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特許7255832パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のマンナナーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-03
(45)【発行日】2023-04-11
(54)【発明の名称】パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のマンナナーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/26 20060101AFI20230404BHJP
C11D 3/386 20060101ALI20230404BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20230404BHJP
【ＦＩ】
C12N9/26 Z
C11D3/386
C12N15/56 ZNA
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2017501229
(86)(22)【出願日】2015-07-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2017-08-17
(86)【国際出願番号】 US2015040057
(87)【国際公開番号】W WO2016007929
(87)【国際公開日】2016-01-14
【審査請求日】2018-07-10
【審判番号】
【審判請求日】2020-10-16
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2014/082034
(32)【優先日】2014-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】509240479
【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100071010
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 行造
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(72)【発明者】
【氏名】アダムス、クリスチャン・ディー
(72)【発明者】
【氏名】ジルニカール、ルーパ
(72)【発明者】
【氏名】フアン、ヴィクトリア
(72)【発明者】
【氏名】ジン、リリン
(72)【発明者】
【氏名】コルクマン、マルク
(72)【発明者】
【氏名】チェン、ゼン
【合議体】
【審判長】上條 肇
【審判官】長井 啓子
【審判官】宮岡 真衣
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１４６３１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．６２，ｐｐ．５１４－５２０（１９９８）
【文献】ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，ｖｏｌ．６，ｅ１４６０８（ｐｐ．１－１２）（２０１１）
【文献】Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１６０－１６６（２００８）
【文献】Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１５９，ｐｐ．８５－９４（２００９）
【文献】Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，ｖｏｌ．９，Ａｒｔ．ｎｏ．２０（ｐｐ．１－１３）（２０１０）
【文献】Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ５）［Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＨＧＦ５］，ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＥＧＧ３４４５４，（Ａｐｒ．１５，２０１１），［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｏｎ ２０１９－０６－２４］，Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ，ＵＲＬ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＥＧＧ３４４５４．１？ｒｅｐｏｒｔ＝ｇｉｒｅｖｈｉｓｔ
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ａｓｎ３３－Ａｓｐ３４－Ｌｅｕ３５を含み、かつマンナナーゼ活性を有するＮＤＬクレードのポリペプチドを含む洗浄組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号３０、３１、および７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ポリペプチドがエンド－β－マンナナーゼであり、
前記ポリペプチドが、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した状態で、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液を用いて緩衝化したローカストビーンガムを基質として用いて、５０℃、１０分間で、ｐＨ６．５～８．５において、マンナナーゼ活性用アッセイによって決定されるとき、その最大マンナナーゼ活性の少なくとも７０％を保持し（この活性を、至適ｐＨでの活性を１００％とした場合の相対活性として報告する）、
前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、洗浄組成物。
【請求項2】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１に記載の洗浄組成物。
【請求項3】
前記ポリペプチドが、３０～３９番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩモチーフを更に含み、このときＸａがＦ又はＹであり、Ｘが任意のアミノ酸であり、前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、請求項１または２に記載の洗浄組成物。
【請求項4】
前記ポリペプチドが、３０～３９番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩモチーフを更に含み、このときＸａがＦ又はＹ、ＸｂがＮ、Ｙ又はＡ、ＸｃがＡ又はＴであり、前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、請求項１～３のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項5】
前記ＮＤＬクレードのポリペプチドが、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３ＸＸＸＧＰＸＧＸＬ２７２Ｔ２７３モチーフを更に含み、このときＸが任意のアミノ酸であり、前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、請求項１～４のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項6】
前記ＮＤＬクレードのポリペプチドが、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３Ｍ／ＬＶ／ＡＴ／ＡＧＰＸ１ＧＸ２Ｌ２７２Ｔ２７３モチーフを更に含み、このときＸ１がＮ、Ａ又はＳであり、Ｘ２がＳ、Ｔ又はＮであり、前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、請求項１～５のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項7】
前記ＮＤＬクレードのポリペプチドが、２６２～２７３番目の位置にＬＤＬＡ／ＶＡ／ＴＧＰＳ／ＮＧＮＬＴモチーフを更に含む、ＮＤＬクレード２のポリペプチドであり、このとき前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、請求項１～６のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項8】
前記ポリペプチドが、プロテアーゼの存在下でマンナナーゼ活性を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項9】
前記ポリペプチドが、グアーガム、ローカストビーンガム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される基質の加水分解が可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項10】
前記ポリペプチドが、炭水化物結合モジュールを更に含まない、請求項１～９のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項11】
Ａｓｎ３３－Ａｓｐ３４－Ｌｅｕ３５を含み、かつマンナナーゼ活性を有するＮＤＬクレードのポリペプチドを含む、洗浄組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号２７、３５、３９、４３、４７、５１および５９から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ポリペプチドがエンド－β－マンナナーゼであり、
前記ポリペプチドが、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した状態で、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液を用いて緩衝化したローカストビーンガムを基質として用いて、５０℃、１０分間で、ｐＨ６．５～８．５において、マンナナーゼ活性用アッセイによって決定されるとき、その最大マンナナーゼ活性の少なくとも７０％を保持し（この活性を、至適ｐＨでの活性を１００％とした場合の相対活性として報告する）、
前記ポリペプチドのアミノ酸の位置が、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている、洗浄組成物。
【請求項12】
界面活性剤；少なくとも１種の補助成分；並びに／又は、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－β－１，４－グルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルノニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素；を更に含む、請求項１～１１に記載の洗浄組成物。
【請求項13】
前記洗浄組成物が、洗濯用洗剤、布地柔軟化洗剤、食器用洗剤、及び硬質面洗浄用洗剤からなる群から選択される洗剤組成物である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項14】
前記洗浄組成物が、液体、粉末、粒状固形物、錠剤、シート、及び一回用量型からなる群から選択される形態である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項15】
前記組成物がリン酸塩を含まない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項16】
前記組成物がホウ素を含まない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項17】
衣類の洗浄方法であって、汚れた衣類を、請求項１～１６のいずれか一項に記載の洗浄組成物と接触させ、清浄衣類をもたらすことを含む、方法。 【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２０３４号（２０１４年７月１１日出願）の優先権を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２０３４号（２０１４年７月１１日出願）の優先権を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、パエニバチルス（Paenibacillus）又はバチルス（Bacillus）種由来のエンド－β－マンナナーゼ、かかるエンド－β－マンナナーゼをコードするポリヌクレオチド、かかるマンナナーゼを含有する組成物、及びその使用方法に関する。かかるエンド－β－マンナナーゼを含有する組成物は、洗剤、並びに布地及び硬質面の洗浄、並びに様々なその他工業用途として使用するのに好適である。
【0003】
エンド－β－マンナナーゼ等のマンナナーゼ酵素は、マンナンの加水分解によりゴムの染みを除去するため、洗剤洗浄組成物に使用されている。天然には、例えば、直鎖マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びグルコガラクトマンナン等の、様々なマンナンがある。かかるマンナンはそれぞれ、最大３３％がグルコース残基で置換され得る、β－１，４結合したマンノース残基の主鎖を含む、ポリサッカライドからなる（Ｙｅｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｅｌｓｉｖｉｅｒ）。ガラクトマンナン又はグルコガラクトマンナンでは、ガラクトース残基は、α－１，６結合でマンナン主鎖に結合されている（Ｍｏｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｆｉｌｈｏ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７９：１６５，２００８）。したがって、マンナンの構成糖への加水分解は、１，４－β－マンノシダーゼによって更にモノサッカライドまで分解される短鎖マンノ－オリゴサッカライドを生成するために、主鎖結合を加水分解するエンド－１，４－β－マンナナーゼが必要である。
【0004】
エンド－β－マンナナーゼは、工業用酵素の技術分野において既知であるが、特定の条件及び使用に好適な、更なるエンド－β－マンナナーゼの必要性が残っている。
【0005】
具体的には、本開示は、組換えポリペプチド、又は、ＮＤＬクレードを含むその活性フラグメントを提供する。一実施形態は、本明細書に記載される、ポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。別の実施形態は、本明細書に記載される、組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、エンド－β－マンナナーゼである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、エンド－β－マンナナーゼである。一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、Ａｓｎ３３－Ａｓｐ－３４－Ｌｅｕ３５（ＮＤＬ）を含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、上記任意の組換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、Ａｓｎ３３－Ａｓｐ－３４－Ｌｅｕ３５（ＮＤＬ）を含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。別の実施形態では、ＮＤＬクレードは、３０～３８番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩモチーフを含み、ＸａはＦ又はＹであり、このときＸは任意のアミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、３０～３８番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩモチーフを含み、このときＸａはＦ又はＹであり、ＸｂはＮ、Ｙ又はＡであり、ＸｃはＡ又はＴであり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、３０～３８番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩモチーフを含み、このときＸａはＦ又はＹであり、ＸｂはＮ、Ｙ又はＡであり、ＸｃはＡ又はＴであり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。更なる実施形態では、ＮＤＬクレードは、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３ＸＸＸＧＰＸＧＸＬ２７２Ｔ２７３モチーフを含み、このときＸは任意のアミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードは、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３Ｍ／ＬＶ／ＡＴ／ＡＧＰＸ１ＧＸ２Ｌ２７２Ｔ２７３モチーフを含み、このときＸ１はＮ、Ａ又はＳであり、Ｘ２はＳ、Ｔ又はＮであり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。更なる一実施形態は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＡ／ＮＧＳ／ＴＬＴモチーフを含むＮＤＬクレード１を目的とし、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。なお更なる実施形態は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＬＡ／ＶＡ／ＴＧＰＳ／ＮＧＮＬＴモチーフを含むＮＤＬクレード２を目的とし、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。別の実施形態は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＬ／ＶＳ／ＡＴ／ＮＧＰＳＧＮＬＴモチーフを含むＮＤＬクレード３を目的とし、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。別の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、マンナナーゼ活性、例えばローカストビーンガムガラクトマンナン又はコンニャクグルコマンナンへの活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、界面活性剤の存在下でマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、４．５～９．０のｐＨ範囲で、その最大マンナナーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、４０℃～７０℃の温度範囲で、その最大マンナナーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、洗剤組成物中で洗浄活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、プロテアーゼの存在下でマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、グアーガム、ローカストビーンガム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される基質の加水分解が可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、炭水化物結合モジュールを更に含まない。
【0006】
別の実施形態は、前段落の少なくとも１つのポリペプチドを含む、洗浄組成物を目的とする。本開示で更に提供されるのは、前段落の少なくとも１つの組換えポリペプチドを含む、洗浄組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、界面活性剤を更に含む。いくつかの好ましい実施形態では、界面活性剤はイオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、イオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－β－１，４－グルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルノニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、酵素を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、プロテアーゼ及びアミラーゼを更に含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、洗剤は、洗濯用洗剤、布地柔軟化洗剤、食器用洗剤、及び硬質面洗浄用洗剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、粒状、粉末、固形、バー状、液体、錠剤、ゲル、ペースト、フォーム、シート、又は一回用量型組成物である。いくつかの実施形態では、洗剤は、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される形態である。本開示は更に、清浄表面を得るために表面を洗剤組成物と接触させることを含む、表面上の汚れ又は染み中に存在するマンナン基質を加水分解する方法を提供する。更に提供されるのは、清浄衣類を得るために汚れた衣類を洗剤組成物と接触させることを含む、衣類の洗浄方法である。
【0008】
更に、本開示は、前段落のポリペプチドをコードする核酸又は単離核酸を提供する。加えて、本開示は、前段落の組換えポリペプチドをコードする核酸又は単離核酸を提供する。更に提供されるのは、作動可能に制御配列に連結された本明細書に記載される核酸を含む、発現ベクターである。また提供されるのは、作動可能に制御配列と組み合わせて本明細書に記載される核酸を含む、発現ベクターである。加えて、本明細書に記載される発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。別の実施形態は、本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする核酸を含む、宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞又は真菌細胞である。
【0009】
本開示は更に、好適な条件下の培養培地中で宿主細胞を培養し、本発明のエンド－β－マンナナーゼを含む培養物を産生することを含む、本発明のエンド－β－マンナナーゼを産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、遠心分離によって培養物から宿主細胞を除くことと、濾過によって１０ｋＤａ未満の細片を除去し、エンド－β－マンナナーゼを濃縮した上清を得ることと、を更に含む。
【0010】
本開示は更に、マンノースを含むポリサッカライドを上清と接触させ、マンノースを含むオリゴサッカライドをもたらすことを含む、ポリサッカライドを加水分解する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリサッカライドは、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0011】
本発明の組成物及び方法のこれら及びその他の態様は、以下の説明より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４のプラスミドマップを提供する。
【図2A】ｐＨ８、２０分における、ローカストビーンガム（ＣＳ－７３）に対するパエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種のマンナナーゼの洗浄性能を示す。
【図2B】ｐＨ８、２０分における、ローカストビーンガム（ＣＳ－７３）に対するパエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種のマンナナーゼの洗浄性能を示す。
【図3A】ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２を含む、マンナナーゼのＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８３）多重整列を示す。
【図3B】ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２を含む、マンナナーゼのＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８３）多重整列を示す。
【図3C】ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２を含む、マンナナーゼのＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８３）多重整列を示す。
【図4】他のマンナナーゼからのＮＤＬクレードマンナナーゼの枝分かれ、並びにＮＤＬクレード１及びＮＤＬクレード２の分化を示す、ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２を含む、マンナナーゼの系統樹を示す。
【図5】保存された一次配列番号を用いる、３０～３８番目の位置のＮＤＬクレードマンナナーゼのモチーフを示す。
【図6】保存された一次配列番号を用いる、保存されたＬｅｕ２６２－Ａｓｐ２６３（ＬＤ）と保存されたＬｅｕ２７２－Ｔｈｒ２７３（ＬＴ）残基との間の、ＮＤＬクレード１及びＮＤＬクレード２マンナナーゼを含むＮＤＬクレードマンナナーゼのモチーフを示す。
【図7】ＮＤＬクレードマンナナーゼにおいて見いだされる、モチーフの変化の結果として可能性のある構造を示す。バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２（１ＷＫＹ）の最も近い既知のマンナナーゼ構造を黒で示し、一方、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ９及びＰｐａＭａｎ２のモデリングした構造を灰色で示す。欠失モチーフの位置を矢印でハイライトしている。欠失モチーフは、それが位置するループの構造に影響を及ぼすと考えられる。
【図8】ｐＨ７．２、３０分における、ローカストビーンガム（ＣＳ－７３）に対するＰａｍＭａｎ３及び規準マンナナーゼの洗浄性能を示す。
【図9A】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図9B】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図9C】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図9D】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図9E】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図9F】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型の様々なマンナナーゼの複数の配列のアライメントを示す。
【図10】近接結合法を用いて作成され、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｔｒｅｅ Ｂｕｉｌｄｅｒプログラムを用いて描出された、成熟型の様々なマンナナーゼのアミノ酸配列の系統樹を示す。
【図11A】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型のＮＤＬクレードマンナナーゼの配列アライメントを示す。
【図11B】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型のＮＤＬクレードマンナナーゼの配列アライメントを示す。
【図11C】ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアを用いて作成された、成熟型のＮＤＬクレードマンナナーゼの配列アライメントを示す。
【0013】
本明細書に記載されるのは、パエニバチルス（Paenibacillus）又はバチルス（Bacillus）種由来のエンド－β－マンナナーゼ、かかるエンド－β－マンナナーゼをコードするポリヌクレオチド、かかるマンナナーゼを含有する組成物、及びその使用方法である。一実施形態では、本明細書に記載されるパエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種のエンド－β－マンナナーゼは、洗剤組成物の存在下でグリコシルヒドロラーゼ活性を有する。この本明細書に記載されるエンド－β－マンナナーゼの特徴によって、例えば、洗剤組成物に含まれている界面活性剤及び他の成分の存在下で、この酵素がマンナンを加水分解することができる、様々な洗浄及び他の工業用用途で使用するのによく適するようになる。
【0014】
以下の用語は、明確にするために定義される。定義されない用語及び略語は、当該技術分野において用いられるそれらの通常の意味を有するものとする。
【0015】
本明細書で使用するとき、「マンナンエンド－１，４－β－マンノシダーゼ」、「エンド－１，４－β－マンナナーゼ」、「エンド－β－１，４－マンナーゼ」、「β－マンナナーゼＢ」、「β－１，４－マンナン４－マンナノヒドロラーゼ」、「エンド－β－マンナナーゼ」、「β－Ｄ－マンナナーゼ」、「１，４－β－Ｄ－マンナンマンナノヒドロラーゼ」、又は「エンド－β－マンナナーゼ」（ＥＣ ３．２．１．７８）は、マンナン、ガラクトマンナン及びグルコマンナン中の１，４－β－Ｄ－マンノシド結合をランダムに加水分解することが可能な酵素を指す。エンド－１，４－β－マンナナーゼは、ＧＨ２６及びＧＨ５を含む、いくつかのファミリーのグリコシルヒドロラーゼのメンバーである。具体的には、エンド－β－マンナナーゼは、マンナンを分解し、マンノース単位を含有する多糖鎖を切断可能な（すなわち、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン及びガラクトグルコ－マンナン中のグリコシド結合を切断可能な）酵素を意味する、ポリサッカラーゼ群を構成する。本開示の「エンド－β－マンナナーゼ」は、追加の酵素活性（例えば、エンド－１，４－β－グルカナーゼ、１，４－β－マンノシダーゼ、セロデキストリナーゼ活性等）を持ってよい。
【0016】
本明細書で使用するとき、「マンナナーゼ」、「マンノシド酵素」、「マンナン分解酵素」、「マンナナーゼ酵素」、「マンナナーゼポリペプチド」、又は「マンナナーゼタンパク質」は、マンナン分解能を呈する酵素、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。マンナナーゼ酵素は、例えば、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、又はグリコシルヒドロラーゼであってよい。本明細書で使用するとき、マンナナーゼ活性は、当該技術分野において既知の任意の手順に従って測定できる（例えば、Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８，１９７２；米国特許第６，６０２，８４２号；及び、国際公開第９５／３５３６２Ａ１号を参照されたい）。
【0017】
本明細書で使用するとき、「マンナン」は、β－１，４結合したマンノースからなる主鎖を有するポリサッカライドであり、「グルコマンナン」は、ほぼ規則的に交互にβ－１，４結合したマンノース及びグルコースの主鎖を有するポリサッカライドであり、「ガラクトマンナン」及び「ガラクトグルコマンナン」は、α－１，６結合したガラクトース側枝を有するマンナン及びグルコマンナンである。これらの化合物をアセチル化してよい。ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンの分解は、ガラクトース側枝を完全に又は部分的に除去することによって促進される。更に、アセチル化マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンの分解は、完全に又は部分的脱アセチル化によって促進される。アセチル基は、アルカリによって、又はマンナンアセチルエステラーゼによって除去できる。マンナナーゼから、又はマンナナーゼ及びα－ガラクトシダーゼ及び／若しくはマンナンアセチルエステラーゼの組み合わせによって放出されるオリゴマーは、β－マンノシダーゼ及び／又はβ－グルコシダーゼによって更に分解され、遊離のマルトースを放出できる。
【0018】
本明細書で使用するとき、「触媒活性」又は「活性」は、定められた反応条件下におけるある基質の変換を、定量的に説明するものである。用語「残留活性」は、ある条件下における酵素の触媒活性と、異なる条件下における触媒活性との比率として定義される。用語「比活性」は、定められた反応条件下における酵素量に対する触媒活性を、定量的に説明するものである。
【0019】
本明細書で使用するとき、「ｐＨ安定性」は、安定性が最適であるｐＨから大きく外れたｐＨ値への限定的曝露に耐える（例えば、至適ｐＨより１単位を超えて上下させ、活性が測定可能な条件下でその活性を損なわない）、タンパク質の特性を説明するものである。
【0020】
本明細書において使用するところの「洗剤安定性」なる語句は、洗剤組成物混合物中の特定の洗剤組成物成分（加水分解酵素等）の安定性のことを指す。
【0021】
本明細書で使用するとき、「ペルヒドロラーゼ」は、洗浄、漂白、及び消毒等の用途に適した過酸を生成する反応を触媒する能力を有する酵素である。
【0022】
本明細書において使用するところの、「水性組成物」及び「水性環境」といった語句で用いられる「水性」なる用語は、少なくとも５０％が水で構成された組成物のことを指す。水性組成物は、少なくとも５０％の水、少なくとも６０％の水、少なくとも７０％の水、少なくとも８０％の水、少なくとも９０％の水、少なくとも９５％の水、少なくとも９７％の水、少なくとも９９％の水、又は更には少なくとも９９％の水を含み得る。
【0023】
本明細書で使用するとき、用語「界面活性剤」は、当該技術分野において、界面活性作用を有するものとして一般的に認識されている任意の化合物のことを指す。界面活性剤には一般的に、アニオン性、カチオン性、非イオン性、及び両性イオン性化合物が含まれるが、これらについては更に後述する。
【0024】
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面が示す疎水性及び親水性等の特性に関して使用される。
【0025】
用語「酸化安定性」は、例えば漂白剤又は酸化剤に曝露又は接触させられる際に、マンノシド分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書に開示される他のプロセス中に、一般的な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のエンド－β－マンナナーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、エンド－β－マンナナーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１分、約３分、約５分、約８分、約１２分、約１６分、約２０分といった時間にわたって漂白剤又は酸化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のエンド－β－マンナナーゼ活性を維持する。
【0026】
用語「キレート化安定性」は、例えばキレート化剤に曝露又は接触させられる際に、マンノシド分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書に開示される他のプロセス中に、一般的な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のエンド－β－マンナナーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、エンド－β－マンナナーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１０分、約２０分、約４０分、約６０分、約１００分といった時間にわたってキレート化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のエンド－β－マンナナーゼ活性を維持する。
【0027】
用語「熱安定性」及び「熱安定的」は、例えば温度変化に曝される際に、マンノシド分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書に開示される他のプロセス中に、一般的な条件下で一定の時間にわたって特定の温度に曝された後、所定量の酵素活性を維持する本開示のエンド－β－マンナナーゼのことを指す。変化した温度には、温度の上昇又は低下が含まれる。いくつかの実施形態では、エンド－β－マンナナーゼは、所定の時間、例えば、少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分といった時間にわたって温度変化に曝露された後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のエンド－β－マンナナーゼ活性を維持する。
【0028】
用語「洗浄活性」は、マンノシド分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書に開示される他のプロセス中に、一般的な条件下でエンド－β－マンナナーゼによって得られる洗浄性能のことを指す。いくつかの実施形態では、洗浄性能は、食品、家庭用剤、又はパーソナルケア製品から生じる酵素感応性の染みに関する様々な洗浄アッセイを応用することによって決定される。染みを標準的洗浄条件にかけた後、様々なクロマトグラフ法、分光光度法、又はその他定量法によって測定される、これらの染みの一部としては、例えば、アイスクリーム、ケチャップ、ＢＢＱソース、マヨネーズ、スープ、チョコレートミルク、チョコレートプディング、冷菓、シャンプー、ボディローション、日焼け止め製品、練り歯磨き、ローカストビーンガム、又はグアーガムが挙げられる。代表的なアッセイには、これらに限定されるものではないが、国際公開第９９／３４０１１号、米国特許第６，６０５，４５８号、及び同第６，５６６，１１４号（これら全ては参照することによって本明細書に組み込まれる）に述べられるもの、並びに実施例に含まれる方法が挙げられる。
【0029】
本明細書で使用するとき、用語「清浄表面」及び「清浄衣類」は、汚れた表面又は衣類の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％の染み除去率を有する、表面又は衣類をそれぞれ指す。
【0030】
用語、エンド－β－マンナナーゼの「洗浄有効量」は、特定の洗浄組成物中の所望の酵素活性のレベルを実現する本明細書に記載されるエンド－β－マンナナーゼの量のことを指す。このような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用される特定のエンド－β－マンナナーゼ、洗浄用途、洗浄組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、粒状、バー状、粉末、固形、液体、錠剤、ゲル、ペースト、フォーム、シート、又は一回用量型）のいずれであるのか、等の多くの要因に基づくものである。
【0031】
用語「洗浄添加物質」は、本明細書で使用するとき、所望の洗浄組成物の具体的な種類、及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、一回用量型、シート、又はフォーム組成物）に対して選択される任意の液体、固体又は気体状物質を意味し、これらの物質はまた、組成物中に用いられるエンド－β－マンナナーゼ酵素と適合性を有することが好ましい。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「圧縮」形態であり、他の実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【0032】
本明細書で使用するとき、「洗浄組成物」及び「洗浄配合物」は、布地、食器、コンタクトレンズ、他の固体表面、毛髪、皮膚、歯等の洗浄しようとする物品からの望ましくない化合物（例えば、汚れ又は染み）の除去において有用な化学成分の混合物のことを指す。組成物又は配合物は、洗浄しようとする表面、物品又は布地、及び組成物又は配合物の所望の形態に応じて、液体、ゲル、顆粒、粉末、バー状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、一回用量型、シート、又はフォームの形態であってよい。
【0033】
