰性菌による重症感染症の治療に利用されている。
【0007】
臨床現場でのアミノグリコシド系薬物の長期的かつ大規模な使用に伴い、薬剤耐性の問題も現れている。また、耳毒性や腎毒性などのアミノグリコシド系薬物の一般的な副作用もその使用を制限している。近年、従来の抗生物質耐性の問題を解決できるいくつかの薬物分子、例えば、Ａｃｈａｏｇｅｎ社によって新たに開発されたＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ（ＷＯ２００９０６７６９２）が報告され、第ＩＩＩ相臨床試験が完了した。
【0008】
本発明の目的は、エチメチン、アミカシン、ゲンタマイシンなどの従来の抗生物質がパッシベーション酵素に対して強い耐性を有し、耳毒性及び腎毒性を有する問題を解決することである。従来技術よりも簡単な合成方法により、より広い抗菌スペクトル及びより良好な活性を有する新規アミノグリコシド系薬物を製造することができる。
【発明の概要】
【0009】
本発明によれば、式（ＩＩ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はその異性体が提供される。
式（ＩＩ）中、Ｒ’は
であり、
Ｌは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－であり、
Ｒ１はＨ又はＣ１－３アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
であり、ここで、Ｃ１－３アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ、－ＮＨ２及び－ＮＯ２から選択されるいずれか１、２又は３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。
【化1】
【化2】
Ｌは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－であり、
Ｒ１はＨ又はＣ１－３アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
【化3】
であり、ここで、Ｃ１－３アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ、－ＮＨ２及び－ＮＯ２から選択されるいずれか１、２又は３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。
【0010】
本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物、その薬学的に許容される塩又はその異性体が提供される。
式（Ｉ）中、Ｒ１はＨ又はＣ１－３アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
であり、ここで、Ｃ１－３アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ、－ＮＨ２及び－ＮＯ２から選択されるいずれか１、２又は３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。
【化4】
式（Ｉ）中、Ｒ１はＨ又はＣ１－３アルキル基であり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１－３アルキル基又は
【化5】
であり、ここで、Ｃ１－３アルキル基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ、－ＮＨ２及び－ＮＯ２から選択されるいずれか１、２又は３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基又はＣ１－３アルキル基であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１－３アルキル基及びＣ１－３アルキル基は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、各Ｒはそれぞれ独立してＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ又は－ＮＨ２である。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、上記化合物は式（Ｉ－１）の構造を有する。
式（Ｉ－１）中、Ｒａ、Ｒｂ及びＲ１については、本発明に定義されているとおりである。
【化6】
【0012】
いくつかの実施形態において、上記Ｒ１はＨ又は－ＣＨ３であり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0013】
いくつかの実施形態において、上記Ｒ１はＨであり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0014】
本発明のいくつかの実施形態において、上記化合物は式（Ｉ－２）の構造を有する。
式（Ｉ－２）中、Ｒａ及びＲｂについては、本発明に定義されているとおりである。
【化7】
式（Ｉ－２）中、Ｒａ及びＲｂについては、本発明に定義されているとおりである。
【0015】
いくつかの実施形態において、各Ｒはそれぞれ独立してＦ又はＣｌであり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0016】
いくつかの実施形態において、各Ｒはそれぞれ独立してＦであり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0017】
いくつかの実施形態において、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３又は－ＣＨ２ＣＨ３であり、ここで、前記－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＣＨ３は、１、２又は３個のＲで置換されていてもよく、Ｒ及び他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0018】
いくつかの実施形態において、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ３、－ＣＨ（Ｒ）２、－ＣＨ２ＣＨ３又は－ＣＨ２ＣＨ（Ｒ）２であり、Ｒ及び他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0019】
いくつかの実施形態において、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立してＨ又は
であり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【化8】
であり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【0020】
いくつかの実施形態において、Ｒ２はＨ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３又は
であり、ここで、前記－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＣＨ３は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＣＮ、－ＮＨ２及び－ＮＯ２から選択されるいずれか１、２又は３個の置換基で置換されていてもよく、Ｒａ、Ｒｂ及び他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【化9】
【0021】
いくつかの実施形態において、上記Ｒ２は
又は
であり、Ｒ及び他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
いくつかの実施形態において、上記構造単位
は
であり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
【化10】
【化11】
いくつかの実施形態において、上記構造単位
【化12】
【化13】
【0022】
いくつかの実施形態において、上記構造単位
は
又は
であり、他の変量については、本発明に定義されているとおりである。
いくつかの実施形態において、上記化合物は
又は
で表される。
【化14】
【化15】
【化16】
いくつかの実施形態において、上記化合物は
【化17】
【化18】
【化19】
【0023】
本発明のいくつかの実施形態は、上記変量の任意の組み合わせからなる。
【0024】
本発明によれば、有効成分とする治療有効量の上記化合物、その薬学的に許容される塩又はその異性体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物がさらに提供される。
【0025】
本発明によれば、細菌感染関連疾患の治療薬の製造における上記化合物、その薬学的に許容される塩又はその異性体、及び上記医薬組成物の使用がさらに提供される。本発明のいくつかの実施形態は、上記細菌は、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌である。
【発明の効果】
【0026】
本発明では、簡単な製造方法により式（ＩＩ）の化合物及その異性体を合成し、ＣＲＥ（カルバペネム耐性腸内細菌科細菌）などの超細菌に引き起こされる薬剤耐性菌感染症の治療に適用される新しいアミノグリコシド系抗生物質が得られ、従来の抗生物質の不活化酵素による薬剤耐性、及び耳毒性、腎毒性が存在する問題が解決される。また、本発明の化合物は、抗菌スペクトルがより広く、活性がより高く、細胞毒性を有しない。
【0027】
定義と説明
特に断りのない限り、本明細書で使用される以下の用語及びフレーズは、以下の意味を有することを意図している。特定の用語やフレーズは、特別な定義がない場合、不確実又は不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に記載されている商品名は、対応する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
特に断りのない限り、本明細書で使用される以下の用語及びフレーズは、以下の意味を有することを意図している。特定の用語やフレーズは、特別な定義がない場合、不確実又は不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に記載されている商品名は、対応する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
【0028】
用語「薬学的に許容される」とは、化合物、材料、組成物及び／又は剤形は、信頼できる医学的判断の範囲内において過度の毒性、刺激、アレルギー反応又はその他の問題や合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスク比に見合うことを指す。
【0029】
用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の塩を指し、本発明で発見された特定の置換基を有する化合物及び比較的無毒の酸又は塩基で製造される。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、純溶液又は適宜な不活性溶媒において十分量の塩基とこのような化合物の中性形態と接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミン若しくはマグネシウム塩、又は類似の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、純溶液又は適宜な不活性溶媒において十分量の酸とこのような化合物の中性形態と接触させることにより酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、無機酸の塩、有機酸の塩が含まれる，無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、重炭酸イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸などである。有機酸は、例えば、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などである。さらに、アミノ酸（例えば、アルギニンなど）の塩、及びグルクロン酸などの有機酸の塩が含まれる。本発明の特定の化合物は塩基性及び酸性の官能基を含むことにより、任意の塩基又は酸付加塩に変換することができる。
【0030】
本発明の薬学的に許容される塩は、酸基又は塩基を含む母体化合物を用いて通常の化学方法により合成される。このような塩は、通常、水若しくは有機溶媒又は両者の混合物において遊離酸又は塩基形態にあるこれらの化合物と化学量論的に適切な塩基又は酸とを反応させることにより製造される。
【0031】
本発明の化合物は、特定の幾何又は立体的異性体の形態を有することができる。本発明において、このような化合物は全て互変異性体、シス・トランス異性体、（－）－及び（＋）－エナンチオマー、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）－異性体、（Ｌ）－異性体、それらのラセミ混合物及び他の混合物、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーに富む混合物を含む。これらの混合物はいずれも本発明の範囲内に含まれる。アルキル基などの置換基には不斉炭素原子が存在する場合がある。これらの異性体及びそれらの混合物はいずれも本発明の範囲内に含まれる。
【0032】
特に断りのない限り、用語「エナンチオマー」又は「光学異性体」とは、互いの鏡像である立体異性体を指す。
【0033】
特に断りのない限り、用語「シス・トランス異性体」又は「幾何異性体」は、二重結合又は環形成炭素原子の単結合が自由回転できないことによって引き起こされるものを指す。
【0034】
特に断りのない限り、用語「ジアステレオマー」とは、分子が２つ以上のキラル中心を有し、分子間の関係が非鏡像である立体異性体を指す。
【0035】
特に断りのない限り、「（Ｄ）」又は「（＋）」は右旋性を意味し、「（Ｌ）」又は「（－）」は左旋性を意味し、「（ＤＬ）」又は「（±）」はラセミ体を意味する。
【0036】
特に断りのない限り、楔形実線結合
及び楔形破線結合
で立体中心の絶対配置を示し、直形実線結合
及び直形破線結合
で立体中心の相対配置を示し、波線
で楔形実線結合
又は楔形破線結合
を示し、或いは波線
で直形実線結合
及び直形破線結合
を示す。
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【0037】
本発明の化合物は特定的であり得る。特に断りのない限り、用語「互変異性体」又は「互変異性体形式」とは、室温で異なる官能基異性体が動的平衡状態にあり、すぐに相互変換できることを指す。互変異性体が可能であると（例えば、溶液中）、互変異性体の化学平衡に達することができる。例えば、プロトン互変異性体（ｐｒｏｔｏｎ ｔａｕｔｏｍｅｒ）（プロトトロピック互変異性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ ｔａｕｔｏｍｅｒ）とも呼ばれる）は、プロトン移動による相互変換（例えば、ケト－エノール異性化及びイミン－エナミン異性化）を含む。原子価互変異性体（ｖａｌｅｎｃｅ ｔａｕｔｏｍｅｒ）は、結合電子の再結合による相互変換を含む。ここで、ケトエノール互変異性化の具体例は、ペンタン－２，４－ジオンと４－ヒドロキシペント－３－エン－２－オンの２つの互変異性体間の相互変換である。
【0038】
