特許 7261742 生体試料の抗酸化能を決定する方法および関連キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-12

(45)【発行日】2023-04-20

(54)【発明の名称】生体試料の抗酸化能を決定する方法および関連キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/52 20060101AFI20230413BHJP

   G01N 33/02 20060101ALI20230413BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20230413BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

G01N33/52 A

G01N33/02

G01N21/78 Z

G01N33/50 G

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2019543221

(86)(22)【出願日】2018-03-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-05-21

(86)【国際出願番号】 IB2018051813

(87)【国際公開番号】W WO2018172904

(87)【国際公開日】2018-09-27

【審査請求日】2021-03-18

(31)【優先権主張番号】102017000030715

(32)【優先日】2017-03-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】510121547

【氏名又は名称】フォンダツィオーネ・イスティトゥート・イタリアーノ・ディ・テクノロジャ

【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＺＩＯＮＥ ＩＳＴＩＴＵＴＯ ＩＴＡＬＩＡＮＯ ＤＩ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】マウロ・モリアネッティ

(72)【発明者】

【氏名】ピエル・パオロ・ポンパ

【審査官】白形 優依

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４２６７０２６（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４７７７１１７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０６１１１１３１（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表平０６－５０７２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１１－３３７５５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０５－０５２７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０３１５６５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００８－２０３０８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－２５７９０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－３１０６２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０２２７２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】FAN, S. et al.，Preparation of CO3O4/crumpled graphene microsphere as peroxidase mimetic for colorimetric assay of ascorbic acid，Biosensors and Bioelectronics，2016年10月01日，Vol.89，pp.846-852

【文献】ZHANG, X. et al.，Evaluation of the antioxidant activity of phenols and tannic acid determination with Mn3O4 nano-octahedrons as an oxidase mimic，Analytical Methods，2015年，Vol.7，pp.8640-8646

【文献】JIA, H. et al.，Peroxidase-like activity of the CO3O4 nanoparticles used for biodetection and evaluation of antioxidant behavior，Nanoscale，2016年02月16日，Vol.8，pp.5938-5945

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／００ － ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － ２１／９５８

Ｂ０１Ｊ ２３／００ － ２３／９６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液または食品の試料を(i)金属が白金である金属ナノ粒子の水溶液、(ii)酸化剤、および(iii)発色性ペルオキシダーゼ基質と接触させ、それによって得られた最終溶液の色の強度を検出するステップを含む、体液または食品の試料の抗酸化能を決定する方法であって、色の強度が、体液または食品の試料の抗酸化能を示す方法。

【請求項2】

金属が、金、パラジウムおよび/または銀と組み合わせた白金である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

発色性ペルオキシダーゼ基質が、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

酸化剤が、過酸化水素である、請求項１～３のいずれか1つに記載の方法。

【請求項5】

ナノ粒子が、0.1nm～1000nmの範囲で変化する直径を有する、請求項１～４のいずれか1つに記載の方法。

【請求項6】

最終溶液が、1～7のpH値を有する緩衝液中で調製される、請求項１～５のいずれか1つに記載の方法。

【請求項7】

最終溶液の色の強度が、肉眼で検出される、請求項１～６のいずれか1つに記載の方法。

【請求項8】

最終溶液の色の強度が、UV可視分光法によって検出される、請求項１～６のいずれか1つに記載の方法。

【請求項9】

最終溶液の色の強度が、60～700nmの波長で吸光度を測定することによって検出される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

体液が、唾液である、請求項１～９のいずれか1つに記載の方法。

【請求項11】

食品が、果汁または油である、請求項１～９のいずれか1つに記載の方法。

【請求項12】

発色性ペルオキシダーゼ基質および金属が白金である金属ナノ粒子の水溶液を含み、および酸化剤および／または緩衝液をさらに含む、体液または食品の試料の抗酸化能を決定するためのキットであって、
該発色性基質、ナノ粒子、酸化剤および任意の緩衝液が、請求項１～１０のいずれか1つに記載されている、キット。

【請求項13】

金属が、金、パラジウムおよび/または銀と組み合わせた白金である、請求項１２に記載のキット。

【請求項14】

・0.01～1000ppmの濃度での、所定量の金属が白金である金属ナノ粒子の水溶液；および
・0.001～1Mの濃度での、所定量の3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)の溶液；および
・0.1M～10Mの濃度での、所定量の過酸化水素；および／または
・0.01Mおよび1Mの濃度での、所定量の酢酸緩衝液；
を含む、請求項１２または１３に記載のキット。

