特許 7257680 毛様体神経栄養因子受容体リガンド結合剤およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-06

(45)【発行日】2023-04-14

(54)【発明の名称】毛様体神経栄養因子受容体リガンド結合剤およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20230407BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230407BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230407BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20230407BHJP

   C07K 14/76 20060101ALI20230407BHJP

   C07K 14/79 20060101ALI20230407BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230407BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230407BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230407BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230407BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230407BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230407BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230407BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230407BHJP

   A61K 45/00 20060101ALN20230407BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20230407BHJP

   G01N 33/574 20060101ALN20230407BHJP

   G01N 33/566 20060101ALN20230407BHJP

   G01N 33/53 20060101ALN20230407BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

C07K14/705 ZNA

C07K19/00

C07K16/18

C07K14/76

C07K14/79

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N15/62 Z

A61K47/68

A61K47/62

A61P43/00 111

A61P35/00

A61K45/00

A61K39/395 N

A61K39/395 T

G01N33/574 A

G01N33/566

G01N33/53 D

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2019529901

(86)(22)【出願日】2017-12-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-12-19

(86)【国際出願番号】 US2017064883

(87)【国際公開番号】W WO2018106790

(87)【国際公開日】2018-06-14

【審査請求日】2020-12-04

(31)【優先権主張番号】62/430,757

(32)【優先日】2016-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/481,027

(32)【優先日】2017-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100095500

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 正和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100195257

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 一志

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュン ウ

(72)【発明者】

【氏名】コクラン、 ジェニファー アール．

(72)【発明者】

【氏名】スウィート、 エリック アレハンドロ

【審査官】長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2003年，Vol.278, No.26，pp.23285-23294

【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2008年，Vol.283, No.44，pp.30341-30350

【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1996年，Vol.271, No.42，pp.26049-26056

【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2004年，Vol.279, No.42，pp.43961-43970

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ｃ０７Ｋ １４／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）に特異的に結合する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドと、
医薬的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物であって、
前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、
野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異を含み、その突然変異は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置１７７、１７８、もしくはその両方に存在し、
および／または、
野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＬＣＦ１に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる突然変異を含み、その突然変異は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置１１０、１７４、２３７、２８７、もしくはそれらの任意の組み合わせに存在する、
医薬組成物。

【請求項2】

前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）に対する前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異をさらに含み、ｇｐ１３０に対する結合親和性を低下させる前記突然変異が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置２６８、２６９、またはその両方に存在する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、異種ポリペプチドと融合している、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有する個体に治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記細胞増殖性疾患が、がんである、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記がんが、肺癌である、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記肺癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

ＣＬＣＦ１に特異的に結合する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドであって、
野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＬＩＦＲに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異を含み、その突然変異は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置１７７、１７８、もしくはその両方に存在し、
および／または、
野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＬＣＦ１に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる突然変異を含み、その突然変異は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置１１０、１７４、２３７、２８７、もしくはそれらの任意の組み合わせに存在する、
可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【請求項12】

前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、ｇｐ１３０に対する結合親和性を低下させる突然変異をさらに含み、その突然変異が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対するアミノ酸位置で位置２６８、２６９、またはその両方に存在する、請求項１１に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【請求項13】

前記可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせと融合している、請求項１１または１２に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【請求項14】

請求項１１～１３のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドをコードする、核酸。

【請求項15】

請求項１４に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【請求項16】

請求項１４に記載の核酸、または請求項１５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４３０，７５７号、および２０１７年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４８１，０２７号の優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ：ciliary neurotrophic factor）は、ニワトリ毛様体ニューロンの生存因子として同定され、構造的に関連する造血および神経新生サイトカインのインターロイキン（ＩＬ）－６ファミリー（ＩＬ－６、ＩＬ－１１、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、カルジオトロフィン－１（ＣＴ－１））に属する。ＣＮＴＦおよびＩＬ－６型サイトカインに対する細胞応答は、１３０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であるｇｐ１３０を含む、異なる複数ユニットの受容体複合体によって誘発される。ＣＮＴＦは、シグナル伝達に関与しないＧＰＩアンカー型ＣＮＴＦ受容体（ＣＮＴＦＲ）に１：１の化学量論で最初に結合する。膜結合型または可溶性ＣＮＴＦＲへのＣＮＴＦの結合は、細胞内シグナル伝達カスケードを誘発するシグナル伝達性β受容体ｇｐ１３０およびＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）のヘテロ二量体を誘導する。

【0003】

がんは、それ自体が腫瘍形成プロセスの結果として変化する微小環境内で発生し進行する。がん細胞と接触している間質細胞は、腫瘍細胞へのシグナル伝達によって直接的に、または腫瘍進行を促進するために他の間質成分を動員することによって間接的に作用し得る増殖因子およびサイトカインを分泌する。このプロセスの重要な側面は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ：cancer-associated fibroblast）の増殖である。ＣＡＦは、異なる腫瘍および組織において別個の特徴を有する間質細胞の多様な集団である。

【0004】

ＣＡＦは、腫瘍細胞の増殖を刺激する可溶性因子の分泌によって、インビボでがん細胞（例えば、肺癌細胞）の増殖を支持する。そのような可溶性因子の１つは、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）である。間質内の細胞によって産生されたＣＬＣＦ１は、このタンパク質の受容体（ＣＮＴＦＲ）を発現している腫瘍細胞によって増殖シグナルとして受け取られる。例えば、機能的研究により、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の増殖促進におけるＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達の役割が明らかにされている。

【発明の概要】

【0005】

毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）のリガンドに特異的に結合する薬剤が提供される。ある特定の態様において、本開示の薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである。可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、１つ以上のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する変化させた（例えば、低下させた）結合親和性、１以上のＣＮＴＦＲリガンドに対する変化させた（例えば、増加させた）結合親和性、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。本開示の薬剤を含む組成物、ならびに薬剤を使用する方法（例えば、細胞増殖性疾患を治療するため）およびＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定する方法もまた提供される。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】本開示の一実施形態による、下流ＣＮＴＦＲシグナル伝達経路を阻害するための戦略を概略的に示す。この実施形態において、ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する薬剤は可溶性ＣＮＴＦＲ「デコイ受容体」であり、ＣＬＣＦ１が膜結合ＣＮＴＦＲと相互作用するのを阻害し、ＪＡＫ ＳＴＡＴ経路およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路等のＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲ媒介シグナル伝達経路の活性化を防止する。

【図2】組換えＣＬＣＦ１がＳＴＡＴ３を活性化することを実証するデータを提供する。パネルＡ：ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９において、Ｔｙｒ７０５におけるｐ－ＳＴＡＴ３のレベルが処理の１５分後および３０分後に検出された。パネルＢ：ＣＮＴＦＲ発現によって正規化した後、ｐ－ＳＴＡＴ３シグナルの強度を定量化した。パネルＣ：Ｈ２３およびＨ３５８等の他のＮＳＣＬＣ細胞株においてＳＴＡＴ３の活性化が検出された。

【図3】Ａ５４９およびＨ２３細胞の生存に対するＣＬＣＦ１処理の影響を実証するデータを示す。無血清条件で２４時間飢餓状態にした後、無血清培地中のＣＬＣＦ１で細胞を７２時間処理した。ＣＬＣＦ１は、Ａ５４９（パネルＡ）およびＨ２３（パネルＢ）細胞の生存率を濃度依存的に増加させた。

【図4】ＣＮＴＦＲの酵母表面ディスプレイ。パネルＡ：ＣＮＴＦＲは、酵母表面タンパク質Ａｇａ２ｐへの融合物として提示された。提示されたタンパク質は、発現レベルを測定することを可能にするＣ末端ｃ－ｍｙｃタグを含有する。パネルＢ：２０ｎＭのＣＬＣＦ１で処理した場合、ＣＮＴＦＲを発現する酵母集団がＣＬＣＦ１結合についてのシグナルを増加させたことを示すフローサイトメトリー散布図。

【図5】酵母に提示されたＣＮＴＦＲは、ＣＬＣＦ１の存在下でβ受容体に結合する。抗ｃＭｙｃ抗体のみ（パネルＡ）、ＬＩＦＲ－Ｆｃ（パネルＢ）、ＣＬＣＦ１およびＬＩＦＲ－Ｆｃ（パネルＣ）、ならびにＣＬＣＦ１、ＬＩＦＲ－Ｆｃ、およびｇｐ１３０－ＨＩＳ（パネルＤ）とともにインキュベートした、ＣＮＴＦＲを提示する酵母を示す散布図。蛍光標識した二次抗体を用いて、フローサイトメトリーにより種々の成分の結合を検出した。パネルＥ：パネルＢ、Ｃ、およびＤのプロットの重ね合わせ。

【図6】酵母に提示されたＣＮＴＦＲ－ＣＬＣＦ１は、ＬＩＦＲなしでｇｐ１３０に結合することができる。抗ｃＭｙｃ抗体のみ（パネルＡ）、ｇｐ１３０－Ｆｃ（パネルＢ）、ＣＬＣＦ１およびｇｐ１３０－Ｆｃ（パネルＣ）、ならびにＣＬＣＦ１、ｇｐ１３０－Ｆｃ、およびＬＩＦＲ－ＨＩＳ（パネルＤ）とともにインキュベートした、ＣＮＴＦＲを提示する酵母を示す散布図。蛍光標識した二次抗体を用いて、フローサイトメトリーにより種々の成分の結合を検出した。パネルＥ：パネルＢ、Ｃ、およびＤのプロットの重ね合わせ。

【図7】ＣＬＣＦ１に対してランダムに突然変異を誘発させたＣＮＴＦＲライブラリーの３ラウンドの選別後に中間的な親和性集団から単離した変異体を示す。

【図8】ＣＬＣＦ１に対してランダムに突然変異を誘発させたＣＮＴＦＲライブラリーの３ラウンドの選別後に最高の親和性集団から単離した変異体を示す。

【図9】ＣＬＣＦ１に対してシャッフルしたＣＮＴＦＲライブラリーの３ラウンドの選別後に最高の親和性集団から単離した変異体を示す。

【図10】親和性成熟ＣＮＴＦＲ変異体の特徴付け。パネルＡ：親和性成熟スクリーンから単離されたＣＮＴＦＲ構築物を発現する酵母へのＣＬＣＦ１の結合。パネルＢ：酵母に提示されたＣＮＴＦＲ構築物の見かけのＫｄ値。パネルＣ：酵母に提示された野生型ＣＮＴＦＲおよび変異体４のＣＮＴＦ結合。パネルＤ：ｈＣＬＣＦ１に加えてｍＣＬＣＦ１に結合した変異体４。

【図11】Ｔ２６８ＡおよびＤ２６９Ａの突然変異を含有するＣＮＴＦＲ変異体はＣＬＣＦ１およびＬＩＦＲに結合するが、ｇｐ１３０には結合しない。ＣＬＣＦ１（パネルＡ）、ｇｐ１３０－Ｆｃ（パネルＢ）、およびＬＩＦＲ－Ｆｃ（パネルＣ）へのＣＮＴＦＲ Ｔ２６８Ａ Ｄ２６９Ａ構築物結合シグナル。

