特許7257067アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-05
(45)【発行日】2023-04-13
(54)【発明の名称】アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/741 20150101AFI20230406BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230406BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230406BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230406BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230406BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20230406BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230406BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230406BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230406BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230406BHJP
A61K 8/00 20060101ALI20230406BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20230406BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230406BHJP
A61K 38/13 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/706 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/573 20060101ALI20230406BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20230406BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230406BHJP
【ＦＩ】
A61K35/741 ZNA
C12N1/00 P
C12N1/20 A
A23L33/135
A61P37/08
A61P17/04
A61P17/00
A61P11/02
A61P11/06
A61P17/06
A61K8/00
A61Q19/00
A61K31/704
A61K45/00
A61K38/13
A61K31/706
A61K31/436
A61K31/573
A61K31/5377
A61P43/00 121
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021552155
(86)(22)【出願日】2021-02-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-24
(86)【国際出願番号】 KR2021002432
(87)【国際公開番号】W WO2022045501
(87)【国際公開日】2022-03-03
【審査請求日】2021-09-02
(31)【優先権主張番号】10-2020-0107617
(32)【優先日】2020-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC13761BP
(73)【特許権者】
【識別番号】521022956
【氏名又は名称】エンテロバイオーム インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＴＥＲＯＢＩＯＭＥ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002066
【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ソ，ジョ グ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ジュ ヒュン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ドキュン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヨンミ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ソ ユル
(72)【発明者】
【氏名】ビョン，ヘ リム
【審査官】井上 能宏
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２２－５０２００５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２２－５０２００６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０４３８６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５００００４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１３７６６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３４２７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０３４１８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含む、アトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、配列番号１で表される１６ｓ ｒＲＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記薬学的組成物は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の生菌剤を含むか、または低温殺菌された菌株を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記薬学的組成物は、ビタミンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記薬学的組成物は、グルココルチコイド（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ピメクロリムス（Ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ミコフェノール酸モフェチル（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ Ｍｏｆｅｔｉｌ）、デキサメタゾンから構成された群から選ばれる免疫抑制剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記アトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、組成物の総重量に対し、有効成分としてアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を１０８～１０１２ＣＦＵの含量で含むか、または同じ数の生菌または低温殺菌体を有する培養物を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記アトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーまたは食物アレルギーであることを特徴とする、請求項１に記載のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＥＢ－ＡＭＤＫ１９）（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含む、アトピー性疾患の予防または改善用健康機能性食品。
【請求項9】
アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＥＢ－ＡＭＤＫ１９）（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含むアトピー性皮膚炎の緩和または改善用化粧料組成物。
【請求項10】
請求項９に記載の前記アトピー性皮膚炎は、皮膚アレルギー、皮膚じんましん、アトピー性皮膚炎、乾癬または湿疹であることを特徴とする、化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関し、より詳細には、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
厳密な意味で「アトピー」という用語は、外部から身体内に入ってくる異物に対して非正常的にＩｇＥを生成する性向を意味する。したがって、「アレルギー」という用語と同一ではないが、実際には、同じ意味で混用している。このような過敏反応が臨床的に症状として発現する場合を「アトピー性疾患」または「アレルギー疾患」と呼び、伝統的に喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）、食物アレルギー（ｆｏｏｄ ａｌｌｅｒｇｙ）などがアトピー性疾患に分類されている。
【0003】
現在までに知られているアトピー性疾患の発症原因は、正確に明らかになっていないが、一般的に遺伝的、免疫学的要因が関与していると推定され、その他に環境的、精神的要因などが悪化要因として作用するというのが専門家の普遍的な見解である。アトピー性疾患は、単一疾患として発生するよりはアトピー性皮膚炎、喘息及びアレルギー性鼻炎などが行進（ａｔｏｐｉｃ ｍａｒｃｈ）をなして発生するか、または同時に現れる多重疾患として知られている。
【0004】
アトピー性疾患のうち、アトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、よく知られているように、新生児や小児に発症し、成人になるまで持続することもある慢性再発性皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎の主な症状は、病変の初期である急性期には、主にかゆみがひどい紅斑性丘疹と水疱が発生し、掻くとみずうみが出る滲出性病変に変わるが、このときに二次感染がよく発生する。病変が進行して亜急性期には、擦傷、丘疹が発生し、慢性期に入ると、皮膚が厚くなる苔癬化（ｌｉｃｈｅｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）現象が起こる。アトピー患者は、頻繁に再発と症状の悪化により、応急室及び入院治療を繰り返すことになり、正常な学校生活、社会生活、または職場生活が困難になって精神的苦痛まで経験し、正常な生活を困難にする可能性がある。
【0005】
アトピー性疾患は、根本的に治療しにくく、症状が悪化する傾向があるため、アトピー性疾患は、治療を目標とせず、適切な治療により症状がコントロールされている。現在、アトピー性皮膚炎は、主にステロイド、抗ヒスタミン剤や抗生剤のような薬物療法によって治療されている。現在、最も広く使用されている治療剤は、ステロイド剤として知られているデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）である。ステロイド系薬物は、抗炎症及び免疫抑制効果に優れているが、長期間使用すると、皮膚弱化、全身ホルモン症状及び中毒性効果のような副作用が発生するという問題点がある。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞からヒスタミンが放出されることを防いでかゆみの症状を減少させるが、一時的な措置として使用され、長期間にわたり不眠症、不安及び食欲不振などの副作用を引き起こすことができる。
【0006】
