特許 7261795 ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-12

(45)【発行日】2023-04-20

(54)【発明の名称】ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/62 20220101AFI20230413BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20230413BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230413BHJP

【ＦＩ】

C12P7/62

C12N1/00 S

C12N1/20 A

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020522177

(86)(22)【出願日】2019-05-27

(86)【国際出願番号】 JP2019020884

(87)【国際公開番号】W WO2019230644

(87)【国際公開日】2019-12-05

【審査請求日】2022-03-24

(31)【優先権主張番号】P 2018103862

(32)【優先日】2018-05-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】猪狩 尊史

(72)【発明者】

【氏名】リー・ワンイン

(72)【発明者】

【氏名】小林 新吾

【審査官】千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－６３２３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１７０７９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００４－１４３１５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Journal of Oil Palm Research, 2016, Vol. 28, No. 1, pp. 52-63

【文献】Lipid Technology, 2010, Vol. 22, No. 1, pp. 11-13

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ、Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対し、蒸留処理を施して、下記要件（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を満足する遊離脂肪酸画分を得る工程（ａ）と、
前記遊離脂肪酸画分を含む培養液中でポリヒドロキシアルカン酸産生微生物を培養する工程（ｂ）と、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
（ｉ）スクワレンの含有量が０．０５重量％以下
（ｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対するトリメチルインデンのピーク面積の比が１１０以下
（ｉｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対する酪酸のピーク面積の比が１０未満

【請求項2】

前記遊離脂肪酸画分が、さらに、下記要件（ｉｖ）及び（ｖ）を満足する、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
（ｉｖ）ビタミンＥの含有量が０．０１重量％未満
（ｖ）β－カロテンの含有量が０．００１ｍｇ／Ｌ以下

【請求項3】

前記廃液が、アブラヤシの果実から粗パーム油を得る過程で排出される廃液（ＰＯＭＥ）である、請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項4】

前記副産物が、粗パーム油からＲＢＤパーム油を得る過程で得られる副産物（ＰＦＡＤ）である、請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項5】

前記副産物が、アブラヤシの空果房から空果房ペレットを得る過程で得られる副産物（ＥＦＢジュース）であり、
工程（ａ）において、当該ＥＦＢジュースの加水分解物に対し、蒸留処理を施す、請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項6】

前記蒸留処理は、
（i）前記遊離脂肪酸含有物を０．６～１．６Ｔｏｒｒ、１７５～１８５℃の条件で蒸留して、塔底留分と塔頂留分とに分離し、次いで、
（ii）前記塔底留分を０．６～１．６Ｔｏｒｒ、１９０～２００℃の条件で蒸留して、塔頂留分として前記遊離脂肪酸画分を得る
処理である、請求項１～５のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項7】

パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対し、蒸留処理を施して、下記要件（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を満足する遊離脂肪酸画分を得る工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸産生微生物培養用炭素源の製造方法。
（ｉ）スクワレンの含有量が０．０５重量％以下
（ｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対するトリメチルインデンのピーク面積の比が１１０以下
（ｉｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対する酪酸のピーク面積の比が１０未満

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸産生微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ポリヒドロキシアルカン酸（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ；以下、「ＰＨＡ」と略する場合がある）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになる。したがって、ＰＨＡは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチックであると言える。

【0003】

ＰＨＡの製造には、ＰＨＡ産生能力を有する微生物を培養して当該微生物からＰＨＡを取り出す方法が行なわれているが、その培養の際には、当該微生物によって好適に資化される炭素源を与えることが必要となる。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂、遊離脂肪酸などが挙げられる。

【0004】

例えば、特許文献１では、植物由来の遊離脂肪酸を利用してＰＨＡ産生微生物を培養し、ＰＨＡを製造する方法が記載されている。

【0005】

また、特許文献２では、より安価な植物油廃液を炭素源として利用して水素細菌によりＰＨＡを製造する方法が記載されている。

【0006】

特許文献３では、パーム油製造時の蒸留工程で残留した残渣油など、着色が強い油脂に対し、過酸化水素での加熱処理を施した後、これを炭素源として微生物を培養することで、ＰＨＡを製造する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】国際公開第２０１４／０４２０７６号

【文献】特開２０００－１８９１８３号公報

【文献】国際公開第２０１６／１７０７９７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物は、一般的な植物油脂であるパーム油よりも安価に入手可能であることに加えて、食料と競合しない非可食原料源であって、環境面においても優位である。そこで、これらを、ＰＨＡ産生微生物を培養する際に使用する炭素源として利用することを検討したところ、ＰＨＡ生産速度が著しく低かったり、あるいは、得られるＰＨＡが臭気や、好ましくない色を帯びていたりする欠点があることが判明した。

【0009】

本発明は、以上に鑑み、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物を利用してポリヒドロキシアルカン酸産生微生物を培養し、臭気が抑制されたポリヒドロキシアルカン酸を生産性よく製造することが可能な、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法、及び、ポリヒドロキシアルカン酸産生微生物培養用炭素源の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物には、ＰＨＡ産生微生物の生育を阻害し得る成分が含まれており、その阻害成分がスクワレンであることを特定した。さらに、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物には臭気成分が含まれており、その臭気成分としてトリメチルインデンと酪酸を同定した。そして、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物又はその加水分解物を蒸留工程に付することで、スクワレン、ビタミンＥ、β－カロテン、トリメチルインデン、及び酪酸それぞれの含量を低減した遊離脂肪酸画分を得ることができ、このような遊離脂肪酸画分を炭素源として用いてＰＨＡ産生微生物を培養することで、臭気が抑制されたＰＨＡを生産性よく製造することが可能になることを見出した。

