知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-07
(45)【発行日】2023-04-17
(54)【発明の名称】ナットウキナーゼの製造菌株およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230410BHJP
C12N 9/56 20060101ALI20230410BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20230410BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20230410BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20230410BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N9/56
A61K35/741
A61P7/02
A61K38/48
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021540418
(86)(22)【出願日】2019-07-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-11
(86)【国際出願番号】 CN2019094334
(87)【国際公開番号】W WO2021000247
(87)【国際公開日】2021-01-07
【審査請求日】2021-07-12
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC 17895
(73)【特許権者】
【識別番号】521198619
【氏名又は名称】サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジエペン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥアン，リリ
(72)【発明者】
【氏名】ホン，リン
(72)【発明者】
【氏名】ジ，イェユ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ホングリュイ
(72)【発明者】
【氏名】カイ，チュンリ
(72)【発明者】
【氏名】フー，リウソン
(72)【発明者】
【氏名】シュー，ジカイ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ユファン
【審査官】中村 俊之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－０５９７０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第０１９２７３６５（ＥＰ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ａ６１Ｋ ３５／７４１
Ａ６１Ｐ ７／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５で中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託される納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｓ ｎａｔｔｏ）株。
【請求項2】
ナットウキナーゼ製品を製造する方法であって、請求項１に記載の納豆菌株を培地で培養することで、前記培地にナットウキナーゼを生成することを含む、前記方法。
【請求項3】
前記培地が炭素源物質と窒素源物質とを含み、且つ前記炭素源物質と前記窒素源物質との比が１０：１～１：２であり、前記炭素源物質が、グルコース、スクロース、マルトース、フルクトース、およびグリセロールからなる群から選択される１種または複数種であり、
前記窒素源物質が、酵母粉末、ペプトン、大豆粉、およびひよこ豆粉からなる群から選択される１種または複数種である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記培地が、さらに、微生物の増殖を促進してナットウキナーゼの収率を向上させる有機物、無機物、または有機物と無機物との混合物を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記有機物が、セリン、グリシン、およびアラニンからなる群から選択される１種または複数種である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記無機物が、マグネシウム塩またはナトリウム塩である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記無機物が、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
培養が、３５～４５℃で行われる、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
培養が、１０～４８時間続けられる、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
培養が、３７～４０℃で行われ、且つ１２～２４時間続けられる、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
発酵工程において炭素源物質または窒素源物質、或いは炭素源物質と窒素源物質との混合物を追加することを含む、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
（１）菌体と上清とを分離する固液分離工程と、（２）分子量範囲が１０００～５０，０００Ｄである限外ろ過膜で分離を行い、ナットウキナーゼ濃縮液を得る工程と、
（３）前記ナットウキナーゼ濃縮液の導電率が３００μｓ／ｃｍ以下となるように、１ｍｍｏｌ／Ｌの等張ＮａＣｌ溶液で洗浄を行う工程と、
（４）噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥である乾燥工程と、
をさらに含む、請求項２～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ステップ（２）において前記限外ろ過膜の分子量範囲が１０，０００～３０，０００Ｄであり、ステップ（３）において前記ナットウキナーゼ濃縮液の導電率が１００μｓ／ｃｍ以下となるようにする、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
固液分離が、セラミックス膜による分離または遠心分離により行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記乾燥工程に保護剤を添加し、前記保護剤が大豆タンパク質粉末、コラーゲンパウダー、食物繊維、微結晶セルロース、コーンスターチ、またはこれらの組成物である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記保護剤が５～２５％の大豆タンパク質粉末と２．５～１２．５％の食物繊維である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ナットウキナーゼ製品の活性が６５，０００～７５０，０００ＦＵ／ｇであり、４３６，０００～５，０２５，０００ＩＵ／ｇに相当する、請求項２～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記ナットウキナーゼ製品が血栓溶解用医薬品に用いられる、請求項２～１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は微生物発酵の分野に関するものには限られず、具体的に、本願はナットウキナーゼの製造菌株、およびナットウキナーゼ製品の製造方法に関するがこれに限られない。