特に断りのない限り、用語「異性体を豊富に含む」、「異性体に富む」、「エナンチオマーを豊富に含む」又は「エナンチオマーに富む」とは、ある異性体又はエナンチオマーの含有量が１００％未満であり、かつこの異性体又はエナンチオマーの含有量が６０％以上、又は７０％以上、又は８０％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上、又は９９．５％以上、又は９９．６％以上、又は９９．７％以上、又は９９．８％以上、又は９９．９％以上であることを指す。
【0039】
特に断りのない限り、用語「異性体が過剰である」又は「エナンチオマーが過剰である」とは、この２種類の異性体又は２種類のエナンチオマーの相対百分率の差分を指す。例えば、一方の異性体又はエナンチオマーの含有量が９０％、他方の異性体又はエナンチオマーの含有量が１０％である場合、異性体又はエナンチオマーは（ｅｅ値）８０％過剰である。
【0040】
キラル合成、キラル試薬又は他の通常の技術により光学活性の（Ｒ）－及び（Ｓ）－異性体並びにＤ及びＬ異性体を製造することができる。本発明に係るある化合物のエナンチオマーを得るために、不斉合成又は不斉補助剤を有する誘導作用により製造することができる。得られるジアステレオマー混合物を分離し、補助基が開裂して必要な純粋なエナンチオマーを提供する。或いは、分子に塩基性官能基（例えば、アミノ基）又は酸性官能基（例えば、ヒドロキシル基）がある場合、適切な光学活性の酸又は塩基とジアステレオマーの塩を形成し、そして通常の方法によりジアステレオマーの分離を行い、純粋なエナンチオマーを回収する。さらに、エナンチオマーとジアステレオマーの分離は、通常クロマトグラフィー法により行う。クロマトグラフィー法では、キラル固定相を使用し、必要に応じて化学的誘導体化法と併用する（例えば、アミンからカーバメートを生成する）。本発明の化合物は、この化合物を構成する１つ又は複数の原子に非天然存在比で原子同位体を有してもよい。例えば、放射性同位体（トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）又はＣ－１４（１４Ｃ））で化合物を標識することができる。さらに、重水素で水素を置換して重水素化薬物を形成することができる。重水素と炭素の結合は、通常の水素と炭素の結合よりもより強固であり、重水素化されていない薬物に比べて、重水素化薬物は、毒・副作用を効果的に低減でき、薬物の安定性及び治療効果を向上させ、薬物の生物学的半減期を延長できるなどの利点を有する。本発明の化合物の全ての同位体からなる変換は、放射性にもかかわらず本発明の範囲内に含まれる。「任意」又は「必要に応じて」とは、後述する事件又は状況に応じて発生する可能性があるが、必ず発生するわけではないことを指し、この記述には前記事件又は状況が発生する場合及び発生しない場合が含まれる。
【0041】
薬物又は薬理学的活性剤にとって、用語「有効量」又は「治療有効量」とは、無毒で所望の効果を達成できる薬物又は薬剤の十分な用量を指す。本発明の経口剤形では、組成物におけるある活性物質の「有効量」とは、この組成物における別の活性物質と併用する際に、所望の効果を達成するために必要な用量を指す。有効量の確定はヒトによって異なり、被験体の年齢及び一般状況、具体的な活性物質に依存する。具体的なケースにおける適切な有効量については、当業者が通常の実験によって決定することができる。
【0042】
用語「有効成分」、「治療剤」、「活性物質」又は「活性剤」とは、障害、疾患又は病状を効果的に治療できる化学実体を指す。
【0043】
用語「置換される」とは、特定の原子上のいずれか１つ又は複数の水素原子が置換基によって置換されることを指し、重水素及び水素の変形を含み、この原子の原子価が正常であるとともに、置換後の化合物が安定すればよい。置換基が酸素（即ち、Ｏ）である場合、２つの水素原子が置換されることを示す。なお、芳香族基上では酸素置換は発生することがない。用語「必要に応じて置換される」とは、置換されていてもよく、置換されていなくてもよいことを指す。特に指定のない限り、置換基の種類及び数は化学的に達成できる限り任意である。
【0044】
ある変量（例えば、Ｒ）が化合物の組成又は構造に１回以上現れる場合、この変量は、いかなる場合においてもその定義が独立する。したがって、ある基が０－２個のＲによって置換された場合、この基は、多くとも２つのＲによって任意に置換することができ、いかなる場合においてもＲは独立した選択肢を有する。さらに、置換基及び／又はその変形の組み合わせは、この組み合わせが安定した化合物を生成する場合にのみ許容される。
【0045】
連結基の数が０である場合（例えば－（ＣＲＲ）０－）、この連結基が単結合であることを示す。
【0046】
ある変量が単結合から選択されるものである場合、それと連結する２つの基が直接結合することを示す。例えば、Ａ－Ｌ－ＺにおけるＬが単結合である場合、この構造は実質的にＡ－Ｚであることを示す。
【0047】
ある置換基が空いている場合、この置換基が存在しないことを示す。例えば、Ａ－ＸにおけるＸが空いている場合、この構造は実質的にＡであることを示す。挙げられる置換基におけるどの原子介して置換される基に結合することが指定されていない場合、この置換基は任意の原子を介して結合することができる。例えば、ピリジル基は、置換基としてピリジン環上の任意の炭素原子を介して置換される基に結合することができる。
【0048】
挙げられる連結基の連結方向が指定されていない場合、その連結方向は任意である。例えば、
における連結基Ｌは－Ｍ－Ｗ－であり、この場合、－Ｍ－Ｗ－は、左から右への順序と同じ方向で環Ａと環Ｂとを連結して
を構成しもてよく、反対方向で環Ａと環Ｂとを連結して
を構成してもよい。連結基、置換基及び／又はその変形の組み合わせは、このような組み合わせが安定した化合物を生成する場合にのみ許容される。
【化30】
【化31】
【化32】
【0049】
特に指定のない限り、用語「Ｃ１－６アルキル基」とは、１から６の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を指す。Ｃ１－６アルキル基は、Ｃ１－５、Ｃ１－４、Ｃ１－３、Ｃ１－２、Ｃ２－６、Ｃ２－４、Ｃ６及びＣ５アルキル基などを含み、一価（例えば、メチル基）、二価（例えば、メチレン基）又は多価（例えば、メチン基）であってもよい。Ｃ１－６アルキル基の例には、メチル基（Ｍｅ）、エチル基（Ｅｔ）、プロピル基（ｎ－プロピル基及びイソプロピル基を含む）、ブチル基（ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基を含む）、ペンチル基（ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基を含む）、ヘキシル基などが含まれるが、これらに限定されない。
【0050】
特に指定のない限り、用語「Ｃ１－３アルキル基」とは、１から３の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を指す。Ｃ１－３アルキル基は、Ｃ１－２及びＣ２－３アルキル基などを含み、一価（例えば、メチル基）、二価（例えば、メチレン基）又は多価（例えば、メチン基）であってもよい。Ｃ１－３アルキル基の例には、メチル基（Ｍｅ）、エチル基（Ｅｔ）、プロピル基（ｎ－プロピル基及びイソプロピル基を含む）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0051】
用語「脱離基」とは、置換反応（例えば、求核置換反応）により別の官能基又は原子によって置換可能な官能基又は原子を指す。代表的な脱離基には、トリフルオロメタンスルホン酸エステル；塩素、臭素、ヨウ素；スルホン酸エステル基、例えば、メタンスルホン酸エステル、トルエンスルホン酸エステル、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸エステル、ｐ－トルエンスルホン酸エステルなど；アシルオキシ、例えば、アセトキシ、トリフルオロアセトキシなどが含まれる。
【0052】
用語「保護基」は、「アミノ保護基」、「ヒドロキシ保護基」又は「チオール保護基」を含むが、これらに限定されない。用語「アミノ保護基」とは、アミノ基の窒素部位での副反応を阻止するのに適した保護基を指す。代表的なアミノ保護基は、ホルミル基；アシル基、例えば、アルカノイル基（例えば、アセチル基、トリクロロアセチル基又はトリフルオロアセチル基）；アルコキシカルボニル基、例えば、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）；アリールメトキシカルボニル基、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）及び９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）；アリールメチル基、例えば、ベンジル基（Ｂｎ）、トリチル基（Ｔｒ）、１，１－二（４’－メトキシフェニル）メチル基；シリル基、例えば、トリメチルシリル基（ＴＭＳ）及びｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＳ）などを含むが、これらに限定されない。用語「ヒドロキシ保護基」とは、ヒドロキシル基の副反応を阻止するのに適した保護基を指す。代表的なヒドロキシ保護基は、アルキル、例えば、メチル基、エチル基及びｔｅｒｔ－ブチル基；アシル基、例えば、アルカノイル基（例えば、アセチル基）；アリールメチル基、例えば、ベンジル基（Ｂｎ）、ｐ－メトキシベンジル基（ＰＭＢ）、９－フルオレニルメチル基（Ｆｍ）及びジフェニルメチル（ＤＰＭ）；シリル基、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）及びＴｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）などを含むが、これらに限定されない。
【0053】
本発明の化合物は、当業者によく知られている多くの合成方法により調製することができる。これらの合成方法は、以下に示される具体的な実施形態、それと他の化学合成方法とを組み合わせた実施形態、及び当業者によく知られている同等の置換態様を含む。好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これに限定されない。
【0054】
本発明で使用される溶媒は市販品である。
【0055】
本発明で使用される略語
ＣＦＵ：コロニー数
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度。
ＣＦＵ：コロニー数
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】化合物１（用量３０ｍｐｋ）及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ（用量３０ｍｐｋ）のマウス大腿筋モデル（腸内細菌ＡＴＣＣ－２５９２２）における体内薬効データである。
【図2】化合物１（用量１０ｍｐｋ及び３０ｍｐｋ）、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ（用量１０ｍｐｋ及び３０ｍｐｋ）及びメロペネム（用量１００ｍｐｋ）のマウス肺炎モデル（肺炎クレブシエラ菌ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５）における体内薬効データである。
【図3】複合活動電位の振幅変化であり、周波数３２ｋＨｚである場合、化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎのＣＡＰ振幅の異なる強度での変化を示す。
【図4】複合活動電位の振幅の変化、具体的には、固定周波数１６ｋＨｚにおける化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎのＣＡＰ振幅の異なる強度の変化を示す。
【図5】複合活動電位の振幅の変化、具体的には、短音（Ｃｌｉｃｋ）である場合における化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎのＣＡＰ振幅の異なる強度の変化を示す。
【図6】蝸牛の有毛細胞の損傷状況を示す。図６Ａは、化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎによる内有毛細胞の損傷の状況を示す。図６Ｂは、化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎによる外有毛細胞の損傷の状況を示す。
【図7】化合物１、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎによるらせん神経節細胞の密度の変化を示す。
【図8】ＨＫ－２細胞に対するＰｌａｚｏｍｉｃｉｎの毒性回帰曲線である。
【図9】ＨＫ－２細胞に対する化合物１の毒性回帰曲線である。
【図10】ＨＫ－２細胞に対するネチルマイシンの毒性回帰曲線である。
【図11】ＨＫ－２細胞に対するアミカシンの毒性回帰曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0057】
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。当業者は本発明の思想から逸脱しない範囲で本発明の実施形態を変更及び改良することができる。
【0058】
実施例１：化合物１
【化33】
【0059】
ステップ１
ジフェニルホスフィニルヒドロキシルアミン（１０ｇ，４２．８８ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、化合物１－１（１３．６５ｇ，１２８．６４ｍｍｏｌ，１２．１９ｍＬ，３ｅｑ）及びナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（４．９５ｇ，５１．４６ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解し、５－１５℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を濃縮し、化合物１－２を得た。
ジフェニルホスフィニルヒドロキシルアミン（１０ｇ，４２．８８ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、化合物１－１（１３．６５ｇ，１２８．６４ｍｍｏｌ，１２．１９ｍＬ，３ｅｑ）及びナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（４．９５ｇ，５１．４６ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解し、５－１５℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応液を濾過し、濾液を濃縮し、化合物１－２を得た。
【0060】
ステップ２
ステップ１で得られた化合物１－２（５．１９ｇ，４２．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液とＮ，Ｎ－二－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－ホルムアミジン（１３．３０ｇ，４２．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を６６℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応液を室温に冷却し、そこに水（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、濾液を濃縮し、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝２０／１，１／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１－３を得た。
