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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-13
(45)【発行日】2023-04-21
(54)【発明の名称】細胞透過性配列を有するポリペプチド及びそれを含む組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20230414BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20230414BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C12N15/87 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019069134
(22)【出願日】2019-03-29
(65)【公開番号】P2020164496
(43)【公開日】2020-10-08
【審査請求日】2021-12-23
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：第６７回高分子学会年次大会予稿集６７巻１号 （２０１８），１Ｇ０８ 発行日 ：平成３０（２０１８）年５月８日 発行人 ：公益財団法人高分子学会
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・集会名 ：第６７回高分子学会年次大会 開催日 ：平成３０（２０１８）年５月２３～２５日 開催場所 ：名古屋国際会議場
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：第２８回バイオ・高分子シンポジウム予稿集Ｐ２１ 発行日 ：平成３０（２０１８）年７月２０日 発行人 ：公益財団法人高分子学会
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・集会名 ：第２８回バイオ・高分子シンポジウム 開催日 ：平成３０（２０１８）年７月２６～２７日 開催場所 ：東京工業大学
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：２５６▲ｔｈ▼ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ＆ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ａｕｇｕｓｔ １９－２３．２０１８，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ，ＰＲＯＧＲＡＭ＿ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ 発行日 ：平成３０（２０１８）年８月１８日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・集会名 ：２５６▲ｔｈ▼ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ＆ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ 開催日 ：平成３０（２０１８）年８月１９～２３日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：第６７回高分子討論会予稿集６７巻２号 （２０１８），１Ｕ１４ 発行日 ：平成３０（２０１８）年８月２９日 発行人 ：公益財団法人高分子学会
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：Ｔｈｅ ６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１８（ＳｍａＳｙｓ ２０１８） ＰＲＯＧＲＡＭ，Ｐａｇｅ３１，ＩＬ－４ 発行日 ：平成３０（２０１８）年１０月１１日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・集会名 ：Ｔｈｅ ６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２０１８（ＳｍａＳｙｓ２０１８） 開催日 ：平成３０（２０１８）年１０月１１～１２日 開催場所 ：山形大学
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・刊行物名 ：Ｔｈｅ １２ｔｈ ＳＰＳＪ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ （ＩＰＣ２０１８）ＰＲＯＧＲＡＭ 発行日 ：平成３０（２０１８）年１１月２０日 ・集会名 ：Ｔｈｅ １２ｔｈ ＳＰＳＪ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ （ＩＰＩＰＣ２０１８） 開催日 ：平成３０（２０１８）年１２月４～７日 開催場所 ：Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、戦略的創造研究推進事業（ＥＲＡＴＯ）「沼田オルガネラ反応クラスタープロジェクト」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】沼田 圭司
(72)【発明者】
【氏名】土屋 康佑
(72)【発明者】
【氏名】宮城 雄
(72)【発明者】
【氏名】宮本 昂明
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／１２９６９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】J. Peptide Res. (2002) Vol.60, pp.178-185
【文献】Biomacromolecules (2019) Vol.20, pp.653-661
【文献】Trends in Molecular Medicine (2012) Vol.18, No.7, pp.385-393
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象物質を細胞内へ輸送するためのポリペプチドであって、
下記式（Ｉ）：
【化1】
で表される、ポリペプチド。
【請求項2】
前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記Ｃ末端が、Ｃ１～Ｃ１０のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ１０のモノアルキルアミノ基もしくはジアルキルアミノ基、又はアミノ基により修飾されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記Ｎ末端が、アシル基（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ；ＲはＣ１～Ｃ１０のアルキル基）、アルコキシカルボニル基（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ；ＲはＣ１～Ｃ１０のアルキル基）、又はＣ１～１０のアルキル基（前記アルキル基は、炭素鎖中の１以上の炭素が、酸素、窒素、硫黄によって置換されていてもよい）により修飾されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
前記反応性官能基が、マレイミド基を含む修飾基又はチオール基を含む修飾基である、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド（第１のポリペプチド）と対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、或いは前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物。
【請求項7】
前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＡｒｇから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸の組み合わせが、２以上連続するカチオン性配列を含む第２のポリペプチドをさらに含有する、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項9】
前記第１のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第２のポリペプチドの少なくとも一部とが結合している請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキット。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチドをインビトロで細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び／又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも１種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規の細胞透過性配列を有するポリペプチドに関する。
【0002】
本発明はまた、上記ポリペプチドと、細胞内に導入するための対象物質とを含む細胞内侵入性組成物に関する。
【0003】
本発明はさらに、上記ポリペプチドを用いて対象物質を細胞内に輸送する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
特定のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドなどの物質（「カーゴ分子」とも称する。）を細胞内に輸送するために広く使用されるツールとして細胞透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ）が知られている。この細胞による取り込み現象は、初期には細胞膜の直接的な浸透により生じると推定されていたが、現在ではエンドサイトーシスが細胞取り込みに大きく寄与していることが知られている（非特許文献１）。
【0005】
細胞透過性ペプチドの適用は、細胞生物学、医学、農学などの分野に及んでおり、例えば医薬の細胞内デリバリー、ゲノム編集による植物等の品種改良、細胞の改質などを目的として使用可能である。このようなペプチドについて、多数の細胞透過性ペプチドが提案されているが、少なくとも、細胞膜を損傷させずに広範囲のカーゴ分子を細胞内に効率的に送達する能力などを含む特性を有する（ポリ）ペプチドが望ましいと云われている。１９８８年にエイズウイルスの転写因子Ｔａｔタンパク質が細胞膜を透過することが発見されたことを契機として、Ｔａｔペプチドを始めとして細胞透過性ペプチドの研究開発が盛んに行われるようになった。
【0006】
細胞透過性ペプチドとしては、例えば、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）などの天然型アミノ酸や非天然型アミノ酸を含むカチオン性官能基を有する（ポリ）ペプチド（例えば特許文献１）、ポリカチオン性配列とポリアニオン性配列を含む両親媒性（ポリ）ペプチド（例えば特許文献２）、テロメラーゼ由来（ポリ）ペプチド（例えば特許文献３）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１６－１９０８１３号公報
【文献】特表２０１７－５２７３００号公報
【文献】特開２０１８－１７２３９６号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｍ．Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ２００５，１１：３６１３－３６２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
多くの細胞透過性ペプチドが報告されているが、欠点も知られている。例えば、ペプチドのなかには、膜破壊によって細胞質を漏出させる又は膜タンパク質の正常な機能を妨害するペプチド、細胞毒性作用又は免疫原性作用を引き起こすペプチド、細胞質内で急速に分解されるペプチド、エンドソーム内に捕捉されたままリソソーム内で分解されるペプチド、カーゴ分子を遊離できないペプチド、適用できるカーゴ分子の範囲が限定されるペプチドなどがある（梶原直樹，芝崎太，日薬理誌２０１３，１４１：２２０－２２１）。
【0010】
このような状況において、上記の欠点がないか又は少ない細胞透過性ペプチド、或いは、種々のカーゴ分子を高効率で細胞内に取り込み、かつ毒性が低い細胞透過性ペプチドに対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、今回、従来の細胞透過性配列であるＴａｔペプチドやＲ９ペプチド（ポリアルギニン）と比較して長時間にわたって高い細胞内侵入性能（インターナリゼーション）を示すこと、高い酵素分解耐性により長期的に細胞内へのカーゴ分子の導入を可能にすること、細胞毒性がほとんどないこと、などの性質を有するポリペプチドを見出し、本発明を完成させた。
【0012】
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）下記式（Ｉ）：
［式中、ｎは２～２０の数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ４のアルキル基を表すか、又は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１０の第一級アミノアルキル基を表し；Ｒ４は、水素原子、又はＣ１～１０の炭化水素基を表し；式中のｎ個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々、互いに同一でも異なっていてもよく；並びに、Ｎ末端及びＣ末端はそれぞれ、修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されるポリペプチド。
（２）Ｒ１及びＲ２がともにメチル基である、上記（１）に記載のポリペプチド。
（３）Ｒ４が、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基である、上記（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
（４）前記Ｃ末端が修飾されている、上記（１）～（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（５）前記Ｎ末端が修飾されている、上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
（６）下記式（ＩＩ）：
－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－ （ＩＩ）
［式中、Ｙ１はＬｙｓ及びＯｒｎからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Ｙ３はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Ｙ２は少なくとも１種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、２～２０個存在するＹ１，Ｙ２及びＹ３の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されるトリペプチド単位を２～２０個含むことを特徴とする、上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリペプチド
（７）Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方に、反応性官能基を有する、上記（１）～（６）のいずれかに記載のポリペプチド。
（８）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドと対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、或いは前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物。
（９）前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、上記（８）に記載の組成物。
（１０）Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＡｒｇから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸の組み合わせが、２以上連続するカチオン性配列を含む第２のポリペプチドをさらに含有する、上記（８）又は（９）に記載の組成物。
（１１）前記第１のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第２のポリペプチドの少なくとも一部とが結合している、上記（１０）に記載の組成物。
（１２）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキット。
（１３）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び／又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも１種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法。
