特許 7252758 ヒト及び／又は動物における免疫応答を調節及び／又は刺激するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-03-28

(45)【発行日】2023-04-05

(54)【発明の名称】ヒト及び／又は動物における免疫応答を調節及び／又は刺激するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/06 20060101AFI20230329BHJP

   A23K 10/16 20160101ALI20230329BHJP

   A61K 31/715 20060101ALI20230329BHJP

   A61K 36/064 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 1/14 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230329BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230329BHJP

【ＦＩ】

A61K36/06

A23K10/16

A61K31/715

A61K36/064

A61P1/12

A61P1/14

A61P29/00

A61P33/00

A61P37/02

A61P37/04

A61P43/00 121

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2018500382

(86)(22)【出願日】2016-07-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-08-09

(86)【国際出願番号】 EP2016066446

(87)【国際公開番号】W WO2017005936

(87)【国際公開日】2017-01-12

【審査請求日】2019-05-15

【審判番号】

【審判請求日】2021-07-20

(31)【優先権主張番号】15176029.5

(32)【優先日】2015-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】517180394

【氏名又は名称】ダンスター フェルマン アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100108143

【弁理士】

【氏名又は名称】嶋崎 英一郎

(72)【発明者】

【氏名】カステックス，マチュー

【合議体】

【審判長】井上 典之

【審判官】齋藤 恵

【審判官】馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－２０３１６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０００８７６７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１２年，Ｖｏｌｕｍｅ ７， Ｉｓｓｕｅ ７， ｅ４０６４８，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０６４８

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K36/00-36/9068, A61P1/00-43/00

ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物であって、
前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖は、キチン、マンナンオリゴ糖、ベータ１，３グルカン及びベータ１，６グルカンであり、その量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である組成物。

【請求項2】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～１５乾燥重量％である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％である、請求項２に記載の組成物。

【請求項5】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１１、１２、１３、１４又は１５乾燥重量％である、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記少なくとも１種のカンジダ種がカンジダ・ユチリスである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖が、サッカロマイセス種、ハンセニアスポラ種、ハンゼヌラ種、クルイベロマイセス種、メチニコビア種、ピキア種、スターメレラ種及びトルラスポラ種又はこれらの混合種由来である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

動物において免疫応答を調節及び／又は刺激するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

動物の腸管の健康、腸管の完全性及び腸管の形態を改善するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

動物の抗炎症応答を刺激するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

飼育動物の成長成績パラメータ及び飼料要求率を改善するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

飼育動物の罹患率、特には抗生物質による治療及び死亡率を低減するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項18】

飼育動物の死亡率を低下させるのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

動物の下痢を減少させるのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

腸管病原体に対する感受性を低下させるのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

寄生虫侵襲及び関連疾患に対する動物の感受性を低下させるのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

水生動物の皮膚粘液の産生を改善するのに使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト及び／又は動物における免疫応答を調節及び／又は刺激するための組成物及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酵母及びその誘導体は、主としてデクチン１及びβ―グルカン経路を通じた又は消化管内で雑菌との直接の結合を介した、腸管粘膜表面で開始される抗真菌免疫応答の活性化を通じて、動物及びヒトの腸管の健康を改善するための栄養補助食品としてますます使用されるようになっている。両方の作用は、酵母細胞壁内での免疫抗原発現及び腸管上皮細胞内での抗原受容体発現の特異性に依存している。しかしながら、よく知られているβ―グルカン／デクチン１相互作用のほかに、免疫応答の活性化を仲介する、より詳しくは抗真菌免疫応答の活性化を仲介する他の「酵母リガンド」― 受容体相互作用が重要な役割を果たしているかもしれず、また酵母細胞壁の組成及び構造に直接依存していることに注意すべきである。最近では、それらの経路を通じた免疫応答の刺激を謳った非特異的で不活性な酵母製品を使用した市場選択肢が存在している。しかしながら、これらの製品は組成及び成果の点で特異性及び一貫性を欠いている。動物又はヒトの免疫応答の刺激を増強する改善された酵母製品を提供することが非常に望ましいことである。

【発明の概要】

【0003】

本開示においては、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖（ｐａｒｉｅｔａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を提供する。驚くことに、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖を、少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖と組み合わせると、配合率が低いときでさえ、動物又はヒトの免疫応答の刺激を増強することになる。複数の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１～９９乾燥重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％である。代替の又は補完的な実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として１～１００重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として２０～８０重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種がカンジダ・ユチリスである。他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種は、サッカロマイセス種、ハンセニアスポラ種、ハンゼヌラ種、クルイベロマイセス種、メチニコビア種、ピキア種、スターメレラ種及びトルラスポラ種又はこれらの混合種である。前記少なくとも１種の異なる酵母種には、これら酵母種のいずれかに由来の種間雑種も含まれる。

【0004】

本開示はまた、動物及び／又はヒトにおいて免疫応答を調節及び／又は刺激するのに使用するための前記実施態様で規定した前記組成物の使用を提供する。他の態様においては、前記動物は家畜である。

【0005】

本開示はまた、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を動物に投与することにより、動物において免疫応答を調節及び／又は刺激する方法を提供する。１つの実施態様においては、その組合せ物は、食品添加剤、動物飼料又は医薬製品の形態である。他の実施態様においては、前記医薬製品は、経口又は非経口投与することができる。さらに他の実施態様においては、食品添加剤、動物飼料は、完全な動物用飼料又はヒト食餌に添加されるか又は直接に消費される錠剤、ペレット又はビードのように個別に添加される形式で提供することができる。またさらに他の実施態様においては、前記動物は家畜である。

【図面の簡単な説明】

【0006】

以上のように本発明について一般的に述べたが、添付図面を参照して好ましい実施態様を示す。

【0007】

【図1】図１は、実施例１のアッセイ１による、異なるサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株に由来する菌体壁多糖と共にインキュベートした単球による活性酸素種（ＲＯＳ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に対するラミナリン含有の効果を示す図である。

【0008】

【図2】図２は、実施例１のアッセイ２による、異なるサッカロマイセス・セレビシエ菌株に由来する菌体壁多糖の異なる濃度のブレンドを有する単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を示す図である。

【0009】

【図3】図３は、実施例１のアッセイ３による、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）菌株に由来する菌体壁多糖又はサッカロマイセス・セレビシエ菌株に由来する菌体壁多糖と共にインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に対するラミナリンの比較効果を示す図である。

【0010】

【図4a】図４ａは、実施例１のアッセイ４による、サッカロマイセス・セレビシエ菌株に由来する異なる濃度の菌体壁多糖のみで又はカンジダ・ユチリス菌株に由来する菌体壁多糖と組み合わせて、（ａ）ラミナリンを用いずにインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を示す図である。

【図4b】図４ｂは、実施例１のアッセイ４による、サッカロマイセス・セレビシエ菌株に由来する異なる濃度の菌体壁多糖のみで又はカンジダ・ユチリス菌株に由来する菌体壁多糖と組み合わせて、（ｂ）１００μｇのラミナリンを用いてインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を示す図である。

【0011】

【図5】図５は、実施例２による、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）に感染し、カプラン・マイヤー統計処理に従って菌体壁多糖の異なる組成物で処置したクルマエビ（ｐｅｎａｅｉｄ ｓｈｒｉｍｐ）の生存率関数を示す図である。

【0012】

【図6a】図６ａは、実施例３による、５週目及び１０週目の本開示による実験食餌で飼養した後の電子顕微鏡検査によるシーバス（ｓｅａ ｂａｓｓ）の遠位腸の微絨毛密度を示す図である。

【図6b】図６ｂは、実施例３による、５週目及び１０週目の本開示による実験食餌で飼養した後の電子顕微鏡検査によるシーバス（ｓｅａ ｂａｓｓ）の遠位腸の微絨毛密度を示す図である。

【0013】

【図7】図７は、実施例３による、１０週目の本開示による実験食餌で飼養した後の遠位腸の２つの免疫遺伝子（ＩＬ１β及びＩＬ１０）の発現を示す図である。

【0014】

【図8】図８は、実施例６による負荷１４日後のエビの生存率（平均±ＳＤ）を示し、同じ大文字で示されている平均は、処置間で違いがないことを示す図である（フィッシャー検定、５％確率）。

【0015】

【図9】図９は、実施例９による、タイセイヨウサケ（Ａｔｌａｎｔｉｃ ｓａｌｍｏｎ）及びニジマスのスパチュラ掻爬の方向を示す図である。

【0016】

【図10】図１０は、実施例９による、６０ＳＣ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ及び（５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（商標））で補完した実験食餌で８週間飼養したニジマス（Ｏ．ｍｙｋｉｓｓ）の皮膚試料の粘液産生レベルと関連する遺伝子の相対的発現レベルを示す図である。データはボックスプロットで表されている（ｎ＝１０／処置）。^＊は、有意な上方制御を示す；Ｐ＜０．０００１。

【0017】

【図11】図１１は、実施例９による、対照給餌魚及び実験食餌で５６日間飼養したニジマスの成長成績を示す図である。

【0018】

【図12】図１２は、実施例１０による、対照（Ａ及びＢ）、６０ＳＣ菌体壁多糖（Ｃ及びＤ）、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（Ｅ及びＦ）で１０週間飼養したシーバスの腸の例を示す図である。縮尺バーは、１０μｍ（画像Ａ、Ｃ、及びＥ）及び１μｍ（画像Ｂ、Ｄ、及びＦ）である。

【0019】

【図13】図１３は、実施例１０による、対照食餌並びに実験食餌を（Ａ）５週間及び（Ｂ）１０週間給餌したシーバスの後腸の微絨毛密度測定値を示す図である。アスタリスクは、対照食餌給餌魚と実験食餌を給餌した魚とに有意差があったことを示す（Ｐ＜０．００１）。

【0020】

【図14】図１４は、実験食餌で１０週間飼養した後のシーバス後腸試料の遺伝子発現データを示す図である。ボックスプロットは、実施例１０による、ＨＳＰ７０、ＰＣＮＡ、ＩＬ－１ベータ、及びＩＬ－１０のデータを示す。アスタリスクは、対照給餌魚と比較して、遺伝子発現の上方又は下方制御が有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。

