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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-28
(45)【発行日】2023-04-05
(54)【発明の名称】広域エンテロウイルス抵抗性ポリペプチド及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/41 20060101AFI20230329BHJP
C07K 14/085 20060101ALI20230329BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230329BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20230329BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230329BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230329BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230329BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230329BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230329BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230329BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230329BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230329BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230329BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230329BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230329BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230329BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20230329BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230329BHJP
【ＦＩ】
C12N15/41
C07K14/085 ZNA
C12N15/63 Z
C07K7/08
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P31/14
A61P17/00
A61P9/10
A61P25/00
A61K38/10
A61K38/16
A61K48/00
A61P31/16
A61P43/00 111
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020560535
(86)(22)【出願日】2019-01-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-20
(86)【国際出願番号】 CN2019072455
(87)【国際公開番号】W WO2019141263
(87)【国際公開日】2019-07-25
【審査請求日】2020-09-28
(31)【優先権主張番号】201810056297.1
(32)【優先日】2018-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520266513
【氏名又は名称】中国科学院武漢病毒研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】505294816
【氏名又は名称】▲復▼旦大学
【氏名又は名称原語表記】Ｆｕｎｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】周 渓
(72)【発明者】
【氏名】陸 路
(72)【発明者】
【氏名】方 媛
(72)【発明者】
【氏名】姜 世勃
(72)【発明者】
【氏名】劉 澤衆
(72)【発明者】
【氏名】秦 成峰
(72)【発明者】
【氏名】邱 洋
(72)【発明者】
【氏名】穆 敬芳
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２９８８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLoS One，2015年，10(10):e0141415，doi: 10.1371/journal.pone.0141415
【文献】J Mol Biol，2003年，330(2):225-34，doi: 10.1016/s0022-2836(03)00577-1
【文献】Vaccine，2011年，Vol. 29，p. 4362-4372
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／４１
Ｃ０７Ｋ １４／０８５
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ０７Ｋ ５／０６２
Ｃ０７Ｋ ５／１０３
Ｃ０７Ｋ ７／０６
Ｃ０７Ｋ ７／０８
Ｃ０７Ｋ ５／０９３
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ６１Ｐ ３１／１４
Ａ６１Ｐ ３１／１２
Ａ６１Ｐ １７／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｋ ３８／１６
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ ３１／１６
Ａ６１Ｐ ４３／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１４のいずれか１つの配列で示されるポリペプチド。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２～１４からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、ことを特徴とする核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
【請求項5】
請求項４に記載の組換えベクターを含む、ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項6】
請求項１に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含む、ＥＶ７１、ＣＶＡ１６、ＣＶＢ３、ＣＶＢ５又はＣＶＡ６のエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の予防又は治療のための薬物。
【請求項7】
前記エンテロウイルスによって引き起こされる疾患は、手足口病である、請求項６に記載の薬物。
【請求項8】
エンテロウイルス７１型の阻害剤であって、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるポリペプチドＰ２である阻害剤である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項9】
請求項１に記載のポリペプチドの改造体であって、前記改造体は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ又は３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡであり、前記３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示され、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示され、３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に示される改造体。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本出願は、２０１８年０１月２０日に中国特許庁へ提出された、出願番号が２０１８１００５６２９７１、発明の名称が「エンテロウイルス７１型の阻害剤及びその応用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、生物医薬の分野に関し、特に、広域エンテロウイルス抵抗性ポリペプチド及びその応用に関する。
【背景技術】
【0003】
エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）は、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）エンテロウイルス属に属し、主にヒトエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ＥＶ）、コクサッキーウイルスＡ群（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ａ ｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ群（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）などを含む。エンテロウイルス感染症は世界中に広く分布しており、軽度の微熱、疲労、呼吸器疾患からヘルパンギーナ、手足口病、重度の無菌性髄膜炎、心筋炎、脳炎、急性灰白髄炎まで、複雑で多様な臨床症状が見られる。現在、エンテロウイルス感染を効果的に治療または抵抗することができる対症療法薬が不足した。
ヘルパンギーナは、主に、コクサッキーウイルスＡ群２型（ＣＶＡ２）、ＣＶＡ４、ＣＶＡ６、ＣＶＡ９、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ２２型、及びＢ群１型（ＣＶＢ１）、ＣＶＢ２、ＣＶＢ３、ＣＶＢ４、ＣＶＢ５型によって引き起こされる。ヘルパンギーナは、急激な発熱になり、ほとんどの場合に軽度または中程度の発熱であり、時々４０℃以上になり、ひいては、けいれんを引き起こすことが多い。発熱の病程は、約２～４日である。年長の子供は喉の痛みを訴え、嚥下に影響を与える可能性がある。乳幼児は唾液分泌、食事の拒否、落ち着きのなさを示す。頭痛、腹痛、筋肉痛を伴うこともある。５歳以下の子供の約２５％は、嘔吐を伴うことがある。典型的な症状は咽頭に現れる。咽頭の充血を特徴とし、発症後２日内に口腔粘膜に小さな（直径１～２ｍｍ）灰白色のヘルペスが数個（少なくとも１～２個であり、１０個以上に多くなり）現れ、その周囲に紅暈で囲まれる。２～３日後に紅暈は激しく拡大し、ヘルペスは破裂して黄色の潰瘍を形成する。このような粘膜疹は、扁桃腺の前柱に現れることが多く、軟口蓋、口蓋垂、及び扁桃腺上にも見られるが、歯肉及び頬粘膜に繋がらない。病程は、一般的に、４～６日であり、時々２週間遅れるものがある。
手足口病は、主に、エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）、ＣＶＡ６、ＣＶＡ８、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６、ＣＶＢ３及びＣＶＢ５によって引き起こされる。手足口病の一般的な臨床症状は、突然の発熱、口の痛み、食欲不振であり、口腔粘膜に散在するヘルペス又は潰瘍が現れ、舌、頬粘膜及び硬口蓋などにあることが多く、軟口蓋、歯肉、扁桃腺及び咽頭に繋がられてもよい。紅斑性丘疹は、手、足、臀部、腕部、下肢部に現れ、その後、ヘルペスに変換し、ヘルペスの周囲に炎症性紅暈があり、水疱内の水分が少ない。手及び足部には多くあり、手掌の裏面にもある。丘疹数は、少なくとも数個であり、数十個に多くなる。消退後に、痕跡や色素沈着が残らない。手足口病の一部の患児は、ヘルパンギーナを最初の症状とし、次いで、手掌、足裏、臀部などの部位に赤色丘疹が現れる。病程が急速に進行すると、少数の患児は、手足口病から重篤な無菌性髄膜炎、脳炎などを発症する可能性がある。発熱、頭痛、吐き気、嘔吐、嘔吐後に伴う髄膜刺激症状を示し、体温は大きく変動し、ほとんどの場合には、低熱であり、４０℃以上に高くなることもあり、二峰性発熱はしばしば病程で存在する。他の症状は、例えば、喉の痛み、筋肉の痛み、丘疹、光恐怖症、下痢、リンパ節腫脹などがあり、少数の患者は、軽度の麻痺が発生する可能性がある。
ヘルパンギーナは、主に、コクサッキーウイルスＡ群２型（ＣＶＡ２）、ＣＶＡ４、ＣＶＡ６、ＣＶＡ９、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ２２型、及びＢ群１型（ＣＶＢ１）、ＣＶＢ２、ＣＶＢ３、ＣＶＢ４、ＣＶＢ５型によって引き起こされる。ヘルパンギーナは、急激な発熱になり、ほとんどの場合に軽度または中程度の発熱であり、時々４０℃以上になり、ひいては、けいれんを引き起こすことが多い。発熱の病程は、約２～４日である。年長の子供は喉の痛みを訴え、嚥下に影響を与える可能性がある。乳幼児は唾液分泌、食事の拒否、落ち着きのなさを示す。頭痛、腹痛、筋肉痛を伴うこともある。５歳以下の子供の約２５％は、嘔吐を伴うことがある。典型的な症状は咽頭に現れる。咽頭の充血を特徴とし、発症後２日内に口腔粘膜に小さな（直径１～２ｍｍ）灰白色のヘルペスが数個（少なくとも１～２個であり、１０個以上に多くなり）現れ、その周囲に紅暈で囲まれる。２～３日後に紅暈は激しく拡大し、ヘルペスは破裂して黄色の潰瘍を形成する。このような粘膜疹は、扁桃腺の前柱に現れることが多く、軟口蓋、口蓋垂、及び扁桃腺上にも見られるが、歯肉及び頬粘膜に繋がらない。病程は、一般的に、４～６日であり、時々２週間遅れるものがある。
手足口病は、主に、エンテロウイルス７１型（ＥＶ７１）、ＣＶＡ６、ＣＶＡ８、ＣＶＡ１０、ＣＶＡ１６、ＣＶＢ３及びＣＶＢ５によって引き起こされる。手足口病の一般的な臨床症状は、突然の発熱、口の痛み、食欲不振であり、口腔粘膜に散在するヘルペス又は潰瘍が現れ、舌、頬粘膜及び硬口蓋などにあることが多く、軟口蓋、歯肉、扁桃腺及び咽頭に繋がられてもよい。紅斑性丘疹は、手、足、臀部、腕部、下肢部に現れ、その後、ヘルペスに変換し、ヘルペスの周囲に炎症性紅暈があり、水疱内の水分が少ない。手及び足部には多くあり、手掌の裏面にもある。丘疹数は、少なくとも数個であり、数十個に多くなる。消退後に、痕跡や色素沈着が残らない。手足口病の一部の患児は、ヘルパンギーナを最初の症状とし、次いで、手掌、足裏、臀部などの部位に赤色丘疹が現れる。病程が急速に進行すると、少数の患児は、手足口病から重篤な無菌性髄膜炎、脳炎などを発症する可能性がある。発熱、頭痛、吐き気、嘔吐、嘔吐後に伴う髄膜刺激症状を示し、体温は大きく変動し、ほとんどの場合には、低熱であり、４０℃以上に高くなることもあり、二峰性発熱はしばしば病程で存在する。他の症状は、例えば、喉の痛み、筋肉の痛み、丘疹、光恐怖症、下痢、リンパ節腫脹などがあり、少数の患者は、軽度の麻痺が発生する可能性がある。
【0004】
心筋炎は、主に、ＣＶＢ１－６１及びＥｃｈｏｖｉｒｕｓによって引き起こされる。ウイルス性心筋炎の患者の臨床症状は、病変の大きさ及び部位に依存し、軽症の場合には、症状がなく、重症の場合には、心不全、心原性ショック及び突然死が発生する可能性がある。患者は、発症の１～３週間前に上気道または腸管感染症の病歴があり、発熱、体の痛み、喉の痛み、疲労、吐き気、嘔吐、下痢などの症状が現れ、そして、動悸、胸の圧迫感、胸の痛み又は前胸部痛、めまい、呼吸困難、浮腫が現れ、ひいては、アダムス・ストークス症候群を発症することが多く、心不全又は心原性ショックが現れる患者はごくわずかである。
エンテロウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ゲノムサイズが約７．５ｋｂであり、ポリタンパク質をコードできる大きなＯＲＦを含む。ポリタンパク質は、さらに４つの構造タンパク質（ＶＰ１－ＶＰ４）及び７つの非構造タンパク質（２Ａ－２Ｃ及び３Ａ－３Ｄ）に加水分解される。３Ａタンパク質は、エンテロウイルス（ＥＶ７１、ＣＶＡ及びＣＶＢなどを含み）で非常に保存されている非構造タンパク質であり、ホモ二量体として細胞内膜に存在し、ウイルスの複製及び宿主の自然免疫の調節に重要な役割を果たす。