ステップ１で得られた化合物１－２（５．１９ｇ，４２．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液とＮ，Ｎ－二－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－ホルムアミジン（１３．３０ｇ，４２．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を６６℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応液を室温に冷却し、そこに水（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（１００ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、濾液を濃縮し、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝２０／１，１／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１－３を得た。
【0061】
ステップ３
化合物１－３（１ｇ，２．７５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及び２－ヨードキシ安息香酸（８４７．５９ｍｇ，３．０３ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）をジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）に溶解し、反応液を４０℃で撹拌しながら１時間反応させた。反応液を濾過し、濾液に水（４０ｍＬ）を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（２０ｍＬ×２回）で抽出。有機相を合わせ、飽和チオ硫酸ナトリウム（１０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、化合物１－４を得た。
化合物１－３（１ｇ，２．７５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及び２－ヨードキシ安息香酸（８４７．５９ｍｇ，３．０３ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）をジメチルスルホキシド（１０ｍＬ）に溶解し、反応液を４０℃で撹拌しながら１時間反応させた。反応液を濾過し、濾液に水（４０ｍＬ）を加え、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（２０ｍＬ×２回）で抽出。有機相を合わせ、飽和チオ硫酸ナトリウム（１０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、化合物１－４を得た。
【0062】
ステップ４
アンバーライト（イオン交換樹脂）ＩＲＡ－４０２（ＯＨ）（５００ｇ）をメタノール（５００ｍＬ）に加え、この溶液を２０℃で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾過ケーキをメタノール（５００ｍＬ）に加え、さらに化合物１－５をこの混合液に加え、混合物を２０℃で１１時間撹拌した。反応過程において化合物１－５は溶解した。反応液を濾過し、濾液を濃縮し、化合物１－６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４８．４（Ｍ＋１）。
アンバーライト（イオン交換樹脂）ＩＲＡ－４０２（ＯＨ）（５００ｇ）をメタノール（５００ｍＬ）に加え、この溶液を２０℃で１時間撹拌した。混合物を濾過し、濾過ケーキをメタノール（５００ｍＬ）に加え、さらに化合物１－５をこの混合液に加え、混合物を２０℃で１１時間撹拌した。反応過程において化合物１－５は溶解した。反応液を濾過し、濾液を濃縮し、化合物１－６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４４８．４（Ｍ＋１）。
【0063】
ステップ５
化合物１－６（１５ｇ，３３．５２ｍｍｏｌ，１ｅｑ）をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、さらにＳ－エチル２，２，２－トリフルオロエチルチオエステル（４．２４ｇ，２６．８２ｍｍｏｌ，０．８ｅｑ）のメタノール（１５０ｍＬ）溶液を上記メタノール溶液に滴下し、混合液を２０℃で１６時間撹拌した。酢酸亜鉛（１４．７２ｇ，８０．４４ｍｍｏｌ，２．４ｅｑ）を溶液に加え、さらに（Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド）－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（１６．８５ｇ，６０．３３ｍｍｏｌ，１．８ｅｑ）及びトリエチルアミン（１０．１７ｇ，１００．５５ｍｍｏｌ，１４．００ｍＬ，３ｅｑ）のテトラヒドロフラン（１７０ｍＬ）溶液を混合液に滴下した。反応液を２０℃で３０時間撹拌した。反応液をグリシン（７ｇ）で停止させた後、濃縮した。ジクロロメタン（１０００ｍＬ）で濃縮液を希釈し、アンモニア水溶液（３００ｍＬ、水：アンモニア＝７：３）で２回洗浄し、有機相を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ジクロロメタン／メタノール＝５０／１～５／１（ｖ／ｖ），少量のアンモニア水を含む）により精製し、化合物１－７を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７４４．３（Ｍ＋１）。
化合物１－６（１５ｇ，３３．５２ｍｍｏｌ，１ｅｑ）をメタノール（１５０ｍＬ）に溶解し、さらにＳ－エチル２，２，２－トリフルオロエチルチオエステル（４．２４ｇ，２６．８２ｍｍｏｌ，０．８ｅｑ）のメタノール（１５０ｍＬ）溶液を上記メタノール溶液に滴下し、混合液を２０℃で１６時間撹拌した。酢酸亜鉛（１４．７２ｇ，８０．４４ｍｍｏｌ，２．４ｅｑ）を溶液に加え、さらに（Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド）－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（１６．８５ｇ，６０．３３ｍｍｏｌ，１．８ｅｑ）及びトリエチルアミン（１０．１７ｇ，１００．５５ｍｍｏｌ，１４．００ｍＬ，３ｅｑ）のテトラヒドロフラン（１７０ｍＬ）溶液を混合液に滴下した。反応液を２０℃で３０時間撹拌した。反応液をグリシン（７ｇ）で停止させた後、濃縮した。ジクロロメタン（１０００ｍＬ）で濃縮液を希釈し、アンモニア水溶液（３００ｍＬ、水：アンモニア＝７：３）で２回洗浄し、有機相を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ジクロロメタン／メタノール＝５０／１～５／１（ｖ／ｖ），少量のアンモニア水を含む）により精製し、化合物１－７を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７４４．３（Ｍ＋１）。
【0064】
ステップ６
（２Ｓ）－４－（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルアミノ）－２－ヒドロキシ－酪酸（６．８５ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解し、溶液にＮ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジイミド（５．６０ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（４．８５ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，５．５３ｍＬ，１．５ｅｑ）を加えた。反応液を２０℃で２時間撹拌した。さらに化合物１－７（１５．５ｇ，２０．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を反応液に加え、反応液を２０℃で１６時間撹拌した。そして水（２００ｍＬ）で希釈し、それぞれ酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮し、混合物を得た。混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ジクロロメタン／メタノール＝５０／１～１０／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１－８を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９４５．５（Ｍ＋１）。
（２Ｓ）－４－（ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルアミノ）－２－ヒドロキシ－酪酸（６．８５ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解し、溶液にＮ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジイミド（５．６０ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）及び１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（４．８５ｇ，３１．２６ｍｍｏｌ，５．５３ｍＬ，１．５ｅｑ）を加えた。反応液を２０℃で２時間撹拌した。さらに化合物１－７（１５．５ｇ，２０．８４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を反応液に加え、反応液を２０℃で１６時間撹拌した。そして水（２００ｍＬ）で希釈し、それぞれ酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮し、混合物を得た。混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ジクロロメタン／メタノール＝５０／１～１０／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物１－８を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９４５．５（Ｍ＋１）。
【0065】
ステップ７
化合物１－８（１６．４０ｇ，１７．３５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボナート（４．５５ｇ，２０．８３ｍｍｏｌ，４．７８ｍＬ，１．２ｅｑ）、ＤＩＥＡ（２．６９ｇ，２０．８３ｍｍｏｌ，３．６ｍＬ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（１７０ｍＬ）に溶解し、３回窒素置換した後、反応液を２０℃で１６時間撹拌した。水（２００ｍＬ）を加えて希釈した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機相を順に０．１Ｍ塩酸（２０ｍＬ）及び飽和食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮した後、固体混合物を得た。混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝１５／１～０／１（ｖ／ｖ））により精製し、目的化合物１－９を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０４５．３（Ｍ＋１）。
化合物１－８（１６．４０ｇ，１７．３５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボナート（４．５５ｇ，２０．８３ｍｍｏｌ，４．７８ｍＬ，１．２ｅｑ）、ＤＩＥＡ（２．６９ｇ，２０．８３ｍｍｏｌ，３．６ｍＬ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（１７０ｍＬ）に溶解し、３回窒素置換した後、反応液を２０℃で１６時間撹拌した。水（２００ｍＬ）を加えて希釈した後、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機相を順に０．１Ｍ塩酸（２０ｍＬ）及び飽和食塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮した後、固体混合物を得た。混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝１５／１～０／１（ｖ／ｖ））により精製し、目的化合物１－９を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０４５．３（Ｍ＋１）。
【0066】
ステップ８
化合物１－９（１５．００ｇ，１４．３５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及びアンモニア水（６３．７０ｇ，１．８２ｍｏｌ，７０ｍＬ，１２６．６２ｅｑ）をメタノール（８０ｍＬ）に溶解し、混合液を２０℃で１６時間撹拌した。反応液を濃縮して溶媒を除去し、水（１００ｍＬ）を加えて希釈し、さらにジクロロメタン（１００ｍＬ×３次）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮した後の混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，まず石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１～０／１（ｖ／ｖ）、次いでジクロロメタン／メタノール＝６／１（ｖ／ｖ），溶離液に少量のアンモニア水が含まれる）により精製し、化合物１－１０を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９４９．３（Ｍ＋１）。
化合物１－９（１５．００ｇ，１４．３５ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及びアンモニア水（６３．７０ｇ，１．８２ｍｏｌ，７０ｍＬ，１２６．６２ｅｑ）をメタノール（８０ｍＬ）に溶解し、混合液を２０℃で１６時間撹拌した。反応液を濃縮して溶媒を除去し、水（１００ｍＬ）を加えて希釈し、さらにジクロロメタン（１００ｍＬ×３次）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮した後の混合物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，まず石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１～０／１（ｖ／ｖ）、次いでジクロロメタン／メタノール＝６／１（ｖ／ｖ），溶離液に少量のアンモニア水が含まれる）により精製し、化合物１－１０を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：９４９．３（Ｍ＋１）。
【0067】
ステップ９