【0021】

【図15】図１５は、実施例１１による、２０日目（負荷６日後）にアイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、及びＥ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）で負荷したブロイラーニワトリの平均腸病変スコアを示す図である。

【0022】

【図16】図１６は、実施例１１による治験の終了時のブロイラーニワトリの累積死亡率（％）を示す図である。

【0023】

【図17】図１７は、実施例１１による、２０日目（負荷６日後）のアイメリア・アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラで負荷したブロイラーニワトリの接合子嚢糞便排泄物（糞便物１グラム当たりのコクシジウム接合子嚢（ＯＰＧ））を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明

【0025】

真菌の細胞壁は、キチン、マンノースに基づく構造体及びベータ―グルカンを含む菌体壁多糖から主としてなる。グルカンは、最大で細胞壁の５０％を構成し、免疫応答を調節するために治療上使用される生理活性物質である。実験的に、これらの菌体壁多糖は、腫瘍成長や感染を含む様々な攻撃に対する防御を付与することができる。最近では、感染に対する宿主免疫応答の理解に向けて多くの進展がみられる。微生物に対する宿主応答を調節する新規な細胞表面分子が発見されている。この受容体は、病原体関連パターン認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれ、トル様受容体、Ｃ型レクチン受容体、スカベンジャー受容体、及び補体受容体が主に知られている。

【0026】

これらの免疫受容体は、細菌又は真菌の表面にある特異的リガンドによって活性化される。真菌の場合、β―１，３及びβ―１，６グリコシド結合によって結合したグルコース単位は、β―グルカンと称され、主としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から抽出されるが、抗菌作用、殺真菌作用及び抗腫瘍作用を誘導することが示されている。これらの分子が防御を誘導する機序は、免疫受容体を含んでおり、その１つはデクチン１、単球上の主要なβ―グルカン受容体である。それは、酵母細胞又は誘導体を認識することができる単一の細胞外Ｃ型レクチン様壁多糖認識ドメインを含んでおり、免疫応答の可動化に寄与する。
Ｃ型レクチン受容体デクチン１は、サッカロマイセス・セレビシエ由来のベータ―グルカンと結合し、特に食作用及びザイモサン、サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞壁抽出物等の粒子やサッカロマイセス・セレビシエ系統由来の他の酵母誘導体（他の酵母誘導体は限定されないが、酵母細胞壁、不活性酵母又は自己消化酵母）の除去を導く様々な経路の誘導に関与することが記載されている（Ｍａｒａｋａｌａら、Ｍａｍｍ Ｇｅｎｏｍｅ （２０１１） ２２：５５－６５）。脅威を検出する機構及び感染に対する迅速な応答は高度に保存されており、免疫応答はこの病原体リガンドの、例えばベータ―グルカンの、宿主細胞の表面上のＰＲＲへの結合によって部分的に引き起こされる。炎症に関連して、数時間以内に、非特異的自然免疫系が活性化される。局所炎症は、感染に対するこの迅速な応答に重要な役割を果たしている。自然免疫系における多くのプレーヤーは、好中球、単球、マクロファージ、補体因子、サイトカイン、抗微生物ペプチド及び急性期タンパク質を含めて、複雑で非常に調節された応答で素早く起動して、感染に対して迅速に防御する。最近では、前記経路を通じた免疫応答の刺激を謳った非特異的で不活性な酵母を基礎とする製品に対する市場選択肢が存在している。しかしながら、これらの製品は特異性及び成果の点で一貫性に欠いている。動物又はヒトの免疫応答の刺激を増強する改善された酵母製品を提供することは非常に望ましいことである。

【0027】

本開示は、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を提供する。本開示では、「菌体壁多糖」は、キチン、マンナンオリゴ糖、ベータ１，３グルカン及びベータ１，６グルカンである。驚くことに、少なくとも１種のカンジダ種からの前記菌体壁多糖を、少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖と組み合わせると、配合率が低いときでさえ、動物又はヒトの免疫応答の刺激を増強することになる。

【0028】

複数の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１～９９乾燥重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として５～９０乾燥重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として５～８０乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～７５乾燥重量％である。さらにまた他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～６０乾燥重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～２０乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～１５乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１１、１２、１３、１４又は１５乾燥重量％である。

【0029】

代替の又は補完的な実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１～９９乾燥重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として５０～９０乾燥重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として７０～９０乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として８０～９０乾燥重量％である。さらにまた他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５又は９０乾燥重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも７０、７５、８０、８５又は９０乾燥重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０乾燥重量％である。

【0030】

代替の又は補完的な実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として１～１００重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として２０～８０重量％である。他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５重量％である。さらにまた他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも２０、２３、２５、２７、３０、３３、３５、３７、４０、４３、４５、４７、５０、５３、５５、５７、６０、６３、６５、６７、７０、７３、７５、７７又は８０重量％である。１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である。

【0031】

１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である。

【0032】

他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として３０～６０重量％である。

【0033】

さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０～５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である。

【0034】

さらにまた他の実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０乾燥重量％であり、かつ、前記少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び前記少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖の量が、前記組成物の総重量を基準として少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０重量％である。

【0035】

１つの実施態様においては、前記少なくとも１種のカンジダ種はカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）である。本開示では、カンジダ・ユチリスには、有性（トルラ酵母（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ））と無性（カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ））の両方を含むと理解される。他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種は、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）、ハンセニアスポラ種（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｓｐ）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ）、クルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）、メチニコビア種（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｓｐ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ）、スターメレラ種（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｓｐ）及びトルラスポラ種（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｓｐ）又はこれらの混合種である。前記少なくとも１種の異なる酵母種はまた、それら酵母種のいずれか由来の種間雑種も含む。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種はサッカロマイセス種である。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種はサッカロマイセス・セレビシエである。サッカロマイセス・セレビシエはまた、限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）のような亜種も含む。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種はサッカロマイセス・セレビシエの２又はそれ以上のブレンドである。さらに他の実施態様においては、前記少なくとも１種の異なる酵母種は、少なくとも１種のサッカロマイセス・セレビシエと少なくとも１種のサッカロマイセス・セレビシエ・バー・ボウラディのブレンドである。

【0036】

１つの実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物又はヒトにおいて免疫応答を調節及び／又は刺激するのに使用することができる。ここで用語「調節する」が使用されるときは、該用語は免疫応答のあらゆる測定可能な上昇又は減少を指すと理解される。他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物又はヒトの健康及び感染抵抗性を改善するのに使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、病原性微生物に対する動物又はヒトの抵抗性を改善するのに使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物育種の実績を促進するのに使用することができる。１つの実施態様においては、前記動物は家畜である。典型的な家畜には、限定されないが、魚、エビ、仔牛、仔豚が含まれる。

【0037】

１つの実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物の腸管の健康、腸管の完全性及び腸管の形態を改善するのに使用するのに使用することができる。他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物の抗炎症応答を刺激するために使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、飼育動物の成長成績パラメータ及び飼料要求率を促進及び／又は改善するために使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、飼育動物の罹患率、特には抗生物質による治療中の罹患率及び死亡率を低減するために使用することができる。１つの実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、飼育動物の死亡率を低減するために使用することができる。他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、動物の下痢を減少させるために使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、腸管病原体に対する感受性を低下させるために使用することができる。さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、寄生虫侵襲及び関連疾患に対する動物の感受性を低下させるために使用することができる。１つの実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、水生動物の皮膚粘液の産生又はその質を促進及び／又は改善するために使用することができる。

【0038】

さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、従来の動物飼料の成分として有用である。

【0039】

さらに他の実施態様においては、前記実施態様で規定した組成物は、通常、動物又はヒトの完全食に添加されるか又は直接的に消費する錠剤、ペレット又はビードとして個別に添加される形式で提供される。

【0040】

本開示は、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を動物又はヒトに投与することにより、動物又はヒトにおいて免疫応答を調節及び／又は刺激する方法を提供する。また、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を動物又はヒトに投与することにより、動物又はヒトの健康及び／又は感染抵抗性を改善する方法を提供する。また、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を動物又はヒトに投与することにより、病原性微生物に対する動物又はヒトの抵抗性を改善する方法を提供する。また、少なくとも１種のカンジダ種からの菌体壁多糖及び少なくとも１種の異なる酵母種からの菌体壁多糖を含む組成物を動物又はヒトに投与することにより、動物育種の実績を促進する方法を提供する。

【0041】

１つの実施態様においては、組合せとして、食品添加剤、飼料添加剤、飼料材料／成分、動物飼料、又は医薬製品の形態がある。他の実施態様においては、該医薬製品は経口的又は非経口的に投与することができる。さらに他の実施態様においては、食品添加剤、動物飼料は、動物又はヒトの完全食に添加されるか又は直接的に消費する錠剤、ペレット又はビードとして個別に添加される形式で提供することができる。さらに他の実施態様においては、前記動物は家畜である。典型的な家畜には、限定されないが、魚、エビ、仔牛、仔豚が含まれる。

【0042】

以下の実施例は本発明をさらに説明、規定するが、いかなる形においても本発明を限定するものではない。

【0043】

実施例

【0044】

実施例１：

【0045】

デクチン１だけが、酵母菌体壁多糖を認識するＰＲＲではない。重要な役割を果たすのは、細胞壁の構造及びアーキテクチャーであると思われる。本明細書において、本発明者は、たとえ菌体壁多糖の組成が類似している場合でも酵母種が異なると、菌体壁多糖ネットワークのアーキテクチャーが異なり、デクチン１の活性化とは必ずしも関連しない異なる一連のＰＲＲが活性化される場合があると仮定した。この仮説を評価するために、デクチン１と高親和性を有する特異的な可溶性リガンドであるラミナリンを使用して、実施例１に示されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ競合アッセイを実施した。