このように合成医薬品は、長期間使用時に副作用が激しく、アトピー性疾患に対して効果的であり、副作用のない新しいアトピー治療法が求められている。副作用のないアトピー治療法として、微生物新薬が新しい治療法として関心を集めている。そこで、プロバイオティクスの効能と機能も大きな注目を集めているが、微生物が体内にどのように作動するかなどは、相当部分が難題として残っており、効能においても腸内環境を健康に保つのに多少役立つだけで、確実な薬学的効能まで期待し難いのが現状である。したがって、難治性疾患であるアトピー性疾患に対して検証された薬学的効能を持つ次世代ファーマバイオティクス（ｐｈａｒｍａｂｉｏｔｉｃｓ）治療剤の開発が切実に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
（特許文献１）韓国特許公開第２０１６-００６９７３３号
（特許文献２）韓国特許公開第２０１３-００３４７６４ 号
（特許文献３）韓国特許第１９２５１３５号
（特許文献２）韓国特許公開第２０１３-００３４７６４ 号
（特許文献３）韓国特許第１９２５１３５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上述した技術的課題を解決するためのもので、本発明の一つの目的は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【0009】
本発明が解決しようする具体的技術的課題は、免疫過剰反応媒体であるＩｇＥの過剰分泌を抑制し、Ｔｈ１タイプサイトカインとＴｈ２タイプサイトカインの均衡的免疫調節に 卓越したアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【0010】
本発明のさらに別の目的は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または改善用健康機能性食品を提供することである。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含むアトピー性疾患の緩和または改善用化粧料組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上述した目的を達成するための本発明の一つの態様は、寄託番号ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰのアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株、前記菌株の培養物または乾燥物を含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【0013】
上述した目的を達成するための本発明の別の態様は、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）、前記菌株の培養物または乾燥物を含むアトピー性疾患の予防または改善用食品に関する。
【0014】
上述した目的を達成するための本発明のさらに別の態様は、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）、前記菌株の培養物または乾燥物を含むアトピー性疾患の緩和または改善用化粧料組成物に関する。
【発明の効果】
【0015】
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、アトピー性疾患の治療効果に優れており、ステロイド系薬物と同等の水準でアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療効果を示す。
【0016】
また、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞のバランス的な免疫調節に優れており、特にアトピー性疾患の重症度に応じて互いに異なる免疫調節機序を通じてＴｈ１タイプサイトカインとＴｈ２タイプサイトカインの均衡的免疫調節を行うことが特徴である。
【0017】
また、本発明の薬学的組成物は、アトピー性疾患の発症の主な因子である血清免疫グロブリンＩｇＥの量を直接的に減少させ、真皮細胞内に肥満細胞、好酸球及び好中球の浸潤を減少させるので、アトピー性疾患の予防及び治療に使用される薬学的組成物、健康機能性食品、化粧料組成物などに応用しうる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）と標準株（ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）であるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株の顕微鏡観察結果である。
【図2】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株のＰＣＲ分析結果である。
【図3】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株のゲノムＤＮＡのＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）分析結果である。
【図4】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株と異なるアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の系統発生的関係を比較図示したものである。
【図5】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株の溶血活性実験結果である。
【図6】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株が大腸上皮細胞の生存率に及ぼす影響を確認した結果である。
【図7】本発明の実施例において各実験群のマウスの皮膚組織の病理学的特徴を肉眼で観察した結果を示す写真である。
【図8】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株による皮膚炎指数（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）の変化を示したグラフである。
【図9】本発明の実施例において各実験群のマウスの耳浮腫の程度を比較して示した写真である。
【図10】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群、陽性対照群（ＤＥＸ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群の耳の厚さ（ｅａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の変化を分析した結果である。
【図11】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群、陽性対照群（ＤＥＸ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群の実験動物の掻く頻度（ｓｃｒａｔｃｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を示すグラフである。
【図12】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群、陽性対照群（ＤＥＸ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群の脾臓の写真である。
【図13】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群、陽性対照群（ＤＥＸ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群の脾臓の重さを比較して示したグラフである。
【図14】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株群、陽性対照群（ＤＥＸ）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群のアレルギー疾患を媒介する最も重要な免疫指標であるＩｇＥの変化を示すグラフである。
【図15】本発明の実施例の各実験群のマウスの皮膚組織を採取し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した結果である。
【図16】アトピー誘導された後、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株がアトピーによる体重変化に及ぼす影響を確認した結果である。
【図17】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与がＩＬ－４、ＩＬ－６に及ぼす影響を確認した結果である。
【図18】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与が血中のＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１２に及ぼす影響を確認した結果である。
【図19】～
【図20】本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与が血中のＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカイン生成能に及ぼす影響を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、添付図面を参照して、本発明についてより詳細に説明する。
【0020】
特に定義しない限り、本願で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属す
当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0021】
本願で使用される「約」という用語は、引用された特定の数値に関連して使用されるとき、その数値が引用された数値から１％以下に変わることがあることを意味する。例えば、本願で使用されるように、「約１００」という表現は、９９及び１０１とその間のすべての数値（例：９９.１、９９.２、９９.３、９９.４など）を含む。
【0022】
本願明細書においてどの部分がどのような構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。
【0023】
本明細書で使用される場合、「アトピー性疾患（ａｔｏｐｉｃ ａｌｌｅｒｇｙ）」という用語は、アレルギー反応を起こす疾患で、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（腱鞘熱）、蕁麻疹、アナフィラキシー、血管浮腫、食物アレルギーなどを含む意味である。
【0024】
本明細書で使用される用語の「予防」とは、本発明による薬学的組成物の投与によりアトピー性疾患を抑制されるか、または発病を遅らせるすべての行為を意味する。
【0025】
本明細書で使用される用語の「治療する」、「治療」という用語は、一時的または永久的に症状を緩和するか、または症状の原因を取り除くか、または前記疾病や病態の症状の発現を防止するか、または遅らせることを意味する。
【0026】
本明細書で使用される用語の「改善」は、非正常な状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を減少させる全ての行為を意味する。
【0027】
本明細書で使用される用語の「薬学的に許容可能な」とは、過度の毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題点または合併症なしに利得／リスク比が合理的であるため、対象体（例：ヒト）の組織と接触して使用するのに適しており、健全な医学的判断の範疇以内である組成物を意味する。
【0028】
ファーマバイオティクス（ｐｈａｒｍａｂｉｏｔｉｃｓ）は、健康や疾病に対して検証された薬学的役割（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅ）を有するヒト由来の細菌またはその産物と定義される（「Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｂｉｏｔｉｃｓ」、Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ ２０１０ Ｍａｒ－Ａｐｒ;１（２）：７９－８４．）．本発明の一つの態様は、寄託番号ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰのアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＥＢ－ＡＭＤＫ１９）（ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ）を有効成分として含むアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【0029】