【図12】ＬＩＦＲに結合しないＣＮＴＦＲ変異体のライブラリースクリーニング。高親和性ＣＬＣＦ１結合剤について最初のスクリーニングを実施した後、低いＬＩＦＲ－Ｆｃシグナルを有する集団を単離した（パネルＡ）。これに続いて、ＣＬＣＦ１結合剤について別のスクリーニング（パネルＣ）、および非ＬＩＦＲ結合剤についてのスクリーニングを行った。パネルＤ：６ラウンドの選別後、スクリーニングされたライブラリーは、減少したＬＩＦＲ結合を示す一方で、未変化のＣＬＣＦ１結合を有していた。Ａの上部パネル、Ｂの下部パネル、およびＣの下部パネルのゲートは、各選別ラウンドで単離された集団を表す。

【図13】ＬＩＦＲに結合しないＣＮＴＦＲ変異体の特徴付け。パネルＡ：ＬＩＦＲに対するネガティブ選別（ネガティブ選別）を用いたライブラリースクリーニング手法から単離された変異体は、２つのコンセンサス変異、Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎを有していた。パネルＢ：これらの２つの突然変異は、組み合わせた場合にＬＩＦＲ結合親和性の低下に対する相加効果を示す。Ｖ４＝図１０の変異体４。

【図14】可溶性ｅＣＮＴＦＲ構築物の特徴付け。パネルＡ：可溶性発現させたｅＣＮＴＦＲ－ＨＩＳおよびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、ｗｔＣＮＴＦＲタンパク質と比較して有意に改善されたＣＬＣＦ１への結合を示した。パネルＢ：可溶性ｅＣＮＴＦＲ構築物は、可溶性ｇｐ１３０およびＬＩＦＲへの最小限の結合を示した（各条件につき、左から右へ、ｗｔＣＮＴＦＲ－ＨＩＳ、ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、ｅＣＮＴＦＲ－ＨＩＳ、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ）。

【図15】ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが細胞のシグナル伝達および生存に与える影響。パネルＡ：Ａ５４９非小細胞肺癌細胞を１０ｎＭのＣＮＴＦＲ－Ｆｃ変異体で２０分間処理し、ウエスタンブロットを行ってｐＳＴＡＴ３を検出した。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処理は、Ａ５４９細胞（パネルＢ）およびＨ２３細胞（パネルＣ）におけるＣＬＣＦ１の生存促進効果を阻害した。パネルＢおよびＣでは、各濃度につき、ＣＬＣＦ１の結果は左側に、ＣＬＣＦ１＋ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの結果は右側に示される。

【図16】ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃによるＣＬＣＦ１の隔離は、Ａ５４９異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。パネルＡ：１ｍｇ／ｋｇ体重の投与後４８時間にわたるＣＬＣＦ１の隔離およびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃのクリアランス。パネルＢ：Ａ５４９ＮＳＣＬＣ細胞の異種移植片モデルにおける腫瘍量。マウスをＰＢＳ、１ｍｇ／ｋｇ体重のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、または１０ｍｇ／ｋｇ体重のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで週２回（矢印）、１７日間処理した（丸：ＰＢＳ、四角：１ｍｇ／ｋｇのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、三角：１０ｍｇ／ｋｇのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ）。パネルＣ：時間０から正規化された個々の腫瘍サイズのウォーターフォールプロット。

【図17】ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、Ｈ２３異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。パネルＡ：Ｈ２３ＮＳＣＬＣ細胞の異種移植片モデルにおける腫瘍量。マウスを、ＰＢＳ（丸）、１０ｍｇ／ｋｇ体重のｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（四角）またはｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ（三角）を用いて週３回、３９日間にわたって処理した。パネルＢ：個々の腫瘍のウォーターフォールプロット

【図18】パネルＡおよびＢは、操作されたＣＬＣＦ１トラップ（ｅＣＮＴＦＲ）における特異性の増加およびインビトロでの有効性を実証するデータを示す。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋ｍＣＬＣＦ１（丸）、ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋ＣＮＴＦ（三角）、ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋ｍＣＬＣＦ１（菱形）、およびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ＋ＣＮＴＦが示される。ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害を用いて阻害効果を実証した。

【図19】パネルＡ～Ｉは、ｅＣＮＴＦＲのインビボ効果を示すデータを提供する。パネルＡ：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンママウスにおける１０ｍｇ／ｋｇのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの腹腔内（ｉｐ）投与後の血液クリアランスおよびＣＬＣＦ１の隔離。注射後に血清試料を回収し、捕捉剤としてｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡにより未結合ＣＬＣＦ１を測定した。ビヒクルで処理したマウスを用いてベースラインＣＬＣＦ１レベルを決定した。血中のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃレベルは、捕捉剤として抗Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより定量化した。パネルＢ：Ａ５４９異種移植片の腫瘍体積定量化［ＰＢＳを除くｎ＝８の腫瘍（最終時点でｎ＝６の腫瘍）、１回の実験］。二元配置分散分析を用いて＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。パネルＣ：最終時点の腫瘍体積の定量化（Ａ５４９異種移植片の最終時点）。ひげは、最大値および最小値を特定し、箱は、７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルを示し、線は、中央値を示す。一元配置分散分析を用いて＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。パネルＤ：Ａ５４９異種移植片についてベースラインからの腫瘍パーセント変化を示すウォーターフォールプロット。パネルＥ：患者由来異種移植片（ＰＤＴＸ）モデルの腫瘍体積の定量化。二元配置分散分析を用いて＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。パネルＦ：ＰＤＴＸモデルの最終時点の腫瘍体積の定量化。ひげは、最大値および最小値を特定し、箱は、７５パーセンタイルおよび２５パーセンタイルを示し、線は、中央値を示す。対応のないスチューデントの両側ｔ検定を用いて＊＊Ｐ＜０．０１。パネルＧ：ＰＤＴＸモデルについてベースラインからの腫瘍パーセント変化を示すウォーターフォールプロット。パネルＨ：ＰＤＴＸ腫瘍の代表的な画像。スケールバー、１ｃｍ。パネルＩ：ホスホヒストンＨ３（ＰＨ３）およびトランケーションカスパーゼ３（ＣＣ３）の代表的なＨ＆Ｅ染色およびＩＨＣ。スケールバー、５０μｍ。ＰＨ３およびＣＣ３陽性病巣の定量化（右パネル）。一元配置分散分析を用いて＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。

【図20】パネルＡ～Ｄは、ＣＬＣＦ１およびＣＮＴＦＲが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において発現されることを実証するデータを提供する。

【発明を実施するための形態】

【0007】

毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）のリガンドに特異的に結合する薬剤が提供される。ある特定の態様において、本開示の薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである。可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、１つ以上のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する変化させた（例えば、低下させた）結合親和性、１以上のＣＮＴＦＲリガンドに対する変化させた（例えば、増加させた）結合親和性、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。本開示の薬剤を含む組成物、ならびに薬剤を使用する方法（例えば、細胞増殖性疾患を治療するため）およびＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定する方法もまた提供される。

【0008】

本開示の薬剤、組成物、および方法をより詳細に説明する前に、薬剤、組成物、および方法は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然のことながら異なり得るということを理解されたい。また、薬剤、組成物、および方法の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定的であることは意図されないことも理解されたい。

【0009】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上そうではないと明確に指示されない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載される範囲内の任意の他の記載値または介在値が、薬剤、組成物、および方法に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲内に含まれてもよく、また、記載される範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って、薬剤、組成物、および方法内に包含される。記載される範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、薬剤、組成物、および方法に含まれる。

【0010】

特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近いかほぼ等しいかを決定するにあたり、近似または近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。

【0011】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、薬剤、組成物、および方法が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または均等な任意の薬剤、組成物、および方法もまた、薬剤、組成物、および方法の実施または試験において使用され得るが、代表的な例示的薬剤、組成物、および方法を次に記載する。

【0012】

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためであり、提供される公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得るため、本発明の薬剤、組成物、および方法は、そのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0013】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。

【0014】

明確性のために別々の実施形態の文脈中に記載されている薬剤、組成物、および方法のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることも理解されたい。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈中に記載されている薬剤、組成物、および方法の種々の特徴は、別々に、または任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書において、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する程度まで、まさに各々およびすべての組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのように開示される。さらに、そのような変数を記載している実施形態に列挙されているすべてのサブコンビネーションも、本発明の複合体、組成物および方法によって具体的に包含され、そのような各サブコンビネーションが個々におよび明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。

【0015】

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。

【0016】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤
上記に要約したように、本開示の態様は、毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）のリガンドに特異的に結合する薬剤を含む。ＣＮＴＦＲ（ＣＮＴＦ受容体サブユニットαとも称される）は、１型サイトカイン受容体ファミリーの一員である。ＣＮＴＦＲは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）ならびにカルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）およびニューロポエチン（ＮＰ）等の他のリガンドの三成分受容体のリガンド特異的成分である。ＣＮＴＦＲへのリガンドの結合は、受容体の膜貫通成分であるｇｐ１３０および白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）を動員し、シグナル伝達を促進する。

【0017】

本明細書で使用される場合、「毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）のリガンドに特異的に結合する薬剤」は、１つ以上のＣＮＴＦＲリガンド（例えば、１つ以上のＣＬＣＦ１、ＣＮＴＦＲ、および／またはＮＰ）に対して結合親和性を示す薬剤であり、約１０^－５Ｍ以下、約１０^－６Ｍ以下、約１０^－７Ｍ以下、約１０^－８Ｍ以下、または約１０－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、もしくは１０^－１２Ｍ以下のＫ_Ｄを有する。そのような親和性は、従来技術を用いて、例えば、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術の使用によって（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器、製造業者によって概説される一般的な手順を用いる）、ラジオイムノアッセイによって、または後述の実施例に記載されるもしくは当業者に既知の別の方法によって、容易に測定され得る。

【0018】

本開示の薬剤は、アプタマー、抗体等を含むが、これらに限定されない、ＣＮＴＦＲリガンドに特異的に結合する任意の好適な種類の薬剤であり得る。ある特定の態様において、薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである。

【0019】

次に、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤の非限定的な実施形態を詳細に記載する。

【0020】

可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド
上記に要約したように、ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである。「可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド」とは、細胞膜に組み込まれていないＣＮＴＦＲポリペプチドを意味する。野生型ヒトＣＮＴＦＲアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２６９９２）を下の表１に提供する。

【表1】

【0021】

ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、溶解性を付与する１つ以上の突然変異を有するポリペプチドのおかげで細胞膜に組み込まれない。本開示を通して使用されるように、「突然変異（単数）」または「突然変異（複数）」は、関連ポリペプチド、例えば、本開示のＣＮＴＦＲポリペプチドにおける、１つ以上のアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸欠失（例えば、トランケーション）、１つ以上のアミノ酸挿入、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0022】

溶解性を付与する１つ以上の突然変異は、ＣＮＴＦＲポリペプチドの任意の好適な領域（複数可）に位置し得る。ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメイン内に、溶解性を付与する１つ以上の突然変異を含む。このドメインは、タンパク質を細胞膜に固定するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）で翻訳後修飾される脂質化部位（Ｓ３４２）を含有する。ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定する野生型ヒトＣＮＴＦＲドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸３４３～３７２からなると定義することができる（表１において下線で示される）。ある特定の条件下で、ＣＮＴＦＲのこの部分は、細胞膜からＣＮＴＦＲを放出するように酵素的に修飾される。いくつかの実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＧＰＩによる翻訳後修飾を妨げる置換突然変異をＳ３４２に含み、それによって溶解性を付与する。野生型ヒトＣＮＴＦＲはまた、配列番号１のアミノ酸１～２２からなるシグナルペプチドを含む（表１において下線で示される）。