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」及び「洗剤配合物」は、汚れた対象物の洗浄用の洗浄媒質中での使用を目的とした化学成分の混合物のことを指す。洗剤組成物／配合物は一般的に少なくとも１種の界面活性剤を含み、更に必要に応じて、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光染料、凝固防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤が含まれる。
【0034】
本明細書で使用するとき、「食器洗い用組成物」は、粒子及び液体状形態を含むがこれらに限定されない、カトラリー類を含む食器を洗浄するための組成物のあらゆる形態のことを指す。いくつかの実施形態では、食器洗い用組成物は、自動食器洗い機において有用な「自動食器洗い用」組成物である。本開示が任意の特定の種類又は食器用組成物に限定されることは意図するところではない。実際、本開示は、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラス、アクリル等を含むがこれらに限定されない任意の材料の食器（例えば、プレート、カップ、グラス、ボール等を含むがこれらに限定されない皿類）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、フォーク、給仕器具等の器具）の洗浄において有用なものである。用語「食器」は、本明細書で皿類及びカトラリーの両方に対して使用される。
【0035】
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、材料（例えば、布地、洗濯物、パルプ等）の光沢化（すなわち、増白）及び／又は洗浄を行ううえで充分な長さの時間、かつ適当なｐＨ及び温度条件下で行われる材料又は表面の処理のことを指す。漂白に好適な化学物質の例としては、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0036】
本明細書で使用するとき、変異型エンド－β－マンナナーゼの「洗浄性能」とは、洗剤組成物に更なる洗浄性能を与える、洗浄に対する変異型エンド－β－マンナナーゼの寄与のことを指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。
【0037】
用語「関連する洗浄条件」は、本明細書において、特に、食器又は洗濯洗剤市場区分において家庭で実際に使用される洗浄温度、時間、洗浄機器、泡濃度、洗剤の種類及び水の硬度といった条件を示すために使用される。
【0038】
本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並びに、物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。本開示が、特定の表面、物品、又は除去しようとする汚染物質若しくは微生物に限定されることは意図するところではない。
【0039】
本明細書における洗浄組成物の「圧縮」形態とは、密度に最もよく反映され、組成物の観点からは無機充填剤塩の量に反映される。無機塩充填剤は、粉末形態の洗剤組成物の通常の成分である。通常の洗剤組成物では、塩充填剤は、相当量で、典型的には組成物全体の約１７～約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、塩充填剤は、組成物全体の約１５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、塩充填剤は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機塩充填剤は、硫酸アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩、並びアルカリ塩化物及びアルカリ土類金属塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、好ましい充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【0040】
用語「衣類」又は「衣類材料」は、織布、並びに紡糸、衣類、編物、及び不織布への転換又はそれらとしての使用に適したステープルファイバー及びフィラメントのことを指す。この用語には、天然及び合成（例えば、製造された）繊維から製造される紡糸が含まれる。
【0041】
核酸又はポリヌクレオチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、核酸又はポリヌクレオチドは「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは「単離され」ている。単離された種は、モルベースで、組成物中に他の分子種よりも豊富に含まれている。例えば、単離された種は、含まれている全ての高分子種の（モルベースで）少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％を構成し得る。好ましくは、対象とする種は、本質的に均一に精製される（すなわち、通常の検出手法により組成物中で汚染種が検出されることはない）。純度及び均一性は、当該技術分野で周知の多数の技術、例えば核酸又はタンパク質試料のそれぞれアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後の染色による可視化を用いて決定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
【0042】
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製された」は、概して、当業者に周知の解析技術により決定したときに、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた培養液中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１本のバンドのみが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製されている核酸又はポリペプチドは、少なくとも純度約５０％のものであり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、又は約９９．８％以上（例えば、モル重量による純度）のものである。関連する意味で、精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。用語「濃縮された」とは、化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分が開始組成物よりも高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在することを指す。
【0043】
本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数のアミノ酸を含む分子を指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換可能に用いられる。タンパク質は必要に応じて修飾される（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化等）ことによって、官能基が付加されてもよい。このようなアミノ酸配列は「酵素」として参照することのできる活性を示す。アミノ酸残基には一般的な１文字又は３文字表記を使用し、アミノ酸配列は、標準的な、アミノ末端からカルボキシ末端へと向かう配向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表される。
【0044】
「ポリヌクレオチド」なる用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖、及びポリペプチドをコードすることが可能な合成分子が含まれる。核酸は１本鎖であっても又は２本鎖であってもよく、化学修飾されていてもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが用いられ得るものであり、本発明の組成物及び方法には、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる。特に断らない限り、核酸配列は５’から３’末端に向かう方向で示される。
【0045】
本明細書で使用するとき、用語「野生型」及び「天然型」は、自然界で見出されるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
【0046】
ポリペプチドに関しての用語「野生型」、「親の」、又は「参照」は、１つ以上のアミノ酸位において人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関しての用語「野生型」、「親の」、又は「参照」は、人工的なヌクレオシドの変化を含まない、天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されるわけではなく、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが包含される。
【0047】
本明細書において使用される場合、「変異型ポリペプチド」は、典型的には組換えＤＮＡ技術によって、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失により親（又は参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを指す。変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと小数のアミノ酸残基だけ異なり得るものであり、親ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義される。好ましくは変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【0048】
配列同一性は、標準パラメーターを用いた、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬ等の既知のプログラムを使用して決定され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．［１９９０］Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．［１９８９］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．［１９９３］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．［１９８８］Ｇｅｎｅ ７３：２３７～２４４を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．［１９８８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４～２４４８）を用いて、データベースを検索してもよい。第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応することは、２つのポリペプチドが実質的に同一であることの１つの指標になる。典型的に、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチド場合は実質的に第２ポリペプチドと同一である。
【0049】
本明細書で使用するとき、「変異型ポリヌクレオチド」とは、変異型ポリペプチドをコードするか、親ポリヌクレオチドと特定の程度の相同性／同一性を有するか、あるいは、親ポリヌクレオチド又はその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。好ましくは、変異型ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のヌクレオチド配列の同一性を有する。一致率（％）を求めるための方法は当該技術分野では周知のものであり、直前に述べた通りである。
【0050】
「～に由来する」という用語は、「～を起源とする」、「～から得られる」、「～から得ることができる」、「～から単離される」、及び「～から作出される」という用語を包含し、ある特定の材料が、別の特定の材料を起源とするか、又は別の特定の材料に関連して述べられ得る特徴を有することを一般に示す。
【0051】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイゼーション」は、当技術分野において公知のように、核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と結合するプロセスを指す。
【0052】
本明細書において使用するところの「ハイブリダイゼーション条件」なる語句とは、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件のことを指す。これらの条件は、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって一般に分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいたものであり得る。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ－５℃（プローブのＴｍの５℃下）、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約５～１０℃下、「中ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍの約１０～２０℃下、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０～２５℃下で起こる。これに代えるかあるいはこれに加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び／又は１回以上のストリンジェンシー洗浄の塩又はイオン強度条件に基づいたものであってもよく、例えば、６×ＳＳＣ＝極めて低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低～中度のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中度のストリンジェンシー、及び０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能的には、最大ストリンジェンシー条件を用いて、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、又はほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定でき、一方高ストリンジェンシー条件を用いて、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を同定する。高い選択性が求められる用途では、典型的には、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが望ましい（例えば、比較的低い塩濃度及び／又は高い温度条件が用いられる）。本明細書において使用するところのストリンジェントな条件とは、５０℃で０．２×ＳＳＣとして定義される（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。
【0053】
少なくとも２個の核酸又はポリペプチドに関して、語句「実質的に同様」及び「実質的に同一」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列又は参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むか、官能性を付与することなく本開示の記載を回避する目的のみで行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は修飾を有さないことを意味する。
【0054】
本明細書で使用するとき、「発現ベクター」は、特定のポリペプチドをコードしており、好適な宿主においてそのポリペプチドを発現させることができる好適な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ構築物を指す。このような調節配列としては、転写を引き起こすプロモーター、こうした転写を調節する、場合により存在するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を調節する配列がある。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単純に潜在的なゲノムインサートであってよい。適当なホスト内に形質転換されると、ベクターは複製され、ホストのゲノムとは独立して機能するか、場合によってはゲノム自体に組み込まれ得る。
【0055】
用語「組換え」は、例えば、コード配列に突然変異を導入することで変化したポリペプチドを生成すること、コード配列を別の遺伝子のコード配列と融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置くこと、遺伝子を異種生物内で発現させること、遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させること、遺伝子をその自然の発現プロファイルとは異なる発現プロファイルで条件的又は構成的に発現させること等により、配列又は発現特性を変化させるように改変された遺伝物質（すなわち、核酸、核酸がコードするポリペプチド、並びにこうしたポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）のことを指す。一般に組換え核酸、ポリペプチド、及びこれらに基づく細胞は、関連する核酸、ポリペプチド、及び天然に見られる細胞と同一ではなくなるよう人為的に操作されている。
【0056】
「シグナル配列」とは、ポリペプチドのＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列のことを指し、タンパク質の成熟型の細胞からの分泌を促進するものである。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌プロセスの際に切断されるシグナル配列は有していない。
【0057】
用語「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、導入された核酸又はベクターを含むホストの選択を容易にする、宿主細胞において発現させることが可能な遺伝子のことを指す。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗菌物質（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は、宿主細胞に栄養的優位性のような代謝的優位性を与える遺伝子が挙げられる。本明細書において使用するところの「選択可能なマーカー」又は「選択可能な遺伝子産物」なる用語は、選択可能なマーカーが発現される細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用のことを指す。
【0058】
本明細書において使用するところの「調節要素」なる用語は、核酸配列の発現の特定の側面を調節する遺伝子要素のことを指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。更なる調節エレメントとしては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが挙げられる。
【0059】
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」は一般に、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターを形質転換又はトランスフェクトした原核生物又は真核生物の宿主である。形質転換された宿主細胞は、タンパク質変異体をコードするベクターを複製するか、あるいは所望のタンパク質変異体を発現することが可能である。タンパク質変異体のプレ型又はプロ型をコードするベクターの場合、かかる変異体は、典型的には、発現されるとき宿主細胞から宿主細胞培地中に分泌される。
【0060】
細胞に核酸配列を挿入することに関連して「導入された」なる用語は、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションを意味する。形質転換の手段として、当技術分野において公知の通り、プロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡ等が挙げられる（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ［１９７９］Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１～１１５；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．［１９８６］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；並びに、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．による総説（Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７～７２，１９８９）を参照されたい）。
【0061】
他の技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ １９９４；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）を参照されたい）。
【0062】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容的に明らかに示されていない限り、複数の対象物が含まれる。
【0063】
本明細書で数値に関して使用するとき、用語「約」は、その数値の－１０％～＋１０％の範囲を指す。例えば、語句「ｐＨ値約６」は、ｐＨ値が５．４～６．６であることを指す。
【0064】
各見出しは、便宜上示されるものであって、限定的に解釈されるべきではない。１つの見出しの下に含まれる説明は、明細書全体に適用され得るものである。
【0065】
パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種のポリペプチド
一実施形態は、本明細書に記載される、ポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。別の実施形態は、本明細書に記載される、組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、エンド－β－マンナナーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、Ａｓｎ３３－Ａｓｐ－３４－Ｌｅｕ３５（ＮＤＬ）を含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。
一実施形態は、本明細書に記載される、ポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。別の実施形態は、本明細書に記載される、組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む、ＮＤＬクレードを目的とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、エンド－β－マンナナーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、Ａｓｎ３３－Ａｓｐ－３４－Ｌｅｕ３５（ＮＤＬ）を含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。
【0066】
一態様では、本明細書に記載される組成物又は方法は、ＮＤＬクレード内のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む。別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、本明細書に記載される方法又は組成物において使用される。
【0067】
一態様では、本発明の組成物及び方法は、ＮＤＬクレード内の組換えエンド－β－マンナナーゼポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を提供する。なお更なる態様では、本発明の組成物及び方法は、ＮＤＬクレード内の組換えエンド－β－マンナナーゼポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む。更になお追加の態様では、本発明の組成物及び方法は、ＮＤＬクレード内のエンド－β－マンナナーゼポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を含む。なお更なる態様は、ＮＤＬクレード内のポリペプチド若しくは組換えポリペプチドエンド－β－マンナナーゼ若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を目的とする。一実施形態は、エンド－β－マンナナーゼポリペプチドのＮＤＬクレードを目的とする。別の実施形態は、エンド－β－マンナナーゼポリペプチドのＮＤＬクレード１を目的とする。なお別の実施形態は、エンド－β－マンナナーゼポリペプチドのＮＤＬクレード２を目的とする。なお更なる実施形態は、エンド－β－マンナナーゼポリペプチドのＮＤＬクレード３を目的とする。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＮＤＬクレードはＡｓｎ３３－Ａｓｐ－３４－Ｌｅｕ３５を含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。別の実施形態では、ＮＤＬクレードは、３０～３８番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩモチーフを含み、ＸａはＦ又はＹであり、このときＸは任意のアミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、ＮＤＬクレードは、３０～３８番目の位置にＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩモチーフを含み、このときＸａはＦ又はＹであり、ＸｂはＮ、Ｙ又はＡであり、ＸｃはＡ又はＴであり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。
【0069】
更なる実施形態では、ＮＤＬクレードは、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３ＸＸＸＧＰＸＧＸＬ２７２Ｔ２７３モチーフを含み、このときＸは任意のアミノ酸であり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードは、２６２～２７３番目の位置にＬ２６２Ｄ２６３Ｍ／ＬＶ／ＡＴ／ＡＧＰＸ１ＧＸ２Ｌ２７２Ｔ２７３モチーフを含み、このときＸ１はＮ、Ａ又はＳであり、Ｘ２はＳ、Ｔ又はＮであり、ポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、ＮＤＬクレード１は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴモチーフを含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。いくつかの実施形態では、ＮＤＬクレード２は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＬＡ／ＶＡ／ＴＧＰＳ／ＮＧＮＬＴモチーフを含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。なお別の実施形態では、ＮＤＬクレード３は、２６２～２７３番目の位置にＬＤＬ／ＶＳ／ＡＴ／ＮＧＰＳＧＮＬＴモチーフを含み、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされており、保存された一次配列番号に基づいている。
【0070】
一態様では、本発明の組成物及び方法は、本明細書に記載されるパエニバチルス（Paenibacillus）又はバチルス（Bacillus）種のエンド－β－マンナナーゼポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を提供する。代表的なパエニバチルス（Paenibacillus）又はバチルス（Bacillus）種のポリペプチドとして、ＢｃｉＭａｎ１（配列番号２）（Ｂ．シルクランス（B. circulans）Ｋ－１から単離）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号４）（Ｂ．シルクランス（B. circulans）１９６から単離）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号６）（Ｂ．シルクランス（B. circulans）ＣＧＭＣＣ１５５４から単離）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号８）（パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｅ６８１から単離）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号１０）（パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２から単離）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号１２）（パエニバチルス（Paenibacillus）種Ａ１から単離）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号１４）（パエニバチルス（Paenibacillus）種ＣＨ－３から単離）、ＰａｍＭａｎ２（前駆体タンパク質は配列番号１６であり、成熟タンパク質は配列番号１７である、パエニバチルス・アミロリティカス（Paenibacillus amylolyticus）から単離）、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６３）（パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１株から単離）、ＰｐａＭａｎ２（前駆体タンパク質は配列番号１９である、パエニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli）から単離）、ＰｓｐＭａｎ９（前駆体タンパク質は配列番号２１である、パエニバチルス（Paenibacillus）種ＦｅＬ０５から単離）、及びＰｔｕＭａｎ２（前駆体タンパク質は配列番号２３であり、成熟タンパク質は配列番号２４である、パエニバチルス・ツンドラエ（Paenibacillus tundrae）から単離）が挙げられる。これらの及びその他単離されたＰｓｐＭａｎ４ポリペプチドが、本発明の組成物及び方法に包含される。
【0071】
別の実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を目的とする。別の実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型を目的とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。また更なる実施形態では、ＮＤＬクレードの組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。別の実施形態では、ＮＤＬクレード１の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。なお別の実施形態では、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。更にまたなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。
【0072】
別の実施形態では、上記の内任意のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３のポリペプチド（polyppeptide）若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
【0073】
別の実施形態では、上記の内任意のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。別の実施形態では、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。
【0074】
別の実施形態では、上記の内任意のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。別の実施形態では、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。
【0075】
別の実施形態では、上記の内任意のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する。なお更なる実施形態では、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。別の実施形態では、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。またなお更なる実施形態では、ＮＤＬクレード３のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型は、配列番号７４及び８１から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列を更に含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。なおまた更なる実施形態では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。なお更なる実施形態では、本発明は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＮＤＬクレードのポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。別の実施形態では、本発明は、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＮＤＬクレード１のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。またなお更なる実施形態では、本発明は、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＮＤＬクレード２のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。またなお更なる実施形態では、本発明は、配列番号７４及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＮＤＬクレード３のポリペプチド若しくは組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型である。
【0077】
配列同一性は、例えば、本明細書に記載されるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬ等のプログラムを使用して、アミノ酸配列アライメントにより決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは単離ポリペプチドである。
【0078】
一実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドはマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドはマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、マンナナーゼ活性は、マンナンガムに対する活性である。いくつかの実施形態では、マンナナーゼ活性は、ローカストビーンガムガラクトマンナンに対する活性である。いくつかの実施形態では、マンナナーゼ活性は、コンニャクグルコマンナンに対する活性である。
【0079】
一実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このとき界面活性剤の存在下でマンナナーゼ活性がある。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、このとき界面活性剤の存在下でマンナナーゼ活性がある。
【0080】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４．５～９．０のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４．５～９．０のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、５．５～８．５のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、５．５～８．５のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、６．０～７．５のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、６．０～７．５のｐＨ範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、３．０、３．５、４．０又は４．５を超えるｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、３．０、３．５、４．０又は４．５を超えるｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、１０．０、９．５、又は９．０を下回るｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、１０．０、９．５、又は９．０を下回るｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。
【0081】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４０℃～７０℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４５℃～６５℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、５０℃～６０℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃を超える温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、９０℃、８５℃、８０℃、７５℃、又は７０℃を下回る温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。
【0082】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４０℃～７０℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、４５℃～６５℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、５０℃～６０℃の温度範囲において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃を超える温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、９０℃、８５℃、８０℃、７５℃、又は７０℃を下回る温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも７０％を保持する。
【0083】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは洗剤組成物中で洗浄活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは洗剤組成物中で洗浄活性を有する。
【0084】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは洗剤組成物中で洗浄活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、プロテアーゼの存在下でマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、グアーガム、ローカストビーンガム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される基質の加水分解が可能である。