本発明の寄託番号ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰのアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）ＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、配列番号１の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持つ。
【0030】
本発明で使用されるアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、健康な韓国人の糞便から単離され、０.５～１μｍサイズの楕円細胞である単核球菌または双球菌であり、嫌気性細菌であり、運動性がなく、グラム－陰性であり、内生胞子を形成しない、粘液－分解性細菌（ｍｕｃｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）である。アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、いくつかの粘液分解酵素を生成して粘液を炭素及び窒素供給源として使用することができ、グルコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン及びラクトースを含む、様々な炭素源を代謝することができ、プロピオン酸と酢酸のような短鎖脂肪酸を主な代謝物質として生成する。
【0031】
ＩｇＥは、喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、アナフィラキシー、食物アレルギーのようなアレルギー反応を媒介する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。ＩｇＥは、Ｂ－細胞またはＢ－リンパ球によって分泌され、その表面上で発現される。ＩｇＥは、ＦｃεＲＩＩと公知された低親和度ＩｇＥ受容体に対するそのＦｃ領域を通じてＢ－細胞に結合し、単核球、好酸球及び血小板にも結合する。哺乳動物がアレルゲンにさらされると、このような抗原に対して特異的な表面に結合されたＩｇＥ抗体を保有するＢ－細胞が活性化され、ＩｇＥ－分泌形質細胞に発達される。アレルギー状態において、Ｂ－細胞によるＩｇＥの生産は、ヒスタミン及びその他の伝染症分子（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の分泌を誘導し、疾患の重症度を加重させる。
【0032】
血清で上昇した免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）水準の存在は、喘息のようなアレルギー疾患で観察される炎症性カスケードの必須的な部分と見なされる。アレルギー誘発性ＩｇＥの誘導は、人間喘息だけでなく、アレルギー性肺炎症の動物モデルで感知されることがあり、これはアレルギーの発生を誘導する関連細胞（Ｔ及びＢ細胞軸）及び体液メカニズムの開始を示す。したがって、治療的介入によるアレルギー抗原特異的ＩｇＥ反応の調節は、根本的にアレルギーの発生を裏付けるメカニズムの調節を指す。
【0033】
本発明のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、Ｔｈ２が優勢な状況でＴｈ１／Ｔｈ２バランスを合わせる作用をする。したがって、Ｔｈ２反応の過剰によるＴｈ１／Ｔｈ２不均衡と誘発されるアトピー性皮膚炎、喘息、及び鼻炎などの予防または治療に効果的である。一般的にアトピー性皮膚炎において、サイトカイン濃度の変化は、分化しないＴ－ヘルパー細胞－１（Ｔｈ１）がＴ－ヘルパー細胞－２（Ｔｈ２）に分化が非常に促進されるＴｈ２の活性化に基づく免疫体系によって誘発されることが知られている。このようなＴｈ２細胞の活性化過程において、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－９及びＩＬ－１０を生成する。
【0034】
本発明のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の生菌剤を含むか、または低温殺菌された菌株を含んでもよい。本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は培養され、遠心分離のような分離過程で回収され、乾燥、例えば、凍結乾燥によりプロバイオティクスの形態で製造して用いられてもよい。アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の低温殺菌は、５０℃以上１００℃未満の温度で１０分以上加熱することを意味する。例えば、７０℃で３０分間低温殺菌しうる。
【0035】
本発明の薬学的組成物は、組成物の総重量に対し、有効成分としてアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を１０８～１０１２ＣＦＵの含量で含むか、または同じ数の生菌を有する培養物を含んでもよい。
【0036】
本発明の一具現例において、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を含む薬学的組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で製剤化して使用されてもよいが、必ずこれらに制限されるものではない。
【0037】
本発明の薬学的組成物は、腸内または経口投与用製品として剤形化されてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、公知の方法を用いて胃腸を通過した後、小腸に到達して活性成分である微生物が迅速に腸内に放出されるように、腸溶被覆されて製品化されてもよい。
【0038】
本発明の一具現例において、経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【0039】
他の実施例において、本発明のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、少なくとも一つのビタミンをさらに含んでもよい。このようなビタミンは、脂溶性または水溶性ビタミンであってもよい。適切なビタミンは、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸及びビオチンを含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。前記任意の適切な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、同一または類似の活性のビタミンを持つ化合物及びビタミンの代謝産物である。
【0040】
本発明のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、アレルギー疾患ないしアトピー性皮膚炎を予防及び治療する効果を持つ公知の追加治療剤をさらに含んでもよい。本発明で使用可能な追加の治療剤は、免疫抑制剤、鎮痛剤、ステロイド、非－ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）またはサイトカイン拮抗剤及びこれらの組合せである。前記免疫抑制剤としては、グルココルチコイド（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ピメクロリムス（Ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ＩＳＡ（ＴＸ）２４７を含むカルシニュリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）阻害剤、ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、タイプＩＶ ＰＤＥ阻害剤（タイプＩＶ ＰＤＥ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、ミコフェノール酸モフェチル（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ Ｍｏｆｅｔｉｌ）、デキサメタゾンなどが挙げられるが、必ずしもこれらに制限されず、公知のすべての免疫抑制剤をともに用いてもよい。また、１種の免疫抑制剤を単独で用いるか、または２種以上の免疫抑制剤を組み合わせて用いてもよく、好ましくは、前記免疫抑制剤としてシクロスポリン、タクロリムス、デキサメタゾン、ピメクロリムスから構成された群から選ばれた１種以上を用いてもよい。本発明による薬学的組成物を他の治療剤と併用する場合には、順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。
【0041】
本発明の薬学的組成物は、前記有効成分以外に製薬学的に許容可能な担体及び／または賦形剤をさらに含んでもよく、この他にもバインダー、分解剤、コーティング剤、潤滑剤などのような製薬学的に通常使用される様々な添加剤とともに剤形化されて調製されてもよい。
【0042】
本発明で使用可能な賦形剤としては、スクロース、ラクトース、マンニトール、グルコースなどの砂糖及びトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、米澱粉、部分的に全ゼランチン化された澱粉などの澱粉を含む。バインダーは、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギナン、グァーガム、アカシア、アガなどのポリサッカライド、トラガカント、ゼラチン、グルテンなどの天然－発生巨大分子物質、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体及びポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及び酢酸ビニル樹脂などの高分子を含む。
【0043】
本発明で使用可能な分解剤としては、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体及びナトリウムカルボキシ澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、トウモロコシデンプン、ジャガイモ澱粉、米澱粉及び部分的に全ゼラチン化された澱粉などの澱粉を使用してもよい。
【0044】
本発明で使用可能な潤滑剤の例としては、タルク、ステアリン酸、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、コロイド性シリカ、ヒドロスシリコンダイオキサイド、様々な種類のワックス及び水素添加油脂などを含む。
【0045】
コーティング剤としては、ジメチルアミノエチルメタクリレート－メタクリル酸共重合体、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、エチルアクリレート－メタクリル酸共重合体、エチルアクリレート－メチルメタクリレート－クロロトリメチルアンモニウムエチルメタクリレート共重合体、エチルセルロースなどの水不溶性ポリマー、メタクリル酸－エチルアクリレート共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートなどの張性ポリマー及びメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【0046】
本発明のアトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物において有効成分である前記菌株の投与量は、様々な疾病類型、患者の年齢、体重、性別、患者の医学的状態、状態の重症度、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野においてよく知られている要素によって決められてもよい。したがって、容量療法は、広範囲に変わることができるが、前記要素をすべて考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって標準方法を用いて容易に決定されてもよい。
【0047】