【背景技術】
【0002】
ナットウキナーゼは、国際的に認められたヒト心脳血管疾患の予防、保健および治療に用いられる最も重要な活性分子の一つであり、納豆菌の発酵により生成された微量の活性物質である。長年に、食品、栄養補助食品および中国国内の保健用食品市場に広く応用されている。ナットウキナーゼの栄養補助食品の原料は国際国内市場の需要量が巨大である。
【0003】
現在、国際的な範囲内のナットウキナーゼは主として日本、中国台湾、米国で産出されている。日本産のナットウキナーゼは納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）の発酵納豆から抽出され、活性は１０，０００～２２，０００ＦＵ／ｇであり、６７，０００～１４７，４００ＩＵ／ｇに相当する。日本では、主に四つのメーカー、即ち、ナビオ社、バイオテクノロジー社、大和社、および本田社の子会社がナットウキナーゼを製造する。ナットウキナーゼの製造が最も早く、生産量が最も大きいのは、バイオテクノロジー会社であり、中国台湾および日本の大部分の市場を占める。大和会社で製造されたナットウキナーゼ粉末は、日本でも一定の市場シェアを占める。この２社のナットウキナーゼ原料は、自用されて外部に販売されない。バイオテクノロジー会社および大和会社が使用する技術は古く、製品の効果が単一であり、粘着物質の保護が欠け、失活しやすく、安定性に劣るが、コストが低い。本田社の子会社は基本的にバイオテクノロジー社と同じであり、ナットウキナーゼ特許を有する。日本ナビオ社はナットウキナーゼ製造の新進社であり、ナットウキナーゼ製品の活性は２２，０００ＦＵ／ｇに達し、１４７，４００ＩＵ／ｇに相当するが、価格が高い。中国台湾産のナットウキナーゼの技術は日本由来である。米国産のナットウキナーゼは麹菌発酵物から抽出され、製品に納豆菌およびビタミンＫ２などの粘性物質を含まず、「血栓溶解酵素」と呼ぶことができる。
【0004】
文献によると、納豆菌を利用して液体発酵を行い、ナットウキナーゼの収量は３，２３２ＩＵ／ｍｌ（４８２．４ＦＵ／ｍｌに相当）であることが報告されている（ＸＩＯＮＧ Ｑｉａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１２，１０（０４）：２６－２９．）。
【0005】
中国では、納豆産業が急速な発展段階にあり、新鮮な納豆および納豆抽出粉末を主な原料とする複合飲料、キャンディー、ビスケットおよび健康食品などの納豆系食品が消費のホットスポットとなっている。しかし、ナットウキナーゼが不安定であるため、精製過程が変性しやすく、現在ナットウキナーゼ純品を取得することは非常に困難である。現在中国および外国にはナットウキナーゼ純品またはその製剤がまだ販売されておらず、ナットウキナーゼの医薬品もない。したがって、本願の目的はナットウキナーゼを製造・精製する方法を提供することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
以下、本発明の概要について詳細に説明する。本概要は、特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【0007】
本願は、従来の技術の欠点を克服し、市場の需要を満たすために、ナットウキナーゼを生成することができる新たな菌種を提供することである。
【0008】
本出願人は長年にわたって鋭意研究し、市販の新鮮な納豆から納豆菌株を分離し、それを出発株として、新たな納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）ＳＴ１０８６を変異誘発し、該誘発菌株はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５で中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託され、アドレスは中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所であり、寄託日は２０１９年６月５日である。本出願人は市販の新鮮な納豆から菌株を分離し、ナットウキナーゼを生産する菌株ＳＴ１０２を得る。ＳＴ１０２菌株を出発株として、紫外線による変異誘発を行い、紫外線による変異誘発を５０世代行った後に形態変異株ＳＴ１０８６が得られ、ナットウキナーゼの生産量を１１倍向上させる。以上の形態変異およびナットウキナーゼの生産量は、数世代の継代培養により比較的安定している。
【0009】
本願による新たな菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５は、グラム陽性菌、芽胞間生、芽胞の大きさが０．６～０．８μｍ×１．０～１．５μｍ、菌体の幅が１μｍ、長さが２～３μｍという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーの表面が飽和し、しわがあり、白であり、突起し、糸引きでき、コロニー径が０．３～０．５ｃｍ、色素無し、菌体を１０時間培養して芽胞が発生する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本願の一態様では、本願の新たな菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５を使用してナットウキナーゼ製品を製造する方法を提供し、培地で本願の菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５を培養し、前記培地でナットウキナーゼを生成することを含む。培養は本分野の従来または既知の装置や条件下で行うことができ、例えば、振とうフラスコを用いて本分野の従来または既知の回転速度で行うことができ、通常の発酵タンク、例えば５Ｌ発酵タンク、５Ｔ発酵タンクで行うこともできる。
【0011】
いくつかの実施形態において、培地が炭素源物質と窒素源物質とを含み、前記炭素源物質と前記窒素源物質との比が１０：１～１：２である。いくつかの実施形態において、炭素源物質が、グルコース、スクロース、マルトース、フルクトース、およびグリセロールからなる群から選択される１種または複数種であり、窒素源物質が、酵母粉末、ペプトン、大豆粉、およびひよこ豆粉からなる群から選択される１種または複数種である。
【0012】
さらにいくつかの実施形態において、培地が、微生物の増殖を促進してナットウキナーゼの収率を向上させる有機物、無機物、または有機物と無機物との混合物を含む。いくつかの実施形態において、有機物が、セリン、グリシン、およびアラニンからなる群から選択される１種または複数種であり、無機物が、マグネシウム塩またはナトリウム塩である。好ましくは、無機物が、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムである。
【0013】
他の実施形態において、培養が、３５～４５℃で、好ましくは３７～４０℃で行われる。いくつかの実施形態において、培養が、１０～４８時間、好ましくは１２～２４時間続けられる。
