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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-24
(45)【発行日】2023-04-03
(54)【発明の名称】細胞膜透過性ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20230327BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230327BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230327BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230327BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20230327BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20230327BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20230327BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20230327BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230327BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230327BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20230327BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C07K7/06
C07K19/00
C12N15/62 Z
C07K14/47
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12P21/02 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019559615
(86)(22)【出願日】2018-12-10
(86)【国際出願番号】 JP2018045228
(87)【国際公開番号】W WO2019117057
(87)【国際公開日】2019-06-20
【審査請求日】2021-10-25
(31)【優先権主張番号】P 2017236660
(32)【優先日】2017-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000006677
【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】510192802
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立国際医療研究センター
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100181168
【弁理士】
【氏名又は名称】丸山 智裕
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 英樹
(72)【発明者】
【氏名】石坂 幸人
(72)【発明者】
【氏名】石黒 亮
(72)【発明者】
【氏名】高品 智記
(72)【発明者】
【氏名】山本 卓
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 哲史
【審査官】中村 俊之
(56)【参考文献】
【文献】特許第７０２６９０６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１４－５０８７６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００８／１０８５０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】RAMSEY, J. D. and FLYNN, N. H，Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells，Pharmacology & Therapeutics，2015年，vol. 154，no. 78-86
【文献】ペプチドの設計 | Thermo Fisher Scientific，2017年07月25日，［２０１９年１月３１日検索］、インターネット＜URL：https://web.archive.org/web/20170725064123/https:
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１）～（３）からなる群から選択されるペプチド：（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項2】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。【請求項3】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。【請求項4】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。【請求項5】
請求項１に記載のペプチド及び機能性分子を含む複合体。【請求項6】
請求項１に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。【請求項7】
請求項５に記載の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞膜透過性ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞膜透過性ペプチドは細胞膜を透過して細胞内部に移動する機能を持つペプチドである。細胞膜透過性ペプチドとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のＴＡＴをはじめ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｏｌｉｇｏａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅなど、多数の配列が知られている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１５、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．７８－８６）。また、ＨＩＶ－１のＶｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ蛋白質に含まれるペプチド配列から見出された細胞膜透過性ペプチドＲＩＦＩＨＦＲＩＧＣが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】国際公開第２００８／１０８５０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の課題は、細胞内への移行性を有する新規細胞膜透過性ペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、細胞膜透過性ペプチドの作製において相当の創意検討を重ねた結果、新規細胞膜透過性ペプチドを作製し（実施例１及び２）、当該細胞膜透過性ペプチドが細胞内への移行性を有すること（実施例３及び４）を見出した。これらの結果、前記細胞膜透過性ペプチドを提供し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］以下の（１）～（３）からなる群から選択されるペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［３］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［４］配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［５］［１］に記載のペプチド及び機能性分子を含む複合体。
［６］［１］に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［７］［５］に記載の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１］以下の（１）～（３）からなる群から選択されるペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［３］配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［４］配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる、［１］に記載のペプチド。
［５］［１］に記載のペプチド及び機能性分子を含む複合体。
［６］［１］に記載のペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［７］［５］に記載の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0007】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、任意の蛋白質を細胞内に透過するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の細胞内への取り込み能を示す。縦軸は全細胞の内のＥＧＦＰによる発光が見られた細胞数の比率を示す。コントロールは溶媒のみを添加した細胞群を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。
【図2】ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－ＡｃｔｉｖａｔｏｒによるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現上昇効果の比較を示す。縦軸はコントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各被験試料によるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。
【図3】ＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びＴＡＬＥ－ＶＰＲによるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現上昇効果の比較を示す。縦軸はコントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各被験試料によるヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を示す。誤差線は重複する３被験試料の測定値の標準偏差を示す。
【図4A】Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＦＰ－ＦＳＥＣ）分析の結果を示す。グラフ縦軸は蛍光強度により測定されたＧＦＰ融合蛋白質量を、横軸は緩衝液の排除体積を示す。（１）ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、（２）ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、（３）ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、（４）ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの各試料の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下に、本発明について詳述する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１７年１２月１１日に出願された日本国特許出願（特願２０１７－２３６６６０号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【0010】
１．本発明の細胞膜透過性ペプチド
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、以下の（１）～（３）からなる群より選択されるペプチドである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、以下の（１）～（３）からなる群より選択されるペプチドである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【0011】