【0011】

すなわち本発明は、パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対し、蒸留処理を施して、下記要件（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を満足する遊離脂肪酸画分を得る工程（ａ）と、前記遊離脂肪酸画分を含む培養液中でポリヒドロキシアルカン酸産生微生物を培養する工程（ｂ）と、を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
（ｉ）スクワレンの含有量が０．０５重量％以下
（ｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対するトリメチルインデンのピーク面積の比が１１０以下
（ｉｉｉ）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対する酪酸のピーク面積の比が１０未満。

【0012】

好ましくは、前記遊離脂肪酸画分が、さらに、下記要件（ｉｖ）及び（ｖ）を満足する。
（ｉｖ）ビタミンＥの含有量が０．０１重量％未満
（ｖ）β－カロテンの含有量が０．００１ｍｇ／Ｌ以下。

【0013】

前記廃液が、アブラヤシの果実から粗パーム油を得る過程で排出される廃液（ＰＯＭＥ）であってよい。前記副産物が、粗パーム油からＲＢＤパーム油を得る過程で得られる副産物（ＰＦＡＤ）であってよい。前記副産物が、アブラヤシの空果房から空果房ペレットを得る過程で得られる副産物（ＥＦＢジュース）であり、工程（ａ）において、当該ＥＦＢジュースの加水分解物に対し、蒸留処理を施してよい。

【0014】

前記蒸留処理は、（i）前記遊離脂肪酸含有物を０．６～１．６Ｔｏｒｒ、１７５～１８５℃の条件で蒸留して、塔底留分と塔頂留分とに分離し、次いで、（ii）前記塔底留分を０．６～１．６Ｔｏｒｒ、１９０～２００℃の条件で蒸留して、塔頂留分として前記遊離脂肪酸画分を得る処理であることが好ましい。

【0015】

また本発明は、パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対し、蒸留処理を施して、前記要件（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を満足する遊離脂肪酸画分を得る工程、を含む、ポリヒドロキシアルカン酸産生微生物培養用炭素源の製造方法にも関する。

【発明の効果】

【0016】

本発明のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法によれば、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物に由来する炭素源を利用してポリヒドロキシアルカン酸産生微生物を培養して、臭気が抑制されたポリヒドロキシアルカン酸を生産性よく製造することが可能となる。

【0017】

本発明のポリヒドロキシアルカン酸産生微生物培養用炭素源の製造方法によれば、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物に由来する炭素源であって、臭気が抑制されたポリヒドロキシアルカン酸を生産性よく製造することが可能な炭素源を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下に、本発明の具体的な実施態様を詳細に説明するが、本発明はこれら実施態様に限定されるものではない。

【0019】

本発明によるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造方法は、パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対し、蒸留処理を施して、下記要件（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を満足する遊離脂肪酸画分を得る工程（ａ）と、前記遊離脂肪酸画分を含む培養液中でＰＨＡ産生微生物を培養する工程（ｂ）と、を含む。

【0020】

（工程（ａ））
まず、蒸留処理によって遊離脂肪酸画分を得る工程（ａ）について説明する。工程（ａ）では、パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物に対して蒸留処理を行なう。

【0021】

パーム油の生産工程において得られる廃液または副産物としては種々のものが知られているが、本発明では、遊離脂肪酸を含む廃液または副産物、または、３分子の脂肪酸が１分子のグリセロールに結合してなるトリグリセリドを含む廃液または副産物を使用することができる。そのような廃液または副産物としては限定されないが、例えば、以下が挙げられる。
（ｉ）ＰＦＡＤ（Palm Fatty Acid Distillate）：粗パーム油からＲＢＤパーム油を得る過程で得られる副産物
（ｉｉ）ＰＯＭＥ（Palm Oil Mill Effluent）：アブラヤシの果実から粗パーム油を得る過程で排出される廃液
（ｉｉｉ）ＥＦＢジュース（Empty Fruit Bunch Juice）：アブラヤシの空果房から空果房ペレットを得る過程で得られる副産物。

【0022】

パーム油の生産工程の一例を以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0023】

パーム油の生産工程では、まず、アブヤラヤシの椰子房（Fresh Fruit Bunch : FFB）を、蒸気を用いた蒸煮工程に付した後、果房を剥離して果実を取り出す。取り出された果実は、その後、蒸解、スクリュープレス、振動ふるい、精製、真空乾燥といった各工程を経て、粗パーム油（ＣＰＯ）が製造される。以上は搾油工場において実施される。

【0024】

ＦＦＢの蒸煮工程では、遊離脂肪酸と水や、その他の固形分を含有する廃液が生じる。これがＰＯＭＥ（Palm Oil Mill Effluent）である。なお、ＰＯＭＥは、遊離脂肪酸に加えて、トリグリセリドを含有する場合もある。

【0025】

ＦＦＢから剥離された空の果房（Empty Fruit Bunch : EFB）はプレスされた後、ペレット化され、例えばバイオマス発電等に利用され得るが、そのプレスからペレット化の過程で生じる液状の副産物がＥＦＢジュースである。ＥＦＢジュースはトリグリセリドと遊離脂肪酸の混合物であって、トリグリセリドを遊離脂肪酸よりも多く含む材料である。