一般的に、成人患者の場合、１Х１０８以上の生菌または低温殺菌された細菌、好ましくは、１Х１０８～１Х１０１２の生菌または低温殺菌された細菌が、必要に応じて一回または数回に分けて投与されてもよい。本発明の一具現例において、前記アトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を含む場合、その含量を特に制限するものではなく、例えば、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を１×１０８細胞／ｍｌ～１×１０１０細胞／ｍｌの濃度で含んでもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。例えば、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の濃度は、１×１０８細胞／ｍｌ～１×１０１０細胞／ｍｌ、２×１０８細胞／ｍｌ～１×１０１０細胞／ｍｌ、３×１０８細胞／ｍｌ～１×１０１０細胞／ｍｌ、５×１０８細胞／ｍｌ～１×１０１０細胞／ｍｌ、１×１０８細胞／ｍｌ～５×１０９細胞／ｍｌ、２×１０８細胞／ｍｌ～５×１０９細胞／ｍｌ、３×１０８細胞／ｍｌ～５×１０９細胞／ｍｌ、５×１０８細胞／ｍｌ～５×１０９細胞／ｍｌであってもよいが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【0048】
本発明のさらに他の態様は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株、これらの培養物または乾燥物を含む食品または健康機能性食品に関する。
【0049】
本発明の菌株含有食品は、牛乳や乳製品のような様々な食品や栄養製品として、または食品補助剤若しくは健康機能性食品として摂取されてもよい。本発明の一具現例によって前記製品は、乳製品、飲料、ジュース、スープまたは子供用食品などの食品が挙げられるが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【0050】
本発明のさらに他の態様は、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株、これらの培養物または乾燥物を含むアトピー性皮膚炎を緩和するか、または改善する化粧料組成物に関する。
【0051】
本発明の化粧料組成物は、前記有効成分以外に化粧料組成物に通常用いられる成分を含んでもよく、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、及び担体を含んでもよい。
【0052】
前記化粧料組成物は、皮膚アレルギー、皮膚じんましん、アトピー性皮膚炎、乾癬、真菌による感染及び湿疹から構成される群から選ばれる１つ以上の皮膚の状態を改善する機能性を有することを特徴とするが、その機能は、必ずしもこれらの状態に限定されるものではない。
【0053】
本発明の化粧料組成物は、当業界で通常製造されるいかなる剤型でも製造されてもよく、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤－含有クレンジング、オイル、パウダーファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パック、マスクパック、マッサージクリーム及びスプレーなどとして剤形化されてもよいが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形として製造されてもよい。
【0054】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。
【0055】
実施例
実施例１：アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の分離及び同定
１．１．菌株の分離及び同定
健康な韓国人（女性、３５歳、ＢＭＩ ２３.３）の糞便からアッカーマンシア・ムシニフィラを分離するため、Ｄｅｒｒｉｅｎの方法によってムチン培地（０.４ｇ ＫＨ２ＰＯ４;０.５３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４；０.３ｇ ＮａＣｌ；０.１ｇ ＭｇＣｌ２６（Ｈ２Ｏ）;０.１１ｇ ＣａＣｌ２０.４ｇ／Ｌ、１ｍｌ酸微量元素溶液、１ｍｌアルカリ性微量元素溶液、１ｍｌビタミン溶液、２.５ｇ／Ｌブタ胃粘液（タイプＩＩＩ））、及び０.２５ｇ／Ｌ硫化ナトリウム九水和物）を用いて菌株を選別培養後に分離した（Ｄｅｒｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
実施例１：アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の分離及び同定
１．１．菌株の分離及び同定
健康な韓国人（女性、３５歳、ＢＭＩ ２３.３）の糞便からアッカーマンシア・ムシニフィラを分離するため、Ｄｅｒｒｉｅｎの方法によってムチン培地（０.４ｇ ＫＨ２ＰＯ４;０.５３ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４；０.３ｇ ＮａＣｌ；０.１ｇ ＭｇＣｌ２６（Ｈ２Ｏ）;０.１１ｇ ＣａＣｌ２０.４ｇ／Ｌ、１ｍｌ酸微量元素溶液、１ｍｌアルカリ性微量元素溶液、１ｍｌビタミン溶液、２.５ｇ／Ｌブタ胃粘液（タイプＩＩＩ））、及び０.２５ｇ／Ｌ硫化ナトリウム九水和物）を用いて菌株を選別培養後に分離した（Ｄｅｒｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。
【0056】
分離された菌株がアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株が正しいかどうか確認するため、分離された菌株を顕微鏡で観察し、その結果を図１に示し、下記表１のＡＭ－特異性プライマーを用いたＰＣＲ分析を行って、その結果を図２に示した。
【0057】
図１においてＡは、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株であり、Ｂは、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を１０００倍の倍率で拡大した顕微鏡写真である。図２において、レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーであり、レーン１は、陽性対照群（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５）であり、レーン２は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株であり、レーン３は、陰性対照群（蒸留水）の結果である。その結果、図２に示すように、本発明の菌株は、陽性対照群菌株であるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株と類似したバンドで結果値が出たことが確認できた。
【0058】
【表1】
【0059】
１.２．分離されたアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株の糖利用性確認
前記で分離された本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の糖利用性を把握するためにＡＰＩ５０ＣＨキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を応用して培養した後、各糖を用いた生長の有無を標準株 (type strain)（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５）と比較し、その結果を下記表２に示した。
前記で分離された本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の糖利用性を把握するためにＡＰＩ５０ＣＨキット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を応用して培養した後、各糖を用いた生長の有無を標準株 (type strain)（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５）と比較し、その結果を下記表２に示した。
【0060】
【表2】
【0061】
前記表２から分かるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、標準株であるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株と比較すると、リボース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－フルクトース及びＤ－マンノースの利用能力において差異があることを確認した。
【0062】
１.３．全ゲノムシーケンシング（Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株間の変化を遺伝体水準で分析するため、ＰａｃＢｉｏ技法を用いて遺伝体の全塩基配列を分析し、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と比較した（表３及び表４）。
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株間の変化を遺伝体水準で分析するため、ＰａｃＢｉｏ技法を用いて遺伝体の全塩基配列を分析し、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と比較した（表３及び表４）。
【0063】
【表3】
【0064】
【表4】
【0065】
前記表３及び表４から分かるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株の全遺伝体統計の数値を比較してみると、差異があった。
【0066】
１.４．Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株が既に報告された同種のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と同一であるかどうかを検証するため、分子タイピングの一種であるＲＡＰＤを行った。このために菌体から抽出したゲノムＤＮＡを対象とする表５の汎用プライマーを用いてＤＮＡを増幅した後、１％アガロースゲルで１時間３０分の間電気泳動し、ＵＶ穿孔機上でＤＮＡ分節パターンを比較し、その結果を図３に示した。
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株が既に報告された同種のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と同一であるかどうかを検証するため、分子タイピングの一種であるＲＡＰＤを行った。このために菌体から抽出したゲノムＤＮＡを対象とする表５の汎用プライマーを用いてＤＮＡを増幅した後、１％アガロースゲルで１時間３０分の間電気泳動し、ＵＶ穿孔機上でＤＮＡ分節パターンを比較し、その結果を図３に示した。
【0067】
【表5】
【0068】
図３から確認されるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と比較すると、異なるＲＡＰＤバンドパターンを示した。したがって、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５の標準株と種は同じであるが、異なる菌株であることを確認した。
【0069】
１.５．全長１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を用いた系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）分析
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析のため、下記表６の２７Ｆ及び１５４１Ｒプライマーを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した後、３７３０ｘｌ ＤＮＡ分析を用いて塩基配列を決定した。このように得られたＥＢ－ＡＭＤＫ１９及び既に公表された同種の他の菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を用いて系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）を作成し、図４に示した。
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析のため、下記表６の２７Ｆ及び１５４１Ｒプライマーを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した後、３７３０ｘｌ ＤＮＡ分析を用いて塩基配列を決定した。このように得られたＥＢ－ＡＭＤＫ１９及び既に公表された同種の他の菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を用いて系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）を作成し、図４に示した。