本明細書における「細胞膜透過性ペプチド」とは、細胞膜を透過する機能を有するペプチドを意味する。細胞膜を透過するか否かは、公知の細胞膜透過評価系を用いて確認することができる。当該評価系としては、例えば、高感度緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）及び被験ペプチドを含む複合体を用いた細胞内標識蛋白質検出系、並びに、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）結合ポリペプチド、転写調節因子及び被験ペプチドを含む複合体を用いた遺伝子発現評価系が挙げられる。ＥＧＦＰ及び被験ペプチドを含む複合体を用いる場合、例えば、細胞内に取り込まれたＥＧＦＰの発光を指標に被験ペプチドの細胞膜透過性を評価できる。ＤＮＡ結合ポリペプチド、転写調節因子及び被験ペプチドを含む複合体を用いた遺伝子発現評価系では標的遺伝子の発現量を指標に被験ペプチドの細胞膜透過性を評価できる。具体的な評価方法としては、例えば後記実施例３及び４に記載された方法を用いることができる。
【0012】
２．本発明の複合体
本発明の複合体は、本発明の細胞膜透過性ペプチド及び機能性分子を含む複合体である。
本発明の複合体は、本発明の細胞膜透過性ペプチド及び機能性分子を含む複合体である。
【0013】
本発明の細胞膜透過性ペプチドと組み合わせることができる機能性分子は幅広く存在し、機能性分子が持つ機能を示す限り、本発明の複合体に含まれる機能性分子は特に限定されず、例えば、低分子化合物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、糖質及びその他の高分子化合物、磁性粒子、リポソームなどの生理活性物質が挙げられる。
【0014】
本発明の複合体に含まれるポリヌクレオチドとしては、例えば、任意の長さのＤＮＡ又はリボ核酸（ＲＮＡ、アプタマーを含む）を使用することができる。当該使用するＤＮＡ又はリボ核酸は、天然又は人工物であってもよい。ポリヌクレオチドは１本鎖又は２本鎖であってもよい。複数のポリヌクレオチドを使用することもできる。
【0015】
ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、生理活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを使用することができる。生理活性を示すポリペプチドとして、例えば、ホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、ワクチン用抗原ペプチド、受容体、抗体、転写因子、構造蛋白質、融合ポリペプチドなどが挙げられる。
【0016】
ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、例えば、ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｖｉｒａｌ ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられる。
【0017】
本発明の複合体に含まれるポリペプチドとしては、例えば、ホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、ワクチン用抗原ペプチド、受容体、抗体、転写因子、構造蛋白質、及び融合ポリペプチドなどが挙げられる。
【0018】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる融合ポリペプチドとして、例えば、ゲノム編集技術として使用される融合ポリペプチド（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.、１９９６、Ｖｏｌ．９３、ｐ．１１５６－１１６０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１０、Ｖｏｌ．１８６、ｐ．７５７－７６１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８１９－８２３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３、Ｖｏｌ．３３９、ｐ．８２３－８２６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.、２０１６、Ｖｏｌ．１４６９、ｐ．１４７－１５５、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３、Ｖｏｌ．１０、ｐ．９７７－９７９）が挙げられる。別の実施形態において、本発明の複合体は当該融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。
【0019】
本発明の複合体に含まれる細胞膜透過性ペプチド及び機能性分子は、直接結合しても良く、又は、リンカーを介して間接的に結合しても良い。
【0020】
本発明の複合体が細胞膜を透過し、かつ、機能性分子の機能を示す限り、細胞膜透過性ペプチド及び機能分子を結合するために使用されるリンカーは限定されない。
【0021】
本発明の複合体の大きさ（直径、長さ等）は、細胞膜を透過することができる大きさである限り限定されるものではないが、例えば、約０．１～５００ｎｍの範囲である。また、本発明の複合体に含まれる機能性分子の長さとしては、機能性分子が例えばＲＮＡである場合は約５０００ヌクレオチド以下、ＤＮＡである場合は約２万ベースペア（以下ｂｐと略記する）以下、ポリペプチドである場合は約３０００アミノ酸以下の長さが挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
３．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【0023】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（１）～（３）からなる群より選択される、ポリヌクレオチドである：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【0024】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（１）～（３）からなる群より選択される、ポリヌクレオチドである：
（１）配列番号３３の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列番号３４の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（３）配列番号３５の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１）配列番号３３の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）配列番号３４の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（３）配列番号３５の塩基番号２７４から３０３までの塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【0025】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の細胞膜透過性ペプチド又は本発明の複合体のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該技術分野で公知の遺伝子合成方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８２、Ｖｏｌ．２５７、ｐ.９２２６－９２２９）を利用して合成できる。
【0026】
４．本発明の発現ベクター
本発明の発現ベクターには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
本発明の発現ベクターには、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【0027】
１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、以下の（１）～（３）からなる群より選択される、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0028】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／若しくは原核細胞（例えば、エシェリキア属菌）の各種の宿主細胞、又は無細胞蛋白質合成に用いられる細胞抽出液（以下、無細胞蛋白質合成液という。例えば、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、及び昆虫細胞抽出液が挙げられる）中において、本発明の細胞膜透過性ペプチド又は本発明の複合体をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ（セルフリーサイエンス）、ｐＥＴ２０ｂ（＋）（ノバジェン）、ｐＣｏｌｄ ｖｅｃｔｏｒ－Ｉ（タカラバイオ）を使用することができる。
【0029】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）、Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＥＦ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸を含む反応液中で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、上述のＴ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。
【0030】
宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、若しくは酵母を用いる場合、又は、無細胞蛋白質合成液を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞としてエシェリキア属菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【0031】
５．本発明の形質転換された宿主細胞
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
本発明の形質転換された宿主細胞には、本発明の細胞膜透過性ペプチドをコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の複合体をコードする塩基配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
【0032】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（１）～（３）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【0033】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、蛋白質を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞等の動物細胞及びエシェリキア属菌を使用することができる。
【0034】
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、電気穿孔法等を用いることができる。
【0035】
６．本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産する方法
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、当該技術分野で公知のペプチド合成法、又は、公知の遺伝子工学的手法により生産することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法（Ｎａｔｕｒｅ、２０１１、Ｖｏｌ．４８０、ｐ．４７１－４７９）が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ.、１９８７、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．２２１－５３３及びＰｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ａ Ｍａｔｈ．Ｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、２００９、Ｖｏｌ．３６７、ｐ．１７０５－１７２６などに示されるような方法を利用することができる。