（１）下記式（Ｉ）：
【化1】
で表されるポリペプチド。
（２）Ｒ１及びＲ２がともにメチル基である、上記（１）に記載のポリペプチド。
（３）Ｒ４が、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基である、上記（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
（４）前記Ｃ末端が修飾されている、上記（１）～（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
（５）前記Ｎ末端が修飾されている、上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
（６）下記式（ＩＩ）：
－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－ （ＩＩ）
［式中、Ｙ１はＬｙｓ及びＯｒｎからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Ｙ３はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Ｙ２は少なくとも１種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、２～２０個存在するＹ１，Ｙ２及びＹ３の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されるトリペプチド単位を２～２０個含むことを特徴とする、上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリペプチド
（７）Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方に、反応性官能基を有する、上記（１）～（６）のいずれかに記載のポリペプチド。
（８）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドと対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、或いは前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物。
（９）前記対象物質が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、及び量子ドットからなる群から選択される、上記（８）に記載の組成物。
（１０）Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＡｒｇから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸の組み合わせが、２以上連続するカチオン性配列を含む第２のポリペプチドをさらに含有する、上記（８）又は（９）に記載の組成物。
（１１）前記第１のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第２のポリペプチドの少なくとも一部とが結合している、上記（１０）に記載の組成物。
（１２）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキット。
（１３）上記（１）～（７）のいずれかに記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び／又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも１種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、細胞毒性がほとんどない、高い酵素分解耐性を有する、並びに長時間にわたって高い細胞内侵入性能（インターナリゼーション）を示すポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１Ａは、本発明のポリペプチドであるＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）の円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。ここで「Ａｉｂ」はα－アミノイソブタン酸残基を表し、「Ｐ」は多量体であることを表す（以下、同義）。また、図１Ｂは、αへリックス、β構造及びβターンの含量（％）、並びに、１６時間インキュベーション後の細胞（ＨＥＫ２９３細胞）内取込み効率（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を示す。
【図2】この図は、１５０ｍＭＮａＣｌ含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中での蛍光偏光により測定されたＴＡＭＲＡ標識された本発明のポリペプチドであるＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）並びに比較例であるＴａｔペプチド（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１））及びＲ９ペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２））の各々とヘパリン硫酸との結合親和性を示す。
【図3】この図は、トリプシンに対する、本発明のポリペプチドであるＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）並びに比較例であるＴａｔペプチド及びＲ９ペプチドの各々のタンパク質分解安定性のアッセイ結果を示す。
【図4】この図は、本発明のポリペプチドであるＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）並びに比較例であるＴａｔペプチド及びＲ９ペプチドの各々のＨＥＫ２９３細胞内取込み（相対蛍光単位（ＲＦＵ）／ｍｇタンパク質×１０６）を示す。
【図5】この図は、細胞透過性能を示す濃度領域の本発明のポリペプチドであるＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）並びに比較例であるＴａｔペプチド及びＲ９ペプチドの各々の存在下でのＨＥＫ２９３細胞生存率（％）を示す。
【図6】この図は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）観察による、Ｔａｔペプチド（Ａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）（Ｂ）で処理された生存ＨＥＫ２９３細胞像を示す。左パネルは、核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した細胞像である。中央パネルは、５％ＣＯ２存在下、３７℃２時間、表示の５μＭペプチド（ＴＡＭＲＡ標識）と一緒にインキュベートした細胞像である。右パネルは、マージした細胞像である。
【図7】この図は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）観察による、Ｔａｔペプチド（Ａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）（Ｂ）で処理された生存ＨＥＫ２９３細胞像を示す。左パネルは、核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した細胞像である。中央パネルは、５％ＣＯ２存在下、３７℃８時間、表示の５μＭペプチド（ＴＡＭＲＡ標識）と一緒にインキュベートした細胞像である。右パネルは、マージした細胞像である。
【図8】この図は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）観察による、Ｔａｔペプチド（Ａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）（Ｂ）で処理された生存ＨＥＫ２９３細胞像を示す。左パネルは、核マーカーＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した細胞像である。中央パネルは、５％ＣＯ２存在下、３７℃１６時間、表示の５μＭペプチド（ＴＡＭＲＡ標識）と一緒にインキュベートした細胞像である。右パネルは、マージした細胞像である。
【図9】この図は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）観察による、Ｔａｔペプチド（Ａ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）（Ｂ）で処理されたシロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の葉表皮像を示す。左パネルは、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を有する葉表皮像である。中央パネルは、２５℃３時間、表示の５０μＭペプチド（ＴＡＭＲＡ標識）と一緒にインキュベートした細胞像である。右パネルは、マージした細胞像である。
【図10】この図は、ベンサミアナタバコの葉を用いたＮａｎｏＬｕｃアッセイにより決定されたｎａｋｅｄ ｐＤＮＡ、（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３でそれぞれ修飾された核酸含有複合体１及び２の遺伝子導入効率を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を表わし、アスタリスク（＊）は統計的有意差（Ｐ＜０．０５，Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ－ｔｅｓｔ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明をさらに詳細に説明する。
【0016】
１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、下記式（Ｉ）：
［式中、ｎは２～２０の数であり；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ４のアルキル基を表すか、又は互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１０の第一級アミノアルキル基を表し；Ｒ４は、水素原子、又はＣ１～１０の炭化水素基を表し；式中のｎ個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々、互いに同一でも異なっていてもよく；並びに、Ｎ末端及びＣ末端はそれぞれ、修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されることを特徴とする。
本発明のポリペプチドは、下記式（Ｉ）：
【化2】
で表されることを特徴とする。
【0017】
上記式（Ｉ）中Ｒ１及びＲ２は、独立してＣ１～Ｃ４のアルキル基を表し、例えばメチル基、エチル基、（ｎもしくはｉｓｏ）プロピル基、（ｎ，ｓｅｃもしくはｔｅｒｔ）ブチル基であるか、或いは、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して環を形成してもよい。環を形成する場合、環は、例えば５員もしくは６員の環状構造であり、例えばシクロペンチル、シクロヘキシルなどのシクロ環状構造、環内に１もしくは２個の酸素原子、窒素原子及び／又は硫黄原子を含む複素環構造などが挙げられる。好ましいＲ１及びＲ２の例は、ともにメチル基である。
【0018】
上記式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ１０の第一級アミノアルキル基を表し、ここでアルキル基は、例えばメチル、エチル、（ｎもしくはｉｓｏ）プロピル、（ｎ，ｓｅｃもしくはｔｅｒｔ）ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの基である。第一級アミノアルキル基の好ましい例は、４－アミノブチル基である。
【0019】
上記式（Ｉ）中、Ｒ４は、水素原子、又はＣ１～１０の炭化水素基を表し、例えばメチル基、エチル基、（ｎもしくはｉｓｏ）プロピル基、（ｎ，ｓｅｃもしくはｔｅｒｔ）ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などのアルキル基、フェニルＣ１－Ｃ４アルキル基（例えば、ベンジル基、ｐ－ヒドロキシフェニルメチル基、等）などであり、好ましい例は水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基である。
【0020】
上記アルキル基及び炭化水素基は、置換されていてもよいし、或いは未置換でもよく、置換される場合、置換基は、例えば、水酸基、ハロゲン基、アシル基、アミノ基、モノもしくはジアルキルアミノ基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アルキルチオ基などの少なくとも１つの基を含むものであってよい。
【0021】
上記式（Ｉ）中、Ｎ末端及びＣ末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、或いは非修飾であってもよい。修飾される場合、Ｎ末端は、例えばアシル基（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ；ＲはＣ１～Ｃ１０のアルキル基等の炭化水素基）によるアシル化、アルコキシカルボニル基（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ；ＲはＣ１～Ｃ１０のアルキル基等の炭化水素基）によるウレア化、アルキル基（例えば、Ｃ１～１０のアルキル基であり、前記アルキル基は、炭素鎖中の１以上の炭素が、酸素、窒素、硫黄等のヘテロ原子によって置換されていてもよい）等によって修飾されてもよい。ここで、アシル基は、例えばＣ１～Ｃ１０のアシル基、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基などである。また、アルコキシカルボニル基は、例えば、Ｃ１～Ｃ１０のアルコキシカルボニル基、例えばＢｏｃなどである。また、アルキル基は、例えばＣ１～１０のアルキル基であり、またアルキル基の例には、ポリエチレングリコール及びオリゴエチレングリコールの残基も含まれる。
【0022】
また、Ｃ末端の修飾は、例えばエステル化、アミド化などによる修飾である。エステル化の場合、Ｃ末端カルボキシ基の水酸基（ＯＨ）が、例えばＣ１～Ｃ１０のアルコキシ基によって置換されうる。また、アミド化の場合、Ｃ末端カルボキシ基の水酸基（ＯＨ）が、例えばＣ１～Ｃ１０のモノアルキルアミノ基もしくはジアルキルアミノ基、又はアミノ基によって置換されうる。
【0023】
また、Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方に、反応性官能基を有すると、後述する対象物質や併用する他のポリペプチドと結合により複合化することができる。反応性官能基については特に制限はない。例えば、マレイミド基とチオール基との付加反応を利用する場合は、マレイミド基を含む修飾基、チオール基を含む修飾基（システイン）等で、修飾してもよい。
【0024】
具体的には、本発明のポリペプチドは、下記式（ＩＩ）：
－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－ （ＩＩ）
［式中、Ｙ１はＬｙｓ及びＯｒｎからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Ｙ３はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Ｙ２は少なくとも１種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、２～２０個存在するＹ１，Ｙ２及びＹ３の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されるトリペプチド単位を２～２０個含むことを特徴とするポリペプチドである。
－Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－ （ＩＩ）
［式中、Ｙ１はＬｙｓ及びＯｒｎからなる群から選択されるカチオン性アミノ酸であり、Ｙ３はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸であり、Ｙ２は少なくとも１種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、２～２０個存在するＹ１，Ｙ２及びＹ３の各々は同一でも異なっていてもよく、前記ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端はそれぞれ修飾されていてもよいし、又は非修飾であってもよい。］
で表されるトリペプチド単位を２～２０個含むことを特徴とするポリペプチドである。
【0025】
本明細書中で使用するアミノ酸類の記号について、Ｌｙｓ（もしくはＫ）はリシン、Ｏｒｎはオルニチン、Ｇｌｙ（もしくはＧ）はグリシン、Ａｌａ（もしくはＡ）はアラニン、Ｐｈｅ（もしくはＦ）はフェニルアラニン、Ｌｅｕ（もしくはＬ）はロイシン、Ｖａｌ（もしくはＶ）はバリン、Ｉｌｅ（もしくはＩ）はイソロイシン、Ａｒｇ（もしくはＲ）はアルギニン、Ｈｉｓ（もしくはＨ）はヒスチジン、Ｇｌｎ（もしくはＱ）はグルタミン、Ｃｙｓ（もしくはＣ）はシステインをそれぞれ表す。
【0026】