【0070】
【表6】
【0071】
図４に示すように、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を通じて進化学的類縁関係を系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）を介して分析した結果、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、遺伝学的にアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）種に属する菌株であることを確認した。ヒトの糞便から単離したアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株をアッカーマンシア・ムシニフィラＴ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５）を対照群とした生化学的方法（ＡＰＩ）及び分子生物学的方法（１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析、ＲＡＰＤ、及び全長スクリーニング）を介して同定し、後述する抗生剤耐性検査によってプロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）の機能を持つ安全な菌株であることを確認した。これらの結果に基づいて単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を「アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９」菌株と命名し、韓国生命工学研究院、微生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰが付与された。
【0072】
実施例２：アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の安全性テスト
２.１．抗生剤耐性
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の抗菌剤感受性を把握するため、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインのｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ方法によって嫌気性細菌用抗菌剤ピペラシリン－タゾバクタム（ＰＴＺ）、セフチゾキシム（ＣＴＺ）、クロラムフェニコール（ＣＨＬ）、クリンダマイシン（ＣＬＩ）、メロペネム（ＭＥＭ）、モキシフロキサシン（ＭＸＦ）、メトロニダゾール（ＭＴＺ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ））に対する最小阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）を決定し（ＣＬＳＩ、２０１７）、その結果を下記表７に示した。
２.１．抗生剤耐性
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の抗菌剤感受性を把握するため、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインのｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ方法によって嫌気性細菌用抗菌剤ピペラシリン－タゾバクタム（ＰＴＺ）、セフチゾキシム（ＣＴＺ）、クロラムフェニコール（ＣＨＬ）、クリンダマイシン（ＣＬＩ）、メロペネム（ＭＥＭ）、モキシフロキサシン（ＭＸＦ）、メトロニダゾール（ＭＴＺ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ））に対する最小阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）を決定し（ＣＬＳＩ、２０１７）、その結果を下記表７に示した。
【0073】
【表7】
【0074】
表７から分かるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、クリンダマイシンに中等度の耐性を示し、フルオロキノロン系の抗生剤であるモキシフロキサシンとシプロフロキサシンは、耐性を示し、これを除いたすべての抗菌剤に感受性を示した。アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株と比較すると、抗菌剤耐性パターンに多少差があった。本発明によるアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、ほとんどの抗生剤に対する耐性のない安全な菌株であることを確認できる。
【0075】
２.２．溶血活性（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及び細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）確認
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の安全性検証のために溶血活性及び細胞毒性の有無を評価した。溶血活性の有無を確認するため、トリプティックソイアガー（１７.０ｇ／Ｌカゼインの膵消化物、３.０ｇ／Ｌ大豆の膵消化物、２.５ｇ／Ｌデキストロース、５.０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２.５ｇ／Ｌリン酸カリウム、１５ｇ／Ｌアガー）に５％ｗ／ｖ ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄを添加して製造した血液寒天培地を用いて菌株を培養し、その結果は、図５に示した。図５から分かるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、コロニー周辺の完全に透明な部分が現れなかったため、病原性に関連したβ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｓを起こさないことを確認した。
前記のように単離されたアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の安全性検証のために溶血活性及び細胞毒性の有無を評価した。溶血活性の有無を確認するため、トリプティックソイアガー（１７.０ｇ／Ｌカゼインの膵消化物、３.０ｇ／Ｌ大豆の膵消化物、２.５ｇ／Ｌデキストロース、５.０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２.５ｇ／Ｌリン酸カリウム、１５ｇ／Ｌアガー）に５％ｗ／ｖ ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄを添加して製造した血液寒天培地を用いて菌株を培養し、その結果は、図５に示した。図５から分かるように、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、コロニー周辺の完全に透明な部分が現れなかったため、病原性に関連したβ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｓを起こさないことを確認した。
【0076】
また、細胞毒性の有無を確認するため、ヒト由来の大腸上皮細胞であるＨＴ２９とＣａｃｏ－２細胞を用いて、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株処理による生存率を３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）ａｓｓａｙ方法によって分析し、その結果は、図２０に示した。図６から分かるように、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株は、大腸上皮細胞の生存率に影響を及ぼさないことから、細胞毒性はないことが確認された。
【0077】
実施例３アッカーマンシア・ムシニフィラ菌株のアトピー性疾患の治療効能確認
３.１．菌株試料
本実験に使用したアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９生菌は、１ｘ１０８ＣＦＵ／１５０μｌ ＰＢＳ（２５％グリセロール、０.０５％システイン／ＰＢＳ）の濃度で製造した。
３.１．菌株試料
本実験に使用したアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株とアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９生菌は、１ｘ１０８ＣＦＵ／１５０μｌ ＰＢＳ（２５％グリセロール、０.０５％システイン／ＰＢＳ）の濃度で製造した。
【0078】
３.２．動物モデル及びサンプリング
アトピー性皮膚炎病変を観察するため、６週齢の体重２１－２５ｇ程度の雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を大韓バイオリンク（忠清道、韓国）から供給された。動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のＡｎｉｍａｌ ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを遵守して行った。一週間の適応期間後、９週間飼育が行われ、飼育環境は、一定の温度（２２℃）と相対湿度（４０～６０％）を維持し、１２時間の周期で明暗を調節しながら飼育した。
アトピー性皮膚炎病変を観察するため、６週齢の体重２１－２５ｇ程度の雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を大韓バイオリンク（忠清道、韓国）から供給された。動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のＡｎｉｍａｌ ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを遵守して行った。一週間の適応期間後、９週間飼育が行われ、飼育環境は、一定の温度（２２℃）と相対湿度（４０～６０％）を維持し、１２時間の周期で明暗を調節しながら飼育した。
【0079】
３.３．アトピー性皮膚炎の誘発
６週齢のＮＣ／Ｎｇａマウスの背中部位をきれいに除毛した後、皮膚の微細傷が治癒するように２４時間放置した。１％２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｋｏｒｅａ）をマウスの背中部位に１週間に２回ずつ、３週間塗布して免疫反応を誘発した後、０.５％ＤＮＣＢ溶液を1週間に２回塗布して接触性皮膚炎を維持した。本実施例に使用されたＤＮＣＢは、アセトンとオリーブオイルが３：１で混合された溶液に０.５％と１％で希釈して使用した。
６週齢のＮＣ／Ｎｇａマウスの背中部位をきれいに除毛した後、皮膚の微細傷が治癒するように２４時間放置した。１％２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｋｏｒｅａ）をマウスの背中部位に１週間に２回ずつ、３週間塗布して免疫反応を誘発した後、０.５％ＤＮＣＢ溶液を1週間に２回塗布して接触性皮膚炎を維持した。本実施例に使用されたＤＮＣＢは、アセトンとオリーブオイルが３：１で混合された溶液に０.５％と１％で希釈して使用した。
【0080】
それぞれの該当する薬物を用いてアトピー性皮膚炎誘導後、６週間毎日経口投与を行った。陽性対照群としてデキサメタゾンを６０μｇ／ｍｌの蒸留水で希釈して毎日２００μｇずつ経口投与した（表８参照）。
【0081】
【表8】
【0082】
３.４．アトピー性皮膚炎の評価