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、当該技術分野で公知のペプチド合成法、又は、公知の遺伝子工学的手法により生産することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法（Ｎａｔｕｒｅ、２０１１、Ｖｏｌ．４８０、ｐ．４７１－４７９）が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ.、１９８７、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．２２１－５３３及びＰｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ａ Ｍａｔｈ．Ｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、２００９、Ｖｏｌ．３６７、ｐ．１７０５－１７２６などに示されるような方法を利用することができる。
【0036】
本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産する方法は、本発明の宿主細胞を培養し、細胞膜透過性ペプチドを発現させる工程、又は、本発明の発現ベクターを用いて合成したｍＲＮＡを無細胞蛋白質合成液と反応させて、細胞膜透過性ペプチドを発現させる工程を含んでも良い。また、本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、細胞膜透過性ペプチドを発現させる工程、又は、本発明の発現ベクターを用いて合成したｍＲＮＡを無細胞蛋白質合成液と反応させて細胞膜透過性ペプチドを発現させる工程に加えて、発現させた当該細胞膜透過性ペプチドを回収、好ましくは単離、精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された細胞膜透過性ペプチドは、各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【0037】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞を培養することにより、本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産することができる。
【0038】
本発明の細胞膜透過性ペプチドには、本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産する方法で生産された細胞膜透過性ペプチドも含まれる。
【0039】
７．本発明の複合体を生産する方法
本発明の複合体は、当該分野で公知の結合方法を用いて、本発明の細胞膜透過性ペプチドと機能性分子とを結合させることで、当業者により容易に生産することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００９、Ｖｏｌ．３７、ｐ.２５７４－２５８３）。
本発明の複合体は、当該分野で公知の結合方法を用いて、本発明の細胞膜透過性ペプチドと機能性分子とを結合させることで、当業者により容易に生産することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００９、Ｖｏｌ．３７、ｐ.２５７４－２５８３）。
【0040】
本発明の複合体を生産する方法は、機能性分子の末端又は内部に存在する官能基を利用して、化学的な結合方法で、直接的に又はリンカーを介して間接的に細胞膜透過性ペプチドに結合させる工程を含む。その際の化学的な結合様式としては、例えば、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、Ｓ－Ｓ結合などの共有結合のほかに、イオン結合、静電的結合、分子間力結合、水素結合などの非共有結合が挙げられる。
【0041】
化学的な結合方法で結合する場合、リンカーとしては、例えば、両端に反応性基を有し、２分子を連結させうる構造を有する限り、特に限定されるものではない。該反応性基としては、例えば、マレイミド基、Ｎ－コハク酸イミドエステル基、エポキシ基、アビジン基などが挙げられる。
【0042】
１つの実施形態において、機能性分子がＤＮＡ又はＲＮＡの場合、例えばジスルフィド結合を利用して本発明の細胞膜透過性ペプチドとＤＮＡ又はＲＮＡを結合することができる（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４、Ｖｏｌ．５５８、ｐ．６３－６８）。また、１つの実施形態において、プロタミンなどの核酸結合性ペプチドを介して、本発明の細胞膜透過性ペプチドとＤＮＡ又はＲＮＡを結合することができる（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ、２０１７、Ｖｏｌ．７、ｐ.２４９５－２５０８）。
【0043】
１つの実施形態において、機能性分子が抗体の場合、例えば、マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド（ＭＢＳ）法（ＮａｎｏＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２００５、Ｖｏｌ．２、ｐ.８８）、カルボジイミドを用いた架橋法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０１２、Ｖｏｌ．５０２、ｐ．１０２）、又は共役法（Ｗｏｎｇ Ｓ、 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ、 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３）などの公知の手法を用いて、本発明の細胞膜透過性ペプチドと抗体とを結合することができる。
【0044】
また、本発明の複合体は、本発明の細胞膜透過性ペプチド及び機能性分子をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドから、当該分野で公知の遺伝子工学的手法を用いて、当業者により容易に生産することができる（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００６、Ｖｏｌ．７２、p．２１１、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１６、Ｖｏｌ．１００、ｐ．５７１９－５７２８）。
【0045】
遺伝子工学的手法を用いる場合、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、複合体を発現させる工程、又は、本発明の発現ベクターを用いて合成したｍＲＮＡを無細胞蛋白質合成液と反応させて、複合体を発現させる工程を含む。本発明の複合体を生産する方法はまた、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、複合体を発現させる工程、又は、本発明の発現ベクターを用いて合成したｍＲＮＡを無細胞蛋白質合成液と反応させて、複合体を発現させる工程に加えて、発現させた当該複合体を回収、好ましくは単離、精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、＜６．本発明の細胞膜透過性ペプチドを生産する方法＞に記載の方法を使用することができる。
【0046】
本発明の複合体には、本発明の複合体を生産する方法で生産された複合体も含まれる。
【0047】
８．本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物には、本発明の複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
本発明の医薬組成物には、本発明の複合体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【0048】
製剤化における本発明の複合体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、又は機能性分子により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【0049】
本発明の医薬組成物は、本発明の複合体に含まれる機能性分子の機能に応じて、様々な疾患の予防及び／又は治療のために使用することができる。例えば、複合体に含まれる機能性分子がその疾患に対する治療用の化合物、ポリヌクレオチド又はポリペプチドである場合、本発明の医薬組成物はその疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【0050】
本発明において、治療又は予防の対象となる疾患は、本発明の複合体に含まれる機能性分子の機能に応じて選択できるため、特に限定されるものではないが、例えば、癌、免疫疾患、神経系の疾患、内分泌系の疾患、心血管系の疾患などが挙げられる。
【0051】
本発明には、本発明の複合体を含む、疾患の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の複合体の治療有効量を患者に投与する工程を包含する、疾患を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、疾患の予防又は治療に使用するための、本発明の複合体が含まれる。また、本発明には、疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造における、本発明の複合体の使用が含まれる。
【0052】
本発明において、患者は哺乳動物である限り限定されるものではなく、例えば、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ヒト等が挙げられる。
【0053】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。これらは例示を目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
［実施例］
［実施例］
【0054】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。
【0055】
以下の実施例において、各種細胞膜透過性ペプチドを「ＣＰＰ」（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ）と総称することがある。また、以下の実施例において、「ＮＴＰ」とは、アミノ酸配列ＲＩＦＩＨＦＲＩＧＣ（配列番号４。国際公開第２００８／１０８５０５号）を有する細胞膜透過性ペプチドを意味し、ＣＰＰの一種である。以下の実施例では、ＮＴＰの８番目のアミノ酸残基ＩをＱに置換したペプチドを「ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）」又は「ＮＴＰ８Ｑ」と称し、ＮＴＰのＮ末端から１０番目のアミノ酸残基ＣをＱに置換したペプチドを「ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）」又は「ＮＴＰ１０Ｑ」と称し、ＮＴＰのＮ末端から８番目及び１０番目のアミノ酸残基をいずれもＱに置換したペプチドを「ＮＴＰ（ＩＣＱ２）」と称する。
【実施例1】
【0056】
ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の作製
各種細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）及びＥＧＦＰを含む蛋白質（ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質と称する）を以下の方法で作製した。
各種細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）及びＥＧＦＰを含む蛋白質（ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質と称する）を以下の方法で作製した。
【0057】
（１）ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質をコードする発現プラスミドの作製
Ｎ末端から順にＮＴＰ及びＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）を融合したＥＧＦＰを含むポリペプチド（ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する。配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号７）に対して、５’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイト及び開始コドン配列を、３’末端にストップコドン配列及び制限酵素ＮｏｔＩサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチド（配列番号６）を取得した。上記ポリヌクレオチドをＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ（タカラバイオ）で制限酵素処理し、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳプラスミド（セルフリーサイエンス）のマルチクローニングサイト上にあるＫｐｎＩ及びＮｏｔＩサイトの間に挿入した。これにより得られた発現プラスミドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する。当該発現プラスミドを既存のアガロース電気泳動法及びシークエンス解析を行うことにより、所望のＤＮＡコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
