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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-03-31
(45)【発行日】2023-04-10
(54)【発明の名称】インターロイキン－６、１０産生促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/064 20060101AFI20230403BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230403BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230403BHJP
A23L 33/145 20160101ALI20230403BHJP
【ＦＩ】
A61K36/064
A61P43/00 111
A61P37/02
A61P43/00 105
A23L33/145
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020527320
(86)(22)【出願日】2019-06-03
(86)【国際出願番号】 JP2019021912
(87)【国際公開番号】W WO2020003905
(87)【国際公開日】2020-01-02
【審査請求日】2021-11-05
(31)【優先権主張番号】P 2018121852
(32)【優先日】2018-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000055
【氏名又は名称】アサヒグループホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100087398
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 勝文
(74)【代理人】
【識別番号】100128783
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 真
(74)【代理人】
【識別番号】100128473
【弁理士】
【氏名又は名称】須澤 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100160886
【弁理士】
【氏名又は名称】久松 洋輔
(72)【発明者】
【氏名】南 太一
(72)【発明者】
【氏名】今井 悠
(72)【発明者】
【氏名】石田 哲也
(72)【発明者】
【氏名】吉田 淳平
(72)【発明者】
【氏名】白井 建史
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５１１１２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLoS ONE (2016) vol.11, issue 2, e0148464
【文献】J. Exp. Med. (1956) vol.103, issue 1, p.1-13
【文献】Food Research International，2002年，Vol.35, No.9，pp.879-884
【文献】Journal of Zhejiang University. Science. B，2016年，Vol.17, No.10，pp.752-762
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／０６２
Ａ６１Ｋ ３６／０６４
Ａ２３Ｌ ３３／１４５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
未精製である酵母細胞壁加水分解物を含み、前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物であるインターロイキン－６産生促進剤。
【請求項2】
未精製である酵母細胞壁加水分解物を含み、前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物であるインターロイキン－１０産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はインターロイキン－６、１０産生に関する。
【背景技術】
【0002】
体内に浸入した病原体等に対する免疫系の攻撃として、好中球やマクロファージなどの貪食細胞による貪食作用（自然免疫系）、細胞傷害性Ｔ細胞のパーフォリン等の細胞傷害性物質の放出による宿主細胞の破壊、Ｂ細胞により産生された抗体による病原体の不活化（適応免疫系）などがある。
免疫系に係る細胞の活性化や機能抑制にはサイトカインが重要な役割を果たしており、そのうちの一つとして、白血球により分泌されるインターロイキンが挙げられる。
インターロイキンはこれまで複数同定されており、このうち、インターロイキン－６（ＩＬ－６）はマクロファージを刺激しての急性反応誘導などの作用が知られている。また、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）については主に２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）により産生され、炎症反応の抑制などに作用することが知られている。
免疫系に係る細胞の活性化や機能抑制にはサイトカインが重要な役割を果たしており、そのうちの一つとして、白血球により分泌されるインターロイキンが挙げられる。
インターロイキンはこれまで複数同定されており、このうち、インターロイキン－６（ＩＬ－６）はマクロファージを刺激しての急性反応誘導などの作用が知られている。また、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）については主に２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）により産生され、炎症反応の抑制などに作用することが知られている。
【0003】
一方、酵母細胞壁を加水分解または酵素処理した後、遠心分離によって精製することにより得られるβ－グルカンについて、免疫賦活効果が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Triggering+dectin1+pathway+alone+is+not+sufficient