ＤＮＣＢによってアトピー性皮膚炎を誘発させた後、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株及びＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株含有調剤を投与して６週間治療を行い、臨床症状を確認するため、皮膚の状態と、これを点数化させた皮膚炎指数（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を確認した。アトピー性皮膚炎において一般的に使用される臨床的肉眼評価法であるＳＣＯＲＡＤ（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）インデックスを修正し、臨床的肉眼評価法により官能評価を行った。皮膚の乾燥状態（ｄｒｙｎｅｓｓ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、紅斑と出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、びらんと傷（ｅｒｏｓｉｏｎ／ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ）を症状なし（０点）、症状の弱さ（１点）、普通（２点）、症状の激しさ（３点）で点数化して毎週測定し、評価結果は、図７及び図８に示す。
ＤＮＣＢによってアトピー性皮膚炎を誘発させた後、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株及びＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株含有調剤を投与して６週間治療を行い、臨床症状を確認するため、皮膚の状態と、これを点数化させた皮膚炎指数（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）を確認した。アトピー性皮膚炎において一般的に使用される臨床的肉眼評価法であるＳＣＯＲＡＤ（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）インデックスを修正し、臨床的肉眼評価法により官能評価を行った。皮膚の乾燥状態（ｄｒｙｎｅｓｓ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、紅斑と出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、びらんと傷（ｅｒｏｓｉｏｎ／ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ）を症状なし（０点）、症状の弱さ（１点）、普通（２点）、症状の激しさ（３点）で点数化して毎週測定し、評価結果は、図７及び図８に示す。
【0083】
６週間の治療期間の間、一週間おきに各グループの皮膚の状態を肉眼で観察して皮膚炎指数（Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅ）で測定した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）は、６週間経過する間、アトピー性皮膚炎の症状が維持される反面、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株とデキサメタゾン（ＤＥＸ）を投与した実験群では、アトピー性皮膚炎の症状が著しく減少することを確認できた。特に、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５菌株投与群と本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、デキサメタゾンを投与した陽性対照群よりもアトピー改善効果がより優れていることが分かった。特に、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群に比べて、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群の方がより優れたアトピー皮膚状態改善効果を示すことを確認した。６週目の皮膚炎指数基準による数値評価において、アトピー誘導群に比べて陽性対照群（ＤＥＸ）（Ｐ＝０.００３）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群（Ｐ＝０.００９）及びＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群（Ｐ＜０.００１）において、それぞれ６週間３８.４、４５.６、６１.７％以上の減少現象が確認された。
【0084】
３.５．アトピー性皮膚炎による耳浮腫に及ぼす影響
重症度のアトピー性皮膚炎を誘発した後、実験終了されたマウスをＣＯ２で麻酔して犠牲になった後、両耳は、厚さ測定器（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｇａｕｇｅ、Ｄｉｇｉｍａｔｉｃ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｇａｕｇｅ、５４７－３０１、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて速度変化法でマウスの耳の浮腫の程度を測定し、その結果を図９及び図１０に示した。
重症度のアトピー性皮膚炎を誘発した後、実験終了されたマウスをＣＯ２で麻酔して犠牲になった後、両耳は、厚さ測定器（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｇａｕｇｅ、Ｄｉｇｉｍａｔｉｃ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｇａｕｇｅ、５４７－３０１、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて速度変化法でマウスの耳の浮腫の程度を測定し、その結果を図９及び図１０に示した。
【0085】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの耳浮腫は、６週目において正常群が０.５５ｍｍ、アトピー誘導群が１.５０ｍｍとなり、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群は、１.０９ｍｍ（Ｐ＜０.００１）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、０.８７ｍｍ（Ｐ＜０.００１）、陽性対照群（ＤＥＸ）は、１.００ｍｍ（Ｐ＜０.００１）となった。本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群において陽性対照群よりも有意に耳浮腫の減少効果が現れることを確認した。また、アッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群よりも有意に耳浮腫が減少すること（Ｐ＝０.０４）を確認した。このように本発明の薬学的組成物は、アトピー誘導されたマウスの耳浮腫動物モデルにおいて顕著な浮腫抑制効果があることを確認した。
【0086】
３.６．掻く回数（Ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｓｃｏｒｅ）測定
実験終了の前日にそれぞれかゆみによる患部を掻く回数を測定した。掻く回数（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の測定は、マウスに１０分間適応期間を与えてから、１０分間掻く回数をカウンター機を用いて測定した。
実験終了の前日にそれぞれかゆみによる患部を掻く回数を測定した。掻く回数（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の測定は、マウスに１０分間適応期間を与えてから、１０分間掻く回数をカウンター機を用いて測定した。
【0087】
図１１を参照すると、アトピー誘導群は、正常群と比較時、身体を掻く回数（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）が有意に増加した（Ｐ＜０.００１）。アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群と本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群の両方で掻く回数は、アトピー性皮膚炎誘導モデルよりそれぞれ６６.７％減少（Ｐ＝０.０１）、７２.９％減少（Ｐ＝０.００５）されることを確認した。陽性対照群は、アトピー誘導群より５９.４％（Ｐ＝０.０３）程度掻く回数が減少されることを示した。したがって、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、デキサメタゾンを投与した陽性対照群や、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群に比べて、より優れた抗掻痒効果を示すことを確認した。
【0088】
３.７．脾臓の重量及びサイズ測定
脾臓は、１次と２次リンパ器官の特性をすべて示し、赤血球を濾過する赤髄（ｒｅｄ ｐｕｌｐ）と体液性免疫と細胞性免疫活性を示す白髄（ｗｈｉｔｅ ｐｕｌｐ）から構成されており、免疫反応においてさらに他の重要な器官である（Ｍｅｂｉｕｓ、Ｒ Ｅ ａｎｄ Ｋｒａａｌ，Ｇ ２００５ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，ｐｐ６０６－６１６）。また、脾臓は、Ｂ細胞発生の最終段階が行われるところであり、同時に、血液に由来する抗原に反応する特化した器官として機能を有する（Ｂｏｅｈｅｍ，Ｔ ａｎｄ Ｂｌｅｕｌ、ＣＣ ２００７ Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ ８，１３１－１３５）。アトピー性皮膚炎の反応は、免疫器官内の様々な反応を誘導し、このような反応は、一次的に免疫器官である脾臓の重量に影響を及ぼすことができる。
脾臓は、１次と２次リンパ器官の特性をすべて示し、赤血球を濾過する赤髄（ｒｅｄ ｐｕｌｐ）と体液性免疫と細胞性免疫活性を示す白髄（ｗｈｉｔｅ ｐｕｌｐ）から構成されており、免疫反応においてさらに他の重要な器官である（Ｍｅｂｉｕｓ、Ｒ Ｅ ａｎｄ Ｋｒａａｌ，Ｇ ２００５ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，ｐｐ６０６－６１６）。また、脾臓は、Ｂ細胞発生の最終段階が行われるところであり、同時に、血液に由来する抗原に反応する特化した器官として機能を有する（Ｂｏｅｈｅｍ，Ｔ ａｎｄ Ｂｌｅｕｌ、ＣＣ ２００７ Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ ８，１３１－１３５）。アトピー性皮膚炎の反応は、免疫器官内の様々な反応を誘導し、このような反応は、一次的に免疫器官である脾臓の重量に影響を及ぼすことができる。
【0089】
したがって、アトピー性皮膚炎予防用組成物がＤＮＣＢによって誘導されたアトピー性皮膚炎が発生したＮＣ／Ｎｇａマウスの免疫臓器に及ぼす影響を観察するために脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）の重量を測定した。より具体的には、実験が終わった後、実験動物をＣＯ２で麻酔した後、頚椎脱臼法で犠牲にして開腹して脾臓組織を採取した。前記採取された脾臓組織を生理食塩水で洗浄した後、水気を除去した後、肉眼で観察し、微細はかりを用いて重量を測定し、その結果を図１２及び図１３に示した。
【0090】
アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）の脾臓の重量は、正常群に比べて約２倍増加し（Ｐ＜０.００１）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群、陽性対照群（ＤＥＸ）では、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に比べてそれぞれ６.９％、２４.３％（Ｐ＝０.０３）、２３.３％の抑制率を示した。特に、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株を投与した群は、デキサメタゾンを投与した陽性対照群よりも良い効果を示し、また、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株よりもさらに大きい脾臓の重量の減少率を示した。したがって、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９が最も免疫を抑制する効果において優れていることを確認した。
【0091】
３.８．血清内のＩｇＥ濃度測定
実験終了時にＣＯ２で麻酔した後、心臓穿刺で血液を採取し、採取した血液は、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血清（ｓｅｒｕｍ）を分離してＩｇＥ濃度を測定し、その結果を図１４に示した。ＩｇＥ濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（ＩｇＥ ｍｏｕｓｅ ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｃａｔ＃８８－５０４６０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。