【0046】

この例では、本発明者は、異なる酵母菌株及び酵母種から抽出された菌体壁多糖の様々な組み合わせが先天性免疫応答に及ぼす影響を評価することを選択した。これら実験で使用した細胞モデルは、ヒト単球の初代培養だった。酸素種を生成する単球の能力を評価した。化学ルミネセンスを利用して、アニオンスーパーオキシドの産生を研究した。この分子は、単球表面に見られる酵素複合体であるＮＡＤＰＨオキシダーゼから放出される。酸素種は、単球により食菌された生細菌又は生真菌を死滅させることに関与する。

【0047】

物質及び方法

【0048】

細胞培養

【0049】

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常血液ドナーのバフィコートから標準的フィコール－ハイパック密度勾配法により得た。ヒト単球は、５％ＣＯ_２を含む湿潤雰囲気中にて、マクロファージ培養に最適化されたＳＦＭ培地で２時間３７℃にてプラスチックに付着させることにより単核細胞から単離した。単球を多ウェル培養プレートに播種し、カルシウムもマグネシウムも含まないＨＢＳＳで洗浄することにより非付着細胞を除去した。残りの付着細胞（＞８５％単球）を、刺激前にＳＦＭでインキュベートした。

【0050】

酸素種産生のアッセイ

【0051】

単核細胞を、９６ウェルマイクロプレートに配置した。活性酸素種（ＲＯＳ）産生は、サーモスタットで温度管理（３７℃）された照度計（Ｗａｌｌａｃ１４２０ Ｖｉｃｔｏｒ２、フィンランド）を使用して、５－アミノ－２，３－ジヒドロ－１，４－フタラジンジオン（ルミノール、Ｓｉｇｍａ社）の存在下で化学ルミネセンスにより測定した。１００μｇ／ｍｌの様々な菌体壁多糖のみの存在下で又は段階的レベルのラミナリン（アッセイに応じて、０、１、１０、及び１００μｇ／ｍｌ）の存在下で、ルミノール（６６μΜ）と共に基本条件にて細胞をインキュベートした後、化学ルミネセンスの発生を６０分間連続してモニターした。１００μｇ／ｍｌのザイモサンを陽性対照として使用した。

【0052】

この研究で使用した酵母菌体壁多糖：

【0053】

異なる酵母菌株から抽出した菌体壁多糖：
サッカロマイセス・セレビシエ菌株：Ｌ６０、Ｌ６２、Ｌ６９、Ｌ７２
カンジダ・ユチリス菌株：Ｌ７５（ＮＲＲＬ－９００）
様々なアッセイで試験した菌体壁多糖のレベル：
カンジダ・ユチリス菌株：菌体壁多糖レベルは、組成物の総重量を基準として３０乾燥重量％に標準化した。
サッカロマイセス・セレビシエ菌株：菌体壁多糖レベルは、組成物の総重量を基準として３０、３５、４５、及び６０乾燥重量％に標準化した。
カンジダ・ユチリス及びサッカロマイセス・セレビシエの組み合わせ：多糖レベルは、組成物の総重量を基準として３０、３５、４５、及び５０乾燥重量％に標準化した。これら組み合わせ中のカンジダ・ユチリスに由来する菌体壁多糖のレベルは、それぞれ、組成物の総重量を基準として１５、１５、１０、１５、及び５乾燥重量％、又は組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として５０、４３、２５、３３、及び１０乾燥重量％だった（図４ａ及び４ｂ）。

【0054】

結果：

【0055】

アッセイ１：サッカロマイセス・セレビシエの異なる菌株に由来する菌体壁多糖と共に異なる濃度のラミナリンでインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生。サッカロマイセス・セレビシエの４つの異なる菌株に由来する各菌体壁多糖画分を、画分の総重量を基準として６０乾燥重量％に標準化し、デクチン１との親和性を試験した。図１に示されているように、全ての菌株に由来する菌体壁多糖は、ＲＯＳの産生を誘導することができ、ラミナリンは、線形用量応答様式でこの誘導を阻害した。

【0056】

アッセイ２：サッカロマイセス・セレビシエに由来する菌体壁多糖の、単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に対する用量応答。２つの異なるサッカロマイセス・セレビシエ菌株（Ｌ６２及びＬ６９）に由来する菌体壁多糖のブレンドを、ブレンドの総重量を基準として３０、３５、４５、及び６０乾燥重量％に調製及び標準化し、それらによるＲＯＳ産生の誘導を試験した。図２に示されているように、試験した濃度範囲にわたって線形用量応答が得られた。

【0057】

アッセイ３：カンジダ・ユチリス菌株に由来する菌体壁多糖又はサッカロマイセス・セレビシエに由来する菌体壁多糖と共にインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に対するラミナリンの比較効果。カンジダ・ユチリスの権利専有菌株に由来する菌体壁多糖画分を、画分の総重量を基準として３０乾燥重量％に標準化し、デクチン１との親和性を試験した。同様に、サッカロマイセス・セレビシエの菌株（Ｌ６２）に由来する菌体壁多糖画分を、画分の総重量を基準として３０及び６０乾燥重量％にそれぞれ標準化し、デクチン１との親和性を試験した。図３に示されているように、ラミナリンの非存在下では、カンジダ・ユチリスの菌体壁多糖画分及びサッカロマイセス・セレビシエの菌体壁多糖画分は、ＲＯＳの産生を誘導することができた。図３では、ラミナリンの濃度の増加は、サッカロマイセス・セレビシエの菌体壁多糖画分によるＲＯＳの産生阻害を増加させている。しかしながら、ラミナリンの濃度が増加しても、１００μｇ／ｍｌでさえ、カンジダ・ユチリスの菌体壁多糖画分によるＲＯＳの産生は阻害されなかった。

【0058】

アッセイ４：サッカロマイセス・セレビシエ菌株に由来する異なる濃度の菌体壁多糖のみで又はカンジダ・ユチリスに由来する菌体壁多糖と組み合わせて、（ａ）ラミナリンを用いずに及び（ｂ）１００μｇのラミナリンを用いてインキュベートした単球によるＲＯＳのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生。

【0059】

図４ａ及び４ｂに示されているように、異なる組成物中にカンジダ・ユチリスに由来する菌体壁多糖が存在すると、たとえ含有割合が低くとも（つまり組成物の総重量を基準として５乾燥重量％）、単球によるＲＯＳ産生の増強に結び付く。図４ｂに示されているように、カンジダ・ユチリスに由来する菌体壁多糖及び少なくとも１つのサッカロマイセス・セレビシエに由来する菌体壁多糖を含む組成物は、より低い含有割合（つまり、組成物の総重量を基準として５乾燥重量％又は組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１０乾燥重量％）でも、サッカロマイセス・セレビシエに由来する多糖のみ（図１及び図３に示されているような）と比べて、ラミナリンの阻害効果による影響を受けなかった。

【0060】

実施例２：

【0061】

カンジダ・ユチリス（ＣＵ）に由来する菌体壁多糖及びサッカロマイセス・セレビシエ（ＳＣ）に由来する菌体壁多糖を含む組成物を、クルマエビのビブリオ症に対する感受性を軽減するための予防的給餌戦略として試験した。菌体壁多糖は、組成物の総重量を基準として５０重量％の量だった（５０ＳＣ／ＣＵ）。

【0062】

ＳＣ菌体壁多糖のみと比べた５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖の利益を評価するために、本発明者は、幼若クルマエビにｉｎ ｖｉｖｏ疾患負荷を適用した。感染方法は浸漬だった。本発明者は、急性肝膵臓壊死症候群を誘導可能な病原性ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）を使用する。

【0063】

試験した菌体壁多糖は以下の通りだった：
・カンジダ・ユチリスＮＲＲＬ－９００に由来する菌体壁多糖を６乾燥重量％（組成物の総重量を基準として、又は組成物中の菌体壁多糖の総重量を基準として１２乾燥重量％）含有する５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖：３用量を試験した：飼料中０．０４％、０．０８％、０．１２％。
・Ｓ．セレビシエの１つの菌株（ＣＮＣＭ Ｉ １０７９）に由来する６０ＳＣ菌体壁多糖を、飼料中０．１２％で試験した。

【0064】

１．１×１０^９ＣＦＵ／ｍｌでＡＨＰＮＳを誘導可能な病原性Ｖ．パラヘモリチカス菌株の１００ｍｌ培養（ＴＳＢ＋２％ＮａＣｌ（ＴＳＢ＋）で１８時間２８℃にて増殖）で浸漬負荷する前に、試験候補で補完した又は補完しなかった食餌で２１日間飼養した２．０７±０．０５ｇの幼若バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）で治験を実施した。死亡率を１０日間モニターし、各食餌での累積生存率を、各治験内の対照と統計的に比較した。また、カプラン・マイヤー生存曲線（Ｋａｐｌａｎ及びＭｅｉｅｒ、１９５８年）を食餌毎に構築し、この曲線をログランク検定を使用して比較して、曲線間の差、及び生存傾向が曲線間で異なっていたか否かを決定した。有意水準はＰ＝０．０５に設定した。

【0065】

５０ＳＣ／ＣＵ処置は、線形用量応答を示し、病原性菌株により誘導される死亡率を低下させた（ログランク（マンテル－コックス）、ｐ＜０．０１）。生存率は、０．０４％の含有割合の場合、陽性対照（感染）と比較して更に有意に改善した。６０ＳＣ／ＣＵのみでは、０．１２％でわずかな改善を示したに過ぎなかった。

【0066】

プロトコール：

【0067】

幼若バナメイエビを、ビブリオ・パラヘモリチカス（急性肝膵臓壊死症－ＡＨＰＮＤを引き起こす因子）と浴接触させる前に、試験製品と混合した市販調製エビ食餌で２１日間飼養して、飼料添加物が生存率及び感染率に影響を及ぼすことになるか否かを決定した。