【0023】

ある特定の実施形態によれば、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメインは、ＣＮＴＦＲポリペプチドが細胞膜に固定される能力を喪失させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、それによって溶解性を付与する。代替的に、またはさらに、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＮＴＦＲポリペプチドが細胞膜に固定される能力を喪失させるトランケーション（例えば、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメイン内に）を含んでもよく、それによって溶解性を付与する。ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するＣＮＴＦＲドメインを欠いている。例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸３４３～３７２を欠いていてもよい。

【0024】

溶解性を付与する１つ以上の突然変異を任意選択的に含むことに加えて、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ポリペプチドに１つ以上の他の望ましい特性を付与する１つ以上の突然変異を含み得る。対象とする他の望ましい特性として、ＣＮＴＦＲリガンドに対する変化させた（例えば、より高い）結合親和性、１つ以上の他のＣＮＴＦＲリガンドと比較して対象とする特定のＣＮＴＦＲリガンドに対する変化させた（例えば、より高い）特異性、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ等）に対する変化させた（例えば、低下させた）結合親和性が挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

「より高い結合親和性」または「増加させた結合親和性」とは、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、分子（例えば、ＣＬＣＦ１等のＣＮＴＦＲリガンド）に対してより密接な結合（より低いＫ_Ｄ値によって示されるように）を示すことを意味する。「より低い結合親和性」または「低下させた結合親和性」とは、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが、野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、分子（例えば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方等のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット）に対してあまり密接ではない結合（より高いＫ_Ｄ値によって示されるように）を示すことを意味する。

【0026】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド）の、対象とする分子、例えばＣＮＴＦＲリガンド、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０等のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する結合親和性を測定するための方法が利用可能である。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００機器を使用する）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）動的排除アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（登録商標））、または他の類似のアッセイ／技術が、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤が所望の結合親和性を示すかどうかを決定するために用いられ得る。本開示の文脈において結合親和性を測定するための好適な手法は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８０：２１－４４に記載されているものを含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、直接結合アッセイにおいて、フルオロフォアもしくは放射性同位体に結合させたＣＮＴＦＲポリペプチド、または標識抗体による検出のためのＮ末端もしくはＣ末端エピトープタグを含有するＣＮＴＦＲポリペプチドを用いて平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を測定することができる。標識またはタグが実行可能でないまたは所望されない場合、競合結合アッセイを使用して、標識競合物の最大シグナルの５０％が検出可能な非標識ＣＮＴＦＲポリペプチドの量である最大半量阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定することができる。次いで、測定されたＩＣ_５０値からＫ_Ｄ値を計算することができる。

【0028】

上記に要約したように、ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を変化させる（例えば、低下させる）１つ以上の突然変異を含む。「リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット」とは、ＣＮＴＦＲがリガンドに結合すると野生型ＣＮＴＦＲと会合するタンパク質を意味する。リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットの非限定的な例には、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）および糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）が含まれる。ある特定の態様において、１つ以上の突然変異は、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる。そのような１つ以上の突然変異は、例えば、ＣＮＴＦＲ媒介シグナル伝達を減少させることが望ましい場合（例えば、細胞増殖を減少させるため）、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがリガンドに結合した際にアゴニストとして作用するのを妨げることができる。

【0029】

ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対して低下した結合親和性を示す場合、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性は、１０ｎＭのＣＬＣＦ１の存在下で１００ｎＭ以上のＫ_Ｄ値を有する。

【0030】

ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＬＩＦＲに対して低下した結合親和性を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１７７、１７８、またはその両方に突然変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。１７７位の例示的な突然変異はＹ１７７Ｈである。１７７位の別の例示的な突然変異はＹ１７７Ａである。１７８位の例示的な突然変異はＫ１７８Ｎである。１７８位の別の例示的な突然変異はＫ１７８Ａである。後述の実施例の項に示されるように、本発明者らは、そのような突然変異がＣＮＴＦＲシグナル伝達の阻害剤である可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドをもたらす一方で、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対して未変化の親和性を有する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、結合時に、例えばＬＩＦＲおよびｇｐ１３０を動員するその能力によってアゴニストとして作用することを明らかにした。ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、突然変異Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎ、または突然変異Ｙ１７７ＡおよびＫ１７８Ａ、または突然変異Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ａ、または突然変異Ｙ１７７ＡおよびＫ１７８Ｎを含む。

【0031】

ある特定の実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ｇｐ１３０に対して低下した結合親和性を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置２６８、２６９、またはその両方に突然変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。２６８位の例示的な突然変異はＴ２６８Ａである。２６９位の例示的な突然変異はＤ２６９Ａである。ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、突然変異Ｔ２６８ＡおよびＤ２６９Ａを含む。

【0032】

上記に要約したように、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦ受容体、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する受容体またはその成熟型と比較して、対象とするＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＬＣＦ１、ＮＰ、ＣＮＴＦ、または別の対象とするＣＮＴＦＲリガンド）に対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性および／または特異性を変化させる（例えば、増加させる）１つ以上の突然変異を含み得る。ある特定の実施形態によれば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドがＣＮＴＦＲリガンドに対して増加した結合親和性を示す場合、リガンドに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性は１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ値を有する。

【0033】

ある特定の実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＬＣＦ１に対する結合親和性および／または特異性を増加させる１つ以上の突然変異を含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１１０、１７４、２３７、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに突然変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。１１０位の例示的な突然変異はＲ１１０Ｑである。１７４位の例示的な突然変異はＴ１７４Ｐである。２３７位の例示的な突然変異はＳ２３７Ｆである。２３７位の別の例示的な突然変異はＳ２３７Ｙである。２８７位の例示的な突然変異はＩ２８７Ｆである。ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、突然変異Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｓ２３７Ｆ／Ｓ２３７Ｙ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つまたはそれらの任意の組み合わせ（例えば、すべて）を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、アミノ酸位置１１０、１７４、１７７、１７８、２３７、２６８、２６９、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに突然変異（例えば、アミノ酸置換）を含む。

【0035】

ある特定の態様において、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、突然変異Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｙ１７７Ｈ／Ｙ１７７Ａ、Ｋ１７８Ｎ／Ｋ１７８Ａ、Ｓ２３７Ｆ／Ｓ２３７Ｙ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２６９Ａ、およびＩ２８７Ｆのうちの１つまたはそれらの任意の組み合わせ（例えば、すべて）を含む。

【0036】

本開示の一実施形態による可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、下の表２に記載のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。表２において、突然変異は太字／下線で示される。この例では、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＣＮＴＦ受容体と比較して、アミノ酸３４３～３７２のＣ末端トランケーションを含む。ある特定の態様において、そのような可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドはシグナルペプチドを含まない（表２において下線で示される）。

【表2】

【0037】

本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、後述の実験の項に示されるＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれか、ならびに図７、図８および図９のいずれかを含む（またはそれに対応する）。

【0038】

ある特定の実施形態によれば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸２３～３４２に対して７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、もしくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片、例えば、２５０～３１９アミノ酸、２５０～２６０アミノ酸、２６０～２７０アミノ酸、２７０～２８０アミノ酸、２８０～２９０アミノ酸、２９０～３００アミノ酸、３００～３１０アミノ酸、もしくは３１０～３１９アミノ酸の長さを有する断片を含む。可溶性であることに加えて、そのようなＣＮＴＦＲポリペプチドは、１つ以上のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方）に対する低下した結合親和性、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＬＣＦ１）に対する増加した結合親和性／特異性、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＮＴＦ、ＮＰ等）に対する低下した結合親和性、およびそれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の所望の特徴を含み得る。

【0039】

抗体
ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する薬剤は抗体である。「抗体（単数）」、「抗体（複数）」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、全抗体（例えば、重鎖および軽鎖ポリペプチドの２つの二量体で構成される四量体で構成される抗体）、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびダイアボディを含むが、これらに限定されないＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＬＣＦ１、ＮＰおよび／またはＣＮＴＦ）への特異的結合を保持する抗体の断片（例えば、全抗体または一本鎖抗体の断片）、キメラ抗体、ならびにヒト化抗体、例えば、ヒト化全抗体またはヒト化抗体断片を含む。

【0040】

「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ_１）を含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ_１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されているという点でＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元々は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた既知である。

【0041】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能となる。

【0042】

ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する抗体は、ＣＮＴＦまたはＮＰ１と比較して優先的にＣＬＣＦ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態によれば、ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する抗体は、ＣＬＣＦ１には特異的に結合するが、ＣＮＴＦまたはＮＰ１には結合しない。

【0043】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤の設計／開発および製造
１つ以上の所望の機能性を有する追加のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を設計／開発する方法もまた、本開示によって提供される。ＣＮＴＦＲリガンド結合剤が開発される様式は様々であり得る。合理的なコンビナトリアル手法が、新規特性、例えば、１つ以上のリガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニット（例えば、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方）に対する低下した結合親和性、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＬＣＦ１）に対する増加した結合親和性および／または特性、ＣＮＴＦＲリガンド（例えば、ＣＮＴＦ、ＮＰ等）に対する低下した結合親和性、ならびにそれらの任意の組み合わせを有するＣＮＴＦＲリガンド結合剤を設計するために用いられ得る。例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドまたは抗体を開発するために、ＣＮＴＦＲポリペプチドまたは抗体のライブラリーを作成し、例えば、細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、および／または他の好適なスクリーニング方法によってスクリーニングしてもよい。

【0044】

酵母表面ディスプレイは、新規の分子認識特性、増加した標的結合親和性、適切な折り畳み、および改善された安定性を有するタンパク質を設計するために使用されてきた強力なコンビナトリアル技術である。このプラットフォームでは、所望の生化学的および生物物理学的特性を有する変異体を単離するために、タンパク質変異体のライブラリーがハイスループット様式で製造およびスクリーニングされる。後述の実施例の項に示されるように、本発明者らは、酵母表面ディスプレイを用いて、望ましい様式でＣＬＣＦ１、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０に対する結合親和性を変化させたＣＮＴＦＲポリペプチドを設計することに成功した。酵母表面ディスプレイは、真核生物分泌経路、シャペロンの補助による折り畳み、および効率的なジスルフィド結合形成の品質管理機構から利益を得る。

【0045】

対象とする望ましい特性を有する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを開発するための１つの例示的な手法は、２つのジスルフィド結合によって酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに連結された酵母接合型凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐにＣＮＴＦＲポリペプチドを遺伝子的に融合することを含む。このＡｇａ２ｐ融合構築物、および染色体に組み込まれたＡｇａ１ｐ発現カセットは、ガラクトース誘導性プロモーター等の好適なプロモーターの制御下で発現させることができる。蛍光標識された一次または二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって細胞表面発現レベルを測定するために、Ｎ末端またはＣ末端のエピトープタグを含めることができる。この構築物は、ＣＮＴＦＲポリペプチド（または操作される他のタンパク質）のＮ末端がＡｇａ２に融合された、最も広く使用されているディスプレイフォーマットを表しているが、酵母表面ディスプレイプラスミドのいくつかの代替変形例が記載されており、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを開発するために用いられ得る。ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイで使用されるパニングに基づく方法に勝る、このスクリーニングプラットフォームの利点の１つは、２色ＦＡＣＳを用いて、特定の標的に対する結合親和性がわずか２倍程異なるクローンを定量的に識別できることである。