上記式（ＩＩ）中、Ｙ２は、少なくとも１種の第四級炭素を含む非天然アミノ酸であり、例えばα－エチルアラニン、α－ブチルアラニン、α－プロパルギルアラニン、α,α－ジエチルグリシン、1－アミノシクロペンタンカルボン酸などであり、好ましくはα－アミノイソブタン酸（Ａｉｂ）であるが、これらに限定されないものとする。ここで「第四級炭素（原子）」は、炭素原子に結合する隣の炭素原子の数が４個存在することを意味する。
【0027】
さらに具体的には、本発明のポリペプチドは、上記式（ＩＩ）中、Ｙ１がＬｙｓであり、Ｙ２がＡｉｂであり、及びＹ３がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される非カチオン性アミノ酸である。
【0028】
場合により、Ｙ１及びＹ３のアミノ酸をＤ－アミノ酸に置換してもよい。これによってプロテアーゼ、ペプチダーゼなどの加水分解酵素に対する安定性をさらに向上させることができる。
【0029】
本発明のポリペプチドは、必要であれば塩の形態であってもよい。塩としては、生理学的に許容されうる酸付加塩が好ましく、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、硫酸など）との塩、又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩を挙げることができるし、或いは、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属など）との塩、或いは有機塩基（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、など）との塩を挙げることができる。
【0030】
２．ポリペプチドの合成
本発明のポリペプチドは、例えば以下の工程を含む方法によって合成することができる。
本発明のポリペプチドは、例えば以下の工程を含む方法によって合成することができる。
【0031】
（第１工程）
この工程では、上記式（ＩＩ）のトリペプチドを作製する。
一般的なペプチド合成法（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．，２３：４５１（１９６７））によってトリペプチドを作製する。この方法は、側鎖を保護したα－アミノ酸を不溶性樹脂担体（固相）に順次結合させることを含む。固相に結合したリンカーに側鎖を保護した第１のα－アミノ酸のカルボキシ基を結合したのち、α－アミノ基の脱保護を行い、側鎖を保護した第２のα－アミノ酸（但しカルボキシ基を活性基で修飾する。）を結合（カップリング）し、同様に脱保護したのち、第３の側鎖を保護したα－アミノ酸をカップリングし、最後に、脱保護とリンカーの切断を行い、合成されたトリペプチドを回収し、精製することを含む。
この工程では、上記式（ＩＩ）のトリペプチドを作製する。
一般的なペプチド合成法（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．，２３：４５１（１９６７））によってトリペプチドを作製する。この方法は、側鎖を保護したα－アミノ酸を不溶性樹脂担体（固相）に順次結合させることを含む。固相に結合したリンカーに側鎖を保護した第１のα－アミノ酸のカルボキシ基を結合したのち、α－アミノ基の脱保護を行い、側鎖を保護した第２のα－アミノ酸（但しカルボキシ基を活性基で修飾する。）を結合（カップリング）し、同様に脱保護したのち、第３の側鎖を保護したα－アミノ酸をカップリングし、最後に、脱保護とリンカーの切断を行い、合成されたトリペプチドを回収し、精製することを含む。
【0032】
精製については、例えば、溶媒抽出、クロマトグラフィー（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて目的のトリペプチドを単離精製することができる。
【0033】
（第２工程）
この工程では、第１工程で合成したトリペプチドのＣ末端カルボキシ基をエステル化（例えばメチルもしくはエチルエステル化）し、必要であればリシン（Ｌｙｓ）のεアミノ基を保護したのち、トリペプチド（例えば約０．０５～約０．５ｍＭ）を、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液（ｐＨ７～8）中、パパイン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、カテプシンＢ、プラスミン、ブロメライン、キモトリプシンなどのプロテアーゼ（例えば約１～約２００ｍｇ／ｍＬ）の存在下、約４０～約６０℃で約１０分～約４時間、酵素重合反応を行い、精製した沈殿を遠心分離によって回収し、純水で十分に洗浄し、白色固体を得ることを含む。もしリシン（Ｌｙｓ）のεアミノ基を保護した場合、最終産物から保護基を除去する操作が追加されうる。保護基が，例えばＢｏｃ基である場合、トリフルオロ酢酸又は塩酸－酢酸エチルなどの酸性条件下で保護基を除去可能である。
この工程では、第１工程で合成したトリペプチドのＣ末端カルボキシ基をエステル化（例えばメチルもしくはエチルエステル化）し、必要であればリシン（Ｌｙｓ）のεアミノ基を保護したのち、トリペプチド（例えば約０．０５～約０．５ｍＭ）を、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などの緩衝液（ｐＨ７～8）中、パパイン、プロテイナーゼＫ、トリプシン、カテプシンＢ、プラスミン、ブロメライン、キモトリプシンなどのプロテアーゼ（例えば約１～約２００ｍｇ／ｍＬ）の存在下、約４０～約６０℃で約１０分～約４時間、酵素重合反応を行い、精製した沈殿を遠心分離によって回収し、純水で十分に洗浄し、白色固体を得ることを含む。もしリシン（Ｌｙｓ）のεアミノ基を保護した場合、最終産物から保護基を除去する操作が追加されうる。保護基が，例えばＢｏｃ基である場合、トリフルオロ酢酸又は塩酸－酢酸エチルなどの酸性条件下で保護基を除去可能である。
【0034】
本発明者らが開発した酵素重合反応（例えば、宮城雄ら，高分子学会討論会，第６６巻，第２号，１Ｃ０６，２０１７、Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．Ｎｕｍａｔａ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，５３：７３１８－７３２１）を利用することによって、上記トリペプチドの多量体（例えば２～２０量体）を容易に合成することができる。また、前記方法に限定されず、例えば、Ｆｍｏｃ固相法により製造することもできる。
【0035】
３．細胞内浸入性組成物
本発明はまた、上記１節に記載のポリペプチドと、対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、又は前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物を提供する。
本発明はまた、上記１節に記載のポリペプチドと、対象物質とを含み、前記対象物質は前記ポリペプチドと一体となって存在しているか、又は前記ポリペプチドと独立して存在していることを特徴とする細胞内浸入性組成物を提供する。
【0036】
本明細書中「細胞内浸入性」は、対象物質が、細胞膜を透過し、細胞内に侵入することができる性質をいう。このような細胞内侵入は、エンドサイトーシスを介して起こる。ここでエンドサイトーシスは、クラスリン被覆小胞を介して細胞外分子などの物質（すなわち、本明細書中の「対象物質」）を細胞内に取込む機構である（十島純子、十島二朗，生化学２０１４，８６（６）：７８８－７９２）。細胞透過性配列を有する上記１節に記載のポリペプチドは、対象物質と複合体を形成し、対象物質を細胞内に輸送することができる。
【0037】
本明細書中の上記「対象物質」は、細胞内に輸送したい（もしくは送達したい）物質を指す。このような物質は、「カーゴ（ｃａｒｇｏ）分子」とも称されることがある。
【0038】
当該物質は、限定されないが、天然物又は非天然物（人工物や合成物とも称する。）のいずれでもよく、例えばタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、天然もしくは非天然核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、低分子量化合物、糖、脂質、糖脂質、造影物質、薬物、ナノ粒子、量子ドット、などである。ここで「薬物」は、疾患又は病的症状を治療、軽減又は予防、或いは診断するための物質を含む広範囲な概念である。
【0039】
一の実施形態によれば、上記組成物では、上記対象物質は上記ポリペプチドと一体となって存在し複合体を形成していてもよい。
【0040】
本明細書中「複合体」は、対象物質がポリペプチドと共有結合又は非共有結合によって結合（もしくはコンジュゲート）された形態、対象物質が少なくとも１種のポリペプチド分子によって内包もしくは付着された形態などを指す。後者の形態では、対象物質の内包のために、本発明に係るポリペプチドの１種のみを用いてもよいし、２種以上の本発明に係るポリペプチドを用いてもよい。また、１種以上の本発明に係るポリペプチドと、１種以上の他の物質（例えば、他のポリペプチド、ポリマー、有機化合物、無機化合物等）とを併用してもよく、この場合、１種以上の本発明に係るポリペプチドと、１種以上の他の物質とが、共有結合又は非共有結合をしていてもよい。
【0041】
ここで、非共有結合による結合の場合、例えば水素結合、静電的相互作用（もしくはイオン結合）、ファンデルワールス力、疎水性結合などを挙げることができる。本発明のポリペプチドは、カチオン性部分と非カチオン性部分（例えば疎水性部分）を含むため、例えばポリヌクレオチドなどの核酸類はホスホジエステル結合を有するため静電的相互作用によってポリペプチドに結合することができる。
【0042】
一方、共有結合による結合の場合、対象物質は、本発明のポリペプチドのＣ末端又はＮ末端に直接的に又は（例えばリンカーを介して）間接的に結合することができる。いずれの場合にも、末端のアミノ基又はカルボキシ基は、対象物質の官能基と結合しやすい活性基を有していてもよいし、或いは、対象物質の生理活性を損なわない部位にポリペプチドのＣ末端又はＮ末端と結合しやすい活性基を有していてもよい。一般にアミノ基は、例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロエステルなどの化合物と結合することが知られているので、そのような反応性基をポリペプチド又は対象物質に導入することができる。
【0043】
上記リンカーは、対象物質の生理活性を損なわない任意の化学基であり、例えばポリオキシアルキレン（ここで、アルキレンは、例えばＣ２～Ｃ１０アルキレンである。）、下記式で表されるサルコシンリンカー：
（式中、ｎは、２～２０を意味し、例えば、３～１２、４～８、又は５～７である。）を挙げることができる。
【化3】
【0044】
さらにまた、対象物質が複数のポリペプチド分子によって内包もしくは付着される場合、例えばファンデルワールス力や疎水性結合によって、或いは物理的な作用によって、対象物質は、複数のポリペプチド分子が形成する構造体の空間内に部分的に又は完全に内包されうる。
【0045】
本発明の組成物は、上記ポリペプチド及び上記対象物質の他に、担体、保存剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、（蛍光）プローブなどの添加剤を含むことができる。
【0046】
本発明の組成物は、例えば固体形態、液体形態などの形態を有する。
【0047】
一方、別の実施形態によれば、上記組成物では、上記対象物質は上記ポリペプチドと独立して（もしくは別々に）存在していてもよい。本発明において「独立して存在」とは、分析データから、上記対象物質と上記ポリペプチドとの間に相互作用が認められない状態をいい、「一体して存在」以外の全ての態様を含む最も広義の用語として解釈されるものとする。上記組成物が、例えば固体形態である場合、対象物質を透過させる細胞と接触させる前に、上記対象物質と上記ポリペプチドを水性媒体（例えば生理食塩水、緩衝液もしくは緩衝塩水、水など）などの担体に溶解することによってその場で、それらの上記複合体が形成される。
【0048】
上記ポリペプチドと上記対象物質の配合比（モル／モル）は、非限定的に、例えば０．１～５、好ましくは０．５～２である。
【0049】
また、本発明の組成物の一実施形態は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）及びＡｒｇ（Ｒ）から選ばれる１種又は２種以上の塩基性アミノ酸類の組み合わせが、２以上（例えば２～５０、２～４０、２～３０、３～３０、又は５～３０）連続するカチオン性配列を含む第２のポリペプチドをさらに含有する。本実施形態の一例では、対象物質（例えばＤＮＡ）と第２のポリペプチドとがイオン性相互作用をして、複合体を形成する。該複合体は、第２のポリペプチドが対象物質取り囲み、内包した状態になっていてもよい。本態様の組成物中では、第１のポリペプチドの少なくとも一部と、前記第２のポリペプチドの少なくとも一部とが共有結合（例えば、リンカーを介した共有結合）した状態であってもよい。即ち、対象物質を内包する第２のポリペプチドの少なくとも一部が、第１のポリペプチドで修飾されていてもよい。第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとは、リンカーを介して共有結合していてもよい。リンカーについては特に制限はない。リンカーの一例は、マレイミド基とチオール基との付加反応によって形成された基を含むリンカーである。
【0050】
４．細胞内デリバリーキット
本発明はさらに、上記１節に記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキットを提供する。
本発明はさらに、上記１節に記載のポリペプチドを含む細胞内デリバリーキットを提供する。
【0051】
上記キットは、上記ポリペプチドの他に、上記３節に記載の対象物質を含むことができる。
【0052】
上記キットはさらに、水性媒体などの担体（もしくは希釈剤）、（蛍光）プローブなどを含んでもよい。
【0053】
上記キットはさらに、細胞内デリバリーするための使用説明書を含むことができる。この使用説明書は、希釈剤中で本発明のポリペプチと対象物質を接触させる手順及び注意事項などを含むことができる。
【0054】
５．細胞内への物質輸送方法
本発明はさらに、上記１節に記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び／又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも１種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法を提供する。
本発明はさらに、上記１節に記載のポリペプチドを細胞に接触させることにより、前記ポリペプチドと一体になって存在する、及び／又は前記ポリペプチドとは独立して存在する少なくとも１種の対象物質を前記細胞内に導入することを含む、細胞内への物質輸送方法を提供する。
【0055】
本発明の方法では、対象物質が細胞内に輸送される経路ないしメカニズムの制限はない。本発明に係るポリペプチド、対象物質、もしくは態様によっては併用する他の物質の分子構造・性質・割合、各物質の存在状態、及び各物質間の相互作用の強弱等によって、輸送経路ないしメカニズムが変動する。前記ポリペプチドと対象物質とが独立して存在する態様では、エンドサイトーシスの一種であるマクロピノサートーシス経由で輸送される傾向があるが、この経路による輸送に制限されるものではない。
【0056】
上記ポリペプチド及び対象細胞は、上記１節及び２節で説明したとおりである。また、上記方法では、上記ポリペプチドを含む、本発明の上記組成物及び/又は上記キットを使用してもよい。
【0057】
上記細胞は、真核生物の細胞であり、例えば動物細胞、植物細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、担子菌細胞などを含む。
【0058】
好ましい動物細胞は、例えば昆虫細胞及び脊椎動物細胞であり、好ましい脊椎動物細胞は、例えば哺乳類細胞及び鳥類細胞である。また好ましい哺乳類細胞は、例えばヒト細胞、イヌ科細胞、ネコ科細胞、齧歯類細胞、有蹄類細胞などの細胞を含む。ここで、齧歯類には、例えばマウス、ラット、ハムズター、ウサギなどの動物を含む。また有蹄類には、例えばウシ、ウマ、ブタ、ラクダなどの動物を含む。
【0059】