ウイルス感染後に、宿主細胞は、一連の自然免疫機構を活性化して防御し、その防御は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、 ＲＮＡｉ）によって誘導される抗ウイルス防御を含む。ウイルスが宿主細胞に感染した後に、ウイルスゲノム自体の構造又は複製中間体により、ウイルスに由来する長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、 ｄｓＲＮＡ）が生成される。これらのｄｓＲＮＡは、宿主細胞のＤｉｃｅｒタンパク質によって認識され、ウイルス由来の低分子干渉ＲＮＡ（ｖｉｒａｌ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、 ｖｓｉＲＮＡ）に切断され、その後、ｖｓｉＲＮＡがＡｒｇｏｎａｕｔｅ （ＡＧＯ）タンパク質と結合されて組み立てられ、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ、 ＲＩＳＣ）を形成し、最終的に、ウイルスの標的遺伝子ＲＮＡの分解を誘導するため、ウイルスの複製を抑制してウイルスを排除する目的を達成する。
エンテロウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ゲノムサイズが約７．５ｋｂであり、ポリタンパク質をコードできる大きなＯＲＦを含む。ポリタンパク質は、さらに４つの構造タンパク質（ＶＰ１－ＶＰ４）及び７つの非構造タンパク質（２Ａ－２Ｃ及び３Ａ－３Ｄ）に加水分解される。３Ａタンパク質は、エンテロウイルス（ＥＶ７１、ＣＶＡ及びＣＶＢなどを含み）で非常に保存されている非構造タンパク質であり、ホモ二量体として細胞内膜に存在し、ウイルスの複製及び宿主の自然免疫の調節に重要な役割を果たす。
ウイルス感染後に、宿主細胞は、一連の自然免疫機構を活性化して防御し、その防御は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、 ＲＮＡｉ）によって誘導される抗ウイルス防御を含む。ウイルスが宿主細胞に感染した後に、ウイルスゲノム自体の構造又は複製中間体により、ウイルスに由来する長鎖二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ、 ｄｓＲＮＡ）が生成される。これらのｄｓＲＮＡは、宿主細胞のＤｉｃｅｒタンパク質によって認識され、ウイルス由来の低分子干渉ＲＮＡ（ｖｉｒａｌ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、 ｖｓｉＲＮＡ）に切断され、その後、ｖｓｉＲＮＡがＡｒｇｏｎａｕｔｅ （ＡＧＯ）タンパク質と結合されて組み立てられ、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ、 ＲＩＳＣ）を形成し、最終的に、ウイルスの標的遺伝子ＲＮＡの分解を誘導するため、ウイルスの複製を抑制してウイルスを排除する目的を達成する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、前記の事情に鑑みてなされたものであり、ポリペプチド及びその応用を提供する。
上記本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術態様を提供する。即ち、
本発明は、ウイルス性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における、標的としての抗エンテロウイルスタンパク質（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＥＲＳＰ）の応用を提供する。
本発明は、さらに、ＥＲＳＰを標的とする阻害剤の調製におけるポリペプチドの応用を提供し、前記ＥＲＳＰの機能は、前記ポリペプチドによって阻害され、ウイルスの核酸は、Ｄｉｃｅｒにより切断されてｖｓｉＲＮＡを生成する。
本発明は、さらに、ウイルス性疾患を予防及び治療するための薬物の調製におけるポリペプチドの応用を提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ＥＲＳＰは、エンテロウイルスの非構造タンパク質３Ａである。
上記本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術態様を提供する。即ち、
本発明は、ウイルス性疾患を予防及び／又は治療するための薬物の調製における、標的としての抗エンテロウイルスタンパク質（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＥＲＳＰ）の応用を提供する。
本発明は、さらに、ＥＲＳＰを標的とする阻害剤の調製におけるポリペプチドの応用を提供し、前記ＥＲＳＰの機能は、前記ポリペプチドによって阻害され、ウイルスの核酸は、Ｄｉｃｅｒにより切断されてｖｓｉＲＮＡを生成する。
本発明は、さらに、ウイルス性疾患を予防及び治療するための薬物の調製におけるポリペプチドの応用を提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ＥＲＳＰは、エンテロウイルスの非構造タンパク質３Ａである。
【0006】
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）エンテロウイルス属に属し、ヒトエンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ＥＶ）、コクサッキーウイルスＡ型（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ａ ｖｉｒｕｓ、ＣＶＡ）、コクサッキーウイルスＢ型（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＣＶＢ）、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）などを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記疾病は、前記ウイルスによって引き起こされる手足口病、心筋炎、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎、脳炎、ウイルス性感冒などである。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＲ、ＣＫ及び／又はＤＬＬを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドは、以下の配列を有する。
Ｉ：（Ｘ１） （Ｘ２）ＤＬＬ、（Ｘ２）ＤＬＬ（Ｘ３）、ＤＬＬ（Ｘ３） （Ｘ４）
、（Ｘ５）ＹＣ（Ｘ６）、Ｃ（Ｘ６）。
（ここで、
Ｘ１は、イソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ２は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）から選ばれ、
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ５は、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選ばれ、
Ｘ６は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）から選ばれる。）
或いは、II：Ｉに記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が欠失、挿入
又は置換されている配列、
或いは、III：Ｉ又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも５０％の同一性を有し、そしてＥＲＳＰ活性を阻害する配列、
或いは、IV：Ｉ又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記疾病は、前記ウイルスによって引き起こされる手足口病、心筋炎、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎、脳炎、ウイルス性感冒などである。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＲ、ＣＫ及び／又はＤＬＬを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドは、以下の配列を有する。
Ｉ：（Ｘ１） （Ｘ２）ＤＬＬ、（Ｘ２）ＤＬＬ（Ｘ３）、ＤＬＬ（Ｘ３） （Ｘ４）
、（Ｘ５）ＹＣ（Ｘ６）、Ｃ（Ｘ６）。
（ここで、
Ｘ１は、イソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ２は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）から選ばれ、
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ５は、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選ばれ、
Ｘ６は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）から選ばれる。）
或いは、II：Ｉに記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が欠失、挿入
又は置換されている配列、
或いは、III：Ｉ又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも５０％の同一性を有し、そしてＥＲＳＰ活性を阻害する配列、
或いは、IV：Ｉ又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
【0007】
本発明に記載の「アミノ酸」には、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸が含まれる。当業者によく知られているアミノ酸の全ては、本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、Ｉに記載の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１～１４のいずれか１つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
本発明は、さらに、ＥＲＳＰの活性を阻害できるポリペプチドを提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＲ、ＣＫ及び／又はＤＬＬを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＹＣＲ及び／又はＹＣＫを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、Ｉに記載の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．１～１４のいずれか１つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
本発明は、さらに、ＥＲＳＰの活性を阻害できるポリペプチドを提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＲ、ＣＫ及び／又はＤＬＬを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＹＣＲ及び／又はＹＣＫを含む。
【0008】
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドは、以下の配列を有する。
Ｉ：（Ｘ１） （Ｘ２）ＤＬＬ、（Ｘ２）ＤＬＬ（Ｘ３）、ＤＬＬ（Ｘ３） （Ｘ４）
、（Ｘ５）ＹＣ（Ｘ６）、Ｃ（Ｘ６）；
（ここで、
Ｘ１は、イソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ２は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）から選ばれ、
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ５は、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選ばれ、
Ｘ６は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）から選ばれる。）
或いは、II：Ｉに記載の配列において少なくとも１つのアミノ酸が欠失、挿入又は置換
されている配列、
或いは、III：Ｉ又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも５０％の同一性を有し、そしてＥＲＳＰ活性を阻害する配列、
或いは、IV：Ｉ又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
Ｉ：（Ｘ１） （Ｘ２）ＤＬＬ、（Ｘ２）ＤＬＬ（Ｘ３）、ＤＬＬ（Ｘ３） （Ｘ４）
、（Ｘ５）ＹＣ（Ｘ６）、Ｃ（Ｘ６）；
（ここで、
Ｘ１は、イソロイシン（Ｉ）であり、
Ｘ２は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ３は、アラニン（Ａ）又はリシン（Ｋ）又はグルタミン（Ｑ）又はアルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）から選ばれ、
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はアラニン（Ａ）から選ばれ、
Ｘ５は、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選ばれ、
Ｘ６は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）から選ばれる。）
或いは、II：Ｉに記載の配列において少なくとも１つのアミノ酸が欠失、挿入又は置換
されている配列、
或いは、III：Ｉ又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも５０％の同一性を有し、そしてＥＲＳＰ活性を阻害する配列、
或いは、IV：Ｉ又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
【0009】
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドＩに記載の配列は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１４のいずれか１つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
上記の研究に基づいて、本発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である核酸を提供する。
本発明は、さらに、前記核酸を含む組換えベクターを提供する。
それに基づいて、本発明は、さらに、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含む薬物を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含むワクチンを提供する。
本発明は、さらに、前記薬物を服用及び／又は注射する、エンテロウイルス感染症の治療方法を提供する。前記注射は、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射である。
本発明は、さらに、前記ワクチンを接種する、エンテロウイルス感染症の予防方法を提供する。
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１～１４のいずれか１つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
上記の研究に基づいて、本発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である核酸を提供する。
本発明は、さらに、前記核酸を含む組換えベクターを提供する。
それに基づいて、本発明は、さらに、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含む薬物を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含むワクチンを提供する。
本発明は、さらに、前記薬物を服用及び／又は注射する、エンテロウイルス感染症の治療方法を提供する。前記注射は、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射である。