【0046】

ＣＮＴＦＲをＤＮＡレベルで選択的に突然変異させるための例示的な手法は、エラープローンＰＣＲであり、これは、プルーフリーディング（すなわち、エキソヌクレアーゼ）活性を有しないポリメラーゼの使用、ヌクレオシド類似体の三リン酸誘導体の混合物の使用、様々な比率のｄＮＴＰの使用、様々な濃度のマグネシウムまたはマンガンの濃度等を含む、任意の数の変化させた反応条件によって突然変異を誘発するために使用することができる。代替的に、例えば、オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いたオリゴヌクレオチドアセンブリによって、縮重コドンを導入することができる。次いで、酵母における相同組換えのために酵母ディスプレイベクターと十分に重複する隣接プライマーを用いて遺伝物質が増幅され得る。これらの方法により、比較的低コストおよび少ない労力でＣＮＴＦＲライブラリーを作製することが可能になる。ライブラリー組成に対する明確な制御を可能にする合成ライブラリーおよび最新の方法が開発されている。

【0047】

ある特定の態様において、ディスプレイライブラリー（例えば、酵母ディスプレイライブラリー）が、ＦＡＣＳによって対象とする標的（例えば、ＣＬＣＦ１等の対象とするＣＮＴＦＲリガンド）への結合についてスクリーニングされる。一方の蛍光標識をｃ－ｍｙｃエピトープタグを検出するために使用することができ、他方の蛍光標識を対象とする結合標的に対するＣＮＴＦＲポリペプチドの相互作用を測定するために使用することができる、２色ＦＡＣＳが用いられてもよい。単一細胞分解能で２つの蛍光体の励起および発光特性を測定するために、異なる機器レーザーおよび／またはフィルターセットを使用することができる。これにより、結合によって酵母の発現レベルを正規化することが可能になる。すなわち、低い酵母発現を示すが大量の標的に結合するＣＮＴＦＲポリペプチドを、高レベルで発現されるが標的に弱く結合するＣＮＴＦＲポリペプチドと区別することができる。したがって、結合対発現の二次元フローサイトメトリープロットでは、対角線上に標的抗原に結合する酵母細胞の集団が現れる。高親和性結合剤は、ライブラリー選別ゲートを用いて単離することができる。代替的に、最初の選別ラウンドにおいて、全長タンパク質を発現しない望ましくないクローンのライブラリーを除去することが有用であり得る。

【0048】

対象とするＣＮＴＦＲポリペプチドをコードするクローンについてのＣＮＴＦＲライブラリーの濃縮後、酵母プラスミドを回収して配列決定する。高い選別ストリンジェンシー下で、さらなるラウンドのＦＡＣＳを実施することができる。次いで、個々の酵母に提示されたＣＮＴＦＲクローンの結合親和性または動的解離速度を測定することができる。

【0049】

一旦、対象とするＣＮＴＦＲポリペプチドが表面ディスプレイ（例えば、酵母表面ディスプレイ）によって同定されると、好適な方法を用いて操作されたＣＮＴＦＲポリペプチドを製造することができる。ある特定の実施形態によれば、ＣＮＴＦＲポリペプチドは固相ペプチド合成によって製造される。ＣＮＴＦＲポリペプチド配列は、自動合成装置で固相ペプチド化学を用いて合成することができる。例えば、標準的な９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベースの固相ペプチド化学が用いられてもよい。固相合成の後に、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）による精製が行われてもよい。

【0050】

ある特定の態様において、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、組換えＤＮＡ手法を用いて製造される。様々な宿主細胞型において、組換え法を用いてＣＮＴＦＲポリペプチド等のタンパク質を製造するための戦略が開発されてきた。例えば、機能的な可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間における折り畳みを促進し、また有用な精製ハンドルとしての役割を果たすバルナーゼを遺伝子融合パートナーとして用いて製造されてもよい。ある特定の実施形態によれば、操作された可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、酵母（例えば、酵母菌株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）または哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）において発現される。発現構築物は、１つ以上のタグ（例えば、金属キレートクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ）による精製のためのＣ末端ヘキサヒスタジンタグ）をコードしてもよい。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、凝集物、誤って折り畳まれた多量体等を除去することができる。

【0051】

本開示の態様は、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤をコードする核酸を含む。すなわち、本明細書に記載のＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、本明細書に記載の任意の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、抗体等）のいずれかをコードする核酸が提供される。ある特定の態様において、そのような核酸は発現ベクター中に存在する。発現ベクターは、薬剤（例えば、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーターは、薬剤を発現するために選択された宿主細胞の種類に基づいて選択される。好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするための選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性等）を含む。

【0052】

本明細書に記載のＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、本明細書に記載の任意の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、抗体等）のいずれかをコードする核酸を含む宿主細胞、ならびにそれを含む任意の発現ベクターもまた提供される。Ｅ．ｃｏｌｉは、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤をコードする核酸をクローニングするために使用することができる原核生物宿主細胞の一例である。使用に好適な他の微生物宿主には、枯草菌等の桿菌、およびサルモネラ菌、セラチア、および種々のシュードモナス種等の他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主において、発現ベクターを作製することもでき、それは典型的には、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば複製起点）を含有するであろう。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β－ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系等の、任意の数の様々な周知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列を用いて発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列等を有するであろう。

【0053】

酵母等の他の微生物もまた、発現に有用である。酵母類（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキアは、必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列等を有する好適なベクターを含む好適な酵母宿主細胞の例である。典型的なプロモーターには、３－ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。

【0054】

微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、インビトロ細胞培養で増殖させた哺乳動物細胞）もまた、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を発現および産生するために使用され得る。好適な哺乳動物宿主細胞には、ヒト細胞系、非ヒト霊長類細胞系、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞系等が含まれる。好適な哺乳動物細胞系として、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー等の発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列等の必要なプロセシング情報部位を含み得る。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。

【0055】

一旦（化学的にまたは組換え的に）合成されると、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動等を含む、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って精製され得る。主題のＣＮＴＦＲリガンド結合剤は実質的に純粋であり得、例えば、少なくとも約８０％～８５％純粋、少なくとも約８５％～９０％純粋、少なくとも約９０％～９５％純粋、もしくは９８％～９９％、またはそれ以上純粋であり得、例えば、細胞片、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤以外の高分子等の混入質を含まない。

【0056】

融合タンパク質およびコンジュゲート
ある特定の態様において、異種部分と安定に会合した（例えば、融合した、結合した、または他の方法で付着した）ＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、本明細書に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドまたは抗体のいずれか）が提供される。

【0057】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドＣＮＴＦＲリガンド結合剤（例えば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドまたは抗体のいずれか）が異種ポリペプチドと融合している融合タンパク質が提供される。対象とする異種ポリペプチドとして、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトまたはマウスのＦｃドメイン）、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、異種ポリペプチドは、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤がそれを必要とする個体に投与されたときに、異種ポリペプチドと融合していない同じＣＮＴＦＲリガンド結合剤と比較して、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤の安定性および／または血清半減期を増加させる。ある特定の態様において、ヒトＦｃドメイン（例えば、全長ヒトＦｃドメインまたはその断片）と融合した本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態によれば、そのような融合タンパク質は、例えば、本開示の方法に従ってそれを必要とする個体（例えば、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有する個体）に投与する際に使用される。本開示の任意の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかと融合され得るヒトＦｃドメインの非限定的な例は、下の表３に記載される配列（配列番号３）を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインまたはその断片である。

【表3】

【0058】

ある特定の実施形態によれば、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を部分（moiety）に結合させたコンジュゲートが提供される。対象とする部分（moiety）として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗がん剤、検出可能な標識、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0059】

対象とする抗がん剤は、細胞増殖を阻害するおよび／またはがん細胞を死滅させる薬剤を含む。そのような薬剤は、様々であり得、細胞分裂阻害剤および細胞傷害性剤（例えば、標的細胞に内在化されることを伴ってまたは伴わずに標的細胞組織を死滅させることができる薬剤）を含み得る。ある特定の態様において、治療薬は、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、およびビンカアルカロイドから選択される細胞傷害性剤である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＣＰＴ－１１（ＳＮ－３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ－１、アウリスタチンＥもしくはアウリスタチンＦのような、アウリスタチンもしくは他のドラスタチン誘導体、ＡＥＢ（ＡＥＢ－０７１）、ＡＥＶＢ（５－ベンゾイルバレリン酸－ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体－エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エレウテロビン、ネットロプシン、またはこれらの任意の組み合わせである。ある特定の実施形態によれば、薬剤は、ＨＴＩ－２８６等のヘミアステリンおよびヘミアステリン類似体（例えば、参照によりそれらの全開示が本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７９，３２３号、ＷＯ２００４／０２６２９３号、および米国特許第８，１２９，４０７号を参照）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカニントキシン、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、α毒素、モーロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マーガトキシン、スロトキシン、スキラトキシン、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロトストラリン、オクラトキシンＡ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテシン、ゼアラレノン、およびテトラドラキシンから選択されるタンパク質毒素である。用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。

【0060】

検出可能な標識は、対象とする用途（例えば、インビトロおよび／またはインビボ研究および／または臨床用途）において検出され得る標識を含む。対象とする検出可能な標識は、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光タンパク質、常磁性原子等を含む。ある特定の態様において、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、検出可能な標識の特異的結合パートナーに結合される（例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能なラベルを介して検出が起こり得るようにビオチンに結合される）。

【0061】

ある特定の実施形態によれば、薬剤は、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法等のインビボイメージングで使用される標識剤であるそのような用途に使用される標識剤として、蛍光標識、放射性同位元素等が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、標識剤は、２つ以上のイメージング手法を用いてインビボイメージングを可能にするマルチモーダルインビボイメージング剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照）。

【0062】

ある特定の態様において、標識剤は近赤外（ＮＩＲ）イメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ ｄｙｅ、Ｐｚ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０および８００Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ５．５および７Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０および７５０Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ６８０および８００ＣＷ Ｆｌｕｏｒｓから選択される。ある特定の実施形態によれば、標識剤は、ＳＰＥＣＴイメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉｎ、^２０１Ｔｌ、および^１３３Ｘｅから選択される。ある特定の態様において、標識剤は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージング用途に使用されるインビボイメージング剤であり、該剤は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^１２４Ｉ、^７６Ｂｒ、^８２Ｒｂ、および^６８Ｇａから選択される。

【0063】

本開示の複合体に使用されるリンカーとしては、エステルリンカー、アミドリンカー、マレイミドまたはマレイミドベースのリンカー、バリン－シトルリンリンカー、ヒドラゾンリンカー、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）リンカー、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー、ビニルスルホンベースのリンカー、テトラエチレングリコールなどだが、これらに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカー、プロパン酸を含むリンカー、カプロレイン酸を含むリンカー、およびその任意の組み合わせを含むリンカーが挙げられる。

【0064】

リンカーを介して対象とする部分（moiety）にＣＮＴＦＲリガンド結合剤を連結するための多数の戦略が利用可能である。例えば、対象とする部分（moiety）は、リンカーを薬物に共有結合させることによって誘導体化することができ、リンカーはＣＮＴＦＲリガンド結合剤上の「化学的ハンドル」と反応することができる官能基を有する。リンカー上の官能基は様々であり得、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤上の化学的ハンドルとの適合性に基づいて選択され得る。一実施形態によれば、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤上の化学的ハンドルは、化学的ハンドルを有する非天然アミノ酸をＣＮＴＦＲリガンド結合剤に組み込むことによって提供される。そのような非天然アミノ酸は、例えば化学合成または組換え手法を介して（例えば、宿主細胞における翻訳中に非天然アミノ酸を組み込むために好適な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を使用して）ＣＮＴＦＲリガンド結合剤に組み込むことができる。