植物細胞は、双子葉植物の細胞及び単子葉植物を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物、木本植物などの任意の細胞である。植物の具体例としては、例えば、ナス科［ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ Ｌ．）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ． ｖａｒ． ａｎｇｕｌｏｓｕｍ Ｍｉｌｌ．）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｌ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）等］、イネ科［イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）、ペレニアルライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ Ｌ．）、イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ Ｌａｍ．）、メドウフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ Ｈｕｄｓ．）、トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ Ｓｃｈｒｅｂ．）、オーチャードグラス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ Ｌ．）、チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ Ｌ．）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ．）、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ Ｌ．）、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ．， Ｂ． ｎａｐｕｓ Ｌ．）等］、マメ科［ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、アズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ Ｗｉｌｌｄ．）、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ Ｌ．）等］、ウリ科［キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌ．）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｓｃｈｒａｄ．）、カボチャ（Ｃ． ｍｏｓｃｈａｔａ Ｄｕｃｈ．， Ｃ． ｍａｘｉｍａ Ｄｕｃｈ．）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）等］、ユリ科［ネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ Ｌ．）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ Ｌ．）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｒｏｔｔｌ．）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．）等］、シソ科［シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ Ｂｒｉｔｔ． ｖａｒ． ｃｒｉｓｐａ）等］、キク科［キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、シュンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ Ｌ．）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． ｖａｒ． ｃａｐｉｔａｔａ Ｌ．）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ．）等］、バラ科［バラ（Ｒｏｓｅ ｈｙｂｒｉｄａ Ｈｏｒｔ．）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ Ｄｕｃｈ．）等］、ミカン科［ミカン（Ｃｉｔｒａｓ ｕｎｓｈｉｕ）、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ ＤＣ．）等］、フトモモ科［ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ Ｌａｂｉｌｌ）等］、ヤナギ科［ポプラ（Ｐｏｐｕｌａｓ ｎｉｇｒａ Ｌ． ｖａｒ． ｉｔａｌｉｃａ Ｋｏｅｈｎｅ）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）等］、リンドウ科［リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａ ｓｃａｂｒａ Ｂｕｎｇｅ ｖａｒ． ｂｕｅｒｇｅｒｉ Ｍａｘｉｍ．）等］、ナデシコ科［カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｌ．）等］などの植物が挙げられる。
【0060】
上記細胞は、非限定的に、例えば、生物体内の細胞であってもよいし、或いは生物体外に取り出された細胞、初代培養細胞、株化細胞、寄託された細胞、生殖細胞（卵母細胞、精原細胞、植物卵細胞、植物精細胞等）、幹細胞（例えば体性幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞等）、疾患細胞などを含む。
【0061】
上記対象物質の一例は、細胞内に導入されたときに、例えば，細胞の機能、形質、形態などの特性に影響を与えることができる物質である。
【0062】
本発明の方法では、ポリペプチドを細胞に接触させる。
【0063】
本発明の方法では、ポリペプチドを接触させる対象細胞の性質、状態については特に制限はない。植物細胞、酵母細胞などの細胞壁を有する細胞であっても、細胞壁を除去する前処理を施すことなく、対象細胞として用いることができる。勿論、細胞壁を酵素（例えばリゾチーム）で処理して破壊しプロトプラストもしくはスフェロプラストにしてから、対象細胞として用いてもよい。また、ポリペプチドを接触させる際の対象細胞は、組織化状態であっても、非組織化状態であってもよい。即ち、植物細胞を対象細胞とする態様では、ポリペプチドを植物個体や植物の種、葉、茎、根等の組織（処理がされていてもされていなくてもよい）、カルス（未分化状態の植物細胞塊）、等に接触させてもよい。
【0064】
一例は、以下の通りである。
【0065】
上記ポリペプチドを上記細胞に接触させるときには、適切な培地中で培養した細胞に、培養液中で上記ポリペプチド及び上記対象物質をそれぞれ所定量添加し、適切な温度及び適切な時間インキュベートすることができる。もしポリペプチドを蛍光物質（例えばＦＩＴＣなど）でラベル化するときには、ポリペプチドが細胞内に侵入したことが、例えば蛍光顕微鏡等の手段で観察することができる。
【0066】
また、植物の葉や根等の組織にポリペプチドを接触させる際は、シリンジ、スポイト等の器具を用いて、組織の所定の箇所にポリペプチドが接触するように、制御してもよい。
【0067】
細胞内に輸送（導入もしくは送達）された対象物質は、細胞内で目的に応じた機能を果たすように使用することが可能になる。そのような使用には、非限定的に例えば以下のようなものが挙げられる。
【0068】
遺伝子治療に使用するときには、疾患遺伝子と置換するための正しい遺伝子を含む、プラスミドなどのベクターを対象物質として用いて疾患組織もしくは器官の細胞内に輸送することができる。
【0069】
腫瘍の治療に使用するときには、抗腫瘍剤を対象物質として用いて腫瘍組織の細胞内に輸送することができる。このとき、ポリペプチドと抗腫瘍剤からなるナノサイズに調製された複合体は、毛細血管を透過して腫瘍組織に送達されやすくなる。
【0070】
ゲノム編集に使用するときには、例えばCrispr-Cas9の複合体を対象物質として用いて目的細胞内に輸送することができる。この方法によって、例えば植物の品種改良などに使用することができる。
【0071】
細胞の改変に使用するときには、例えば体細胞を人工多能性幹細胞に改変するための転写因子を細胞内に送達することができる。
【0072】
本発明の組成物を生体（例えばヒトを含む哺乳類）に投与する方法としては、経口投与又は非経口投与（例えば注射、点眼、点鼻、経肺、皮膚、脳室内を介した投与）のいずれでもよく、好ましくは注射（例えば静脈内投与）である。また、投与は、例えば静脈注射による全身投与又は患部に注射することによる局所投与であってもよい。
【実施例】
【0073】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【0074】
［実施例１］
＜材料＞
以下の実施例では、渡辺化学工業株式会社、東京化成工業株式会社、富士フイルム和光純薬株式会社、又はシグマアルドリッチ社から入手した材料を用いた。
＜材料＞
以下の実施例では、渡辺化学工業株式会社、東京化成工業株式会社、富士フイルム和光純薬株式会社、又はシグマアルドリッチ社から入手した材料を用いた。
【0075】
化学酵素重合のモノマーに用いたトリペプチドエステルは、後述の手順で合成した。
【0076】
パパインは、富士フイルム和光純薬株式会社から入手したものを用いた。その活性は約０．５Ｕｇ－１である。１ユニットは、１分間当たりに、１モルのＮ－ベンゾイル－ｄｌ－アルギニンｐ－ニトロアニリドを、ｐＨ７．５及び２５℃で加水分解するのに必要なパパインの量として定義される。
【0077】
菌（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫは、富士フイルム和光純薬株式会社から入手したものを用いた。活性は、２１Ｕ／ｍｇであった。１ユニットは、着色物質として、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中の基質としてヘモグロビンを用いて、フォリン－チオカルトー試薬（Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｒｅａｇｅｎ）と３７℃で１分間反応させた、１μｍｏｌのチロシンに相当するペプチドを生じるプロテイナーゼＫの量として定義される。
【0078】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、富士フイルム和光純薬株式会社から入手し、細胞培養培地として用いた。
【0079】
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ，ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ－１５７３）は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、ｌ－グルタミン（２ｍＭ）及び１ｖ／ｖ％のペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地により、５％のＣＯ２インキュベータ中で、３７℃で培養された。
【0080】
タンパク質濃度は、株式会社アプロサイエンス社製のＸＬ－Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキットにより同定した。
【0081】
細胞溶解バッファは、プロメガ社（米国）から入手した。
【0082】
共焦点顕微鏡による可視化のために、サーモフィッシャーサイエンス社（米国）から入手したＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって、細胞を染色した。
【0083】
＜測定＞
１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは、ＶＡＲＩＡＮ ＮＭＲ装置で測定した。
１Ｈ（５００ＭＨｚ）及び１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは、ＶＡＲＩＡＮ ＮＭＲ装置で測定した。
【0084】
ＩＲスペクトルは、島津製作所（株）製のＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ－２１分光器を用いた。
【0085】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析は、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分光光度計（ブルカーダルトニクス社製（米国））を用い、１５ｋＶの加速電圧で、反射モードで測定した。試料は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリル（０．８ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）の水／アセトニトリル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、及びターゲットプレート（ＭＴＰ ３８４ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔｅｅｌ ＢＣ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ）上に堆積させた。
【0086】
ＣＤスペクトルは、分光せん光計「Ｊ－８２０」（ＪＡＳＣＯ社製）を用いて測定した。
【0087】
蛍光スペクトルは、分光光度計「ＦＰ－８５００」（ＪＡＳＣＯ社製）を用いて測定した。
【0088】
逆相高速液体クロマト（ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析は、自動サンプル計「ＡＳ－２０５５」、グラジエントポンプ「ＰＵ２０８９」、カラムオーブン「ＣＯ－４０６０」、ＵＶ／ｖｉｓ検出器「ＵＶ－４０７５」、及び４液グラジエントポンプ「ＰＵ－２０８９ Ｐｌｕｓ」（ＪＡＳＣＯ社製）からなるＨＰＬＣシステムにより、カラム「ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８」（粒子サイズ５μｍ、１５０×３ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用いて、２５℃で流量１ｍＬ／ｍｉｎで行った。移動相は、アセトニトリル（溶出液Ａ）、ミリ－Ｑ水（溶出液Ｂ）、及び０．１ｖ／ｖ％のＴＦＡが添加されたミリ－Ｑ水（溶出液Ｃ）から構成した。Ｂｏｃ－Ｇｌｙは、内部標準として用いた。ポリペプチドのタンパク質分解安定性の分析のために、Ｂｏｃ－Ｇｌｙが添加された１００μＬのポリペプチド試料溶液を注入し、移動相の組成を、溶出液Ａ：Ｂ：Ｃ＝８８％：２％：１０％の組成から、溶出液Ａ：Ｂ：Ｃ＝６４％：２６％：１０％の組成に、約２４分間で直線的に変化させて、溶出させた。
【0089】
＜モノマーの合成＞
以下の合成例において、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がＢｏｃ（ｔｅｒｔ－ブチトキシカルボニル基）で保護されていることを表し、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がＺで保護されていることを表し、また、任意のアミノ酸に付記されたＯＥｔは、当該アミノ酸のカルボン酸がＥｔ（エチル）エステルになっていることを表す。
以下の合成例において、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がＢｏｃ（ｔｅｒｔ－ブチトキシカルボニル基）で保護されていることを表し、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表し、任意のアミノ酸に付記された場合は、当該アミノ酸のアミノ基がＺで保護されていることを表し、また、任意のアミノ酸に付記されたＯＥｔは、当該アミノ酸のカルボン酸がＥｔ（エチル）エステルになっていることを表す。
【0090】
Ａｉｂはα－アミノイソブタン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｌｙｓはリシン、Ａｌａはアラニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｌｅｕはロイシンをそれぞれ表す。
【0091】
＜ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔの合成＞
Ｂｏｃ－Ａｉｂ（４．０６ｇ，２０．０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・Ｇｌｙ－ＯＥｔ（２．７９ ｇ，２０ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）（２．９７ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）を、フラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、０℃の窒素雰囲気下でクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に溶解した。トリエチルアミン（２．７９ｍＬ，２０．０ｍｍｏｌ）を添加した後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（４．２２ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を約３０分間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮したところ、白色固体を得た。白色固体をジクロロメタンに０℃で溶解した。ＴＦＡ（１１．５ｍＬ，１５０ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、混合物を２５℃で撹拌した。２４時間後、有機溶媒を減圧下で除去した。粘着性の固体を定量的収率で得た。