【0014】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、発酵過程において炭素源物質または窒素源物質、或いは炭素源物質と窒素源物質との混合物を追加することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、（１）菌体と上清とを分離する固液分離工程と、（２）分子量範囲が好ましくは１，０００～５０，０００Ｄ、より好ましくは１０，０００～３０，０００Ｄである限外ろ過膜で分離を行い、ナットウキナーゼ濃縮液を得る工程と、（３）前記ナットウキナーゼ濃縮液の導電率が３００μｓ／ｃｍ以下、好ましくは２００μｓ／ｃｍ以下、より好ましくは１００μｓ／ｃｍ以下となるように、１ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液で洗浄を行う工程と、（４）好ましくは噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥である乾燥工程と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、固液分離が、本分野の従来または既知の固液分離により行われ、例えば、セラミック膜分離または遠心分離である。いくつかの実施形態において、乾燥工程に保護剤を添加し、前記保護剤は、好ましくは大豆タンパク質粉末、コラーゲンパウダー、食物繊維、微結晶セルロース、コーンスターチ、またはこれらの組成物であり、より好ましくは５～２５％の大豆タンパク質粉末と２．５～１２．５％の食物繊維である。
【0015】
いくつかの実施形態によれば、本願の方法により得られたナットウキナーゼ製品の活性は６５，０００～７５０，０００ＦＵ／ｇであり、４３６，０００～５，０２５，０００ＩＵ／ｇに相当する。
【0016】
別の態様では、本願は、本願の新たな菌株ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５から発酵培養された培養液でナットウキナーゼ製品を製造する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記方法は、
（１）例えば、セラミック膜分離、遠心分離の本分野の従来または既知の固液分離方法を用いて菌体と発酵上清とを分離する固液分離工程と、
（２）分子量範囲が好ましくは１，０００～５０，０００Ｄ、より好ましくは１０，０００～３０，０００Ｄである限外ろ過膜で分離を行い、ナットウキナーゼ濃縮液を得る工程と、
（３）前記ナットウキナーゼ濃縮液の導電率が３００μｓ／ｃｍ以下、好ましくは２００μｓ／ｃｍ以下、より好ましくは１００μｓ／ｃｍ以下となるように、等張塩溶液で洗浄を行う工程と、
（４）好ましくは噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥である乾燥工程と、
を含む。
（１）例えば、セラミック膜分離、遠心分離の本分野の従来または既知の固液分離方法を用いて菌体と発酵上清とを分離する固液分離工程と、
（２）分子量範囲が好ましくは１，０００～５０，０００Ｄ、より好ましくは１０，０００～３０，０００Ｄである限外ろ過膜で分離を行い、ナットウキナーゼ濃縮液を得る工程と、
（３）前記ナットウキナーゼ濃縮液の導電率が３００μｓ／ｃｍ以下、好ましくは２００μｓ／ｃｍ以下、より好ましくは１００μｓ／ｃｍ以下となるように、等張塩溶液で洗浄を行う工程と、
（４）好ましくは噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥である乾燥工程と、
を含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、乾燥過程に本分野の従来的または既知の保護剤を添加し、例えば大豆タンパク質粉末、コラーゲンパウダー、食物繊維、微結晶セルロース、コーンスターチ、またはこれらの組成物であり、好ましくは５～２５％の大豆タンパク質粉末と２．５～１２．５％の食物繊維である。
【発明の効果】
【0018】
本願の菌種ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５および本願の発酵方法を採用よれば、１６～２４時間の短期間、収量が１２，０００ＩＵ／ｍｌ（１，７９１．０ＦＵ／ｍｌに相当）に達し、最終的にナットウキナーゼ製品活性が６５，０００～７５０，０００ＦＵ／ｇであり、製剤プロセスの過程でより安定する。
【0019】
具体的な実施形態を読んで理解した後、他の態様を理解することができる。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、実施例により本願をさらに説明し、これらの説明は本願の内容をさらに限定するものではない。当業者であれば理解されるように、本願の技術的解決手段の精神および範囲から逸脱することなく、本願の技術的解決手段に対して修正または同等置換を行うことができ、いずれも本願の特許請求の範囲に含まれるべきである。
【0021】
本願において、ナットウキナーゼ活性は以下の方法により測定される。
【0022】
ナットウキナーゼ活性の測定方法１
【0023】
試験液
１． ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ、リン酸緩衝塩溶液）緩衝液：
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）：リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）３．５８ｇを秤量し、再蒸留水を加えて溶解させ、１０００ｍＬまで希釈してＩ液とした。リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）０．７８ｇを取り、再蒸留水を加えて溶解させ、５００ｍＬまで希釈してＩＩ液とした。約８４ｍＬのＩ液、約１６ｍＬのＩＩ液を取り、両者をｐＨが７．５になるまで混合した。
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）と０．９％塩化ナトリウム溶液（１：１７）を混合し、ＰＢＳ緩衝液を得た。
２． １．５％アガロース溶液：アガロース１．５ｇを取り、ＰＢＳ緩衝溶液１００ｍＬを添加し、加熱溶解し、５０℃の水浴中で保温した。
３． フィブリノゲン溶液：適量のフィブリノゲンを取り、ＰＢＳ緩衝溶液を添加して１ｍＬあたり１．５ｍｇの凝固可能なタンパク質溶液を含む溶液とした。
４． トロンビン溶液：トロンビンを取り、０．９％塩化ナトリウム溶液を添加して１ｍＬあたり１ＢＰ単位を含む溶液とした。
５． ウロキナーゼ標準品溶液の調製：
５．１ ウロキナーゼ標準溶液（１，０００ＩＵ／ｍＬ）：ウロキナーゼを１本取り、表示力価に従い、ＰＢＳ緩衝溶液を添加して溶解すれば、１，０００ＩＵ／ｍＬウロキナーゼ標準溶液となる。
５．２ ウロキナーゼ作動標準溶液の調製は、以下のとおりである。
１． ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ、リン酸緩衝塩溶液）緩衝液：
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）：リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）３．５８ｇを秤量し、再蒸留水を加えて溶解させ、１０００ｍＬまで希釈してＩ液とした。リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）０．７８ｇを取り、再蒸留水を加えて溶解させ、５００ｍＬまで希釈してＩＩ液とした。約８４ｍＬのＩ液、約１６ｍＬのＩＩ液を取り、両者をｐＨが７．５になるまで混合した。