【0068】

養魚槽及び実験計画：

【0069】

この例で使用したＳＰＦ（特定病原体除去）動物は、ＷＳＳＶ（白点症候群ウイルス）、ＴＳＶ（田浦症候群ウイルス、ＩＭＮＶ（感染性筋壊死ウイルス）、ＡＨＰＮＤ（急性肝膵臓壊死症）を含む重要な感染症が、組織病理学的技法及びＰＣＲ技法の両方を使用して検査されている。１２日齢の後期仔魚を、孵卵所からウェットラボに移し、１～２グラムのサイズに達するまで厳重なバイオセキュリティーで更に４５日間飼育した。研究を開始する１日前に、１～２グラムのＳＰＦバナメイエビを各々２７ ９０Ｌ水槽に移した（３５尾エビ／水槽）。各水槽中のエビは全て、治験終了時に成長速度を算出するために、養殖前に集団で計量した。これら水槽中の動物には全て、それぞれの試験食餌を２１日給餌した（表１）。

【0070】

１処置当たり４つの重複水槽に、試験製品を含有する調製飼料を給餌した。４つの水槽を陽性対照に指定し、他の４つの水槽が陰性対照としての役目を果たした。また、陰性対照水槽を市販エビ食餌ペレットで飼養したが、ビブリオ・パラヘモリチカスを引き起こすＥＭＳ／ＡＨＰＮＤで負荷しなかった。全ての水槽に、体重のおよそ５％に相当する各食餌を毎日与えた。

【0071】

飼料添加物を含有する飼料を投与した２１日後に、１６個の処置水槽をビブリオ・パラヘモリチカスで負荷した。一方で、陽性対照水槽は、添加物を一切含まない同じエビ食餌で飼養し、治験の２１日目にビブリオ・パラヘモリチカスで負荷した。負荷エビを更に１０日間維持して、生存率を記録し、成長速度をモニターした。

【0072】

負荷方法：

【0073】

この研究では、エビを浸漬負荷にかけた。ビブリオ・パラヘモリチカスの一貫して病原性の菌株を接種し、１８時間インキュベートしたトリプシン大豆ブロス＋２％（ＴＳＢ＋）塩化ナトリウムを、水槽に直接添加した。光学密度吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）で測定される細菌密度を達成するように、細菌懸濁液を水槽に添加した。負荷期間中、エビは、それぞれの食餌処置で更に１０日間維持した。

【0074】

結果

【0075】

治験終了時の統計処理後の最終生存率は、表１に報告されている。図５には、異なる群のエビの実験経過中の生存率の分布が、カプラン・マイヤー手順に従って報告されている。

【0076】

表１：最終生存率：処置観察の要約

【0077】

表２及び表３には、異なる群のエビの生存率分布間の統計的差異が示されている。

【0078】

表２に示されているように、適用した試験は全て、生存率分布間で非常に有意な処置効果を明らかにした。

【0079】

表２：統計比較：異なるレベルの処置の生存率分布の同等性に関する試験

【0080】

表３に示されているように、各感染群の死亡率の動態を、カプラン－マイヤー法及びログランク（マンテル－コックス）検定を使用して、陰性対照（未感染群）と比較した場合、細菌負荷は、全ての群のエビの生存率に有意な影響を及ぼした。加えて、こうしたｉｎ ｖｉｖｏ結果により、サッカロマイセス・セレビシエ及びカンジダ・ユチリスに由来する菌体壁多糖を含む組成物が、自然防御の調節及び／又は刺激に有益な効果を示し、負荷条件下の動物成績を向上させることが確認される（表３）。

【0081】

表３：ログランク（マンテル－コックス）検定を使用した分布の統計比較：異なる処置間の生存率分布の同等性に関する検定

【0082】

実施例３

【0083】

シーバスでの本例の結果は、＜＜５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖＞＞対＜＜６０ＳＣ菌体壁多糖＞＞が魚成績及びストレス応答に対して肯定的な影響を及ぼすことを示した。

【0084】

１５．４ｇの平均体重を有するヨーロピアンシーバス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ ｌａｂｒａｘ）を、０．０８％の＜＜５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖＞＞対０．２％の＜＜６０ＳＣ菌体壁多糖＞＞による１０週間の飼養治験にかけた。

【0085】

表４に示されているように高レベルの大豆粉末（４０％）を含むように飼料を配合した。

【0086】

表４：食餌配合

【0087】

１処置当たり２５匹の魚の水槽を３つ使用した。塩分ストレスを８週目に適用した。記録したパラメータ：成長成績／腸形態／腸微生物叢。

【0088】

表５には、１０週目の最終成績が示されている。

【0089】

表５：１０週目の成績

【0090】

データは全て、平均±標準偏差（ＳＤ）として示されている。データは、必要に応じて変換し、ウィンドウズ用のＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン１８（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．社、シカゴ、イリノイ州、米国）を使用して統計的分析を実施した。Ｐ＜０．０５レベルで有意性があると認めた。データは全て、一方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した。対照と実験群との有意差は、マン－ホイットニーのノンパラメトリック検定を使用して決定した。

【0091】

図６ａ及び図６ｂには、それぞれ５週目及び１０週目の実験食餌で飼養した後のシーバス遠位腸の微絨毛密度の走査型電子顕微鏡検査結果が示されている。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）として表されている。対応する対照との有意差は、（^＊）Ｐ＜０．０１、及び（^＊＊）Ｐ＜０．００１で表示されている。データは、必要に応じて変換し、ウィンドウ用ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン１８（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．社、シカゴ、イリノイ州、米国）を使用して統計的分析を実施し、Ｐ＜０．０５レベルで有意性を認めた。一方向ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析し、対照と実験群との有意差は、チューキーのポストホック検定を使用して決定した。

【0092】

表６：５週目及び１０週目の光学顕微鏡検査

【0093】

表６のデータは全て、平均±標準偏差（ＳＤ）として示されている。データは、必要に応じて変換し、ウィンドウズ用ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン１８（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．社、シカゴ、イリノイ州、米国）を使用して統計的分析を実施した。Ｐ＜０．０５レベルで有意性があると認めた。データは全て、一方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した。対照と実験群との有意差は、ポストホックチューキーのＨＳＤ検定を使用して決定した。

【0094】

図７には、１０週目における本開示により実験食餌で飼養した後のシーバスの遠位腸での２つの免疫遺伝子（ＩＬ１β及びＩＬ１０）の発現が示されている。

【0095】

実施例４：

【0096】

この例は、第２段階飼養において本開示による菌体壁多糖の組み合わせで離乳仔豚を補完した効果を示すものである。

【0097】

治験設定

【0098】

治験の期間：４２日間

【0099】

動物材料及び畜産条件：

【0100】

離乳仔豚を、１檻当たり仔豚１２匹で収容した。１つの建物にて、６つの檻を２つの処置（対照及び処置）の１つに割り当てた。２回の治験を経時的に繰り返して、１処置当たり１２個の重複檻を生成し、２回分を一緒に分析した。

【0101】

試験製品：６％ＣＵを有する５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖

【0102】

処置：治験は、２つの処置で構成されていた。
・Ｔ－１：対照－酵母誘導体を含まない通常食餌
・Ｔ－２：０．０８％の５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖で補完された対照食餌

【0103】

食餌

【0104】

動物を、表７に示されているような２段階食餌で飼養した。

【0105】

［表７］
表７：２段階食餌

【0106】

測定した畜産パラメータ：
・各飼養段階の開始時及び終了時の１檻当たりの体重、
・第２飼養段階の１檻当たりの飼料消費量
・死亡率及び淘汰率

【0107】

統計的分析

【0108】

結果は、ＳＰＳＳを使用して、ＧＬＭ（一般化線形モデル）単変量モデルで分析する。

【0109】

結果：

【0110】

Ａ．成長成績

【0111】

表８に示されているように、最終体重及び平均１日増体量に有意な効果が検出された。この効果は、主に、処置群では、第２段階中の成績が有意により良好であり、１日成長速度及び飼料要求率が有意により高いことにより説明される。

【0112】

【0113】

他の観察：対照檻では３（三）匹の仔豚が死亡したが、処置檻の１つで１匹の仔豚が死亡したに過ぎなかった。死亡は全て脳膜炎によるものであった。処置群では、耳への噛みつきがあまり観察されなかった。対照群では、糞がより緩かった。

【0114】

実施例５：

【0115】

この例は、離乳前後の仔牛の畜産成績及び健康成績に対する、固形飼料により補完された場合の５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖組成物の効果を評価するものである。

【0116】

研究期間：６週間。

【0117】

物質及び方法

【0118】

関与した動物：
・動物の総数：開始時１２９匹、終了時１２５匹。
・性別：雄
・血統：フリージアン（由来：フランスの異なる農場）

【0119】

実験処置

【0120】

２つの食餌処置を、異なる製品で補完した同じミール粉末を使用して比較した。
Ｔ０として：製品を一切含まない対照食餌。
Ｔ１：５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖で補完した同じ食餌
・最初の２週間：５ｇ／動物／日＝２．７ｇ／ｋｇの開始飼料
・その後：３ｇ／動物／日＝１．６ｇ／ｋｇの開始飼料

【0121】

実験設計

【0122】

農場到着時に、動物を無作為に檻に割り当てた。６日後、治験を開始した。動物を計量し、平均体重及び体重の平均標準偏差により檻を均一化した。檻は全て同時期に実施した。開始体重は、平均で５３．９±４．３ｋｇであり、開始時の平均日齢は、２７．３±４．４日だった。

【0123】

実施場所の説明及び飼養

【0124】

動物は全て、同じ建物に収容し、わら敷きの檻には１０～１１匹動物を入れた。１処置当たり４つの檻が関与した：各１１匹の動物の３つの檻及び各１０匹の動物の１つの檻＝１処置当たり４３匹の動物。全ての檻は、檻の給餌器間で接触がない給餌器を有していた。ストローは２つの檻で共有したが、処置間の相互汚染はなかった。ミルクは、午前８：００及び午後６：００の１日２回個々に分配した。仔牛用濃縮液を、給餌葉桶で１日１回手作業で分配した。分配量は、毎日分配前に計量した。動物は全て、ストローを自由に使用した。