【0065】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤中に存在する非天然アミノ酸の官能基は、アジド、アルキン、アルケン、アミノオキシ、ヒドラジン、アルデヒド、ニトロン、ニトリルオキシド、シクロプロペン、ノルボルネン、イソシアニド、アリールハライド、ボロン酸、または他の好適な官能基であってもよく、リンカー上の官能基は、非天然アミノ酸の官能基と反応するように選択される（逆もまた同様である）。

【0066】

組成物
本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を含む組成物もまた提供される。組成物は、本明細書に記載の任意の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドおよび抗体を含む、本明細書に記載のＣＮＴＦＲリガンド結合剤のいずれかを含み得る。

【0067】

ある特定の態様において、組成物は、液体媒体中に存在する本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を含む。液体媒体は、水、緩衝溶液等の水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等が、そのような組成物中に存在してもよい。

【0068】

医薬組成物もまた提供される。医薬組成物は、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤のいずれか（例えば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドおよび抗体のいずれか）、および医薬的に許容される担体を含む。医薬組成物は、一般に、治療有効量のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を含む。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な投与量、例えば、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有する個体における細胞増殖の減少等の有益なまたは所望の治療（予防を含む）結果をもたらすのに十分な量を意味する。

【0069】

本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、治療的投与のために様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、適切な医薬的に許容される賦形剤または希釈剤との組み合わせによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤等の固体、半固体、液体、またはガス状形態の製剤に製剤化することができる。

【0070】

個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤の製剤は、概して無菌であり、検出可能な発熱物質、または選択された投与経路による個体への投与が禁忌である他の混入物をさらに含んでいない状態であり得る。

【0071】

医薬剤形において、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、単独で、または他の医薬的に活性な化合物との適切な会合において、および組み合わせにおいて投与することができる。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。

【0072】

経口製剤の場合、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン等の従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチン等の結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を用いて、また必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤を用いて、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作成するために、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤を単独でまたは適切な添加剤と組み合わせて使用することができる。

【0073】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒もしくは非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、また必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の従来の添加剤を用いて、注射用製剤に製剤化することができる。

【0074】

医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるべきである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と当量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の製造に抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。

【0075】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤の水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０、もしくは約５．０～約６．０の範囲、または代替的に約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適である緩衝液の例には、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、または約５ｍＭ～約５０ｍＭであり得る。

【0076】

使用方法
本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤および組成物を使用する方法もまた提供される。ある特定の実施形態によれば、治療有効量の本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み、リガンドへの薬剤の結合はＣＮＴＦＲへのリガンドの結合を阻害する、方法が提供される。ある特定の態様において、それを必要とする個体は、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有し、投与することは細胞増殖性疾患を治療するのに有効である。ある特定の態様において、細胞増殖性疾患はがんである。

【0077】

例えば、いくつかの実施形態において、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物は、該ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物が有効量で投与されたときに、宿主におけるがん細胞（複数可）の増殖、転移および／または浸潤を阻害する。「がん細胞」とは、例えば、異常な細胞増殖、異常な細胞増殖、密度依存性の増殖阻害の損失、足場非依存性の増殖能力、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍増殖および／もしくは発達、ならびに／または細胞形質転換の任意の適切な指標を促進することができる能力のうちの１つ以上によって特徴付けることができる、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「がん細胞」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「がん性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。

【0078】

本開示の方法を用いて治療することができるがんとして、固形腫瘍、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、および本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を用いて治療され得る任意の他の種類のがんが挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、単独で（例えば、単剤療法において）または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）投与され得る。

【0080】

いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤（またはそれを含む医薬組成物）の有効量は、単独で（例えば、単独療法において）または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）１回以上の用量で投与されたときに、個体における細胞増殖性障害（例えば、がん）の症状を、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を用いた治療が存在しない個体の症状と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上低減するのに有効な量である。

【0081】

ある特定の態様において、本開示の方法は、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物が有効量で投与されたときに、個体におけるがん細胞の増殖、転移および／または浸潤を阻害する。

【0082】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物は、インビボおよびエクスビボ法、ならびに全身および局所投与経路を含む、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与される。従来のおよび医薬的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、必要に応じて組み合わされてもよいか、またはＣＮＴＦＲリガンド結合剤および／もしくは所望の効果に応じて調節されてもよい。ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物は静脈内投与される。いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のために、または局所部位に、注射によって投与される。

【0083】

様々な個体が本方法に従って治療可能である。一般に、そのような対象は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱内の生物を説明するために広く使用されるいくつかの実施形態において、個体はヒトである。

【0084】

「治療すること」または「治療」とは、個体の細胞増殖性疾患（例えば、がん）に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、あるパラメータ、例えば、治療される細胞増殖性疾患に関連する症状の程度における少なくとも軽減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、個体が細胞増殖性疾患、または少なくとも細胞増殖性疾患を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制された、例えば、発生するのを防止された、または停止された、例えば、中止された状況も含む。

【0085】

投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法および反復率を決定することができる。最適な投与量は、個々のＣＮＴＦＲリガンド結合剤の相対効力に応じて様々であり得、一般にインビトロおよびインビボ動物モデル等において有効であることが分かっているＥＣ_５０に基づいて推定され得る。一般に、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回以上投与され得る。治療する医師は、測定された滞留時間、および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて、投与の繰り返し率を推定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を防止するために対象に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物が、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回以上、数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年１回、または任意の他の好適な頻度で投与される。

【0086】

本開示の治療方法は、単一の種類のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を対象に投与することを含んでもよいか、または異なるＣＮＴＦＲリガンド結合剤のカクテルを投与することによって２種類以上のＣＮＴＦＲリガンド結合剤を対象に投与することを含んでもよく、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤は、例えば、異なるＣＮＴＦＲリガンドに結合するように操作される。

【0087】

いくつかの実施形態において、この方法は、ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を投与する前に、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することを含む。ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することは、様々な手法およびそれらの組み合わせを用いて実施され得る。ある特定の態様において、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲリガンドの存在量に基づく。ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、ＮＰ等、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは以上であり得る。ある特定の態様において、試料は、がん関連線維芽細胞（正常肺線維芽細胞（ＮＬＦ）等のＣＡＦ）を含み、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することは、ＣＡＦにおけるＣＬＣＦ１発現のレベルに基づく。いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンドの存在量は、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、例えば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかを使用して定量化される。例えば、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として使用される可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、本明細書に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかであり得る。

【0088】

ある特定の実施形態によれば、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲの存在量および／またはＣＮＴＦＲ－ｇｐ１３０－ＬＩＦＲ三成分受容体複合体の存在量に基づく。ある特定の態様において、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルに基づく。ＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルは、１つ以上のＣＮＴＦＲシグナル伝達経路分子のリン酸化状態に基づき得る。例えば、本発明者らは、ＣＬＣＦ１へのＣＮＴＦＲの結合がＪａｋ－ＳＴＡＴおよびＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化をもたらすことを明らかにした。したがって、Ｊａｋ、ＳＴＡＴ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ等のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせの存在量、活性、リン酸化状態等を評価して、個体における異常なＣＮＴＦＲシグナル伝達を測定することができる。

【0089】

同定することは、任意の好適な手法を用いて定量化されるリガンド、ＣＮＴＦＲ分子、ＣＮＴＦＲ－ｇｐ１３０－ＬＩＦＲ三成分受容体複合体等に基づいてもよい。ある特定の実施形態によれば、同定することはイムノアッセイに基づく。ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーアッセイ、組織切片試料に対する免疫組織化学、組織切片試料に対する免疫蛍光、ウエスタン分析等を含む様々な好適なイムノアッセイフォーマットが利用可能である。

【0090】

いくつかの実施形態において、同定することは核酸配列決定に基づく。例えば、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する配列決定リードの数は、そのタンパク質の発現レベルを決定するために使用され得る。ある特定の態様において、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、および／またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ＩＩ配列決定システム）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ＧＳ ＦＬＸ＋および／またはＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）によって提供される配列決定プラットフォーム、または任意の他の対象とする配列決定プラットフォーム等の次世代配列決定システムを使用して行われる。組織または体液試料から核酸を単離するためのプロトコル、および所望の配列決定プラットフォームに適した配列決定アダプターを有する配列決定ライブラリーを調製するためのプロトコルが容易に利用可能である。

【0091】

いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することを含む方法は、個体から試料を得ることをさらに含む。

【0092】

ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することを含む方法もまた提供される。ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することは、様々な手法およびそれらの組み合わせを用いて実施され得る。ある特定の態様において、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲリガンドの存在量に基づく。ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、ＮＰ等、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは以上であり得る。ある特定の態様において、試料は、がん関連線維芽細胞（正常肺線維芽細胞（ＮＬＦ）等のＣＡＦ）を含み、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することは、ＣＡＦにおけるＣＬＣＦ１発現のレベルに基づく。いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンドの存在量は、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、例えば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかを使用して定量化される。例えば、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として使用される可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、本明細書に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかであり得る。ある特定の実施形態によれば、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲの存在量および／またはＣＮＴＦＲ－ｇｐ１３０－ＬＩＦＲ三成分受容体複合体の存在量に基づく。ある特定の態様において、同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルに基づく。ＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルは、１つ以上のＣＮＴＦＲシグナル伝達経路分子のリン酸化状態に基づき得る。例えば、本発明者らは、ＣＬＣＦ１へのＣＮＴＦＲの結合がＪａｋ－ＳＴＡＴおよびＲａｓ－Ｒａｆ－ＭＥＫ－ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化をもたらすことを明らかにした。したがって、Ｊａｋ、ＳＴＡＴ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫのいずれか、またはそれらの任意の組み合わせの存在量、活性、リン酸化状態等を評価して、個体における異常なＣＮＴＦＲシグナル伝達を測定することができる。同定することは、イムノアッセイ、核酸配列決定等を用いる等の任意の好適な手法を用いて定量化されるリガンド、ＣＮＴＦＲ分子、ＣＮＴＦＲ－ｇｐ１３０－ＬＩＦＲ三成分受容体複合体等に基づいてもよい。いくつかの実施形態において、方法は、個体から試料を得ることをさらに含む。

【0093】

個体から得られる試料は、個体がＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連した細胞増殖性疾患を有するかどうかを決定するのに好適な任意の試料であり得る。ある特定の態様において、試料は、全血、血清、血漿等の流体試料である。いくつかの実施形態において、試料は組織試料である。対象とする組織試料として腫瘍生検試料等が挙げられるが、これに限定されない。

【0094】

キット
キットもまた、本開示によって提供される。ある特定の実施形態によれば、キットは、治療有効量の本明細書に記載のＣＮＴＦＲリガンド結合剤のいずれか、または本明細書に記載の医薬組成物のいずれか、およびＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を、それを必要とする個体（例えば、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして同定された個体）に投与するための指示書を含む。ある特定の態様において、キットは、容器内に存在する、本開示のＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を含む。容器は、チューブ、バイアル等であり得る。ある特定の実施形態によれば、キットは、１、２またはそれ以上、３またはそれ以上、４またはそれ以上、５またはそれ以上等の単位用量等の１つ以上の単位用量で存在するＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を含む。