本発明は、さらに、前記ワクチンを接種する、エンテロウイルス感染症の予防方法を提供する。
【0010】
本発明では、「予防」という用語は、臨床基準によって認識される疾患の前に、疾患の様々な症状の発症又は進展を阻止又は低減するように、医学的、物理的または化学的方法を含む、疾患の発症又は進展を防止するための手段又は方法を意味する。
本発明では、「治療」という用語は、疾患の発症又は進展を阻止又は低減するように、病程の進展又は悪化を抑制、阻止、低減、改善、軽減、停止、遅延、または逆転することを意味し、記載された維持及び／又は投与中の疾患の、障害または病理学的状態のさまざまな指標は、症状又は合併症の軽減又は緩和、或いは、治愈又は消除疾患、障害又は病状の治癒又は消失を指す。
本発明では、「薬物」という用語は、ある疾患の予防又は治療に適用できる単一化合物、複数の化合物からなる組成物を意味し、或いは、単一化合物を主要な活性成分とする組成物又は製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、さらに、複数の化合物を活性成分とする組成物又は製剤である。「薬物」とは、各国の法律や規制に準拠し設立された行政機関によって承認されて生産された製品だけでなく、承認及び生産許可を取得するための過程で形成された単一化合物を活性成分として含有する様々な物質形態であることを理解すべきである。「形成」とは、化学合成、生物学的変換、または購入を通じて取得することを理解すべきである。
本発明では、「治療」という用語は、疾患の発症又は進展を阻止又は低減するように、病程の進展又は悪化を抑制、阻止、低減、改善、軽減、停止、遅延、または逆転することを意味し、記載された維持及び／又は投与中の疾患の、障害または病理学的状態のさまざまな指標は、症状又は合併症の軽減又は緩和、或いは、治愈又は消除疾患、障害又は病状の治癒又は消失を指す。
本発明では、「薬物」という用語は、ある疾患の予防又は治療に適用できる単一化合物、複数の化合物からなる組成物を意味し、或いは、単一化合物を主要な活性成分とする組成物又は製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、さらに、複数の化合物を活性成分とする組成物又は製剤である。「薬物」とは、各国の法律や規制に準拠し設立された行政機関によって承認されて生産された製品だけでなく、承認及び生産許可を取得するための過程で形成された単一化合物を活性成分として含有する様々な物質形態であることを理解すべきである。「形成」とは、化学合成、生物学的変換、または購入を通じて取得することを理解すべきである。
【0011】
本発明は、さらに、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるポリペプチドＰ２であるエンテロウイルス７１型の阻害剤を提供する。
本発明は、さらに、前記阻害剤により調製された改造体を提供し、前記改造体は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ又は３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡであり、前記３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩの非天然アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される。
さらに、本発明は、さらに、エンテロウイルス阻害剤の調製における前記阻害剤又は前記改造体の応用を提供する。
ＲＮＡ干渉は、ウイルスに対する自然免疫機構である。ＲＮＡ干渉によるウイルス抵抗過程では、ウイルスＲＮＡ複製によって生成された二本鎖ＲＮＡは、宿主Ｄｉｃｅｒタンパク質によって認識され、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される。これらのウイルス由来低分子干渉ＲＮＡ（ｖｓｉＲＮＡ）は、転送され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み立てられ、相同性のあるウイルスＲＮＡの分解を誘導するため、ウイルスに抵抗する目的を達成する。例えば、ＥＶ７１の非構造タンパク質３Ａは、ウイルス二本鎖ＲＮＡに結合することによりＤｉｃｅｒの切断を防止し、ｖｓｉＲＮＡウイルス由来低分子干渉ＲＮＡの生成を阻害することができるため、ＲＮＡ干渉による抗ウイルス自然免疫を回避する目的を達成する。
本発明で提供されるポリペプチドは、効率良く、広域の抗ウイルス活性を有する。これは、ＥＶ７１ウイルス、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＡ６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルス７１型、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスに抵抗するポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。
本発明は、さらに、前記阻害剤により調製された改造体を提供し、前記改造体は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ又は３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡであり、前記３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩの非天然アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される。
さらに、本発明は、さらに、エンテロウイルス阻害剤の調製における前記阻害剤又は前記改造体の応用を提供する。
ＲＮＡ干渉は、ウイルスに対する自然免疫機構である。ＲＮＡ干渉によるウイルス抵抗過程では、ウイルスＲＮＡ複製によって生成された二本鎖ＲＮＡは、宿主Ｄｉｃｅｒタンパク質によって認識され、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される。これらのウイルス由来低分子干渉ＲＮＡ（ｖｓｉＲＮＡ）は、転送され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み立てられ、相同性のあるウイルスＲＮＡの分解を誘導するため、ウイルスに抵抗する目的を達成する。例えば、ＥＶ７１の非構造タンパク質３Ａは、ウイルス二本鎖ＲＮＡに結合することによりＤｉｃｅｒの切断を防止し、ｖｓｉＲＮＡウイルス由来低分子干渉ＲＮＡの生成を阻害することができるため、ＲＮＡ干渉による抗ウイルス自然免疫を回避する目的を達成する。
本発明で提供されるポリペプチドは、効率良く、広域の抗ウイルス活性を有する。これは、ＥＶ７１ウイルス、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＡ６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルス７１型、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスに抵抗するポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、ポリペプチド及びその応用を開示しており、当業者にとっては、本明細書を参照し、プロセスパラメーターを適切に改良して達成することができる。特に、すべての類似した置換及び変更は、当業者にとっては明らかになり、それらはすべて本発明に含まれることを理解すべきである。本発明に係る方法及び応用は、好ましい実施例を記載し、当業者にとっては、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び応用を改良し、又は適当な変更及び組み合わせを加え、本発明の技術を実現及び適用することができることは明らかである。
ＥＶ７１ ３Ａタンパク質は、８６個のアミノ酸残基を含む。３Ａは、二量体化する能力があり、その二量体化は、３Ａの正確な機能に重要な役割を果たす。出願人は、３Ａ二量体化ドメインの２つの螺旋構造の構成及び配列特徴に基づいて、ＥＰポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される）を設計し、その配列は、ＥＶ７１非構造タンパク質３Ａに結合し、３Ａタンパク質二量体の形成を妨げることができるため、ウイルスの複製及び感染を阻害する。
上記の考え方に基づいて、出願人は、該阻害剤が細胞膜を通過して細胞内に入ることによりウイルスへの阻害作用を果たすために、ＥＰポリペプチドをコア配列とし、ポリペプチドＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される）を設計し、そのポリペプチドＰ２は、α１と競争的に相互作用することができるため、３Ａの二量体化を阻止し、３Ａタンパクの抗自然免疫を阻害する役割を果たし、最終的に抗ウイルスの目的を達成する。
ＥＶ７１ ３Ａタンパク質は、８６個のアミノ酸残基を含む。３Ａは、二量体化する能力があり、その二量体化は、３Ａの正確な機能に重要な役割を果たす。出願人は、３Ａ二量体化ドメインの２つの螺旋構造の構成及び配列特徴に基づいて、ＥＰポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される）を設計し、その配列は、ＥＶ７１非構造タンパク質３Ａに結合し、３Ａタンパク質二量体の形成を妨げることができるため、ウイルスの複製及び感染を阻害する。
上記の考え方に基づいて、出願人は、該阻害剤が細胞膜を通過して細胞内に入ることによりウイルスへの阻害作用を果たすために、ＥＰポリペプチドをコア配列とし、ポリペプチドＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される）を設計し、そのポリペプチドＰ２は、α１と競争的に相互作用することができるため、３Ａの二量体化を阻止し、３Ａタンパクの抗自然免疫を阻害する役割を果たし、最終的に抗ウイルスの目的を達成する。
【0014】
出願人は、さらに、ポリペプチドＰ２に基づいてその構造を改造し、一連の改造体を構築し、試験により、改造されたポリペプチドＰ２は、ウイルスへの阻害効果を向上させ、ヒトエンテロウイルスに対する予防、制御及び治療に非常に重要であることが確認されている。
前記改造体は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡであり、前記３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される。
エンテロウイルス７１型の阻害剤の応用においては、本発明で提供されるＰ２及びＰ２改造体によりエンテロウイルス７１型の阻害剤を調製すること、又は本発明で提供されるＰ２及びＰ２改造体を他の有効成分とともにエンテロウイルス７１型の阻害剤を調製することを含む。
前記改造体は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡであり、前記３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示され、３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される。
エンテロウイルス７１型の阻害剤の応用においては、本発明で提供されるＰ２及びＰ２改造体によりエンテロウイルス７１型の阻害剤を調製すること、又は本発明で提供されるＰ２及びＰ２改造体を他の有効成分とともにエンテロウイルス７１型の阻害剤を調製することを含む。
【0015】
本発明で保護されるものは、Ｐ２ポリペプチドに基づいて、それに異なる細胞膜透過性配列を置換するか、又はポリペプチドを修飾するか、又は非天然アミノ酸の設計及び改造を行った後にＥＶ７１の阻害活性を有する阻害剤である。
エンテロウイルス３Ａタンパクは、ウイルスｄｓＲＮＡに結合してＤｉｃｅｒによる切断を阻止し、ウイルス由来ｖｓｉＲＮＡの産生を阻害し、宿主のＲＮＡｉによる抗ウイルス免疫に抵抗することができる効率的なＥＲＳＰである。
本発明に係るポリペプチド及びその誘導体は、エンテロウイルス３Ａの抗ウイルス免疫力を阻害することができ、新たなＥＶ７１治療薬であり、新しい標的については、抗ウイルス薬の薬剤耐性などに非常に重要である。
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
Ｐ２系ポリペプチドは、効率よい抗ウイルス活性を持つ。これは、エンテロウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルスポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。また、Ｐ２系ポリペプチドの明確な抗ウイルスメカニズムは、その応用の安全性及び最適化方法の明確さを保証し、将来のさらなる開発に便利である。
エンテロウイルス３Ａタンパクは、ウイルスｄｓＲＮＡに結合してＤｉｃｅｒによる切断を阻止し、ウイルス由来ｖｓｉＲＮＡの産生を阻害し、宿主のＲＮＡｉによる抗ウイルス免疫に抵抗することができる効率的なＥＲＳＰである。
本発明に係るポリペプチド及びその誘導体は、エンテロウイルス３Ａの抗ウイルス免疫力を阻害することができ、新たなＥＶ７１治療薬であり、新しい標的については、抗ウイルス薬の薬剤耐性などに非常に重要である。
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
Ｐ２系ポリペプチドは、効率よい抗ウイルス活性を持つ。これは、エンテロウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルスポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。また、Ｐ２系ポリペプチドの明確な抗ウイルスメカニズムは、その応用の安全性及び最適化方法の明確さを保証し、将来のさらなる開発に便利である。
【0016】
本発明により提供されるポリペプチドを、表１に示す。
【0017】
【表1】
【0018】
本発明では、ポリペプチド配列のうち、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ８）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ）は膜透過ペプチドであり、ＧＳＧはリンカーペプチドであり、各ポリペプチドのアミノ酸配列が前記膜透過ペプチド及びリンカーペプチドの配列を除いたものは、コア配列である。本発明の各実施例におけるポリペプチドは、本発明で提供されるポリペプチドのコア配列が対応する抗ウイルス効果を有するを証明するために、陰性対照が設けられる。
本発明で提供されるポリペプチド及びその応用に使用される原料及び試薬は、いずれも市販品を購入できる。
以下、実施例と組み合わせて本発明をさらに説明する。
本発明で提供されるポリペプチド及びその応用に使用される原料及び試薬は、いずれも市販品を購入できる。
以下、実施例と組み合わせて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【0019】
実施例１：ポリペプチドＰ２の細胞膜透過効率の検出
１．材料：
ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ（ＮＥＳＴ）は、プロモーター公司から購入され、ＰＢＳ、ＤＡＰＩ、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドＰ２は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示された。
２．実験手順
実験は、２つの群に分けられ、ＥＶ７１ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、１つの実験群ではＥＶ７１ウイルスを添加した後、ポリペプチドＰ２を加え、別の実験群ではウイルスを添加ずにポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光の手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞１ｍｌを免疫蛍光用ディッシュに敷き、３０％コンフルエントに達したら、試料を収集した。
（２）培地を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残った培地を３回、各回５分間洗い流した。
（３）４％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、ＰＢＳ １００ｍｌにパラホルムアルデヒド４ｇを溶解させた。調製された４％パラホルムアルデヒド １ｍｌを各ディッシュに加え、細胞を固定するために、５ｍｉｎ反応させた。