【0125】

動物は、以下のスケジュールに従って飼養した。
・到着日～２週間：２×１．５Ｌ／日の初乳ミルク希釈液（２５％ＣＰ及び１９．５％脂肪）、その後代用ミルク（２２％ＣＰ及び１８％脂肪）＋固形飼料（粉末ミール）自由摂取＋ストロー自由摂取＋水自由摂取。
・２週間～離乳（３４日）：１×２Ｌ／日の代用ミルク（１９％ＣＰ及び１５％脂肪）＋固形飼料（粉末ミール）自由摂取＋ストロー自由摂取＋水自由摂取。
・離乳～出荷：固形飼料（粉末ミール）自由摂取＋ストロー自由摂取＋水自由摂取

【0126】

仔牛が良好な身体状態を示し、１ｋｇ／日／動物を超えて食べ始めたら、離乳を終了した。

【0127】

記録したパラメータ及び適用した方法

【0128】

個々の生体重：仔牛は、研究の開始時から終了時まで２週間毎に午前１０：００に個々に計量した（合計で４回の体重測定）。飼料消費量：檻毎に週１回記録した飼料消費量（濃縮液）＝毎日提供した飼料重量の合計－その週の最終日の未消費重量

【0129】

結果

【0130】

体重（ＢＷ）及び平均１日増体量（ＡＤＧ）

【0131】

表９に示されているように、Ｔ１で飼養した動物の平均体重（ＢＷ）は、Ｔ０で飼養した動物よりも良好である傾向があった。処置と期間とに相互作用は見出されなかった。初期ＢＷ及び最終ＢＷ（それぞれＢＷ０及びＢＷ４２）は、Ｔ１の数値がより高かった。

【0132】

表９：治験中の体重

【0133】

表１０に示されているように、Ｔ１の動物はＴ０の動物よりも数値的に増体量が良好だったが、平均１日増体量には処置間で差異はなかった。

【0134】

表１０：治験中の平均１日増体量

【0135】

檻内の標準偏差は、飼育者らが更により多くの摂取の結果としてのより良好な均一性を求めている場合、体重及び増体量の不均一性の良好な指標となる。Ｔ１の標準偏差はＴ０よりも有意に低く、これは対照動物が処置動物よりも体重の不均一性が大きいことを意味している（表１１）。成長の不均一性を見ると、統計的有意差は観察されなかったが、対照動物は、数値的には処置群動物よりも不均一性が高かった。

【0136】

表１１：治験中のＢＷ及びＡＤＧの標準偏差（檻内）

【0137】

濃縮液摂取及び飼料効率（ＦＥ）及び飼料要求率（ＦＣＲ）

【0138】

総濃縮液摂取量（檻毎の全期間の総摂取量／動物数）の統計的分析は、差異を示さなかった。飼料要求率分析は、処置間の有意差を一切示さなかった。

【0139】

下痢及び罹患率

【0140】

表１２に示されているように、Ｔ１の動物は、対照Ｔ０と比較して、下痢をした日数が少なく、抗生物質での治療回数が少なかった。

【0141】

表１２：下痢をした日数及び抗生物質での治療回数

【0142】

少なくとも１回下痢を治療した動物のパーセントに適用したマン・ホイットニー検定は、Ｔ０と比較してＴ１が有意な低減を示し、抗生物質で少なくとも１回治療した動物のパーセントは低下傾向を示した。

【0143】

抗生物質で少なくとも１回及び下痢を少なくとも１回治療した動物のパーセント

【0144】

実施例６：

【0145】

幼若バナメイエビを、微胞子虫寄生虫であるエンテロシトゾーン・ヘパトペナエイ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）で負荷する１４日前に、ＬＡＬＬＥＭＡＮＤ社により提供された飼料添加物製品を混合した市販の調製エビ食餌で１４日間飼養して、飼料添加剤のいずれかの用量が、生存率に肯定的な効果を及ぼし、感染率及び寄生虫量を低減するか否かを決定した。

【0146】

物質及び方法

【0147】

ＳＰＦ（特定病原体除去）幼若エビをこの研究に使用した。これらのエビは、ＷＳＳＶ（白点症候群ウイルス）、ＴＳＶ（田浦症候群ウイルス）、ＩＭＮＶ（感染性筋細胞壊死ウイルス）、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死症候群）、及びＥＨＰ（エンテロシトゾーン・ヘパトペナエイ）を含む重要な感染症が検査されていた。研究を開始する１日前に、１．５０±０．０９グラムのＳＰＦバナメイエビを各々、２０ｐｐｔの塩水を９０Ｌ含む１２０Ｌ水槽に移した（３０尾エビ／水槽）。各水槽は、活性サンゴを含む浸漬型生物フィルターを装備していた。

【0148】

実験設計

【0149】

実験は、完全無作為化設計として設定し、全ての処置を、異なる水槽で無作為に設計した。治験の総期間：２９日間。表１３に記載の通り、０１日の順化、１４日間の飼料添加物投与、その後同じ飼養処置下で１４日間のＥＨＰ負荷を含む。全水槽のエビには、治験中１日４回それぞれの食餌を十分に与えた（表１４）。５つの水槽を、飼料添加物を含む調製飼料で飼養した。５つの水槽を、共棲飼育負荷の陽性対照に設計し、５つの水槽は、陰性対照として役目を果たした。

【0150】

表１３：実験のタイミング

【0151】

表１４

【0152】

ＥＨＰ研究で使用した全ての１２０Ｌ養魚層の定義

【0153】

エビ食餌製造

【0154】

飼料添加剤を飼料粉末と混合し、結合剤（ＣＭＣ－カルボキシメチルセルロース）及び水分を添加してから、加圧肉挽器で押出した。その後、飼料を摂氏５０度で６時間乾燥した。飼料を、研究に使用する予想サイズ（長さ１．５～２ｍｍ）に粉砕した。

【0155】

負荷方法

【0156】

標準共棲飼育負荷法を使用して、ＥＨＰ、即ち微胞子虫の寄生虫病を引き起こすエンテロシトゾーン・ヘパトペナエイを小幼若エビに負荷し、自然の感染経路を擬態した。

【0157】

ＳＰＦ及び罹患エビを、水が自由に往き来できるネット仕切りで分離した。共棲飼育負荷法は、以下のように設計されている：各１２０リットルのプラスチック水槽に、５０立方リットル矩形ネットを取り付ける。負荷中、２０尾のＥＨＰ感染エビを、懸垂ネット内側に放ち、３０尾のＳＰＦエビを外側に放った。ＥＨＰ感染エビ及びＳＰＦエビは両方とも、各々それぞれの処置の試験食餌で更に１４日間飼養した。また、陰性対照（Ｆ）を同じ負荷方法で処置した。しかしながら、２０尾のＥＨＰ感染エビではなく、２０尾のＳＰエビを、懸垂ネットの内側に放った。負荷期間中、陰性対照のネット内側のエビ及びネット外側のエビは両方とも、市販エビ食餌で飼養した。

【0158】

ＥＨＰ罹患エビの寄生虫量密度は、負荷開始時ではエンテロシトゾーン・ヘパトペナエイの５．０５Ｅ＋０６ ＣＦＵ／ｇだった。

【0159】

試料採取及び観察

【0160】

ｑＰＣＲによるＥＨＰの検査を、３時点において、０５尾のエビ／水槽／時点で実施した：ＳＰＦエビがＥＨＰ未感染状態であることを確認する１４日目（負荷直前）、寄生虫量を定量化する１５日目（負荷の２４時間後）及び１８日目（負荷の９６時間後）。負荷研究終了時に、生存動物を全て生存として計数した。

【0161】

統計的分析

【0162】

７つの処置の平均の比較は、フィッシャーのＬＳＤ検定を使用してＡＮＯＶＡにより実施し、Ｐ＜０．０５の場合に有意差があるとみなした。

【0163】

結果

【0164】

エビ成績パラメータ
２８日間の実験期間にわたる平均生産パラメータは、表１５に示されている。値は、５つの重複試料の平均を表わす。

表１５

【0165】

負荷治験生存率

【0166】

負荷１４日後の処置の生存率

【0167】

負荷１４日後のエビの生存率は、図８に処置の（平均±ＳＤ）として示されている。同じ大文字で示されている平均は、処置間で違いがない（フィッシャー検定、５％確率）。

表１６

【0168】

ＥＨＰ寄生虫量に関するｑＰＣＲ検査の結果は、表１６に示されている。負荷実験の開始時（負荷直前）の処置群は、ＥＨＰ未感染状態にある。負荷の４８時間後、処置Ａの実験エビ及び陽性対照（Ｇ）は、この疾患に罹患しているが、陰性対照（Ｆ）は、ＥＨＰ未感染状態だった。したがって、これは、この治験設定が許容可能であり、陰性対照には相互汚染が起こらなかったことを示す。４８時間後の処置Ａ及びＧのＥＨＰ寄生虫量は類似していた。しかしながら、負荷１２０時間後では、処置ＡのＥＨＰ寄生虫量は、５つの水槽のうちの４つで検出限界未満であったが、陰性対照の水槽は全てＥＨＰ陽性だった（５／５）。

【0169】

実施例７

【0170】

熱ストレスに対するブロイラーの耐性に対する５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖の効果の評価

【0171】

熱ストレスは、世界的に、家禽生産を難しくする最も重要な環境ストレス因子の１つである。熱ストレスは、家禽成績に負の影響を及ぼし、成長及び製品安全性を低下させる。熱ストレス期間中、ブロイラーニワトリは、熱射病による死亡を防止するために、かなりの体温調節適応を行うが、これは、成績に有害な影響を及ぼす。

【0172】

実験設計

【0173】

場所：私有実験農場（フランス）

【0174】

実験設計：２群

【0175】

対照（Ｃ）：補完物なし。５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（Ｙ）：開始期間及び成長期間でそれぞれ８００ｇ／トン及び４００ｇ／トンの５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ。仕上げ期間中は、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳを補完しない（８００－４００－０）。