Ｎ末端から順にＮＴＰ及びＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）を融合したＥＧＦＰを含むポリペプチド（ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する。配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号７）に対して、５’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイト及び開始コドン配列を、３’末端にストップコドン配列及び制限酵素ＮｏｔＩサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチド（配列番号６）を取得した。上記ポリヌクレオチドをＫｐｎＩ及びＮｏｔＩ（タカラバイオ）で制限酵素処理し、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳプラスミド（セルフリーサイエンス）のマルチクローニングサイト上にあるＫｐｎＩ及びＮｏｔＩサイトの間に挿入した。これにより得られた発現プラスミドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する。当該発現プラスミドを既存のアガロース電気泳動法及びシークエンス解析を行うことにより、所望のＤＮＡコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
【0058】
次にｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを鋳型として、配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲ（環状ポリヌクレオチドの一領域から外側に向けてプライマーを設計し、環状化したポリヌクレオチド全体を増幅するＰＣＲ法）を行った。これにより、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰのＮＴＰの８番目のアミノ酸残基ＩをＱに置換されたポリペプチド（ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを合成した。これをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（タカラバイオ）により環状化することで、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを作製した。
【0059】
同様に、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを鋳型として、配列番号１０及び１１に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲを行った。これにより、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰのＮＴＰの１０番目のアミノ酸残基ＣをＱに置換されたポリペプチド（ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを作製した。これをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔにより環状化することで、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを作製した。
【0060】
さらに、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを鋳型として、配列番号１２及び１３に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲを行った。これにより、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰのＮＴＰの８番目及び１０番目のアミノ酸残基がともにＱに置換されたポリペプチド（ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと称する）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを作製した。これをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔにより環状化することで、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰを作製した。これら発現プラスミドはいずれも既存のアガロース電気泳動法及びシークエンシングを行うことにより、所望のＤＮＡコンストラクトが得られていることを確認した。
【0061】
（２）ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の作製
（１）で作製した４種類の発現プラスミド（ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ）を鋳型として、ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質を以下の方法で作製し、精製した。
（１）で作製した４種類の発現プラスミド（ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ）を鋳型として、ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質を以下の方法で作製し、精製した。
【0062】
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス）を用いて、（１）で作製した４つの発現プラスミド３μｇを用いて反応液量０．２９ｍＬで各蛋白質を作製した。ここで作製した蛋白質の一部は実施例５で使用した。作製後、反応液量に対して０．１％のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）（シグマ）を添加した。さらに、リン酸緩衝生理食塩水で飽和したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケア）を１００μＬ加えて４℃で２時間振盪した。遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを回収し、氷冷した０．１％のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）を含むリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離する作業を２回繰り返した。回収したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを分離した。
【0063】
次に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質を抽出するために、以下の操作を行った。すなわち、３０ｍＭの還元型グルタチオン（和光）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０－９．０）８０μＬを上述のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した。数分おきにタッピングしながら室温で３０分間静置した後、遠心分離により上清を回収した。同じ作業を２回繰り返した。上清を回収することにより、各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質を取得した。回収した上清にグリセリン（ナカライ）を終濃度２０％で添加して氷上で保存した。この上清中に含まれる各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法とクマシーブリリアントブルー染色法を用いて、並行して泳動したＢＳＡ（シグマ ｆｒａｃｔｉｏｎＶ）との比較から算定した。
【実施例2】
【0064】
ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒの作製
ＣＰＰ、ヒトＴＥＲＴ遺伝子のエンハンサーに特異的に結合するように設計された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド（ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒと称する）を以下の方法で作製した。なお陰性対照として、ＴＡＬＥ及び転写活性化因子を含み、かつ、ＣＰＰを含まない融合ポリペプチド（以下、ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒとも称する）を作製した。
ＣＰＰ、ヒトＴＥＲＴ遺伝子のエンハンサーに特異的に結合するように設計された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及び転写活性化因子を含む融合ポリペプチド（ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒと称する）を以下の方法で作製した。なお陰性対照として、ＴＡＬＥ及び転写活性化因子を含み、かつ、ＣＰＰを含まない融合ポリペプチド（以下、ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒとも称する）を作製した。
【0065】
（１）発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶの作製
発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳのマルチクローニングサイトにＧＳＴをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１５）、ＮＴＰをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１４）、ＴＥＶプロテアーゼの標的ペプチド（以下ＴＥＶと表記する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１６）を５’側から順に挿入した。
発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳのマルチクローニングサイトにＧＳＴをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１５）、ＮＴＰをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１４）、ＴＥＶプロテアーゼの標的ペプチド（以下ＴＥＶと表記する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１６）を５’側から順に挿入した。
【0066】
具体的には、配列番号１５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＶサイトを、３’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。ＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩを用いて発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳに上記ポリヌクレオチドを挿入することにより、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴを作製した。次に、５’末端側から順に制限酵素ＢａｍＨＩサイト配列、ＮＴＰをコードする塩基配列（配列番号１４）、ＴＥＶをコードする塩基配列（配列番号１６）、制限酵素ＸｈｏＩサイト配列、制限酵素ＳｇｆＩサイト配列、制限酵素ＰｍｅＩサイト配列、制限酵素ＮｏｔＩサイト配列、及び制限酵素ＳａｌＩサイト配列を含むポリヌクレオチド（但し、ＸｈｏＩサイトとＳｇｆＩサイトの間にはコードするアミノ酸配列のフレームを合わせるためにシトシンを挿入した）を作製した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いて、前記ポリヌクレオチドを発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴに挿入した。その後、配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーを用いてインバースＰＣＲを行い、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶを作製した。