【0085】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは洗剤組成物中で洗浄活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、プロテアーゼの存在下でマンナナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、グアーガム、ローカストビーンガム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される基質の加水分解が可能である。
【0086】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意のポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、炭水化物結合モジュールを更に含まない。いくつかの実施形態では、本発明は、上記実施形態のうち任意の組換えポリペプチド若しくはフラグメント、活性フラグメント、又はその変異型であり、このポリペプチドは、炭水化物結合モジュールを更に含まない。
【0087】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは組換えによって産生されるが、一方他の実施形態では、本発明のポリペプチドは合成によって産生され、又は天然源から精製される。
【0088】
特定の別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの構造及び／又は機能に実質的に影響しない置換を含む。代表的な置換は、表Ｉにまとめたような保存的突然変異である。
【0089】
【表1】
【0090】
天然に存在するアミノ酸が関与する置換は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸に突然変異を導入し、次いでこの変異体ポリヌクレオチドを生物で発現させることにより一般に行われる。非天然型アミノ酸が関与する置換、又はアミノ酸に対する化学修飾は、本発明の組換えポリペプチドが特定の生物によって合成された後に化学的に修飾することにより一般的に行われる。
【0091】
いくつかの実施形態では、本発明の変異型単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、又は６０と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能、又は発現に大きく影響しない、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能、又は発現に大きく影響しない、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型単離ポリペプチドは、配列番号６、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、３４、３５、３６、３８、３９、４０、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、及び７１と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能、又は発現に大きく影響しない、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型単離ポリペプチドは、配列番号４、８、１０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、４６、４７、４８、７２、及び７３と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能、又は発現に大きく影響しない、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の変異型単離ポリペプチドは、配列番号７４及び８１と実質的に同一であり、これは、ポリペプチドの構造、機能、又は発現に大きく影響しない、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含まないことを意味する。このような本発明の変異型単離ポリペプチドには、本発明の記載を回避する目的でのみ設計されたものが含まれる。
【0092】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド（その変異型を含む）は、マンナナーゼ、エンド－１，４－β－Ｄ－マンナナーゼ、エキソ－１，４－β－Ｄ－マンナナーゼガラクトマンナナーゼ、及び／又はグルコマンナナーゼ活性を含む、１，４－β－Ｄ－マンノシドヒドロラーゼ活性を有する。１，４－β－Ｄ－マンノシドヒドロラーゼ活性は、本明細書に記載されるアッセイを用いるか、又は当該技術分野において既知の他のアッセイによって決定及び測定することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、洗剤組成物の存在下で活性を有する。
【0093】
本発明のポリペプチドは、１，４－β－Ｄ－マンノシドヒドロラーゼ活性を保持する、「完全長」ポリペプチドのフラグメントを含む。こうしたフラグメントは、完全長ポリヌクレオチドの活性部位を保持していることが好ましいが、重要ではないアミノ酸残基の欠失を有してもよい。フラグメントの活性は、本明細書において述べるアッセイを用いるか、又は当該技術分野では周知の他のアッセイによって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのフラグメントは、洗剤組成物の存在下で１，４－β－Ｄ－マンノシドヒドロラーゼ活性を保持する。
【0094】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列及び誘導体は、例えば、抽出、検出及び／若しくは精製を補助するため、並びに／又は機能性を本発明のポリペプチドに付加するために、Ｎ及び／又はＣ末端融合タンパク質として産生される。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＢＣＥ１０３（国際公開第２０１０／０４４７８６号）、又は当業者に周知の他のタグが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質分解による切断部位を、融合タンパク質パートナーと目的のタンパク質配列との間に設けて、融合配列を除去できるようにする。好ましくは、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの活性を妨げない。
【0095】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、リーダーペプチド、プロペプチド、１つ若しくは２つ以上の結合ドメイン（モジュール）及び／又は触媒ドメインを含む、機能的ドメインと融合される。好適な結合ドメインとして、本発明のポリペプチドの適用中に存在する炭水化物成分への親和性を向上する、様々な特異性を有する炭水化物結合モジュール（例えば、ＣＢＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドのＣＢＭ及び触媒ドメインは、操作可能に連結される。
【0096】
炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）は、炭水化物結合活性を有する目立たない折り畳み部位を持つ、炭水化物活性酵素内に近接するアミノ酸配列として定義される。若干の例外は、セルロソームスキャフォールディンタンパク質中のＣＢＭであり、珍しい例では、独立した推定ＣＢＭである。より大きい酵素内のモジュールとして存在するＣＢＭの要件により、このクラスの炭水化物結合タンパク質が、レクチン等の他の非触媒糖結合タンパク質、及び糖輸送タンパク質から区別される。ＣＢＭは、セルロースに結合したいくつかのモジュールが初期に発見されたことから、以前はセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）に分類されていた（Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７０：５７５～５８１，１９８８；及びＧｉｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６３：１０４０１～１０４０７，１９８８）。しかしながら、炭水化物活性酵素中に、そうでなければＣＢＭの基準に合致する、セルロース以外の炭水化物に結合する追加のモジュールが続いて発見されているため、より包括的な用語を用いてこれらのポリペプチドを再分類する必要がある。セルロース結合ドメインの以前の分類は、アミノ酸類似性に基づくものであった。ＣＢＤのグループを「型」と呼び、ローマ数字で番号を付けた（例えば、Ｉ型又はＩＩ型ＣＢＤ）。グリコシドヒドロラーゼ分類に沿って、これらのグループを今ではファミリーと呼び、アラビア数字で番号を付けている。ファミリー１～１３は、Ｉ型～ＸＩＩＩ型と同じである（Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．＆Ｐｅｎｎｅｒ，Ｍ．，ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ：ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ｐｐ．１４２～１６３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９５）。ＣＢＭの構造及び結合様式の詳細な総説は、（Ｂｏｒａｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３８２：７６９～８１，２００４）に記載されている。ＣＢＭのファミリー分類により、ＣＢＭの同定を助ける、一部の例では、結合特異性を予測する、機能的残基の同定を助ける、進化的関係を明らかにする、及び、場合によっては、ポリペプチドの折り畳みを予測することが見込まれる。タンパク質の折り畳みは、その配列よりも良好に保存されているため、ＣＢＭファミリーの一部は、スーパーファミリー又はクランに分類することができる。現在のＣＢＭファミリーは１～６３である。ＣＢＭ／ＣＢＤは、非加水分解性ポリサッカライド結合タンパク質として、藻類、例えば、紅藻類であるポルフィラ・プルプレア（Porphyra purpurea）にも見つかっている。しかしながら、ＣＢＤの多くは、セルラーゼ及びキシラナーゼ由来である。ＣＢＤは、タンパク質のＮ末端及びＣ末端にあり、又は内部にある。酵素ハイブリッドは、当該技術分野において既知であり（例えば、国際公開第９０／００６０９号及び同第９５／１６７８２号）、本発明の開示されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、リンカーと共に又は伴わずにライゲーションされた、セルロース結合ドメインをコードするＤＮＡの少なくともフラグメントを含むＤＮＡ構築物によって、宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を増殖して融合遺伝子を発現させることによって、調製することができる。酵素ハイブリッドは、以下の式によって記載されてよい。
ＣＢＭ－ＭＲ－Ｘ又はＸ－ＭＲ－ＣＢＭ
ＣＢＭ－ＭＲ－Ｘ又はＸ－ＭＲ－ＣＢＭ
【0097】
上記式において、ＣＢＭは、少なくとも炭水化物結合モジュールに相当するアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端領域であり；ＭＲは、中間領域（リンカー）であり、結合部、若しくは好ましくは約２～約１００個の炭素原子、より好ましくは２～４０個の炭素原子の短い連結基であってよく；好ましくは約２～約１００個のアミノ酸、より好ましくは２～４０個のアミノ酸であってよく；Ｘは、マンナナーゼ触媒活性を有する本発明のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端領域である。加えて、マンナナーゼは、２つ以上のＣＢＭ又は、非糖分解機能の他のモジュール／ドメインを含有してよい。用語「モジュール」及び「ドメイン」は、本開示において互換的に使用される。
【0098】
好適な酵素活性ドメインは、所望の生成物の産生において、本発明のポリペプチドの作用を支持する活性を有する。触媒ドメインの非限定例として、セルラーゼ、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、グルカナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチナーゼ、並びに／又はその他活性、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、酸ホスファターゼ及び／若しくはその他、又はそれらの機能的フラグメントが挙げられる。融合タンパク質は、所望により、いずれの構成要素の特性に大きく影響を与えずに、本発明のポリペプチド及び融合ドメインを単純に連結するリンカー配列、又は所望により、目的の用途において機能的重要性を有するリンカーによって、本発明のポリペプチドに連結される。
【0099】
あるいは、本明細書に記載される本発明のポリペプチドは、１つ又は２つ以上の追加の所望のタンパク質と連結して使用される。所望のタンパク質の非限定例として、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－β－１，４－グルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルノニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ及び／又はその他酵素が挙げられる。
【0100】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドと融合される。例えば、特定の実施形態では、シグナルペプチドは、本発明のポリペプチドの天然シグナルペプチドである。別の実施形態では、シグナルペプチドは、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）ＡｐｒＥシグナルペプチド等の非天然シグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、成熟型とシグナルペプチドとの間に、Ａｌａ－Ｇｌｙ－ＬｙｓのＮ末端伸長を有する。
【0101】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、異種生物、すなわち、パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種以外の生物内で発現される。代表的な異種生物は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ゲオバチルス（Geobacillus）（以前のバチルス（Bacillus））ステロサーモフィラス（stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシェンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、又はストレプトマイセス・ムリナス（Streptomyces murinus）等のグラム陽性菌；エシェリキア・コライ（Escherichia coli）等のグラム陰性菌；サッカロマイセス（Saccharomyces）種又はシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種等の酵母、例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）；及び、アスペルギルス（Aspergillus）種等の糸状菌、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、及びトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）である。これらの生物内に核酸を形質転換するための方法は当該技術分野では周知のものである。アスペルギルス（Aspergillus）宿主細胞の形質転換に適した方法が、欧州特許第２３８ ０２３号に記載されている。
【0102】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現され、その場合、本組成物及び方法には、本発明のポリペプチドを異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現させるための方法が含まれる。
【0103】
本発明のポリヌクレオチド
本明細書に開示される別の態様は、本発明のポリペプチド（変異型及びそのフラグメントを含む）をコードするポリヌクレオチドである。一態様では、本明細書において特定されているもの等の、異種生物における本発明のポリペプチドの発現を指示するための発現ベクターと関連して、ポリヌクレオチド（polynucleuatide）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの発現を助けるための調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等）と作動可能に連結させることができる。
本明細書に開示される別の態様は、本発明のポリペプチド（変異型及びそのフラグメントを含む）をコードするポリヌクレオチドである。一態様では、本明細書において特定されているもの等の、異種生物における本発明のポリペプチドの発現を指示するための発現ベクターと関連して、ポリヌクレオチド（polynucleuatide）が提供される。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの発現を助けるための調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等）と作動可能に連結させることができる。
【0104】
本発明のポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１又は６４のヌクレオチド配列を有する。本発明のポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、又は５７のヌクレオチド配列を有する。本発明のポリペプチド及び変異型をコードする実質的に同一のものを含む同様のポリヌクレオチドは、例えば、Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓの他の株又は単離物等、自然に存在し得る。遺伝子コードの縮重を考慮して、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、同じ本発明のポリペプチド、変異型、又はフラグメントをコードし得ることが理解されるであろう。
【0105】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする例示されるポリヌクレオチドに対して、特定の程度のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、及び８１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする例示されるポリヌクレオチドに対して、特定の程度のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１９、２１、２３、２４、２６、２７、２８、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５８、５９、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する。相同性は、例えば本明細書に記載されるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬ等のプログラムを使用した、アミノ酸配列アライメントにより決定することができる。
【0106】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明の例示されるポリヌクレオチドに対して、特定の程度のヌクレオチド配列同一性、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１又は６４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有してよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明の例示されるポリヌクレオチドに対して、特定の程度のヌクレオチド配列同一性、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、又は５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有してよい。相同性は、例えば本明細書に記載されるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬ等のプログラムを使用した、アミノ酸配列アライメントにより決定することができる。
【0107】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの細胞外分泌を指示するためのシグナルペプチドのコード配列の後ろ（すなわち、その下流）にインフレームで融合される。異種シグナル配列には、細菌のセルラーゼ遺伝子から得られるものが含まれる。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発現させるのに好適な、又は好適な宿主細胞中に発現ベクターを導入する前に発現ベクターを増殖させるのに好適な異種宿主細胞において提供されてもよい。
【0108】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１又は６４（又はその相補）の例示のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１８、２０、２２、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、又は５７（又はその相補）の例示のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。代表的な条件は、本明細書において述べられるストリンジェントな条件、及び高ストリンジェント条件である。
【0109】
本発明のポリヌクレオチドは、は天然に存在するものであっても、又は合成（すなわち人工）のものであってもよく、異なる宿主内での発現のためにコドン最適化させてもよく、突然変異させてクローニング部位を導入してもよく、又は別の方法で変更して機能を付加してもよい。
【0110】
ベクター及び宿主細胞
本発明の開示されるポリペプチドを生成するために、ポリペプチドをコードしているＤＮＡを、公開されている配列から化学合成することができ、又はその遺伝子を有する宿主細胞から直接（例えばｃＤＮＡライブラリースクリーニング又はＰＣＲ増幅によって）得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれ、かつ／又は標準的な分子クローニング技術によって好適な発現ベクター中にクローニングされる。そのような発現カセット又はベクターは、転写の開始及び終結を助ける配列（例えば、プロモーター及びターミネーター）を含有し、また通常は、選択可能マーカーを含有する。
本発明の開示されるポリペプチドを生成するために、ポリペプチドをコードしているＤＮＡを、公開されている配列から化学合成することができ、又はその遺伝子を有する宿主細胞から直接（例えばｃＤＮＡライブラリースクリーニング又はＰＣＲ増幅によって）得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれ、かつ／又は標準的な分子クローニング技術によって好適な発現ベクター中にクローニングされる。そのような発現カセット又はベクターは、転写の開始及び終結を助ける配列（例えば、プロモーター及びターミネーター）を含有し、また通常は、選択可能マーカーを含有する。
【0111】
発現カセット又はベクターを好適な発現宿主細胞中に導入し、次いで、対応する本発明のポリヌクレオチドを発現させる。特に好適な発現宿主は、エシェリキア（Escherichia）（例えば、エシェリキア・コライ（Escherichia coli））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）又はＰ．スタットゼリ（P. stutzerei））、プロテウス（Proteus）（例えば、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis））、ラルストニア（Ralstonia）（例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha））、ストレプトマイセス（Streptomyces）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）（例えば、Ｓ．カルノサス（S. carnosus））、ラクトコッカス（Lactococcus）（例えば、Ｌ．ラクティス（L. lactis））、又はバチルス（Bacillus）（ズブチリス（subtilis）、メガテリウム（megaterium）、リケニフォルミス（licheniformis）等）等の、細菌発現宿主属である。また特に好適であるのは、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クリヴェロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母発現宿主である。特に好適であるのは、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、アスペルギルス（Aspergillus）（例えば、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ニゲル（A. niger）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）等）又はトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）等の真菌発現宿主である。哺乳動物発現宿主、例えば、マウス（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系等もまた適している。他の真核生物宿主、例えば、昆虫細胞又はウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ又はλ等のバクテリオファージ、又はバキュロウイルス等のウイルス）等もまた、本発明のポリペプチドを産生させるために適している。
【0112】
目的の特定の宿主における分泌型タンパク質と関連したプロモーター及び／又はシグナル配列は、その宿主又は他の宿主におけるエンド－β－マンナナーゼの異種産生及び分泌において使用するための候補である。例として、糸状菌系では、セルビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ－アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ－プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈＩＩ、エンドグルカナーゼ遺伝子ＥＧＩ－ＥＧＶ、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｅｇｌ１－ｅｇｌ５、ｇｐｄプロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ－１α、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１及びｈｅｘ１の遺伝子を駆動するプロモーターが特に好適であり、多くの異なる生物（例えば、Ａ．ニゲル（A. niger）、Ｔ．レーシ（T. reesei）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ｔ．アワモリ（A. awamori）及びＡ．ニデュランス（A. nidulans））由来であってよい。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを細胞外（又はペリプラズム）空間へ分泌させ、それにより細胞上清（又はペリプラズム空間又は溶解物）中で酵素活性を直接検出することを可能にする、好適な同種又は異種シグナル配列をコードしているポリヌクレオチドと、組換えにより関連させる。エシェリキア・コライ（Escherichia coli）、他のグラム陰性菌及び当技術分野において既知の他の生物に、特に好適なシグナル配列として、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ又はＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが挙げられる。バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、グラム陽性生物及び当技術分野において既知の他の生物では、特に好適なシグナル配列として更に、Ａｐｒｅ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動するものが挙げられ、Ｓ．セレヴィシエ（S. cerevisiae）又は他の酵母では、キラートキシン、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子α、Ｉｎｕ１Ａ又はＧｇｐｌｐシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、多くのシグナルペプチダーゼにより切断して、発現されたタンパク質の残部から除去することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの残りは、単独で又はＮ末端若しくはＣ末端に位置する他のペプチド、タグ若しくはタンパク質（例えば、６×Ｈｉｓ、ＨＡ又はＦＬＡＧタグ）との融合体として発現させる。好適な融合として、アフィニティ精製又は検出を容易にするタグ、ペプチド又はタンパク質（例えば、ＢＣＥ１０３、６×Ｈｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシン又はＦＬＡＧタグ）、並びに標的エンド－β－マンナナーゼの発現、分泌又はプロセシングを容易にするものが挙げられる。好適なプロセシング部位として、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、Ｋｅｘ２又はインビボ若しくはインビトロでの切断のための他のプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【0113】
本発明のポリヌクレオチドは、エレクトロポレーション、脂質を用いた形質転換又は遺伝子導入（「リポフェクション」）、化学的に媒介される遺伝子導入（例えば、ＣａＣｌ及び／又はＣａＰ）、酢酸リチウムに媒介される形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、バイオリスティック「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧに媒介される形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、プロトプラスト融合（例えば、細菌又は真核生物のプロトプラストを使用した融合）、リポソームに媒介される形質転換、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アデノウイルス又は他のウイルス又はファージによる形質転換又は形質導入が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形質転換方法によって、発現宿主細胞中に導入される。
【0114】
あるいは、本発明のポリペプチドを細胞内に発現させてよい。任意に、酵素変異型の細胞内発現、又は上記で述べたもの等のシグナル配列を使用したペリプラズム空間への分泌の後に、透過化又は溶解工程を使用して、ポリペプチドを上清中に放出することができる。膜バリアの破壊は、超音波、加圧処理（フレンチプレス）、キャビテーション等の機械的手段を使用して、又はリゾチーム等の膜消化酵素又は酵素混合物を使用して行うことができる。更なる選択肢として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、好適な無細胞発現系を用いて発現させてよい。無細胞系では、目的のポリヌクレオチドは通常、プロモーターの補助により転写させるが、ライゲーションして環状発現ベクターを形成させるかは任意である。別の実施形態では、ＲＮＡを外因的に加えるか、又は無細胞系において転写及び翻訳を伴わずに生成する。
【0115】
本明細書に開示される本発明のポリペプチドは、広範なｐＨ条件にわたって酵素活性を有し得る。特定の実施形態では、本発明の開示されるポリペプチドは、約ｐＨ４．０～約ｐＨ１１．０、又は約ｐＨ４．５～約ｐＨ１１．０で酵素活性を有する。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、約ｐＨ４．０～１１．０、ｐＨ４．５～１１．０、ｐＨ４．５～９．０、ｐＨ５．５～８．５、又はｐＨ６．０～７．５で、実質的な酵素活性、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の活性を有する。本明細書において述べるｐＨの値は、±０．２だけ変化し得ることに注意されたい。例えば、約８．０のｐＨの値は、ｐＨ７．８～ｐＨ８．２で変化し得る。
【0116】
本明細書に開示される本発明のポリペプチドは、広範な温度、例えば、約２０℃以下から９０℃、３０℃～８０℃、４０℃～７０℃、４５℃～６５℃、又は５０℃～６０℃にわたって、酵素活性を有し得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、約２０℃以下～９０℃、３０℃～８０℃、４０℃～７０℃、４５℃～６５℃、又は５０℃～６０℃の温度範囲において、実質的な酵素活性、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の活性を有する。本明細書において述べる温度の値は、±０．２℃だけ変化し得ることに注意されたい。例えば、約５０℃の温度は、４９．８℃～５０．２℃で変化し得る。
【0117】
本発明のポリペプチドを含む洗剤組成物
本明細書に開示される組成物及び方法の一態様は、本発明の単離ポリペプチド（その変異体又はフラグメントを含む）を含む洗剤組成物、及び洗浄用途においてこうした組成物を使用するための方法である。洗浄用途としては、洗濯物又は衣類のクリーニング、洗濯物又は衣類の柔軟化、食器洗い（手洗い及び自動）、染みの前処理等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の用途は、マンナン（例えば、ローカストビーンガム、グアーガム等）が除去すべき汚れ又は染みの成分であるような用途である。洗剤組成物は、典型的には、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの任意の有効量、例えば、少なくとも０．０００１重量パーセント、約０．０００１～約１、約０．００１～約０．５、約０．０１～約０．１重量パーセント、又は更に約０．１～約１重量パーセント、又はそれ以上を含む。洗剤組成物中の本発明のポリペプチドの有効量は、マンナン含有基質、例えばローカストビーンガム、グアーガム、又はこれらの組み合わせを加水分解するのに十分な酵素活性を有する、本発明のポリペプチドをもたらす。
本明細書に開示される組成物及び方法の一態様は、本発明の単離ポリペプチド（その変異体又はフラグメントを含む）を含む洗剤組成物、及び洗浄用途においてこうした組成物を使用するための方法である。洗浄用途としては、洗濯物又は衣類のクリーニング、洗濯物又は衣類の柔軟化、食器洗い（手洗い及び自動）、染みの前処理等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の用途は、マンナン（例えば、ローカストビーンガム、グアーガム等）が除去すべき汚れ又は染みの成分であるような用途である。洗剤組成物は、典型的には、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの任意の有効量、例えば、少なくとも０．０００１重量パーセント、約０．０００１～約１、約０．００１～約０．５、約０．０１～約０．１重量パーセント、又は更に約０．１～約１重量パーセント、又はそれ以上を含む。洗剤組成物中の本発明のポリペプチドの有効量は、マンナン含有基質、例えばローカストビーンガム、グアーガム、又はこれらの組み合わせを加水分解するのに十分な酵素活性を有する、本発明のポリペプチドをもたらす。
【0118】
加えて、約０．４ｇ／Ｌ～約２．２ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ～約２．０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ～約１．７ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ～約１ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ～約０．８ｇ／Ｌ、又は約０．４ｇ／Ｌ～約０．５ｇ／Ｌの濃度を有する洗剤組成物を、本発明の単離ポリペプチドの有効量と混合してよい。洗剤組成物は、約０．４ｍＬ／Ｌ～約２．６ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ～約２．０ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ～約１．５ｍ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ～約１ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ～約０．８ｍＬ／Ｌ、又は約０．４ｍＬ／Ｌ～約０．５ｍＬ／Ｌの濃度で存在してもよい。
【0119】
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルは全て、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率（％）及び比率は全て、特に断りのない限り、重量で計算している。全ての百分率（％）及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
【0120】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、非イオン性、半極性、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、又はこれらの組み合わせ及び混合物でありうる、１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、約０．１重量％～６０重量％の濃度で存在する。代表的な界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２～１４パレス－７、Ｃ１２～１５パレス－７、Ｃ１２～１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４～１５パレス－４、ラウレス硫酸ナトリウム（例えばＳｔｅｏｌ ＣＳ－３７０）、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２エトキシレート（Ａｌｆｏｎｉｃ １０１２－６、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ７、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ４）、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（例えばＮａｃｃｏｎｏｌ ９０Ｇ）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【0121】
本明細書において述べる洗剤組成物と共に使用することが可能なアニオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α－オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸エステル（脂肪アルコール硫酸エステル）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸エステル（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、２級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α－スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル－若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸が挙げられる。これは、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号に述べられる）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物等の０～４０％の非イオン性界面活性剤を更に含み得る。