【請求項15】

請求項１～１１のいずれか1つに記載の方法によって、対象からの体液試料の抗酸化能を決定することを含む、対象における酸化ストレスを評価するためのインビトロ方法であって、
参照試料または値と比較した、対象からの体液試料の抗酸化能の減少が、対象の酸化ストレスを示す、方法。

【請求項16】

対象が、アルコールを乱用するか、または不健康な食事をとっている、健康を害するライフスタイルを行っている疑いがあるか、または行っている、あるいは、対象が、腎障害、痛風、子宮内膜症、糖尿病および癌から選択される疾患に罹患している、または罹患している疑いがある、請求項１５に記載の、対象における酸化ストレスを評価するためのインビトロ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体試料の抗酸化能を決定するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

多くの科学的研究と疫学的調査が酸化ストレスを癌、腎障害、痛風、子宮内膜症、糖尿病などのさまざまな疾患に関連付けているため、酸化ストレスと、酸化防止剤を介してそれを調節する能力は科学界で多くの注目を集めている。

【0003】

これに関連して、唾液、および血液、汗、尿などの他の体液は重要な診断の可能性を有し、試料採取時の個人の生理学的状態を反映する。特に、唾液は、毛細血管を介した受動拡散によって唾液に運ばれた血清成分とともに、唾液腺によって生成された分子、および細胞によって放出された他の物質を含むことが知られている。

【0004】

これまでに、唾液やその他の体液の抗酸化状態と、重篤な病状の発症を結び付ける多くの文献がある。唾液と血液の酸化ストレス値が、強く相関していることも示されている。

【0005】

そのため、科学および医学界では、たとえば、総抗酸化能(TAC)など、身体の状態をモニターすることができるさまざまな唾液バイオマーカーに注目している。TACは、酵素および非酵素分子などの、酸化を調節できるすべての成分を含み、したがって、正味の抗酸化能を表すため、非常に興味深い。TACの変更は、双方向であり、特定の組織の酸化還元恒常性の全身的または特定の変化を示す。

【0006】

同時に、果物、野菜、お茶、コーヒー、ココアの摂取に起因する有益な効果が実際に抗酸化剤に起因すると考えられると仮定すると、食品における抗酸化剤が人間の健康において演じる役割に関心が高まっている。

【0007】

現在まで、臨床または食品分析のために、体液または食品の試料の抗酸化能を決定する主な方法は、合成手順によって生成されるフリーラジカルを減少させるか、特定の金属イオン(たとえば、銅、金、鉄)を減少させるか、蛍光性ラジカル分子をブロックするか、発色基質(たとえば：ABTS(2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)、DPPH(1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル)、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を修飾するか、または合成的に生成されたスーパーオキシドアニオンをブロックする、抗酸化剤の能力に基づいている。

【0008】

その総抗酸化能を評価できるようにするために、与えられた生物学的試料の総抗酸化能を測定できる新しい試験の開発に多くの注意が向けられてきた。しかしながら、使用可能な試験の種類が多すぎるため、異なるシステムで得られる結果の一貫性が失われ、結果として、結果の均一性とフラグメンテーションが失われる。多くの場合、複数の試験を使用して、試料の全体的な実際の抗酸化能を評価することも必要である。

【0009】

また、ポータブルデバイス、ポイントオブケアデバイス、およびエンドユーザーが実行可能なデバイスを通じて実施するのに役立つ試験が不足している。これらの特性を備えた試験は、主要な体液を通して生物の抗酸化能の連続的かつ効果的なモニタリングを可能にする。

【0010】

理想的な標準的方法は、以下の特徴のすべてを基本的に備えるべきである：
・試料を直接測定、精製ステップなし；
・シンプルで低コストである；
・明確な物理化学的操作メカニズムを持っている；
・特定の機器を必要としない；
・再現性と信頼性がある；
・周囲条件で安定している；
・親油性と親水性の両方の抗酸化剤を測定する；
・多数の試料に関する研究に使用可能。

【0011】

これまでに開発された方法は、水素原子移動(HAT)および単一電子移動(SAT)という2つの主要なカテゴリーに分類される。最初のカテゴリーに属する方法は、水素の提供を通じてフリーラジカルをブロックする抗酸化剤の能力を測定する。代わって、SAT法は、化合物が金属、カルボニル、ラジカルのいずれであっても、抗酸化剤が電子を移動して該化合物を還元する能力を測定する。