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、インターロイキン－６の産生を促進することができる新規な技術を提供することを目的とする。また、本発明はインターロイキン－１０の産生を促進することができる新規な技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は鋭意研究の結果、未精製の状態である酵母細胞壁の加水分解物が精製物と比較して、インターロイキン－６やインターロイキン－１０の産生を促進することができることを見出し、本発明を完成させた。
【0007】
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む、インターロイキン－６産生促進剤。
［２］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１］に記載のインターロイキン－６産生促進剤。
［３］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む、インターロイキン－１０産生促進剤。
［４］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［３］に記載のインターロイキン－１０産生促進剤。
［５］ インターロイキン－６の産生を促進する組成物を調製するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の使用。
［６］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［５］に記載の使用。
［７］ インターロイキン－１０の産生を促進する組成物を調製するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の使用。
［８］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［７］に記載の使用。
［９］ 前記組成物が食品組成物または医薬組成物である［５］から[８]のいずれか一つに記載の使用。
［１０］ インターロイキン－６の産生を促進するための酵母細胞壁加水分解物の非治療的使用。
［１１］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１０］に記載の使用。
［１２］ インターロイキン－１０の産生を促進するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の非治療的使用。
［１３］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１２］に記載の使用。
［１４］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を対象に摂取させることを含む、対象におけるインターロイキン－６の産生を促進する方法。
［１５］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１４］に記載の方法。
［１６］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を対象に摂取させることを含む、対象におけるインターロイキン－１０の産生を促進する方法。
［１７］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１６］に記載の方法。
［１］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む、インターロイキン－６産生促進剤。
［２］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１］に記載のインターロイキン－６産生促進剤。
［３］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む、インターロイキン－１０産生促進剤。
［４］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［３］に記載のインターロイキン－１０産生促進剤。
［５］ インターロイキン－６の産生を促進する組成物を調製するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の使用。
［６］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［５］に記載の使用。
［７］ インターロイキン－１０の産生を促進する組成物を調製するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の使用。
［８］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［７］に記載の使用。
［９］ 前記組成物が食品組成物または医薬組成物である［５］から[８]のいずれか一つに記載の使用。
［１０］ インターロイキン－６の産生を促進するための酵母細胞壁加水分解物の非治療的使用。
［１１］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１０］に記載の使用。
［１２］ インターロイキン－１０の産生を促進するための未精製である酵母細胞壁加水分解物の非治療的使用。
［１３］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１２］に記載の使用。
［１４］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を対象に摂取させることを含む、対象におけるインターロイキン－６の産生を促進する方法。
［１５］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１４］に記載の方法。
［１６］ 未精製である酵母細胞壁加水分解物を対象に摂取させることを含む、対象におけるインターロイキン－１０の産生を促進する方法。