【0122】
本明細書において述べる洗剤組成物と共に使用することが可能な非イオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴＷＥＥＮ類）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ類及びＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔｅｒｔ－オクチルフェノール又はオクチルフェニル－エチレンオキシド縮合物（例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）、エチレンオキシドと脂肪アルコールとの縮合物（例えば、Ｌｕｂｒｏｌ）、ポリオキシエチレンノニルフェノール、ポリアルキレングリコール（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０８）、糖ベースの界面活性剤（例えば、グリコピラノシド、チオグリコピラノシド）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【0123】
本明細書において開示される洗剤組成物は、これらに限定されるものではないが、５～１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ホスホネート、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、ゲラニオール、ゼオライト、ポリカルボキシレート、ヘキシルシンナマル、リモネン、カチオン性界面活性剤、シトロネロール、及びベンズイソチアゾリノンを含む混合物を有し得る。
【0124】
洗剤組成物は更に、１以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステム、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定化剤、起泡促進剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、ヒドロトロープ、変色防止剤、蛍光増白剤、柔軟剤、及び香料を更に含んでもよい。洗剤組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチン分解酵素、キシログルカナーゼ、又は更なるカルボン酸エステル加水分解酵素を含むがこれらに限定されない、酵素を更に含んでもよい。洗剤組成物のｐＨは、本明細書において述べるように中性～塩基性でなければならない。
【0125】
少なくとも１種のビルダーを組み込むいくつかの実施形態では、洗剤組成物は、洗浄組成物の重量に基づいて、少なくとも約１重量％、約３重量％～約６０重量％、又は更には約５重量％～約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５－トリヒドロキシベンゼン－２，４，６－トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸）、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５－トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩等のポリカルボン酸類を挙げてよいが、これらに限定されない。実際、任意の適当なビルダーが本開示の異なる実施形態において有用であると考えられる。
【0126】
いくつかの実施形態では、ビルダーは水溶性の硬度イオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩等（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物等）を形成する。当該技術分野では既知のものを含む（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照）任意の適当なビルダーが、本開示において有用であると考えられる。
【0127】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、本明細書において述べる洗浄組成物は、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性剤、漂白剤触媒、他の酵素、酵素安定システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤を含む添加物質を更に含む（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４及び同第５，６４６，１０１号を参照）。具体的な洗浄組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。洗濯組成物中で、洗浄添加物質が本発明のポリペプチドと適合するものでない実施形態では、これら２種の構成成分を組み合わせることが適切になるまでの間、洗浄添加物質及びエンド－β－マンナナーゼを別々に保管する（すなわち、互いに接触させない）好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離等）。
【0128】
本明細書において述べる洗浄組成物は、例えば、洗濯用途、硬質面の洗浄、食器洗い用途、並びに入れ歯、歯、毛髪及び皮膚等の美容用途において効果的に使用することができる。加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、低温溶液中において高い効果を示すという特有の効果のために、洗濯及び布地柔軟化用途に特に適している。更に本発明のポリペプチドは、粒状及び液体組成物において有用である。
【0129】
本明細書に記載されるポリペプチド又は単離ポリペプチドは、添加用製品における洗浄用途に使用することもできる。いくつかの実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング用途において有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、本発明の開示されるポリペプチドを少なくとも１種含む洗浄添加用製品を提供し、当該洗浄添加用製品は、更に漂白効果が所望される場合に、洗浄グプロセスに含めるために理想的に適している。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング用途が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加用製品は最も単純な形態の１種又は２種以上のエンド－β－マンナナーゼである。いくつかの実施形態では、添加剤は、クリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加剤は、過酸化物供給源が用いられかつ漂白効果の増加が所望されるクリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。これらに限定されるものではないが、ピル、錠剤、ジェルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体等の他の一回用量単位を含む、任意の適当な一回容量単位の形態が、本開示と共に使用するのに有用である。いくつかの実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料を含める。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイ等が挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオール等の低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、このような材料を約５％～約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを低下させるために有用である。あるいは、いくつかの実施形態では、洗浄添加剤として、以下により詳細に記載されるような補助成分が挙げられる。
【0130】
一実施形態では、本発明の洗浄組成物又は洗浄添加剤は、本明細書に記載される少なくとも１つのポリペプチドの有効量を、所望により他のエンド－β－マンナナーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせて含有する。特定の実施形態では、追加の酵素として、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セルビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－β－１，４－グルカナーゼ、エンド－β－マンナナーゼ、エキソ－β－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルノニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１つの酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
必要とされる酵素濃度は、１種又は２種以上の本発明の開示されるポリペプチドを添加することによって達成される。典型的には、本発明の洗浄組成物は、少なくとも約０．０００１重量パーセント、約０．０００１～約１０、約０．００１～約１、又は更に約０．０１～約０．１重量パーセントの、少なくとも１種の本発明の開示されるポリペプチドを含むであろう。
【0132】
本明細書の洗浄組成物は、典型的には、水性洗浄操作での使用中に、洗浄水のｐＨが約３．０～約１１となるように配合される。液体製品の配合は、典型的には、未希釈時ｐＨが約５．０～約９．０を有するように配合される。粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約８．０～約１１．０になるよう配合される。推奨される使用レベルでｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸等の使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
【0133】
好適な低ｐＨ洗浄組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約３．０～約５．０又は更に約３．５～約４．５を有する。低ｐＨ洗浄組成物は、典型的には、かかるｐＨ環境中で加水分解する界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシド約１～約１６モルを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このような洗浄組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約３．０～約５．０である洗浄組成物をもたらすのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸等を含む。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。一部の実施形態では、組成物は液体であるが、他の実施形態では、組成物は固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には原液のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の１０％固体溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、別途記載のない限り、ｐＨの測定は全て２０℃で行われる。
【0134】
好適な高ｐＨ洗浄組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約９．０～約１１．０、又は更に正味ｐＨが９．５～１０．５を有する。このような洗浄組成物は、典型的には、未希釈時ｐＨが約９．０～約１１．０である洗浄組成物をもたらすのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸等を含む。このような組成物は、典型的には、塩基に安定な酵素を少なくとも１種含む。一部の実施形態では、組成物は液体であるが、他の実施形態では、組成物は固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には原液のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の１０％固体溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、別途記載のない限り、ｐＨの測定は全て２０℃で行われる。
【0135】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドが粒状組成物又は液体中で使用される場合、本発明のポリペプチドは、保管時に粒状組成物の他の成分から本発明のポリペプチドを保護するためにカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。更にカプセル化は、洗浄プロセスの際に本発明のポリペプチドの利用性を調節する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化によって、本発明のポリペプチド及び／又は追加の酵素の性能が高められる。この点に関し、本開示の本発明のポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の好適なカプセル材によってカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル材は、典型的には、本明細書に記載される本発明のポリペプチドに関する触媒の少なくとも一部を封入する。典型的には、カプセル材は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、封入剤のガラス転移温度（Ｔｇ）は０℃以上である。ガラス転移温度については、国際特許出願公開第９７／１１１５１号により詳細に述べられている。カプセル材は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル材が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの典型的な実施形態では、カプセル材はデンプンである（例えば、欧州特許第０ ９２２ ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル材は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物等のプラスチックから製造されるマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとして、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ－ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）として供給されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0136】
用語「粒状組成物」は、分離している固形の巨視的粒子の集塊を指す。粉末は、粒径が小さいことによる特殊な等級の粒状物質であり、より凝集し、より容易に懸濁されるようになる。
【0137】
洗浄用途における本発明のポリペプチドを含む洗剤組成物の使用に際しては、布地、衣類、食器、又は洗浄しようとする他の表面を、ポリペプチドが、汚れ又は染み中に存在する、ローカストビーンガム、グアーガム、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないマンナン基質を加水分解するのに充分な時間にわたって本発明のポリペプチドを有する洗剤組成物の存在下でインキュベートした後、典型的には、水又は別の水性溶媒で洗い流すことによって、加水分解されたマンナンと一緒に洗剤組成物を除去する。
【0138】
本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドは、洗濯用洗剤及び食器用洗剤が挙げられるが、これらに限定されない、洗浄産業において特に有用である。これらの用途では、酵素を様々な環境ストレス下に置く。本発明のポリペプチドは、様々な条件下における安定性のため、多くの現在使用されている酵素と比較して優れた利点を与えるものである。
【0139】
実際に、多様な洗剤の配合、多様な洗浄水の体積、多様な洗浄水の温度、及び多様な洗浄時間の長さ等の様々な洗浄条件が存在し、洗浄に関与するエンド－β－マンナナーゼはこれらの条件に晒される。加えて、異なる地域で使用される洗剤配合物では、クリーニング水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００～５０００ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水中に有するが、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水中に有する。
【0140】
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分がクリーニング水に存在する洗剤が包含される。日本の洗剤は、クリーニング水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に低濃度洗剤系とみなされる。
【0141】
中濃度洗剤は、洗浄水中に約８００ｐｐｍ～約２０００ｐｐｍの洗剤構成成分が存在するように洗剤を含む。北アメリカの洗剤は、洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、典型的にクリーニング水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
【0142】
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在している洗剤が包含される。欧州の洗剤は、クリーニング水中におよそ４５００～５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に高濃度洗剤系であるとみなされる。
【0143】
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸塩ビルダー洗剤であり、クリーニング水中に１５００～６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記のように、ブラジルでは、クリーニング水中に典型的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、例えば、他のラテンアメリカの国々に限定されないが、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、クリーニング水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
【0144】
前述の内容を考慮すると、世界中の典型的な洗浄液中の洗剤組成物の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低濃度洗剤地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、約８００ｐｐｍ～約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「中間濃度の洗剤地域」）、例えば、米国の約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「高濃度洗剤地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ～約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものまで様々であることが明白である。
【0145】
典型的な洗浄液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国では、典型的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、クリーニング溶液中に約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌのクリーニング液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者が、洗剤に付属された計量カップを用いてクリーニング水に量り入れる典型的な量である。
【0146】
更なる例として、異なる地域では異なるクリーニング温度が使用される。日本で使用されているクリーニング水の温度は、一般的に、欧州で使用される温度よりも低い。例えば、北アメリカ及び日本の洗浄水の温度は、典型的には約１０～約３０℃（例えば、約２０℃）であるが、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０～約６０℃（例えば、約４０℃）である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される洗剤組成物は、約１０℃～約６０℃、又は約２０℃～約６０℃、又は約３０℃～約６０℃、又は約４０℃～約６０℃、並びに約４０℃～約５５℃の範囲内の全てのその他組み合わせ、並びに１０℃～６０℃内の全ての範囲の温度において利用できる。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水洗浄の使用に切り替えている。加えて、いくつかの更なる地域では、典型的に洗濯だけでなく食器洗浄用途にも冷水が使用されている。いくつかの実施形態では、本開示の「冷水洗浄」は、約１０℃～約４０℃、又は約２０℃～約３０℃、又は約１５℃～約２５℃、並びに約１５℃～約３５℃の範囲内の全てのその他組み合わせ、並びに１０℃～４０℃内の全ての範囲の温度における洗浄を利用する。
【0147】
更なる例として、異なる地域では、典型的に、異なる硬度の水が用いられている。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計のグレイン／ガロン単位で表される。硬度は、は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中硬水（６０～１２０ｐｐｍ）～硬水（１２１～１８１ｐｐｍ）は、６０～１８１ｐｐｍ（ｐｐｍをグレイン／ＵＳガロン単位に変換する場合、ｐｐｍ数を１７．１で除したものがグレイン／ガロンに相当する）の鉱物を含有する。
【0148】
【表2】
【0149】
欧州の水硬度は、典型的には、約０．１５０（例えば約０．１５０～約０．２８５）グラム毎リットル（約１０．５（例えば、約１０．５～約２０．０）グレイン毎ガロン）超となるようＣａ２＋／Ｍｇ２＋が混在している（例えば、約０．２１グラム毎リットル（約１５グレイン毎ガロン）のＣａ２＋／Ｍｇ２＋が混在している）。北アメリカの水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度より低い。例えば、北米の水の硬度は約０．０４～約０．１４グラム、約０．０４～約０．１グラム又は約０．０９グラム（約３～約１０グレイン、約３～約８グレイン又は約６グレイン）であり得る。日本の水の硬度は一般的に北米の水の硬度よりも低く、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋が、通常、約０．０６未満、例えば、約０．０４グラム毎リットル（通常、約４未満、例えば、約３グレイン毎ガロン）混在している。
【0150】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示す本発明のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドの洗浄性能は、他のエンド－β－マンナナーゼと同程度である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、市販されている現行のエンド－β－マンナナーゼの洗浄性能を上回る洗浄性能を呈する。すなわち、いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に提供される本発明のポリペプチドは、高い酸化安定性、高い熱安定性、異なる条件下での高い洗浄能力、及び／又は高いキレート剤安定性を示す。加えて、本発明のポリペプチドは、単独でも又はビルダー及び安定化剤との組み合わせとしても、洗剤を含まない洗浄組成物において有用であり得る。
【0151】
本開示のいくつかの実施形態では、洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の本開示の少なくとも１種の本発明のポリペプチドと、洗浄添加物質からなる組成物の残部（例えば、組成物の約９９．９９９重量％～約９０．０重量％）と、を含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度の少なくとも１種の本発明のポリペプチドと、洗浄添加物質からなる洗浄組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％～約９０．０重量％、約９９．９９９重量％～約９８重量％、約９９．９９５重量％～約９９．５重量％）とを含む。
【0152】
本明細書に提供される本発明のポリペプチドに加え、任意のその他好適なエンド－β－マンナナーゼは、単独で、又は本明細書に記載されるポリペプチドと組み合わせて、本明細書に記載される組成物において有用である。好適なエンド－β－マンナナーゼとして、ＧＨ２６ファミリーのグリコシルヒドロラーゼであるエンド－β－マンナナーゼ、ＧＨ５ファミリーのグリコシルヒドロラーゼであるエンド－β－マンナナーゼ、酸性エンド－β－マンナナーゼ、中性エンド－β－マンナナーゼ、及びアルカリ性エンド－β－マンナナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。アルカリ性エンド－β－マンナナーゼの例として、米国特許第６，０６０，２９９号、同第６，５６６，１１４号、及び同第６，６０２，８４２号；国際公開第９５３５３６２Ａ１号、同第９９６４５７３Ａ１号、同第９９６４６１９Ａ１号、及び同第２０１５０２２４２８号に記載されるものが挙げられる。加えて、好適なエンド－β－マンナナーゼとして、動物、植物、真菌、又は細菌起源のものが挙げられるが、これらに限定されない。化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体は本開示に含まれる。
【0153】
有用なエンド－β－マンナナーゼの例として、バチルス（Bacillus）エンド－β－マンナナーゼ、例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，０６０，２９９号、及び国際公開第９９６４５７３Ａ１号参照）、Ｂ．種Ｉ６３３エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、バチルス（Bacillus）種ＡＡＩ１２エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、Ｂ種ＡＡ３４９エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、Ｂ．アガラドハエレンス（B. agaradhaerens）ＮＣＩＭＢ４０４８２エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）エンド－β－マンナナーゼ、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、フミコーラ（Humicola）エンド－β－マンナナーゼ、例えば、Ｈ．インソレンス（H. insolens）エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）、及びカルディセルロシルプター（Caldocellulosiruptor）エンド－β－マンナナーゼ、例えば、Ｃ．種エンド－β－マンナナーゼ（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号参照）が挙げられる。
【0154】
更に、多くの同定されたマンナナーゼ（すなわち、エンド－β－マンナナーゼ及びエキソ－β－マンナナーゼ）が本開示のいくつかの実施形態において有用であり、これらには、アガリクス・ビスポラス（Agaricus bisporus）マンナナーゼ（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，［２００１］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２２９８～２３０３参照）、アスペルギルス・タマリイ（Aspergillu tamarii）マンナナーゼ（Ｃｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．，［１９８４］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１９：８５７～８６３参照）、アスペルギルス・アキュリタス（Aspergillus aculeatus）マンナナーゼ（Ｃｈｒｉｓｔｇａｕ ｅｔ ａｌ．，［１９９４］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３：９１７～９２５参照）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）マンナナーゼ（Ｓｅｔａｔｉｅｔ ａｌ．，［２００１］Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ．２１：１０５～１１４参照）、アスペルギルス・フミガーツフ（Aspergillus fumigatus）マンナナーゼ（Ｐｕｃｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．１６７４：２３９～２５０参照）、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）マンナナーゼ（Ａｄｅｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，［１９９８］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：１９９～２１０参照）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）ＮＲＲＬマンナナーゼ（Ｒｅｇａｌａｄｏ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．８０：１３４３～１３５０参照）、アスペルギルス・サルフレウス（Aspergillus sulphureus）マンナナーゼ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，［２００７］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２８（３）：４５２～４６１参照）、アスペルギルス・テルス（Aspergillus terrus）マンナナーゼ（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，［２００７］Ｗｅｉ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｘｕｅ Ｂａｏ．４７（２）：２８０～２８４参照）、パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）種マンナナーゼ（米国特許第６，３７６，４４５号参照）、バチルス（Bacillus）ＡＭ００１マンナナーゼ（Ａｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，［１９８９］Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：１０～１５参照）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）マンナナーゼ（Ａｒａｕｊｏ及びＷａｒｄ，［１９９０］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６８：２５３～２６１参照）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）Ｋ－１マンナナーゼ（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，［１９９８］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（３）：５１４～５２０参照）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）マンナナーゼ（Ａｒａｕｊｏ及びＷａｒｄ，［１９９０］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６８：２５３～２６１参照）、バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－７５０マンナナーゼ（Ｈａｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．９：４９７～５００参照）、バチルス（Bacillus）種Ｍ５０マンナナーゼ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ｗｅｉ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｘｕｅ Ｂａｏ．４０：６２～６８参照）、バチルス（Bacillus）種Ｎ１６－５マンナナーゼ（Ｙａｎｈｅ ｅｔ ａｌ．，［２００４］Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ８：４４７～４５４参照）、バチルス・ステアロサーモフィル（Bacillus stearothermophilu）マンナナーゼ（Ｔａｌｂｏｔ及びＳｙｇｕｓｃｈ，［１９９０］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３５０５～３５１０参照）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）マンナナーゼ（Ｍｅｎｄｏｚａ ｅｔ ａｌ．，［１９９４］Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：５１～５４参照）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）Ｂ３６マンナナーゼ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，［２００６］Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ（Ｃ）．６１：８４０～８４６）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＢＭ９６０２マンナナーゼ（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，［１９９９］Ｗｅｉ Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｘｕｅ Ｂａｏ．３９（１）：６０～６３参照）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）ＳＡ－２２マンナナーゼ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，［２００３］Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ．１９（３）：３２７～３３０参照）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）１６８マンナナーゼ（Ｈｅｌｏｗ及びＫｈａｔｔａｂ，［１９９６］Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ．４３：２８９～２９９参照）、バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）マンナナーゼ（Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，［１９８７］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０３８～２０４３参照）、バクテロイデス・ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）マンナナーゼ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，［１９９１］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６９１９～６９２６参照）、カルディバチルス・セルロボランス（Caldibacillus cellulovorans）マンナナーゼ（Ｓｕｎｎａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：６６４～６７０参照）、カルディセルロシルプター・サッカロリティクス（Caldocellulosiruptor saccharolyticus）マンナナーゼ（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，［１９９５］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：２２６２～２２６９参照）、カルドセラム・サッカロリティカム（Caldocellum saccharolyticum）マンナナーゼ（、Ｂｉｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，［１９９１］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３３７～３４３参照）、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）マンナナーゼ（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，［１９９９］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（６）：２５９８～２６０５参照）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）／ベイジェリンキ（beijerinckii）マンナナーゼ（Ｎａｋａｊｉｍａ及びＭａｔｓｕｕｒａ，［１９９７］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１７３９～１７４２参照）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）マンナナーゼ（Ｐｅｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：２５５～２５９参照）、クロストリジウム・テルチウム（Clostridium tertium）マンナナーゼ（Ｋａｔａｏｋａ及びＴｏｋｉｗａ，［１９９８］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８４：３５７～３６７参照）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）マンナナーゼ（Ｈａｌｓｔｅａｄ ｅｔ ａｌ．，［１９９９］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：３１０１～３１０８参照）、ディクチオグロムス・サーモフィラム（Dictyoglomus thermophilum）マンナナーゼ（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，［１９９９］Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９（６）：３５１～３５７参照）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種マンナナーゼ（Ｚａｋａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，［１９９８］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６５５～６６０参照）、ガストロポダ・プルモナタ（Gastropoda pulmonata）マンナナーゼ（Ｃｈａｒｒｉｅｒ及びＲｏｕｌａｎｄ，［２００１］Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｚｏｏｌ．２９０：１２５～１３５参照）、リットリナ・ブレビクラ（Littorina brevicula）マンナナーゼ（Ｙａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，［１９９６］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６７４～６７６参照）、リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）マンナナーゼ（Ｆｉｌｉｃｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３４：１０８０～１０８７参照）、パエニバチルス・クルドラノリティクス（Paenibacillus curdlanolyticus）マンナナーゼ（Ｐａｓｏｎ及びＲａｔａｎａｋｈａｎｏｋｃｈａｉ，［２００６］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：２４８３～２４９０参照）、パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）マンナナーゼ（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，［２００６］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３（３）：６１８～６３０参照）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）マンナナーゼ（Ｗｙｍｅｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，［２００５］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１８：１７～３４参照）、ピロマイセス（Piromyces）種マンナナーゼ（Ｆａｎｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，［１９９５］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４９）：２９３１４～２９３２２参照）、ポマセア・インスラース（Pomacea insulars）マンナナーゼ（Ｙａｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，［１９９３］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：１３１６～１３１９参照）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）亜種セルロースマンナナーゼ（Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，［１９９５］Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３０５：１００５－１０１０参照）、ロドサーマス・マリヌス（Rhodothermus marinus）マンナナーゼ（、Ｐｏｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３（６）：７１５～７２１参照）、スクレロチウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）マンナナーゼ（Ｓａｃｈｓｌｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，［２０００］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０：１２７～１３４参照）、ストレプトマイセス・ガルバス（Streptomyces galbus）マンナナーゼ（Ｋａｎｓｏｈ及びＮａｇｉｅｂ，［２００４］Ａｎｔｏｎ．ｖａｎ．Ｌｅｅｕｗｏｎｈｏｅｋ．８５：１０３～１１４参照）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）マンナナーゼ（Ａｒｃａｎｄ ｅｔ ａｌ．，［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９０：８５７～８６３参照）、サーモアナエロバクテリウム・ポリサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium Polysaccharolyticum）マンナナーゼ（Ｃａｎｎ ｅｔ ａｌ．，［１９９９］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１６４３～１６５１参照）、サーモモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）マンナナーゼ（Ｈｉｌｇｅ ｅｔ ａｌ．，［１９９８］Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：１４３３～１４４４参照）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）マンナナーゼ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，［２００１］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：３２２～３３３参照）、サーモトガ・ネアポリチタナ（Thermotoga neapolitana）マンナナーゼ（Ｄｕｆｆａｕｄ ｅｔ ａｌ．，［１９９７］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１６９～１７７参照）、トリコデルマ・ハルザニウム（Trichoderma harzanium）株Ｔ４マンナナーゼ（Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：２５５～２５９参照）、トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）マンナナーゼ（Ｓｔａｌｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：２２９～２４２参照）、及びビブリオ（Vibrio）種マンナナーゼ（Ｔａｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．，［１９９７］Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８３：２０１～２０５参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0155】
追加の好適なエンド－β－マンナナーゼとして、市販のエンド－β－マンナナーゼ、例えば、ＨＥＭＩＣＥＬＬ（登録商標）（Ｃｈｅｍｇｅｎ）；ＧＡＭＡＮＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）、（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；ＰＵＲＡＢＲＩＴＥ（商標）及びＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ａ Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））；及びＰＹＲＯＬＡＳＥ（登録商標）１６０及びＰＹＲＯＬＡＳＥ（登録商標）２００（Ｄｉｖｅｒｓａ）が挙げられる。
【0156】
本開示のいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の追加のエンド－β－マンナナーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部と、を更に含む。本開示の他の態様では、本開示の洗浄組成物はまた、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のエンド－β－マンナナーゼも含む。
【0157】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なプロテアーゼを使用することもできる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。様々なプロテアーゼは、国際公開第９５／２３２２１号及び同第９２／２１７６０号；米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号；及び米国特許第５，８０１，０３９号；同第５，３４０，７３５号；同第５，５００，３６４号；同第５，８５５，６２５；同第ＲＥ３４，６０６号；同第５，９５５，３４０号；同第５，７００，６７６号；同第６，３１２，９３６号；同第６，４８２，６２８号；及び様々なその他特許に記載されている。いくつかの更なる実施形態では、国際公開第０７／０４４９９３号に述べられる中性メタロプロテアーゼを含むがこれに限定されない、メタロプロテアーゼが本開示において有用である。本発明において有用な市販のプロテアーゼ酵素として、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えばＰ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えばＰ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えばＰ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異型（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、及びＫＡＰ（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ サブチリシン；Ｋａｏ Ｃｏｒｐ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0158】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なアミラーゼを使用することもできる。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、細菌由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本開示において有用なアミラーゼとして、Ｂ．リケニフォルミス（licheniformis）から得られるα－アミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照）。本開示において有用な市販のアミラーゼとして、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、並びにＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ａ Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0159】
本開示のいくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の追加のアミラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部と、を更に含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のアミラーゼを含む。
【0160】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の好適なペクチン分解酵素を使用することができる。本明細書で使用するとき、「ペクチン分解酵素」は、アラビナナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９９）、ガラクタナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８９）、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５）、エキソ－ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．６７）、エキソ－ポリ－α－ガラクツロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．８２）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１０）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）、エキソ－ポリガラクツロン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．９）、並びにヘミセルラーゼ、例えばエンド－１，３－β－キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３２）、キシラン－１，４－β－キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）及びα－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５５）を包含する。ペクチン分解酵素は、上記酵素活性の天然混合物である。したがって、ペクチン酵素として、ペクチンメチルエステル結合を加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、ガラクツロン酸分子間のグリコシド結合を切断するポリガラクツロナーゼ、及び、ペクチン酸に作用してα－１，４グリコシド結合の非加水分解切断をもたらし、ガラクツロン酸の不飽和誘導体を形成するペクチントランスエリミナーゼ又はリアーゼが挙げられる。
【0161】
好適なペクチン分解酵素として、植物、真菌、又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、ペクチン分解酵素は、アルカリ性ペクチン分解酵素であり、すなわち、約７．０～約１２のｐＨにおいて、最大活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％の酵素活性を有する酵素である。特定の別の実施形態では、ペクチン分解酵素は、約７．０～約１２において、最大活性を有する酵素である。アルカリ性ペクチン分解酵素は、好アルカリ性微生物、例えば、バチルス（Bacillus）種等の細菌、真菌、及び酵母微生物によって産生される。いくつかの実施形態では、微生物は、日本特許第５６１３１３７６号及び同第５６０６８３９３号に記載されるような、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、及びバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）である。アルカリ性ペクチン分解酵素として、ガラクツロン－１，４－α－ガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．６７）、ポリ－ガラクツロナーゼ活性（ＥＣ ３．２．１．１５）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．２）及びこれらのイソ酵素を挙げてよいが、これらに限定されない。アルカリ性ペクチン分解酵素を、エルウィニア（Erwinia）種によって産生することができる。いくつかの実施形態では、アルカリ性ペクチン分解酵素は、Ｅ．クリサンテミ（E. chrysanthemi）、Ｅ．カロトボラ（E. carotovora）、Ｅ．アミロボラ（E. amylovora）、Ｅ．ヘルビコラ（E. herbicola）、及びＥ．ディソルベンス（E. dissolvens）（日本特許第５９０６６５８８号、同第６３０４２９８８号、及びＷｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（８，２，１１５～１２０）１９９２に記載）によって産生される。特定の別の実施形態では、アルカリ性ペクチン酵素は、日本特許第７３００６５５７号及びＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２），３６（２）２８５～９３に開示されるように、バチルス（Bacillus）種によって産生される。
【0162】
本開示のいくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の追加のペクチン分解酵素と、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部と、を更に含む。本開示の別の態様では、洗浄組成物はまた、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のペクチン分解酵素も含む。
【0163】
いくつかの別の実施形態では、任意の好適なキシログルカナーゼが本開示の洗浄組成物において有用である。好適なキシログルカナーゼとして、植物、真菌、又は細菌由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本明細書で使用するとき、「キシログルカナーゼ」は、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＶｉｎｃｋｅｎ及びＶｏｒａｇｅｎによって記載される酵素ファミリーを包含し［Ｖｉｎｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４，９９～１０７］、Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０，１３９～１６８に記載されるようなキシログルカンを分解することができる。Ｖｉｎｃｋｅｎらは、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）から精製されたキシログルカナーゼ（エンド－ＩＶ－グルカナーゼ）による、単離されたリンゴ細胞壁のセルロースからの、キシログルカンコーティングの除去を証明した。この酵素は、細胞壁内のセルロースの酵素的分解を促進し、ペクチン酵素と相乗的に作用する。Ｇｉｓｔ－ＢｒｏｃａｄｅｓのＲａｐｉｄａｓｅ ＬＩＱ＋は、キシログルカナーゼ活性を含む。
【0164】
本開示のいくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の追加のキシログルカナーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部と、を更に含む。本開示の別の態様では、洗浄組成物はまた、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のキシログルカナーゼも含む。特定の別の実施形態では、特定の用途向けのキシログルカナーゼは、アルカリ性キシログルカナーゼ、すなわち、７～１２の範囲のｐＨにおいて、その最大活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％の酵素活性を有する酵素である。特定の別の実施形態では、キシログルカナーゼは、約７．０～約１２において、最大活性を有する酵素である。
【0165】
いくつかの更なる実施形態では、任意の適当なセルラーゼが本開示の洗浄組成物において有用である。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。好適なセルラーゼとして、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。特に適当なセルラーゼは、カラーケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０ ４９５ ２５７号参照）。本開示において有用な市販のセルラーゼとして、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の市販のセルラーゼとして、ＰＵＲＡＤＥＸ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ａ Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））及びＫＡＣ－５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ－末端部分が欠失している成熟野生型又は変異体セルラーゼの部分又はフラグメントとして組み込まれる（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号参照）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の更なるセルラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のセルラーゼを含む。
【0166】
なお更なる実施形態では、洗剤組成物中での使用に好適な任意のリパーゼも、本開示において有用である。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。有用なリパーゼの例として、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８ ０６８号、及び同第３０５ ２１６号参照）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８ ０２３号参照）、カンジダ（Candida）リパーゼ、例えば、Ｃ．アンタルチカ（C. antarctica）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタルチカ（C. antarctica）リパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４ ７６１号参照）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）リパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８ ２７２号参照）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１ ３７６号参照）、Ｐ．スタットゼリ（P. stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号参照）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３～２６０］；Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）リパーゼ［例えば、特表昭第６４／７４４９９２号参照］；及びＰ．プミルス（B. pumilus）リパーゼ［例えば、国際公開第９１／１６４２２号参照］）が挙げられる。更に、ペニシリウム・カメンベルティー（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，［１９９１］Ｇｅｎｅ １０３：６１～６７参照）、ジオトリカム・カンディダム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，［１９８９］Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０６：３８３～３８８参照）、及び様々なリゾプス（Rhizopus）リパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（R. delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，［１９９１］Ｇｅｎｅ １０９：１１７～１１３参照）、Ｒ．ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，［１９９２］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６～７１９）、及びＲ．オリザエ（R. oryzae）リパーゼが挙げられるが、これらに限定されない、多くのクリーニングされたリパーゼが、本開示のいくつかの実施形態において有用である。シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号参照）、及び、フザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号参照）が挙げられるが、これらに限定されない、クチナーゼ等の別の種類の脂肪分解酵素も、本開示のいくつかの実施形態において有用である。追加の好適なリパーゼとして、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ，Ａ Ｄａｎｉｓｃｏ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）等の市販のリパーゼが挙げられる。
【0167】
いくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の追加のリパーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の別の態様では、洗浄組成物はまた、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度のリパーゼも含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物中に、ペルオキシダーゼが、過酸化水素又はその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩、又は過硫酸塩）と組み合わせて使用される。いくつかの代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。いずれのタイプの酵素も「溶液を漂白する」（すなわち、布地を一緒にクリーニング液でクリーニングする場合に、繊維製品の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号及び同第９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素と、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％、約０．００５重量％～約０．５重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素を含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、ペルヒドロラーゼを含むがこれに限定されない、更なる酵素が有用である（例えば、国際公開第０５／０５６７８２号を参照）。更に、いくつかの特に好ましい実施形態では、上記に述べた酵素、特に、１種又は２種以上の更なるプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼの混合物が本明細書に含まれる。実際、これらの酵素の様々な混合物が本開示において有用であると考えられる。本発明のポリペプチド及び１種又は２種以上の追加の酵素の濃度は、いずれも独立して約１０％までの範囲で変化し、洗浄組成物の残部は洗浄添加物質からなることも想到される。具体的な洗浄添加物質の選別は、洗浄される表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗剤を用いた洗浄中）の洗浄条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
【0170】
適当な洗浄添加物質の例としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒物質、過酸化水素、過酸化水素の供給源、予め生成された過酸（preformed peracis）、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟仕上げ剤、柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、顔料、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照）。具体的な洗浄組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。洗浄組成物中で、洗浄添加物質が本発明の開示されるポリペプチドと適合するものでない実施形態では、これら２種の構成成分を組み合わせることが適切になるまでの間、洗浄添加物質及びエンド－β－マンナナーゼを別々に保管する（すなわち、互いに接触させない）好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離等）。
【0171】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書において提供される１種又は２種以上の本発明のポリペプチドの有効量が、染みを除去する必要のある様々な表面を洗浄するうえで有用な組成物中に含まれる。このような洗浄組成物としては、硬質表面、布地、及び皿のクリーニング等の用途向けの洗浄組成物が挙げられる。実際、いくつかの実施形態では、本開示は衣類洗浄用組成物を提供するものであるが、他の実施形態では、本開示は衣類以外の洗浄用組成物を提供する。特に、本開示は、口腔ケア（歯磨き剤、歯磨き粉、マウスウォッシュ等、並びに入れ歯洗浄用組成物）を含むパーソナルケアに適した洗浄組成物、皮膚及び毛髪洗浄用組成物を更に提供する。加えて、更に別の実施形態では、本開示は布地柔軟化組成物を提供する。本開示は、任意の形態（すなわち、液体、粒状、バー状、固形、半固形、ゲル、ペースト、乳濁液、錠剤、カプセル、一回用量型、シート、フォーム等）の洗剤組成物を包含することを意図する。
【0172】
例として、本発明の開示されるポリペプチドが有用ないくつかの洗浄組成物を以下に詳細に記載する。開示される洗浄組成物が、洗濯機による洗浄方法における使用に適した組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び少なくとも１種のビルダー化合物、並びに、有機ポリマー化合物、漂白剤、更なる酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、汚れ懸濁及び再付着防止剤、及び腐蝕防止剤から好ましくは選択される１種又は２種以上の洗浄添加物質を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加の洗浄添加物質として）。本開示の組成物は、固体又は液体の形態の洗剤添加用製品においても有用である。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。一部の実施形態では、２０℃で測定した場合、本発明の洗濯洗剤組成物の密度は約４００～約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方で他の実施形態では約５００～約９５０ｇ／リットルの範囲である。
【0173】
手による食器洗いの方法において使用するための組成物として配合された実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種の界面活性剤、並びに、好ましくは、有機ポリマー化合物、起泡促進剤、ＩＩ族の金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び更なる酵素から選択される少なくとも１種の更なる洗浄添加物質を含むことが好ましい。
【0174】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるような様々な洗浄組成物は、本発明のポリペプチドと共に使用される。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、コンパクトな粒状布地洗浄組成物である一方、別の実施形態では、組成物は、着色された布地を洗濯するのに有用な粒状布地洗浄組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、洗浄能を通して柔軟効果を提供する粒状布地洗浄組成物であり、追加の実施形態では、組成物は、強力液体布地洗浄組成物である。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような布地洗浄組成物である。加えて、本発明のポリペプチドは、欧州又は日本の洗浄条件（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号参照）下で特に有用である粒状洗濯用洗剤組成物への使用が見いだされる。
【0175】
いくつかの代替的実施形態では、本開示は、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む、硬質面用洗浄組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるもの等の硬質面用洗浄組成物である。
【0176】
なお更なる実施形態では、本開示は、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む、食器用洗浄組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるもの等の硬質面用洗浄組成物である。いくつかのなお更なる実施形態では、本開示は、本明細書に提供される少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む、食器用洗浄組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，６０５，４５８号のもの等の口腔ケア組成物を含む。上記米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に含まれる化合物及び洗浄添加物質の処方及び説明が、本発明のポリペプチドと共に使用される。
【0177】
なお更なる実施形態では、少なくとも１種の本発明のポリペプチドを含む組成物は、英国特許第Ａ１ ４００８９８号、同第Ａ１ ５１４ ２７６号、欧州特許第０ ０１１ ３４０号、同第０ ０２６ ５２８号、同第０ ２４２ ９１９号、同第０ ２９９ ５７５号、同第０ ３１３ １４６号、及び米国特許第５，０１９，２９２号のもの等の布地柔軟化組成物を含む。上記英国特許第Ａ１ ４００８９８号、同第Ａ１ ５１４ ２７６号、欧州特許第０ ０１１ ３４０号、同第０ ０２６ ５２８号、同第０ ２４２ ９１９号、同第０ ２９９ ５７５号、同第０ ３１３ １４６号、及び米国特許第５，０１９，２９２号に含まれる化合物及び柔軟化剤の処方及び説明が、本発明のポリペプチドと共に使用される。
【0178】
本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低ｐＨの洗浄組成物が所望される場合、かかる組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）等の追加の材料により調整される。
【0179】
いくつかの実施形態では、本発明の洗浄組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、シート、及び多区画パウチ等の一回用量形状で提供される。いくつかの実施形態では、一回用量形状は、多区画パウチ（又は他の一回用量形状）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な一回用量型及び制御放出形式は、当該技術分野において既知である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号、国際公開第０２／１０２９５５号、米国特許第４，７６５，９１６号及び同４，９７２，０１７号、並びに、一回用量型及び制御放出形式に使用するための好適な材料については国際公開第０４／１１１１７８号を参照）。いくつかの実施形態では、一回用量形状は、水溶性フィルムで包装された錠剤又は水溶性パウチとして提供される。様々な一回用量形状が、欧州特許第２ １００ ９４７号及び国際公開第２０１３／１６５７２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されており、当該技術分野において既知である。
【0180】
本開示の目的において不可欠ではないが、以下に示す添加物質の非限定的な一覧は、本発明の洗浄組成物における使用に適したものである。いくつかの実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料等の場合には洗浄組成物の美観を改善するために組み込まれる。こうした助剤は、本発明のポリペプチドに追加されるものであることは理解される。このような追加成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用されるクリーニング操作の性質によって決まる。好適な助剤としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、高分子分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の助剤の好適な例及び使用レベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これら公報は参照により組み込まれる。上記の補助成分は、本開示の洗浄組成物の残部を構成してよい。
【0181】
いくつかの実施形態では、本開示に従う洗浄組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低ｐＨ洗浄組成物の実施形態（例えば、未希釈時ｐＨが約３～約５の組成物の場合）では、界面活性剤がこのような組成物の酸性成分により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には当該組成物はエトキシル化アルキル硫酸塩を含まない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄組成物の重量に基づいて、約０．１重量％～約６０重量％のレベルで存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％～約５０重量％のレベルで、あるいは更に他の実施形態では約５重量％～約４０重量％のレベルで存在する。
【0182】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種のキレート剤を含む。好適なキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種のキレート剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、本発明の洗浄組成物の約０．１重量％～約１５重量％、又は更には約３．０重量％～約１０重量％のキレート剤を含む。
【0183】
いくつかの更なる実施形態では、本明細書で提供される洗浄組成物は、少なくとも１種の付着助剤を含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸等の汚れ剥離ポリマー、カオリナイト等のクレイ、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
【0184】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、再付着防止剤が本開示のいくつかの実施形態において有用である。いくつかの好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤が有用である。例えば、自動食器クリーニング機の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、表面改質の目的で、特にシーチングのために、フィルミングとスポッティングを防止するため、及び光沢を改善するために有用である。これらの非イオンの界面活性剤は、また、汚れの再付着の防止にも有用である。いくつかの好ましい実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野では周知の非イオン性界面活性剤である（例えばば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【0185】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、１種又は２種以上の移染防止剤を含む。好適なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ－オキシドポリマー、Ｎ－ビニルピロリドンとＮ－ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種の移染防止剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、洗浄組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．０１重量％～約５重量％、又は更には約０．１重量％～約３重量％を含む。