Ｂｏｃ－Ａｉｂ（４．０６ｇ，２０．０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・Ｇｌｙ－ＯＥｔ（２．７９ ｇ，２０ｍｍｏｌ）及び１－ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）（２．９７ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）を、フラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、０℃の窒素雰囲気下でクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に溶解した。トリエチルアミン（２．７９ｍＬ，２０．０ｍｍｏｌ）を添加した後、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（４．２２ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を約３０分間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮したところ、白色固体を得た。白色固体をジクロロメタンに０℃で溶解した。ＴＦＡ（１１．５ｍＬ，１５０ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、混合物を２５℃で撹拌した。２４時間後、有機溶媒を減圧下で除去した。粘着性の固体を定量的収率で得た。
【0092】
＜Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔの合成＞
Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（３．８０ｇ，１０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔ（２．２５ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．４９ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）をフラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、０℃の窒素雰囲気下でクロロホルム（ＣＨＣｌ３）１０ｍＬに溶解した。トリエチルアミン（１．３９ｍＬ，１０．０ｍｍｏｌ）を添加した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．１１ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を約３０分間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを白色固体として得た。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔをメタノール（４７．５ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（０．５２５ｇ，１０ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを白色固体として得た。収率は６９％であった。
Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（３．８０ｇ，１０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔ（２．２５ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．４９ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）をフラスコ内でスターラーバーで撹拌しつつ混合し、０℃の窒素雰囲気下でクロロホルム（ＣＨＣｌ３）１０ｍＬに溶解した。トリエチルアミン（１．３９ｍＬ，１０．０ｍｍｏｌ）を添加した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．１１ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液を約３０分間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を、５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータによって濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを白色固体として得た。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔをメタノール（４７．５ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（０．５２５ｇ，１０ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを白色固体として得た。収率は６９％であった。
【0093】
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．１６（ｔ，３Ｈ，－ＯＣＨ２ＣＨ
３），１．２２（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．３０－１．４７（ｍ，１３Ｈ，－Ｃ（ＣＨ
３），－Ｃ（ＣＨ
３）２－，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．６６（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２－）－），２．８８（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），３．６３（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－），３．７８（ｍ，２Ｈ，－ＣＯＣＨ
２ＮＨ－），４．０５（ｍ，２Ｈ，－ＯＣＨ
２ＣＨ３），６．７７（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）），８．２２ （ｔ，１Ｈ，－Ｃ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ－），８．４１（ｍ，２Ｈ，－ＮＨ
２），８．８２（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯ－）
１３Ｃ ＮＭＲ（１３２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．１，２１．６，２３．５，２６．５，２８．３，３０．０，３０．４，４０．９，５２．３，５６．３，６０．３，７７．４，１５５．６，１６８．０，１６９．８，１７３．９
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２９６，３２１７，３０４７，２９８０，２９３９，２８７３，１１６８，１５２９，１４５６，１３９２，１３６６，１２５２，１１７３，１０１８，９３５，８６４，７８１ｃｍ－１．
１３Ｃ ＮＭＲ（１３２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．１，２１．６，２３．５，２６．５，２８．３，３０．０，３０．４，４０．９，５２．３，５６．３，６０．３，７７．４，１５５．６，１６８．０，１６９．８，１７３．９
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２９６，３２１７，３０４７，２９８０，２９３９，２８７３，１１６８，１５２９，１４５６，１３９２，１３６６，１２５２，１１７３，１０１８，９３５，８６４，７８１ｃｍ－１．
【0094】
＜ＨＣｌ・ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔの合成＞
出発原料としてＢｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ａｌａ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを合成した。ＨＣｌ・ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
出発原料としてＢｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ａｌａ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを合成した。ＨＣｌ・ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
【0095】
＜Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔの合成＞
出発原料としてＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを用いた以外は、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを白色粘着性の固体として得た。収率は８４％であった。
出発原料としてＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔを用いた以外は、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＡｌａ－ＯＥｔを白色粘着性の固体として得た。収率は８４％であった。
【0096】
１Ｈ ＮＭＲ （５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．１６（ｔ，３Ｈ，－ＯＣＨ２ＣＨ
３），１．２７（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．３０－１．４５（ｍ，１８Ｈ，－Ｃ（ＣＨ
３）３，－ＣＨ＊（ＣＨ
３）－，－Ｃ（ＣＨ
３）２－，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．６７（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２－）－），２．８７（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），３．５６（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－），３．８１（ｍ，１Ｈ，－ＣＯＣＨ（ＣＨ３）ＮＨ－），４．０４（ｍ，２Ｈ，－ＯＣＨ
２ＣＨ３），４．２３（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ３）－），６．７４（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）），７．９２（ｔ，１Ｈ，－Ｃ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ－），８．３６（ｍ，２Ｈ，－ＮＨ
２），８．７８（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯ－）
１３Ｃ ＮＭＲ（１３２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．０，１６．８，２１．６，２３．５，２６．２，２８．３，３０．０，４７．９，５２．３，５６．２，６０．３，６６．４，７７．４，１５５．６，１６８．０，１７２．６，１７３．２
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３８１，３２４４，２９８２，２９４０，２８７４，１６８８，１５２０，１４５４，１３９１，１３６６，１２７１，１２５０，１２１５，１１７５，１０５３，１０２０，８６６ｃｍ－１．
１３Ｃ ＮＭＲ（１３２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．０，１６．８，２１．６，２３．５，２６．２，２８．３，３０．０，４７．９，５２．３，５６．２，６０．３，６６．４，７７．４，１５５．６，１６８．０，１７２．６，１７３．２
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３８１，３２４４，２９８２，２９４０，２８７４，１６８８，１５２０，１４５４，１３９１，１３６６，１２７１，１２５０，１２１５，１１７５，１０５３，１０２０，８６６ｃｍ－１．
【0097】
＜ＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔの合成＞
出発原料としてＢｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ｌｅｕ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを合成した。ＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
出発原料としてＢｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ｌｅｕ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを合成した。ＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
【0098】
＜Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔの合成＞
出発原料としてＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを用いた以外は、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを白色粘着性固体として得た。収率は５１％であった。
出発原料としてＨＣｌ・ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを用いた以外は、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｅｕ－ＯＥｔを白色粘着性固体として得た。収率は５１％であった。
【0099】
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８５（ｍ，６Ｈ，－ＣＨ（ＣＨ
３）２），１．１５（ｔ，３Ｈ，－ＯＣＨ２ＣＨ
３），１．２０－１．４５（ｍ，２０Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ
２－）－，－Ｃ（ＣＨ
３）３，－ＣＨ＊（ＣＨ
３）－，－Ｃ（ＣＨ
３）２－，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．５１（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ（ＣＨ３）２），１．６７－１．７９（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２ＣＨ（ＣＨ３）２）－，－ＣＨ＊（ＣＨ
２－）－），２．８６（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），３．３７（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－），３．８２（ｍ，１Ｈ，－ＣＯＣＨ（ＣＨ２－）ＮＨ－），４．０６（ｍ，２Ｈ，－ＯＣＨ
２ＣＨ３），４．２７（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ３）－），６．７４（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）），７．９２（ｔ，１Ｈ，－Ｃ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯ－），８．３６（ｍ，２Ｈ，－ＮＨ
２），８．７８（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯ－）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．１，２１．０，２１．３，２３．０，２３．９，２６．２，２８．３，３０．３，５０．５，５０．８，５２．３，５６．３，６０．３，６０．６，７７．３，１５５．５，１６８．０，１７２．０，１７３．３
ＩＲ （ｎｅａｔ）：３３３１，３２０８，３０４６，２９５９，２８７０，１６８２，１５１６，１４５６，１３８６，１３６６，１２７１，１２５２，１１７３，１０３０，９４５，８６４，７７７ｃｍ－１．
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．１，２１．０，２１．３，２３．０，２３．９，２６．２，２８．３，３０．３，５０．５，５０．８，５２．３，５６．３，６０．３，６０．６，７７．３，１５５．５，１６８．０，１７２．０，１７３．３
ＩＲ （ｎｅａｔ）：３３３１，３２０８，３０４６，２９５９，２８７０，１６８２，１５１６，１４５６，１３８６，１３６６，１２７１，１２５２，１１７３，１０３０，９４５，８６４，７７７ｃｍ－１．
【0100】
＜ＨＣｌ・ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅの合成＞