０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）と０．９％塩化ナトリウム溶液（１：１７）を混合し、ＰＢＳ緩衝液を得た。
２． １．５％アガロース溶液：アガロース１．５ｇを取り、ＰＢＳ緩衝溶液１００ｍＬを添加し、加熱溶解し、５０℃の水浴中で保温した。
３． フィブリノゲン溶液：適量のフィブリノゲンを取り、ＰＢＳ緩衝溶液を添加して１ｍＬあたり１．５ｍｇの凝固可能なタンパク質溶液を含む溶液とした。
４． トロンビン溶液：トロンビンを取り、０．９％塩化ナトリウム溶液を添加して１ｍＬあたり１ＢＰ単位を含む溶液とした。
５． ウロキナーゼ標準品溶液の調製：
５．１ ウロキナーゼ標準溶液（１，０００ＩＵ／ｍＬ）：ウロキナーゼを１本取り、表示力価に従い、ＰＢＳ緩衝溶液を添加して溶解すれば、１，０００ＩＵ／ｍＬウロキナーゼ標準溶液となる。
５．２ ウロキナーゼ作動標準溶液の調製は、以下のとおりである。
【表1】
【0024】
プレートの調製
５０℃の水浴中で５ｍｉｎのフィブリノゲン溶液３９ｍＬを取り、ビーカーに入れ、撹拌しながら５０℃のアガロース溶液３９ｍＬ、トロンビン溶液３．０ｍＬを添加し、直ちに均一に混合し、１４ｃｍの培養皿に急速全量で入れ、室温で１時間水平に放置し、直径３ｍｍのステンレス鋼細管（穿孔器）を用いて、フィブリンプレートに複数の孔を穿孔する。
５０℃の水浴中で５ｍｉｎのフィブリノゲン溶液３９ｍＬを取り、ビーカーに入れ、撹拌しながら５０℃のアガロース溶液３９ｍＬ、トロンビン溶液３．０ｍＬを添加し、直ちに均一に混合し、１４ｃｍの培養皿に急速全量で入れ、室温で１時間水平に放置し、直径３ｍｍのステンレス鋼細管（穿孔器）を用いて、フィブリンプレートに複数の孔を穿孔する。
【0025】
測定
異なる濃度のウロキナーゼ標準品溶液を各１０μＬずつ精密に量り取り、それぞれ同一のアガロースフィブリンプレートにサンプリングし、蓋をし、３７℃の恒温箱に置いて１８時間反応させた。取り出して溶解直径を測定し、溶解面積を算出し、溶解面積対数を横座標、濃度の対数を縦座標として回帰曲線とし、対応する回帰式を得た。
異なる濃度のウロキナーゼ標準品溶液を各１０μＬずつ精密に量り取り、それぞれ同一のアガロースフィブリンプレートにサンプリングし、蓋をし、３７℃の恒温箱に置いて１８時間反応させた。取り出して溶解直径を測定し、溶解面積を算出し、溶解面積対数を横座標、濃度の対数を縦座標として回帰曲線とし、対応する回帰式を得た。
【0026】
予め推定されたナットウキナーゼ活性に基づき、ナットウキナーゼ試料をメスフラスコ中に精密に秤量し、適量のＰＢＳ緩衝溶液で溶解し、１５分間超音波処理した後に目盛りまで定容し、最終的なサンプリング濃度を２００～４００ＩＵ／ｍＬとした。ナットウキナーゼ試料溶液１０μＬを精密に秤量し、アガロースフィブリンプレートにサンプリングし、蓋をし、３７℃の恒温箱に置いて１８時間反応させ、取り出して溶解直径を測定し、溶解面積を算出し、試料の溶解面積を回帰式に代入し、試料溶液のナットウキナーゼ活性を算出した。
【0027】
ナットウキナーゼ活性の算出：
Ｘ＝Ｃ×Ｖ／Ｍ
ここで、Ｘは試料のナットウキナーゼ活性を示し、単位がＩＵ／ｇであり、
Ｃは回帰式により算出したローディング試料液中のナットウキナーゼ活性を示し、単位がＩＵ／ｍＬであり、
Ｖは試料希釈の全体積を示し、単位がｍＬであり、
Ｍは試料質量を示し、単位がｇである。
Ｘ＝Ｃ×Ｖ／Ｍ
ここで、Ｘは試料のナットウキナーゼ活性を示し、単位がＩＵ／ｇであり、
Ｃは回帰式により算出したローディング試料液中のナットウキナーゼ活性を示し、単位がＩＵ／ｍＬであり、
Ｖは試料希釈の全体積を示し、単位がｍＬであり、
Ｍは試料質量を示し、単位がｇである。
【0028】
ナットウキナーゼ活性の測定方法２
【0029】
ＦＵとしてのナットウキナーゼ活性は、以下のように定義される。
【数1】
【0030】
日本食品研究実験室のナットウキナーゼ活性解析方法（第１０４０２２６４０号）に基づいてナットウキナーゼ活性を解析した。
【0031】
酵素反応群
（１）試験管を取ってＰＢＳ緩衝液１．４ｍＬおよび０．７２％フィブリノゲン溶液０．４ｍＬを添加し、均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で５ｍｉｎ反応させた。
（２）上記試験管にさらに２０Ｕ／ｍＬトロンビン溶液０．１ｍＬを添加し、十分に均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で１０ｍｉｎ反応させた。
（３）工程（２）の溶液を正確に１０分間目反応させる際に、０．１ｍＬの試験試料溶液を正確に添加し、均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で６０分間酵素反応を行い、３０ｍｉｎおよび５０ｍｉｎに１回ずつ均一に振った。
（４）工程（２）の溶液を正確に６０ｍｉｎ目反応させる際に、０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍＬを添加して酵素反応を停止させ、３７±０．３℃の水浴中で２０ｍｉｎ反応させた。
（１）試験管を取ってＰＢＳ緩衝液１．４ｍＬおよび０．７２％フィブリノゲン溶液０．４ｍＬを添加し、均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で５ｍｉｎ反応させた。
（２）上記試験管にさらに２０Ｕ／ｍＬトロンビン溶液０．１ｍＬを添加し、十分に均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で１０ｍｉｎ反応させた。
（３）工程（２）の溶液を正確に１０分間目反応させる際に、０．１ｍＬの試験試料溶液を正確に添加し、均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で６０分間酵素反応を行い、３０ｍｉｎおよび５０ｍｉｎに１回ずつ均一に振った。
（４）工程（２）の溶液を正確に６０ｍｉｎ目反応させる際に、０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍＬを添加して酵素反応を停止させ、３７±０．３℃の水浴中で２０ｍｉｎ反応させた。
【0032】
陰性対照管
（１）酵素反応群の工程（１）および（２）と同様に、正確に１０分間目反応する際に、まず０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍＬを添加した。
（２）次に、試験試料溶液０．１ｍＬを添加し、十分に均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で２０ｍｉｎ反応させた。
（３）反応が終了した後、試験管を１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。
（４）清浄な試験管に上清を移し、陰性対照管とした。陰性対照管をブランクとし、２７５ｎｍで酵素反応群の吸光値（ＯＤ、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定し、記録した。
（１）酵素反応群の工程（１）および（２）と同様に、正確に１０分間目反応する際に、まず０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍＬを添加した。
（２）次に、試験試料溶液０．１ｍＬを添加し、十分に均一に混合し、３７±０．３℃の水浴中で２０ｍｉｎ反応させた。