（４）４％パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残ったパラホルムアルデヒドを３回、各回５分間洗い流した。
（５）１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ディッシュに加え、１５ｍｉｎ反応させた。
（６）反応液を吸引し、１ｍｌ ０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳを再度追加し、残った反応液を３回、各回５分間洗い流した。
（７）ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識（ＦＩＴＣ）付きポリペプチドを使用し、ＲＤ細胞のその細胞膜透過効率を検出した。２群の実験を個別に設定し、第１群は、未処理対照群であり、それぞれＲ８及びＰ２を加え、第２群は、ＥＶ７１感染群であり、ＥＶ７１感染後に、さらに、それぞれＲ８、Ｐ２を加えた。２群の実験は同時に実行され、ウイルスＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，感染多重度）＝０．１であり、濃度１μＭであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから１２時間後、試料を収集し、細胞を固定して免疫蛍光染色を行い、細胞核をＤＡＰＩ溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図１に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドＰ２は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
１．材料：
ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ（ＮＥＳＴ）は、プロモーター公司から購入され、ＰＢＳ、ＤＡＰＩ、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドＰ２は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示された。
２．実験手順
実験は、２つの群に分けられ、ＥＶ７１ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、１つの実験群ではＥＶ７１ウイルスを添加した後、ポリペプチドＰ２を加え、別の実験群ではウイルスを添加ずにポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光の手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞１ｍｌを免疫蛍光用ディッシュに敷き、３０％コンフルエントに達したら、試料を収集した。
（２）培地を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残った培地を３回、各回５分間洗い流した。
（３）４％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、ＰＢＳ １００ｍｌにパラホルムアルデヒド４ｇを溶解させた。調製された４％パラホルムアルデヒド １ｍｌを各ディッシュに加え、細胞を固定するために、５ｍｉｎ反応させた。
（４）４％パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残ったパラホルムアルデヒドを３回、各回５分間洗い流した。
（５）１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ディッシュに加え、１５ｍｉｎ反応させた。
（６）反応液を吸引し、１ｍｌ ０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳを再度追加し、残った反応液を３回、各回５分間洗い流した。
（７）ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識（ＦＩＴＣ）付きポリペプチドを使用し、ＲＤ細胞のその細胞膜透過効率を検出した。２群の実験を個別に設定し、第１群は、未処理対照群であり、それぞれＲ８及びＰ２を加え、第２群は、ＥＶ７１感染群であり、ＥＶ７１感染後に、さらに、それぞれＲ８、Ｐ２を加えた。２群の実験は同時に実行され、ウイルスＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，感染多重度）＝０．１であり、濃度１μＭであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから１２時間後、試料を収集し、細胞を固定して免疫蛍光染色を行い、細胞核をＤＡＰＩ溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図１に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドＰ２は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
【0020】
実施例２：ポリペプチドＰ２の細胞毒性測定
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＰ２は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μｌ播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェルのＰ２の最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように一定の濃度勾配でポリペプチドＰ２を加えた。
（３）ポリペプチドを添加してから２４ｈ後に試料を収集し、生細胞検出試薬ＣＣＫ－８を１ウェルあたり１０μｌ加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
結果は、図２、表２に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％とし、ポリペプチド１００μＭを加えた後に細胞生存率は、対照群（未処理細胞）と有意差がなく、本研究で使用されるポリペプチドＰ２は、１００μＭ以内でいずれも細胞毒性がないことが証明されている。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＰ２は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μｌ播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェルのＰ２の最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように一定の濃度勾配でポリペプチドＰ２を加えた。
（３）ポリペプチドを添加してから２４ｈ後に試料を収集し、生細胞検出試薬ＣＣＫ－８を１ウェルあたり１０μｌ加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
結果は、図２、表２に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％とし、ポリペプチド１００μＭを加えた後に細胞生存率は、対照群（未処理細胞）と有意差がなく、本研究で使用されるポリペプチドＰ２は、１００μＭ以内でいずれも細胞毒性がないことが証明されている。
【0021】
【表2】
【0022】
実施例３：ポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、飛げい公司から購入され、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）は、友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体としてＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．ウイルスの増幅
（１）ＲＤ細胞を５つの１００ｍｍディッシュに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、１μｌの１０7ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１ウイルス、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスを加えた。
（３）２日間後に、細胞にＣＰＥ（細胞変性効果）現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになると試料を収集した。
（４）１００ｍｍ ディッシュ中の上清を１５ｍｌ 遠心チューブに吸引し、５００ｇ、５ｍｉｎ遠心した。
（５）次いで、上清を別の１５ｍｌ 遠心チューブに採取し、５０ｍｌ 注射器及び０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
（６）ウイルス抽出ＲＮＡ １００μｌを採取して前に抽出された既知力価のウイルスＲＮＡとともにワンステップｑＲＴ－ＰＣＲを実行し、ウイルスの力価を測定した。
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、飛げい公司から購入され、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）は、友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体としてＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．ウイルスの増幅
（１）ＲＤ細胞を５つの１００ｍｍディッシュに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、１μｌの１０7ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１ウイルス、ＣＶＡ１６ウイルス、ＣＶＢ３ウイルス、ＣＶＢ５ウイルスを加えた。
（３）２日間後に、細胞にＣＰＥ（細胞変性効果）現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになると試料を収集した。
（４）１００ｍｍ ディッシュ中の上清を１５ｍｌ 遠心チューブに吸引し、５００ｇ、５ｍｉｎ遠心した。
（５）次いで、上清を別の１５ｍｌ 遠心チューブに採取し、５０ｍｌ 注射器及び０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
（６）ウイルス抽出ＲＮＡ １００μｌを採取して前に抽出された既知力価のウイルスＲＮＡとともにワンステップｑＲＴ－ＰＣＲを実行し、ウイルスの力価を測定した。
【0023】
３．ＲＤ細胞のポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
（１）それぞれ異なる細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は、０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6ＰＦＵ／ｍＬ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭである異なるポリペプチドを加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次に、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル ２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
Ｒ８膜透過ペプチド（配列：ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が挿入されたＲＤ細胞を陰性対照とした。
（１）それぞれ異なる細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は、０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6ＰＦＵ／ｍＬ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭである異なるポリペプチドを加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次に、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル ２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
Ｒ８膜透過ペプチド（配列：ＲＲＲＲＲＲＲＲ）が挿入されたＲＤ細胞を陰性対照とした。
【0024】
結果は、図３、表３に示され、ＥＶ７１ウイルス感染したものにＲ８が加えられた実験群ウイルスＲＮＡの量を１００％とし、ポリペプチドＰ２を加えた後、ポリペプチド濃度が高くなるとウイルス量が低減し、ポリペプチド濃度が５０μＭになると、ウイルス量は約４％に低下し、ポリペプチドＰ２が良い抗ウイルス効果を有することを証明し、ｑＲＴ－ＰＣＲ法によりウイルス力価を検出し、Ｐ２のＩＣ50値が６．３７２μＭとして測定され、図２と組み合わせると、ポリペプチドＰ２は、１００μＭ以内で細胞毒性を示さないため、薬物の安全性を前提として、ポリペプチドは優れた抗ウイルス効果を奏することが証明された。
【0025】
【表3】
【0026】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチドＰ２の抗ウイルス效果を検出し、８０％コンフルエントのＲＤ細胞にＥＶ７１（ＭＯＩ＝０．１）を加え、１時間感染後、濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭになるように、それぞれ特定の濃度勾配でポリペプチドＰ２を加えた。２４時間後に試料を収集し、細胞全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲにより検出ウイルスゲノムＲＮＡの発現レベルを検出し、膜透過ペプチドＲ８が加えられたサンプルのみに感染したものを対照群とした。結果は、ポリペプチド濃度が増加するに伴い、ウイルスＲＮＡの発現レベルは有意に低下し、ポリペプチドＰ２が有意な抗ＥＶ７１活性を有することを証明した。
【0027】
実施例４：複数種の細胞のポリペプチドＰ２の抗ウイルス効果の測定
１．材料
ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｈｕｈ７．５細胞
２．複数種の細胞のポリペプチドＰ２の抗ウイルス効果の測定
（１）２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＨｕｈ７．５細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ異なる細胞に最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭであるポリペプチドＰ２を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次いで、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
図４より、ＲＤ細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞又はｈｕｈ７．５細胞のいずれにも、ポリペプチドＰ２はいずれも有意な抗ウイルス效果を奏することことがわかった。
２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈμｈ７．５細胞で測定されたＩＣ50値は、それぞれ９．６７７μＭ、１．９５８μＭ、１．８４２μＭである。
１．材料
ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、Ｈｕｈ７．５細胞
２．複数種の細胞のポリペプチドＰ２の抗ウイルス効果の測定
（１）２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞及びＨｕｈ７．５細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ異なる細胞に最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭであるポリペプチドＰ２を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次いで、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