化合物１－４（５０．６３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）及び化合物１－１０（１４５．００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．００ｍＬ）に溶解し、４Ａ分子篩（０．５ｇ）を加え、窒素雰囲気、１８℃で０．５時間撹拌し、そしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．２０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。ＬＣＭＳにより完全に反応したことを検出した後、濾過して濃縮し、分取ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：６０％－９０％，１０ｍｉｎにより分離し、化合物１－１１を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１２９４．７（Ｍ＋１）。
化合物１－４（５０．６３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）及び化合物１－１０（１４５．００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．００ｍＬ）に溶解し、４Ａ分子篩（０．５ｇ）を加え、窒素雰囲気、１８℃で０．５時間撹拌し、そしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．２０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。ＬＣＭＳにより完全に反応したことを検出した後、濾過して濃縮し、分取ＨＰＬＣ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：６０％－９０％，１０ｍｉｎにより分離し、化合物１－１１を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１２９４．７（Ｍ＋１）。
【0068】
ステップ１０
化合物１－１１（９１．００ｍｇ，７１．９７μｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．００ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気の保護下で０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ）を加え、０－１９℃で９時間撹拌し、常温で濃縮し、アセトニトリル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４ｍＬ，１／３）でスラリー化し、濾過して濃縮し、化合物１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：５．６２（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），４．０９－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，５Ｈ），３．７７－３．７３（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，１Ｈ），３．２２－３．１０（ｍ，６Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６１－２．１４（ｍ，２Ｈ），２．０４－２．１４（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６４．５（Ｍ＋１）。
化合物１－１１（９１．００ｍｇ，７１．９７μｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．００ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気の保護下で０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ）を加え、０－１９℃で９時間撹拌し、常温で濃縮し、アセトニトリル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４ｍＬ，１／３）でスラリー化し、濾過して濃縮し、化合物１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：５．６２（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），４．０９－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，５Ｈ），３．７７－３．７３（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，１Ｈ），３．２２－３．１０（ｍ，６Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６１－２．１４（ｍ，２Ｈ），２．０４－２．１４（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６４．５（Ｍ＋１）。
【0069】
実施例２：化合物２
【化34】
【0070】
ステップ１
化合物２－１（１ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，７１．９４μＬ，１．２ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－二－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－ホルムアミジン（３．１５ｇ，１０．１６ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及びトリフェニルホスフィン（３．２０ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）に溶解し、０℃でＤＩＡＤ（２．４６ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，２．３７ｍＬ，１．２ｅｑ）を滴下し、そして２０℃に昇温し、１２時間撹拌した。反応液に水（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ，３回）で抽出し、合わせた有機相を水（３０ｍＬ，３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーカラム（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝５０／１から２０／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２－２を得た。
化合物２－１（１ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，７１．９４μＬ，１．２ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－二－ＢＯＣ－１Ｈ－ピラゾール－１－ホルムアミジン（３．１５ｇ，１０．１６ｍｍｏｌ，１ｅｑ）及びトリフェニルホスフィン（３．２０ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）に溶解し、０℃でＤＩＡＤ（２．４６ｇ，１２．１９ｍｍｏｌ，２．３７ｍＬ，１．２ｅｑ）を滴下し、そして２０℃に昇温し、１２時間撹拌した。反応液に水（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ，３回）で抽出し、合わせた有機相を水（３０ｍＬ，３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーカラム（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝５０／１から２０／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２－２を得た。
【0071】
ステップ２
化合物１－２（２．１ｇ，１７．３４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、２０℃で化合物２－２（３．２５ｇ，８．６７ｍｍｏｌ，０．５ｅｑ）を加え、反応液を６７℃で１２時間撹拌した。反応液に水（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機相を水（３０ｍＬ，３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーカラム（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１から１／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２－３を得た。
化合物１－２（２．１ｇ，１７．３４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、２０℃で化合物２－２（３．２５ｇ，８．６７ｍｍｏｌ，０．５ｅｑ）を加え、反応液を６７℃で１２時間撹拌した。反応液に水（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機相を水（３０ｍＬ，３回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をクロマトグラフィーカラム（シリカ，石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１から１／１（ｖ／ｖ））により精製し、化合物２－３を得た。
【0072】
ステップ３
化合物２－３（１５０ｍｇ，３５０．９３μｍｏｌ，１ｅｑ）をジメチルスルホキシド（３ｍＬ）に溶解し、４０℃で２－ヨードキシ安息香酸（１０８．０９ｍｇ，３８６．０２μｍｏｌ，１．１ｅｑ）を加え、反応液を４０℃で２時間撹拌した。反応液に飽和重炭酸ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム（３０ｍＬ，（ｖ／ｖ））を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機相を飽和重炭酸ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム（１０ｍＬ×３回（１／１，ｖ／ｖ））で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、化合物２－４を得た。
化合物２－３（１５０ｍｇ，３５０．９３μｍｏｌ，１ｅｑ）をジメチルスルホキシド（３ｍＬ）に溶解し、４０℃で２－ヨードキシ安息香酸（１０８．０９ｍｇ，３８６．０２μｍｏｌ，１．１ｅｑ）を加え、反応液を４０℃で２時間撹拌した。反応液に飽和重炭酸ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム（３０ｍＬ，（ｖ／ｖ））を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ×２）で抽出し、合わせた有機相を飽和重炭酸ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム（１０ｍＬ×３回（１／１，ｖ／ｖ））で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、化合物２－４を得た。
【0073】
ステップ４
化合物１－１０（２３９．３２ｍｇ，２５２．１６μｍｏｌ，１ｅｑ）を１，２－ジクロロエタン（２ｍＬ）に溶解し、２０℃で化合物２－５（１１８ｍｇ，２７７．３７μｍｏｌ，１．１ｅｑ）及び４Ａ分子篩（３００ｍｇ）を加え、１時間撹拌した後、酢酸水素化ホウ素ナトリウム（６４．１３ｍｇ，３０２．５９μｍｏｌ，１．２ｅｑ）を加え、反応液を２０℃で１２時間撹拌した。反応液に水（２０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機相を水（１０ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：３５％－５６％，７ｍｉｎ）により精製し、化合物２－６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１３５８．７（Ｍ＋１）。
化合物１－１０（２３９．３２ｍｇ，２５２．１６μｍｏｌ，１ｅｑ）を１，２－ジクロロエタン（２ｍＬ）に溶解し、２０℃で化合物２－５（１１８ｍｇ，２７７．３７μｍｏｌ，１．１ｅｑ）及び４Ａ分子篩（３００ｍｇ）を加え、１時間撹拌した後、酢酸水素化ホウ素ナトリウム（６４．１３ｍｇ，３０２．５９μｍｏｌ，１．２ｅｑ）を加え、反応液を２０℃で１２時間撹拌した。反応液に水（２０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（２０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機相を水（１０ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮し、粗生成物を得た。分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５ｍｍ×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：３５％－５６％，７ｍｉｎ）により精製し、化合物２－６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１３５８．７（Ｍ＋１）。
【0074】
ステップ５
化合物２－８（４０ｍｇ，２９．４４μｍｏｌ，１ｅｑ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、０℃でトリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ，１ｍＬ，４５８．７０ｅｑ）を加え、２０℃に昇温し、２時間撹拌した。反応液を０℃に冷却し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１５ｍＬ）を加え、濾過し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２ｍＬ×３）で洗浄した後、オイルポンプ４０℃で乾燥し、化合物２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝６．１８－５．８７（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｓ，１Ｈ），５．２８－５．２２（ｍ，１Ｈ），５．０８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．１６（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０３（ｍ，３Ｈ），３．９８－３．８９（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．６８（ｍ，８Ｈ），３．４６－３．３８（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６－３．２２（ｍ，２Ｈ），３．１６－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６９－２．５５（ｍ，１Ｈ），２．４２－２．２８（ｍ，１Ｈ），２．１９－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．９５－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．８３－１．７１（ｍ，１Ｈ），１．２９－１．２３（ｍ，３Ｈ）。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７５８．３（Ｍ＋１）。