【0026】

搾油工場で製造された粗パーム油は、精油工場に輸送されて、そこで脱ガム、脱酸、白土を用いた脱色、蒸留による脱臭といった各工程を経てＲＢＤ（Refined, Bleached and Deodorized）パーム油が製造される。前記蒸留では、粗パーム油に含まれる遊離脂肪酸が除去される。この蒸留によって除去された遊離脂肪酸を含む副産物がＰＦＡＤ（Palm Fatty Acid Distillate）である。

【0027】

本発明では、以上で説明した副産物または廃液を原料として、これに蒸留処理を施すことで、ＰＨＡ産生微生物を培養する際に好適に使用可能な炭素源を製造することができる。

【0028】

前記廃液または副産物が水や固形分を含有する場合には、蒸留処理の前に、遠心分離を実施して、これら水や固形分をあらかじめ除去しておくことが好ましい。遠心分離の条件は特に限定されず、前記廃液または副産物の状態や、それに含まれる水や固形分の種類または量などを考慮して適宜決定することができる。

【0029】

前記廃液または副産物が遊離脂肪酸を豊富に含む材料（例えば、ＰＦＡＤ、又は、トリグリセリドを実質的に含有しない場合のＰＯＭＥ）である場合には、当該廃液または副産物を、必要に応じて遠心分離を実施した後、蒸留処理に付すことができる。しかし、前記廃液または副産物がトリグリセリドを豊富に含む材料（例えば、ＥＦＢジュース、又は、トリグリセリドを豊富に含有する場合のＰＯＭＥ）である場合には、当該廃液または副産物を、必要に応じて遠心分離を実施した後、さらに加水分解処理に付して該トリグリセリドを遊離脂肪酸に変換してから、蒸留処理に付すことができる。加水分解処理を実施するか否かは、前記廃液または副産物中のトリグリセリド含量を考慮して適宜決定すればよい。また、加水分解処理によってトリグリセリドを遊離脂肪酸に変換することで、着色成分などの不純物を炭素源から分離することが容易になる。

【0030】

加水分解処理としては、トリグリセリドを加水分解して遊離脂肪酸が得られる処理方法であれば特に限定されず、公知の処理方法を適宜採用することができる。例えば、水酸化ナトリウムなどの塩基性物質を添加する方法や、リパーゼなどの酵素を添加する方法が挙げられる。

【0031】

本発明では、前記廃液または副産物をそのまま、または、以上述べたように遠心分離及び／又は加水分解処理を施した後、工程（ａ）における蒸留処理に付することで、蒸留前の材料に含まれる培養阻害成分、臭気成分、および、好ましくは着色成分を低減または除去して、これらの含量が低い遊離脂肪酸画分を得る。

【0032】

前記遊離脂肪酸画分に含まれる遊離脂肪酸は、特に限定されないが、主要な遊離脂肪酸としては、パルミチン酸や、オレイン酸等が挙げられる。これらに加えて、リノール酸、ステアリン酸、ミリスチン酸なども含まれる。前記遊離脂肪酸画分におけるパルミチン酸とオレイン酸の合計含量は、５０重量％以上が好ましく、６０重量％以上がより好ましく、７０重量％以上がさらに好ましい。

【0033】

本願発明者らは、炭素源としてＰＦＡＤを使用してＰＨＡ産生微生物を培養すると、該培養が阻害され、ＰＨＡの生産性および炭素源収率が有意に低下することを見出した。この障害を解消すべく検討したところ、ＰＦＡＤに含まれる成分が、前記微生物によるＰＨＡの産生を阻害していること、及び、該成分がスクワレンであることを発見した。ＰＦＡＤは、本来、約１重量％程度のスクワレンを含有している。

【0034】

この知見に基づき、本発明は、ＰＦＡＤなどの、本来的にスクワレンを高濃度で含んでいる遊離脂肪酸含有物において、スクワレンの含量を低減した後に、これを、ＰＨＡ産生微生物の培養時における炭素源として利用する。本発明の工程（ａ）では遊離脂肪酸含有物に対し蒸留処理を施すことで、スクワレンの含有量が０．０５重量％以下の遊離脂肪酸画分を得る。スクワレンの含有量がこの範囲内にあると、前記微生物によるＰＨＡの産生が阻害されにくくなり、ＰＨＡの生産性および炭素源収率を向上させることができる。得られる遊離脂肪酸画分におけるスクワレン含量は少ないほどよく、０．０４重量％以下が好ましく、０．０３重量％以下がより好ましく、０．０２重量％以下がさらに好ましく、０．０１重量％以下がよりさらに好ましい。

【0035】

また、パーム油の生産工程において得られる廃液もしくは副産物、又は、それらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物を炭素源としてＰＨＡ産生微生物を培養した場合、得られるＰＨＡが臭気を帯び、さらに、好ましくない色を帯びていることがある。臭気がなく、着色していないＰＨＡを製造するために検討したところ、臭気の原因物質としてＰＦＡＤにはトリメチルインデンやテトラヒドロトリメチルナフタレン、テトラメチルインダン等が含まれており、ＰＯＭＥおよびＥＦＢジュースには、酪酸、グアイアコールまたはメキノール等が含まれていることを特定した。さらに、着色の原因物質として、ＰＦＡＤにはビタミンＥ（トコフェロール及びトコトリエノール）が含まれており、ＥＦＢジュースにはビタミンＥとβ－カロテンが含まれていることを特定した。