図４より、ＲＤ細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞又はｈｕｈ７．５細胞のいずれにも、ポリペプチドＰ２はいずれも有意な抗ウイルス效果を奏することことがわかった。
２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈμｈ７．５細胞で測定されたＩＣ50値は、それぞれ９．６７７μＭ、１．９５８μＭ、１．８４２μＭである。
【0028】
実施例５：抗ウイルス効果に対するポリペプチドＰ２の改造体の影響
１．材料
ポリペプチドは３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す）及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す）を採用した。かかるポリペプチドは、いずれも商業的に合成されたものである。
２．抗ウイルス效果に対するポリペプチドＰ２の改造体の影響
（１）２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、ポリペプチドＰ２、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ－ＰＡをそれぞれ最終濃度０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭで加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次いで、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１．材料
ポリペプチドは３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す）及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す）を採用した。かかるポリペプチドは、いずれも商業的に合成されたものである。
２．抗ウイルス效果に対するポリペプチドＰ２の改造体の影響
（１）２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、ポリペプチドＰ２、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ－ＰＡをそれぞれ最終濃度０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭで加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）次いで、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0029】
３．ＲＤ細胞の３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ及び３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのＣＣＫ８キットによるウイルス阻害活性の検出
（１）まず、増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに１×１０4個、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。
（２）２％ＦＢＳ含有ＭＥＭを使用してポリペプチド薬物（３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ及び３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ）を２倍段階希釈し、希釈濃度は４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１３μＭであり、１ウェルあたり１００μｌ、別の９６ウェルプレートに加え、各濃度は３点測定（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）を行った。
（３）希釈されたウイルスを上記ウェルに１ウェルあたり１００μＬ加え、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェルをそれぞれ対照とし、ウイルスの最終濃度は、０．１ ＭＯＩである。
（４）混合物を細胞が播種された９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２４時間培養した後、ＣＣＫ８キットによりウイルスに対するポリペプチドの阻害活性を測定した。
（５）ウイルス感染に対するさまざまな濃度のポリペプチドの阻害率は、次の式を使用して計算されました。
阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）。ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
結果は、図５に示され、ポリペプチドＰ２から改造されたポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す）及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す）は、いずれもＥＶ７１阻害剤として作用を発揮し、またウイルスへの阻害を向上させる効果を奏することもできる。ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定された３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのＩＣ50は３．２５μＭである。
図６では、ＣＣＫ８キットによるポリペプチドのウイルス阻害活性の測定は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのＩＣ50は４．３６μＭであり、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのＩＣ50は３．５６μＭであることを示した。
（１）まず、増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに１×１０4個、３７℃、５％ ＣＯ2の条件下で２４時間培養した。
（２）２％ＦＢＳ含有ＭＥＭを使用してポリペプチド薬物（３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ及び３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ）を２倍段階希釈し、希釈濃度は４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１３μＭであり、１ウェルあたり１００μｌ、別の９６ウェルプレートに加え、各濃度は３点測定（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）を行った。
（３）希釈されたウイルスを上記ウェルに１ウェルあたり１００μＬ加え、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェルをそれぞれ対照とし、ウイルスの最終濃度は、０．１ ＭＯＩである。
（４）混合物を細胞が播種された９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２４時間培養した後、ＣＣＫ８キットによりウイルスに対するポリペプチドの阻害活性を測定した。
（５）ウイルス感染に対するさまざまな濃度のポリペプチドの阻害率は、次の式を使用して計算されました。
阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）。ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
結果は、図５に示され、ポリペプチドＰ２から改造されたポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す）、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す）及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す）は、いずれもＥＶ７１阻害剤として作用を発揮し、またウイルスへの阻害を向上させる効果を奏することもできる。ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定された３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡのＩＣ50は３．２５μＭである。
図６では、ＣＣＫ８キットによるポリペプチドのウイルス阻害活性の測定は、３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰのＩＣ50は４．３６μＭであり、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩのＩＣ50は３．５６μＭであることを示した。
【0030】
実施例６：ポリペプチドＰ１の細胞膜透過効率の検出
１．材料：
ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ（ＮＥＳＴ）は、プロモーター公司から購入され、ＰＢＳ、ＤＡＰＩ、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドＰ１は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示された。
２．実験手順
実験は、２つの群に分けられ、ＥＶ７１ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、１つの実験群ではＥＶ７１ウイルスを添加してからポリペプチドＰ１を加え、別の実験群ではウイルスを添加せずポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光染色の手順は、以下の通りである。：
（１）ＲＤ細胞１ｍｌを免疫蛍光用ディッシュに敷き、３０％コンフルエントに達したら試料を収集した。
（２）培地を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残った培地を３回、各回５分間洗い流した。
（３）４％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、パラホルムアルデヒド４ｇをＰＢＳ １００ｍｌに溶解させた。調製された４％パラホルムアルデヒド１ｍｌを各ディッシュに加え、５ｍｉｎ反応させ、細胞を固定化した。
（４）４％パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残ったパラホルムアルデヒドを３回、各回５分間洗い流した。
（５）１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ディッシュに加え、１５ｍｉｎ反応させた。
（６）反応液を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌを再度追加し、残った反応液を３回、各回５分間洗い流した。
（７）ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識（ＦＩＴＣ）付きポリペプチドを使用し、ＲＤ細胞のその細胞膜透過効率を検出した。２群の実験を個別に設定し、第１群は、未処理対照群であり、それぞれＲ８、Ｐ１及びＰ２を加え、第２群は、ＥＶ７１感染群であり、ＥＶ７１感染後に、さらに、それぞれＲ８、Ｐ１及びＰ２を加えた。２群の実験は同時に実行され、ウイルスＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，感染多重度）＝０．１であり、濃度１μＭであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから１２時間後に試料を収集し、細胞を固定化して免疫蛍光染色を行い、細胞核をＤＡＰＩ溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図１４に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドＰ１は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
１．材料：
ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ（ＮＥＳＴ）は、プロモーター公司から購入され、ＰＢＳ、ＤＡＰＩ、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドＰ１は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示された。
２．実験手順
実験は、２つの群に分けられ、ＥＶ７１ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、１つの実験群ではＥＶ７１ウイルスを添加してからポリペプチドＰ１を加え、別の実験群ではウイルスを添加せずポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光染色の手順は、以下の通りである。：
（１）ＲＤ細胞１ｍｌを免疫蛍光用ディッシュに敷き、３０％コンフルエントに達したら試料を収集した。
（２）培地を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残った培地を３回、各回５分間洗い流した。
（３）４％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、パラホルムアルデヒド４ｇをＰＢＳ １００ｍｌに溶解させた。調製された４％パラホルムアルデヒド１ｍｌを各ディッシュに加え、５ｍｉｎ反応させ、細胞を固定化した。
（４）４％パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌで残ったパラホルムアルデヒドを３回、各回５分間洗い流した。
（５）１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液をＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ディッシュに加え、１５ｍｉｎ反応させた。
（６）反応液を吸引し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ １ｍｌを再度追加し、残った反応液を３回、各回５分間洗い流した。
（７）ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識（ＦＩＴＣ）付きポリペプチドを使用し、ＲＤ細胞のその細胞膜透過効率を検出した。２群の実験を個別に設定し、第１群は、未処理対照群であり、それぞれＲ８、Ｐ１及びＰ２を加え、第２群は、ＥＶ７１感染群であり、ＥＶ７１感染後に、さらに、それぞれＲ８、Ｐ１及びＰ２を加えた。２群の実験は同時に実行され、ウイルスＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，感染多重度）＝０．１であり、濃度１μＭであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから１２時間後に試料を収集し、細胞を固定化して免疫蛍光染色を行い、細胞核をＤＡＰＩ溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図１４に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドＰ１は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
【0031】
実施例７：ポリペプチドＰ１の細胞毒性測定
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＰ１は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中のＰ１最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＰ１を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＰ１は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中のＰ１最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＰ１を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0032】