【0067】
（２）プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖの作製
配列番号１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＡＬＥの一部をコードする塩基配列及びＶＰ６４（配列番号２１）をコードする塩基配列を含む。ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４と称する）を、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶの、ＴＥＶをコードする塩基配列の直後にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔにより組み込むことで、プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖを得た。ＶＰ６４のＣ末端にバリンが付加されているため末尾にＶを付けた名称とした。
配列番号１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＴＡＬＥの一部をコードする塩基配列及びＶＰ６４（配列番号２１）をコードする塩基配列を含む。ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４と称する）を、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶの、ＴＥＶをコードする塩基配列の直後にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔにより組み込むことで、プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖを得た。ＶＰ６４のＣ末端にバリンが付加されているため末尾にＶを付けた名称とした。
【0068】
（３）ヒトＴＥＲＴ遺伝子を標的とするＴＡＬＥの作製
テロメラーゼのサブユニットであるヒトＴＥＲＴ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２）の周辺配列を公知のデータベースであるＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒで検索した。エンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から下流約４万ｂｐの遺伝子領域から、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２の塩基番号４９４４４～４９４６１までの塩基配列（配列番号２０に示される塩基配列）をＴＡＬＥの標的塩基配列として選択した。公知の方法（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｌａｂ）Ｖｅｒ．１．０ ［２０１７年１月２６日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｍｓ／ｆｉｌｅｓ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ＿Ｇａｔｅ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ＞）により、配列番号２０に示される塩基配列に特異的に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号２２の塩基番号４２９～２０６４までの塩基配列を含むポリヌクレオチド）を作製した。そして、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（２）で作製したプラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖに含まれる配列番号１９の塩基番号４３５～８８９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを、上述の配列番号２２の塩基番号４２９～２０６４までの塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。これにより、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド（ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ－１とも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２２に示される塩基配列からなる）を含むプラスミドを取得した。なお、配列番号２３のアミノ酸番号７～７８４までのアミノ酸配列は、配列番号２０に示される塩基配列に結合するように設計された、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分を含むポリペプチド部分である。当該プラスミドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖと称する。
テロメラーゼのサブユニットであるヒトＴＥＲＴ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２）の周辺配列を公知のデータベースであるＥｎｓｅｍｂｌ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒで検索した。エンハンサーとして作用することが予想される当該遺伝子の転写開始点から下流約４万ｂｐの遺伝子領域から、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００７６９９．２の塩基番号４９４４４～４９４６１までの塩基配列（配列番号２０に示される塩基配列）をＴＡＬＥの標的塩基配列として選択した。公知の方法（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｇａｔｅ ＴＡＬＥＮ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｌａｂ）Ｖｅｒ．１．０ ［２０１７年１月２６日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｍｓ／ｆｉｌｅｓ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ＿Ｇａｔｅ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ＞）により、配列番号２０に示される塩基配列に特異的に結合するように設計されたＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号２２の塩基番号４２９～２０６４までの塩基配列を含むポリヌクレオチド）を作製した。そして、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、（２）で作製したプラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖに含まれる配列番号１９の塩基番号４３５～８８９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドを、上述の配列番号２２の塩基番号４２９～２０６４までの塩基配列からなるポリヌクレオチドに置換した。これにより、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるＤＮＡ結合ポリペプチド（ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ－１とも称する）をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２２に示される塩基配列からなる）を含むプラスミドを取得した。なお、配列番号２３のアミノ酸番号７～７８４までのアミノ酸配列は、配列番号２０に示される塩基配列に結合するように設計された、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合リピート部分及びチミン結合部分を含むポリペプチド部分である。当該プラスミドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖと称する。
【0069】
（４）ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒをコードする発現プラスミドの作製
（３）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(タカラバイオ)を用いて、配列番号２４及び２５に示される塩基配列からなるプライマーを使用したＰＣＲ反応を行った。これにより、ＴＡＬＥ及びＶＰ６４をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５’末端側にＳｇｆＩサイト配列が、３’末端側にＮｏｔＩサイト配列がそれぞれ付加されたポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをＴＡＬＥ-ＶＰ６４と称する。このＴＡＬＥ-ＶＰ６４をＳｇｆＩ及びＮｏｔＩで切断し、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶの制限酵素サイトＳｇｆＩ及びＮｏｔＩの間に挿入し、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４を作製した。
（３）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４Ｖを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(タカラバイオ)を用いて、配列番号２４及び２５に示される塩基配列からなるプライマーを使用したＰＣＲ反応を行った。これにより、ＴＡＬＥ及びＶＰ６４をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの５’末端側にＳｇｆＩサイト配列が、３’末端側にＮｏｔＩサイト配列がそれぞれ付加されたポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをＴＡＬＥ-ＶＰ６４と称する。このＴＡＬＥ-ＶＰ６４をＳｇｆＩ及びＮｏｔＩで切断し、（１）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶの制限酵素サイトＳｇｆＩ及びＮｏｔＩの間に挿入し、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４を作製した。
【0070】
ＳＰ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、配列番号２６及び２７に示される塩基配列からなるプライマーを使用したＰＣＲ反応を行った。これにより、ＶＰＲ（配列番号２８）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号２９）を、３’末端側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号３０）をそれぞれ付加した。当該ポリヌクレオチドをＶＰＲ－ＰＣＲと称する。
【0071】
次に、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４を鋳型として、配列番号３１及び３２に示される塩基配列からなるプライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。これにより、ＶＰ６４をコードする塩基配列を除去し、かつ、３’側にＣＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣ（配列番号２９）を、５‘側にＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣ（配列番号３０）をそれぞれ付加したポリヌクレオチドを作製した。当該ポリヌクレオチドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＰＣＲと称する。
【0072】
ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＰＣＲ及びＶＰＲ－ＰＣＲを１対１０のモル比でＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを用いて連結させた。これにより、転写活性化因子ＶＰＲをコードする発現プラスミドを作製した。当該発現プラスミドをｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲと称する。当該発現プラスミドを既存のアガロース電気泳動法及びシークエンシングを行うことにより、所望のコンストラクトがクローニングされていることを確認した。