【0186】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物にはケイ酸塩が含まれる。このようないくつかの実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）は有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％～約２０％のレベルで存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約５重量％～約１５重量％の濃度で存在する。
【0187】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は更に分散剤を含む。好適な水溶性有機材料には、ホモポリマー型若しくはコポリマー型の酸又はそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されず、このうち、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以内の程度で互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【0188】
いくつかの更なる実施形態では、洗浄組成物に使用される酵素は任意の好適な技術により安定化されている。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を存在させて、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給することで安定化する。一部の実施形態では、酵素安定化剤としては、オリゴ糖類、多糖類、及び二価の無機金属塩、例えばアルカリ土類金属塩（カルシウム塩等）が挙げられる。酵素安定化のための様々な技術が本開示において有用であるものと考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ）イオン）の水溶性供給源を存在させて当該イオンを酵素に供給することで安定化される。塩酸塩及び硫酸塩も本開示のいくつかの実施形態において有用である。好適なオリゴサッカライド及びポリサッカライド（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、国際公開第０７／１４５９６４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４－ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒド等の可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた、所望により更に安定性を改善させるために有用である。
【0189】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤、及び／又は漂白触媒が、本開示の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、これらに限定されるものではないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において既知の任意の好適な塩が、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【0190】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤が本開示の組成物中に使用される。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度にてクリーニング過程で漂白作用を増強させる有機過酸前駆体である。本明細書での使用に好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で、好ましくは約１～約１０個の炭素原子、特に約２～約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は選択的に置換された過安息香酸を生じる化合物が挙げられる。更なる漂白活性化剤は当該技術分野において既知のものであり、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【0191】
更に、いくつかの実施形態では、また、本明細書において更に述べるように、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種類の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト錯体、銅錯体、マンガン錯体、及び鉄錯体も有用である。追加の漂白触媒も本開示において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、同第４，８１０，４１０号、国際公開第９９／０６５２１号、及び欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【0192】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は１以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒は有用である。いくつかの好ましい実施形態では、金属系漂白触媒には、所定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかしか有さない又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒型及び補助金属カチオンに関して所定の安定性定数を有する金属イオン封鎖剤、具体的には、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩を含む触媒系が含まれる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物はマンガン化合物によって触媒される。このような化合物及び使用濃度は当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照されたい）。更なる実施形態では、コバルト漂白触媒が本開示の洗浄組成物において有用である。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において既知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照されたい）、既知の手順により容易に調製される。
【0193】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、巨大多環式剛性配位子（macropolycyclic rigid ligand）（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実用上の問題として、限定するものではないが、いくつかの実施形態において、本開示により提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗浄媒質中に少なくとも約１億分の１のオーダーの活性ＭＲＬ種を与えるように調整され、いくつかの好ましい実施形態では、約０．００５ｐｐｍ～約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍ、最も好ましくは約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄液中に与えるように調整される。
【0194】
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒中の好ましい遷移金属としては、これらに限定されるものではないが、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。好ましいＭＲＬとしては、これらに限定されるものではないが、架橋された特殊な超剛性配位子が挙げられる（例えば、５，１２－ジエチル－１，５，８，１２－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順により容易に調製される（例えば、国際公開第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照されたい）。
【0195】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は金属ケア剤を含む。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食、及び／又は酸化の予防及び／又は軽減に有用である。好適な金属ケア剤としては、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号、国際公開第９４／２６８６０号及び同第９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属ケア剤は亜鉛塩である。更なるいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、約０．１重量％～約５重量％の１以上の金属ケア剤を含む。
【0196】
上記に述べたように、本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低ｐＨの洗浄組成物が所望される他のいくつかの実施形態では、このような組成物のｐＨは、ＨＣｌ等の酸性材料を添加することで調整される。
【0197】
本明細書において開示される洗浄組成物は、所定の場所（例えば、表面、食器、又は布地）を洗浄するうえで有用である。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明の洗浄組成物と接触させ、そしてその後、場合により、その部位を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本開示の目的において、「洗浄」には、これらに限定されるものではないが、こすり洗い、及び機械的な攪拌が含まれる。いくつかの実施形態では、洗浄組成物は、典型的には溶液中で約５００ｐｐｍ～約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃～約９０℃の範囲であり、部位が布地を含む場合、水と布地との質量比は、典型的には、約１：１～約３０：１である。
【0198】
化学試薬としての本発明のポリペプチド
マンノース単位（マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナンが挙げられるが、これらに限定されない）を含有するポリサッカライド鎖の加水分解に、本発明のポリペプチドが好ましいことが、本発明のポリペプチドを、１，４－β－Ｄ－マンノシド結合を含むポリサッカライド基質が関与する、マンナンの加水分解反応を行うのに特に有用にする。
マンノース単位（マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナンが挙げられるが、これらに限定されない）を含有するポリサッカライド鎖の加水分解に、本発明のポリペプチドが好ましいことが、本発明のポリペプチドを、１，４－β－Ｄ－マンノシド結合を含むポリサッカライド基質が関与する、マンナンの加水分解反応を行うのに特に有用にする。
【0199】
大まかに言えば、ドナー分子を、本明細書に記載される単離ポリペプチド若しくはポリペプチド、若しくはフラグメント、又はその変異型の存在下、マンナン加水分解反応を行うのに好適な条件下でインキュベートした後、必要に応じて反応から生成物を単離する。あるいは、食品に関連したものである場合、生成物は単離されずに食品の成分となり得る。特定の実施形態では、ドナー分子は、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びガラクトグルコマンナンが挙げられるが、これらに限定されない、マンノース単位を含むポリサッカライド鎖である。
【0200】
食品加工及び／又は動物飼料用の本発明のポリペプチド
一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む組成物を用いて、動物飼料又はヒト用食品を加工、及び／又は製造する。なお更なる実施形態では、本発明のポリペプチドは、非ヒト動物用飼料の添加剤であってよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、ヒト用食品の添加剤として等、ヒト用食品において有用であってよい。
一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを含む組成物を用いて、動物飼料又はヒト用食品を加工、及び／又は製造する。なお更なる実施形態では、本発明のポリペプチドは、非ヒト動物用飼料の添加剤であってよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、ヒト用食品の添加剤として等、ヒト用食品において有用であってよい。
【0201】
いくつかの栄養素は、動物飼料及びヒト用食品の調製に使用できる安価な植物材料の量を限定する場合がある。例えば、マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン及びガラクトグルコマンナン等のオリゴマンナンを含有する植物材料は、動物において、無機質、ビタミン、糖、及び脂肪等の栄養物質の消化及び吸収能を低下させる場合がある。これらの負の効果は、マンナン含有ポリマーの高い粘度と、マンナン含有ポリマーによる栄養物質の吸収能に特に起因する。これらの効果は、本明細書に記載されるエンド－β－マンナナーゼ酵素等のマンナン含有ポリマーを分解する酵素を食品中に含め、それによって、典型的には、食品中に含まれる安価な植物材料中にある、高い割合のマンナン含有ポリマーを利用できるようにすることによって低下させることができ、究極的には食品のコストを低減する。加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、マンナン含有ポリマーをより単純な糖に分解でき、追加のエネルギーをもたらすために容易に吸収できる。
【0202】
更なる実施形態では、植物材料を含有する動物飼料を、本明細書に記載されるポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド、若しくはフラグメント、又はその変異型の存在下、マンナン含有ポリマーの分解に好適な条件下でインキュベートする。
【0203】
別の実施形態では、製パン改良組成物は、本明細書に記載されるポリペプチドを、所望によりマンナン又はグルコマンナン又はガラクトマンナン源と組み合わせて、及び、更に所望により１種又は２種以上の別の酵素と組み合わせて含む。
【0204】
用語、非ヒト動物は、全ての非反芻動物及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、非反芻動物は、ウマ、並びに、これらに限定されないが、ブタ、家禽、家畜ブタ及び魚類等の単胃動物からなる群から選択されるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、ブタは、これらに限定されないが、子ブタ、育成ブタ、及び雌ブタであってよく、家禽は、これらに限定されないが、七面鳥、アヒル及びニワトリ（ブロイラー及び産卵鶏を非限定的に含む）であってよく、魚類は、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及びコイを非限定的に含み、甲殻類は、小エビ及びエビを非限定的に含む。更なる実施形態では、反芻動物は、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【0205】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを用いて、飼料添加物の代わりに飼料を前処理する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドを加え、又は用いて、離乳ブタ、新生ブタ、子ブタ、肥育ブタ、育成ブタ、仕上げブタ、産卵鶏、ブロイラー、及び七面鳥用の飼料の前処理をする。
【0206】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドを加え、又は用いて、パーム核、ココナツ、コンニャク、ローカストビーンガム、ガムグアー、大豆、大麦、オーツ麦、亜麻、コムギ、トウモロコシ、亜麻仁、シトラスパルプ、綿実、落花生、菜種、ヒマワリ、エンドウ、及びハウチワマメ等の植物材料由来の飼料の前処理をする。
【0207】
本発明によるポリペプチドは、熱安定的であり、その結果、本明細書に開示されるポリペプチドを、ペレット化工程に先立って飼料混合物に熱を加える、ペレット飼料の製造プロセスで使用できる。別の実施形態では、ペレット化工程前、又はペレット化工程後（すなわち、既に形成された飼料ペレット）のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドを他の飼料成分に加える。
【0208】
なお別の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを含有する食品加工又は飼料用サプリメント組成物は、所望により、着色剤、香料化合物、安定化剤、ビタミン、無機質、及び他の飼料又は食品強化酵素から選択される、他の置換物質を更に含んでよい。これは、特にいわゆるプレミックスに適用される。
【0209】
また更なる実施形態では、本発明による食品添加物を、適当な量の、例えば、穀物又は植物タンパク質等の別の食品構成要素と組み合わせ、加工食品を形成してよい。
【0210】
一実施形態では、動物飼料組成物及び／又は動物飼料添加剤組成物及び／又はペットフードは、本明細書に記載されるポリペプチドを含む。
【0211】
別の実施形態は、本明細書に記載されるポリペプチドを、１種又は２種以上の動物飼料成分及び／又は動物飼料添加剤成分及び／又はペットフード成分と混合することを含む、動物飼料組成物及び／又は動物飼料添加剤組成物及び／又はペットフードを調製する方法に関する。
【0212】
更なる実施形態は、動物飼料組成物及び／又は動物飼料添加剤組成物及び／又はペットフードを調製するための、本明細書に記載されるポリペプチドの使用に関する。語句「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウム等）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビ等）、並びに飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙等）であるがこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味する。
【0213】
用語、動物飼料組成物、飼料原料、及び飼葉は、互換的に使用され、かつａ）シリアル類、例えば、小粒（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、及びこれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガム等の大粒；ｂ）シリアル、例えば、トウモロコシグルテンミール、醸造乾燥粒可溶化物（ＤＤＧＳ）（特にコーンベースの醸造乾燥粒可溶化物（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、ホイートミドリングス、小麦ショート、米ふすま、もみ殻、オーツ殻、パーム核、及びシトラスパルプからの生成物；ｃ）大豆、ヒマワリ、落花生、ハウチワマメ、エンドウ、そら豆、綿、キャノーラ、魚肉、乾燥結晶タンパク質、肉骨粉、じゃがいもタンパク質、乳清、コプラ、及び胡麻等の資源から得られたタンパク質；ｄ）植物及び動物資源から得られる油脂；並びに、ｅ）ミネラル及びビタミンからなる群から選択される１種以上の試料成分を含ませることができる。
【0214】
一態様では、食品組成物又は添加剤は、液体又は固体であってよい。
【0215】
ビール等の発酵飲料用の本発明のポリペプチド
本発明のある態様では、食品組成物は、本明細書に記載されるポリペプチドを含む、これらに限定されないが、ビール及びワイン等の発酵飲料等の飲料である。
本発明のある態様では、食品組成物は、本明細書に記載されるポリペプチドを含む、これらに限定されないが、ビール及びワイン等の発酵飲料等の飲料である。
【0216】
本発明の文脈において、用語「発酵飲料」は、微生物発酵、例えば、細菌及び／又は酵母発酵等の発酵プロセスを含む方法により生産される、任意の飲料を含むことを意味する。
【0217】
本発明の態様において、発酵飲料はビールである。用語「ビール」は、デンプンを含有する植物材料の発酵／醸造により生産される任意の発酵麦汁を含むことを意味する。多くの場合、ビールは、麦芽若しくは副原料、又は麦芽及びデンプンを含有する植物材料としての副原料の任意の組み合わせから産生される。本明細書で使用するとき、用語「麦芽」は、任意の麦芽入り穀物、麦芽入り大麦又は小麦であると理解される。
【0218】
本明細書で使用するとき、用語「副原料」は、大麦麦芽又は小麦麦芽等の麦芽ではない、任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料を指す。副原料の例として、例えば、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造者により粉砕された酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦デンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、及びシロップ、例えばトウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップが挙げられ、同様のものをデンプン源として使用できる。
【0219】
本明細書で使用するとき、用語「マッシュ」は、任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料、例えば、製粉用穀物（例えば、破砕大麦麦芽、破砕大麦、及び／若しくはその他の副原料、又はこれらの組み合わせを含む）等の水性スラリーを指し、このスラリーは、水と混合した後に、麦汁及び粕に分離される。
【0220】
本明細書で使用するとき、用語「麦汁」は、マッシュ中の製粉用穀物の抽出後に放出される未発酵の液体を指す。
【0221】
別の態様では、本発明は、本発明の任意のポリペプチドを麦芽及び／又は副原料と混合することを含む、ビール等の発酵飲料の製造方法に関する。
【0222】
ビールの例には、フルモルトビール、「ビール純粋令」に従って醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、ノンアルコール麦芽酒、及び同様物、並びに、別の穀物及び麦芽飲料、例えば、果実風味の麦芽飲料（例えばレモン、オレンジ、ライム、又はベリー風味といったシトラス風味の麦芽飲料）、酒風味の麦芽飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラ風味の麦芽酒）、あるいはコーヒー風味の麦芽飲料（カフェイン風味の麦芽酒）、及び同様物が含まれる。
【0223】
本発明の一態様は、ビール等の発酵飲料の製造における、本発明の任意のポリペプチドの使用に関する。
【0224】
別の態様は、マッシュ及び／又は麦汁を、本発明の任意のポリペプチドと接触させる工程と含む、発酵飲料を提供する方法に関与する。
【0225】
更なる態様は、（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）マッシュを濾過して麦汁を得る工程と、（ｃ）麦汁を発酵させてビール等の発酵飲料を得る工程と、を含み、本発明の任意のポリペプチドを、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の麦汁、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の麦汁に加える、発酵飲料を提供する方法に関する。
【0226】
更に別の態様によると、（１）マッシュ及び／又は麦汁を本発明の任意のポリペプチドと接触させる工程、及び／又は（２）（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）マッシュを濾過して麦汁を得る工程と、（ｃ）麦汁を発酵させてビール等の発酵飲料を得る工程と、を含み、本発明の任意のポリペプチドを、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の麦汁、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の麦汁に加える、工程を含む方法により、ビール等の発酵飲料が製造され、又は提供される。
【0227】
コーヒー抽出物の処理用の本発明のポリペプチド
本明細書に記載される本発明のポリペプチドを、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解のためにも使用できる。一態様では、本発明のポリペプチドを用いて、液体コーヒー抽出物の凍結乾燥中のゲル形成を抑制する。抽出物の粘度を下げると、乾燥中のエネルギー消費が低下する。特定の別の態様では、本発明のポリペプチドは、酵素消費を抑え、コーヒー抽出物の汚染を防ぐために、固定化形態で適用される。この用途は、欧州特許第６７６ １４５号に更に開示されている。
本明細書に記載される本発明のポリペプチドを、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解のためにも使用できる。一態様では、本発明のポリペプチドを用いて、液体コーヒー抽出物の凍結乾燥中のゲル形成を抑制する。抽出物の粘度を下げると、乾燥中のエネルギー消費が低下する。特定の別の態様では、本発明のポリペプチドは、酵素消費を抑え、コーヒー抽出物の汚染を防ぐために、固定化形態で適用される。この用途は、欧州特許第６７６ １４５号に更に開示されている。
【0228】
一般的には、本発明のポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド若しくはフラグメント、又はその変異型の存在下、液体コーヒー抽出物中に存在するガラクトマンナンの加水分解に好適な条件下で、コーヒー抽出物をインキュベートする。
【0229】
焼成食品用の本発明のポリペプチド
別の態様では、本発明は、本発明の任意のポリペプチドをドウに加え、続いてそのドウを焼成することを含む、焼成製品の調製方法に関する。焼成製品の例は、当業者に周知であり、パン、ロール、パフペストリー、甘味付き発酵ドウ、バンズ、ケーキ、クラッカー、クッキー、ビスケット、ワッフル、ウエハース、トルティーヤ、朝食用シリアル、絞り出し製品等が挙げられる。
別の態様では、本発明は、本発明の任意のポリペプチドをドウに加え、続いてそのドウを焼成することを含む、焼成製品の調製方法に関する。焼成製品の例は、当業者に周知であり、パン、ロール、パフペストリー、甘味付き発酵ドウ、バンズ、ケーキ、クラッカー、クッキー、ビスケット、ワッフル、ウエハース、トルティーヤ、朝食用シリアル、絞り出し製品等が挙げられる。
【0230】
任意の本発明のポリペプチドを、製パン改良組成物の一部としてドウに加えてよい。製パン改良剤は、ドウの特性、並びに焼成製品、例えばパン及びケーキの品質を改善する、様々な成分を含有する組成物である。多くの場合、有益な効果、例えばドウの安定性、並びにパンのテクスチャー及びかさのため、製パン改良剤を工業的焼成プロセスに加える。製パン改良剤は、通常、油脂、並びに、乳化剤、酵素、抗酸化剤、酸化剤、安定化剤、及び還元剤等の添加剤を含有する。本発明の任意のポリペプチドに加え、パン改良剤中にも存在してよい、又はそうでない場合は、本発明の任意のポリペプチドと共に使用してよいその他酵素として、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解複合体、リパーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、非デンプンポリサッカライド分解酵素、及び、グルコースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ又はアスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化還元酵素が挙げられる。
【0231】
本発明の好ましい焼成用態様では、コンニャクガム、グアーガム、ローカストビーンガム（イナゴマメ）、コプラミール、アイボリーナットマンナン（ゾウゲヤシ）、海草マンナン抽出物、ココナツミール、及び醸造用酵母の細胞壁（乾燥、又は醸造用酵母抽出物の形態で使用されてよい）等の、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナン源も含む、製パン改良組成物の一部として、本発明の任意のポリペプチドをドウに加えてよい。本発明での使用に許容されるその他のマンナン誘導体として、非分枝状のβ－１，４結合したマンナンホモポリマー及びマンノ－オリゴサッカライド（マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、及びマンノペントエース）が挙げられる。任意の本発明のポリペプチドは更に、ドウの耐性、ドウの柔軟性及び／若しくはドウの粘着性、並びに／又は、パンくず構造、並びにパン老化の遅延性を改善するため、単独で、又は、グルコマンナン及び／若しくはガラクトマンナン及び／若しくはガラクトグルコマンナンと組み合わせて使用してよい。別の態様では、マンナナーゼ加水分解産物は、マンノ－オリゴサッカライド（ＭＯＳ）等の可溶性プレバイオティクスとして働き、結腸中に好ましい密度で存在するとき、良好な健康状態に一般的に関連する、乳酸菌の増殖を促進する。
【0232】
一態様では、本発明の任意のポリペプチドが加えられるドウは、精製小麦粉に加え、又はその代わりに、フスマ又はオーツ麦、コメ、キビ、トウモロコシ、又は豆果粉を含む（すなわち、精白粉のドウではない）。
【0233】
酪農食品用の本発明のポリペプチド
本発明の一態様では、本発明の任意のポリペプチドを、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナンも添加されている、牛乳又は任意のその他酪農製品に加えてよい。典型的なグルコマンナン及び／又はガラクトマンナン源は、焼成用態様において上述しており、グアー又はコンニャクガムが挙げられる。本発明の任意のポリペプチドをグルコマンナン及び／又はガラクトマンナンと組み合わせると、マンナナーゼ加水分解産物（マンノオリゴサッカライド）を遊離し、これは、大腸又は結腸中に好ましい密度で存在するとき、良好な健康状態に一般的に関連する、プロバイオティクス細菌（特にビフィズス菌（Bifidobacteria）及びラクトバチルス（Lactobacillus）乳酸菌）の選択的生育及び増殖を促進することによって、可溶性プレバイオティクスとして作用する。
本発明の一態様では、本発明の任意のポリペプチドを、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナンも添加されている、牛乳又は任意のその他酪農製品に加えてよい。典型的なグルコマンナン及び／又はガラクトマンナン源は、焼成用態様において上述しており、グアー又はコンニャクガムが挙げられる。本発明の任意のポリペプチドをグルコマンナン及び／又はガラクトマンナンと組み合わせると、マンナナーゼ加水分解産物（マンノオリゴサッカライド）を遊離し、これは、大腸又は結腸中に好ましい密度で存在するとき、良好な健康状態に一般的に関連する、プロバイオティクス細菌（特にビフィズス菌（Bifidobacteria）及びラクトバチルス（Lactobacillus）乳酸菌）の選択的生育及び増殖を促進することによって、可溶性プレバイオティクスとして作用する。
【0234】
別の態様は、本発明の任意のポリペプチド、及び、任意のグルコマンナン又はガラクトマンナン又はガラクトグルコマンナンを加えることを含む、牛乳又は酪農製品の調製方法に関する。
【0235】
別の態様では、プレバイオティクスマンナン加水分解産物を含む、酪農系食品を製造するため、酪農系食品に加える前、又は後に、本発明の任意のポリペプチドを、任意のグルコマンナン又はガラクトマンナンと組み合わせて使用する。更なる態様では、このように製造されたマンノオリゴサッカライド含有酪農製品は、有益なヒト腸管微生物叢の集団を増やすことができ、また更なる態様では、酪農系食品は、任意のグルコマンナン及び／又はガラクトマンナン及び／又はガラクトグルコマンナン源と共に、本発明の任意のポリペプチドと、ヒト大腸中での効果が既知である、摂取に十分な量の少なくとも１種の細菌株（例えば、ビフィズス菌（Bifidobacteria）又はラクトバチルス（Lactobacillus））と、を含んでよい。一態様では、酪農系食品は、ヨーグルト又は牛乳飲料である。
【0236】
紙パルプ漂白用の本発明のポリペプチド
本明細書に記載されるポリペプチドは、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ、及び亜硫酸法によって作製されたパルプ等の、紙パルプの酵素による漂白に更に有用である。大まかに言えば、紙パルプを、紙パルプの漂白に好適な条件下で、本明細書に記載されるポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド若しくはフラグメント、又はその変異型と共にインキュベートする。
本明細書に記載されるポリペプチドは、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ、及び亜硫酸法によって作製されたパルプ等の、紙パルプの酵素による漂白に更に有用である。大まかに言えば、紙パルプを、紙パルプの漂白に好適な条件下で、本明細書に記載されるポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド若しくはフラグメント、又はその変異型と共にインキュベートする。
【0237】
いくつかの実施形態では、パルプは、酸素、オゾン、ペルオキシド又はペルオキシ酸で漂白された、塩素を含まないパルプである。いくつかの実施形態では、低リグニン含量を呈する、改変又は連続パルプ化法によって製造されたパルプの酵素による漂白に、本発明のポリペプチドを使用する。いくつかの別の実施形態では、本発明のポリペプチドを、単独で、又は好ましくはキシラナーゼ及び／若しくはエンドグルカナーゼ及び／若しくはα－ガラクトシダーゼ及び／若しくはセルビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて適用する。
【0238】
増粘剤分解用の本発明のポリペプチド
グアーガム及びローカストビーンガム等のガラクトマンナンは、増粘剤として、例えば、食品、及び、Ｔシャツのプリント等の衣類捺染用捺染糊中で広く使われている。したがって、本明細書に記載されるポリペプチドはまた、マンナン含有基質の濃度又は粘度を低下させるのにも有用である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを、加工装置中の残留食品の粘度を低下させ、それによって加工後の洗浄を容易にするために使用する。特定の別の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドを、捺染糊の粘度を低下させ、それによって衣類プリント後の余剰の捺染糊を容易に洗い流すために使用する。大まかに言えば、マンナン含有基質を、本明細書に記載されるポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド若しくはフラグメント、又はその変異型と、マンナン含有基質の粘度の低下に好適な条件下でインキュベートする。
グアーガム及びローカストビーンガム等のガラクトマンナンは、増粘剤として、例えば、食品、及び、Ｔシャツのプリント等の衣類捺染用捺染糊中で広く使われている。したがって、本明細書に記載されるポリペプチドはまた、マンナン含有基質の濃度又は粘度を低下させるのにも有用である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドを、加工装置中の残留食品の粘度を低下させ、それによって加工後の洗浄を容易にするために使用する。特定の別の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドを、捺染糊の粘度を低下させ、それによって衣類プリント後の余剰の捺染糊を容易に洗い流すために使用する。大まかに言えば、マンナン含有基質を、本明細書に記載されるポリペプチド及び／若しくは単離ポリペプチド若しくはフラグメント、又はその変異型と、マンナン含有基質の粘度の低下に好適な条件下でインキュベートする。
【0239】
本発明の組成物及び方法の他の態様及び実施形態は、上記の説明及び以下の実施例より明らかとなるであろう。
【実施例】
【0240】
以下の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を実証及び例示する目的で示されるものであって、限定と解釈されるべきものではない。
【0241】
（実施例１）
バチルス（Bacillus）及びパエニバチルス（Paenibacillus）マンナナーゼの同定
バチルス（Bacillus）及びパエニバチルス（Paenibacillus）種によってコードされるマンナナーゼについて、次のヌクレオチド及びアミノ酸配列をＮＣＢＩデータベースから抽出した。
バチルス（Bacillus）及びパエニバチルス（Paenibacillus）マンナナーゼの同定
バチルス（Bacillus）及びパエニバチルス（Paenibacillus）種によってコードされるマンナナーゼについて、次のヌクレオチド及びアミノ酸配列をＮＣＢＩデータベースから抽出した。
【0242】
ＢｃｉＭａｎ１遺伝子のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ参照配列ＡＢ００７１２３．１）（Ｂ．シルクランス（B. circulans）Ｋ－１から単離）を、配列番号１と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0243】
ＢｃｉＭａｎ１遺伝子によってコードされる前駆体タンパク質ＢｃｉＭａｎ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＢＡＡ２５８７８．１）を、配列番号２と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0244】
ＢｃｉＭａｎ３遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＡＹ９０７６６８．１、４３０～１４１３、相補）（Ｂ．シルクランス（B. circulans）１９６から単離）を、配列番号３と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0245】
ＢｃｉＭａｎ３遺伝子によってコードされる前駆体タンパク質ＢｃｉＭａｎ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＡＸ８７００２．１）を、配列番号４と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0246】
ＢｃｉＭａｎ４遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＡＹ９１３７９６．１、７８５～１７６５）（バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）ＣＧＭＣＣ１５５４から単離）を、配列番号５と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0247】
ＢｃｉＭａｎ４遺伝子によってコードされる前駆体タンパク質ＢｃｉＭａｎ４のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＡＸ８７００３．１）を、配列番号６と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0248】
ＰｐｏＭａｎ１遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０１４４８３．１、６４９１３４～６５０１１７、相補）（パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）Ｅ６８１から単離）を、配列番号７と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0249】
ＰｐｏＭａｎ１遺伝子によってコードされるタンパク質ＰｐｏＭａｎ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＹＰ＿００３８６８９８９．１）を、配列番号８と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0250】
ＰｐｏＭａｎ２遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０１４６２２．１、７４６８７１～７４７８５４、相補）（パエニバチルス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）ＳＣ２から単離）を、配列番号９と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0251】