【0095】

キットの成分は、別々の容器内に存在してもよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。

【0096】

ＣＮＴＦＲリガンド結合剤または医薬組成物を個体に投与するための指示書は、好適な記録媒体に記録することができる。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。したがって、指示は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態において、指示は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の指示は、キットには存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、指示を閲覧することができ、かつ／または指示をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るための手段は、好適な基材上に記録される。

【0097】

いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤と、生物学的試料中に存在するＣＮＴＦＲリガンドの存在量を定量化するために捕捉剤を使用するための指示書と、を含む、キットが提供される。ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、ＮＰ等、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは以上であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＮＴＦＲリガンドの存在量は、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、例えば、本開示の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかを使用して定量化される。例えば、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として使用される可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、本明細書に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドのいずれかであり得る。

【0098】

以下の実施例は、限定ではなく、例示として提供される。

【実施例】

【0099】

序文
上皮細胞とその下にある間質との間の情報伝達は、重要であるが、あまり理解されていない有機体生物学の局面である。異常に調節されると、これらの相互作用が腫瘍形成性であることが分かり得る。がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）は、腫瘍の増殖を促進および維持することが知られているが、その根底にある機構は完全には理解されていない。本発明者らは、ＣＡＦが、腫瘍細胞上の毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）と結合して腫瘍増殖を促進するサイトカインであるカルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）を分泌する、新規情報伝達機構を同定した。

【0100】

可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、ＣＮＴＦＲシグナル伝達を減少させるための治療薬として用いることができ、野生型ＣＮＴＦＲと比較してＣＬＣＦ１に対してより高い結合親和性を有する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが望ましいという仮説を立てた。ＣＬＣＦ１に対してより高い結合親和性を有する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを操作するために、エラープローンＰＣＲによってＣＮＴＦＲに突然変異をランダムに導入した。得られたライブラリーは、サブセットがＣＬＣＦ１への結合を保持している酵母細胞表面上の融合タンパク質として提示された（図４、パネルＡに概略的に示される）。

【0101】

実施例１－機能的ＣＬＣＦ１の組換え発現
ＣＬＣＦ１を細菌発現プラスミドｐＥＴ２８ｂにクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ２（ＤＥ）３細胞に形質転換した。発現させると、組換えＣＬＣＦ１が封入体に蓄積し、それを５ｍＭ ＤＴＴを含有する６０％ｄｄＨ２Ｏ、４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに溶解した。逆相高速液体クロマトグラフィーを用いてＣＬＣＦ１を精製した。ヒト非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９をＣＬＣＦ１で処理すると、数分以内にＴｙｒ７０５におけるＳＴＡＴ３のリン酸化が誘導された（図２、パネルＡ）。ＳＴＡＴ３の活性化はまた、他の２つの細胞株Ｈ２３およびＨ３５８においても検出された（図２、パネルＢ）。これらの結果は、ＣＬＣＦ１がＳＴＡＴ３のＴｙｒ７０５のリン酸化の増加を引き起こすことを示している。

【0102】

実施例２－組換えＣＬＣＦ１は細胞生存を増加させる
サイトカイン媒介ＳＴＡＴ３活性化は、細胞をアポトーシスから保護することが示されている。ＣＬＣＦ１も細胞生存を増加させることができるかどうかを試験するために、２４時間の血清飢餓後に、Ａ５４９細胞をＣＬＣＦ１で処理した。７２時間のインキュベーション後、ＣＬＣＦ１は濃度依存的に細胞生存を増加させることが示された（図３、パネルＡ）。Ｈ２３細胞で試験した場合も同様に、より高いＣＬＣＦ１濃度は生存の増加をもたらした（図３、パネルＢ）。血清がアッセイに含まれた場合、ＣＬＣＦ１処理のそのような効果は見られなかったことから、その効果は、血清飢餓等のストレッサーによって誘発される条件においてより明白であることが示唆される。

【0103】

実施例３－酵母に提示されたＣＮＴＦＲは組換え発現させたＣＬＣＦ１に結合する
ＣＮＴＦＲの細胞外ドメインを酵母表面ディスプレイプラスミドｐＣＴＣＯＮ２にクローニングし、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００に形質転換した。このプラスミドは、酵母凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐへの遺伝子連結を介して酵母細胞表面上でのＣＮＴＦＲの発現を可能にする（図４、パネルＡ）。ＣＮＴＦＲは、Ｎ末端赤血球凝集素（ＨＡ）およびＣ末端ｃ－Ｍｙｃタグによって隣接され、それにより抗体標識およびフローサイトメトリー検出による全長タンパク質の検出が可能になる。二次抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定したところ、誘導した酵母は、５０％の発現パーセンテージを示し、２０ｎＭのＣＬＣＦとともにインキュベートした場合、発現集団の大部分が組換え発現させたＣＬＣＦ１と結合した（図４、パネルＢ）。

【0104】

実施例４－酵母に提示されたＣＮＴＦＲは、ＣＬＣＦ１、ｇｐ１３０、およびＬＩＦＲと三成分受容体複合体を形成する
前述のように、ＣＮＴＦＲ－ＣＬＣＦ１複合体は、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲに結合して三成分受容体複合体を形成する。したがって、完全に機能的なＣＮＴＦＲは、ＣＬＣＦ１とともにインキュベートした場合に、２つのβサブユニットに結合すると予想される。ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０の可溶性構築物を調製するために、細胞外ドメインを哺乳動物発現プラスミドＡｄｄ２にクローニングし、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３懸濁細胞にトランスフェクトした。精製を容易にするために、構築物をＨｉｓタグとマウスＩｇＧ２ａの融合物として調製した。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いてＨｉｓ標識構築物を精製し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてＦｃ融合構築物を精製した。酵母に提示されたＣＮＴＦＲをＬＩＦＲ－Ｆｃとともにインキュベートしたときに結合シグナルは検出されなかったが、このことは、ＣＬＣＦ１がないと、ＣＮＴＦＲがβ受容体に結合して下流のシグナル伝達経路を活性化しないことから予想された（図５、パネルＡおよびＢ）。しかしながら、ＣＬＣＦ１を添加するとＬＩＦＲ－Ｆｃ結合シグナル伝達が増加したことから、ＣＬＣＦ１の存在下で、ＣＮＴＦＲが実際にＬＩＦＲと相互作用することが示唆される（図５、パネルＣ）。酵母に提示されたＣＮＴＦＲをＣＬＣＦ１およびｇｐ１３０とともにインキュベートした場合、ＬＩＦＲ－Ｆｃ結合シグナルはさらに高く増加したことから、ｇｐ１３０がＬＩＦＲとＣＮＴＦＲとの結合にさらに寄与することが示唆される（図５、パネルＤおよびＥ）。

【0105】

以前のいくつかの研究は、ＣＮＴＦＲとベータ受容体との相互作用が特定の順序で起こり得ることを示唆している。例えば、ＣＮＴＦは、最初にＣＮＴＦＲに結合し、次いでｇｐ１３０を動員し、最後にＬＩＦＲと複合体を形成することが提案されている。上記の実験は、ＣＬＣＦ１が最初に結合する限り、ＬＩＦＲへのＣＮＴＦＲの結合がｇｐ１３０の非存在下で起こり得ることを示す。さらに、ＣＬＣＦ１なしでは、ｇｐ１３０－Ｆｃは酵母に提示されたＣＮＴＦＲへの検出可能な結合を示さなかった（図６、パネルＡおよびＢ）。ＣＬＣＦ１を添加するとｇｐ１３０－Ｆｃシグナルが有意に増加したことから、ｇｐ１３０がＬＩＦＲなしでＣＮＴＦＲに結合できることが示唆される（図６、パネルＣ）。ＬＩＦＲを添加すると、ｇｐ１３０結合シグナルがわずかに増加した。総合すると、図６に示される一連の結合実験は、ＬＩＦＲとｇｐ１３０との間にＣＮＴＦＲ－ＣＬＣＦ１への相乗的または相加的結合が存在することを示唆している（図６、パネルＤおよびＥ）。

【0106】

実施例５－酵母表面ディスプレイを用いたＣＮＴＦＲのＣＬＣＦ１への親和性成熟
エラープローンＰＣＲを用いてＣＮＴＦＲ（２０～３４２）の細胞外ドメインに突然変異をランダムに導入するタンパク質工学戦略を設計した。得られたライブラリーは、推定約１×１０^８個の形質転換体の多様性を有し、前述のように酵母細胞表面に融合タンパク質として提示された。平衡結合条件を用いてフローサイトメトリー選別（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングし、増加したＣＬＣＦ１結合を示す変異体についてライブラリーを濃縮し、所与の量のｃ－Ｍｙｃ発現について正規化した選別の各連続ラウンドにおいてライブラリーとともにインキュベートしたＣＬＣＦ１の濃度を減少させることにより、スクリーニングストリンジェンシーを付与した。ＦＡＣＳを用いた３ラウンドのスクリーニング後、異なるレベルのＣＬＣＦ１結合シグナルを有する３つの酵母集団が観察された。最も高い２つのＣＬＣＦ１結合集団においてコンセンサス変異が出現した：中間の親和性集団においてＴ１７４Ｐが観察された一方、最も高い親和性集団においてＳ２３７Ｆが観察された（図７および図８）。

【0107】

実施例６－高親和性ＣＬＣＦ１変異体を同定するためのシャッフルＣＮＴＦＲライブラリーのスクリーニング
濃縮されたコンセンサス変異にもかかわらず、選別されたライブラリーは、依然として実質的な多様性を含んでいた。２つのより高い結合集団において見出された突然変異の相加的効果を試験するために、クローンをＳｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＳｔＥＰ）法を用いてシャッフルした。このライブラリーに増加したストリンジェンシーを課すために、平衡結合と速度論的解離速度スクリーンの組み合わせを使用した。３ラウンドのスクリーニング後、４つの突然変異（Ｒ１１０Ｑ、Ｔ１７４Ｐ、Ｓ２３７Ｆ、およびＩ２８７Ｆ）の組み合わせが出現した（図９）。定性的酵母ディスプレイ結合試験は、これらの突然変異のそれぞれがＣＬＣＦ１に対する結合親和性に寄与していることを示唆し、したがって４つすべての突然変異を含むクローン（変異体４）をさらなる実験のために選択した（図１０、パネルＡおよびＢ）。興味深いことに、酵母はＣＮＴＦに結合した野生型ＣＮＴＦＲを提示したが、変異体４はＣＮＴＦに結合しなかったことから、定向進化の過程がＣＬＣＦ１に対する特異性の増加をもたらしたことが示唆される（図１０、パネルＣ）。変異体４は、ｈＣＬＣＦ１に加えて、依然としてｍＣＬＣＦ１にも結合した（図１０、パネルＤ）。