【0036】

この知見に基づき、本発明は、これら臭気成分を高濃度で含んでいる遊離脂肪酸含有物において該臭気成分の含量を低減した後に、これを、ＰＨＡ産生微生物の培養時における炭素源として利用する。具体的には、本発明の工程（ａ）では遊離脂肪酸含有物に対し蒸留処理を施すことで１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析において標準物質ナフタレン－ｄ８のピーク面積に対するトリメチルインデンのピーク面積の比が１１０以下、および、酪酸のピーク面積の比が１０未満である遊離脂肪酸画分を得る。トリメチルインデンと酪酸の含有量がこの範囲内にあると、臭気が充分に抑制されたＰＨＡを得ることができる。前記トリメチルインデンのピーク面積比は９０以下が好ましく、７０以下がより好ましい。また、前記酪酸のピーク面積比は、７以下が好ましく、５以下がより好ましい。前記１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析は、後述の方法により実施することができる。

【0037】

また、着色成分に関しても、着色成分を高濃度で含んでいる遊離脂肪酸含有物において該着色成分の含量を低減した後に、これを、ＰＨＡ産生微生物の培養時における炭素源として利用することが好ましい。本発明の工程（ａ）によって、ビタミンＥの含有量が０．０１重量％未満で、β－カロテンの含有量が０．００１ｍｇ／Ｌ以下である遊離脂肪酸画分を得ることが好ましい。ビタミンＥとβ－カロテンの含有量がこの範囲内にあると、着色が充分に抑制されたＰＨＡを得ることができる。前記ビタミンＥの含有量は０．００５重量％以下が好ましく、０．００１重量％以下がより好ましい。また、前記β－カロテンの含有量は０．０００５ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、０．０００１ｍｇ／Ｌ以下がより好ましい。

【0038】

工程（ａ）における蒸留処理の具体的な条件は、上述した各種不純物を当該蒸留処理によって除去できる条件であれば特に限定されず、当業者であれば、スクワレン、臭気成分、着色成分を含む各不純物の沸点を考慮して適宜決定することができる。この蒸留工程では、減圧蒸留を行なうことが好ましく、減圧蒸留の一例として、工業的には、蒸留塔において次の処理を実施することが好ましい。

【0039】

まず、前記廃液もしくは副産物またはそれらの加水分解物である遊離脂肪酸含有物を圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒ、温度１７５～１８５℃の条件で蒸留して（第一次蒸留）、塔底留分と塔頂留分とに分離する。これにより、酪酸やトリメチルインデンなど低融点の臭気成分は塔頂留分に含まれ、遊離脂肪酸や、より高融点の物質は塔底留分に含まれることになる。

【0040】

以上の第一次蒸留により得られた塔底留分を、第二次蒸留に付する。第二次蒸留では、圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒ、温度１９０～２００℃の条件で蒸留を行なって、塔底留分と塔頂留分とに分離する。この際、ビタミンＥやβ－カロテンを含む着色成分や、スクワレンを含む培養阻害成分は融点が高いため、塔底留分に留まる一方、遊離脂肪酸は、蒸留塔上部から塔頂留分として得られることになる。

【0041】

以上で説明した蒸留時の圧力および温度は、蒸留に関する一般的な知識に基づいて当業者が適宜変更することができる。そのような変更後の圧力および温度で実施する蒸留も本発明の範囲に含まれる。

【0042】

第一次蒸留と第二次蒸留は同じ蒸留塔内で連続的に実施してもよいが、第一蒸留において除去する臭気成分が第二次蒸留時に持ち込まれることを回避するため、各蒸留を、別の蒸留塔で実施することが好ましい。つまり、第一次蒸留で得られた塔底留分を、別の蒸留塔に移送して、そこで第二次蒸留を実施することが好ましい。あるいは、第一次蒸留を実施した蒸留塔内部を充分に洗浄した後、同じ蒸留塔で第二次蒸留を実施してもよい。

【0043】

（工程（ｂ））
次に工程（ｂ）について説明する。工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた遊離脂肪酸画分を炭素源として含む培養液中でＰＨＡ産生微生物を培養する。

【0044】

本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）とは、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の４－ヒドロキシアルカン酸、乳酸）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。具体的には、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、並びに、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。

【0045】

本発明で使用できるＰＨＡ産生微生物としてはＰＨＡ産生能を有する微生物である限り特に限定されず、自然界で見出される微生物であってもよいし、突然変異体または形質転換体であってもよい。具体的には、ＰＨＢ生産菌としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの他、カプリアビダス・ネケイター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ）等が挙げられる。また、３－ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体生産菌としては、ＰＨＢＶおよびＰＨＢＨ生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）等が挙げられる。特に、ＰＨＢＨ生産菌としては、ＰＨＢＨの生産性を上げるためにＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ＡＣ３２，ＦＥＲＭ ＢＰ－６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１－４８３０（１９９７））が挙げられる。

【0046】

形質転換により導入されるＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されず、アエロモナス・キヤビエ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｒｏｍｏｎａｓ ＳＰ ６１－３、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体とは、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列のことをいう。