【0012】

最も一般的なHAT法は、次のとおりである：
・総ラジカル捕捉抗酸化パラメーター(TRAP)；
・酸素ラジカル吸収能；
・誘発されたLDL酸化の阻害；
・総オキシラジカル捕捉能アッセイ(TOSCA)。

【0013】

最も一般的なSET法は、次のとおりである：
・トロロックス等価抗酸化能(TEAC)アッセイ；
・鉄イオン還元抗酸化能(FRAP)アッセイ；
・銅イオン還元抗酸化能(CUPRAC)；
・酸化剤としてCu錯体を用いる総抗酸化能アッセイ；
・2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル(DPPH)捕捉；
・2,2-アジノビス3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸ラジカル(ABTS)捕捉アッセイ；
・N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミンラジカル(DMPD)捕捉アッセイ。

【0014】

上記の2つのカテゴリーに加えて、特定の生物学的関連酸化剤をブロックする特定の物質の能力を選択的に測定する方法もある。これらの中で最も重要なものは、過酸化水素捕捉アッセイ、スーパーオキシドアニオンラジカル捕捉アッセイ、およびヒドロキシルラジカル捕捉アッセイである。

【0015】

流体の抗酸化能を測定する新しい方法が近年登場しており、金ナノ粒子を比色センサーとして使用している。これらの方法は、金ナノ粒子への金イオンの還元に基づき、その結果、金属ナノ粒子の形成に関連する色が生成される。金ナノ粒子のサイズ、すなわち、それらの光学特性を大きくする抗酸化剤の特性も、抗酸化剤の検出方法として提案されている。

【0016】

もう1つの方法は、過酸化水素による金ナノ粒子の形成の阻害、溶液の染色不足をもたらす現象を使用する。金ナノ粒子およびそれらの光学特性にも基づく方法が、抗酸化剤を検出するためにさらに提案されており、これは、コロイド金ナノ粒子のクラスター化および結果として生じる溶液の色の変化に基づいている。

【0017】

食品中の抗酸化剤を検出するためのさらなる既知の方法は、セリウムナノ粒子を使用し、液相で食品と接触したときのナノ材料の色の変化に基づいている(米国特許第8,969,085号)。

【0018】

体液または食品の抗酸化能を測定するためのいくつかの既知の方法は、抗酸化剤酵素(たとえば、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼ)によって触媒される酸化還元反応に基づいている。しかしながら、後者は単離および精製のコストが高く、プロテアーゼ、pH、および温度に非常に敏感である。したがって、科学的関心は、効率的で選択的なカタラーゼおよびペルオキシダーゼ活性にとって理想的な、白金ナノ粒子を含むナノ酵素として指定される「人工酵素」を開発することである。

【0019】

プラチナナノ粒子は、シンプルで安価な合成および精製プロトコルによって得られ、安定しており、極端な温度およびpH条件下でも触媒活性を不変に維持し、プロテアーゼの作用に抵抗する。また、それらは、酸化剤としての過酸化水素の存在下で、生物学的ペルオキシダーゼよりもTMBに対して高い親和性をもって、発色性ペルオキシダーゼ基質(特に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB))を酸化することができる。

【0020】

近年、DNA、腫瘍細胞、金属イオン、ペニシリンベースの抗生物質、過酸化水素、グルコース、コレステロール、L-システイン、タンパク質および抗体の検出のために、白金ナノ粒子の使用に基づくいくつかの比色試験が開発された。

【0021】

プラチナナノ粒子の使用に基づく最初の生物学的アッセイは、白金ナノ粒子とアプタマーの複合体を触媒とする、ルミノールと過酸化水素の化学発光反応に基づくタンパク質検出システムを開発したGill、Rらによって10年以上前に提案された：Pt Nanoparticles Functionalized with Nucleic Acid Act as Catalytic Labels for the Chemiluminescent Detection of DNA and Proteins. Small 2、1037-1041、doi：10.1002/smll.200600133 (2006)。代わりに、抗RIgG抗体で機能化された不規則な形状のプラチナナノ粒子が、基質としてTMBとH2O2を使用する、ウサギIgGの比色定量のための酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)におけるペルオキシダーゼ代替物として提案されている(Gao、Z.ら、Irregular-shaped platinum nanoparticles as peroxidase mimics for highly efficient colorimetric immunoassay、Analytica chimica acta 776、79-86 (2013))。食品分野では、4-メルカプトフェニルボロン酸で官能化された金および白金ナノ粒子により促進されるTMB酸化メカニズムが、食品および水試料中の大腸菌を検出するための「肉眼」バイオセンサーの開発に適用された。