結果は、図１５及表４に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、１００μＭ ポリペプチドを加えた細胞生存率は対照群と有意差がなく、本研究で使用されるポリペプチドＰ１は１００μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0033】
【表4】
【0034】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチドＰ１の細胞毒性を検出し、８０％コンフルエントのＲＤ細胞では、濃度勾配でポリペプチドＰ１を加え、濃度はそれぞれ０μＭ（対照群）、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭであり、各濃度勾配ごとに３つの並行実験が設けられた。２４時間後に試料を収集し、ＣＣＫ－８キットにより細胞活性を検出した。結果は、１００μＭ ポリペプチドＰ１を加えた細胞生存率は対照群と有意差がなく、ポリペプチドＰ１は１００μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0035】
実施例８：ポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰの細胞毒性測定
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中のＥＰ最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＥＰを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中のＥＰ最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＥＰを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0036】
結果は、図１６及表５に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、ポリペプチド１００μＭを加えた細胞生存率は対照群（未処理細胞）と有意差がなく、本研究で使用されるポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰは１００μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0037】
【表5】
【0038】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰの細胞毒性を検出し、８０％コンフルエントのＲＤ細胞では、濃度勾配でポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰを加え、濃度はそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭであり、各濃度勾配ごとに３つの並行実験が設けられた。２４時間後に試料を収集し、ＣＣＫ－８キットにより細胞活性を検出した。結果は、未処理細胞の細胞活性を１００％とし、ポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰ １００μＭを加えた細胞生存率は、未処理対照群と基本的に一致しており、ポリペプチド３Ａ－ＴＡＴ－ＥＰは１００μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0039】
実施例９：ポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡの細胞毒性測定
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡ最終濃度がそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0040】
結果は、図１７及表６に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、ポリペプチド１００μＭを加えた細胞生存率は対照群（未処理細胞）と基本的に一致しており、本研究で使用されるポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡは５０μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0041】
【表6】
【0042】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡの細胞毒性を検出し、８０％コンフルエントのＲＤ細胞では、それぞれ濃度勾配でポリペプチドＥＰ－ＤＲＩ及びＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡを加え、濃度はそれぞれ０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭである。２４時間後に試料を収集し、ＣＣＫ－８キットにより細胞活性を検出した。結果は、ポリペプチド ５０μＭを加えた細胞生存率は対照群と基本的に一致しており、ポリペプチド３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡは５０μＭ以内で細胞毒性がないことを証明した。
【0043】
実施例１０：ポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート 、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は飛げい公司から購入され、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）は友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体として在ＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．ウイルスの増幅：
（１）ＲＤ細胞を５つの１００ｍｍディッシュに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、１０7 ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１ウイルス １μｌを加えた。
（３）２日間後、細胞にＣＰＥ（細胞変性効果）現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになる時に試料を収集した。
（４）１００ｍｍディッシュ中の上清を１５ｍｌ 遠心チューブに吸引し、５００ｇ、５ｍｉｎで遠心した。
（５）次いで、上清を採取して別の新しい１５ｍｌ 遠心チューブに入れ、５０ｍｌ 注射器及び０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
（６）ウイルス抽出ＲＮＡ１００μｌを採取して前に抽出された既知力価のウイルスＲＮＡとともにワンステップｑＲＴ－ＰＣＲを実行し、ウイルス力価を測定した。
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット（Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート 、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は飛げい公司から購入され、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）は友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体として在ＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．ウイルスの増幅：
（１）ＲＤ細胞を５つの１００ｍｍディッシュに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、１０7 ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１ウイルス １μｌを加えた。
（３）２日間後、細胞にＣＰＥ（細胞変性効果）現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになる時に試料を収集した。
（４）１００ｍｍディッシュ中の上清を１５ｍｌ 遠心チューブに吸引し、５００ｇ、５ｍｉｎで遠心した。
（５）次いで、上清を採取して別の新しい１５ｍｌ 遠心チューブに入れ、５０ｍｌ 注射器及び０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
（６）ウイルス抽出ＲＮＡ１００μｌを採取して前に抽出された既知力価のウイルスＲＮＡとともにワンステップｑＲＴ－ＰＣＲを実行し、ウイルス力価を測定した。
【0044】
３．複数種の細胞のポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
（１）それぞれ異なる細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍＬ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭである異なるポリペプチドを加えた。ポリペプチド無添加群を対照とした。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）さらに、ウェル中に７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
（１）それぞれ異なる細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し（１ウェルあたりの２％血清含有ＭＥＭ培地の添加量は０．５ｍｌである）、各ウェルに１０6 ＰＦＵ／ｍＬ ＥＶ７１ウイルス ５μｌを加えた。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭである異なるポリペプチドを加えた。ポリペプチド無添加群を対照とした。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）さらに、ウェル中に７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0045】
ポリペプチドＥＰ－ＰＡ、ＥＰ－ＣＨＯＬ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡの抗ウイルス効果のうちの抗ＥＶ７１活性の検出結果は、図１８、表７～表１０に示された。
【0046】
【表7】
【0047】
【表8】
【0048】
【表9】
【0049】
【表10】
【0050】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチドＥＰ－ＰＡ、ＥＰ－ＣＨＯＬ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡの抗ウイルス効果を検出した、８０％コンフルエントのＲＤ細胞では、ＥＶ７１（ＭＯＩ＝０．１）を加え、１時間感染後、それぞれ濃度勾配でポリペプチドＥＰ－ＰＡ、ＥＰ－ＣＨＯＬ、３Ａ－ＥＰ－ＤＲＩ及び３Ａ－ＥＰ－ＰＥＧ４－ＰＡを加え、全てのポリペプチド濃度は、いずれも０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭに設けられた。２４時間後に試料を収集し、細胞全ＲＮＡを抽出し、蛍光定量ＰＣＲによりウイルスゲノムＲＮＡの発現レベルを検出し、ポリペプチドが添加されないサンプルのみに感染したものを対照群とした。結果は、全てのポリペプチドは、いずれも抗ＥＶ７１活性を有し、ポリペプチド濃度を高めるとウイルスＲＮＡの発現レベルを有意に阻害できることを示した。
ポリペプチドＰ２、ＥＲ、ＥＲ－ＤＲＩの抗ＣＶＡ１６ウイルス効果の検出結果は、図２２、表１１～１５に示した。
ポリペプチドＰ２、ＥＲ、ＥＲ－ＤＲＩの抗ＣＶＡ１６ウイルス効果の検出結果は、図２２、表１１～１５に示した。
【0051】
【表11】
【0052】
【表12】
【0053】
【表13】
【0054】
【表14】
【0055】
【表15】
【0056】
ＲＤ細胞を使用してポリペプチドＰ２、ＥＲ、ＥＲ－ＤＲＩの抗ウイルス効果を検出し、膜透過ペプチドＲ８及びＴＡＴを対照とした。８０％コンフルエントのＲＤ細胞では、ＥＶ７１（ＭＯＩ＝０．１）を加え、１時間感染した後、それぞれ特定の濃度勾配でポリペプチドＰ２、ＥＲ、ＥＲ－ＤＲＩ、Ｒ８及びＴＡＴを加え、全てのポリペプチドの濃度は、いずれも０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭに設定された。２４時間感染した後に、ＣＣＫ－８キットによりウイルスに対するポリペプチドの阻害活性を測定した。ポリペプチドの阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）。ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。結果は、ポリペプチドＰ２、ＥＲ、ＥＲ－ＤＲＩは、いずれもＣＶＡ１６を有意に阻害できるが、膜透過ペプチドＲ８及びＴＡＴは、ウイルスに作用を奏していない。Ｐ２のＩＣ50は、１．５３３μＭであり、ＥＲのＩＣ50は、３．２１１μΜであり、ＥＲ－ＤＲＩのＩＣ50は、０．８５６μΜである。
【0057】
実施例１１：マウス体内のＥＶ７１及びＣＶＡ１６に対するポリペプチドＰ１の抗ウイルス活性の検出
１．材料
Ｐ１：ＲＲＲＲＲＲＲＲＡＩＳＤＬＬＡＳは、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＰ１の抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス８匹をランダムに２つの群に分けられ、各群あたり４匹である。これらの新生児マウス８匹は、腹腔内注射にて用量が１０8ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１でチャレンジされた。
（２）チャレンジされるとともに、１つの群は、Ｐ１ポリペプチドを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射されて治療群とし、別の群は、同量のＰＢＳを注射されて対照群とした。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌで研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
結果は、図７及び表１６に示され、Ｐ１は、マウス体内のＥＶ７１ウイルス量を有意に低減した。
３． マウス体内のＣＶＡ１６に対するＰ１の抗ウイルス活性の検出は、以上と同じである。
１．材料
Ｐ１：ＲＲＲＲＲＲＲＲＡＩＳＤＬＬＡＳは、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＰ１の抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス８匹をランダムに２つの群に分けられ、各群あたり４匹である。これらの新生児マウス８匹は、腹腔内注射にて用量が１０8ＰＦＵ／ｍｌのＥＶ７１でチャレンジされた。
（２）チャレンジされるとともに、１つの群は、Ｐ１ポリペプチドを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射されて治療群とし、別の群は、同量のＰＢＳを注射されて対照群とした。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌで研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
結果は、図７及び表１６に示され、Ｐ１は、マウス体内のＥＶ７１ウイルス量を有意に低減した。
３． マウス体内のＣＶＡ１６に対するＰ１の抗ウイルス活性の検出は、以上と同じである。
【0058】
結果は、図８及表１７に示され、Ｐ１がマウス体内のＣＶＡ１６のウイルス量を有意に低減させることを示した。
【0059】
【表16】
【0060】
【表17】
【0061】
実施例１２：ＲＤ細胞内のＥＶ７１に対するポリペプチドＣＲの阻害活性の検出