【0047】

以上のようなＰＨＡ産生微生物を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。培養にあたっては、炭素源として、工程（ａ）で得られた遊離脂肪酸画分を培地に添加する。当該炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。また、炭素源の使用量は適宜設定することができるが、例えば、１０Ｌジャーに対して２００～１７００ｇ程度である。

【0048】

前記炭素源を流加する際には、前記遊離脂肪酸画分は融点が高いため、流加ライン内で固化してラインが閉塞する不都合が発生しやすい。この不都合を回避するため、前記遊離脂肪酸画分を加温しつつ培地に流加しても、培地に到達した瞬間に固化して、凝集してしまうため、培養を実施できなくなる場合がある。そのため、前記遊離脂肪酸画分を水と混合して乳化液を作製し、この乳化液を培地に添加したり、または、前記遊離脂肪酸画分を培地に噴霧したりする方法をとることが好ましい。

【0049】

また、炭素源として、工程（ａ）で得られた遊離脂肪酸画分と共に、由来が異なる遊離脂肪酸や、トリグリセリドなど別の炭素源を併用してもよい。

【0050】

炭素源以外の培養条件は、通常の微生物培養法に従うことができ、培地組成、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。

【0051】

培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収する。その回収方法は特に限定されないが、例えば、次のような方法によって実施することができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。

【0052】

以上によって、パーム油の生産工程において得られる廃液や副産物を炭素源として有効利用しつつ、かつ、臭気、および、好ましくは着色が抑制されたＰＨＡを生産性よく製造することが可能になる。

【実施例】

【0053】

以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0054】

（実施例１及び比較例１）ＰＦＡＤの利用
以下の実験では、ＦＥＬＤＡ社から、鉄配管に接触しないようにＳＵＳ配管経由で入手したＰＦＡＤを利用した。

【0055】

（第一次蒸留）低融点画分の除去
２００ｍＬフラスコに、ＰＦＡＤ ９０ｇを投入した後、該フラスコに連結管（ト字型、角度７５°）とコンデンサーを連結し、該コンデンサーを真空ポンプと回収容器に接続して、減圧単蒸留系を組み立てた。

【0056】

スターラーによって１０００ｒｐｍでの攪拌条件下、真空引きをしながら、オイルバスを用いて昇温を開始した。コンデンサーには４℃程度の冷媒溶液を通液した。系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内のＰＦＡＤ温度が１７５～１８５℃に到達した時点で、トリメチルインデンを含む低融点の臭気成分が留出し、コンデンサーを経由して除去された。臭気成分の留出開始時点で、系中の気相部の温度が上昇し、臭気成分の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第一次蒸留の終了と判断した。フラスコ内の残渣物を、次の第二次蒸留で使用した。

【0057】

（第二次蒸留）高融点画分の除去
第一次蒸留で得た残渣物を回収し、２００ｍＬ（又は１０００ｍＬ）フラスコに投入した後、該フラスコにビグリューカラムを連結し、該カラムを真空ポンプと回収容器に接続して、新たに減圧単蒸留系を組み立てた。第二次蒸留では、留出した遊離脂肪酸を回収することになるため、融点の高い遊離脂肪酸によるラインの閉塞のリスクを回避するため、コンデンサーは使用しなかった。

【0058】

スターラーによって１０００ｒｐｍでの攪拌条件下、真空引きをしながら、オイルバスを用いて昇温を開始した。系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内温が１９０～２００℃に到達した時点で、無色の遊離脂肪酸が留出を開始した。この時に気相部の温度が上昇し、遊離脂肪酸の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第二次蒸留の終了と判断した。これにより、第一次蒸留に供したＰＦＡＤの約８０重量％にあたる遊離脂肪酸画分を回収した。

【0059】

この第二次蒸留によって、遊離脂肪酸より融点が高い、ビタミンＥやβ－カロテンを含む着色成分や、スクワレンを含む培養阻害成分はフラスコ内に留まり、遊離脂肪酸画分から除去された。

【0060】

（不純物含量の測定）
得られた遊離脂肪酸画分（実施例１）について、スクワレン、トリメチルインデン、酪酸、ビタミンＥ、β－カロテンの含量を測定した。また、第一次蒸留に供する前のＰＦＡＤ（比較例１）そのものについても、同様に各成分の含量を測定した。結果を次の表１に示す。

【0061】

なお、各成分の含量は、次に記載した装置を用いて測定した。

【0062】

（スクワレン及びビタミンＥの含量測定）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）
試料２５ｍｇを溶媒（ｎ－ヘキサン／イソプロピルアルコール＝２／５（体積比）混合液）に加えメスフラスコで５０ｍｌに調整した後、ろ過したものを、以下の条件にてＧＣ分析に供試した。なお、この分析方法によるとビタミンＥの検出限界は０．０００１重量％である。表１では、ビタミンＥを検出できなかった場合を“Ｎ．Ｄ．”と表示した。
分析機器：ＧＣ（島津ＧＣ－２０１０相当品）
カラム：ＤＢ－１ＭＳ ＵＩ（５．０ｍ ｘ ０．２５ｍｍＩＤ、膜圧０．２５μｍ）
カラム温度：初期温度７０℃、７０→１００℃昇温時の昇温速度１０℃／ｍｉｎ、１００→１８０℃昇温時の昇温速度１５℃／ｍｉｎ、１８０→２００℃昇温時の昇温速度５℃／ｍｉｎ、２００→３４０℃昇温時の昇温速度１５℃／ｍｉｎ、３４０℃で１２ｍｉｎホールド
検出器：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）
注入口温度：３００℃
検出器温度：３４０℃
注入量：２μｌ
スプリット比１／２０
ガス：キャリアガスＨｅ
線速度５０．０ｃｍ／ｓｅｃ
シリンジ洗浄溶媒：ｎ－ヘキサン／イソプロピルアルコール＝２／５（体積比）混合液
面積測定範囲：３３分間。