Ｚ－Ａｉｂ（６．１７ｇ，２６．０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（７．７１ｇ，２６．０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．８６ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）をフラスコ中でスターラーバーで混合し、０℃、窒素雰囲気下で、ＣＨＣｌ３（２５ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミンを添加した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５．４８ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下により約３０分間で添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。得られた粘着性固体をメタノール（１３０ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（１．２５ｇ，１０ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。ＨＣｌ・ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
Ｚ－Ａｉｂ（６．１７ｇ，２６．０ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（７．７１ｇ，２６．０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．８６ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）をフラスコ中でスターラーバーで混合し、０℃、窒素雰囲気下で、ＣＨＣｌ３（２５ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミンを添加した後、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５．４８ｇ，２８．６ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下により約３０分間で添加した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。得られた粘着性固体をメタノール（１３０ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（１．２５ｇ，１０ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。ＨＣｌ・ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅを白色粘着性固体として定量的収率で得た。
【0101】
＜Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅの合成＞
Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（９．２１ｇ，２４．２ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（８．３５ｇ，２４．２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．６０ｇ，２６．６ｍｍｏｌ）をフラスコ中でスターラーバーで混合し、０℃、窒素雰囲気下で、ＣＨＣｌ３（２５ｍＬ）に溶解した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＥｔを白色固体として得た。白色固体をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（０．８６４ｇ，１０ ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅを白色固体として得た。収率は６３％であった。
Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（９．２１ｇ，２４．２ｍｍｏｌ），ＨＣｌ・ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅ（８．３５ｇ，２４．２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３．６０ｇ，２６．６ｍｍｏｌ）をフラスコ中でスターラーバーで混合し、０℃、窒素雰囲気下で、ＣＨＣｌ３（２５ｍＬ）に溶解した。溶液を０℃で１時間及び２５℃で２４時間撹拌した。溶液を５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ＭｇＳＯ４をろ別後、有機溶媒をロータリーエバポレータで濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルを溶出液として用いて、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって精製した。Ｚ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＥｔを白色固体として得た。白色固体をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中に溶解した。溶液に窒素ガスを１５分間バブリングした後、カーボン（０．８６４ｇ，１０ ｗｔ％）に担持されたパラジウムを注意深く添加した。窒素雰囲気を水素雰囲気で置き換えた後、２５℃で溶液を４８時間撹拌した。溶液をセライトでろ過し、ろ過物を減圧下で濃縮した。得られた粘性固体を水中に分散して、凍結乾燥した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＬｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅを白色固体として得た。収率は６３％であった。
【0102】
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．１５－１．４５（ｍ，３２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ
２－）－×２，－Ｃ（ＣＨ
３）３×２，－Ｃ（ＣＨ
３）２－，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２－）－×２），１．７０－１．８５（ｍ，４Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２－）－×２），２．７６（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），２．８７（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），３．６０（ｍ，３Ｈ，－ＯＣＨ
３），３．８６（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－），４．２０（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－），６．７６（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）×２），７．７９－７．８７（ｍ，１Ｈ，－ＮＨＣＯ－），７．６５－８．５０（ｍ，１Ｈ，－ＮＨＣＯ－），８．７８－８．８６（ｍ，２Ｈ，－ＮＨ
２）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２６．３，２８．３，２９．０，３８．２，５６．３，７７．３，１５５．５，１６８．０，１７２．７，１７３．４
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３３１，２９７６，２９３４，２８６６，１６８２，１５１４，１４４５，１３９１，１３６６，１２７１，１２５０，１１７１，１０４０，１００７，８６６，７８１ｃｍ－１．
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２６．３，２８．３，２９．０，３８．２，５６．３，７７．３，１５５．５，１６８．０，１７２．７，１７３．４
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３３１，２９７６，２９３４，２８６６，１６８２，１５１４，１４４５，１３９１，１３６６，１２７１，１２５０，１１７１，１０４０，１００７，８６６，７８１ｃｍ－１．
【0103】
＜ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔの合成＞
出発原料として、Ｂｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ｐｈｅ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを製造した。ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを白色粘着性固体として、定量的収率で得た。
出発原料として、Ｂｏｃ－Ａｉｂ及びＨＣｌ・Ｐｈｅ－ＯＥｔを用いた以外は、ＨＣｌ・ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを製造した。ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを白色粘着性固体として、定量的収率で得た。
【0104】
＜Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔの合成＞
ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを出発原料として、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを白色粘着性固体として得た。収率は６３％であった。
ＨＣｌ・ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを出発原料として、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＧｌｙ－ＯＥｔと同様にして、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを合成した。Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ＡｉｂＰｈｅ－ＯＥｔを白色粘着性固体として得た。収率は６３％であった。
【0105】
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．０６（ｔ，３Ｈ，－ＯＣＨ２ＣＨ３），１．２０－１．４５（ｍ，１６Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ
２－）－，－Ｃ（ＣＨ
３）３，－Ｃ（ＣＨ
３）２－，－ＣＨ＊（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ
２－）－），１．６７（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２－）－），２．８８（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ
２Ａｒ）－），３．０３（ｍ，２Ｈ，－ＣＨ
２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）３），３．８０（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ
＊（ＣＨ２－）－）３．９９（ｍ，２Ｈ，－ＯＣＨ
２ＣＨ３），４．３９（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ＊（ＣＨ２Ａｒ）－），６．７９（ｍ，１Ｈ，－ＣＨ２ＮＨＣＯＣ（ＣＨ３）），７．１５－７．３５（ｍ，５Ｈ，Ａｒ），７．９４（ｍ，１Ｈ，－ＮＨＣＯ－），８．２６（ｍ，１Ｈ，－ＮＨＣＯ－），８．６１（ｍ，２Ｈ，－ＮＨ
２）
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１３．９，２１．６，２４．０，２５．６，２８．３，３０．６，３６．７，５２．３，５４．１，５６．３，６０．４，７７．４，１２６．４，１２８．２，１２９．２，１３７．６，１５５．６，１６８．１，１７１．４，１７３．３
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３７９，３２８５，３０５９，２９８０，２９３８，２８７０，１７２４，１６８８，１６５１，１５１８，１４４３，１３８９，１３６６，１３５０，１２７５，１２１７，１１７１，１１４０，１０３０，９９５，８６４，７４３，７００ｃｍ－１
１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１３．９，２１．６，２４．０，２５．６，２８．３，３０．６，３６．７，５２．３，５４．１，５６．３，６０．４，７７．４，１２６．４，１２８．２，１２９．２，１３７．６，１５５．６，１６８．１，１７１．４，１７３．３
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３７９，３２８５，３０５９，２９８０，２９３８，２８７０，１７２４，１６８８，１６５１，１５１８，１４４３，１３８９，１３６６，１３５０，１２７５，１２１７，１１７１，１１４０，１０３０，９９５，８６４，７４３，７００ｃｍ－１
【0106】
＜トリペプチドエステルの重合＞
いずれの重合も、ガラス管中で行った。いずれの重合でも、基本的には、パパイン又はプロテイナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、リン酸緩衝液（１Ｍ，ｐＨ８．０）のトリペプチドエステル（［Ｍ］０＝０．１－０．２ｍＭ）溶液に添加し、得られた溶液を、４０又は６０℃で１０－６０分間撹拌し、その後、遠心分離（９，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）により、沈殿物を収集し、ミリＱ水で２回洗浄した。凍結乾燥後、各ポリペプチドを白色粉末として、９－５４％の収率で得た。
得られたポリペプチドを表１に示す。
いずれの重合も、ガラス管中で行った。いずれの重合でも、基本的には、パパイン又はプロテイナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、リン酸緩衝液（１Ｍ，ｐＨ８．０）のトリペプチドエステル（［Ｍ］０＝０．１－０．２ｍＭ）溶液に添加し、得られた溶液を、４０又は６０℃で１０－６０分間撹拌し、その後、遠心分離（９，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）により、沈殿物を収集し、ミリＱ水で２回洗浄した。凍結乾燥後、各ポリペプチドを白色粉末として、９－５４％の収率で得た。
得られたポリペプチドを表１に示す。
【0107】
【表1】
【0108】
＜Ｂｏｃ基の脱保護処理＞
各ポリペプチドを、フラスコ中で、２５℃で、ＴＦＡに溶解した。２４時間後、溶媒を減圧下で除去した。得られた生成物を凍結乾燥し、白色粉末として脱保護されたポリペプチドを得た。収率は１１－５５％であった。
各ポリペプチドを、フラスコ中で、２５℃で、ＴＦＡに溶解した。２４時間後、溶媒を減圧下で除去した。得られた生成物を凍結乾燥し、白色粉末として脱保護されたポリペプチドを得た。収率は１１－５５％であった。
【0109】
＜テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）－標識されたポリペプチドの合成＞
各ペプチドを以下の方法に従ってテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。
各ペプチドを以下の方法に従ってテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識した。
【0110】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のテトラメチルローダミン－５－イソチオシナネートの溶液を、ペプチドの溶液に添加した。生じた溶液を２５℃で１４時間撹拌した。この混合物を、過剰のミリＱ水中に注いだ。遠心分離により、沈殿物を収集し、ミリＱ水で洗浄した。凍結乾燥後、桃色固体を１１－５５％の収率で得た。
【0111】
＜評価＞
＜円二色性（ＣＤ）分光法＞
ＣＤスペクトルは、ＪＡＳＣＯ Ｊ－８２０分光偏光計で測定した。測定には、光路長０．１ｃｍの石英キュベットを用いた。スペクトルは１９０ｎｍから２４０ｎｍまで測定した。０．１ｗｔ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した各ペプチド（Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＸａａ）：Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ及びＰｈｅ）の３０μＭ溶液について、２０℃、窒素雰囲気下で測定した。データは、平均残留質量楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｍａｓｓ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ－１））として示す。ペプチド溶液の濃度は、各ペプチドの繰り返し単位の濃度から調整した。
＜円二色性（ＣＤ）分光法＞