［１７］ 前記酵母細胞壁加水分解物が、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０に調整し、６０～１２０℃で３～２４時間加水分解することにより得られる酵母細胞壁加水分解物である［１６］に記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、インターロイキン－６の産生を促進することができる新規な技術を提供することができる。また、本発明によれば、インターロイキン－１０の産生を促進することができる新規な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の一つの態様はインターロイキン－６（ＩＬ－６）の産生促進剤に関する。また、本発明の他の態様はインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の産生促進剤に関する。これらを本明細書においてはＩＬ産生促進剤と総称し、共通する一つの実施形態について以下、詳細に説明する。
ＩＬ産生促進剤は、未精製である酵母細胞壁加水分解物を含有する。
ＩＬ産生促進剤は、未精製である酵母細胞壁加水分解物を含有する。
【0011】
未精製である酵母細胞壁加水分解物は、酵母細胞壁を加水分解処理に供することにより得ることができる。酵母細胞壁は市販品を用いるようにしてもよいほか、酵母菌体から調製してもよい。
酵母菌体から酵母細胞壁を得る方法としては特に限定されず、例えば酵母菌体から公知の方法により得ることができる。具体的には、酵母菌体を４５～６５℃に加温して５～２０時間自己消化させた後、遠心分離機で上清を除去する方法や、酵母菌体を８０℃以上に昇温殺菌した後、そのまま遠心分離で上清を除去する方法や、酵素を添加、反応後に遠心分離して上清を除去する方法等が挙げられる。
酵母菌体から酵母細胞壁を得る方法としては特に限定されず、例えば酵母菌体から公知の方法により得ることができる。具体的には、酵母菌体を４５～６５℃に加温して５～２０時間自己消化させた後、遠心分離機で上清を除去する方法や、酵母菌体を８０℃以上に昇温殺菌した後、そのまま遠心分離で上清を除去する方法や、酵素を添加、反応後に遠心分離して上清を除去する方法等が挙げられる。
【0012】
酵母細胞壁が由来する酵母についても特に限定されず当業者が適宜設定することができる。例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、カンジダ（Candida）属、ピキア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsis）属に属する酵母等の食品グレードのもの（Bekatorou et al, 2006,Food Technol.Biotechnol.44(3),407-415）が挙げられる。
このうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生をより促進する観点から、ビール酵母などの属するサッカロマイセス（Saccharomyces）属の酵母が好ましい。サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するものとしては、ビール酵母、ウイスキー酵母、焼酎酵母、パン酵母、ワイン酵母、清酒酵母等を例示でき、例えばこれらのうち１種または２種以上を酵母細胞壁加水分解物の調製に用いるようにしてもよい。
ビール酵母を用いる場合には、例えば泥状ビール酵母、圧搾ビール酵母、乾燥ビール酵母、ビール酵母懸濁液などから酵母細胞壁を得たものを挙げることがでる。
このうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生をより促進する観点から、ビール酵母などの属するサッカロマイセス（Saccharomyces）属の酵母が好ましい。サッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するものとしては、ビール酵母、ウイスキー酵母、焼酎酵母、パン酵母、ワイン酵母、清酒酵母等を例示でき、例えばこれらのうち１種または２種以上を酵母細胞壁加水分解物の調製に用いるようにしてもよい。
ビール酵母を用いる場合には、例えば泥状ビール酵母、圧搾ビール酵母、乾燥ビール酵母、ビール酵母懸濁液などから酵母細胞壁を得たものを挙げることがでる。
【0013】
酵母細胞壁を加水分解する方法についても特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
このうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生量促進の観点から好ましい態様として、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０（より好ましくは１０．０～１２．０）に調整し、６０～１２０℃（より好ましくは８５～９５℃）で３～２４時間（より好ましくは１２～２０時間）加水分解することを挙げることができる。加水分解の際、攪拌はしてもしなくてもよい。
また、加水分解に供する酵母細胞壁は、加水分解処理の前に必要に応じアルカリ条件での洗浄処理等を行うようにしてもよい。
このうち、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生量促進の観点から好ましい態様として、酵母細胞壁のｐＨを８．０～１４．０（より好ましくは１０．０～１２．０）に調整し、６０～１２０℃（より好ましくは８５～９５℃）で３～２４時間（より好ましくは１２～２０時間）加水分解することを挙げることができる。加水分解の際、攪拌はしてもしなくてもよい。
また、加水分解に供する酵母細胞壁は、加水分解処理の前に必要に応じアルカリ条件での洗浄処理等を行うようにしてもよい。
【0014】
ＩＬ産生促進剤は例えば上記のようにして得ることができる未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む。未精製とは、例えばβグルカンや、マンナンなど酵母細胞壁中の特定の成分の純度を上げるための工程を行っていない状態のものをいう。酵母細胞壁中の特定の成分の純度を上げることを目的とする工程としては、例えば上述のようにして得られた酵母細胞壁加水分解物について行う、遠心分離やろ過、蒸留、再結晶、抽出、昇華、クロマトグラフィー、等電点沈殿分離、エタノール沈殿分離、塩析等の工程が挙げられる。ただし、これらと同様の工程であっても、酵母細胞壁中の特定の成分の純度を上げることを目的としない工程、例えば飲食品としての品質を担保するための異物除去を目的とした工程等は含まない。酵母細胞壁加水分解物中の特定の成分の純度を上げるための工程であるか否かは、当業者は、当該工程において使用する機器や処理条件などから判別することができる。