【0108】

実施例７－ＬＩＦＲへの結合減少についての親和性成熟ＣＮＴＦＲのネガティブスクリーニング
ＣＮＴＦＲのアミノ酸残基２６８および２６９におけるアラニン置換が、ＣＮＴＦＲとβ受容体との相互作用を減少させることが以前に示された。Ｔ２６８ＡおよびＤ２６９Ａが酵母細胞表面に提示されたＣＮＴＦＲに導入されたとき、我々は、これらの突然変異がｇｐ１３０に対する結合を減少させたが、ＬＩＦＲへの有意な結合が残っていたことを見出した（図１１）。したがって、ＣＮＴＦＲをさらに操作してＬＩＦＲに対するその結合を減少させるために、エラープローンＰＣＲを用いて別のランダム突然変異を図１０のパネルＢの変異体４に導入した。結果として得られたライブラリーを再び酵母に提示させたが、今度は、ＣＬＣＦ１の存在下でＬＩＦＲに対する結合シグナルが減少した集団についてスクリーニングした。ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を保持するために、ＣＬＣＦ１結合に対するポジティブ選択とＬＩＦＲに対するネガティブ選択とを交互に繰り返すことによってスクリーニングを行った（図１２）。６ラウンドの選別の後、２つのコンセンサス変異が出現した（Ｙ１７７ＨおよびＫ１７８Ｎ）（図１３、パネルＡ）。これらの突然変異はＬＩＦＲ結合の減少に相加的に寄与したため、両方の突然変異を有するクローン（ｅＣＮＴＦＲと命名）を、さらなる特徴付けのために選択した。ｅＣＮＴＦＲは、変異体４からの高親和性ＣＬＣＦ１結合を付与する４つの突然変異、およびＬＩＦＲへの結合を減少させる２つの新しい突然変異を含有する。

【0109】

実施例８－操作された可溶性ＣＮＴＦＲの特徴付け
ｅＣＮＴＦＲ変異体をＡｄｄ２哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、ＨｉｓタグおよびマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃに融合した可溶性構築物を生成した。野生型ＣＮＴＦＲ（ｗｔＣＮＴＦＲ）は、細胞培養液１リットル当たり８ミリグラムを産生し、ｅＣＮＴＦＲは、１リットル当たり４ミリグラムを産生した。可溶性ＣＮＴＦＲ構築物の結合親和性を測定するために、それらを最初にＣＬＣＦ１とともに室温で４時間インキュベートした。次いで、抗ｈｉｓ抗体または抗マウスＦｃ抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて複合体を捕捉した。ウサギ抗ＣＬＣＦ１一次抗体、続いてＨＲＰ標識抗ウサギ二次抗体を用いて、ＣＬＣＦ１と可溶性ＣＮＴＦＲとの結合相互作用を測定することができた。Ｈｉｓ標識およびＦｃ融合ｅＣＮＴＦＲの両方がＣＬＣＦ１に対してピコモルの結合親和性を示した（図１４、パネルＢ）。対照的に、ｗｔＣＮＴＦＲについては、ＣＬＣＦ１結合親和性が弱すぎたため定量化できなかった。同じ手法を用いて、β受容体との結合相互作用を特徴付けた。これらの実験において、両方の受容体に結合したｗｔＣＮＴＦＲとは異なり、ｅＣＮＴＦＲ－ＨｉｓおよびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは、ｇｐ１３０およびＬＩＦＲに対して検出可能な結合シグナルを示さなかった（図１３、パネルＢ）。これらの結果は、酵母に提示された構築物から観察された結果と一致していた。糸球体濾過を回避するために小タンパク質のサイズを大きくすると血清半減期が有意に増加し得るため、ＣＬＣＦ１阻害の下流効果を評価するために、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインに融合したｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを選択した。このＦｃ融合物はまた、インビボでの半減期延長のためにＦｃＲｎ媒介リサイクルから利益を得るであろう。

【0110】

例示的な可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド－Ｆｃ融合物（「ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ」－配列番号４）のアミノ酸配列を下の表４に記載する。この例では、配列番号２の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドが全長マウスＦｃ領域（表４において下線で示される）に融合されている。

【表4】

【0111】

実施例９－ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃはヒトＮＳＣＬＣ細胞においてＳＴＡＴ３活性化を阻害する
ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが効果的にＣＬＣＦ１を中和し、ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することができるかどうかを決定するために、我々は２つのヒトＮＳＣＬＣ細胞株、Ａ５４９およびＨ２３に対するその効果を試験した。可溶性ＣＮＴＦＲ構築物の存在下および非存在下で細胞をＣＬＣＦ１で刺激した。驚くべきことに、ｗｔＣＮＴＦＲ－ＦｃはＳＴＡＴ３のリン酸化（Ｔｙｒ７０５）を増加させたが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処理はＳＴＡＴ３のリン酸化を効果的に減少させた（図１５、パネルＡ）。さらに、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃとのインキュベーションは、Ａ５４９細胞およびＨ２３細胞の両方において血清飢餓状態におけるＣＬＣＦ１媒介細胞生存を阻害した（それぞれ図１５、パネルＢおよびＣ）。

【0112】

実施例１０－ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃはマウス異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を減少させる
次いで、我々は、ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがインビボでＣＬＣＦ１を隔離して腫瘍増殖を減少させる能力を保持するかどうかを試験した。腫瘍を持たないマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを単回投与し、捕捉剤としてｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡにより、異なる時点で血清中の未結合ＣＬＣＦ１の量を測定した。注射の６、１２、２４、３６、および４８時間後に血清試料を回収し分析した。血清ＣＬＣＦ１は注射されたｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによって急速に隔離されたが、４８時間後にはＣＬＣＦ１レベルが未処理のベースラインに近づいた（図１６、パネルＡ）。注射後６時間から開始して、測定されたｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃレベルは約４８時間の推定半減期で減少し、これは血清ＣＬＣＦ１の隔離と相関していた。

【0113】

ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃがインビボで腫瘍増殖に影響を及ぼし得るかどうかを試験するために、非小細胞肺癌の２つの異なるモデルをｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処理した。第１のモデルでは、各マウスの対向する２つの側腹部でＡ５４９細胞を皮下注射し、増殖させた。腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に成長した後、マウスに１０ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇ体重または生理食塩水対照を週２回、４週間注射した。両方の濃度のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによる処理は、生理食塩水対照と比較して処理の１７日後に腫瘍増殖を有意に減少させた（図１６、パネルＢおよびＣ）。

【0114】

Ｈ２３細胞を用いた異種移植片モデルを用いて、別の実験を同様の様式で行った。今回は、１０ｍｇ／ｋｇでのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処理をｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処理および生理食塩水対照と比較し、注射頻度を週３回、３９日間に増加させた。同様の結果が観察され、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは試験終了時までに腫瘍体積を有意に減少させ、一方ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃは腫瘍サイズをわずかに増加させるように見えたが、これらの結果は統計的に有意ではなかった（図１７）。

【0115】

実施例１１－操作されたＣＬＣＦ１トラップ（ｅＣＮＴＦＲ）における特異性
ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）は、ＣＮＴＦＲのリガンド結合モチーフをＣＬＣＦ１と共有するＣＮＴＦＲの別のリガンドである。ＣＮＴＦ媒介シグナル伝達は神経細胞の生存にとって重要であり、傷害によって誘導される細胞保護効果を有し得るため、ＣＮＴＦに勝るＣＬＣＦ１へのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの結合親和性は、ＣＮＴＦを阻害することによる副作用を予防するのに有利であり得る。組換え生成されたＣＮＴＦに対するｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの結合親和性をＥＬＩＳＡを用いて測定したとき、ｗｔＣＮＴＦＲ－ＦｃはＣＮＴＦに対して実質的な結合を示したが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは試験濃度においてＣＮＴＦに対するその親和性を失った。一方、ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃはマウスＣＬＣＦ１（ｍＣＬＣＦ１）に対して高い親和性を示したが、マウスＣＬＣＦ１はヒト細胞においてＳＴＡＴ３をリン酸化することができるため、これはインビボマウスモデル実験にとって非常に重要であり得る。データを図１８のパネルＡに示す。

【0116】

ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃが効果的にＣＬＣＦ１を中和し、ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することができるかどうかを決定するために、２つのヒトＮＳＣＬＣ細胞株、Ａ５４９およびＨ２３に対するその効果を試験した。可溶性ＣＮＴＦＲ構築物の存在下および非存在下で細胞をＣＬＣＦ１で刺激した。ｗｔＣＮＴＦＲ－ＦｃはＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）のリン酸化を増加させたが、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃは両方の細胞株においてリン酸化を効果的に減少させた。データを図１８のパネルＢに示す。

【0117】

実施例１２－ＣＬＣＦ１隔離およびｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃクリアランスの薬物動態
ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがインビボでＣＬＣＦ１を隔離する能力を保持するかどうかを試験するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンママウスにおける１０ｍｇ／ｋｇのｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの腹腔内（ｉｐ）投与後の血液クリアランスおよびＣＬＣＦ１隔離を定量化した。注射後に血清試料を回収し、捕捉剤としてｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを用いたＥＬＩＳＡにより、未結合ＣＬＣＦ１（四角）を測定した。ビヒクルで処理したマウスを用いてベースラインＣＬＣＦ１レベル（丸）を決定した。血中のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃレベルは、捕捉剤として抗Ｆｃ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより定量化した。血清ＣＬＣＦ１は注射されたｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃによって急速に隔離されたが、７２時間で、ＣＬＣＦ１レベルは未処理のベースラインに近づいた。（図１９、パネルＡ）。これらのデータは、ｅＣＮＴＦＲ－ＦｃがマウスＣＬＣＦ１に効果的に結合することを実証し、インビボでの有意な毒性はマウスにおいて観察できるはずであることを示唆するものである。

【0118】

実施例１３－ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃはインビボで腫瘍増殖を阻害する
インビボでｅＣＮＴＦＲの薬理学的効力を試験するために、ＮＳＣＬＣ細胞株を免疫不全マウスに移植した。原発腫瘍を約１００～１５０ｍｍ３のサイズまで成長させた。最初に、ビヒクル（ＰＢＳ）、野生型ＣＮＴＦＲ（ｗｔＣＮＴＦＲ－Ｆｃ）、低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ、および高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの４つの群のうちの１つにマウスを無作為化した（図２１、パネルＢ）。マウスに週２回、１８日間腹腔内（ｉｐ）注射した。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃの投与は用量依存性の腫瘍阻害を示した（図１９、パネルＢ～Ｄ）。第２のＮＳＣＬＣ細胞株においても同等の効果が観察された。

【0119】

増加する証拠は、ＰＤＴＸがヒト腫瘍生物学を忠実に再現し、治療に対する反応を予測することを示唆している。ヒトから外科的に切除された腫瘍のマウスへの直接移植によって得られたＰＤＴＸは、形態学的類似性を維持し、元の腫瘍の分子プロファイルを再現することが知られている。したがって、臨床的に関連する状況において我々の発見を検証するために、我々は、ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃを試験するためのＮＳＣＬＣ ＰＤＴＸモデルを生成した。１つのＬＵＡＤ ＰＤＴＸモデルは、腹腔内注射による週３回のｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃ処理により、３週間にわたって、または対照（ＰＢＳ）マウスが罹患の徴候を示すときまで、有意な腫瘍増殖阻害を示した（図１９、パネルＥ～Ｈ）。

【0120】

各異種移植片モデルにおいて、ｅＣＮＴＦＲに応答した増殖およびアポトーシスを、それぞれＰＨ３およびＣＣ３免疫染色によってアッセイした。ｅＣＮＴＦＲ－Ｆｃで処理した後、増殖の有意な減少およびアポトーシスの増加が観察された（図１９、パネルＩ）。パネルＩの左下および右下の棒グラフにおいて、ＰＢＳ、ＷＴ ＣＮＴＦＲ、ｅＣＮＴＦＲ（１ｍｇ／ｋｇ）、およびｅＣＮＴＦＲ（１０ｍｇ／ｋｇ）についての結果が左から右へ提供されている。総合すると、これらの結果は、腫瘍細胞におけるＣＬＣＦ１誘導シグナル伝達の混乱が、ｅＣＮＴＦＲを用いて効果的に達成され得ることを示唆している。