実験終了時にＣＯ２で麻酔した後、心臓穿刺で血液を採取し、採取した血液は、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血清（ｓｅｒｕｍ）を分離してＩｇＥ濃度を測定し、その結果を図１４に示した。ＩｇＥ濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（ＩｇＥ ｍｏｕｓｅ ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｃａｔ＃８８－５０４６０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。
【0092】
図１４を参照すると、ＤＮＣＢを処理した対照群では、血清内ＩｇＥの生成量は、正常群に比べて増加したが（１５４５.０８ｎｇ／ｍｌ、約１３倍増加、Ｐ＜０.００１）、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群と本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与群の両方でアトピー誘導群に比べて著しく減少した。ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９、陽性対照群においてアトピー誘導群に比べて、それぞれ１３０４３.６ｎｇ／ｍｌ（３４.９５％減少）、７５７１.６４ｎｇ／ｍｌ（６２.２４％減少）、１１８９１.３４ｎｇ／ｍｌ（４０.７０％減少）で有意に著しく減少することを確認した（Ｐ＜０.００１）。特に、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９を投与した群の血清内のＩｇＥ濃度は、標準株であるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群より４１.９５％（Ｐ＝０.００７）さらに減少し、陽性対照群よりは３６.３２％（Ｐ＝０.０５）さらに減少していることを測定された。したがって、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株含有組成物がＩｇＥ生成抑制効能がはるかに優れており、アトピー症状を緩和させるのに最も効果的なことが確認された。
【0093】
３.９．組織病理学的観察
実験終了時にマウスを犠牲にした後、皮膚を摘出して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンブロックを作製して薄片を製造した後、ヘマトキシリン＆エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）染色を行って表皮層及び真皮層の厚さの変化を光学顕微鏡で２００倍拡大して観察し、その結果を図１５に示した。角化過多症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）と上皮肥大増殖（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）現象を正常群の厚さを０点、正常群の厚さの２倍を１点、３倍を２点、４倍を３点、４倍以上の４点に点数化し、組織学的に等級化して１５（Ｂ）及び（Ｃ）に示した。
実験終了時にマウスを犠牲にした後、皮膚を摘出して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンブロックを作製して薄片を製造した後、ヘマトキシリン＆エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）染色を行って表皮層及び真皮層の厚さの変化を光学顕微鏡で２００倍拡大して観察し、その結果を図１５に示した。角化過多症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）と上皮肥大増殖（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）現象を正常群の厚さを０点、正常群の厚さの２倍を１点、３倍を２点、４倍を３点、４倍以上の４点に点数化し、組織学的に等級化して１５（Ｂ）及び（Ｃ）に示した。
【0094】
ＮＣ／Ｎｇａマウスの背中の皮膚組織をＨ＆Ｅ染色して観察した結果、図１５に示すように、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）は、正常群と比較して表皮層が真皮層側に厚く下がって拡張された肥厚化と皮膚障壁の深刻な損傷及び炎症細胞の浸潤増加の組織病理学的所見を示した。アッカーマンシア・ムシニフィラ投与群と陽性対照群（ＤＥＸ群）の両方において顕微鏡観察時、炎症細胞の浸潤が減少する様相を示し、アトピー性皮膚炎の誘発時に観察される表皮の厚さと真皮の厚さが全て拡張されることが抑制され、正常群と似た組織病理学的特徴を示した。
【0095】
図１５（Ｂ）及び（Ｃ）のグラフに示すように、角化過多症と上皮肥大増殖現象は、正常群に比べてアトピー誘導群（ＤＮＣＢ）において有意に増加しており、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に比べて陽性対照群を含むアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群と本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群の両方で有意に著しく抑制されることを確認した。
【0096】
３.１０．体重の変化観察
本実験に使用した菌株による体重変化が発生するかどうかを確認するため、アトピー誘導期間を含んで菌株投与期間の間、実験動物の体重を毎週測定した。図１６から確認されるように、菌株投与６週目に体重を測定した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）では、薬物の副作用及びストレスなどにより体重減少が発生することを確認できた。それに対して、アトピー誘導群にアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を投与した群では、アトピー誘導群に比べて体重の増加様相を示した。また、ステロイド系治療剤であるデキサメタゾンを投与した陽性対照群よりアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を投与した群（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５の標準株とＥＢ－ＡＭＤＫ１９）において体重減少抑制様相を確認できた。特に、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の投与時には、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）と同じパターンの体重増加を示して体重減少の副作用は現れずに、安全であることが確認された。
本実験に使用した菌株による体重変化が発生するかどうかを確認するため、アトピー誘導期間を含んで菌株投与期間の間、実験動物の体重を毎週測定した。図１６から確認されるように、菌株投与６週目に体重を測定した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）では、薬物の副作用及びストレスなどにより体重減少が発生することを確認できた。それに対して、アトピー誘導群にアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を投与した群では、アトピー誘導群に比べて体重の増加様相を示した。また、ステロイド系治療剤であるデキサメタゾンを投与した陽性対照群よりアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株を投与した群（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５の標準株とＥＢ－ＡＭＤＫ１９）において体重減少抑制様相を確認できた。特に、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株の投与時には、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）と同じパターンの体重増加を示して体重減少の副作用は現れずに、安全であることが確認された。
【0097】
３.１１．血清内のサイトカイン濃度測定
アトピー性皮膚炎の誘導後、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与による免疫反応を確認するため、Ｔｈ１とＴｈ２に関連したサイトカインの濃度を測定した。すべての実験の統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７.０４．Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用した。
アトピー性皮膚炎の誘導後、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与による免疫反応を確認するため、Ｔｈ１とＴｈ２に関連したサイトカインの濃度を測定した。すべての実験の統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７.０４．Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用した。
【0098】
実験終了時にマウスをＣＯ２で麻酔した後、心臓穿刺で血液を採取し、採取した血液は、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、血清を分離して－て８０℃で保管した。ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６サイトカインの濃度を測定し、その結果を図１７及び図１８に示した。
【0099】
優先的にＴｈ２細胞活性によって誘導され、炎症反応の指標としても知られているサイトカインＩＬ－４とＩＬ－６の濃度を確認した。図１７（Ａ）に示すように、ＩＬ－４濃度は、アトピー誘導群において正常群よりも有意に高くなり（Ｐ＝０.０３）、アトピー誘導群に比べて陽性対照群（ＤＥＸ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ投与群であるＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群とＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群の両方で有意に減少した。特にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群（Ｐ＝０.００１）では、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群（Ｐ＝０.０３）より有意にさらに減少したことが分かった。また、ＩＬ－６の濃度もＩＬ－４と類似の結果を確認できた（図１７（Ｂ）参照）。ＩＬ－６濃度を測定した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）において４３.４％増加（Ｐ＝０.０３）しており、ＤＮＣＢ誘導群に比べて陽性対照群（ＤＥＸ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ投与群の両方で抑制されること（それぞれＤＥＸ：Ｐ＝０.０３、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５：Ｐ＝０.０４、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９：Ｐ＝０.００６）を確認できた。ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群は、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に比べてＩＬ－６の濃度が３０.５％減少し、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、３９.４％減少することを確認した。したがって、ＩＬ－４、ＩＬ－６などサイトカインによって体液性免疫を活性化させてＢ細胞が活性化され、ＩｇＥが多くなってアトピー性皮膚炎が誘発されるが、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株がＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株より効果的に阻害すると考えられる。