【0073】
次に、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲをＡｓｉＳＩ（ニューイングランドバイオラボ）及びＳｗａＩ（タカラバイオ）で制限酵素処理した。
【0074】
配列番号３３、３４、及び３５にそれぞれ示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成し、それぞれＡｓｉＳＩ及びＳｗａＩで制限酵素処理した。アガロース電気泳動し、約３４０塩基のポリヌクレオチド断片を切り出し、ＦａｓｔＧｅｎｅゲル／ＰＣＲ抽出キット（日本ジェネテクス、ＦＧ９１２０２）を用いて精製した。当該ポリヌクレオチド断片をＡｓｉＳＩ及びＳｗａＩで切断した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲにＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）でそれぞれ連結した。連結して得られたプラスミドを熱処理でＳｔｂｌコンピテントセル（ニューイングランドバイオラボ）に導入し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（シグマ）入りＬＢ培地寒天プレート（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ（ベクトンディッキンソン）、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ベクトンディッキンソン）、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（和光）を含有する水溶液及び１．５％アガロース（和光）からなる）（以下、ＬＡプレートと称する）にて、３０℃で一晩培養した。得られたコロニーからプラスミドを精製し、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲのＮＴＰをコードするポリヌクレオチド領域が、配列番号１、２、及び３をコードするポリヌクレオチドにそれぞれ置換されたｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを得た。シークエンス解析を行うことで、上記コンストラクトが正しく作製されていることを確認した。
【0075】
（５）ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒの作製
（４）で作製した各種ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒをコードする発現プラスミド（ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ）を鋳型として、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＫｉｔによりＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを以下の方法で作製し、精製した。
（４）で作製した各種ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒをコードする発現プラスミド（ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ）を鋳型として、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＫｉｔによりＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを以下の方法で作製し、精製した。
【0076】
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、（４）で作製したＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒの発現プラスミド１μｇ（実施例４（２）に用いたＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲの発現プラスミドは３μｇ）を用いて反応液量０．２９ｍＬで各蛋白質を作製した。作製後、反応液量に対して０．１％のＥｍｐｉｇｅｎを添加した。さらに、リン酸緩衝生理食塩水で飽和したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを６０μＬ（実施例４（２）に用いたＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを作製した反応液に対しては１００μL）加えて４℃で２時間振盪した。遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを回収し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離する作業を２回繰り返した。回収したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。再度、遠心分離によりＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを分離した。
【0077】
次に、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを抽出するために、以下の操作を行った。すなわち、３０ｍＭの還元型グルタチオン（和光）を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０－９．０）８０μＬを上述のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加した。室温１分間振盪した後、遠心分離により上清を回収した。同じ作業を２回繰り返した。上清を回収することにより、ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを取得した。回収した上清中に含まれるＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ蛋白質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法とクマシーブリリアントブルー染色法を用いて、並行して泳動したＢＳＡとの比較から算定した。
【0078】
ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＴＡＬＥ－ＶＰＲから取得したポリペプチドを、それぞれ、ＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びＮＴＰＩＣＱ２－ＴＡＬＥ－ＶＰＲと称する。
【0079】
（６）ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒの作製
実施例４の陰性対照として、ＴＡＬＥ及びＶＰＲを含み、かつ、ＣＰＰを含まない融合ポリペプチド（ＴＡＬＥ－ＶＰＲと称する）をコードする発現プラスミドを作製した。
実施例４の陰性対照として、ＴＡＬＥ及びＶＰＲを含み、かつ、ＣＰＰを含まない融合ポリペプチド（ＴＡＬＥ－ＶＰＲと称する）をコードする発現プラスミドを作製した。
【0080】
（４）で作製した発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて配列番号３６及び３７に示される塩基配列からなるプライマーを使用したインバースＰＣＲを行った。これにより、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＮＴＰ－ＴＥＶ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲからＮＴＰ及びＴＥＶをコードする塩基配列部分のみを除去したポリヌクレオチドを合成した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ ｋｉｔを用いてこのポリヌクレオチドをセルフライゲーションさせて発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを作製した。そして、アガロース電気泳動法及びシークエンシングにより所望のコンストラクトが得られていることを確認した。
【0081】
「（５）ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒの作製」に記載された方法と同様の方法により、発現プラスミドｐＥＵ－Ｅ０１－ＧＳＴ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを鋳型として、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＫｉｔによりＴＡＬＥ－ＶＰＲを作製し、精製した。
【実施例3】
【0082】
細胞膜透過性実験（ＥＧＦＰ実験）
ヒト肺がん由来細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）を１０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＲＰＭＩ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に懸濁し、９６ウェル培養プレート（岩城硝子）に０．２×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで播種した。３６時間培養後、各ウェルに実施例１で作製したＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの各蛋白質を最終濃度３０ｎＭになるように３－３．７μＬを添加した。陰性対照としてＥＧＦＰ（フナコシ）を同様に最終濃度３０ｎＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水で濃度を調整して３μL添加した。コントロールはリン酸緩衝生理食塩水のみを３μＬ添加した。２４時間後に各ウェル１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した。上記培地を１００μＬ添加し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－８１００（キーエンス）を用いて、１０倍拡大検鏡下でＧＦＰによる緑色発光が見られる細胞数を計測した。計測方法は検鏡した画像から同一の一定視野における緑色発光細胞数をカウントし、これを同じく計測した視野にある総細胞数で除し、３回計測した平均値を求めることにより、上記融合蛋白質群が細胞内に透過して作用した細胞数を比較した。
ヒト肺がん由来細胞Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）を１０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＲＰＭＩ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に懸濁し、９６ウェル培養プレート（岩城硝子）に０．２×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで播種した。３６時間培養後、各ウェルに実施例１で作製したＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの各蛋白質を最終濃度３０ｎＭになるように３－３．７μＬを添加した。陰性対照としてＥＧＦＰ（フナコシ）を同様に最終濃度３０ｎＭになるようにリン酸緩衝生理食塩水で濃度を調整して３μL添加した。コントロールはリン酸緩衝生理食塩水のみを３μＬ添加した。２４時間後に各ウェル１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した。上記培地を１００μＬ添加し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－８１００（キーエンス）を用いて、１０倍拡大検鏡下でＧＦＰによる緑色発光が見られる細胞数を計測した。計測方法は検鏡した画像から同一の一定視野における緑色発光細胞数をカウントし、これを同じく計測した視野にある総細胞数で除し、３回計測した平均値を求めることにより、上記融合蛋白質群が細胞内に透過して作用した細胞数を比較した。
【0083】
結果を図１に示す。ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは、コントロール及びＥＧＦＰと比較して、ＧＦＰ陽性細胞数が高いことが認められた。以上より、配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは細胞膜透過性を有することが示された。
【実施例4】
【0084】
（１）ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量の測定