化合物２－８（４０ｍｇ，２９．４４μｍｏｌ，１ｅｑ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、０℃でトリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ，１ｍＬ，４５８．７０ｅｑ）を加え、２０℃に昇温し、２時間撹拌した。反応液を０℃に冷却し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１５ｍＬ）を加え、濾過し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２ｍＬ×３）で洗浄した後、オイルポンプ４０℃で乾燥し、化合物２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝６．１８－５．８７（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｓ，１Ｈ），５．２８－５．２２（ｍ，１Ｈ），５．０８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３－４．１６（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０３（ｍ，３Ｈ），３．９８－３．８９（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．６８（ｍ，８Ｈ），３．４６－３．３８（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２６－３．２２（ｍ，２Ｈ），３．１６－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６９－２．５５（ｍ，１Ｈ），２．４２－２．２８（ｍ，１Ｈ），２．１９－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．９５－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．８３－１．７１（ｍ，１Ｈ），１．２９－１．２３（ｍ，３Ｈ）。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７５８．３（Ｍ＋１）。
【0075】
実施例３：化合物３
【化35】
【0076】
ステップ１
化合物３－１（１６．００ｇ，１１５．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００．００ｍＬ）に溶解し、そこにＮ－ＢＯＣ－ヒドロキシルアミン（１５．３３ｇ，１１５．１２ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１９．２８ｇ，１２６．６３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１１℃－２５℃で１６時間反応させた後、濃縮した。残留物を酢酸エチル（３５０ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０－１／１（ｖ／ｖ））により分離し、化合物３－２を得た。
化合物３－１（１６．００ｇ，１１５．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２００．００ｍＬ）に溶解し、そこにＮ－ＢＯＣ－ヒドロキシルアミン（１５．３３ｇ，１１５．１２ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１９．２８ｇ，１２６．６３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１１℃－２５℃で１６時間反応させた後、濃縮した。残留物を酢酸エチル（３５０ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０－１／１（ｖ／ｖ））により分離し、化合物３－２を得た。
【0077】
ステップ２
化合物３－２（１．００ｇ，５．２３ｍｍｏｌ）及び塩化水素のジオキサン溶液（１０ｍＬ，４ｍｍｏｌ）を混合し、２０℃で１６時間撹拌し、そして減圧濃縮し、化合物３－３を得た。
化合物３－２（１．００ｇ，５．２３ｍｍｏｌ）及び塩化水素のジオキサン溶液（１０ｍＬ，４ｍｍｏｌ）を混合し、２０℃で１６時間撹拌し、そして減圧濃縮し、化合物３－３を得た。
【0078】
ステップ３
化合物３－３（５８１．２７ｍｇ，６．３８ｍｍｏｌ）及びビスＢｏｃピラゾールグアニジン（１．８０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、溶液を８０℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳで完全に反応したことを検出した。この混合物を水（１００ｍＬ）に入れ、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で希釈し抽出し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝５０／１－２０／１（ｖ／ｖ））により分離し、化合物３－４を得た。
化合物３－３（５８１．２７ｍｇ，６．３８ｍｍｏｌ）及びビスＢｏｃピラゾールグアニジン（１．８０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、溶液を８０℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳで完全に反応したことを検出した。この混合物を水（１００ｍＬ）に入れ、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で希釈し抽出し、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝５０／１－２０／１（ｖ／ｖ））により分離し、化合物３－４を得た。
【0079】
ステップ４
化合物３－４（０．４０ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５．００ｍＬ）に溶解し、２－ヨードキシ安息香酸（０．３４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気、４０℃で３時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ×２）及び飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０－１／１）により分離し、化合物３－５を得た。
化合物３－４（０．４０ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（５．００ｍＬ）に溶解し、２－ヨードキシ安息香酸（０．３４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気、４０℃で３時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ×２）及び飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（フィラー：シリコーン粉末，溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０－１／１）により分離し、化合物３－５を得た。
【0080】
ステップ５
化合物３－５（５０．６３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）及び化合物１－１０（１４５．００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．００ｍＬ）に溶解し、４Ａ分子篩（０．５ｇ）を加え、窒素雰囲気、１８℃で０．５時間撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．２０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌し、ＬＣＭＳにより完全に反応したことを検出し、濾過して濃縮し、分取－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：６０％－９０％，１０ｍｉｎ）により分離し、化合物３－７を得た。
化合物３－５（５０．６３ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）及び化合物１－１０（１４５．００ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．００ｍＬ）に溶解し、４Ａ分子篩（０．５ｇ）を加え、窒素雰囲気、１８℃で０．５時間撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１９．２０ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌し、ＬＣＭＳにより完全に反応したことを検出し、濾過して濃縮し、分取－ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０×２５×１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ギ酸）－アセトニトリル］；アセトニトリル％：６０％－９０％，１０ｍｉｎ）により分離し、化合物３－７を得た。
【0081】
ステップ６
化合物３－７（９１．００ｍｇ，７１．９７μｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．００ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気の保護下で０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ）を加え、０－１９℃で９時間撹拌し、常温で濃縮した。残留物をアセトニトリル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４ｍＬ，１／３）で洗浄し、化合物３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：５．６２（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），４．０９－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，５Ｈ），３．７７－３．７３（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，１Ｈ），３．２２－３．１０（ｍ，６Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６１－２．１４（ｍ，２Ｈ），２．０４－２．１４（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６４．５（Ｍ＋１）。
化合物３－７（９１．００ｍｇ，７１．９７μｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．００ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気の保護下で０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ）を加え、０－１９℃で９時間撹拌し、常温で濃縮した。残留物をアセトニトリル／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４ｍＬ，１／３）で洗浄し、化合物３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ（ｐｐｍ）：５．６２（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，１Ｈ），４．０９－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，５Ｈ），３．７７－３．７３（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，１Ｈ），３．２２－３．１０（ｍ，６Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．６１－２．１４（ｍ，２Ｈ），２．０４－２．１４（ｍ，６Ｈ），１．２６（ｓ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６６４．５（Ｍ＋１）。
【0082】
生物活性測定
実験例１：化合物の静菌作用の測定（ＭＩＣ）
３株の腸内細菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２，Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２５２３，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１７０５ヲ用いて臨床及び実験室標準協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ，ＣＬＳＩ）の要求に従って、微量液体希釈法により各化合物の最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）を測定した。丸底９６－ウェルプレート（Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３７８８，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２倍段階希釈化合物（最終濃度の範囲：０．１２５μｇ／ｍＬ－１２８μｇ／ｍＬ）を加え、一晩静置したミューラー・ヒントン寒天培地Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ａｇａｒ（ＭＨＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１１４３８，ＢＤ ＢＢＬＴＭ）から新鮮な細菌モノクローンを取り、滅菌生理食塩水に懸濁させ、濃度を１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに調節し、さらに陽イオンで調整したミューラー・ヒントン培地Ｃａｔｉｏｎ－Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ，Ｃａｔａｌｏｇ＃２１２３３２，ＢＤ ＢＢＬＴＭ）で５×１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、１００μＬを取り、薬物が入った丸底９６－ウェルプレートに入れた。プレートを逆さまにし、３７℃で２０－２４ｈ培養した後、ＭＩＣ値を読み取った。細菌の増殖を抑制できる最低薬物濃度をＭＩＣとする。結果を表１に示す。
実験例１：化合物の静菌作用の測定（ＭＩＣ）