（３）反応が終了した後、試験管を１２，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した。
（４）清浄な試験管に上清を移し、陰性対照管とした。陰性対照管をブランクとし、２７５ｎｍで酵素反応群の吸光値（ＯＤ、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定し、記録した。
【0033】
ナットウキナーゼの活性は、以下の方式で算出される。
ここで、Ｘは試料のナットウキナーゼ活性を示し、単位がＦＵ／ｇまたはＦＵ／ｍＬであり、
Ａｒは酵素反応群のＯＤ値を示し、
Ａｃは陰性対照群のＯＤ値を示し、
Ａｒ－Ａｃの数値は０．０５０～０．０８０の間にある必要があり、
６０は反応時間（ｍｉｎ）を示し、
０．１は試料体積（ｍＬ）を示す。
【数2】
Ａｒは酵素反応群のＯＤ値を示し、
Ａｃは陰性対照群のＯＤ値を示し、
Ａｒ－Ａｃの数値は０．０５０～０．０８０の間にある必要があり、
６０は反応時間（ｍｉｎ）を示し、
０．１は試料体積（ｍＬ）を示す。
【0034】
実施例１：ナットウキナーゼを生成する納豆菌を市販の納豆から分離する
納豆（日本バイオテクノロジー社から購入）を滅菌水で溶解し、希釈した後に固体ＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で２４時間恒温培養し、プレート表面に白色コロニーが成長し、接種用針でつついて糸引き現象がある。白色コロニーをＬＢ斜面培地に移し、３７℃で２４時間培養し、接種用ループで発酵培地（１００ｍｌの三角フラスコの充填量が２０ｍｌであり、培地の配合成分はグルコース２％、スクロース２％、大豆粉３％、硫酸マグネシウム０．０１％、塩化ナトリウム０．５％、セリン０．０８％である）に接種し、３７℃、２７０ｒｐｍで２０時間振とうし、遠心分離して上清を取り、アガロースフィブリンプレート法によりナットウキナーゼの含有量を測定し、溶解直径が大きい菌株を選抜し、最終的にナットウキナーゼを生成する納豆菌を同定した。
納豆（日本バイオテクノロジー社から購入）を滅菌水で溶解し、希釈した後に固体ＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で２４時間恒温培養し、プレート表面に白色コロニーが成長し、接種用針でつついて糸引き現象がある。白色コロニーをＬＢ斜面培地に移し、３７℃で２４時間培養し、接種用ループで発酵培地（１００ｍｌの三角フラスコの充填量が２０ｍｌであり、培地の配合成分はグルコース２％、スクロース２％、大豆粉３％、硫酸マグネシウム０．０１％、塩化ナトリウム０．５％、セリン０．０８％である）に接種し、３７℃、２７０ｒｐｍで２０時間振とうし、遠心分離して上清を取り、アガロースフィブリンプレート法によりナットウキナーゼの含有量を測定し、溶解直径が大きい菌株を選抜し、最終的にナットウキナーゼを生成する納豆菌を同定した。
【0035】
実施例２：ナットウキナーゼを生成する菌種の変異誘発
実施例１で得られた納豆菌を出発株として、紫外線による変異誘発を行う。紫外線波長が２００～３００ｎｍであり、照射距離が１５～３０ｃｍであり、照射時間が２０ｓであり、５０世代の変異誘発により変異株ＳＴ－１０８６を得た。該変異株ＳＴ－１０８６は、グラム陽性菌、芽胞間生、芽胞の大きさが０．６～０．８μｍ×１．０～１．５μｍであり、菌体の幅が１μｍであり、長さが２～３μｍであるという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーの表面が飽和し、しわがあり、白であり、突起し、糸引きでき、直径０．３～０．５ｃｍ、色素無し、菌体を１０時間培養して芽胞が発生した。該変異株ＳＴ－１０８６は中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託され、アドレスが中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、寄託日が２０１９年６月５日であり、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５である。
実施例１で得られた納豆菌を出発株として、紫外線による変異誘発を行う。紫外線波長が２００～３００ｎｍであり、照射距離が１５～３０ｃｍであり、照射時間が２０ｓであり、５０世代の変異誘発により変異株ＳＴ－１０８６を得た。該変異株ＳＴ－１０８６は、グラム陽性菌、芽胞間生、芽胞の大きさが０．６～０．８μｍ×１．０～１．５μｍであり、菌体の幅が１μｍであり、長さが２～３μｍであるという微生物学的特性を有する。ＬＢ寒天培地で、コロニーの表面が飽和し、しわがあり、白であり、突起し、糸引きでき、直径０．３～０．５ｃｍ、色素無し、菌体を１０時間培養して芽胞が発生した。該変異株ＳＴ－１０８６は中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託され、アドレスが中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、寄託日が２０１９年６月５日であり、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５である。
【0036】
実施例３：種子の調製
出発株と実施例２で得られたＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株をそれぞれ２０ｍｌ種子培地（表１参照）に接種し、３７～４０℃、１５０～３００ｒｐｍで培養箱を振とうして３～１６時間培養すれば、種子培養液が得られる。
出発株と実施例２で得られたＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株をそれぞれ２０ｍｌ種子培地（表１参照）に接種し、３７～４０℃、１５０～３００ｒｐｍで培養箱を振とうして３～１６時間培養すれば、種子培養液が得られる。
【0037】
【表2】
【0038】
実施例４：５Ｌ罐発酵
実施例３で得られた種子培養液を、接種量が発酵培地量の２０％を占めることで基礎培地（表２参照）に接種し、４０℃で培養し、３０分間培養した後にフィード培地への補給流加を開始し（表３参照）、半時間ごとにフィード培地２００ｍｌを添加し、１０．５時間まで続けられ、合計２Ｌフィード培地を補充した。培養過程でｐＨが自然であり、溶存酸素濃度は３０％以上に制御される。発酵サイクルは１７時間である。フィブリンプレート法によりナットウキナーゼの含有量を測定した。
実施例３で得られた種子培養液を、接種量が発酵培地量の２０％を占めることで基礎培地（表２参照）に接種し、４０℃で培養し、３０分間培養した後にフィード培地への補給流加を開始し（表３参照）、半時間ごとにフィード培地２００ｍｌを添加し、１０．５時間まで続けられ、合計２Ｌフィード培地を補充した。培養過程でｐＨが自然であり、溶存酸素濃度は３０％以上に制御される。発酵サイクルは１７時間である。フィブリンプレート法によりナットウキナーゼの含有量を測定した。
【0039】
【表3】
【0040】
【表4】
【0041】
出発株により本方法で得たナットウキナーゼ収量が８００ＩＵ／ｍｌ（１１９．４ＦＵ／ｍｌに相当）であり、得られた発酵液をセラミックス膜で固液分離し、得られた透析液を１０，０００Ｄ分子量の限外ろ過膜で濃縮し、濃縮液のナットウキナーゼ活性が７，０００ＩＵ／ｍｌ（１，０４４．８ＦＵ／ｍｌに相当）であり、ナットウキナーゼ濃縮液に１５％の大豆タンパク質粉末と５％の食物繊維（フランスのロケット社から購入、小麦由来の水溶性食物繊維）を加えて溶解した後、噴霧乾燥した。活性が１，５００ＦＵ／ｇ（１０，０５０ＩＵ／ｇに相当）である納豆粉を得た。