【0063】

（トリメチルインデン及び酪酸の含量測定）１次元目ダイナミックヘッドスペース－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ分析
試料５ｍｇと内部標準物質のナフタレン－ｄ８（１００μｇ／ｍｌヘキサン溶液）１μＬをバイアル瓶に入れて６０℃で３０ｍｉｎ加熱した（ＧＥＲＳＴＥＬ製ＭＰＳ－ｘｔ）後、１次元目ＤＨＳ－ＧＣ／ＴＯＦＭＳ法（ＧＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製 ７８９０Ｂ、ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製 ７２００）によりｎ＝２で分析した。次の計算式によりナフタレン－ｄ８のピーク面積に対するトリメチルインデン又は酪酸のピーク面積の比を算出した。
トリメチルインデン又は酪酸の面積比＝トリメチルインデン又は酪酸の面積／ナフタレン－ｄ８の面積／試料量ｘ１０００。

【0064】

（β－カロテンの含量測定）ロビボンド比色計
試料０．５ｇに試薬特級シクロヘキサンを加え、メスフラスコで５０ｍｌに調整した。ろ過後、試料としてロビボンド計分析（Ｌｏｖｉｂｏｎｄ製 ＰＦＸ ｉＳｅｒｉｅｓ）に供試した。光路長は１０ｍｍに設定した。

【0065】

表１より、第一次蒸留および第二次蒸留を経て得た遊離脂肪酸画分（実施例１）は、蒸留処理を行なっていないＰＦＡＤ（比較例１）と比較して、培養阻害成分であるスクワレン、臭気成分であるトリメチルインデン、着色成分であるビタミンＥ及びβ－カロテンが明らかに減少していることが分かる。

【0066】

（炭素源の臭気の評価）
第一次蒸留および第二次蒸留を経て得た遊離脂肪酸画分（実施例１）、又は、蒸留処理を行なっていないＰＦＡＤ（比較例１）それぞれを１グラムずつ、無臭の５０ｍＬ試験管に投入した。これらサンプルの臭いを、内容物を特定せずに、５人のパネラーに嗅いでもらい、その臭いを次の基準で評価し、各人の評価点を平均した値を表１に示した。
（臭気の評価基準）０：無臭、１：わずかに感知できる程度の臭い、２：何の臭いであるか判定できる程度の臭い、３：楽に感知できる臭い、４：強い臭い、５：強烈な臭い。

【0067】

（培養実験）
微生物培養における炭素源として、実施例１では、ＰＦＡＤから第一次蒸留および第二次蒸留を経て得た遊離脂肪酸画分を使用し、比較例１では、蒸留処理を行なっていないＰＦＡＤを使用した。

【0068】

しかし、遊離脂肪酸画分およびＰＦＡＤ（以下、単に炭素源と略記する場合がある）は融点が高いため、そのまま培養液に加えると直ちに固化してしまい、培養に支障が生じる場合がある。そのため、以下の手法によりあらかじめ炭素源の乳化液を作製し、該乳化液を培養液に加えることで培養を実施した。

【0069】

乳化液を作製する際には、炭素源：水の重量比率が６：４となる量の水を使用し、また、乳化剤であるカゼインナトリウムを炭素源重量に対して０．５重量％使用し、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏを水に対して１０．９ｇ／Ｌを使用した。乳化液作製の手順としては、カゼイン、及び、前記リン酸塩を溶解した６０℃の水に対して６０℃に加温した炭素源を少量ずつ、転相しないように、ホモジナイザー作動条件下で添加した。これによって、炭素源の乳化液を作製した。該乳化液を培養培地に流加する際には、６０℃に温調した乳化液を使用した。

【0070】

具体的な培養条件は以下のとおりである。
培養生産にはＫＮＫ－６３１株（国際公開２０１６／１１４１２８号を参照）を用いた。

【0071】

種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４とし、ｐＨを６．８とした。

【0072】

前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてはパーム油を１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

【0073】

本培養培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ 塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。

【0074】

まず、ＫＮＫ－６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して３０℃で２４時間培養し種母培養を行なった。

【0075】

得られた種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５でコントロールしながら２４時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0076】

次に、得られた前培養液を、６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３４℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．５でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。前記炭素源の乳化液を、培養液中の濃度を制御しつつ流加した。培養途中からリン酸溶液を一定速度で流加した。培養は４８時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

【0077】

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＢＨを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＢＨをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、ＰＨＢＨを得た。ＰＨＢＨの生産性、および、炭素源収率を表１に示す。なお、ＰＨＢＨの生産性は、培養液の体積あたりのＰＨＢＨの収量（ｇ／Ｌ）であり、炭素源収率は、炭素源の供給重量あたりのＰＨＢＨの収量（ｇ／ｇ）である。