【0121】

実施例１５－肺癌におけるＣＬＣＦ１およびＣＮＴＦＲの発現
がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）はＣＬＣＦ１を発現し、インビボでこのサイトカインの供給源であり得るが、本発明の試験によりＮＳＣＬＣ細胞系もＣＬＣＦ１を分泌することが明らかされたことから、このサイトカインのパラ分泌シグナル伝達および自己分泌シグナル伝達の両方の存在が示唆される（図２０、パネルＡ）。ＣＬＣＦ１の受容体であるＣＮＴＦＲもまた、試験したすべてのＮＳＣＬＣ細胞株および患者由来異種移植片（ＰＤＴＸ）モデルで発現されることが明らかになった（図２０、パネルＢおよびＣ）。ＰＤＴＸモデルにおいて、およびＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐ５３ｆ／ｆ遺伝子操作マウスモデルに作製された腫瘍において、免疫組織化学によってＣＮＴＦＲの発現が観察された（図２０、パネルＤ）。総合すると、これらの結果は、ＣＬＣＦ１－ＣＮＴＦＲシグナル伝達軸が肺腺癌において活性であり、それが発がんにおいて、特に発がん性Ｋｒａｓによって駆動される腫瘍において役割を有し得ることを示唆する。

【0122】

添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の項目によっても定義される。
１．毛様体神経栄養因子受容体（ＣＮＴＦＲ）のリガンドに特異的に結合する薬剤と、
医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【0123】

２．ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する薬剤は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）、ニューロポエチン（ＮＰ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるリガンドに特異的に結合する、項目１に記載の医薬組成物。

【0124】

３．ＣＮＴＦＲのリガンドに特異的に結合する薬剤は、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである、項目１または項目２に記載の医薬組成物。

【0125】

４．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異を含む、項目３に記載の医薬組成物。

【0126】

５．リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、またはその両方である、項目４に記載の医薬組成物。

【0127】

６．リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、ＬＩＦＲである、項目５に記載の医薬組成物。

【0128】

７．ＬＩＦＲに対する結合親和性を低下させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置１７７、１７８、またはその両方に存在する、項目６に記載の医薬組成物。

【0129】

８．リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、ｇｐ１３０である、項目５に記載の医薬組成物。

【0130】

９．ｇｐ１３０に対する結合親和性を低下させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置２６８、２６９、またはその両方に存在する、項目８に記載の医薬組成物。

【0131】

１０．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメイン内に、溶解性を付与する突然変異を含む、項目３～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0132】

１１．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメイン内にトランケーションを含む、項目１０に記載の医薬組成物。

【0133】

１２．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインを欠いている、項目１０に記載の医薬組成物。

【0134】

１３．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＮＴＦＲリガンドに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる突然変異を含む、項目３～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0135】

１４．ＣＮＴＦＲリガンドは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）、ニューロポエチン（ＮＰ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１３に記載の医薬組成物。

【0136】

１５．ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＬＣＦ１である、項目１３に記載の医薬組成物。

【0137】

１６．ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を増加させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置１１０、１７４、２３７、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、項目１５に記載の医薬組成物。

【0138】

１７．薬剤は、抗体である、項目１または項目２に記載の医薬組成物。

【0139】

１８．薬剤は、異種ポリペプチドと融合したポリペプチドである、項目１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0140】

１９．異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、項目１８に記載の医薬組成物。

【0141】

２０．異種ポリペプチドは、Ｆｃドメインである、項目１９に記載の医薬組成物。

【0142】

２１．Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、項目２０に記載の医薬組成物。

【0143】

２２．薬剤は、部分（moiety）に結合している、項目１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0144】

２３．部分（moiety）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗がん剤、検出可能な標識、またはそれらの任意の組み合わせである、項目２２に記載の医薬組成物。

【0145】

２４．治療有効量の項目１～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物または項目５８～７４のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを、それを必要としている個体に投与することを含み、リガンドへの薬剤の結合は、ＣＮＴＦＲへのリガンドの結合を阻害する、方法。

【0146】

２５．前記それを必要とする個体は、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有し、前記投与することは、細胞増殖性疾患を治療するのに有効である、項目２４に記載の方法。

【0147】

２６．投与の前に、ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することをさらに含む、項目２４または項目２５に記載の方法。

【0148】

２７．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲリガンドの存在量に基づく、項目２６に記載の方法。

【0149】

２８．前記存在量は、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、ＮＰ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＣＮＴＦＲリガンドのものである、項目２７に記載の方法。

【0150】

２９．ＣＮＴＦＲリガンドの存在量は、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを使用して定量化される、項目２７または項目２８に記載の方法。

【0151】

３０．ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として使用される可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、項目５８～７４のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである、項目２９に記載の方法。

【0152】

３１．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲの存在量に基づく、項目２６に記載の方法。

【0153】

３２．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルに基づく、項目２６に記載の方法。

【0154】

３３．試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達を定量化することは、１つ以上のＣＮＴＦＲシグナル伝達経路分子のリン酸化状態を定量化することを含む、項目３２に記載の方法。

【0155】

３４．前記同定することは、イムノアッセイに基づく、項目２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【0156】

３５．前記同定することは、核酸配列決定に基づく、項目２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【0157】

３６．試料は、組織試料である、項目２７～３５のいずれか一項に記載の方法。

【0158】

３７．試料は、液体試料である、項目２７～３５のいずれか一項に記載の方法。

【0159】

３８．個体から試料を得ることをさらに含む、項目２７～３７のいずれか一項に記載の方法。

【0160】

３９．細胞増殖性疾患は、がんである、項目２５～３８項のいずれか一項に記載の方法。

【0161】

４０．がんは、肺癌である、項目３９に記載の方法。

【0162】

４１．肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目４０に記載の方法。

【0163】

４２．ＣＮＴＦＲシグナル伝達に関連する細胞増殖性疾患を有するとして個体を同定することを含む、方法。

【0164】

４３．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲリガンドの存在量に基づく、項目４２に記載の方法。

【0165】

４４．前記存在量は、ＣＮＴＦ、ＣＬＣＦ１、ＮＰ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＣＮＴＦＲリガンドのものである、項目４３に記載の方法。

【0166】

４５．ＣＮＴＦＲリガンドの存在量は、ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドを使用して定量化される、項目４２または項目４３に記載の方法。

【0167】

４６．ＣＮＴＦＲリガンド捕捉剤として使用される可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、項目５８～７４節のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドである、項目４５に記載の方法。

【0168】

４７．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲの存在量に基づく、項目４２に記載の方法。

【0169】

４８．前記同定することは、個体から得られた試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルに基づく、項目４２に記載の方法。

【0170】

４９．試料中のＣＮＴＦＲシグナル伝達のレベルは、１つ以上のＣＮＴＦＲシグナル伝達経路分子のリン酸化状態に基づいて決定される、項目４８に記載の方法。

【0171】

５０．前記同定することは、イムノアッセイに基づく、項目４２～４９のいずれか一項に記載の方法。

【0172】

５１．前記同定することは、核酸配列決定に基づく、項目４２～４９のいずれか一項に記載の方法。

【0173】

５２．試料は、組織試料である、項目４２～５１のいずれか一項に記載の方法。

【0174】

５３．試料は、液体試料である、項目４２～５１のいずれか一項に記載の方法。

【0175】

５４．個体から試料を得ることをさらに含む、項目４３～５３のいずれか一項に記載の方法。

【0176】

５５．細胞増殖性疾患は、がんである、項目４２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【0177】

５６．がんは、肺癌である、項目５５に記載の方法。

【0178】

５７．肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目５６に記載の方法。

【0179】

５８．野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異、
野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＮＴＦＲリガンドに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる突然変異、または
その両方、を含む、可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0180】

５９．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を低下させる突然変異を含み、リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）、またはその両方である、項目５８に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0181】

６０．リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、ＬＩＦＲである、項目５９に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0182】

６１．ＬＩＦＲに対する結合親和性を低下させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置１７７、１７８、またはその両方に存在する、項目６０に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0183】

６２．リガンド－ＣＮＴＦＲ複合体サブユニットは、ｇｐ１３０である、項目５９に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0184】

６３．ｇｐ１３０に対する結合親和性を低下させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置２６８、２６９、またはその両方に存在する、項目６２に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0185】

６４．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメイン内に、溶解性を付与する突然変異を含む、項目５８～６３項のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0186】

６５．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメイン内にトランケーションを含む、項目６４に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0187】

６６．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲを細胞膜に固定するドメインを欠いている、項目６４に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0188】

６７．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、野生型ＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して、ＣＮＴＦＲリガンドに対する可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドの結合親和性を増加させる突然変異を含む、項目５８～６６のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0189】

６８．ＣＮＴＦＲリガンドは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子１（ＣＬＣＦ１）、ニューロポエチン（ＮＰ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目６７に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0190】

６９．ＣＮＴＦＲリガンドは、ＣＬＣＦ１である、項目６７に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0191】

７０．ＣＬＣＦ１に対する結合親和性を増加させる突然変異は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドに対してアミノ酸位置１１０、１７４、２３７、２８７、またはそれらの任意の組み合わせに存在する、項目６９に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0192】

７１．可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドは、異種ポリペプチドと融合している、項目５８～７０のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0193】

７２．異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、項目７１に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0194】

７３．異種ポリペプチドは、Ｆｃドメインである、項目７１に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0195】

７４．Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、項目７３に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0196】

７５．項目５８～７４のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチドをコードする、核酸。

【0197】

７６．項目７５に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【0198】

７７．項目５８～７０のいずれか一項に記載の可溶性ＣＮＴＦＲポリペプチド、項目７５に記載の核酸、項目７６に記載の発現ベクター、またはそれらの任意の組み合わせを含む、宿主細胞。

【0199】

７８．宿主細胞は、原核細胞である、項目７７に記載の宿主細胞。

【0200】

７９．宿主細胞は、真核細胞である、項目７７に記載の宿主細胞。

【0201】

８０．真核細胞は、哺乳動物細胞である、項目７９に記載の宿主細胞。

【0202】

８１．哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、項目８０に記載の宿主細胞。

【0203】

８２．細胞表面ディスプレイタンパク質と融合したＣＮＴＦＲポリペプチドをコードする、核酸。

【0204】

８３．ＣＮＴＦＲポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＮＴＦＲポリペプチドと比較して１つ以上の突然変異を含む、項目８２に記載の核酸。

【0205】

８４．細胞表面ディスプレイタンパク質は、細菌表面ディスプレイタンパク質、ファージディスプレイタンパク質、および酵母ディスプレイタンパク質からなる群から選択される、項目８３に記載の核酸。

【0206】

８５．細胞表面ディスプレイタンパク質は、酵母ディスプレイタンパク質である、項目８４に記載の核酸。

【0207】

８６．酵母ディスプレイタンパク質は、Ａｇａ２ｐである、項目８５に記載の核酸。

【0208】

８７．項目８２～８６のいずれか一項に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【0209】

８８．項目８２～８６のいずれか一項に記載の核酸、または項目８７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【0210】

８９．項目８２～８６のいずれか一項に記載の核酸、または項目８７に記載の発現ベクターによってコードされる、ＣＮＴＦＲポリペプチド。

【0211】

このように、上記は、単に本開示の原理を説明しているに過ぎない。当業者であれば、たとえ本明細書に明示的に記載または図示されていなくても、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲内に含まれる種々の構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に記載された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を記載する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図19-5】

【図19-6】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【配列表】

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