【0042】
本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ収量が７，５００ＩＵ／ｍｌ（１，１１９．４ＦＵ／ｍｌに相当）であり、得られた発酵液をセラミックス膜で固液分離し、得られた透析液を１０，０００Ｄ分子量の限外ろ過膜で濃縮し、濃縮液のナットウキナーゼ活性が１５０，０００ＩＵ／ｍｌ（２２，３８８．１ＦＵ／ｍｌに相当）であった。得られたナットウキナーゼ濃縮液は１２％の大豆タンパク質粉末と６％の食物繊維を加えて噴霧乾燥した。活性が５８，０００ＦＵ／ｇ（３９０，０００ＩＵ／ｇに相当）の納豆粉を得た。
【0043】
実施例５
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１２，０００ＩＵ／ｍｌ（１，７９１．０ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１２，０００ＩＵ／ｍｌ（１，７９１．０ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0044】
実施例６
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のグリシンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は９，０００ＩＵ／ｍｌ（１，３４３．３ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のグリシンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は９，０００ＩＵ／ｍｌ（１，３４３．３ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0045】
実施例７
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，０００ＩＵ／ｍｌ（１，４９２．５ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，０００ＩＵ／ｍｌ（１，４９２．５ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0046】
実施例８
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンおよび０．１６％のグリシンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，５００ＩＵ／ｍｌ（１，５６７．２ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンおよび０．１６％のグリシンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，５００ＩＵ／ｍｌ（１，５６７．２ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0047】
実施例９
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１１，０００ＩＵ／ｍｌ（１，６４１．８ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１１，０００ＩＵ／ｍｌ（１，６４１．８ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0048】
実施例１０
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のグリシンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は９，５００ＩＵ／ｍｌ（１，４１７．９ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のグリシンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は９，５００ＩＵ／ｍｌ（１，４１７．９ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0049】
実施例１１
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリン、０．１６％のグリシンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，３００ＩＵ／ｍｌ（１，５３７．３ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
実施例４との違いは、フィード培地には０．１６％のセリン、０．１６％のグリシンおよび０．１６％のアラニンを含むことである。本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼ発酵収量は１０，３００ＩＵ／ｍｌ（１，５３７．３ＦＵ／ｍｌに相当）であった。
【0050】
実施例１２
実施例４におけるＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５の発酵液を取り、孔径０．１μｍのセラミックス膜で固液分離し、菌体や培地等の固体粒子を除去し、ナットウキナーゼ含有液を得た。得られたナットウキナーゼ含有液は分画分子量１０，０００Ｄの限外ろ過膜でろ過されて濃縮され、ナットウキナーゼ濃縮液が得られた。得られたナットウキナーゼ濃縮液は３０％飽和度の硫酸アンモニウムで不純物を除去し、７０％飽和度の硫酸アンモニウムでナットウキナーゼを沈殿させ、一部の色素および多糖を除去し、ナットウキナーゼの沈殿を得た。ナットウキナーゼ濃縮液の沈殿をｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５フィラーで脱塩し、リン酸緩衝液で溶出し、ローディング試料量が２０％のＣＶ（カラム容積）で、流速が４０ｃｍ／ｈで、脱塩したナットウキナーゼ液を集め、脱塩後のナットウキナーゼ液はＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦフィラー（ＧＥから購入）で精製され、ローディング試料量が８０～１２０ｍｇ／ｍｌで、流速が１２０ｃｍ／ｈで、色素多糖部分の不純物タンパク質が除去されたナットウキナーゼ液を得た。色素多糖が除去された濃縮液を分子ふるいフィラーのｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でカラムクロマトグラフィを行い、残りの不純物タンパク質バンドを除去し、ローディング試料量が５％／ＣＶで、流速が２０ｃｍ／ｈで、ナットウキナーゼ単一バンド含有収集液を収集して取得した。単一バンドのナットウキナーゼの収集液を凍結乾燥機で凍結乾燥し、７，０００，０００ＦＵ／ｇ（４６，９００，０００ＩＵ／ｇに相当）のナットウキナーゼ純物粉末を得た。