【0176】

食餌：

【0177】

３段階（開始、成長、及び仕上げ）。この３つの飼養段階は、０～１０日、１１～２５日、及び２６～３５日だった。

【0178】

動物：

【0179】

到着時に２０羽の鳥／檻の密度に達するように１３個の檻に無作為に割り当てた（Ｃ：６つの檻、Ｙ：７つの檻）Ｒｏｓｓ ＰＭ３血統のブロイラーで治験を実施した。

【0180】

熱ストレス負荷：

【0181】

熱ストレス負荷をＤ２０で実施した。Ｄ１９からＤ２０にかけての夜間に、室温を３１℃に上昇させた。

【0182】

測定：１檻当たりの死亡数及び日付。

【0183】

統計的分析：

【0184】

治験中の２群間の死亡率の差（及び特に鳥の熱ストレスに対する耐性）を、カプラン－マイヤー検定により分析した。ｐ値がｐ＜０．１の場合、群間に有意差があるとみなした。そうでなければ、統計的分析では、有意ではない（ＮＳ）とみなされる。

【0185】

結果

【0186】

熱ストレス負荷に対する鳥の死亡率及び耐性：結果は、表１７に示されている。

【0187】

表１７

【0188】

４０羽の鳥：５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ群では９羽の鳥、及び対照群では３１羽の鳥が熱ストレス負荷中に死亡した。死亡した鳥の総数は、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ群で１７羽、及び対照群で３８羽だった。カプラン－マイヤー分析（２群の平均生存期間を比較する統計的検定）は、強い有意性を示し（ｐ＜０．００１）、評価は以下の通りだった：Ｃ群及びＹ群の平均生存期間は、それぞれ２９．６日間及び３２．９日間だった。したがって、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ群は、対照群よりも急性熱ストレス負荷に、より耐性だった。

【0189】

結論として、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳの給餌は、熱ストレスに対するより良好な耐性に結び付いた。

【0190】

実施例８

【0191】

緒言及び目的

【0192】

本治験の目的は、薬物除去後の離乳後仔豚成績、罹患率、及び下痢発生に対する５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳの効果を試験することだった。

【0193】

実験設計

【0194】

動物及び畜舎

【0195】

合計で、４つの後続バッチの４８０匹の離乳仔豚（雌親系統：ラージホワイト（Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ）×ランドレース（Ｌａｎｄｒａｃｅ）；雄親系統：ダンブレッドデュロック（Ｄａｎｂｒｅｄ Ｄｕｒｏｃ））を、４つの檻を有する８つの育仔室に各群２０匹の仔豚／檻で分配した。仔豚は、初期体重が檻内及び処置間で可能な限り均一になるように分配し、各檻に１０匹の雌及び１０匹の雄を配置した。

【0196】

仔豚は、７及び２１日齢でミコプラズマに対するワクチン接種を受け、２１日齢でサーコウイルスに対するワクチン接種を受けた。

【0197】

期間

【0198】

治験は、平均で１９日齢で離乳させることから開始して、５５日間継続した。

【0199】

処置

【0200】

仔豚は、２段階給餌プログラムで飼養し、全実験期間中は自由に飼料及び水を与えた。

【0201】

２つの処置を行った（表１８）：対照（Ｃ）及び治験１（Ｔ１）。

【0202】

農場で現在使用されている抗生物質戦略は、以下の通りである：プレ開始段階：１２０ｐｐｍコリスチン＋３００ｐｐｍアモキシシリン＋２４００ｐｐｍのＺｎＯ；開始段階：１６００ｐｐｍ ＺｎＯ。

【0203】

仔豚負荷が目的の本治験では、薬物は、プレ開始段階：２４００ｐｐｍ ＺｎＯ；開始段階：ブランク飼料とした。

【0204】

表１８ 処置

【0205】

実験設定及び観察
・体重：個々、実験の開始時及び終了時及び食餌変更時。
・飼料摂取量：１檻当たり。食餌変更時に、供給した飼料と変更した日に残っていた飼料の差として。
・罹患率：定期的な集団単位の予防を含む、個体及び集団単位の医療行為。
・死亡率：日付、体重、及び考えられる理由。
・下痢：１檻当たり。下痢発生の日常的点検。

【0206】

統計

【0207】

以下のモデルによるＳＰＳＳ ２２．０（ＩＢＭ）の一般線形モデルでの分散分析：
Ｙ_ｊｋ＝μ＋ａｘＩＢＷ＋バッチ_ｊ＋処置_ｋ＋バッチ_ｊ＊処置_ｋ＋ｅ_ｊｋ

【0208】

式中、

【0209】

Ｙ＝最終体重（ＦＢＷ）、平均１日増体量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）、飼料要求率（ＦＣＲ）、死亡率；ＩＢＷ＝共変数として使用される初期体重；バッチ＝バッチ（ｊ＝１、２、３、４）に起因する固定効果；処置＝処置（ｋ＝Ｃ、Ｔ１）に起因する固定効果；バッチ＊処置＝実験処置とバッチとの相互作用；ｅ＝エラー。実験は、檻単位で行った。Ｐ＜０．０５から有意性があると宣言した。

【0210】

処置とバッチとの相互作用は見出されなかった。したがって、相互作用をモデルから取り除いた。

【0211】

結果

【0212】

成績

【0213】

ＦＢＷ（Ｐ＜０．０１）、開始期間の成長及び全体的な成長（Ｐ＜０．０５）、及び開始期間のＦＣＲ（Ｐ＜０．０５）には有意差があった。Ｔ１の仔豚は、ＢＷがより高く、成長がより早く、ＦＣＲがより低い仔豚であった。更に、Ｔ１仔豚は、開始期間でより早く成長し（Ｐ＜０．１）、開始期間でより多くの飼料を消費する（Ｐ＜０．１）傾向があった。成績結果は表１９に示されている。

【0214】

表１９ 処置Ｃ及びＴ１の仔豚の期間毎の及び全体の成績

【0215】

プレ開始期間よりも開始期間において差異がより大きいという事実は、農場での健康状態が良好であり、仔豚がブランク食餌でより負荷されたのはプレ開始段階中よりも開始期間だったという事実によると思われる。

【0216】

死亡率は、実験期間にわたって低く、処置間に差はなかった。全期間の平均で、死亡率は１．８％だった。合計で、１３匹の仔豚が治験中に死亡した。

【0217】

結論：

【0218】

この治験の主な結論は、以下の通りである。
・離乳後の食餌に５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳを添加することにより、限定的な薬物処方を伴う対照食餌と比べて、最終体重、全体の平均１日増体量、及び全体飼料要求率が数値的な向上する。
・この影響は、恐らくは農場での健康状態に応じて、プレ開始期間よりも開始期間でより大きいと思われる。
・５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳは、開始段階中のＺｎＯ及び／又は抗生物質の良好で有望な代用物である可能性がある。
５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ処置を陽性対照と比較して、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳが抗生物質の代わりになる可能性を試験すること、及び抗生物質に加えて５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳを添加することが及ぼす補完的効果の可能性を試験することが推奨される。

【0219】

実施例９

【0220】

施設、試料詳細、及び実験食餌

【0221】

ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）幼魚で実験を行った。４週間の順化後、４８０匹の魚（２３．０７±０．２ｇ）を、通気再循環真水を含有する１６×１５０リットルのガラス繊維水槽に無作為に分配した（１水槽当たり３０匹の魚）。魚は、３回の給餌時間（０９００、１３００、及び１７００時）に分けて１日当たり体重の３％の一定量体制による食餌で５６日間で飼養した。魚は、隔週で２４時間の飢餓期間後にバッチ計量し、１４．５±０．５℃にて、１２時間：１２時間の明期：暗期の光周期で飼育した。水のｐＨは、６．８～７．５に維持し、溶存酸素は７．５～８ｍｇ／ｌに、アンモニウムは０．０４～０．０８ｍｇ／ｌに、亜硝酸塩は０．０２～０．０６ｍｇ／ｌに、及び硝酸塩は５４～５８ｍｇ／ｌに維持した。ニジマスは、処置毎に４つの重複水槽により４つの食餌体制の１つで飼養した：１］対照、２］６０ＳＣ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ、３］５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ、連続給餌、及び４］５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ、５６日間にわたって間欠投与した（食餌の組成は表２１を参照）。

【0222】

［表２１］
表２１．プリマス実験用の実験食餌の配合。各成分は、１食餌当たりのｇ／ｋｇとして表されている。

【0223】

方法

【0224】

粘液収集

【0225】

魚は、無作為に選択し、治験実施施設のプロトコールに従って人道的に絶命させることになる。麻酔薬の好ましい選択は、ＭＳ２２２である。魚を網にかける場合、魚の粘膜表面への損傷が最小限になるようにできるだけ迅速に行うように注意しなければならない。絶命直後に、小さなスパチュラを使用してえら蓋の端部から肛門まで魚の一方の側をこすることにより粘液を収集することになる（図９：タイセイヨウサケ及びニジマスの場合のスパチュラ掻爬の方向）。魚の尾部末端に蓄積した粘液を、１ｍｌの事前に計量した注射器へと移すことになる。粘液を１ｍｌのエッペンドルフチューブに保存し、直ちに－８０℃に凍結し、分析まで待機した。

【0226】

リアルタイムｑＰＣＲ試料の収集

【0227】

皮膚試料（＜１００ｍｇ）をニジマスから収集し、１ｍＬ ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ウォリントン、英国）に移し、４℃で２４時間保管し、その後ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保管した。ＲＮＡを抽出した後、ｑＰＣＲを実施して、粘液産生の特異的バイオマーカーの発現を観察した。

【0228】

成長成績の計算

【0229】

成長は、増体量（ＷＧ）、比成長速度（ＳＧＲ）、飼料要求率（ＦＣＲ）、タンパク質効率比（ＰＥＲ）、条件因子（Ｋ）で評価した。計算は、以下の数式を使用して行った：ＮＷＧ（ｇ）＝ＦＷ－ＩＷ；ＳＧＲ（％ＢＷ／日）＝１００（（ｌｎＦＷ－ｌｎＩＷ）／Ｔ）；ＦＣＲ（ｇ／ｇ）＝ＦＩ／ＷＧ；ＰＥＲ＝ＷＧ／ＰＩ；Ｋ＝ＦＷ／（ＦＬ^３）。式中、ＦＷ＝最終体重（ｇ）、ＩＷ＝初期体重（ｇ）、Ｔ＝給餌期間（日）、ＷＧ＝湿増体量（ｇ）、ＦＩ＝飼料摂取量（ｇ）、ＰＩ＝タンパク質摂取量（ｇ）、及びＦＬ＝最終体長（ｃｍ）。