（１）増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル（ＤＭＥＭ）を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はＭＯＩ＝０．１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭであるＣＲポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設置した。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に、ウイルスのみを添加する対照群では病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（５）３７℃で２ｈ静置した。
（６）マイクロプレートリーダーでＯＤ450における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）であり、ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
結果は、図９及び表１８に示され、ＥＶ７１に対するＣＲのＩＣ50は、１．７μＭである。
（１）増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル（ＤＭＥＭ）を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はＭＯＩ＝０．１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭであるＣＲポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設置した。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に、ウイルスのみを添加する対照群では病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（５）３７℃で２ｈ静置した。
（６）マイクロプレートリーダーでＯＤ450における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）であり、ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
結果は、図９及び表１８に示され、ＥＶ７１に対するＣＲのＩＣ50は、１．７μＭである。
【0062】
【表18】
【0063】
実施例１３：マウス体内のＥＶ７１及びＣＶＡ１６に対するポリペプチドＣＲの抗ウイルス活性
１．材料
ポリペプチドＣＲ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＣＲは、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＣＲの抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス８匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり４匹である。これらの新生児マウスの８匹に腹腔内注射にて１０8ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１用量でチャレンジした。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、ＣＲを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射し、別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射した。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
結果は、図１０及表１９に示され、ＣＲがマウス体内のＥＶ７１ウイルス量を有意に低減させることを示した。
１．材料
ポリペプチドＣＲ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＧＣＲは、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＣＲの抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス８匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり４匹である。これらの新生児マウスの８匹に腹腔内注射にて１０8ＰＦＵ／ｍｌ ＥＶ７１用量でチャレンジした。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、ＣＲを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射し、別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射した。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
結果は、図１０及表１９に示され、ＣＲがマウス体内のＥＶ７１ウイルス量を有意に低減させることを示した。
【0064】
３．マウス体内のＣＶＡ１６に対するＣＲの抗ウイルス活性の検出は、以上と同じである。
結果は、図１１及表２０に示され、ＣＲがマウス体内のＣＶＡ１６のウイルス量を有意に低減させることを示した。
結果は、図１１及表２０に示され、ＣＲがマウス体内のＣＶＡ１６のウイルス量を有意に低減させることを示した。
【0065】
【表19】
【0066】
【表20】
【0067】
実施例１４：マウス体内のＥＲ－ＤＲＩの毒性評価
１．材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＲＩは、商業的に合成されたものであり、１０日齢の新生児マウス１２匹を採用した。
２．マウス体内のＥＲ－ＤＲＩの毒性評価
（１）１０日齢の新生児マウス１２匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり６匹であり、１つの群は、ＥＲ－ＤＲＩを２０ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内注射し、３日間の注射を連続した。別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射した。
（２）マウスの体重を毎日記録し、合計１５日である。
（３）マウスに４週間投与した後、マウスを安楽死させ、解剖し、その脳、肝臓、肺、腎臓を分離させ、ＨＥ染色を行った。
結果は、図１２に示され、２０ｍｇ／ｋｇのポリペプチド注射群とＰＢＳ群は体重が有意差がない。図１３のＨＥ染色像より、２０ｍｇ／ｋｇのポリペプチド注射群とＰＢＳ群は脳、肝臓、肺、腎臓に明らかな病理学的変化はなく、有意差がないことを示した。
１．材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＲＩは、商業的に合成されたものであり、１０日齢の新生児マウス１２匹を採用した。
２．マウス体内のＥＲ－ＤＲＩの毒性評価
（１）１０日齢の新生児マウス１２匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり６匹であり、１つの群は、ＥＲ－ＤＲＩを２０ｍｇ／ｋｇで１日１回腹腔内注射し、３日間の注射を連続した。別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射した。
（２）マウスの体重を毎日記録し、合計１５日である。
（３）マウスに４週間投与した後、マウスを安楽死させ、解剖し、その脳、肝臓、肺、腎臓を分離させ、ＨＥ染色を行った。
結果は、図１２に示され、２０ｍｇ／ｋｇのポリペプチド注射群とＰＢＳ群は体重が有意差がない。図１３のＨＥ染色像より、２０ｍｇ／ｋｇのポリペプチド注射群とＰＢＳ群は脳、肝臓、肺、腎臓に明らかな病理学的変化はなく、有意差がないことを示した。
【0068】
実施例１５ ＲＤ細胞のＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩの毒性の検出
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ０．４６μＭ、２．３４μＭ、４．６８μＭ、９．３７μＭ、１８．７５μＭ、３７．５μＭ、７５μＭ、１５０μＭ、３００μＭになるように、ＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ０．４６μＭ、２．３４μＭ、４．６８μＭ、９．３７μＭ、１８．７５μＭ、３７．５μＭ、７５μＭ、１５０μＭ、３００μＭになるように、ＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩを加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0069】
結果は、図１９及び表２１、２２に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、ＴＡＴ－ＥＲ－ＤＲＩの５０％細胞毒性濃度（ＣＣ50）は１１７μＭであり、ＴＡＴ－ＥＲのＣＣ50は２９０μＭと計算された。本研究で使用されるポリペプチドＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩの５０％細胞毒性濃度（２９０μＭ、１１７μＭ）は、その５０％阻害濃度（１．２６μＭ、０．６４μＭ）よりも、毒性が非常に低い薬物であることを証明した。
【0070】
【表21】
【0071】
【表22】
【0072】
実施例１６ ＲＤ細胞のＥＶ７１に対するＥＲ及びＥＲ－ＤＲＩの阻害活性の検出
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット （Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート 、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、飛げい公司から購入され、ワンステップｑ－ｐｃｒキット（Ｔａｋａｒａ）は、友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体として在ＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．細胞中のポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
（１）増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル（ＤＭＥＭ）を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はＭＯＩ＝０．１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭであるＥＲ－ＤＲＩ及びＥＲポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設定した。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に、ウイルスのみを添加する対照群で病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（５）３７℃で２ｈ静置した。
（６）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）であり、ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
１．材料
トータルＲＮＡ抽出キット （Ｏｍｅｇａ）、２４ウェルプレート 、１００ｍｍディッシュ、５０ｍｌ注射器は、迪躍創新公司から購入され、０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、飛げい公司から購入され、ワンステップｑ－ｐｃｒキット（Ｔａｋａｒａ）は、友名公司から購入され、ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲプロセスで使用される水はＤＥＰＣ水であり、実験は全体として在ＲＮａｓｅフリーの環境で実行された。
２．細胞中のポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
（１）増殖状態が良いＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル（ＤＭＥＭ）を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はＭＯＩ＝０．１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭであるＥＲ－ＤＲＩ及びＥＲポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設定した。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に、ウイルスのみを添加する対照群で病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（５）３７℃で２ｈ静置した。
（６）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率＝（処理されたＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）×１００％／（未処理ＯＤウェル－ウイルスのみ添加ＯＤウェル）であり、ここで、ＯＤはＯＤ450－ＯＤ630の値を指す。
【0073】
結果は、図２０及び表２３、２４、２５に示され、ＥＲがＲＤ細胞でＥＶ７１を阻害するＩＣ50は、１．２６μＭであり、ＥＲ－ＤＲＩがＲＤ細胞でＥＶ７１を阻害するＩＣ50は０．６４μＭであることを示した。
【0074】
【表23】
【0075】
【表24】
【0076】
【表25】
【0077】
実施例１７ マウス体内のＥＲ－ＤＲＩの抗ＥＶ７１活性の検出
１． 実験材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＲＩは、商業的に合成されたものであり、２日齢の新生児マウス１０匹を採用した。
２．実験手順
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス１０匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり５匹である。これらの新生児マウス１０匹は、腹腔内注射にて用量１０8ＰＦＵ ＥＶ７１でチャレンジされた。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、ＥＲ－ＤＲＩポリペプチドを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射して薬物治療群とし、別の群は、同量のＰＢＳを注射して対照群とした。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、肺を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１． 実験材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＲＩは、商業的に合成されたものであり、２日齢の新生児マウス１０匹を採用した。
２．実験手順
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス１０匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり５匹である。これらの新生児マウス１０匹は、腹腔内注射にて用量１０8ＰＦＵ ＥＶ７１でチャレンジされた。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、ＥＲ－ＤＲＩポリペプチドを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射して薬物治療群とし、別の群は、同量のＰＢＳを注射して対照群とした。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、肺を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0078】
結果は、図２１及表２６に示され、ＥＲ－ＤＲＩがマウス肺内のＥＶ７１ウイルス量を有意に低減させることを示した。