ＰｐｏＭａｎ２遺伝子によってコードされる仮説タンパク質ＰｐｏＭａｎ２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＹＰ＿００３９４４８８４．１）を、配列番号１０と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0252】
ＰｓｐＭａｎ４遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＧＱ３５８９２６．１）（パエニバチルス（Paenibacillus）種Ａ１から単離）を、配列番号１１と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0253】
ＰｓｐＭａｎ４遺伝子によってコードされるタンパク質ＰｓｐＭａｎ４のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＣＵ３０８４３．１）を、配列番号１２と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0254】
ＰｓｐＭａｎ５遺伝子の核酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＪＮ６０３７３５．１、５３６～１５１９）（パエニバチルス（Paenibacillus）種ＣＨ－３から単離）を、配列番号１３と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0255】
ＰｓｐＭａｎ５遺伝子によってコードされるタンパク質ＰｓｐＭａｎ５のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＥＸ６０７６２．１）を、配列番号１４と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0256】
更に、マンナナーゼを、パエニバチルス・アミロリティカス（Paenibacillus amylolyticus）ＤＳＭ１１７３０、ＤＳＭ１５２１１、及びＤＳＭ１１７４７、パエニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli）ＤＳＭ３０３６、パエニバチルス（Paenibacillus）種ＦｅＬ０５（パエニバチルス・フナネンシス（Paenibacillus hunanensis）ＤＳＭ２２１７０に改名）、及びパエニバチルス・ツンドラエ（Paenibacillus tundrae）（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＤｕＰｏｎｔ）のゲノムを配列決定することによって、同定した。これらの生物の全ゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代シーケンス技術を用いて、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が配列決定し、その後ＢａｓｅＣｌｅａｒがまとめた。コンティグはＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により注釈付した。
【0257】
ＰａｍＭａｎ２遺伝子のヌクレオチド配列（パエニバチルス・アミロリティカス（Paenibacillus amylolyticus）から単離）を、配列番号１５と定める（ＤＳＭ１１７３０、ＤＳＭ１５２１１、及びＤＳＭ１１７４７に同一配列が見つかり、予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0258】
ＰａｍＭａｎ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１６と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0259】
完全にプロセシングを受けた成熟ＰａｍＭａｎ２タンパク質の配列（２９７残基のアミノ酸）を、配列番号１７と定める：
【0260】
ＰｐａＭａｎ２遺伝子のヌクレオチド配列（パエニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli）ＤＳＭ３０３６から単離）を、配列番号１８と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0261】
ＰｐａＭａｎ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１９と定める（予測される天然シグナルペプチドをイタリックかつ太字で示す）：
【0262】
ＰｓｐＭａｎ９遺伝子のヌクレオチド配列（パエニバチルス（Paenibacillus）種ＦｅＬ０５から単離）を、配列番号２０と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0263】
ＰｓｐＭａｎ９前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２１と定める（予測される天然シグナルペプチドをイタリックかつ太字で示す）：
【0264】
ＰｔｕＭａｎ２遺伝子のヌクレオチド配列（パエニバチルス・ツンドラエ（Paenibacillus tundrae）から単離）を、配列番号２２と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0265】
ＰｔｕＭａｎ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２３と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0266】
完全にプロセシングを受けた成熟ＰｔｕＭａｎ２の配列（３０３残基のアミノ酸）を、配列番号２４と定める：
【0267】
（実施例２）
マンナナーゼの異種発現
成熟型のＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、及びＰｓｐＭａｎ９遺伝子のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によってＢ．ズブチリス（B. subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０～５２、２００７）内に挿入して、ａｐｒＥプロモーター、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）内で標的タンパク質の分泌の誘導に使用されるａｐｒＥシグナル配列、ペプチドＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓをコードし、標的タンパク質の分泌を促進するオリゴヌクレオチドＡＧＫ－ｐｒｏＡｐｒＥ、及び、対象とする遺伝子の成熟領域をコードする合成ヌクレオチド配列を含む、発現プラスミドを得た。ＰｓｐＭａｎ４発現プラスミド（ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４）の代表的なプラスミドマップを図１に示す。
マンナナーゼの異種発現
成熟型のＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、及びＰｓｐＭａｎ９遺伝子のＤＮＡ配列を合成し、Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によってＢ．ズブチリス（B. subtilis）発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０～５２、２００７）内に挿入して、ａｐｒＥプロモーター、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）内で標的タンパク質の分泌の誘導に使用されるａｐｒＥシグナル配列、ペプチドＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓをコードし、標的タンパク質の分泌を促進するオリゴヌクレオチドＡＧＫ－ｐｒｏＡｐｒＥ、及び、対象とする遺伝子の成熟領域をコードする合成ヌクレオチド配列を含む、発現プラスミドを得た。ＰｓｐＭａｎ４発現プラスミド（ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４）の代表的なプラスミドマップを図１に示す。
【0268】
好適なＢ．ズブチリス（B. subtilis）宿主株を、それぞれの発現プラスミドによって形質転換し、形質転換細胞を、５ｐｐｍのクロラムフェニコールと添加したルリア寒天プレート上に播種した。上記マンナナーゼのそれぞれを産生させるため、プラスミドを含むＢ．ズブチリス（B. subtilis）形質転換体を、２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて、追加の５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加したＭＯＰＳ系合成培地中で増殖した。
【0269】
発現プラスミドｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ１中の合成ＢｃｉＭａｎ１遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号２５と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0270】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ１プラスミドから発現されるＢｃｉＭａｎ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２６と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0271】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ１プラスミドから発現されるＢｃｉＭａｎ１成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２７と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0272】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＢｃｉＭａｎ１成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２８と定める：
【0273】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ３プラスミド中の合成ＢｃｉＭａｎ３遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号２９と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0274】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ３プラスミドから発現されるＢｃｉＭａｎ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３０と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0275】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ３から発現されるＢｃｉＭａｎ３成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３１と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長を太字で示す）：
【0276】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＢｃｉＭａｎ３成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３２と定める：
【0277】
発現プラスミドｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ４中の合成ＢｃｉＭａｎ４遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号３３と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0278】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ４から発現されるＢｃｉＭａｎ４前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３４と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0279】
ｐ２ＪＭ－ＢｃｉＭａｎ４から発現されるＢｃｉＭａｎ４成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３５と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長を太字で示す）：
【0280】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＢｃｉＭａｎ４成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３６と定める：
【0281】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐａＭａｎ２中の合成ＰｐａＭａｎ２遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号３７と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0282】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐａＭａｎ２から発現されるＰｐａＭａｎ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３８と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0283】
ｐ２ＪＭ－ＰｐａＭａｎ２から発現されるＰｐａＭａｎ２成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３９と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0284】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰｐａＭａｎ２成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４０と定める：
【0285】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ１中の合成ＰｐｏＭａｎ１遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号４１と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0286】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ１から発現されるＰｐｏＭａｎ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４２と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0287】
ｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ１から発現されるＰｐｏＭａｎ１成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４３と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長を太字で示す）：
【0288】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰｐｏＭａｎ１成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４４と定める：
【0289】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ２中の合成ＰｐｏＭａｎ２遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号４５と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0290】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ２から発現されるＰｐｏＭａｎ２前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４６と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0291】
ｐ２ＪＭ－ＰｐｏＭａｎ２から発現されるＰｐｏＭａｎ２成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４７と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0292】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰｐｏＭａｎ２成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４８と定める：
【0293】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４中の合成ＰｓｐＭａｎ４遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号４９と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0294】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４から発現されるＰｓｐＭａｎ４前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５０と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0295】
ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ４から発現される確認されたＰｓｐＭａｎ４成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５１と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0296】
天然に存在する配列の予測切断に基づく、確認されたＰｓｐＭａｎ４成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５２と定める：
【0297】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ５中の合成ＰｓｐＭａｎ５遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号５３と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0298】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ５から発現されるＰｓｐＭａｎ５前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５４と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0299】
ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ５から発現されるＰｓｐＭａｎ５成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５５と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0300】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰｓｐＭａｎ５成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５６と定める：
【0301】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ９中の合成ＰｓｐＭａｎ９遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号５７と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基付加（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0302】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ９から発現されるＰｓｐＭａｎ９前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５８と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0303】
ｐ２ＪＭ－ＰｓｐＭａｎ９から発現されるＰｓｐＭａｎ９成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５９と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0304】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰｓｐＭａｎ９成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６０と定める：
【0305】
（実施例３）
マンナナーゼの精製
ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ４、及びＰｓｐＭａｎ４タンパク質を、陰イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる２つのクロマトグラフィー工程によって精製した。濃縮され、脱塩された粗タンパク質サンプルを、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ）で予め平衡化した、７０ｍＬのＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。カラムの洗浄後、カラムの５倍量の、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａの０～５０％勾配によって、タンパク質を溶出した。標的タンパク質は素通り画分内にあった。次に、硫酸アンモニウムを、最終濃度が０．８～１Ｍになるまで素通り画分に加えた。この溶液を、０．８～１Ｍの硫酸アンモニウムを含む、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにのせた。カラムの４倍量の勾配溶出（０～１００％緩衝液Ａ）の後、カラムの３倍量の段階溶出（１００％緩衝液Ａ）を行い、最終的に目的とするタンパク質を溶出した。画分の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて検出し、その結果、標的タンパク質が完全に精製されていることが示された。活性画分をプールし、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を用いて濃縮した。サンプルの純度は９０％超であり、使用するまで－２０℃～－８０℃の４０％グリセロール中で保存した。
マンナナーゼの精製
ＢｃｉＭａｎ１、ＢｃｉＭａｎ４、及びＰｓｐＭａｎ４タンパク質を、陰イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる２つのクロマトグラフィー工程によって精製した。濃縮され、脱塩された粗タンパク質サンプルを、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ）で予め平衡化した、７０ｍＬのＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。カラムの洗浄後、カラムの５倍量の、１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａの０～５０％勾配によって、タンパク質を溶出した。標的タンパク質は素通り画分内にあった。次に、硫酸アンモニウムを、最終濃度が０．８～１Ｍになるまで素通り画分に加えた。この溶液を、０．８～１Ｍの硫酸アンモニウムを含む、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにのせた。カラムの４倍量の勾配溶出（０～１００％緩衝液Ａ）の後、カラムの３倍量の段階溶出（１００％緩衝液Ａ）を行い、最終的に目的とするタンパク質を溶出した。画分の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて検出し、その結果、標的タンパク質が完全に精製されていることが示された。活性画分をプールし、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を用いて濃縮した。サンプルの純度は９０％超であり、使用するまで－２０℃～－８０℃の４０％グリセロール中で保存した。
【0306】
ＢｃｉＭａｎ３、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２タンパク質を、陰イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びゲル濾過精製法の３工程を用いて精製した。振盪フラスコの７００ｍＬの粗培養液を、ＶＩＶＡＦＬＯＷ ２００（カットオフ１０ｋＤａ）で濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換を行った。次に、この液体を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）で予め平衡化した５０ｍＬのＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。このカラムを、カラムの３倍量の０～５０％緩衝液Ｂ（１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）の直線勾配と、その後の、カラム３倍量の１００％緩衝液Ｂによって溶出した。目的とするタンパク質は勾配溶出部に検出され、純粋画分をプールした。続いて、３Ｍ硫酸アンモニウム溶液を活性画分に加えて最終濃度を１Ｍとし、その後、前処理した画分を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化した５０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにのせた。カラム４倍量の勾配溶出（０～１００％緩衝液Ａ）の後、３倍量の段階溶出（１００％緩衝液Ａ）を行い、比較的純粋な画分をプールした。回収した画分を１０ｍＬに濃縮し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）２６／６０，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５カラム（カラム容量＝３２０ｍＬ）にのせた。純粋画分をプールし、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を用いて濃縮した。精製したサンプルを、４０％グリセロールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、－２０℃において使用するまで保存した。
【0307】
ＰｓｐＭａｎ５及びＰｓｐＭａｎ９タンパク質を精製するため、硫酸アンモニウムを、最終濃度が１Ｍになるまで粗サンプルに加えた。この溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、１Ｍ硫酸アンモニウム（緩衝液Ａ）で予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）１６／１０ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦカラムにのせた。標的タンパク質を、１～０Ｍ硫酸アンモニウムの直線塩勾配を用いてカラムから溶出した。活性画分をプールし、ＶｉｖａＦｌｏｗ ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて濃縮し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）への緩衝液交換を行った。得られた溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）Ｑ ＸＬ １６／１０カラムにのせた。標的タンパク質を、緩衝液Ａ中の０～０．６Ｍ ＮａＣｌの直線塩勾配を用いてカラムから溶出した。続いて、得られた活性タンパク質画分をプールして、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ装置を用いて濃縮し、使用するまで－２０℃の４０％グリセロール中で保存した。
【0308】
ＰｐａＭａｎ２を、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。８００ｍＬの粗培養液を、ＶＩＶＡＦＬＯＷ ２００（カットオフ１０ｋＤａ）で濃縮し、硫酸アンモニウムを最終濃度が０．８Ｍになるように加えた。次に、このサンプルを、緩衝液Ａ（０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）で予め平衡化した５０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。このカラムを、カラムの５倍量の０～１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）の勾配溶出と、その後の、カラム３倍量の１００％緩衝液Ｂによって処理した。比較的純粋な活性画分をプールし、緩衝液Ｂへの緩衝液交換を行った。溶液は混濁し、それを５０ｍＬ容チューブに分注して、３８００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。上清及び沈殿物を回収した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル解析の結果によると、標的タンパク質は上清中に同定され、それを続いて、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにのせ、カラム４倍量の０～５０％緩衝液Ｃ（１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム）による直線勾配溶出の後、３倍量の段階溶出（１００％緩衝液Ｃ）を行った。各画分の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。純粋画分をプールし、１０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を用いて濃縮した。精製したサンプルを、４０％グリセロールを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で、－２０℃において保存した。
【0309】
（実施例４）
マンナナーゼの活性
０．５％ローカストビーンガムガラクトマンナン（Ｓｉｇｍａ Ｇ０７５３）及びコンニャクグルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｐ－ＧＬＣＭＬ）を基質として用いて、マンナナーゼのβ１－４マンナナーゼ活性を測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２の２種の緩衝液系を用いて、５０℃にて１０分間アッセイを実施した。両設定のアッセイにおいて、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８、１９７２）を用いて、遊離した還元糖を定量した。マンノースを用いて、各緩衝液について検量線を作製し、酵素活性単位の算出に使用した。このアッセイでは、１マンナナーゼ単位は、１分あたりに１マイクロモルのマンノース還元糖等価物を生成するのに要する酵素量として定義する。マンナナーゼの比活性を表１にまとめる。
マンナナーゼの活性
０．５％ローカストビーンガムガラクトマンナン（Ｓｉｇｍａ Ｇ０７５３）及びコンニャクグルコマンナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｐ－ＧＬＣＭＬ）を基質として用いて、マンナナーゼのβ１－４マンナナーゼ活性を測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２の２種の緩衝液系を用いて、５０℃にて１０分間アッセイを実施した。両設定のアッセイにおいて、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８、１９７２）を用いて、遊離した還元糖を定量した。マンノースを用いて、各緩衝液について検量線を作製し、酵素活性単位の算出に使用した。このアッセイでは、１マンナナーゼ単位は、１分あたりに１マイクロモルのマンノース還元糖等価物を生成するのに要する酵素量として定義する。マンナナーゼの比活性を表１にまとめる。
【0310】
【表3】
【0311】
（実施例５）
マンナナーゼのｐＨ特性
基質としてローカストビーンガムを用いて、５０℃、１０分間で、２～９の範囲の様々なｐＨ値において、マンナナーゼ活性用アッセイによってマンナナーゼのｐＨ特性を決定した。タンパク質を、用量反応曲線に基づく適当な濃度まで、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した。様々なｐＨのクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液を用いて緩衝化した基質溶液を、５０℃のサーモミキサーで５分間予備インキュベートした。この反応は、マンナナーゼの添加により開始した。混合液を５０℃で１０分間インキュベートした後、１００マイクロリットルのＰＡＨＢＡＨ溶液を含む９６ウェルのＰＣＲプレートに、１０マイクロリットルの反応混合液を移すことによって反応を停止した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ内で、ＰＣＲプレートを９５℃で５分間加熱した。その後、新しい９６ウェルプレートに、各ウェルから１００マイクロリットルを移した。分光光度計において、４１０ｎｍの吸光度を測定することによって、基質からの還元糖の遊離を定量した。各ｐＨにおける酵素活性を、至適ｐＨでの活性を１００％とした場合の相対活性として報告する。これらのアッセイ条件下におけるマンナナーゼの至適ｐＨ及び≧７０％活性の範囲を、表２に示す。
マンナナーゼのｐＨ特性
基質としてローカストビーンガムを用いて、５０℃、１０分間で、２～９の範囲の様々なｐＨ値において、マンナナーゼ活性用アッセイによってマンナナーゼのｐＨ特性を決定した。タンパク質を、用量反応曲線に基づく適当な濃度まで、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した。様々なｐＨのクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液を用いて緩衝化した基質溶液を、５０℃のサーモミキサーで５分間予備インキュベートした。この反応は、マンナナーゼの添加により開始した。混合液を５０℃で１０分間インキュベートした後、１００マイクロリットルのＰＡＨＢＡＨ溶液を含む９６ウェルのＰＣＲプレートに、１０マイクロリットルの反応混合液を移すことによって反応を停止した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ内で、ＰＣＲプレートを９５℃で５分間加熱した。その後、新しい９６ウェルプレートに、各ウェルから１００マイクロリットルを移した。分光光度計において、４１０ｎｍの吸光度を測定することによって、基質からの還元糖の遊離を定量した。各ｐＨにおける酵素活性を、至適ｐＨでの活性を１００％とした場合の相対活性として報告する。これらのアッセイ条件下におけるマンナナーゼの至適ｐＨ及び≧７０％活性の範囲を、表２に示す。
【0312】
【表4】
【0313】
（実施例６）
マンナナーゼの温度特性
ｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で、様々な温度で１０分間、基質としてローカストビーンガムを用いて、マンナナーゼ活性用アッセイによってマンナナーゼの温度特性を決定した。この活性を、至適温度での活性を１００％とした場合の相対活性として報告する。これらのアッセイ条件下におけるマンナナーゼの至適温度及び≧７０％活性の温度範囲を、表３に示す。
マンナナーゼの温度特性
ｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で、様々な温度で１０分間、基質としてローカストビーンガムを用いて、マンナナーゼ活性用アッセイによってマンナナーゼの温度特性を決定した。この活性を、至適温度での活性を１００％とした場合の相対活性として報告する。これらのアッセイ条件下におけるマンナナーゼの至適温度及び≧７０％活性の温度範囲を、表３に示す。
【0314】
【表5】
【0315】
（実施例７）
パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）マンナナーゼの熱安定性
パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）マンナナーゼの温度安定性を、ｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で決定した。４０℃～９０℃の範囲の温度で２時間、サーモサイクラー内で酵素をインキュベートした。残存酵素活性を、基質としてローカストビーンガムを用いて測定した。氷上に保持された試料の活性を１００％の活性として定義した。これらのアッセイ条件下で、２時間インキュベートした後に、酵素が５０％活性（Ｔ５０）を保持する温度を表４に示す。
パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）マンナナーゼの熱安定性
パエニバチルス（Paenibacillus）及びバチルス（Bacillus）マンナナーゼの温度安定性を、ｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で決定した。４０℃～９０℃の範囲の温度で２時間、サーモサイクラー内で酵素をインキュベートした。残存酵素活性を、基質としてローカストビーンガムを用いて測定した。氷上に保持された試料の活性を１００％の活性として定義した。これらのアッセイ条件下で、２時間インキュベートした後に、酵素が５０％活性（Ｔ５０）を保持する温度を表４に示す。
【0316】
【表6】
【0317】
（実施例８）
マンナナーゼの洗浄性能
人工汚れからのガラクトマンナンの除去を測定するために開発されたハイスループットアッセイを用いて、洗浄性能を測定した。このアッセイは、ローカストビーンガムを含有する人工汚れからのローカストビーンガムの遊離を測定する。ＢＣＡ試薬は、ブランク（酵素を含まない）対照と比較して、マンナナーゼ酵素の存在下で遊離されたオリゴサッカライドの還元端を測定する。この測定値は、酵素の洗浄性能と相関する。マンナナーゼはガラクトマンナンを加水分解するため、新たな還元端を持つ様々な長さのオリゴサッカライドが綿スウォッチから遊離される。次いで、Ｃｕ１＋が、Ｃｕ２＋の還元により生成されるため、ＢＣＡ試薬中のビシンコニン酸が、好感度の比色検出を可能にする。
マンナナーゼの洗浄性能
人工汚れからのガラクトマンナンの除去を測定するために開発されたハイスループットアッセイを用いて、洗浄性能を測定した。このアッセイは、ローカストビーンガムを含有する人工汚れからのローカストビーンガムの遊離を測定する。ＢＣＡ試薬は、ブランク（酵素を含まない）対照と比較して、マンナナーゼ酵素の存在下で遊離されたオリゴサッカライドの還元端を測定する。この測定値は、酵素の洗浄性能と相関する。マンナナーゼはガラクトマンナンを加水分解するため、新たな還元端を持つ様々な長さのオリゴサッカライドが綿スウォッチから遊離される。次いで、Ｃｕ１＋が、Ｃｕ２＋の還元により生成されるため、ＢＣＡ試薬中のビシンコニン酸が、好感度の比色検出を可能にする。
【0318】