【0078】

（ＰＨＢＨの評価）
得られたＰＨＢＨについて臭気、及び、色調を以下の方法によって評価した。結果を表１に示す。

【0079】

（ＰＨＢＨの臭気の評価）
実施例または比較例で得られたＰＨＢＨそれぞれを１グラムずつ、無臭の５０ｍＬ試験管に投入した。これらサンプルの臭いを、内容物を特定せずに、５人のパネラーに嗅いでもらい、その臭いを次の基準で評価し、各人の評価点を平均した値を表１に示した。
（臭気の評価基準）０：無臭、１：わずかに感知できる程度の臭い、２：何の臭いであるか判定できる程度の臭い、３：楽に感知できる臭い、４：強い臭い、５：強烈な臭い。

【0080】

（色調の評価）
色調（ＹＩ値）の測定は、以下のとおり行った。得られたＰＨＢＨのプレスシートを作製し、そのＹＩ値を測定した。ＰＨＢＨのプレスシートの作製は、乾燥させたＰＨＢＨ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ－１５型）にセットして、１６０℃にて７分間加温後、約５Ｍｐｓにて２分間加熱しながらプレスし、プレス後は室温に放置してＰＨＢＨを硬化させる方法で行った。ＹＩ値は、色差計「ＳＥ－２０００」（日本電色社製）にて、３０ｍｍ測定板を使ってプレスシートを載せ、その上に白色標準板を被せて測定した。

【0081】

【表1】

【0082】

（実施例２及び比較例２）ＰＯＭＥの利用
以下の実験では、ＦＥＬＤＡ社から入手したＰＯＭＥを利用した。ここで利用したＰＯＭＥの油脂成分はほぼ遊離脂肪酸から構成され、トリグリセリドを実質的に含有しないものであった。

【0083】

（遠心分離）
まずは、ＰＯＭＥに含まれている水分や固形分を除去して、遊離脂肪酸を含む液状の有機成分を回収するために遠心分離を行なった。遠心分離は、約５０℃に加温して融解したＰＯＭＥ１５０ｍＬを、２００ｍＬ遠沈管に入れて、遠心機（ベックマン社製、ｒｏｔａｒ ４２５０）を用いて常温設定で行なった。遠心分離は４５００ｒｐｍで１０分間行なった。この処理によってＰＯＭＥは３つの画分に分かれた。最上層の遊離脂肪酸含有画分を回収し、次の蒸留処理に用いた。

【0084】

（第一次蒸留）低融点画分の除去
実施例１のＰＦＡＤの代わりに、遠心分離で得たＰＯＭＥ由来遊離脂肪酸含有画分を用いて、実施例１と同様の条件で第一次蒸留を行なった。

【0085】

系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内の遊離脂肪酸含有画分の温度が１７５～１８５℃に到達した時点で、酪酸、吉相酸およびカプロン酸を含む低融点の臭気成分が留出し、コンデンサーを経由して除去された。臭気成分の留出開始時点で系中の気相部の温度が上昇し、臭気成分の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第一次蒸留の終了と判断した。フラスコ内の残渣物を、次の第二次蒸留で使用した。

【0086】

（第二次蒸留）高融点画分の除去
第一次蒸留で得た残渣物を回収し、実施例１と同様の条件で第二次蒸留を行なった。系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内温が１９０～２００℃に到達した時点で、無色の遊離脂肪酸が留出を開始した。この時に気相部の温度が上昇し、遊離脂肪酸の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第二次蒸留の終了と判断した。これにより、第一次蒸留に供したＰＯＭＥ由来遊離脂肪酸含有画分の約８０重量％にあたる遊離脂肪酸画分を回収した。

【0087】

この第二次蒸留によって、遊離脂肪酸より融点が高い、ビタミンＥやβ－カロテンを含む着色成分はフラスコ内に留まり、遊離脂肪酸画分から除去された。

【0088】

（不純物含量の測定）
得られた遊離脂肪酸画分（実施例２）と、第一次蒸留に供する前のＰＯＭＥ由来遊離脂肪酸含有画分（比較例２）それぞれについて、スクワレン、トリメチルインデン、酪酸、ビタミンＥ、β－カロテンの含量を、実施例１と同様の方法によって測定した。結果を次の表１に示す。

【0089】

（培養実験及びＰＨＢＨの評価）
微生物培養における炭素源として、実施例２では、第一次蒸留および第二次蒸留を経て得た遊離脂肪酸画分を使用して、実施例１と同様の条件で微生物の培養を実施し、ＰＨＢＨを単離した。実施例１と同様にして、炭素源の臭気を評価すると共に、ＰＨＢＨの生産性、および、炭素源収率を測定し、また、臭気、及び、色調を評価した。結果を表１に示す。

【0090】

第一次蒸留に供する前のＰＯＭＥ由来遊離脂肪酸含有画分を炭素源として用いた培養実験は行なっていないが、このＰＯＭＥ由来遊離脂肪酸含有画分には、相当量の臭気成分および着色成分が含まれているため、これを炭素源として使用してＰＨＢＨを製造した場合、そのＰＨＢＨは、当然に、臭気および色調の点で不十分な結果に終わるものと推測される。

【0091】

（実施例３及び比較例３）ＥＦＢジュースの利用
以下の実験では、Ｄｅｎｇｋｉｌ社から入手したＥＦＢジュースを利用した。

【0092】

（遠心分離）
まずは、ＥＦＢジュースに含まれている水分や固形分を除去してトリグリセリドを回収するために遠心分離を行なった。遠心分離は実施例２と同様の条件で行なった。この遠心分離処理によってＥＦＢジュースは３つの画分に分かれた。最上層のトリグリセリド含有画分を回収し、次の酵素処理に用いた。