ＣＤスペクトルは、ＪＡＳＣＯ Ｊ－８２０分光偏光計で測定した。測定には、光路長０．１ｃｍの石英キュベットを用いた。スペクトルは１９０ｎｍから２４０ｎｍまで測定した。０．１ｗｔ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加した各ペプチド（Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＸａａ）：Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ及びＰｈｅ）の３０μＭ溶液について、２０℃、窒素雰囲気下で測定した。データは、平均残留質量楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｍａｓｓ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ－１））として示す。ペプチド溶液の濃度は、各ペプチドの繰り返し単位の濃度から調整した。
【0112】
結果を図１に示す。
上記ＣＤスペクトル測定結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）はランダムな二次構造を形成するが、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は範囲外のＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）と比較して、ヘリックス構造を多く含む二次構造を形成することが分かった。
上記ＣＤスペクトル測定結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）はランダムな二次構造を形成するが、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は範囲外のＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）と比較して、ヘリックス構造を多く含む二次構造を形成することが分かった。
【0113】
＜ヘパリンアッセイ＞
蛍光偏光を用いて、ＴＡＭＲＡ標識された各ペプチドとヘパリン硫酸との親和性を評価した。ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含む４ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中のポリペプチド及びヘパリン硫酸を、このアッセイのために調製した。ペプチド溶液をヘパリン硫酸溶液と混合した。ポリペプチドの最終濃度は、５４３ｎｍ（Δε＝８８，０００ｃｍ－１Ｍ－１）の吸光度により決定される５０ｎＭに調整した。混合物を、２５℃で３０分間インキュベーションした後、５７０ｎｍの蛍光異方性を、偏光子（４９０ｎｍで励起）を用いた蛍光スペクトルを用いて測定した。データを正規化するために、ヘパリン硫酸の非存在下での蛍光異方性を標準とした。
蛍光偏光を用いて、ＴＡＭＲＡ標識された各ペプチドとヘパリン硫酸との親和性を評価した。ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含む４ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）中のポリペプチド及びヘパリン硫酸を、このアッセイのために調製した。ペプチド溶液をヘパリン硫酸溶液と混合した。ポリペプチドの最終濃度は、５４３ｎｍ（Δε＝８８，０００ｃｍ－１Ｍ－１）の吸光度により決定される５０ｎＭに調整した。混合物を、２５℃で３０分間インキュベーションした後、５７０ｎｍの蛍光異方性を、偏光子（４９０ｎｍで励起）を用いた蛍光スペクトルを用いて測定した。データを正規化するために、ヘパリン硫酸の非存在下での蛍光異方性を標準とした。
【0114】
結果を図２に示す。なお比較例として、ペプチド固相合成法により合成したＴａｔ（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１））及びＲ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２））のヘパリンアッセイ結果もあわせて示す。
【0115】
上記ヘパリンアッセイの結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、既知の細胞透過性配列Ｔａｔ及びＲ９と比較して、細胞膜への吸着特性は低いと考えられる。このことから、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は細胞膜上に留まることなく効率的に細胞内へ導入することが可能な物質であることが分かった。
【0116】
＜タンパク質分解安定性アッセイ＞
各ポリペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）、及びトリプシン（１０μｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）を、３７℃でインキュベーションし、１０００ｒｐｍで撹拌して混合した。数時間後、６０μＬのペプチド溶液を、１５０μＬの１％ＴＦＡに注ぎ、トリプシンを失活させた。３０μＬのＢｏｃ－Ｇｌｙ溶液を内部標準として添加した後、混合物を１３，５００ｒｐｍで遠心分離し、失活トリプシンを沈殿させた。上清を、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析に使用し、ピーク面積を計算することによって、残留ポリペプチドの量を決定した。
各ポリペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）、及びトリプシン（１０μｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）を、３７℃でインキュベーションし、１０００ｒｐｍで撹拌して混合した。数時間後、６０μＬのペプチド溶液を、１５０μＬの１％ＴＦＡに注ぎ、トリプシンを失活させた。３０μＬのＢｏｃ－Ｇｌｙ溶液を内部標準として添加した後、混合物を１３，５００ｒｐｍで遠心分離し、失活トリプシンを沈殿させた。上清を、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析に使用し、ピーク面積を計算することによって、残留ポリペプチドの量を決定した。
【0117】
結果を図３に示す。なお比較例として、Ｔａｔ及びＲ９の結果もあわせて示す。
【0118】
上記タンパク質分解安定性アッセイの結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）及びＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、範囲外のＰ（ＬｙｓＡｉｂＬｙｓ）、並びに既知の細胞透過性配列Ｔａｔ及びＲ９と比較して、非天然アミノ酸残基であるＡｉｂを配列内に含むことにより酵素分解に対して高い耐性を有することが分かった。すなわち、細胞内外において長期的な安定性を有する物質であることが分かる。
【0119】
[各ポリペプチドの動物細胞内透過性評価]
ＨＥＫ ２９３細胞を２４ウェル培養プレートに播種し（２０，０００細胞／ウェル）、ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベーションした。２４時間後、培地を、１０％ＦＢＳ及び５μＭの各ポリペプチド試料を含有する５００μＬの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を４００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡで１５分間トリプシン処理した。剥離した細胞を、４℃、１，６００ｒｐｍで３分間遠心分離して収集した。細胞ペレットをＰＢＳ中に分散させて、４℃、１，６００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞溶解緩衝液で処理した後、細胞ペレットをホモジナイザーで均一化した。細胞片を１３，５００ｒｐｍの遠心分離で除去し、上清を各測定に用いた。マイクロプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍにおける各溶解物の蛍光強度を測定した。タンパクの重量によって、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を標準化するために、各ウェル中のタンパク量を決定するのにブラッドフォードタンパクアッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いた。
ＨＥＫ ２９３細胞を２４ウェル培養プレートに播種し（２０，０００細胞／ウェル）、ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベーションした。２４時間後、培地を、１０％ＦＢＳ及び５μＭの各ポリペプチド試料を含有する５００μＬの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を４００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡで１５分間トリプシン処理した。剥離した細胞を、４℃、１，６００ｒｐｍで３分間遠心分離して収集した。細胞ペレットをＰＢＳ中に分散させて、４℃、１，６００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞溶解緩衝液で処理した後、細胞ペレットをホモジナイザーで均一化した。細胞片を１３，５００ｒｐｍの遠心分離で除去し、上清を各測定に用いた。マイクロプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍにおける各溶解物の蛍光強度を測定した。タンパクの重量によって、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を標準化するために、各ウェル中のタンパク量を決定するのにブラッドフォードタンパクアッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）を用いた。
【0120】
結果を図４に示す。なお比較例として、Ｔａｔ及びＲ９の結果もあわせて示す。
上記結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、従来の細胞透過性配列であるＴａｔやＲ９と比較して長時間にわたって高い細胞内侵入性能（インターナリゼーション）を示すことが分かった。すなわち、高い酵素分解耐性により長期的に細胞内への導入が可能な細胞透過性ペプチドとして機能することが分かった。
上記結果から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、従来の細胞透過性配列であるＴａｔやＲ９と比較して長時間にわたって高い細胞内侵入性能（インターナリゼーション）を示すことが分かった。すなわち、高い酵素分解耐性により長期的に細胞内への導入が可能な細胞透過性ペプチドとして機能することが分かった。
【0121】
＜細胞生存率＞
ＨＥＫ ２９３細胞を、ＦＢＳを含む１００μＬのＤＭＥＭ 中で、９６ウェル培養プレート上に播種した（２，５００細胞／ウェル）。プレートを３７℃，５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間のインキュベート後、培地を５μＭの各ポリペプチド試料を含有する１００μＬの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を１００μＬの新鮮な培地で２回洗浄した。最後に、各ウェルを１００μＬの新鮮培地で満たし、２０μＬの「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」（登録商標；プロメガ株式会社）を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２下での２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍでの各ウェルの吸光度を、９６ウェルプレートリーダーを用いて測定した。
ＨＥＫ ２９３細胞を、ＦＢＳを含む１００μＬのＤＭＥＭ 中で、９６ウェル培養プレート上に播種した（２，５００細胞／ウェル）。プレートを３７℃，５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間のインキュベート後、培地を５μＭの各ポリペプチド試料を含有する１００μＬの新鮮培地と交換した。各インキュベーション時間の後、培地を除去し、細胞を１００μＬの新鮮な培地で２回洗浄した。最後に、各ウェルを１００μＬの新鮮培地で満たし、２０μＬの「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ」（登録商標；プロメガ株式会社）を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２下での２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍでの各ウェルの吸光度を、９６ウェルプレートリーダーを用いて測定した。
【0122】
結果を図５に示す。
図５から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、従来の細胞透過性配列であるＴａｔやＲ９と同様に、細胞侵入（インターナリゼーション）性能を示す濃度領域において細胞毒性は全く示さないことが理解できる。
図５から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＧｌｙ）、Ｐ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、従来の細胞透過性配列であるＴａｔやＲ９と同様に、細胞侵入（インターナリゼーション）性能を示す濃度領域において細胞毒性は全く示さないことが理解できる。
【0123】
[共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いた動物細胞へのポリペプチドの内在化評価]
ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地中のＨＥＫ２９３細胞を３．５ｃｍ皿上に播種した。２４時間のインキュベーション後、培地をＦＢＳ及び各ポリペプチド試料を含有する５００μＬの新鮮培地と交換した。ポリペプチドの最終濃度を５μＭとした。２，８，及び１６時間のインキュベーションの後、各ウェル中の培地を除去し、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含有する５００μＬの新鮮なＤＭＥＭとともに、３７℃で１５分間インキュベーションした。培地を除去し、皿を新鮮なＤＭＥＭで充填した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核メーカ及び各テトラメチルローダミン標識化ポリペプチドの蛍光シグナルを、それぞれ４０５ｎｍ及び５５５ｎｍ（ダイオード）の励起波長で、共焦点レーザー走査顕微鏡ＬＳＭ７００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。顕微鏡写真の共局在化分析はオペレーティングソフトウェア「Ｚｅｎ２０１１」を用いて行った。
ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭ培地中のＨＥＫ２９３細胞を３．５ｃｍ皿上に播種した。２４時間のインキュベーション後、培地をＦＢＳ及び各ポリペプチド試料を含有する５００μＬの新鮮培地と交換した。ポリペプチドの最終濃度を５μＭとした。２，８，及び１６時間のインキュベーションの後、各ウェル中の培地を除去し、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含有する５００μＬの新鮮なＤＭＥＭとともに、３７℃で１５分間インキュベーションした。培地を除去し、皿を新鮮なＤＭＥＭで充填した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核メーカ及び各テトラメチルローダミン標識化ポリペプチドの蛍光シグナルを、それぞれ４０５ｎｍ及び５５５ｎｍ（ダイオード）の励起波長で、共焦点レーザー走査顕微鏡ＬＳＭ７００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。顕微鏡写真の共局在化分析はオペレーティングソフトウェア「Ｚｅｎ２０１１」を用いて行った。
【0124】
【0125】
＜各ポリペプチドの植物細胞内透過性及び植物細胞へのポリペプチドの内在化評価＞
細胞質内に黄色タンパク質（ＹＦＰ）を発現しているシロイヌナズナＡｌａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＹＦＰｏｘ）の葉を、直径１ｃｍの円状に切断した。この葉の切片を、１．５ｍＬのチューブに入れ、０．０８ＭＰａで１分間お及び－０．０８ＭＰａで１分間、１００μＬのＴＡＭＲＡ－標識された各ポリペプチド（５０μＭ）に浸漬した。処理後の葉の切片を、暗所条件で、２５℃、３時間インキュベーションした。ＣＳＬＭを用いて、この葉の切片について、ポリペプチド内在化の定量的評価を行った。ＴＡＭＲＡ標識化ポリペプチドの細胞内分布は、５５５ｎｍ（ダイオード）の励起波長で直接観察された。
細胞質内に黄色タンパク質（ＹＦＰ）を発現しているシロイヌナズナＡｌａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＹＦＰｏｘ）の葉を、直径１ｃｍの円状に切断した。この葉の切片を、１．５ｍＬのチューブに入れ、０．０８ＭＰａで１分間お及び－０．０８ＭＰａで１分間、１００μＬのＴＡＭＲＡ－標識された各ポリペプチド（５０μＭ）に浸漬した。処理後の葉の切片を、暗所条件で、２５℃、３時間インキュベーションした。ＣＳＬＭを用いて、この葉の切片について、ポリペプチド内在化の定量的評価を行った。ＴＡＭＲＡ標識化ポリペプチドの細胞内分布は、５５５ｎｍ（ダイオード）の励起波長で直接観察された。