実施例２で作製したＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰＩＣＱ２－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ）を微量透析カラム（トミー）でＯＰＴＩＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に対して４℃で３時間透析した。精製後の濃度は５０ｎＭであった。
実施例２で作製したＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰＩＣＱ２－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ、ＮＴＰ８Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びＮＴＰ１０Ｑ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ）を微量透析カラム（トミー）でＯＰＴＩＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に対して４℃で３時間透析した。精製後の濃度は５０ｎＭであった。
【0085】
ヒト臍帯マトリクス由来間葉系幹細胞（プロモセル Ｃ－１２９７１。以下ＵＣ－ＭＳＣと称する）をＭＳＣＧＭ－ＣＤ間葉系幹細胞増殖培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ロンザジャパン、００１９０６３２）で懸濁し、９６ウェル コラーゲンＩ コーティング透明培養プレート（コーニング）へ０．４×１０４細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。ＣＯ２濃度５％、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１２時間静置した後に、２４０ｎＭの各ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを最終濃度がそれぞれ０．２５、１、３、１０及び３０ｎＭになるように添加した。３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した。コントロールとして、ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒを添加しないウェルを作製した。
【0086】
２４時間後の細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量を以下の方法で測定した。上述の培養細胞の各ウェルから培養上清を除去し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄した。その後、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標） Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に付属の溶解液（Ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２４．５μＬ及びＤＮａｓｅＩ ０．５μＬの混合溶液）２５μＬを各ウェルに添加して、細胞と混合した。室温で５分静置した後、上記キットに付属のＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェル２．５μＬ加えて室温で２分静置した。これにより細胞から抽出されたＲＮＡを含む細胞溶解液が得られた。
【0087】
上記細胞溶解液を鋳型として、上記キットに付属の逆転写酵素を用い、そのプロトコールに従ってＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。次いで、下記のプライマー及び上記キットに付属のＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ リアルタイムＰＣＲ解析システム（バイオラッド）でＲｅａｌ Ｔｉｍｅ－ＰＣＲを行い、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量を測定した。 内在性コントロール遺伝子として、ヒトアクチンベータ（ＡＣＴＢ）ｍＲＮＡ量を測定した。ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量をヒトＡＣＴＢ ｍＲＮＡ量で除した値をヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量とした。コントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各群のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を算出した。なお同一試料について各３ウェル実施した。
【0088】
ＴＥＲＴ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及びＴＥＲＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号３８及び３９に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ使用した。また、ＡＣＴＢ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及びＡＣＴＢ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号４０及び４１に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ使用した。
【0089】
図２に示す通り、未添加のＵＣ－ＭＳＣに比較して、ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ添加群は細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量を最大で１９倍に増加させた。
【0090】
（２）ＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ及びＴＡＬＥ－ＶＰＲ添加時の細胞内ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ発現量の測定
ＵＣ－ＭＳＣを２０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地と称する）に懸濁し、９６ウェル透明培養プレート（岩城硝子）へ０．４×１０４細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。ＣＯ２濃度５％、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１２時間静置した。２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地で３００ｎＭに濃度調整をしたＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを、ウェル内終濃度が０．２５ｎＭになるように添加した。また、２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地で３００ｎＭに濃度調整をしたＣＰＰを付加しない陰性コントロールＴＡＬＥ－ＶＰＲを、ウェル内終濃度が０．２５、１、３、１０及び３０ｎＭになるようにそれぞれ添加した。これらを３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した。なおコントロールとして何も添加しないウェルを作製した。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水１００μＬで２回洗浄した後、当該培養プレートを液体窒素で処理して細胞を凍結した。
ＵＣ－ＭＳＣを２０％ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）含有ＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）（以下、２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地と称する）に懸濁し、９６ウェル透明培養プレート（岩城硝子）へ０．４×１０４細胞／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。ＣＯ２濃度５％、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で１２時間静置した。２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地で３００ｎＭに濃度調整をしたＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲを、ウェル内終濃度が０．２５ｎＭになるように添加した。また、２０％ＦＣＳ－ＤＭＥＭ培地で３００ｎＭに濃度調整をしたＣＰＰを付加しない陰性コントロールＴＡＬＥ－ＶＰＲを、ウェル内終濃度が０．２５、１、３、１０及び３０ｎＭになるようにそれぞれ添加した。これらを３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で２４時間静置した。なおコントロールとして何も添加しないウェルを作製した。氷冷したリン酸緩衝生理食塩水１００μＬで２回洗浄した後、当該培養プレートを液体窒素で処理して細胞を凍結した。
【0091】
上述の培養プレートを氷上に静置して融解すると同時に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴＴＭ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に付属の溶解液（Ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２９．７μＬ及びＤＮａｓｅＩ ０．３μＬの混合溶液）３０μＬを各ウェルに添加して細胞と混合した。室温で５分静置した後、上記キットに付属のＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェル３μＬ加えて室温で５分静置した。これにより細胞から抽出されたＲＮＡを含む細胞溶解液が得られた。
【0092】
上記細胞溶解液を鋳型として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィシャーサイエンティフィック）を用いて、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）でＲｅａｌ Ｔｉｍｅ－ＰＣＲを行い、ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量を測定した。内在性コントロールとしてヒトＡＣＴＢ ｍＲＮＡ量を測定した。ヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量をヒトＡＣＴＢ ｍＲＮＡ量で除した値をヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量とした。コントロールのヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を１としたときの、各群のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ相対発現量を算出した。なお同一試料について各３ウェル実施した。
ヒトＴＥＲＴのプライマーのセットとして、ＴＥＲＴ ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ、Ｈｓ００９７２６４８_ｇ１）を、ヒトＡＣＴＢのプライマーのセットはＡＣＴＢ ＶＩＣ（アプライドバイオシステムズ、Ｈｓ９９９９９９０３_ｍ１）を使用した。
図３に示す通り、ＴＡＬＥ－ＶＰＲ添加群はＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ添加の場合と異なり、細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量の顕著な増加は見られなかった。
（１）と（２）の結果、ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒによる細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量の増加は、ＣＰＰによる細胞膜透過性に依存することが分かった。以上より、配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは細胞膜透過性を有することが示された。
ヒトＴＥＲＴのプライマーのセットとして、ＴＥＲＴ ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ、Ｈｓ００９７２６４８_ｇ１）を、ヒトＡＣＴＢのプライマーのセットはＡＣＴＢ ＶＩＣ（アプライドバイオシステムズ、Ｈｓ９９９９９９０３_ｍ１）を使用した。