【0015】
ＩＬ産生促進剤は未精製である酵母細胞壁加水分解物に加えて、本発明の目的を達することができる限り、他の成分を含んでいてもよい。
ＩＬ産生促進剤の形態（剤型）については特に限定されず、医薬品、医薬部外品または飲食品などとして製造することができる。
ＩＬ産生促進剤を医薬品、医薬部外品または飲食品とする場合、未精製の酵母細胞壁分解物と例えば賦型剤、結合剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の成分とを適宜混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等が可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
ＩＬ産生促進剤の形態（剤型）については特に限定されず、医薬品、医薬部外品または飲食品などとして製造することができる。
ＩＬ産生促進剤を医薬品、医薬部外品または飲食品とする場合、未精製の酵母細胞壁分解物と例えば賦型剤、結合剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の成分とを適宜混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等が可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
【0016】
または、特に限定されないが、ＩＬ産生促進剤が飲食品としての態様で製造される場合、通常の飲食品のほか、特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品などであってもよい。飲食品の具体例としては、例えば、栄養補助食品（サプリメント）、牛乳、加工乳、乳飲料、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、アイスクリーム、キャンディ、グミ、ガム、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品等を挙げることができる。
また、ＩＬ産生促進剤は、ヒトを対象とする医薬品、医薬部外品、飲食品に限らず、ヒト以外の動物に対する医薬品や飼料などの形態であってもよい。ヒト以外の動物としてはヒト以外の高等脊椎動物、特にヒト以外の哺乳類を挙げることができ、より具体的にはイヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜を例示することができる。また、鳥類や魚類も挙げることができ、より具体的には肉鶏、産卵鶏、七面鳥や、サーモン、コイ、フナ、ティラピア、ナマズ、スズキ、ブリ、カンパチ、ヒラメ、タイ、マグロ等の養殖魚を例示することができる。さらに、エビ、カニ等無脊椎動物も挙げることができる。
また、ＩＬ産生促進剤は、ヒトを対象とする医薬品、医薬部外品、飲食品に限らず、ヒト以外の動物に対する医薬品や飼料などの形態であってもよい。ヒト以外の動物としてはヒト以外の高等脊椎動物、特にヒト以外の哺乳類を挙げることができ、より具体的にはイヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜を例示することができる。また、鳥類や魚類も挙げることができ、より具体的には肉鶏、産卵鶏、七面鳥や、サーモン、コイ、フナ、ティラピア、ナマズ、スズキ、ブリ、カンパチ、ヒラメ、タイ、マグロ等の養殖魚を例示することができる。さらに、エビ、カニ等無脊椎動物も挙げることができる。
【0017】
ＩＬ産生促進剤の一日あたりの摂取量についても特に限定されず、例えば、成人の場合、未精製の酵母細胞壁加水分解物を０．０１～１００ｇ、好ましくは０．１～１０g摂取できるように配合量等を調整すればよい。ＩＬ産生促進剤における未精製の酵母細胞壁加水分解物の含有割合も特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日の投与量等に合わせて適宜調節すればよい。
【0018】
以上、本実施形態によれば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生を促進可能である新規な技術を提供できる。
すなわち、本実施形態に係る未精製である酵母細胞壁加水分解物等を、摂取の態様は特に限定されないが、例えば上述の当該未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む医薬品、医薬部外品、食品などの態様で摂取することにより、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生を促進することができる。その結果、個人差はあるが、免疫機能の賦活化による感染症の症状緩和などが期待できる。
すなわち、本実施形態に係る未精製である酵母細胞壁加水分解物等を、摂取の態様は特に限定されないが、例えば上述の当該未精製である酵母細胞壁加水分解物を含む医薬品、医薬部外品、食品などの態様で摂取することにより、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生を促進することができる。その結果、個人差はあるが、免疫機能の賦活化による感染症の症状緩和などが期待できる。
【実施例】
【0019】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【0020】
［未精製の酵母細胞壁分解物の調製（実施例）］
アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１０％）を、加水分解処理に供した。
具体的は、酵母細胞壁を水酸化ナトリウムでｐＨ１１に調整後、９０℃に加熱し、１８時間処理した。これをドラムドライヤーにて乾燥し、酵母細胞壁加水分解物（以下、ＨＹＣＷ）とした。
アサヒグループ食品（株）栃木小金井工場にて製造したサッカロマイセス（Saccharomyces）属に属するビール酵母に由来する酵母細胞壁（固形分１０％）を、加水分解処理に供した。
具体的は、酵母細胞壁を水酸化ナトリウムでｐＨ１１に調整後、９０℃に加熱し、１８時間処理した。これをドラムドライヤーにて乾燥し、酵母細胞壁加水分解物（以下、ＨＹＣＷ）とした。
【0021】
［精製した酵母細胞壁分解物の調製（比較例）］