【0126】
結果を図９に示す。なお比較例として、Ｔａｔ及びＲ９の結果もあわせて示す。
図９から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、既知の細胞透過性配列Ｔａｔと比較して、ＴＡＭＲＡ－標識由来の蛍光を示す部位が黄色タンパク質の存在する細胞質とほぼ一致しており、植物細胞においても効果的に細胞内へ導入されることが分かった。
図９から、本発明の式（Ｉ）のＰ（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）は、既知の細胞透過性配列Ｔａｔと比較して、ＴＡＭＲＡ－標識由来の蛍光を示す部位が黄色タンパク質の存在する細胞質とほぼ一致しており、植物細胞においても効果的に細胞内へ導入されることが分かった。
【0127】
［実施例２］
＜カチオン性キャリアペプチドの合成＞
スペーサー（テトラエチレングリコール，ＴＥＧ）を介してマレイミド基（ＭＡＬ）と結合した２種類のカチオン性キャリアペプチド、
ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）１４（配列部分：ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号３））、及び
ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４（配列部分：ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ（配列番号４））
を、それぞれＦｍｏｃ固相法により合成した。ペプチドの純度および分子量は，逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）によりそれぞれ確認した。
なお、Ｋはリシン、Ｈはヒスチジン、Ｒはアルギニンを意味する。
＜カチオン性キャリアペプチドの合成＞
スペーサー（テトラエチレングリコール，ＴＥＧ）を介してマレイミド基（ＭＡＬ）と結合した２種類のカチオン性キャリアペプチド、
ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）１４（配列部分：ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号３））、及び
ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４（配列部分：ＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨＲＨ（配列番号４））
を、それぞれＦｍｏｃ固相法により合成した。ペプチドの純度および分子量は，逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）によりそれぞれ確認した。
なお、Ｋはリシン、Ｈはヒスチジン、Ｒはアルギニンを意味する。
【0128】
＜ポリペプチドの合成＞
モノマーＬｙｓＡｉｂＡｌａのトリペプチドであって、リシンのＮ末端にシステイン（Ｃ）が結合したＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３（配列：ＣＫＸａａＡＫＸａａＡＫＸａａＡ、Ｘａａ＝Ａｉｂ（配列番号５））をＦｍｏｃ固相法により合成し、純度および分子量をＲＰ－ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによりそれぞれ確認した。
モノマーＬｙｓＡｉｂＡｌａのトリペプチドであって、リシンのＮ末端にシステイン（Ｃ）が結合したＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３（配列：ＣＫＸａａＡＫＸａａＡＫＸａａＡ、Ｘａａ＝Ａｉｂ（配列番号５））をＦｍｏｃ固相法により合成し、純度および分子量をＲＰ－ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによりそれぞれ確認した。
【0129】
＜カチオン性キャリアペプチド－ＤＮＡ複合体の調製＞
トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ、ｐ３５Ｓ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔＮｏｓ）を準備した。２０μｇのｐＤＮＡを含む水溶液に、上記で調製した、２ｍｇ／ｍＬのＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）１４あるいはＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４の水溶液を、Ｎ／Ｐ比（カチオン性キャリアペプチドに含まれる正に帯電した窒素とｐＤＮＡに含まれる負に帯電したリンのモル比）２の割合で混合し，全量が８００μＬとなるように調製した。これらの混合溶液をそれぞれ、４℃で３０分間インキュベートすることにより、カチオン性キャリアペプチド－ＤＮＡ複合体、即ち、ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）－１４／ｐＤＮＡおよびＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４／ｐＤＮＡ、をそれぞれ得た。
トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ、ｐ３５Ｓ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔＮｏｓ）を準備した。２０μｇのｐＤＮＡを含む水溶液に、上記で調製した、２ｍｇ／ｍＬのＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）１４あるいはＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４の水溶液を、Ｎ／Ｐ比（カチオン性キャリアペプチドに含まれる正に帯電した窒素とｐＤＮＡに含まれる負に帯電したリンのモル比）２の割合で混合し，全量が８００μＬとなるように調製した。これらの混合溶液をそれぞれ、４℃で３０分間インキュベートすることにより、カチオン性キャリアペプチド－ＤＮＡ複合体、即ち、ＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）－１４／ｐＤＮＡおよびＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４／ｐＤＮＡ、をそれぞれ得た。
【0130】
＜カチオン性キャリアペプチド－ＤＮＡ複合体のポリペプチドによる修飾＞
カチオン性キャリアペプチドが有するマレイミド基と、Ｃ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）3が有するシステイン（Ｃ）のチオール基とを付加反応させることで、上記で得られた各複合体を、上記ポリペプチドで修飾した。具体的には、以下の通りである。
カチオン性キャリアペプチドが有するマレイミド基と、Ｃ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）3が有するシステイン（Ｃ）のチオール基とを付加反応させることで、上記で得られた各複合体を、上記ポリペプチドで修飾した。具体的には、以下の通りである。
【0131】
各複合体を含む溶液（８００μＬ）に、上記で調製したＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３およびＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）を終濃度がそれぞれ６μＭおよび５ｍＭとなるように加え、攪拌しながら２５℃で１時間インキュベートさせることにより、チオール／マレイミド付加反応を進行させた。
【0132】
反応後の溶液をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで分析する事により、複合体へのＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３修飾を確認した。また，反応溶液をＲＰ－ＨＰＬＣで分析し、ピーク面積から未反応のＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３を定量する事により、複合体中に存在するマレイミド基（５μＭ）の修飾率を算出した。さらに動的光散乱（ＤＬＳ）測定により、複合体の流体力学直径を求めた。
【0133】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析は，ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅａｍｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を用い、１５ｋＶの加速電圧で，反射モードで測定した。試料は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリル（０．８ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）の水／アセトニトリル溶液（１０ ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ターゲットプレート（ＭＴＰ ３８４ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔｅｅｌ ＢＣ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ）上に堆積させた後、乾燥させた。
【0134】
分析の結果、Ｃ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３とそれぞれ結合したＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＫＨ）１４およびＭＡＬ－ＴＥＧ－（ＲＨ）１４の分子量に相当するピークが観測されたことから、複合体はＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３により修飾されたことが明らかとなった。
【0135】
即ち、それぞれ以下の構造の複合体１及び２がそれぞれ得られた。
【0136】
【化4】
【0137】
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析は，自動サンプル計「ＡＳ－２０５５」，グラジエントポンプ「ＰＵ２０８９」、カラムオーブン「ＣＣＯ－４０６０」，ＵＶ／ｖｉｓ検出器「ＵＶ－４０７５」、及びグラジエントポンプ「ＰＵ－２０８９ Ｐｌｕｓ」（ＪＡＳＣＯ社製）からなるＨＰＬＣシステムにより、カラム「ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８」（粒子サイズ５μｍ、１５０×４．６ｍｍ、ＹＭＣ社製）を用いて、２５℃で流量１ｍＬ／ｍｉｎで行った。移動相は、アセトニトリル（溶出液Ａ）、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（溶出液Ｂ）、及び１％（ｖ／ｖ）のＴＦＡが添加されたＭｉｌｌｉ－Ｑ水（溶出液Ｃ）から構成した。Ｂｏｃ－Ｐｒｏは内部標準、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は還元剤としてそれぞれ用いた。Ｂｏｃ－Ｐｒｏ（終濃度：１００μｇ／ｍＬ）とＴＣＥＰ（終濃度：５０ｍＭ）が添加された１００μＬの試料を注入し、移動相の組成を、溶出液Ａ：Ｂ：Ｃ＝８０％：１０％：１０％の組成から溶出液Ａ：Ｂ：Ｃ＝３５％：５５％：１０％の組成に３０分間で直線的に変化させて溶出させた。
【0138】
ピーク面積から未反応のＣ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３を定量した結果、複合体１および複合体２それぞれにおけるマレイミド基の修飾率は，それぞれ８８±７％および７８±５％と見積もられた。
試料溶液（８００μＬ）をキャピラリーセル（ＤＴＳ１０７０，Ｍａｌａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）に移し、ゼータ電位計（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ，Ｍａｌａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を用いてＤＬＳ測定を行った。
試料溶液（８００μＬ）をキャピラリーセル（ＤＴＳ１０７０，Ｍａｌａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）に移し、ゼータ電位計（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ，Ｍａｌａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）を用いてＤＬＳ測定を行った。
【0139】
測定の結果，複合体１および複合体２はそれぞれ８０±１ｎｍおよび８９±２ｎｍの流体力学直径を示した。
【0140】
＜ポリペプチドで修飾したカチオン性キャリアペプチド－ＤＮＡ複合体（修飾複合体）による植物への遺伝子導入＞
モデル植物としてベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を選択した。ベンサミアナタバコは以下の手順で準備した。
モデル植物としてベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を選択した。ベンサミアナタバコは以下の手順で準備した。
【0141】
まず、土壌及びバーミキュライトの２：１混合物を含有する栽培媒体を含むポット中で種子を発芽させた。発芽した植物は、植物インキュベーター（Ｂｉｏｔｒｏｎ ＮＫ ｓｙｓｔｅｍ社製）内で２２℃の長日条件（１６時間明期，８時間暗期）下で４週間成長させた。成長したベンサミアナタバコの葉に，上記で調製した修飾複合体を含む水溶液を浸透させ、植物体を植物インキュベーター（Ｂｉｏｔｒｏｎ ＮＫ ｓｙｓｔｅｍ社製）内で１６時間インキュベートした後、ＮａｎｏＬｕｃアッセイを製造業者（Ｐｒｏｍｅｇ社）のプロトコルに従って行い、遺伝子導入効率を定量した。具体的には、葉の複合体溶液が浸透した領域を直径１ｃｍのディスク状にくり抜き、Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１００μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）中で溶解させた。溶解物を遠心分離し、得られた上清（５０μＬ）をＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＮａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の混合液（５０μＬ）に加え、相対的光単位（ＲＬＵ）をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ２０／２０、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で測定した。また、上清中のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ試薬（ＡＰＲＯ ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用いて決定し、そして相対的光単位／タンパク質重量（ＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を得た。修飾複合体溶液を浸透させていない未処理の葉についても同様の操作でＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎを決定し、その値をバックグランドとして補正に使用した。補正後のＲＬＵ／ｍｇ蛋白質の平均値±標準偏差（ｎ＝４）を遺伝子導入効率とした。なお、ネガティブコントロールとして、２０μｇのｐＤＮＡ（ｐ３５Ｓ－ＮａｎｏＬｕｃ－ｔＮＯＳ）を含む水溶液を浸透させた葉についても同様の実験を行い，遺伝子導入効率を算出した。
【0142】
複合体１、複合体２、およびｎａｋｅｄ ｐＤＮＡ（ネガティブコントロール）の遺伝子導入効率を図１０に示す。複合体１および複合体２それぞれの遺伝子導入効率はｎａｋｅｄ ｐＤＮＡと比較して有意に高い値を示した。この結果により、Ｃ－（ＬｙｓＡｉｂＡｌａ）３で修飾した核酸含有複合体を用いることで、植物へ外来遺伝子を導入できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0143】
本発明によって提供される、細胞毒性がほとんどない、高い酵素分解耐性を有する、並びに長時間にわたって高い細胞内侵入性能（インターナリゼーション）を示すポリペプチドは、対象物質を安全にかつ効率よく目的細胞内に輸送することができるため、例えば医学、農学、分子生物学等の分野で利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【0144】
配列番号１～５：合成ペプチド
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】