【0100】
３.１２．ＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株が血中のＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ－γとＩＬ－１２に及ぼす影響
本実験においては、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ－γとそのｉｎｄｕｃｅｒであるＩＬ－１２を測定した結果、図１８から確認されるように、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群において全て有意に増加していることが分かった。ＩＦＮ－γの場合にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、正常群（Ｐ＝０.００１）、アトピー誘導群（Ｐ＜０.００１）、陽性対照群（ＤＥＸ）（Ｐ＝０.００７）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株（Ｐ＜０.００１）投与群よりそれぞれ有意に増加した。また、ＩＬ－１２の濃度は、正常群に比べてアトピー誘導群は、有意に減少し（Ｐ＝０.００８）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、有意に増加した（Ｐ＜０.００１）。アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に比べて陽性対照群（ＤＥＸ）（Ｐ＝０.００１）、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株（Ｐ＝０.００６）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９（Ｐ＜０.００１）で有意に増加した。特にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、陽性対照群（ＤＥＸ）に比べて有意に増加し（Ｐ＝０.０２）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株に比べても有意に増加する結果を示した（Ｐ＜０.００１）。したがって、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与が血清ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γ濃度の増加をもたらし、したがって、Ｔｈ１分化を誘導することを確認した。
本実験においては、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ－γとそのｉｎｄｕｃｅｒであるＩＬ－１２を測定した結果、図１８から確認されるように、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群において全て有意に増加していることが分かった。ＩＦＮ－γの場合にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、正常群（Ｐ＝０.００１）、アトピー誘導群（Ｐ＜０.００１）、陽性対照群（ＤＥＸ）（Ｐ＝０.００７）及びアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株（Ｐ＜０.００１）投与群よりそれぞれ有意に増加した。また、ＩＬ－１２の濃度は、正常群に比べてアトピー誘導群は、有意に減少し（Ｐ＝０.００８）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、有意に増加した（Ｐ＜０.００１）。アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に比べて陽性対照群（ＤＥＸ）（Ｐ＝０.００１）、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株（Ｐ＝０.００６）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９（Ｐ＜０.００１）で有意に増加した。特にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、陽性対照群（ＤＥＸ）に比べて有意に増加し（Ｐ＝０.０２）、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５標準株に比べても有意に増加する結果を示した（Ｐ＜０.００１）。したがって、本発明のＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与が血清ＩＬ－１２及びＩＦＮ－γ濃度の増加をもたらし、したがって、Ｔｈ１分化を誘導することを確認した。
【0101】
３.１３．アトピー動物モデルにおいてＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株投与がＴｈ１とＴｈ２サイトカイン生成能に及ぼす影響
免疫学的観点からアトピー性皮膚炎は、Ｔｈ１とＴｈ２特定の免疫反応が過剰に発生してバランスが崩れて生じる疾患である。したがって、先に測定したサイトカインの濃度に基づいて、Ｔｈ２／Ｔｈ１サイトカインの比率で表現して図１９及び図２０に示した
図１９（Ａ）を参照すると、ＩＬ－４／ＩＬ－１２を分析した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）では有意に数値が増加し（Ｐ＝０.００６）、アトピー性皮膚炎に代表的に現れるＴｈ２サイトカインの増加を確認し、陽性対照群を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ投与群、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５の標準株とＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群の両方でアトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に対して有意に数値が減少すること（それぞれＤＥＸ：Ｐ＝０.００６、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５：Ｐ＝０.００３）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９：Ｐ＜０.００１）を確認した。それだけでなく、ＩＬ－４／ＩＦＮ－γでも同じ様相を確認できた（図１９（Ｂ）参照）。ＩＬ－４／ＩＦＮ－γの比率がＤＮＣＢに対してＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群は、１５.０％（Ｐ＝０.０３）減少し、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、３２.９％（Ｐ＜０.００１）減少することが確認できた。特にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群よりも有意に減少していることが確認できた（図１９（Ｂ）参照）。
免疫学的観点からアトピー性皮膚炎は、Ｔｈ１とＴｈ２特定の免疫反応が過剰に発生してバランスが崩れて生じる疾患である。したがって、先に測定したサイトカインの濃度に基づいて、Ｔｈ２／Ｔｈ１サイトカインの比率で表現して図１９及び図２０に示した
図１９（Ａ）を参照すると、ＩＬ－４／ＩＬ－１２を分析した結果、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）では有意に数値が増加し（Ｐ＝０.００６）、アトピー性皮膚炎に代表的に現れるＴｈ２サイトカインの増加を確認し、陽性対照群を含むアッカーマンシア・ムシニフィラ投与群、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５の標準株とＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群の両方でアトピー誘導群（ＤＮＣＢ）に対して有意に数値が減少すること（それぞれＤＥＸ：Ｐ＝０.００６、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５：Ｐ＝０.００３）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９：Ｐ＜０.００１）を確認した。それだけでなく、ＩＬ－４／ＩＦＮ－γでも同じ様相を確認できた（図１９（Ｂ）参照）。ＩＬ－４／ＩＦＮ－γの比率がＤＮＣＢに対してＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群は、１５.０％（Ｐ＝０.０３）減少し、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、３２.９％（Ｐ＜０.００１）減少することが確認できた。特にＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群よりも有意に減少していることが確認できた（図１９（Ｂ）参照）。
【0102】
また、ＩＬ－６／ＩＬ－１２とＩＬ－６／ＩＦＮ－γの比率も前記結果と類似の様相を確認できた。ＩＬ－６／ＩＬ－１２の比率は、アトピー誘導群において正常群と比較して１.５０倍、Ｐ＝０.０１増加し、アトピー誘導群に対して陽性対照群、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９群の両方で、それぞれ３４.５％（Ｐ＝０.０２）、３５.９％（Ｐ＝０.００５）、５０.５％（Ｐ＜０.００１）減少することを確認した。ＩＬ－６／ＩＦＮ－γの比率もアトピー誘導群において正常群と比較して１４％（Ｐ＝０.００４）増加し、アトピー誘導群（ＤＮＣＢ）と対比して陽性対照群では、１２.７％（Ｐ＝０.０１）、ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、２７.０％（Ｐ＜０.００１）減少した。ＥＢ－ＡＭＤＫ１９投与群は、陽性対照群やアッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５投与群よりも有意に減少した数値を示した。
【0103】
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＥＢ－ＡＭＤＫ１９菌株（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＥＢ－ＡＭＤＫ１９）を有効成分として含む、アトピー性疾患の予防または治療用薬学的組成物は、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ－４、ＩＬ－６の生成を抑制し、その結果、ＩｇＥの過剰生産を抑制し、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２の生成を促進してアトピー性疾患の治療効果に優れており、特に、従来のプロバイオティクス製剤が有している限界をはるかに改善し、ステロイド系薬物と同等の水準でアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療効果を示すため、産業上の利用可能性が高い。
【0104】
本明細書に記載された具体的実施例は、単に本発明の好ましい具現例を説明するためのもので、本発明を制限するものと解釈してはならない。本発明は、その思想及び範囲から外れることなく様々に変形及び変化されて行われてもよく、このような事実は、当業者に自明であろう。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められるべきであり、前記様々な変形及び変化は、本発明の保護範囲に含まれることが意図される。
【受託番号】
【0105】
寄託機関：韓国基準菌株培養コレクション
受託番号：ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ
受託日付：２０１８年１２月０５日
受託番号：ＫＣＴＣ１３７６１ＢＰ
受託日付：２０１８年１２月０５日
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】