３株の腸内細菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２，Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２５２３，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１７０５ヲ用いて臨床及び実験室標準協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄ，ＣＬＳＩ）の要求に従って、微量液体希釈法により各化合物の最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）を測定した。丸底９６－ウェルプレート（Ｃａｔａｌｏｇ＃ ３７８８，Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２倍段階希釈化合物（最終濃度の範囲：０．１２５μｇ／ｍＬ－１２８μｇ／ｍＬ）を加え、一晩静置したミューラー・ヒントン寒天培地Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ａｇａｒ（ＭＨＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１１４３８，ＢＤ ＢＢＬＴＭ）から新鮮な細菌モノクローンを取り、滅菌生理食塩水に懸濁させ、濃度を１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに調節し、さらに陽イオンで調整したミューラー・ヒントン培地Ｃａｔｉｏｎ－Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ，Ｃａｔａｌｏｇ＃２１２３３２，ＢＤ ＢＢＬＴＭ）で５×１０５ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、１００μＬを取り、薬物が入った丸底９６－ウェルプレートに入れた。プレートを逆さまにし、３７℃で２０－２４ｈ培養した後、ＭＩＣ値を読み取った。細菌の増殖を抑制できる最低薬物濃度をＭＩＣとする。結果を表１に示す。
【0083】
【表1】
【0084】
結論：本発明の化合物は良好なインビトロ静菌活性を有する。
【0085】
実験例２：ラット体内での薬物動態評価
実験の目的：ラット体内での本発明の化合物の薬物動態パラメータの測定
実験計画
１）実験薬：化合物１
２）実験動物：３匹の７－９週齢の雄ＳＤラット
３）薬物の調製：適用の薬物を秤量し、生理食塩水に溶解し、６０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製した。
実験の操作
動物に対して、尾静脈単回静脈内注入により用量１５０ｍｇ／ｋｇ、濃度６０ｍｇ／ｍＬの薬物を３０ｍｉｎ投与した。投与した後の０、０．０３３３、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４時間目に血漿サンプルを差採取した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法により血漿サンプル中の薬物濃度を測定した。得られた試験薬物の動態パラメータを２に示す。
実験の目的：ラット体内での本発明の化合物の薬物動態パラメータの測定
実験計画
１）実験薬：化合物１
２）実験動物：３匹の７－９週齢の雄ＳＤラット
３）薬物の調製：適用の薬物を秤量し、生理食塩水に溶解し、６０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製した。
実験の操作
動物に対して、尾静脈単回静脈内注入により用量１５０ｍｇ／ｋｇ、濃度６０ｍｇ／ｍＬの薬物を３０ｍｉｎ投与した。投与した後の０、０．０３３３、０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４時間目に血漿サンプルを差採取した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法により血漿サンプル中の薬物濃度を測定した。得られた試験薬物の動態パラメータを２に示す。
【0086】
【表2】
【0087】
結論：本発明の化合物はラット体内において良好な薬物動態特性を有する。
【0088】
実験例３：マウス体内での薬物動態研究
実験の目的：化合物の単回静脈内注射及び胃内投与後の薬物動態挙動を評価し、胃内投与後の生物利用度を考察した。
実験操作
７から１０週齢のＣＤ－１雄マウスを選択し、静脈内投与の用量は１ｍｇ／ｋｇであった。投与前にマウスを少なくとも１２時間断食させ、投与の４時間後から給餌を回復し、試験期間中に自由に飲水させた。
実験当日に静脈群の動物に対して尾静脈単回注射により対応する化合物を投与し、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。投与前に動物の体重を計測し、体重に応じて投与体積を計算した。サンプル採取時点は０．０８３，０．２５，０．５，１，２，４，８，２４ｈであった。各時点で伏在静脈から約３０μＬの全血を採取して血漿を調製し、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により濃度を測定した。最後の時点でＰＫサンプルを採取した後、全ての動物をＣＯ２麻酔により安楽死させた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）薬物動態ソフトウェアの非房室モデルにより血漿濃度を処理し、線形対数台形法により薬物動態パラメータを計算した。
実験結果：マウスＰＫ特性評価結果を表３に示す。
実験の目的：化合物の単回静脈内注射及び胃内投与後の薬物動態挙動を評価し、胃内投与後の生物利用度を考察した。
実験操作
７から１０週齢のＣＤ－１雄マウスを選択し、静脈内投与の用量は１ｍｇ／ｋｇであった。投与前にマウスを少なくとも１２時間断食させ、投与の４時間後から給餌を回復し、試験期間中に自由に飲水させた。
実験当日に静脈群の動物に対して尾静脈単回注射により対応する化合物を投与し、投与体積は５ｍＬ／ｋｇであった。投与前に動物の体重を計測し、体重に応じて投与体積を計算した。サンプル採取時点は０．０８３，０．２５，０．５，１，２，４，８，２４ｈであった。各時点で伏在静脈から約３０μＬの全血を採取して血漿を調製し、高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により濃度を測定した。最後の時点でＰＫサンプルを採取した後、全ての動物をＣＯ２麻酔により安楽死させた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）薬物動態ソフトウェアの非房室モデルにより血漿濃度を処理し、線形対数台形法により薬物動態パラメータを計算した。
実験結果：マウスＰＫ特性評価結果を表３に示す。
【0089】
【表3】
【0090】
結論：本発明の化合物はマウス体内において良好な薬物動態特性を有する。
【0091】
実験例４：マウス体内での薬効実験評価（マウス大腿筋モデル）
１２匹のＣＤ－１雌マウスを３匹／１ケージで４ケージに分け、免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１５０ｍｐｋ）を腹腔内注射した。
２４時間後、４ケージのマウスに対して再度免疫抑制剤シクロホスファミド（１００ｍｐｋ）を腹腔内注射し、ＭＨＡプレートで菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ－２５９２２（腸内細菌ＡＴＣＣ－２５９２２）を蘇生させた。蘇生したコロニーを生理食塩水に溶解し、濃度１．００Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ－２５９２２菌液を調製し、マウス大腿筋を感染させた。実験マウスの大腿筋に注射される菌液量は１００μＬ／匹であり、即ち、接種量は１．００Ｅ＋０６ＣＦＵ／マウスであった。感染した２ｈ後に、対照群マウスから大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。
１２匹のＣＤ－１雌マウスを３匹／１ケージで４ケージに分け、免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１５０ｍｐｋ）を腹腔内注射した。
２４時間後、４ケージのマウスに対して再度免疫抑制剤シクロホスファミド（１００ｍｐｋ）を腹腔内注射し、ＭＨＡプレートで菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ－２５９２２（腸内細菌ＡＴＣＣ－２５９２２）を蘇生させた。蘇生したコロニーを生理食塩水に溶解し、濃度１．００Ｅ＋０７ＣＦＵ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ－２５９２２菌液を調製し、マウス大腿筋を感染させた。実験マウスの大腿筋に注射される菌液量は１００μＬ／匹であり、即ち、接種量は１．００Ｅ＋０６ＣＦＵ／マウスであった。感染した２ｈ後に、対照群マウスから大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。
【0092】
マウスに対する具体的な投与状況
（１）感染後の２ｈ目：第１ケージのマウスを感染した２ｈ後に、大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの大腿筋組織における菌量を計測し、第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１を皮下注射した。
（２）感染後の１０ｈ目：第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１を皮下注射した。第２～４ケージのマウスを感染した２４ｈ後に、大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの大腿筋組織における菌量を計測した。実験結果を図１に示す。
結論：図１の結果から明らかなように、化合物１は３０ｍｐｋである場合体内での薬効はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも高い。
（１）感染後の２ｈ目：第１ケージのマウスを感染した２ｈ後に、大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの大腿筋組織における菌量を計測し、第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１を皮下注射した。
（２）感染後の１０ｈ目：第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１を皮下注射した。第２～４ケージのマウスを感染した２４ｈ後に、大腿筋組織を取り、１０ｍＬ生理食塩水に置き、大腿筋組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの大腿筋組織における菌量を計測した。実験結果を図１に示す。
結論：図１の結果から明らかなように、化合物１は３０ｍｐｋである場合体内での薬効はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも高い。
【0093】
実験例５：マウス体内での薬効実験評価（マウス肺炎モデル）
２１匹のＣＤ－１雌マウスを３匹／ケージで７ケージに分けた。４日目に免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１５０ｍｐｋ）を腹腔内注射した。
１日目に、７ケージのマウスに再度免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１００ｍｐｋ）を腹腔内注射した。ＭＨＡプレートで菌株Ｋｐｎ ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５（肺炎クレブシエラ菌ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５）を蘇生させた。蘇生したコロニーを選択して生理食塩水に溶解し、濃度４．００Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｍＬのＫｐｎ ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５菌液を調製し、マウスの肺部を感染させた。実験マウスの肺部の感染菌液量は５０μＬ／匹であり、即ち、接種量は２．００Ｅ＋０７ＣＦＵ／マウスであった。感染後の２ｈ及び２４ｈ目に、対照群マウスから肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。
２１匹のＣＤ－１雌マウスを３匹／ケージで７ケージに分けた。４日目に免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１５０ｍｐｋ）を腹腔内注射した。
１日目に、７ケージのマウスに再度免疫抑制剤であるシクロホスファミド（１００ｍｐｋ）を腹腔内注射した。ＭＨＡプレートで菌株Ｋｐｎ ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５（肺炎クレブシエラ菌ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５）を蘇生させた。蘇生したコロニーを選択して生理食塩水に溶解し、濃度４．００Ｅ＋０８ＣＦＵ／ｍＬのＫｐｎ ＡＴＣＣ－ＢＡＡ－１７０５菌液を調製し、マウスの肺部を感染させた。実験マウスの肺部の感染菌液量は５０μＬ／匹であり、即ち、接種量は２．００Ｅ＋０７ＣＦＵ／マウスであった。感染後の２ｈ及び２４ｈ目に、対照群マウスから肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。
【0094】
マウスに対する具体的な投与状況
（１）感染後の２ｈ目：第１ケージのマウスを感染した２ｈ後に、肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの肺組織の菌量を計測し、第３、４ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎを皮下注射し、第５、６ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物１を皮下注射し、第７ケージのマウスに１００ｍｐｋのメロペネムを皮下注射した。
（２）感染後の１０ｈ目：第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎを皮下注射し、第５、６ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物１を皮下注射し、第７ケージのマウスに１００ｍｐｋのメロペネムを皮下注射した。第２～７ケージのマウスを感染させた２４ｈ後に、肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの肺組織の菌量を計測した。実験結果を図２に示す。
結論：図２の結果から明らかなように、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１は肺炎クレブシエラ菌株１７０５肺感染モデルにおいて良好な体内活性を示している。また、化合物１の薬効はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも高く、１０ｍｐｋ用量の化合物１の薬効は３０ｍｐｋ用量のＰｌａｚｏｍｉｃｉｎの薬効に相当する。
（１）感染後の２ｈ目：第１ケージのマウスを感染した２ｈ後に、肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの肺組織の菌量を計測し、第３、４ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎを皮下注射し、第５、６ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物１を皮下注射し、第７ケージのマウスに１００ｍｐｋのメロペネムを皮下注射した。