２枚の直径５．５ｃｍのローカストビーンガムＣＳ－７３マイクロスウォッチ（ＣＦＴ（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ））を、底部が平らな非結合９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに置いた。酵素を、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した。希釈した酵素及びマイクロスウォッチアッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０）を合わせて１００マイクロリットルにして、各ウェルに加えた。プレートに封をし、１１５０ｒｐｍで２０分間撹拌しながら２５℃のｉＥＭＳ機器内でインキュベートした。生成した新たな還元端を測定するため、１００マイクロリットルのＢＣＡアッセイ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））をピペッティングして、新しいＰＣＲプレートの各ウェルに加えた。インキュベート時間が完了した後、マイクロスウォッチアッセイプレートの各ウェルから１５マイクロリットルの洗浄液を取り出し、ＢＣＡ試薬を含むプレートに移した。プレートに封をし、９５℃のＰＣＲ機器内で２～３分間インキュベートした。プレートを２５℃に冷却した後、１００マイクロリットルの上清を新しい底部が平らなマイクロタイターアッセイプレートに移し、分光光度計で５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。図２Ａ及び２Ｂは、このアッセイにおけるマンナナーゼの反応を示す。試験した全てのマンナナーゼが、ガラクトマンナン除去活性を示した。
【0319】
（実施例９）
相同なマンナナーゼの同定
成熟タンパク質のアミノ酸配列であるＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、及びＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）を用いて、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９～４０２、１９９７）によって、関連タンパク質を同定し、その結果の一部をそれぞれ表５Ａ、６Ａ、及び７Ａに示す。検索パラメーターをデフォルト値に設定し、クエリ配列として成熟タンパク質のアミノ酸配列であるＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、及びＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）を用いて、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースに対する類似性検索を行い、その結果の一部をそれぞれ表５Ｂ、６Ｂ、及び７Ｂに示す。いずれの検索セットに関しても、同一性パーセント（ＰＩＤ）は、ペアワイズアライメントにおいて、同一残基数をアライメントした残基の数で除したものとして定義する。「配列長」と称されたカラムは、一覧の登録番号に関連するタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指し、一方「アライメント長」と称されたカラムは、ＰＩＤ計算に使用されたアライメントしたタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指す。
相同なマンナナーゼの同定
成熟タンパク質のアミノ酸配列であるＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、及びＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）を用いて、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９～４０２、１９９７）によって、関連タンパク質を同定し、その結果の一部をそれぞれ表５Ａ、６Ａ、及び７Ａに示す。検索パラメーターをデフォルト値に設定し、クエリ配列として成熟タンパク質のアミノ酸配列であるＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、及びＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）を用いて、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースに対する類似性検索を行い、その結果の一部をそれぞれ表５Ｂ、６Ｂ、及び７Ｂに示す。いずれの検索セットに関しても、同一性パーセント（ＰＩＤ）は、ペアワイズアライメントにおいて、同一残基数をアライメントした残基の数で除したものとして定義する。「配列長」と称されたカラムは、一覧の登録番号に関連するタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指し、一方「アライメント長」と称されたカラムは、ＰＩＤ計算に使用されたアライメントしたタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指す。
【0320】
【表7】
【0321】
【表8】
【0322】
【表9】
【0323】
【表10】
【0324】
【表11】
【0325】
【表12】
【0326】
（実施例１０）
相同配列の解析
成熟ＢｃｉＭａｎ１（配列番号２８）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号３２）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号３６）、ＰａｍＭａｎ２（配列番号１７）、ＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号４４）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号４８）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号５６）、ＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）、及びＰｔｕＭａｎ２（配列番号２４）マンナナーゼのアミノ酸配列と、表５Ａ、６Ａ、及び７Ａマンナナーゼの成熟型の配列（ＮＣＢＩ検索により同定）の一部とのアライメントを、図３に示す。完全長のトリミングされていない配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いてアライメントしたが、図３には、アミノ酸番号１～３００のアライメントを示し、完全長のトリミングされていない配列のアライメントではない。
相同配列の解析
成熟ＢｃｉＭａｎ１（配列番号２８）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号３２）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号３６）、ＰａｍＭａｎ２（配列番号１７）、ＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号４４）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号４８）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号５６）、ＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）、及びＰｔｕＭａｎ２（配列番号２４）マンナナーゼのアミノ酸配列と、表５Ａ、６Ａ、及び７Ａマンナナーゼの成熟型の配列（ＮＣＢＩ検索により同定）の一部とのアライメントを、図３に示す。完全長のトリミングされていない配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いてアライメントしたが、図３には、アミノ酸番号１～３００のアライメントを示し、完全長のトリミングされていない配列のアライメントではない。
【0327】
図３のアライメントしたマンナナーゼのアミノ酸配列の系統樹を作製し、図４に示す。完全長のトリミングされていない配列をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅに入力し、近隣結合（ＮＪ）法を用いて樹形図を作成した（Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｎｅｉ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ，４：４０６～４２５，１９８７）。樹形構成は、以下のパラメーターと、配列距離について木村の相関を用い、ギャップ位置を無視して計算した。ＡｌｉｇｎＸは、図４に示される系統樹上に表示された分子名に続いて、カッコ内に計算した距離値を表示する。
【0328】
（実施例１１）
ＮＤＬクレードマンナナーゼの独特の特徴
実施例１０に記載されるマンナナーゼのアライメントを行うと、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２マンナナーゼにおいて共通の特徴が保存されていた。１つには、Ｔｒｐ３０～Ｉｌｅ３９間の残基において共通のパターンの保存されたアミノ酸があり、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされている。ＮＤＬマンナナーゼは、後にＮＤＬクレードと名付けられるクレードを構成するための特徴を共有しており、この用語ＮＤＬは、Ｎ末端付近の完全に保存された残基ＮＤＬ（Ａｓｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ３３～３５）に由来している。示されるマンナナーゼの残基の番号は、連続した一次配列であり、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされている。ＮＤＬクレードに関連する保存されたアミノ酸のパターンを、図５にハイライトして示しており、ＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（ＸａはＦ又はＹであり、Ｘは任意のアミノ酸である）、ＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩ（ＸａはＦ又はＹであり、ＸｂはＮ、Ｙ又はＡであり、ＸｃはＡ又はＴである）、又は、ＷＦ／ＹＫＮＤＬＸ１Ｔ／ＡＡＩ（Ｘ１はＮ、Ｙ又はＡである）として記載できる。
ＮＤＬクレードマンナナーゼの独特の特徴
実施例１０に記載されるマンナナーゼのアライメントを行うと、ＢｃｉＭａｎ３、ＢｃｉＭａｎ４、ＰａｍＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ５、ＰｓｐＭａｎ９、及びＰｔｕＭａｎ２マンナナーゼにおいて共通の特徴が保存されていた。１つには、Ｔｒｐ３０～Ｉｌｅ３９間の残基において共通のパターンの保存されたアミノ酸があり、このときポリペプチドのアミノ酸の位置は、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされている。ＮＤＬマンナナーゼは、後にＮＤＬクレードと名付けられるクレードを構成するための特徴を共有しており、この用語ＮＤＬは、Ｎ末端付近の完全に保存された残基ＮＤＬ（Ａｓｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ３３～３５）に由来している。示されるマンナナーゼの残基の番号は、連続した一次配列であり、配列番号３２に定められるアミノ配列に対応して番号付けされている。ＮＤＬクレードに関連する保存されたアミノ酸のパターンを、図５にハイライトして示しており、ＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（ＸａはＦ又はＹであり、Ｘは任意のアミノ酸である）、ＷＸａＫＮＤＬＸｂＸｃＡＩ（ＸａはＦ又はＹであり、ＸｂはＮ、Ｙ又はＡであり、ＸｃはＡ又はＴである）、又は、ＷＦ／ＹＫＮＤＬＸ１Ｔ／ＡＡＩ（Ｘ１はＮ、Ｙ又はＡである）として記載できる。
【0329】
実施例１０に記載される系統樹は、ＮＤＬクレードマンナナーゼと他のマンナナーゼとの間の分化を示している。このクレードは、ＮＤＬクレード１及びＮＤＬクレード２に更に区別され、ＮＤＬクレード１はＰｔｕＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ４、ＢｃｉＭａｎ４、ＰｐａＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ９及びＰｓｐＭａｎ５を含み、一方ＮＤＬクレード２はＢｃｉＭａｎ３、ＰｐｏＭａｎ２及びＰｐｏＭａｎ１を含む。
【0330】
ＮＤＬクレードの全てのメンバーは、バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２及び他の参照マンナナーゼ配列には存在しない欠失を特徴とする、保存されたモチーフ（以下、「欠失モチーフ」）を有する。欠失モチーフは、図６に定められるアミノ酸配列の保存された一次配列中の２６２番目の位置から始まり、配列ＬＤＸＸＸＧＰＸＧＸＬＴ（Ｘは任意のアミノ酸である）又はＬＤＭ／ＬＶ／ＡＴ／ＡＧＰＸ１ＧＸ２ＬＴ（Ｘ１はＮ、Ａ又はＳであり、Ｘ２はＳ、Ｔ又はＮである）を含む。この配列は、ＮＤＬクレード１マンナナーゼでは、ＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ、ＮＤＬクレード２マンナナーゼでは、ＬＤＬＡ／ＶＡ／ＴＧＰＳ／ＮＧＮＬＴ、及び、ＮＤＬクレード３マンナナーゼでは、ＬＤＬ／ＶＳ／ＡＴ／ＮＧＰＳＧＮＬＴに更に区別される。ＮＤＬクレードの全てのメンバーは、バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２＿ＢＡＤ９９５２７．１、Ｂ．ネアルソニイ（B_nealsonii）＿ＡＧＵ７１４６６．１、及びＢｃｉｍａｎ１＿Ｂ．シルクランス（B_circulans）＿ＢＡＡ２５８７８．１マンナナーゼ配列には見られない、保存された欠失モチーフを有する。図６に定められるＮＤＬクレードの欠失モチーフ（すなわち、ＬＤＭ／ＬＶ／ＡＴ／ＡＧＰＸ１ＧＸ２ＬＴ（Ｘ１はＮ、Ａ又はＳであり、Ｘ２はＳ、Ｔ又はＮである）は、保存残基Ｌｅｕ２６２－Ａｓｐ２６３（ＬＤ）とＬｅｕ２７２－Ｔｈｒ２７３（ＬＴ）との間に起こる。
【0331】
ＮＤＬクレードマンナナーゼに最も近い関連構造は、バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２（１ＷＫＹ．ｐｄｂ）由来のものであり、そのため、これを対照として用いて、ＮＤＬクレードマンナナーゼの特徴の分化から予測される結果を理解する。図７は、バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２（黒色）、並びにＮＤＬクレードマンナナーゼＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ９及びＰｐａＭａｎ２のモデル（灰色）の構造を示す。ＰｓｐＭａｎ４、ＰｓｐＭａｎ９及びＰｐａＭａｎ２の構造を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウェア（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ））の「アライン」オプションを用いてモデリングし、構造類似性を確認した。アライメントは、従来の配列アライメントに対する追加のガイドとして、保存された構造モチーフを適用する。ＭＯＥの２０１２．１０配布版にある標準的なデフォルトプログラムを用いて、このアライメントを行った。欠失モチーフセグメントを矢印で示す。欠失モチーフは、Ｃ末端の構造中のループ内に位置する。バチルス（Bacillus）種ＪＡＭＢ－６０２マンナナーゼのＣ末端領域は、アルカリ性環境におけるこれらのマンナナーゼの相互作用の仕方を理解するのに重要であると考えられている（Ａｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ，６０：１４９０～１４９２，２００４）。この欠失により、ループの構造、長さ及び柔軟性に影響し、そのため、ＮＤＬクレードマンナナーゼの活性及び性能に影響すると想定される。
【0332】
（実施例１２）
パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１からの追加のマンナナーゼの同定
パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１株（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の全ゲノムの配列を、合成法によるＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）配列ケッチ法を利用して決定した。配列決定、アセンブリ及び注釈付後、この株から同定された遺伝子のうちの１つ、ＰａｍＭａｎ３は、ＮＤＬクレードマンナナーゼのメンバーに対する相同性を示した。
パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１からの追加のマンナナーゼの同定
パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１株（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の全ゲノムの配列を、合成法によるＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）配列ケッチ法を利用して決定した。配列決定、アセンブリ及び注釈付後、この株から同定された遺伝子のうちの１つ、ＰａｍＭａｎ３は、ＮＤＬクレードマンナナーゼのメンバーに対する相同性を示した。
【0333】
ＰａｍＭａｎ３遺伝子のヌクレオチド配列（パエニバチルス（Paenibacillus）種ＮＯ２１から単離）を、配列番号６１と定める（予測される天然シグナルペプチドをコードする配列を太字で示す）：
【0334】
ＰａｍＭａｎ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６２と定める（予測される天然シグナルペプチドを太字で示す）：
【0335】
完全にプロセシングを受けた成熟ＰａｍＭａｎ３タンパク質の配列（２９７残基のアミノ酸）を、配列番号６３と定める：
【0336】
（実施例１３）
ＰａｍＭａｎ３の発現
成熟型のＰａｍＭａｎ３遺伝子のＤＮＡ配列を合成し、ＰａｍＭａｎ３タンパク質を、実施例２に記載されるように発現させた。
ＰａｍＭａｎ３の発現
成熟型のＰａｍＭａｎ３遺伝子のＤＮＡ配列を合成し、ＰａｍＭａｎ３タンパク質を、実施例２に記載されるように発現させた。
【0337】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰａｍＭａｎ３中の合成ＰａｍＭａｎ３遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号６４と定める（遺伝子は、別の開始コドン（ＧＴＧ）を有しており、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを太字で示す）：
【0338】
プラスミドｐ２ＪＭ－ＰａｍＭａｎ３から発現されるＰａｍＭａｎ３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６５と定める（予測シグナル配列をイタリックで示し、３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0339】
ｐ２ＪＭ－ＰａｍＭａｎ３プラスミドから発現されるＰａｍＭａｎ３成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６６と定める（予測切断部位に基づく３残基のアミノ末端延長（ＡＧＫ）を太字で示す）：
【0340】
天然に存在する配列の予測切断に基づくＰａｍＭａｎ３成熟タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号６７と定める：
【0341】
（実施例１４）
ＰａｍＭａｎ３の精製
ＰａｍＭａｎ３を、２つのクロマトグラフィー工程、すなわち、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。濃縮され脱塩された粗タンパク質サンプルを、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。勾配溶出を行い、酵素活性を有する画分をプールして、緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で予め平衡化した３０ｍＬのＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。このカラムを、カラムの５倍量の０～５０％緩衝液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ）の勾配溶出と、その後の、カラム４倍量の１００％緩衝液Ｂにかけた。各画分の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その結果、標的タンパク質が効率よく精製されていることが示された。高純度の画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を１０Ｋ ＭＷＣＯで用いて濃縮した。最終精製タンパク質を、４０％グリセロール中、－２０℃で使用するまで保存した。
ＰａｍＭａｎ３の精製
ＰａｍＭａｎ３を、２つのクロマトグラフィー工程、すなわち、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。濃縮され脱塩された粗タンパク質サンプルを、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。勾配溶出を行い、酵素活性を有する画分をプールして、緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で予め平衡化した３０ｍＬのＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムにのせた。このカラムを、カラムの５倍量の０～５０％緩衝液Ｂ（１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ）の勾配溶出と、その後の、カラム４倍量の１００％緩衝液Ｂにかけた。各画分の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その結果、標的タンパク質が効率よく精製されていることが示された。高純度の画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５装置を１０Ｋ ＭＷＣＯで用いて濃縮した。最終精製タンパク質を、４０％グリセロール中、－２０℃で使用するまで保存した。
【0342】
（実施例１５）
ＰａｍＭａｎ３のマンナナーゼ活性
ＰａｍＭａｎ３のβ１－４マンナナーゼ活性を、実施例４に記載されるように測定した。精製したＰａｍＭａｎ３の比活性を表８にまとめる。
ＰａｍＭａｎ３のマンナナーゼ活性
ＰａｍＭａｎ３のβ１－４マンナナーゼ活性を、実施例４に記載されるように測定した。精製したＰａｍＭａｎ３の比活性を表８にまとめる。
【0343】
【表13】
【0344】
（実施例１６）
ＰａｍＭａｎ３のｐＨ特性
ＰａｍＭａｎ３のｐＨ特性を、実施例５に記載されるように決定した。これらのアッセイ条件下におけるＰａｍＭａｎ３の至適ｐＨ及び≧７０％活性の範囲を、表９に示す。
ＰａｍＭａｎ３のｐＨ特性
ＰａｍＭａｎ３のｐＨ特性を、実施例５に記載されるように決定した。これらのアッセイ条件下におけるＰａｍＭａｎ３の至適ｐＨ及び≧７０％活性の範囲を、表９に示す。
【0345】
【表14】
【0346】
（実施例１７）
ＰａｍＭａｎ３の温度特性
ＰａｍＭａｎ３の温度特性を、実施例６に記載されるように決定した。
ＰａｍＭａｎ３の温度特性
ＰａｍＭａｎ３の温度特性を、実施例６に記載されるように決定した。
【0347】
これらのアッセイ条件下におけるＰａｍＭａｎ３の至適温度及び≧７０％活性の温度範囲を、表１０に示す。
【0348】
【表15】
【0349】
（実施例１８）
ＰａｍＭａｎ３の熱安定性
ＰａｍＭａｎ３の温度安定性を、実施例７に記載されるように決定した。これらのアッセイ条件下で、２時間インキュベートした後に、ＰａｍＭａｎ３が５０％活性（Ｔ５０）を保持する温度を表１１に示す。
ＰａｍＭａｎ３の熱安定性
ＰａｍＭａｎ３の温度安定性を、実施例７に記載されるように決定した。これらのアッセイ条件下で、２時間インキュベートした後に、ＰａｍＭａｎ３が５０％活性（Ｔ５０）を保持する温度を表１１に示す。
【0350】
【表16】
【0351】
（実施例１９）
ＰａｍＭａｎ３の洗浄性能
ＰａｍＭａｎ３の洗浄性能を、人工汚れからのガラクトマンナンの遊離を測定するために開発されたハイスループットマイクロスウォッチアッセイで評価した。ＰＡＨＢＡＨ（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８、１９７２）を用いて、遊離した還元糖を定量した。
ＰａｍＭａｎ３の洗浄性能
ＰａｍＭａｎ３の洗浄性能を、人工汚れからのガラクトマンナンの遊離を測定するために開発されたハイスループットマイクロスウォッチアッセイで評価した。ＰＡＨＢＡＨ（ｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８、１９７２）を用いて、遊離した還元糖を定量した。
【0352】
２枚の直径５．５ｃｍのローカストビーンガムＣＳ－７３（ＣＦＴ（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ））マイクロスウォッチを、底部が平らな非結合９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに置いた。酵素を、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－８０で希釈した。希釈した酵素及びマイクロスウォッチアッセイ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ－８０）を合わせて１００マイクロリットルにして、各ウェルに加えた。プレートに封をし、１１５０ｒｐｍで３０分間撹拌しながら２５℃のｉＥＭＳ機器内でインキュベートした。１０マイクロリットルの反応混合液を、各ウェルにつき１００マイクロリットルのＰＡＨＢＡＨ溶液を含むＰＣＲプレートに移した。プレートに封をし、９５℃のＰＣＲ機器内で５分間インキュベートした。プレートを４℃に冷却した後、８０マイクロリットルの上清を新しい底部が平らなマイクロタイタープレートに移し、分光光度計で４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。図８は、基準（市販のマンナナーゼ、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標））に対するＰａｍＭａｎ３の洗浄反応を示す。
【0353】
（実施例２０）
相同なマンナナーゼの同定
成熟型のＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）のアミノ酸配列（２９７残基）を、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９～４０２，１９９７）にかけた。クエリ配列として配列番号６７を用いて、検索パラメーターをデフォルト値に設定して、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースに対する類似性検索を行った。検索結果のサブセットを表１２Ａ及び１２Ｂに示す。いずれの検索セットに関しても、同一性パーセント（ＰＩＤ）は、ペアワイズアライメントにおいて、同一残基数をアライメントした残基の数で除したものとして定義した。「配列長」と称されたカラムは、一覧の登録番号に関連するタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指し、一方「アライメント長」と称されたカラムは、ＰＩＤ計算に使用されたアライメントしたタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指す。
相同なマンナナーゼの同定
成熟型のＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）のアミノ酸配列（２９７残基）を、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９～４０２，１９９７）にかけた。クエリ配列として配列番号６７を用いて、検索パラメーターをデフォルト値に設定して、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースに対する類似性検索を行った。検索結果のサブセットを表１２Ａ及び１２Ｂに示す。いずれの検索セットに関しても、同一性パーセント（ＰＩＤ）は、ペアワイズアライメントにおいて、同一残基数をアライメントした残基の数で除したものとして定義した。「配列長」と称されたカラムは、一覧の登録番号に関連するタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指し、一方「アライメント長」と称されたカラムは、ＰＩＤ計算に使用されたアライメントしたタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指す。
【0354】
【表17】
【0355】
【表18】
【0356】
（実施例２１）
相同なマンナナーゼ配列の解析
図５に定めるトリミングしたアミノ酸配列、並びに、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１（配列番号６８）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１（配列番号７０）、ＢｌｅＭａｎ１（配列番号７５）、バチルス（Bac.）種＿ＷＯ２０１５０２２４２８－００１５（配列番号７８）、２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号７９）及びＰ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１（配列番号８１）マンナナーゼのトリミングした成熟アミノ酸配列を用いて、複数のマンナナーゼアミノ酸配列アライメントを作製したものを、図９に示す。これらの配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いてアライメントした。ＮＤＬクレードに特異的な残基（図９参照）をカバーする領域において配列アライメントを確認すると、Ｐ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１（配列番号８１）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１９９１２４８１．１（配列番号７４）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号３２）、パエニバチルス（Paenibac.）種ＷＰ＿００９５９３７６９．１（配列番号７３）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号４４）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号４８）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７４２７９８１．１（配列番号７２）、ＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号５６）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７８１３１１１．１（配列番号７１）、ＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｔｕＭａｎ２（配列番号２４）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１（配列番号７０）、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号３６）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、ＰａｍＭａｎ２（配列番号１７）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１（配列番号６８）、及びパエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７６８８７４５．１（配列番号６９）の全てのマンナナーゼが、ＮＤＬクレードに所属していることが示され、そのうち、トリミングしたアミノ酸配列の更なる配列アライメントを、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いて提供したものを、図１１に示す。
相同なマンナナーゼ配列の解析
図５に定めるトリミングしたアミノ酸配列、並びに、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１（配列番号６８）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１（配列番号７０）、ＢｌｅＭａｎ１（配列番号７５）、バチルス（Bac.）種＿ＷＯ２０１５０２２４２８－００１５（配列番号７８）、２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号７９）及びＰ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１（配列番号８１）マンナナーゼのトリミングした成熟アミノ酸配列を用いて、複数のマンナナーゼアミノ酸配列アライメントを作製したものを、図９に示す。これらの配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いてアライメントした。ＮＤＬクレードに特異的な残基（図９参照）をカバーする領域において配列アライメントを確認すると、Ｐ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１（配列番号８１）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１９９１２４８１．１（配列番号７４）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号３２）、パエニバチルス（Paenibac.）種ＷＰ＿００９５９３７６９．１（配列番号７３）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号４４）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号４８）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７４２７９８１．１（配列番号７２）、ＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号５６）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７８１３１１１．１（配列番号７１）、ＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｔｕＭａｎ２（配列番号２４）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１（配列番号７０）、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号３６）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、ＰａｍＭａｎ２（配列番号１７）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１（配列番号６８）、及びパエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７６８８７４５．１（配列番号６９）の全てのマンナナーゼが、ＮＤＬクレードに所属していることが示され、そのうち、トリミングしたアミノ酸配列の更なる配列アライメントを、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３～４６８０，１９９４）をデフォルトのパラメーターで用いて提供したものを、図１１に示す。
【0357】
ＮＤＬクレードは、ＮＤＬクレード１、ＮＤＬクレード２、及びＮＤＬクレード３に更に区別できる。ＮＤＬクレード１は、ＰｔｕＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｓｐＭａｎ４、ＢｃｉＭａｎ４、ＰｐａＭａｎ２、ＰｓｐＭａｎ９、ＰｓｐＭａｎ５、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７８１３１１１．１、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１、及びパエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７６８８７４５．１を含む。ＮＤＬクレード２は、ＢｃｉＭａｎ３、パエニバチルス（Paenibac.）種ＷＰ＿００９５９３７６９．１、ＰｐｏＭａｎ１、ＰｐｏＭａｎ２、及びパエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７４２７９８１．１を含む。ＮＤＬクレード３は、Ｐ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１及びパエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１９９１２４８１．１を含む。
【0358】
ＮＤＬクレードマンナナーゼである、ＢｃｉＭａｎ１（配列番号２８）、ＢｃｉＭａｎ３（配列番号３２）、ＢｃｉＭａｎ４（配列番号３６）、ＰａｍＭａｎ２（配列番号１７）、ＰｐａＭａｎ２（配列番号４０）、ＰｐｏＭａｎ１（配列番号４４）、ＰｐｏＭａｎ２（配列番号４８）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号５２）、ＰｓｐＭａｎ５（配列番号５６）、ＰｓｐＭａｎ９（配列番号６０）、及びＰｔｕＭａｎ２（配列番号２４）、ＰａｍＭａｎ３（配列番号６７）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＥＴＴ３７５４９．１（配列番号６８）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７６８８７４５．１（配列番号６９）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０２４６３３８４８．１（配列番号７０）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７８１３１１１．１（配列番号７１）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１７４２７９８１．１（配列番号７２）、パエニバチルス（Paenibac.）種ＷＰ＿００９５９３７６９．１（配列番号７３）、パエニバチルス（Paenibac.）種＿ＷＰ＿０１９９１２４８１．１（配列番号７４）、ＢｌｅＭａｎ１（配列番号７５）、バチルス・ネアルソニイ（Bac.nealsonii）＿ＡＧＵ７１４６６．１（配列番号７６）、バチルス（Bac.）種＿ＢＡＤ９９５２７．１（配列番号７７）、バチルス（Bac.）種＿ＷＯ２０１５０２２４２８－００１５（配列番号７８）、及び２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号７９）及びＰ＿ムシラギノサス（P_mucilaginosus）＿ＹＰ＿００６１９０５９９．１（配列番号８１）の、トリミングしたアミノ酸配列の系統樹を作製したものを、図１０に示す。トリミングした配列を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅに入力し、続いて、アライメントファイルをＴｈｅ Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｔｒｅｅ Ｂｕｉｌｄｅｒプログラム（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ８．１．２）にインポートして、Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｔｒｅｅ Ｂｕｉｌｄｅｒを近隣結合作製法で用いて図１０に示される系統樹を作製した。これらの配列間の配列同一性パーセントを計算したものを、表１３に示す。
【0359】
【表19】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【配列表】