実施例４におけるＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５の発酵液を取り、孔径０．１μｍのセラミックス膜で固液分離し、菌体や培地等の固体粒子を除去し、ナットウキナーゼ含有液を得た。得られたナットウキナーゼ含有液は分画分子量１０，０００Ｄの限外ろ過膜でろ過されて濃縮され、ナットウキナーゼ濃縮液が得られた。得られたナットウキナーゼ濃縮液は３０％飽和度の硫酸アンモニウムで不純物を除去し、７０％飽和度の硫酸アンモニウムでナットウキナーゼを沈殿させ、一部の色素および多糖を除去し、ナットウキナーゼの沈殿を得た。ナットウキナーゼ濃縮液の沈殿をｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５フィラーで脱塩し、リン酸緩衝液で溶出し、ローディング試料量が２０％のＣＶ（カラム容積）で、流速が４０ｃｍ／ｈで、脱塩したナットウキナーゼ液を集め、脱塩後のナットウキナーゼ液はＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦフィラー（ＧＥから購入）で精製され、ローディング試料量が８０～１２０ｍｇ／ｍｌで、流速が１２０ｃｍ／ｈで、色素多糖部分の不純物タンパク質が除去されたナットウキナーゼ液を得た。色素多糖が除去された濃縮液を分子ふるいフィラーのｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でカラムクロマトグラフィを行い、残りの不純物タンパク質バンドを除去し、ローディング試料量が５％／ＣＶで、流速が２０ｃｍ／ｈで、ナットウキナーゼ単一バンド含有収集液を収集して取得した。単一バンドのナットウキナーゼの収集液を凍結乾燥機で凍結乾燥し、７，０００，０００ＦＵ／ｇ（４６，９００，０００ＩＵ／ｇに相当）のナットウキナーゼ純物粉末を得た。
【0051】
【表5】
【0052】
実施例１３
本実施例は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼを文献の精製方法で精製することを目的とし、精製過程におけるナットウキナーゼ活性の変化状況を調べた。
本実施例は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株のナットウキナーゼを文献の精製方法で精製することを目的とし、精製過程におけるナットウキナーゼ活性の変化状況を調べた。
【0053】
実施例４におけるＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５の発酵液を取り、孔径０．１μｍのセラミックス膜で固液分離し、菌体や培地等の固体粒子を除去し、ナットウキナーゼ含有液を得た。得られたナットウキナーゼ含有液は分画分子量１０，０００Ｄの限外ろ過膜でろ過されて濃縮され、ナットウキナーゼ濃縮液７，０００ＩＵ／ｍｌが得られた。濃縮液は３０％飽和度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、６０％飽和度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、一部の色素および多糖を除去し、ナットウキナーゼの沈殿を得た。沈殿は、２Ｍ硫酸アンモニウム溶液で５％の溶液に溶解し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ疏水カラムでクロマトグラフィーを行い、ローディング試料量が２０～６０ｍｇ／ｍｌで、流速が６０ｃｍ／ｈで、２Ｍ～０Ｍの硫酸アンモニウム溶液で線形勾配による溶出を行い、２０倍カラム容積を溶出し、流速が１００ｃｍ／ｈで、溶出液を段階的に収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより溶出液のナットウキナーゼ純度を検出し、９５％純度のナットウキナーゼ純品を得た。クロマトグラフィーザ流出液をそのまま凍結乾燥し、５，０００，０００ＦＵ／ｇ（３３，５００，０００ＩＵ／ｇ）のナットウキナーゼ純品粉末を得た。
【0054】
【表6】
【0055】
実施例１４
実施例１２との違いは、実施例４における出発株の発酵液を取り、６，０００，０００ＦＵ／ｇ（４０，２００，０００ＩＵ／ｇに相当）のナットウキナーゼ純品粉末を得た。
実施例１２との違いは、実施例４における出発株の発酵液を取り、６，０００，０００ＦＵ／ｇ（４０，２００，０００ＩＵ／ｇに相当）のナットウキナーゼ純品粉末を得た。
【0056】
【表7】
【0057】
実施例１２、実施例１３の結果から、従来技術の方法に比べて、本願の精製方法によれば、ナットウキナーゼ純品の活性濃度を顕著に向上させることができることが分かった。
【0058】
実施例１２、実施例１４の結果から、出発株に比べて、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株によれば、ナットウキナーゼ活性濃度がより高い純品を得ることができることが分かった。
【0059】
実施例１５
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。導電率は導電率計により測定された。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には５％の微結晶セルロースと５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥した。噴霧乾燥条件については、入口空気温度２００℃、出口空気温度４５℃、ファン速度７０Ｒ／ｍｉｎ、供給速度４５Ｌ／ｈであり、乾燥收率が４５％であった。得られた納豆粉活性は１０１，０００ＦＵ／ｇ（６７８，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。導電率は導電率計により測定された。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には５％の微結晶セルロースと５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥した。噴霧乾燥条件については、入口空気温度２００℃、出口空気温度４５℃、ファン速度７０Ｒ／ｍｉｎ、供給速度４５Ｌ／ｈであり、乾燥收率が４５％であった。得られた納豆粉活性は１０１，０００ＦＵ／ｇ（６７８，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0060】
実施例１６
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液で洗浄することである。導電率は導電率計により測定された。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には５％の大豆タンパク質粉末と５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は８０％であった。得られた納豆粉活性は１８０，０００ＦＵ／ｇ（１，２０６，０００ＩＵ／ｇに相当）であった。大豆タンパク質粉末がタンパク質保護剤として、ナットウキナーゼの安定性を向上させることができる。微結晶セルロースは賦形剤のみであり、濃縮液の固溶量を高め、噴霧乾燥プロセスに有利である。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液で洗浄することである。導電率は導電率計により測定された。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には５％の大豆タンパク質粉末と５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は８０％であった。得られた納豆粉活性は１８０，０００ＦＵ／ｇ（１，２０６，０００ＩＵ／ｇに相当）であった。大豆タンパク質粉末がタンパク質保護剤として、ナットウキナーゼの安定性を向上させることができる。微結晶セルロースは賦形剤のみであり、濃縮液の固溶量を高め、噴霧乾燥プロセスに有利である。