（２）感染後の１０ｈ目：第３、４ケージのマウスにそれぞれ３０ｍｐｋのＰｌａｚｏｍｉｃｉｎを皮下注射し、第５、６ケージのマウスにそれぞれ用量３０ｍｐｋ及び１０ｍｐｋの化合物１を皮下注射し、第７ケージのマウスに１００ｍｐｋのメロペネムを皮下注射した。第２～７ケージのマウスを感染させた２４ｈ後に、肺組織を取り、５ｍＬ生理食塩水に置き、肺組織を均質化し、段階希釈してプレートに接種した。各マウスに対して２回繰り返した。マウスの肺組織の菌量を計測した。実験結果を図２に示す。
結論：図２の結果から明らかなように、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１は肺炎クレブシエラ菌株１７０５肺感染モデルにおいて良好な体内活性を示している。また、化合物１の薬効はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも高く、１０ｍｐｋ用量の化合物１の薬効は３０ｍｐｋ用量のＰｌａｚｏｍｉｃｉｎの薬効に相当する。
【0095】
実験例6：新型アミノグリコシド系抗生物質製剤の聴覚安全性の研究報告
研究目的
モルモット体内における化合物１及び既存抗生物質ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎの聴覚機能に対する影響を評価し、化合物１の聴覚毒性作用を評価した。
研究目的
モルモット体内における化合物１及び既存抗生物質ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎの聴覚機能に対する影響を評価し、化合物１の聴覚毒性作用を評価した。
【0096】
研究方法
健常成年モルモット（１５０－２５０ｇ）を研究対象とし、８匹／群でランダムに生理食塩水対照群、ゲンタマイシン群、化合物Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群及び化合物１群に分けた。皮下投与により、１４日間連続投与し、投与終了後に以下のように研究した。
１．異なる薬物のモルモット聴覚機能に対する影響を研究するために、それぞれ投与終了後の１４日（２９日、即ち４週）目に動物の複合活動電位（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＡＰ）を記録し、結果を分析し、異なる処理群間の閾値シフト及び振幅、潜伏期間などの指標の変化を比較した。
２．異なる群の動物を処理し、聴覚機能データを採取した後、動物の蝸牛を固定、染色し、片側の蝸牛の基底膜をシート化し、有毛細胞の損失を計測し、蝸牛図を作成し、他側の蝸牛を脱灰した後に冷凍スライスし、らせん神経節の密度を計測し、群間の比較を行った。
健常成年モルモット（１５０－２５０ｇ）を研究対象とし、８匹／群でランダムに生理食塩水対照群、ゲンタマイシン群、化合物Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群及び化合物１群に分けた。皮下投与により、１４日間連続投与し、投与終了後に以下のように研究した。
１．異なる薬物のモルモット聴覚機能に対する影響を研究するために、それぞれ投与終了後の１４日（２９日、即ち４週）目に動物の複合活動電位（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＡＰ）を記録し、結果を分析し、異なる処理群間の閾値シフト及び振幅、潜伏期間などの指標の変化を比較した。
２．異なる群の動物を処理し、聴覚機能データを採取した後、動物の蝸牛を固定、染色し、片側の蝸牛の基底膜をシート化し、有毛細胞の損失を計測し、蝸牛図を作成し、他側の蝸牛を脱灰した後に冷凍スライスし、らせん神経節の密度を計測し、群間の比較を行った。
【0097】
研究結果
１．投与方法及び処理
薬物ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１については、ゲンタマイシンは大連美侖生物技術有限公司から購入され、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１は武漢明康徳新薬開発有限公司から提供された。使用時に新たに調製され、生理食塩水で溶解し、濃度は５０ｍｇ／ｍＬ、注射用量は１００ｍｇ／ｋｇ体重であった。投与方法は皮下注射であり、毎回注射した後に薬液が滲み出たかを確認した。
１．投与方法及び処理
薬物ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１については、ゲンタマイシンは大連美侖生物技術有限公司から購入され、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及び化合物１は武漢明康徳新薬開発有限公司から提供された。使用時に新たに調製され、生理食塩水で溶解し、濃度は５０ｍｇ／ｍＬ、注射用量は１００ｍｇ／ｋｇ体重であった。投与方法は皮下注射であり、毎回注射した後に薬液が滲み出たかを確認した。
【0098】
２．複合活動電位結果（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＡＰ）の分析
各群の動物に短音（Ｃｌｉｃｋ）及び異なる周波数の純音（１ＫＨｚ－３２ｋＨｚ）を聞かせるときの複合活動電位（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＡＰ）を測定して記録した。主に短音及び中高周波数の純音（１６、３２ｋＨｚ）を聞かせるときの振幅及び潜伏期間の変化を比較した。振幅の大きさは有毛細胞及び聴神経の応答能力を反映する。振幅が大きいほど、Ｉ／Ｏ曲線の傾きは大きくなり、応答性は高くなり、機能も優れる。また、蝸牛の頂回転から基底回転までそれぞれ低周波数から高周波数までの音声に対して応答性（即ち、蝸牛の基底膜の周波数対応性）を有し、異なる周波数の機能変化は、蝸牛の頂回転から基底回転までの異なる構造機能の変化に対応する。潜伏期間の長さも有毛細胞及び聴神経応答の機能に関係する。一般的には、蝸牛が損傷すると、閾値が高くなることで潜伏期間が長くなる。さらに、閾値に顕著な変化がない場合、潜伏期間の延長は、聴神経放電の同期生の低下を反映する。言い換えれば、潜伏期間の延長は機能低下を示す。従来のアミノグリコシド系抗生物質の耳毒性は主に高周波数領域に集中する。本発明の研究において、ゲンタマイシン群は従来の結果と一致し、以下の通りである。
化合物１は、実験群の高周波数（３２ｋＨｚ）ＣＡＰ振幅の低下のみを引き起こし、高周波数領域での聴力が損傷したことを示したが、その振幅は依然としてゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群よりも高かった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群の損傷範囲は大きく、１６ｋＨｚから３２ｋＨｚまで損傷があり、かつ３２ｋＨｚでの損傷は化合物１よりも大きかったが、ゲンタマイシン群よりも顕著に小さかった。ゲンタマイシンの実験群に対する損傷は高周波数（３２ｋＨｚ）領域に集中するが、３２ｋＨｚでの閾値シフトは顕著で、損傷が他の２群よりも大きかった（図３～５を参照）。
各群の動物に短音（Ｃｌｉｃｋ）及び異なる周波数の純音（１ＫＨｚ－３２ｋＨｚ）を聞かせるときの複合活動電位（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＡＰ）を測定して記録した。主に短音及び中高周波数の純音（１６、３２ｋＨｚ）を聞かせるときの振幅及び潜伏期間の変化を比較した。振幅の大きさは有毛細胞及び聴神経の応答能力を反映する。振幅が大きいほど、Ｉ／Ｏ曲線の傾きは大きくなり、応答性は高くなり、機能も優れる。また、蝸牛の頂回転から基底回転までそれぞれ低周波数から高周波数までの音声に対して応答性（即ち、蝸牛の基底膜の周波数対応性）を有し、異なる周波数の機能変化は、蝸牛の頂回転から基底回転までの異なる構造機能の変化に対応する。潜伏期間の長さも有毛細胞及び聴神経応答の機能に関係する。一般的には、蝸牛が損傷すると、閾値が高くなることで潜伏期間が長くなる。さらに、閾値に顕著な変化がない場合、潜伏期間の延長は、聴神経放電の同期生の低下を反映する。言い換えれば、潜伏期間の延長は機能低下を示す。従来のアミノグリコシド系抗生物質の耳毒性は主に高周波数領域に集中する。本発明の研究において、ゲンタマイシン群は従来の結果と一致し、以下の通りである。
化合物１は、実験群の高周波数（３２ｋＨｚ）ＣＡＰ振幅の低下のみを引き起こし、高周波数領域での聴力が損傷したことを示したが、その振幅は依然としてゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群よりも高かった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群の損傷範囲は大きく、１６ｋＨｚから３２ｋＨｚまで損傷があり、かつ３２ｋＨｚでの損傷は化合物１よりも大きかったが、ゲンタマイシン群よりも顕著に小さかった。ゲンタマイシンの実験群に対する損傷は高周波数（３２ｋＨｚ）領域に集中するが、３２ｋＨｚでの閾値シフトは顕著で、損傷が他の２群よりも大きかった（図３～５を参照）。
【0099】
１）１６ｋＨｚ振幅の結果から明らかなように、化合物１と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）との間に違いがなく、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群では２５．９％の損傷が発生した。
２）３２ｋＨｚでは、ＣＡＰ振幅の結果は、化合物１、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎがそれぞれ３２ｋＨｚに対して３４．７％、４８．２％及び７４．３％の聴力損傷を引き起こしたことを示し、即ち、化合物１は３２ｋＨｚでの聴力損傷を引き起こしたが、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎによる損傷に比べてそれぞれ１３．５％及び３９．６％低かった。
３）短音（Ｃｌｉｃｋ）ＣＡＰ振幅は、化合物１及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎがいずれも対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と一致し、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎが聴力損傷を引き起こしたことを示している。
２）３２ｋＨｚでは、ＣＡＰ振幅の結果は、化合物１、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎがそれぞれ３２ｋＨｚに対して３４．７％、４８．２％及び７４．３％の聴力損傷を引き起こしたことを示し、即ち、化合物１は３２ｋＨｚでの聴力損傷を引き起こしたが、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎによる損傷に比べてそれぞれ１３．５％及び３９．６％低かった。
３）短音（Ｃｌｉｃｋ）ＣＡＰ振幅は、化合物１及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎがいずれも対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と一致し、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎが聴力損傷を引き起こしたことを示している。
【0100】
具体的なデータは以下の通りである。
１）１６ｋＨｚ ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ）の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝７．８５８，ｐ＜０．００１）。化合物１動物群と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群とは動物聴力に有意差がなかった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群の動物の聴力はＣｔｒｌ群（ｔ＝４．５６６，ｐ＜０．００１）、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（ｔ＝４．０９９，ｐ＜０．００１）及び化合物１群（ｔ＝２．７９９，ｐ＝０．０２１）よりも低かった（＊：ｐ＜０．０５）。９０ｄＢでは各群の応答はいずれも最大であり、この場合、化合物１動物の聴力（３８１．６４６±２０．８９５ｕｖ）はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（２８２．０５８±２２．５６９ｕｖ，ｔ＝２．７９９，ｐ＝０．０２１）よりも顕著に高く、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（３８３．１３０±１９．５４５）群及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（３７３．３２９±１５．３３２ｕｖ）と有意差がなかった。
２）３２ｋＨｚ ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ）の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝１００．６１１，ｐ＜０．００１）。化合物１動物の聴力は対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ｔ＝５．０１９，ｐ＜０．００１）よりも低く、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（ｔ＝３．１２８，ｐ＝０．００２）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（ｔ＝１０．４８４，ｐ＜０．００１）よりも高かった。９０ｄＢでは各群の応答はいずれも最大であり、この場合、化合物１群の動物の聴力（７９．４２０±７．０００ｕｖ）は対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも低く（１２１．６０８±６．５４８ｕｖ，ｔ＝４．４０１，ｐ＜０．００１）、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（３１．２７２±５．１３７ｕｖ，ｔ＝５．５４５，ｐ＜０．００１）及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（６２．９８２±７．５６１ｕｖ，ｔ＝１．５９５，ｐ＝０．１１１）よりも高かった。
３）短音（Ｃｌｉｃｋ）ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ） の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝６．７５１，ｐ＜０．００１）。化合物１動物群の聴力はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（ｔ＝３．４９３，ｐ＝０．００３）よりも顕著に優れ、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群と有意差がなかった。
まとめると、ＣＡＰ振幅結果から分かるように、実験動物の聴覚機能に対する化合物１の損傷はゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも顕著に小さい。