上記の加水分解処理後の乾燥を行わずに、塩酸でｐＨ５．５に調整後、遠心分離して得られた重液をドラムドライヤーで乾燥したものを酵母グルカン（以下、ＹＧ）とした。また、軽液をＢｒｉｘ４０％まで濃縮した後、１２５℃、４０秒の条件で殺菌し、スプレードライにて乾燥したものを酵母マンナン（以下、ＹＭ）とした。
上記の加水分解処理後の乾燥を行わずに、塩酸でｐＨ５．５に調整後、遠心分離して得られた重液をドラムドライヤーで乾燥したものを酵母グルカン（以下、ＹＧ）とした。また、軽液をＢｒｉｘ４０％まで濃縮した後、１２５℃、４０秒の条件で殺菌し、スプレードライにて乾燥したものを酵母マンナン（以下、ＹＭ）とした。
【0022】
なお、実施例、比較例とも、２０１３年８月および同年９月製造の２種類の酵母細胞壁を用い、それぞれ上記の調製を行った。以下、２０１３年８月製造の酵母細胞壁に由来するものを（ａ）と、同年９月製造の酵母細胞壁に由来するものを（ｂ）とする。
【0023】
［β－グルカン純度］
実施例であるＨＹＣＷと、比較例であるＹＧ、ＹＭについて、採取した試料にα-アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼを順に作用させた後に、エタノールを添加した。生成した沈殿を８０％エタノール、アセトンを用いて洗浄した。その後、７２％ 硫酸を５ｍＬ添加し、２０℃で４時間分解した後、水を７０ｍＬ添加し、沸騰水浴中で２時間加水分解を行った。冷却、中和後、グルコースオキシダーゼ法によりグルコース濃度を定量し、それに０．９を乗じ、β-グルカン純度を算出した。
結果を図１に示す。ＨＹＣＷを遠心分離することにより、β－グルカン画分とマンナン画分に分離することができる。沈殿を乾燥させたものがＹＧで、β－グルカン純度は約３３％に高まり、上清を乾燥させたものがＹＭでβ－グルカン純度は約１％とほぼ含まれていなかった。
実施例であるＨＹＣＷと、比較例であるＹＧ、ＹＭについて、採取した試料にα-アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼを順に作用させた後に、エタノールを添加した。生成した沈殿を８０％エタノール、アセトンを用いて洗浄した。その後、７２％ 硫酸を５ｍＬ添加し、２０℃で４時間分解した後、水を７０ｍＬ添加し、沸騰水浴中で２時間加水分解を行った。冷却、中和後、グルコースオキシダーゼ法によりグルコース濃度を定量し、それに０．９を乗じ、β-グルカン純度を算出した。
結果を図１に示す。ＨＹＣＷを遠心分離することにより、β－グルカン画分とマンナン画分に分離することができる。沈殿を乾燥させたものがＹＧで、β－グルカン純度は約３３％に高まり、上清を乾燥させたものがＹＭでβ－グルカン純度は約１％とほぼ含まれていなかった。
【0024】
［ＩＬ－６、ＩＬ－１０産生量の測定］
公知の方法に従い、ＩＬ－６、ＩＬ－１０を測定した（Sonck et al,2010,Veterinary Immunology and Immunopathology 135,199-207）。１４週齢の離乳子豚５頭の頸静脈から、ヘパリン管に末梢血を採血した。その後、Lymphoprepを用い、８００×g・１８℃・２５分間の条件下で密度勾配遠心分離し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。塩化アンモニウムで赤血球を溶血し、３５０×g・１８℃・１０分間の遠心分離後、沈殿を１０％ ウシ胎児血清・非必須アミノ酸溶液・１００ μｇ／ｍＬピリビン酸ナトリウム・２９２ｍｇ／ｍＬ Ｌ-グルタミン・１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン・１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン・１００ μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対しＨＹＣＷ、ＹＧ、ＹＭにより刺激し、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生量を測定した。
具体的には、２０μｇ／ｍＬもしくは２００μｇ／ｍＬ の各サンプルで、マルチウェルプレート上にて１×１０７ ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣを２４時間刺激した。
その後、上清を回収し、市販のサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Systems社）を用いて、マニュアルに従って測定した。negative control はHBSS（Hank's Balanced Salt Solution）を使用した。
公知の方法に従い、ＩＬ－６、ＩＬ－１０を測定した（Sonck et al,2010,Veterinary Immunology and Immunopathology 135,199-207）。１４週齢の離乳子豚５頭の頸静脈から、ヘパリン管に末梢血を採血した。その後、Lymphoprepを用い、８００×g・１８℃・２５分間の条件下で密度勾配遠心分離し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。塩化アンモニウムで赤血球を溶血し、３５０×g・１８℃・１０分間の遠心分離後、沈殿を１０％ ウシ胎児血清・非必須アミノ酸溶液・１００ μｇ／ｍＬピリビン酸ナトリウム・２９２ｍｇ／ｍＬ Ｌ-グルタミン・１００ ＩＵ／ｍＬ ペニシリン・１００ μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン・１００ μｇ／ｍＬ カナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対しＨＹＣＷ、ＹＧ、ＹＭにより刺激し、ＩＬ－６、ＩＬ－１０の産生量を測定した。
具体的には、２０μｇ／ｍＬもしくは２００μｇ／ｍＬ の各サンプルで、マルチウェルプレート上にて１×１０７ ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣを２４時間刺激した。
その後、上清を回収し、市販のサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Systems社）を用いて、マニュアルに従って測定した。negative control はHBSS（Hank's Balanced Salt Solution）を使用した。
【0025】
【図1】
【図2】
【図3】