【0079】
【表26】
【0080】
実施例１８ ＲＤ細胞のポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５の毒性アッセイ
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μｌである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ３．０６２５μＭ、６．１２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃放置４ｈ。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）ＲＤ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μｌである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ３．０６２５μＭ、６．１２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃放置４ｈ。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0081】
結果は、図２３及表２７、２８、２９に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、ＢＰ８、ＢＰ１０は、ポリペプチド２００μＭを加えた細胞生存率が対照群（未処理細胞）と基本的に一致し、ＢＰ１５は、ポリペプチド１００μＭを加えた細胞生存率が対照群（未処理細胞）と基本的に一致し、ポリペプチド２００μＭを加えた後に細胞生存率が２０％に低下した。ＢＰ８、ＢＰ１０は２００μＭ以で細胞毒性がなく、ＢＰ１５は１００μＭ以内で細胞毒性がないことを示した。
【0082】
【表27】
【0083】
【表28】
【0084】
【表29】
【0085】
実施例１９ Ｖｅｒｏ細胞のポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５の毒性アッセイ
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ３．０６２５μＭ、６．１２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
１．実験材料
ＣＣＫ－８試薬（ＭＣＥ）は、プロモーター公司から購入された。
２．実験手順
ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
（１）Ｖｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μＬである。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地を２％血清含有ＭＥＭ培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ３．０６２５μＭ、６．１２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（３）ポリペプチドを加えてから２４時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬ＣＣＫ－８ １０μｌを加え、均一に混合した。
（４）３７℃で２ｈ静置した。
（５）マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０における吸光度を検出した。
【0086】
結果は、図２４及び表３０、３１、３２に示され、未処理細胞の細胞生存率を１００％として、ＢＰ８、ＢＰ１０は、ポリペプチド２００μＭを加えた細胞生存率が対照群（未処理細胞）と基本的に一致し、ＢＰ１５は、ポリペプチド１００μＭを加えた細胞生存率が対照群（未処理細胞）と基本的に一致し、ポリペプチド２００μＭを加えた後に細胞生存率が２０％に低下した。ＢＰ８、ＢＰ１０は２００μＭ以内で細胞毒性がなく、ＢＰ１５は１００μＭ以内で細胞毒性がないことを示した。ＲＤ細胞及びＶｅｒｏ細胞における薬物の毒性は、相対的に一致する。
【0087】
【表30】
【0088】
【表31】
【0089】
【表32】
【0090】
実施例２０ ＲＤ細胞のポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５の抗ＣＶＢ５効果の検出
１．材料
ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示され）、ＢＰ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示され）及びＢＰ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示され）を採用した。それらのポリペプチドは、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５の抗ウイルス効果への影響
（１）ＲＤ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ５ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地に交換し、１ウェルにあたり０．５ｍｌであり、ＭＯＩ＝０．０１で、対照群にＣＶＢ５ウイルスが含まれない。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．７８μＭ、１．５６μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭであるポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１．材料
ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示され）、ＢＰ１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示され）及びＢＰ１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示され）を採用した。それらのポリペプチドは、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５の抗ウイルス効果への影響
（１）ＲＤ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ５ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地に交換し、１ウェルにあたり０．５ｍｌであり、ＭＯＩ＝０．０１で、対照群にＣＶＢ５ウイルスが含まれない。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が０．７８μＭ、１．５６μＭ、３．１３μＭ、６．２５μＭであるポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0091】
結果は、図２５及び表３３、３４、３５に示され、ポリペプチドＢＰ８、ＢＰ１０及びＢＰ１５はいずれもＣＶＢ５を有意に阻害できることを示した。ＢＰ８のＩＣ50は１．５４５μＭであり、ＢＰ１０のＩＣ50は１．３３５μΜであり、ＢＰ１５のＩＣ50は６．７５８μΜである。
【0092】
【表33】
【0093】
【表34】
【0094】
【表35】
【0095】
実施例２１ Ｖｅｒｏ細胞のポリペプチドＢＰ８の抗ＣＶＢ３効果の検出
１．材料
ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示され）は、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＢＰ８の抗ＣＶＢ３ウイルス効果への影響
（１）Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ３ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地に交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌであり、対照群にＣＶＢ３ウイルスが含まれなく、ウイルスのＭＯＩ＝０．０１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、５μＭ、１０μＭであるポリペプチドＢＰ８を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１．材料
ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示され）は、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＢＰ８の抗ＣＶＢ３ウイルス効果への影響
（１）Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ３ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地に交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌであり、対照群にＣＶＢ３ウイルスが含まれなく、ウイルスのＭＯＩ＝０．０１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、５μＭ、１０μＭであるポリペプチドＢＰ８を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0096】
結果は、図２６及び表３６に示され、ポリペプチドＢＰ８がＣＶＢ３の複製を阻害できることを示した。ＢＰ８のＩＣ50は、４．１２５μＭである。
【0097】
【表36】
【0098】
実施例２２ マウス体内のポリペプチドＢＰ８の抗ＣＶＢ５効果の検出
１．材料：ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す）は、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＢＰ８の抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス１０匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり５匹である。これらの新生児マウスの１０匹は、腹腔内注射にて用量１０8ＰＦＵ ＣＶＢ５でチャレンジされた。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰ８で腹腔内注射され、別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射された。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１．材料：ポリペプチドＢＰ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示す）は、商業的に合成されたものである。２日齢のＩＣＲ系新生児マウスを採用した。
２．マウス体内のポリペプチドＢＰ８の抗ウイルス活性
（１）２日齢のＩＣＲ系新生児マウス１０匹をランダムに２つの群に分け、各群あたり５匹である。これらの新生児マウスの１０匹は、腹腔内注射にて用量１０8ＰＦＵ ＣＶＢ５でチャレンジされた。
（２）チャレンジすると同時に、１つの群は、１０ｍｇ／ｋｇのＢＰ８で腹腔内注射され、別の群は、同量のＰＢＳを対照として注射された。
（３）ポリペプチド及びＰＢＳを１２時間おきに１回注射し、チャレンジ後５日目まで注射し続けた。
（４）５日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Ｔｒｉｚｏｌにより研磨した後、組織から全ＲＮＡを抽出した。
（５）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0099】
結果は、図２７及び表３７に示され、投与群（ＰＢ１０）は、ブランク対照群（ＰＢＳ）よりも、ウイルス粒子のコピー数が顕著に低下し、ウイルス粒子が約８０倍低減していることを示した。
【0100】
【表37】
【0101】
実施例２３ Ｖｅｒｏ細胞のポリペプチドＥＲ－ＤＲＩの抗ＣＶＡ６ウイルス効果の検出
１．材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示す）は、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＥＲ－ＤＥＩの抗ＣＶＡ６ウイルス効果への影響
（１）Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ３ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地、１ウェルあたり０．５ｍｌであり、対照群にＣＶＡ６ウイルスが含まれなく、ウイルスのＭＯＩ＝０．０１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、５μＭ、１０μＭであるポリペプチドＢＰ８を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）さらに、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、 １２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
１．材料
ポリペプチドＥＲ－ＤＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に示す）は、商業的に合成されたものである。
２．ポリペプチドＥＲ－ＤＥＩの抗ＣＶＡ６ウイルス効果への影響
（１）Ｖｅｒｏ細胞を２４ウェルプレートに播種した。
（２）７０％～８０％コンフルエントに達したら、１０％血清含有ＭＥＭ培地をＣＶＢ３ウイルスの２％血清を含むＭＥＭ培地、１ウェルあたり０．５ｍｌであり、対照群にＣＶＡ６ウイルスが含まれなく、ウイルスのＭＯＩ＝０．０１である。
（３）１時間後、それぞれ最終濃度が２．５μＭ、５μＭ、１０μＭであるポリペプチドＢＰ８を加えた。
（４）ウイルスに感染してから２４時間後に試料を収集し、トータルＲＮＡ抽出キットでＲＮＡを抽出した。
（５）上清を捨て、ウェルにＴＲＫ細胞溶解液３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（６）さらに、ウェルに７０％エタノール（ＤＥＰＣ）３５０μｌを加え、シェーカーで５ｍｉｎ振盪した。
（７）ウェルから溶液を取り出し、ＲＮＡ抽出用カラムに移し、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（８）回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、１２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（９）ＲＮＡ洗浄バッファー１を加え、１２０００ｇで３０ｓ遠心した。
（１０）ＲＮＡ洗浄バッファー２を加え、 １２０００ｇで１ｍｉｎ遠心した。
（１１）ステップ（１０）を繰り返した。
（１２）洗浄バッファーを加えずカラムを１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心し、残留ＲＮＡ洗浄バッファーを完全に除去した。
（１３）ＤＥＰＣ水 ５０μｌを加え、１２０００ｇで２ｍｉｎ遠心した。
（１４）ＲＮＡサンプル２μｌを採取し、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキットによりリアルタイム定量ＰＣＲを行った。
【0102】
結果は、図２８及び表３８に示され、ポリペプチドＥＲ－ＤＥＩのいずれもはＣＶＡ６の複製を阻害できることを示した。ＢＰ８のＩＣ50は、０．６２５μＭ未満である。
【0103】
【表38】
【0104】
本発明により提供されるポリペプチド及びそれらの用途は、上記に詳細に記載されている。本明細書では、具体的な例を使用して、本発明の原理及び実施態様を説明しており、以上の実施例の説明は、本発明の方法及びそのコアアイデアの理解を助けるためにのみ使用されている。当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、本発明に幾つかの改良及び修飾を加えることができ、これらの改良及び修飾も本発明の請求の範囲の保護範囲に含まれることを理解すべきである。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】