【0093】

（酵素処理）
次に、トリグリセリドを遊離脂肪酸に変換するために酵素処理を行なった。まずは、遠心分離で得たＥＦＢジュース由来トリグリセリド含有画分４５ｇと、水４５ｇを２００ｍｌミニジャーに投入して、４０℃にて回転数３００ｒｐｍで攪拌した。そこに、酵素（リパーゼ、名糖産業社製）を、トリグリセリドに対して０．０６重量％添加して、４０℃、３００ｒｐｍの条件下で加水分解反応を行なった。反応時間は約６０分とした。

【0094】

酵素処理後の溶液を回収して、６０℃で静置して油層と水層が分離した後、油層を回収した。得られた油層を再度６０℃で融解し、遠心分離を行い、上層の遊離脂肪酸含有画分を回収し、次の蒸留処理に使用した。

【0095】

（第一次蒸留）低融点画分の除去
実施例１のＰＦＡＤの代わりに、酵素処理で得たＥＦＢジュース由来遊離脂肪酸含有画分を用いて、実施例１と同様の条件で第一次蒸留を行なった。

【0096】

系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内の遊離脂肪酸含有画分の温度が１７５～１８５℃に到達した時点で、酪酸、グアイアコール、メキノールおよび酢酸を含む低融点の臭気成分が留出し、コンデンサーを経由して除去された。臭気成分の留出開始時点で系中の気相部の温度が上昇し、臭気成分の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第一次蒸留の終了と判断した。フラスコ内の残渣物を、次の第二次蒸留で使用した。

【0097】

（第二次蒸留）高融点画分の除去
第一次蒸留で得た残渣物を回収し、実施例１と同様の条件で第二次蒸留を行なった。系内圧力０．６～１．６Ｔｏｒｒにおいて、フラスコ内温が１９０～２００℃に到達した時点で、無色の遊離脂肪酸が留出を開始した。この時に気相部の温度が上昇し、遊離脂肪酸の留出終了時点で該温度は低下した。この温度低下によって第二次蒸留の終了と判断した。これにより、第一次蒸留に供したＥＦＢジュース由来遊離脂肪酸含有画分の約２０重量％にあたる遊離脂肪酸画分を回収した。

【0098】

この第二次蒸留によって、遊離脂肪酸より融点が高い、ビタミンＥ及びβ－カロテンを含む着色成分はフラスコ内に留まり、遊離脂肪酸画分から除去された。

【0099】

（不純物含量の測定）
得られた遊離脂肪酸画分（実施例３）と、第一次蒸留に供する前のＥＦＢジュース由来遊離脂肪酸含有画分（比較例３）それぞれについて、スクワレン、トリメチルインデン、酪酸、ビタミンＥ、β－カロテンの含量を、実施例１と同様の方法によって測定した。結果を次の表１に示す。

【0100】

（培養実験）
微生物培養における炭素源として、実施例３では、ＥＦＢジュース由来トリグリセリド含有画分に対し、酵素処理、第一次蒸留および第二次蒸留を経て得た遊離脂肪酸画分を使用して、実施例１と同様の条件で微生物の培養を実施し、ＰＨＢＨを単離した。実施例１と同様にして、炭素源の臭気を評価すると共に、ＰＨＢＨの生産性、および、炭素源収率を測定し、また、臭気、及び、色調を評価した。結果を表１に示す。

【0101】

第一次蒸留に供する前のＥＦＢジュース由来遊離脂肪酸含有画分を炭素源として用いた培養実験は行なっていないが、このＥＦＢジュース由来遊離脂肪酸含有画分には、相当量の臭気成分および着色成分が含まれているため、これを炭素源として使用してＰＨＢＨを製造した場合、そのＰＨＢＨは、当然に、臭気および色調の点で不十分な結果に終わるものと推測される。

【0102】

（参考例）スクワレンが培養に与える影響を実証する実験
炭素源として、スクワレンを１重量％添加したＲＢＤパーム油、または、スクワレン未添加のＲＢＤパーム油を用いたこと以外は、実施例１と同様にして微生物の培養を実施してＰＨＢＨを単離した。実施例１と同様にして、ＰＨＢＨの生産性、および、炭素源収率を測定した結果を次の表２に示す。

【0103】

なお、ＲＢＤパーム油に本来的に含まれているスクワレン含量は０．０５重量％程度であり、ＲＢＤパーム油は実質的にスクワレンを含有していないといえる。本参考例で適用したスクワレンの添加量１重量％は、未処理のＰＦＡＤに含まれているスクワレン含量に相当する数値である。

【0104】

【表2】

【0105】

以上の結果より、炭素源に１重量％のスクワレンが含まれることで、ＰＨＢＨ生産性が約２２％低下し、炭素源収率が約５％低下することが分かる。これにより、スクワレンは、ＰＨＢＨ産生微生物のＰＨＢＨ産生を阻害する作用を有することが明らかである。
以上によって、ＰＦＡＤなど、スクワレンを本来的に含む材料を炭素源として利用する場合には、あらかじめ該材料からスクワレンを除去した後、培養に供する必要があることが明らかになった。