【0230】

結果

【0231】

粘液試料の分析

【0232】

粘液産生のデータは、表２２に示されている。粘液産生は、対照と比べて６０ＳＣ及び５０ＳＣ／ＣＵを給餌した魚で増加した。数値的には５０ＳＣ／ＣＵの方が好ましく有利だった。

【0233】

［表２２］
表２２．実験食餌を給餌した２８日及び５６日後の魚の皮膚粘液産生（ｍｇ／ｃｍ）。データは、平均±ＳＤとして表されている。

【0234】

リアルタイムｑＰＣＲ分析

【0235】

ニジマスの皮膚試料の遺伝子発現解析は、対照給餌魚（１．１６±０．４８ＮＥＬ）と比較して、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ食餌を連続的に給餌した魚（２．３１±１．２６ＮＥＬ；Ｐ＝０．０００３）及び間欠的に給餌した魚（２．０９±０．５８ＮＥＬ；Ｐ＜０．０００１）の粘液産生の特異的バイオマーカーの発現が有意に上方制御されたことを明らかにした。データは、図１０に示されており、この図には、６０ＳＣ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ及び（５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（商標））で補完した実験食餌で８週間飼養したニジマス（Ｏ．ｍｙｋｉｓｓ）の皮膚試料中のこの遺伝子の相対的発現が示されている。データは、ボックスプロットで表されている（ｎ＝１０／処置）。^＊は、上方制御が有意であることを示す；Ｐ＜０．０００１。

【0236】

成長成績

【0237】

実験食餌で５６日間給餌したニジマスは、対照給餌魚と比較して成長成績に有意差を示さなかった。データは、図１１に示されており、この図には、実験食餌を５６日間給餌したニジマスの成長成績が示されている。

【0238】

実施例１０：

【0239】

魚、実験設計、及び食餌配合

【0240】

４週間の順化後、２２５匹のシーバス（１５．４５±０．１ｇ）を、無作為に９×１１０リットルのガラス繊維水槽に分配した（１水槽当たり２５匹の魚）。シーバスを、３回の給餌時間９：００、１３：００、及び１６：３０時に分けて１日当たり体重の２．０％の一定割合で１０週間飼養した。魚は、隔週で２４時間の飢餓期間後にバッチ計量し、２４．１４±０．８５℃にて塩分２６．５８±４．３２で１２時間：１２時間の明期：暗期の光周期で飼育した。水のｐＨは、６．８～７．５に維持し、溶存酸素は７．５～８ｍｇ／ｌに、アンモニウムは０．０４～０．０８ｍｇ／ｌに、亜硝酸塩は０．０２～０．０６ｍｇ／ｌに、及び硝酸塩は５４～５８ｍｇ／ｌに維持した。

【0241】

高含有レベルの大豆粉（４０％含有）を含むように食餌を配合した。食餌の配合は、表２３に示されている。

【0242】

表２３．実験食餌の配合。各成分は（含有レベル％）として表されている。

【0243】

方法

【0244】

光学顕微鏡分析（ＬＭ）

【0245】

魚の遠位腸を取り出し、１０％マリンホルマリン（ｍａｒｉｎｅ ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定し、４８時間４℃で維持した後、保存用の７０％エタノールに移した。分析前に、腸試料を脱水し（Ｌｅｉｃａ社製ＴＰ１０２０）、Ｄｉｍｉｔｒｉｇｌｏｕら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、８７巻、３２２６～３２３４頁）に従ってパラフィンワックスに包埋した。

【0246】

試料を、５μｍ厚に切片化し（Ｌｅｉｃａ社製ＲＭ２２３５ミクロトーム）、オーブンで一晩乾燥し、その後ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で自動染色した（Ｌｅｉｃａ社製Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＸＬ）。ＤＰＸを使用してスライドにカバーグラスを装着し、静置して乾燥させた。その後、染色した試料の画像を撮影した（Ｌｅｉｃａ社製ＤＭＩＲＢ顕微鏡及びＯｌｙｍｐｕｓ社製Ｅ４１０デジタルＳＬＲカメラ）。画像分析は、Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４７ｖ（国立衛生研究所、ベテスダ、メリーランド州、米国）ソフトウェアを使用して実施した。ＬＭ画像を使用して、杯状細胞（ＧＣ）の他に、折り畳み長さ（ＦＬ）及び固有層幅（ＬＰ－Ｗ）を算出し、２００μｍにわたって測定した。周囲長比（ＰＲ）の場合、８ビットに転換した後、画像閾値を調整した。内周長を外周長で除算して、比率を算出した。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として示されており、統計的分析は、ウィンドウズ用ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン１５（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．社、イリノイ州、米国）を使用して実施し、Ｐ＜０．０５で受け入れた。組織学的データは、一方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した。対照と処置群との有意差は、ポストホックチューキーのＨＳＤ検定を使用して決定した。

【0247】

走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）

【0248】

試料を、２．５％グルタルアルデヒド＋０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム緩衝液で固定した（１：１容積、ｐＨ７．２）。その後、試料を、各段階にて段階的エタノール系列（３０％アルコール、５０％、７０％、９０％、及び１００％×２）で１５分間脱水し、中間流体としてエタノール及び遷移流体としてＣО_２を用いて臨界点乾燥した（Ｋ８５０ Ｅｍｉｔｅｃｈ）。その後、試料を金でスパッタコーティングし（Ｋ５５０ Ｅｍｉｔｅｃｈ）、ＪＳＭ６６１０ＬＶ走査電子顕微鏡で観察した。各試料毎に、×５００～×２０，０００の範囲の倍率で複数の画像を撮影し、全体的な腸完全性を評価した。微絨毛密度測定は、×２０，０００倍率の画像を使用して、Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｖ１．４５）を使用して実施した（図１３）。ＳＥＭデータは、一方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した。対照と処置群との有意差は、ポストホックチューキーのＨＳＤ検定を使用して決定した。

【0249】

リアルタイムｑＰＣＲ試料の収集

【0250】

ヨーロピアンシーバスから後腸試料（＜１００ｍｇ）を収集し、１ｍＬ ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ウォリントン、英国）に移し、４℃で２４時間保管し、その後ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保管した。

【0251】

ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成

【0252】

ＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国）を、製造業者の指示に幾つかの変更を加えて使用して、全ＲＮＡを抽出した。手短かに言えば、５０～１００ｍｇの腸試料をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液から取り出し、試料を無菌薄紙間に挟んで押圧することにより過剰な溶液を除去した。試料（＜１００ｍｇ）を、１ｍＬのＴＲＩ試薬を含むチューブに移し、１０分間ホモジナイズした。この２００μｌクロロホルムを添加し、混合した後、試料を１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上部水相を、等容積のイソプロパノールを含むチューブに移した。混合物をボルテックスし、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿したＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％エタノールを使用して洗浄した。全ＲＮＡを、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）に溶解し、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ社、英国）の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して精製して、あらゆる狭雑ゲノムＤＮＡを除去した。各試料中のＲＮＡの濃度及び品質は、２６０／２８０ｎｍ及び２６０／２３０吸光度比を測定することにより決定した（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｇｔｏｎ、米国）。ＲＮＡの完全性は、試料をＢｉｏ－ａｎａｌｙｓｅｒにかけることにより確認した。ＲＮＡ完全性値（ＲＩＮ、ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ）は、８．０～９．５の範囲だった（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国）。試料を、－８０℃で保管した。合計１μｇの量のＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、英国）を使用した。反応物を、５分間２５℃に、次に３０分間４２℃に置き、５分間８５℃で不活化した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットには、オリゴｄＴ及び幅広く様々な標的で作用するランダム六量体の組み合わせが含まれている。

【0253】

リアルタイムＰＣＲアッセイ

【0254】

ＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、ＳＹＢＲグリーン法で実施した。分析する各試料毎にＰＣＲ反応を重複して実施した。各ＰＣＲ反応は、２μｌの希釈（１／１０）ｃＤＮＡを、蛍光挿入剤としてＳＹＢＲグリーンを含有する５．５μｌの２×濃縮ｉＱ（商標）ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）、０．３μΜ順方向プライマー、及び０．３μΜ逆方向プライマーと混合することにより３８４ウェルプレートに準備した。使用したプライマー及びそれらの配列は、表１に示されている。全反応のサーマルプロファイルは、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間、５９℃で６０秒間の４０サイクルだった。蛍光モニタリングは、各サイクルの終わりで行った。更なる解離曲線分析を実施し、全ての場合で単一ピークが観察された。ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの量及び質のばらつきを排除することにより結果を標準化するために、各試料でβ－アクチン及びＧＡＰＤＨを基準遺伝子として使用した（Ｂｕｓｔｉｎら、２００９年）。実際は、基準遺伝子としてのＧＡＰＤＨ及びβ－アクチンの安定性及び適合性は、ｇｅＮｏｒｍ（商標）ソフトウェアにより使用されるアルゴリズムにより確認した（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、３巻（７号）、リサーチ００３４）。

【0255】

各基準遺伝子毎に発現安定性値「Ｍ」を生成した。増幅産物は、陰性対照では観察されなかった。対照テンプレートでは、プライマー二量体形成は観察されなかった。遺伝子発現の変化は、処置と同時に試料採取した対照に対して表わされている。