【0022】

臨床分野では、代わりに、磁性Fe3O4ナノ粒子とプラチナナノ粒子のナノハイブリッドシステムに関連付けられたTMB色素原が、酸化グラフェン表面に固定化されて使用され、乳がん細胞を比色定量的に同定した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0023】

しかしながら、現在利用可能なアッセイでは、特定の機器を使用せずに、ポイント・オブ・ケアで、肉眼測定により抗酸化能を評価することはできない。

【課題を解決するための手段】

【0024】

これらおよび他の必要性は、最新技術において説明されている技術と比較して、非常に短い時間(約5分)しか必要とせず、試料自体に存在する抗酸化剤による発色の阻害に基づいており、試料の前処理を必要とせず、非常に低コストである、体液または食品の試料の抗酸化能を決定する方法を提供する本発明によって満たされる。さらに、信号、すなわち色の検出を、肉眼で、したがって、その場で実行すること(ポイント・オブ・ケア)が可能であり、必ずしも特定の機器を使用する必要はない。

【0025】

本発明の方法は、添付の請求項１に定義されている通りである。本発明の範囲には、本発明の方法を実施するのに適した、添付の請求項１１で定義されるキットも含まれる。

【0026】

さらなる特徴および利点は、従属項にて定義される。

【0027】

特許請求の範囲は、本明細書の不可欠な部分を形成する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図1は、健康なボランティアから得られた100個の唾液試料で試験を実行し、UV-Vis分光法(652nmでの吸光度の測定)で検出を行うことによって得られた結果を示す。0.1未満の吸光度値は、栄養補助食品(ビタミンC)の摂取後に得られた唾液試料に対応する。

【図2】分光法の代替として、参照カラースケール(異なる色強度バンドおよび関連する抗酸化剤スコアを示す)を使用して、肉眼で検出を実行することができる(たとえば、「優秀」、「中高」、「標準」、「中低」、「低」、図2参照)。

【図3】上述したように、本発明の方法は、果汁などの食品試料の分析にも使用できる。図3は、果汁およびその他の工業的飲料の食品試料を試験し、UV-Vis分光法(652nmでの吸光度の測定)で検出を行うことによって得られた結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明の方法において、白金ナノ粒子は触媒機能を果たす。完全に白金で作られたナノ粒子の代替として、白金ベースのナノ粒子は、金、パラジウムおよび／または銀などの別の金属と組み合わせて使用されうる。

【0030】

酸化反応の基質は、好ましくは色素原TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)である。過酸化水素は通常、酸化剤として使用される。

【0031】

本発明の方法は、検査中の試料中の抗酸化剤物質が過酸化水素と相互作用し、TMB酸化反応の部分的または完全な阻害を引き起こすという事実に基づく。結果は、知られているように、TMB発色基質の酸化により形成される青色の発色がそれほど強くなくなる。観察可能な過酸化水素によるTMBの酸化の減少は、抗酸化剤物質の量に直接比例するため、試験中の試料中の抗酸化剤の濃度を比色定量するために使用することができる。この反応スキームは、予備精製ステップを必要とせずに試料の総抗酸化能を測定できるため、特に効果的かつ特異的である。

【0032】

本発明のアッセイ方法は、唾液、血液、汗、または尿などのいくつかの体液に適用することができる。また、果汁や食用油などの液体食品にも適用できる。油の場合、最初に試料をメタノールとイソプロパノールの溶液と混合し、その後、上記の試薬を加えますが、分離や精製の必要はない。

【0033】

以下の例は、例示のみを目的として提供されており、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0034】

以下のアッセイを行う：
・一般的に0.01～1M、好ましくは0.05～0.3Mの酢酸緩衝液400マイクロリットルを試験管に加えた；pHは1～7、好ましくは3～5.5の間で変化することができる；
・200マイクロリットルのTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液を0～1M、好ましくは0.002～0.05Mの濃度で添加した；
・白金ナノ粒子を含む100マイクロリットルの溶液を、0.01～1000ppm、好ましくは0.1～10ppmの白金濃度で加えた；ナノ粒子の直径は0.1nm～1000nm、好ましくは1～100nmの範囲で変化することができる；
・1：2～1：500の間、好ましくは1：2～1：100の間の倍数で水溶液により事前に希釈された、100マイクロリットルの試験される試料を加えた；試料が油の形態であるならば、最初にメタノールとイソプロパノールの溶液と混合する；
・発色反応(青)は、200マイクロリットルの1M過酸化水素溶液の添加により開始された。

【図1】

【図2】

【図3】