【0061】
実施例１７
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が２００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９０％であった。得られた納豆粉活性は１２９，０００ＦＵ／ｇ（８６１，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が２００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９０％であった。得られた納豆粉活性は１２９，０００ＦＵ／ｇ（８６１，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0062】
実施例１８
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維と５％の微結晶セルロースとを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９８％であった。得られた納豆粉活性は１２４，０００ＦＵ／ｇ（８３２，０００ＩＵ／ｇに相当）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は３００，０００ＩＵ／ｍｌ（４５，０００ＦＵ／ｍｌに相当）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維と５％の微結晶セルロースとを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９８％であった。得られた納豆粉活性は１２４，０００ＦＵ／ｇ（８３２，０００ＩＵ／ｇに相当）であった。
【0063】
実施例１９
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２５０，０００ＩＵ／ｍｌ（３７，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には５％の大豆タンパク質粉末と５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は８０％であった。得られた納豆粉活性は１６４，０００ＦＵ／ｇ（１，１００，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が３００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２５０，０００ＩＵ／ｍｌ（３７，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には５％の大豆タンパク質粉末と５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は８０％であった。得られた納豆粉活性は１６４，０００ＦＵ／ｇ（１，１００，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0064】
実施例２０
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が２００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２４０，０００ＩＵ／ｍｌ（３６，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９０％であった。得られた納豆粉活性は１０８，０００ＦＵ／ｇ（７２４，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が２００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２４０，０００ＩＵ／ｍｌ（３６，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維とを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９０％であった。得られた納豆粉活性は１０８，０００ＦＵ／ｇ（７２４，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0065】
実施例２１
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２３０，０００ＩＵ／ｍｌ（３４，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維と５％の微結晶セルロースとを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９８％であった。得られた納豆粉活性は９７，０００ＦＵ／ｇ（６４７，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２３０，０００ＩＵ／ｍｌ（３４，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液には１５％の大豆タンパク質粉末と７．５％の食物繊維と５％の微結晶セルロースとを加えて噴霧乾燥し、乾燥收率は９８％であった。得られた納豆粉活性は９７，０００ＦＵ／ｇ（６４７，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0066】
実施例２２
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２３０，０００ＩＵ／ｍｌ（３４，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液を噴霧乾燥し、乾燥收率は５０％であった。得られた納豆粉活性は２１０，０００ＦＵ／ｇ（１，４２０，０００ＩＵ／ｇ）であった。
実施例５との違いは、本願のＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１７８９５株での発酵によって得られた発酵液を１０，０００Ｄの限外ろ過膜で濃縮した後、導電率が１００μｓ／ｃｍになるまで精製水で洗浄することである。得られたナットウキナーゼ濃縮液の活性は２３０，０００ＩＵ／ｍｌ（３４，０００ＦＵ／ｍｌ）であった。濃縮液を噴霧乾燥し、乾燥收率は５０％であった。得られた納豆粉活性は２１０，０００ＦＵ／ｇ（１，４２０，０００ＩＵ／ｇ）であった。
【0067】
実施例２３
実施例２２、実施例１５、実施例１６、実施例１７、実施例１８で得られた納豆粉を使用し、それぞれ打錠し、異なる副原料の製剤プロセスの過程への安定性を調べた。打錠プロセスについては、納豆粉に３０％の魚コラーゲン、１０％のマルトデキストリン、１０％の乳糖、３０％の微結晶セルロースを加え、原材料、副原料をそれぞれ８０メッシュの篩を通し、混合・造粒・打錠を行い、ナットウキナーゼの打錠前後の活性を測定することである。結果は以下の表に示す。
実施例２２、実施例１５、実施例１６、実施例１７、実施例１８で得られた納豆粉を使用し、それぞれ打錠し、異なる副原料の製剤プロセスの過程への安定性を調べた。打錠プロセスについては、納豆粉に３０％の魚コラーゲン、１０％のマルトデキストリン、１０％の乳糖、３０％の微結晶セルロースを加え、原材料、副原料をそれぞれ８０メッシュの篩を通し、混合・造粒・打錠を行い、ナットウキナーゼの打錠前後の活性を測定することである。結果は以下の表に示す。
【0068】
【表8】