【0256】

閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光がバックグラウンド蛍光よりも明確に高くなった地点として定義され、各実験実施毎に手作業で決定した。各プライマー組のＰＣＲ効率は、ｃＤＮＡの系列希釈（ｎ＝３）及びその結果得られるＣｔ対ｃＤＮＡ入力の対数のプロットを使用し、数式Ｅ（ＰＣＲ効率）＝１０（－１／傾き）を使用して決定した。標的遺伝子の標準化発現レベル（ＮＥＬ）を、未知試料対対照試料のＣｔ偏差（ΔＣｔ）に基づいて算出し、ｇｅＮｏｒｍ（商標）マニュアル（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／～ｊｖｄｅｓｏｍｐ／ｇｅｎｏｒｍ／）及びＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら（Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、３巻（７号）、リサーチ００３４）に概説されている計算に従って、基準遺伝子ＧＡＰＤＨ及びβ－アクチンと比較して表した。

【0257】

ＲＴ－ｑＰＣＲデータの統計は全て、Ｒの並べ替え検定を使用して実施した。

【0258】

成長成績の計算

【0259】

成長は、増体量（ＷＧ）、比成長速度（ＳＧＲ）、飼料要求率（ＦＣＲ）、タンパク質効率比（ＰＥＲ）、条件因子（Ｋ）で評価した。計算は、以下の数式を使用して行った：ＮＷＧ（ｇ）＝ＦＷ－ＩＷ；ＳＧＲ（％ＢＷ／日）＝１００（（ｌｎＦＷ－ｌｎＩＷ）／Ｔ）；ＦＣＲ（ｇ／ｇ）＝ＦＩ／ＷＧ；ＰＥＲ＝ＷＧ／ＰＩ；Ｋ＝ＦＷ／（ＦＬ^３）。式中、ＦＷ＝最終体重（ｇ）、ＩＷ＝初期体重（ｇ）、Ｔ＝給餌期間（日）、ＷＧ＝湿増体量（ｇ）、ＦＩ＝飼料摂取量（ｇ）、ＰＩ＝タンパク質摂取量（ｇ）、及びＦＬ＝最終体長（ｃｍ）。

【0260】

結果

【0261】

光学顕微鏡検査

【0262】

光顕微鏡検査により、対照食餌及び実験食餌を給餌したシーバスが、完全な上皮障壁及び組織化絨毛様粘膜折り畳みの粘膜配置を示したことが明らかになった。腸粘膜は、散在性ＩＥＬで構成される単層上皮及び固有層（ＬＰ）で構成されていた（図１２Ａを参照）。対照食餌を給餌した魚と比較した周囲長比は（周囲長比がより大きいと、吸収性腸表面がより大きいことを示し、これは、より多数の及び／又はより長い粘膜折り畳みによりもたらされる）、実験期間の５週目及び１０週目の両方で、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ食餌を給餌した魚で有意に上昇した（表２４Ａ及び表２４Ｂを参照）。対照的に、６０ＳＣＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ食餌体制で飼養した魚は、対照給餌魚と比較して、給餌の１０週後でＰＲが有意に上昇したに過ぎなかった（表２４Ｂを参照）。

【0263】

表２４Ａ．実験食餌を給餌した５週間後の光顕微鏡データ。データは、平均±標準偏差（ｎ＝６／処置）として示されている。上付き文字^ａ－ｂは、チューキーのＨＳＤポストホック検定を使用した有意差を示す。

【0264】

表２４Ｂ．実験食餌で給餌した１０週後の光顕微鏡データ。データは、平均±標準偏差（ｎ＝１８／処置）として示されている。上付き文字ａ－ｂは、チューキーのＨＳＤポストホック検定を使用した有意差を示す。

【0265】

ＳＥＭ分析

【0266】

全ての魚の上皮表面は健康であると考えられた。均一な腸細胞形成及び稠密に充填された微絨毛を有し、細胞又は微絨毛の障害又は壊死の徴候はなかった。各処置内の魚の代表的な画像は、図１２に示されており、微絨毛密度測定分析は、図１３Ａ及び図１３Ｂに示されている。実験食餌を給餌した５週間後（図１３Ａを参照）、対照給餌魚（１．５８±０．５ａ．ｕ．）と比較して、６０ＳＣ菌体壁多糖（２．９０±１．０ａ．ｕ．）及び５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（４．８１±１．０ａ．ｕ．）を給餌した魚は、微絨毛密度が有意に上昇したことが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。同様に、実験食餌を給餌した１０週間後（図１３Ｂを参照）、６０ＳＣ菌体壁多糖（３．５１±０．４ａ．ｕ．）及び５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（３．４８±０．７ａ．ｕ．）を給餌した魚は、対照食餌を給餌した魚と比較して（１．６６±０．２）、微絨毛密度が有意に上昇したことが明らかになった（Ｐ＜０．００１）。

【0267】

リアルタイムｑＰＣＲ

【0268】

遺伝子発現データは、対照給餌魚と比較して（０．４８±０．１５ＮＥＬ）、６０ＳＣ菌体壁多糖（０．１７±０．０７ＮＥＬ）及び５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（０．１１±０．０８ＮＥＬ）食餌を給餌した魚は、ヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の有意な下方制御を示した（Ｐ＝０．０３）ことを明らかにした。同様に、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）遺伝子発現の場合、６０ＳＣ菌体壁多糖（０．１４±０．１ＮＥＬ）及び５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ（０．１２±０．０４ＮＥＬ）を給餌した魚は、対照食餌を給餌した魚と比較して（０．４７±０．１４ＮＥＬ）、有意な下方制御を示した（Ｐ＝０．０３）。対照的に、炎症性エフェクターサイトカインインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１ベータ）の遺伝子発現データは、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ食餌を給餌した魚（１．７４±０．４ＮＥＬ）が、対照食餌を給餌した魚と比較して（０．５１±０．４ＮＥＬ）、有意な上方制御を示した（Ｐ＝０．０３）ことを明らかにした。同様に、抗炎症性エフェクターサイトカインインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の遺伝子発現データは、５０ＳＣ／ＣＵ ＰＡＲＩＥＴＡＬ ＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ食餌を給餌した魚（２．７９±２．０ＮＥＬ）が、対照食餌を給餌した魚と比較して（０．３６±０．２ＮＥＬ）、有意な上方制御を示した（Ｐ＝０．０５）ことを明らかにした。データは全て図１４に示されている。

【0269】

実施例１１：アイメリア・アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラの混合負荷と接触させた市販ブロイラーニワトリの５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖の抗コクシジウム効力

【0270】

目的

【0271】

この研究の目的は、アイメリア・アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラの混合物に対する、５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖の抗コクシジウム効力／感受性を測定することであった。

【0272】

実験設計

【0273】

この研究は、各々が１０羽のニワトリで開始した４５個のケージで構成されていた。８つの処置を、９回反復した。

【0274】

処置

【0275】

動物

【0276】

孵化した日の雄ブロイラーニワトリ（系統Ｒｏｓｓ７０８）を、この治験に使用した。孵卵所にて鳥を性別分けし、日常的なワクチン接種を行った。健康と思われるニワトリのみを、この研究に使用した。研究は、鳥を実験ケージに割り当て、ケージに入れた時点（０日目）で開始した。研究中は鳥を補充しなかった。鳥は、０、１４、２０、及び２８日目にケージで計量した。

【0277】

禽舎

【0278】

ニワトリを、到着時にバタリーケージに入れた。１動物当たりの床面積は０．５１ｓｑ．ｆｔ／鳥だった。サーモスタットで制御されたガス炉／空気調節装置により均一な温度を維持した。更に、壁面に沿って垂下されている蛍光灯により連続照明を提供した。飼料及び水を自由摂取で提供した。

【0279】

生物作用剤

【0280】

コクシジウム接種原は、３つの種のエイメリア混合培養で構成されていた。これらの種は、Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラだった。コクシジウム接種原は、感染処置しようとする鳥に経口胃管栄養で投与した。

【0281】

この研究の１４日目に、無感染処置の鳥には各々、１ｍｌの蒸留水を経口ピペット（ｐ．ｏ．）で投与した。感染処置の鳥には、１ｍｌ容積に希釈して、Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラを、それぞれ７５，０００、２５，０００、及び５０，０００の平均接合子嚢数に滴定したコクシジウム接種原を投与した（ｐ．ｏ．）。

【0282】

病変スコアリング

【0283】

２０日目に、１ケージ当たり５（五）羽の鳥を人道的に安楽死させ、集団で計量した。鳥は、腸の感染領域に応じてコクシジウム症病変スコアリングで点数化した。

【0284】

負荷スケジュール
・Ｄ１４：コクシジウム症負荷＝それぞれ７５，０００、２５，０００、及び５０，０００のＥ．アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラ
・Ｄ２０：糞便物（ケージ毎に混合）中の接合子嚢数（ｏｏｃｙｓｔｓ ｃｏｕｎｔ）
腸病変スコアリング（５羽の鳥／ケージ）
結果

【0285】

結果は、図１５～図１７に示されている。

【0286】

図１５に示されているように、５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖を給餌した動物は、アイメリア・アセルブリナ、Ｅ．マキシマ、及びＥ．テネラ感染に伴う特異的な病変が低かった。この効果は、有意に低い平均病変スコアリングをもたらした。

【0287】

興味深いことには、エイメリア種に感染したブロイラーニワトリの死亡率も、実験の経過にわたって、図１６に示されているような用量依存的な様式で数値的に低下した。

【0288】

５０ＳＣ／ＣＵ菌体壁多糖を給餌した鳥の２０日目（感染６日後）の糞便排泄物の病原体接合子嚢は、図１７に示されているように用量依存的な様式で有意に低下した。

【0289】

こうした結果は、５０ＳＣ／ＣＨ菌体壁多糖でブロイラーニワトリを飼養することにより、エイメリア種の感染に伴う負の効果を緩和することができるという事実を支持している。

【0290】

本発明は、その特定の実施形態に関して説明されているが、更なる改変が可能であることが理解されるだろう。本出願は、本発明が関する技術分野内で公知の範囲内又は通常の実施内に入るような本開示からの逸脱、上記に記載されている必須特徴に適用することができるもの、及び以下のような添付の特許請求の範囲を含む、概して本発明の原理に従った本発明のあらゆる変異、使用、又は応用を包含することが意図されていることが理解されるだろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】