１）１６ｋＨｚ ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ）の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝７．８５８，ｐ＜０．００１）。化合物１動物群と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群とは動物聴力に有意差がなかった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群の動物の聴力はＣｔｒｌ群（ｔ＝４．５６６，ｐ＜０．００１）、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（ｔ＝４．０９９，ｐ＜０．００１）及び化合物１群（ｔ＝２．７９９，ｐ＝０．０２１）よりも低かった（＊：ｐ＜０．０５）。９０ｄＢでは各群の応答はいずれも最大であり、この場合、化合物１動物の聴力（３８１．６４６±２０．８９５ｕｖ）はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（２８２．０５８±２２．５６９ｕｖ，ｔ＝２．７９９，ｐ＝０．０２１）よりも顕著に高く、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（３８３．１３０±１９．５４５）群及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（３７３．３２９±１５．３３２ｕｖ）と有意差がなかった。
２）３２ｋＨｚ ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ）の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝１００．６１１，ｐ＜０．００１）。化合物１動物の聴力は対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ｔ＝５．０１９，ｐ＜０．００１）よりも低く、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（ｔ＝３．１２８，ｐ＝０．００２）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（ｔ＝１０．４８４，ｐ＜０．００１）よりも高かった。９０ｄＢでは各群の応答はいずれも最大であり、この場合、化合物１群の動物の聴力（７９．４２０±７．０００ｕｖ）は対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）よりも低く（１２１．６０８±６．５４８ｕｖ，ｔ＝４．４０１，ｐ＜０．００１）、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ群（３１．２７２±５．１３７ｕｖ，ｔ＝５．５４５，ｐ＜０．００１）及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（６２．９８２±７．５６１ｕｖ，ｔ＝１．５９５，ｐ＝０．１１１）よりも高かった。
３）短音（Ｃｌｉｃｋ）ＣＡＰ振幅：二元配置分散分析（Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ ｍｅｔｈｏｄ） の結果から明らかなように、４群の動物群の間には違いがあった（Ｆ３，５７０＝６．７５１，ｐ＜０．００１）。化合物１動物群の聴力はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群（ｔ＝３．４９３，ｐ＝０．００３）よりも顕著に優れ、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ群と有意差がなかった。
まとめると、ＣＡＰ振幅結果から分かるように、実験動物の聴覚機能に対する化合物１の損傷はゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも顕著に小さい。
【0101】
３．有毛細胞の数の変化
異なる薬物の有毛細胞に対する影響を比較するために、蝸牛の基底膜全体に対して有毛細胞を染色して計測した。結果から分かるように、ゲンタマイシン群は、中高周波数領域（頂回転から６０－１００％離れた部位）において１２－６７．７％の外有毛細胞が喪失し、高周波数がより顕著であった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群は、高周波数（頂回転から７０～１００％離れた部位）において１１．２－２８．１％の外有毛細胞が喪失し、頂回転の開始端（１０－２０％）において１６．７－２４．２％の外有毛細胞が喪失した。これに対し、化合物１群では、外有毛細胞の喪失は、頂回転から始まった低周波数領域（頂回転から－４０％離れた部位）のみに発生し、外有毛細胞の損失率はこの範囲内で約２．５－１１％であり、高周波数領域での外有毛細胞は比較的完全であった（図６Ｂ）。具体的なデータを表４に示す。
化合物１群は内有毛細胞がほぼ損傷することがなく、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びゲンタマイシン群は基底回転の末端に近い部位（頂回転から１００％離れた部位）にそれぞれ３．５±３．０％及び９．３±４．１％の内有毛細胞が喪失した（図６Ａを参照）具体的なデータを表５に示す。
まとめると、化合物１群は、頂回転にのみ僅かな外有毛細胞の喪失があり、他の部分、基底回転では内有毛細胞が比較的完全に保留しており、有毛細胞に対する毒性はゲンタマイシン群及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群よりも顕著に低かった。
異なる薬物の有毛細胞に対する影響を比較するために、蝸牛の基底膜全体に対して有毛細胞を染色して計測した。結果から分かるように、ゲンタマイシン群は、中高周波数領域（頂回転から６０－１００％離れた部位）において１２－６７．７％の外有毛細胞が喪失し、高周波数がより顕著であった。Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群は、高周波数（頂回転から７０～１００％離れた部位）において１１．２－２８．１％の外有毛細胞が喪失し、頂回転の開始端（１０－２０％）において１６．７－２４．２％の外有毛細胞が喪失した。これに対し、化合物１群では、外有毛細胞の喪失は、頂回転から始まった低周波数領域（頂回転から－４０％離れた部位）のみに発生し、外有毛細胞の損失率はこの範囲内で約２．５－１１％であり、高周波数領域での外有毛細胞は比較的完全であった（図６Ｂ）。具体的なデータを表４に示す。
化合物１群は内有毛細胞がほぼ損傷することがなく、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びゲンタマイシン群は基底回転の末端に近い部位（頂回転から１００％離れた部位）にそれぞれ３．５±３．０％及び９．３±４．１％の内有毛細胞が喪失した（図６Ａを参照）具体的なデータを表５に示す。
まとめると、化合物１群は、頂回転にのみ僅かな外有毛細胞の喪失があり、他の部分、基底回転では内有毛細胞が比較的完全に保留しており、有毛細胞に対する毒性はゲンタマイシン群及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群よりも顕著に低かった。
【0102】
４．らせん神経節の変化
モルモットの蝸牛を基底回転から頂回転まで回転（Ｔｕｒｎ）１、回転２、回転３及び回転４に分け、らせんニューロン（Ｓｐｉｒａｌｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ，ＳＧＮ）を冷凍スライス上でＴｕＪ標記染色した後、特定の面積内のＳＧＮの密度を計測し、群間比較を行った。化合物１群の各回転でのＳＧＮ密度は対照群と有意差がなく、即ち、らせん神経節には損傷がない一方、ゲンタマイシン群の各回転のいずれにも顕著な損傷があり、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群では頂回転に近い部位でのＳＧＮ密度が低下したが、ゲンタマイシン群よりも優れた。二元配置分散分析により、群間には有意差がある（Ｆ（３，７４）＝３５．４３，ｐ＜０．０００１）ことが分かった（図７を参照）。具体的なデータを表６に示す。
モルモットの蝸牛を基底回転から頂回転まで回転（Ｔｕｒｎ）１、回転２、回転３及び回転４に分け、らせんニューロン（Ｓｐｉｒａｌｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎ，ＳＧＮ）を冷凍スライス上でＴｕＪ標記染色した後、特定の面積内のＳＧＮの密度を計測し、群間比較を行った。化合物１群の各回転でのＳＧＮ密度は対照群と有意差がなく、即ち、らせん神経節には損傷がない一方、ゲンタマイシン群の各回転のいずれにも顕著な損傷があり、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ群では頂回転に近い部位でのＳＧＮ密度が低下したが、ゲンタマイシン群よりも優れた。二元配置分散分析により、群間には有意差がある（Ｆ（３，７４）＝３５．４３，ｐ＜０．０００１）ことが分かった（図７を参照）。具体的なデータを表６に示す。
【0103】
結論：異なる群に対する複合活動電位分析により、化合物１群は高周波数（３２ｋＨｚ）にのみ聴力損傷が存在し、Ｐｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びゲンタマイシン群よりも優れたことが実証された。有毛細胞及びらせん神経節に対する観察により、頂回転から２．５－１１％離れた部位に外有毛細胞が損傷した以外、化合物１が他の領域の外有毛細胞の顕著な損傷を引き起こさなく、内有毛細胞の数及びらせん神経節の数も影響されされず、ゲンタマイシン及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ群よりも顕著に優れたことが実証された。したがって、化合物１を動物（モルモット）に１４日間連続して皮下投与し、さらに１４日間回復した後の耳毒性はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びゲンタマイシン群よりも低い。上記各結果により、本発明の化合物１の聴覚毒性はＰｌａｚｏｍｉｃｉｎ及びゲンタマイシンよりも低い（優れる）ことが実証された。
【0104】
【表4】
【0105】
【表5】
【0106】
【表6】
【0107】
実験例７：細胞ＨＫ－２に対する本発明の化合物の毒性の実験
細胞の準備
実験の当日に、培養フラスコ内の細胞ＨＫ－２コンフルエンスが８０％－９０％に達したときに、培地を捨てた。ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、３ｍＬのパンクレアチン（Ｔ１５０細胞培養フラスコ）を加えて１～２分間消化した後、直ちに９ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）を加えて消化を停止させた。その後、ピペットにて軽く均一にピペッティングし、単細胞懸濁液を形成した。１０００ｒｐｓで５分間遠心分離した。上清を捨て、新鮮な完全培地を加え、均一にピペッティングした。セルカウンターにより実際の細胞密度を測定し、細胞懸濁液を２．５×１０５細胞／ｍｌに調整した。ピペットにより８０μＬ細胞懸濁液を吸い取り、９６ウェルプレート（黒）内に接種した（２×１０４細胞／ウェル）。次に、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベータに置いて４．５時間インキュベートした。これを細胞プレートとした。
細胞の準備
実験の当日に、培養フラスコ内の細胞ＨＫ－２コンフルエンスが８０％－９０％に達したときに、培地を捨てた。ダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、３ｍＬのパンクレアチン（Ｔ１５０細胞培養フラスコ）を加えて１～２分間消化した後、直ちに９ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）を加えて消化を停止させた。その後、ピペットにて軽く均一にピペッティングし、単細胞懸濁液を形成した。１０００ｒｐｓで５分間遠心分離した。上清を捨て、新鮮な完全培地を加え、均一にピペッティングした。セルカウンターにより実際の細胞密度を測定し、細胞懸濁液を２．５×１０５細胞／ｍｌに調整した。ピペットにより８０μＬ細胞懸濁液を吸い取り、９６ウェルプレート（黒）内に接種した（２×１０４細胞／ウェル）。次に、９６ウェルプレートをＣＯ２インキュベータに置いて４．５時間インキュベートした。これを細胞プレートとした。
【0108】
化合物の調製
ａ．下表に従って化合物母液を調製した。溶媒は完全培地であった。
ｂ．９６－ｖウェルプレート内の第３－１１列に５０μｌの完全培地を加えた。
ｃ．９６－ｖウェルプレートの第２列に７５μｌの被測定化合物（５０ｍｇ／ｍＬ）及び陽性対照を加えた。
ｄ．第２列から２５μｌ化合物を取り出して第３列に加え、ピペットで複数回ピペッティングし、さらに第３列から２５μｌ取り出して第４列に加え、このように第１０列まで３倍段階希釈し、第２列から第１１列の化合物の濃度はそれぞれ５０，１６．６７，５．５６，１．８５，０．６２，０．２１，０．０７，０．０２，０．００８，０ｍｇ／ｍＬであった。
ｅ．ピペットで２０μＬ調製した各濃度の化合物溶液を細胞プレートの対応ウェルに移した。これを試験プレートとした。
ａ．下表に従って化合物母液を調製した。溶媒は完全培地であった。
【表7】
ｃ．９６－ｖウェルプレートの第２列に７５μｌの被測定化合物（５０ｍｇ／ｍＬ）及び陽性対照を加えた。
ｄ．第２列から２５μｌ化合物を取り出して第３列に加え、ピペットで複数回ピペッティングし、さらに第３列から２５μｌ取り出して第４列に加え、このように第１０列まで３倍段階希釈し、第２列から第１１列の化合物の濃度はそれぞれ５０，１６．６７，５．５６，１．８５，０．６２，０．２１，０．０７，０．０２，０．００８，０ｍｇ／ｍＬであった。
ｅ．ピペットで２０μＬ調製した各濃度の化合物溶液を細胞プレートの対応ウェルに移した。これを試験プレートとした。
【0109】
試験プレートでの培養
全てのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて４３時間培養した。
全てのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて４３時間培養した。
【0110】
読み取り
所定時間培養した後、試験プレート内に１０μｌアラマーブルーを加え、直ちに試験プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて３時間培養した。次にマイクロプレートリーダーにより試験プレートの各ウェルの蛍光値（波長Ｅｘ ５４０ｎｍ／Ｅｍ ５８５ｎｍ）を読み取った。Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより曲線をシミュレートしてＣＣ５０値を算出した。
所定時間培養した後、試験プレート内に１０μｌアラマーブルーを加え、直ちに試験プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに置いて３時間培養した。次にマイクロプレートリーダーにより試験プレートの各ウェルの蛍光値（波長Ｅｘ ５４０ｎｍ／Ｅｍ ５８５ｎｍ）を読み取った。Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより曲線をシミュレートしてＣＣ５０値を算出した。
【0111】
研究結果
【表8】
【0112】
結論：ＨＫ－２細胞に対する化合物１及びＰｌａｚｏｍｉｃｉｎの毒性は、ネチルマイシン及びアミカシンよりも顕著に低く、毒性回帰曲線及びソフトウェアにより（図８～１１）ＨＫ－２細胞に対する化合物１の毒性がＰｌａｚｏｍｉｃｉｎよりも低いことが予測された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