図３に示す通り、ＴＡＬＥ－ＶＰＲ添加群はＮＴＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰＲ添加の場合と異なり、細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量の顕著な増加は見られなかった。
（１）と（２）の結果、ＣＰＰ－ＴＡＬＥ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒによる細胞内のヒトＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量の増加は、ＣＰＰによる細胞膜透過性に依存することが分かった。以上より、配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは細胞膜透過性を有することが示された。
【0093】
上記実施例３及び４の結果から、本発明のペプチドは、ペプチドに結合した機能性分子を細胞内に送達することができることが示された。また、当該結果から、本発明の複合体は、細胞内に移行（透過）することができることが示された。さらに、本発明のペプチドにより細胞内に移行した機能性分子及び本発明の複合体は、細胞内でその機能を発揮することが示された。
【実施例5】
【0094】
ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質のＧＦＰ－ＦＳＥＣ分析
実施例１で作製した各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の凝集性を検討するため、ＧＦＰ－ＦＳＥＣ法により各蛋白質の可溶画分の分析を行った。
ＧＦＰ－ＦＳＥＣ法は、蛍光検出機を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＧＦＰ融合蛋白質を検出する方法である。
実施例１で作製した各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質の凝集性を検討するため、ＧＦＰ－ＦＳＥＣ法により各蛋白質の可溶画分の分析を行った。
ＧＦＰ－ＦＳＥＣ法は、蛍光検出機を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてＧＦＰ融合蛋白質を検出する方法である。
【0095】
ＨＰＬＣに使用した機材は、ＨＰＬＣカラム、オートサンプラー（ＳＩＬ－ＨＴＣ、島津製作所）、送液のためのポンプ(ＬＣ－１０ＡＤＶＰ、島津製作所）、デガッサー（ＤＧＵ－１４Ａ、島津製作所）、カラムオーブン（ＣＴＯ－１０ＡＣＶＰ、島津製作所）及び蛍光検出器（ＲＦ－１０ＡＸＬ、島津製作所）である。ＨＰＬＣカラムとして、ＥＮｒｉｃｈＴＭＳＥＣ６５０ １０×３００カラム（バイオラッド）を用いた。検出器は、Ｅｘ４８８ｎｍ、Ｅｍ５０８ｎｍで設定した。クロマトグラム表示ソフトとシグモイド計算ソフトはＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ｖｅｒ．１．２５（島津製作所）、及びＦＳＥＣｐｌｏｔｔｅｒ２ （オープンソースソフトウェア、ＴａｉｚｏＡｙａｓｅ、ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ｉｏ／ｇｉｔｈｕｂ／ＴａｉｚｏＡｙａｓｅ／ＦＳＥＣｐｌｏｔｔｅｒ２（２０１８年１０月１８日））をそれぞれ用いた。
実施例１で作製したＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質、すなわち、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの粗製試料各２５μＬ（ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質５μｇ含有）にリン酸緩衝液７５μＬを加えた。１．５ｍＬマイクロチューブ内で混合し、４℃１５分間毎分回転数１５，０００で遠心分離し、可溶画分の分離を行った。可溶画分をそれぞれ９６ウェルプレートに移し、各試料５０μＬをリン酸緩衝液で平衡化したカラムに順次添加した。流速は１．０ ｍＬ／ｍｉｎでゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。検出したＧＦＰ融合蛋白質量を分子量に沿ってシグモイド計算ソフトＦＳＥＣｐｌｏｔｔｅｒ２によりグラフ化した。
結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは可溶画分中にほぼ検出されなかった（図４Ｂ）。一方ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは顕著に低分子量のピークが検出された。したがってＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと比較して、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの溶解性が改善されたことが認められた。
また、本実施例の検出結果においては、高分子量と低分子量に２つのピークが見られた（図４Ａ（１）－（４））。低分子量のピークが各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質であり、高分子量のピークが凝集体を示している。それらのピークの蛋白質の比率を比較すると、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは高分子量と低分子量のピークが同程度であるのに対して、ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは、この順でより低分子量のピークが大きく、高分子量のピークが小さいことが確認された。
以上の結果から、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの各蛋白質は、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと比較して、高分子量の凝集体の形成が低減することが示された。
上記４種の融合蛋白質のＧＳＴ－ＥＧＦＰ部分は同一の構造であることから、本発明の細胞膜透過性ポリペプチドＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）は、ＮＴＰと比較して、融合させた蛋白質の凝集性を低減させて溶解性を改善し、融合蛋白質の生産、精製に有用な性質を付与することが認められた。
実施例１で作製したＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質、すなわち、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの粗製試料各２５μＬ（ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質５μｇ含有）にリン酸緩衝液７５μＬを加えた。１．５ｍＬマイクロチューブ内で混合し、４℃１５分間毎分回転数１５，０００で遠心分離し、可溶画分の分離を行った。可溶画分をそれぞれ９６ウェルプレートに移し、各試料５０μＬをリン酸緩衝液で平衡化したカラムに順次添加した。流速は１．０ ｍＬ／ｍｉｎでゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。検出したＧＦＰ融合蛋白質量を分子量に沿ってシグモイド計算ソフトＦＳＥＣｐｌｏｔｔｅｒ２によりグラフ化した。
結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは可溶画分中にほぼ検出されなかった（図４Ｂ）。一方ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは顕著に低分子量のピークが検出された。したがってＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと比較して、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの溶解性が改善されたことが認められた。
また、本実施例の検出結果においては、高分子量と低分子量に２つのピークが見られた（図４Ａ（１）－（４））。低分子量のピークが各ＣＰＰ－ＥＧＦＰ蛋白質であり、高分子量のピークが凝集体を示している。それらのピークの蛋白質の比率を比較すると、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは高分子量と低分子量のピークが同程度であるのに対して、ＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰは、この順でより低分子量のピークが大きく、高分子量のピークが小さいことが確認された。
以上の結果から、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰ及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）－ＧＳＴ－ＥＧＦＰの各蛋白質は、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰと比較して、高分子量の凝集体の形成が低減することが示された。
上記４種の融合蛋白質のＧＳＴ－ＥＧＦＰ部分は同一の構造であることから、本発明の細胞膜透過性ポリペプチドＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）及びＮＴＰ（ＩＣＱ２）は、ＮＴＰと比較して、融合させた蛋白質の凝集性を低減させて溶解性を改善し、融合蛋白質の生産、精製に有用な性質を付与することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明の細胞膜透過性ペプチドは、機能性分子を細胞内に送達させるのに有用であると期待される。本発明の複合体は、各種試薬及び医薬組成物の構成成分として有用であると期待される。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞及び蛋白質を生産する方法は、前記細胞膜透過性ペプチド及び前記複合体を生産するのに有用であると期待される。
【配列表フリーテキスト】
【0097】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列番号１、２、３及び４に示されるアミノ酸配列はそれぞれ、ＮＴＰ（ＩＣＱ２）、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）及びＮＴＰのアミノ酸配列である。配列番号５に示されるアミノ酸配列は、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰのアミノ酸配列である。配列番号６に示される塩基配列は、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイト及び開始コドン配列を、３’末端にストップコドン配列及び制限酵素ＮｏｔＩサイトをそれぞれ付加したポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号７に示される塩基配列は、ＮＴＰ－ＧＳＴ－ＥＧＦＰをコードする塩基配列である。配列番号８－１３、１７、１８、２４－２７、３１、３２、３６－４１に示される塩基配列は、各プライマーの塩基配列である。配列番号１４に示される塩基配列は、ＮＴＰをコードする塩基配列である。配列番号１６に示される塩基配列は、ＴＥＶをコードする塩基配列である。配列番号１９に示される塩基配列は、ΔＴＡＬＥ－ＶＰ６４の塩基配列である。配列番号２１に示されるアミノ酸配列は、ＶＰ６４のアミノ酸配列である。配列番号２２に示される塩基配列は、ＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ－１の塩基配列であり、配列番号２３で示されるアミノ酸配列は、配列番号２２に示される塩基配列によりコードされるＴＡＬＥ＿ＴＥＲＴ－１のアミノ酸配列である。配列番号２８に示されるアミノ酸配列は、ＶＰＲのアミノ酸配列である。配列番号２９及び３０に示される塩基配列は、それぞれＶＰＲ－ＰＣＲの５’末端側及び３’末端側の塩基配列である。配列番号３３に示される塩基配列は、ＮＴＰ（ＩＣＱ２）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号３４に示される塩基配列は、ＮＴＰ（Ｉ８Ｑ）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの塩基配列である。配列番号３５に示される塩基配列は、ＮＴＰ（Ｃ１０Ｑ）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの塩基配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【配列表】