特許 7262391 フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-13

(45)【発行日】2023-04-21

(54)【発明の名称】フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/702 20060101AFI20230414BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20230414BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230414BHJP

   A23L 33/125 20160101ALI20230414BHJP

   A23K 20/163 20160101ALI20230414BHJP

   A23K 50/40 20160101ALI20230414BHJP

【ＦＩ】

A61K31/702

A61P1/12 171

A61P31/04 171

A23L33/125

A23K20/163

A23K50/40

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2019542255

(86)(22)【出願日】2018-09-12

(86)【国際出願番号】 JP2018033742

(87)【国際公開番号】W WO2019054396

(87)【国際公開日】2019-03-21

【審査請求日】2021-09-07

(31)【優先権主張番号】P 2017175375

(32)【優先日】2017-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000226415

【氏名又は名称】物産フードサイエンス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】篠原 実可子

(72)【発明者】

【氏名】門田 吉弘

(72)【発明者】

【氏名】栃尾 巧

【審査官】松本 淳

(56)【参考文献】

【文献】特開２００５－３０６７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】SUCHODOLSKI, J. S. et al，The Fecal Microbiome in Dogs with Acute Diarrhea and Idiopathic Inflammatory Bowel Disease，PLOS ONE，2012年，Vol.7, Issue 12，e51907

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

Ａ２３Ｋ ５０／００－５０／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１－ケストースを有効成分とする、フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制剤。

【請求項2】

イヌにおけるフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数を抑制するために用いられる、請求項１に記載の菌数抑制剤。

【請求項3】

急性出血性下痢の予防または治療に用いられることを特徴とする、請求項１または２に記載の菌数抑制剤。

【請求項4】

１－ケストースを有効成分とする、フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制用食品組成物。

【請求項5】

１－ケストースを有効成分とする、フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制用動物用飼料。

【請求項6】

動物（ヒトを除く）に１－ケストースを摂取させることにより前記動物の体内におけるフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数を抑制する工程を有する、フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１－ケストースを有効成分とする、フソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制剤、菌数抑制用食品組成物、菌数抑制用動物用飼料および菌数抑制方法、急性出血性下痢の予防または治療方法ならびに急性出血性下痢の予防または治療用医薬品を製造するための１－ケストースの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

フソバクテリウム属細菌（Fusobacterium）は嫌気性のグラム陰性桿菌であり、ヒトの腸内や口腔内など、動物の消化器官に生息することが報告されている。ステレラ属細菌（Sutterella）もまた、嫌気性または微好気性のグラム陰性短桿菌であり、ヒトなどの動物の腸内細菌叢の構成菌種である。

【0003】

近年の研究において、フソバクテリウム属細菌やステレラ属細菌は種々の疾患や健康状態との関連が示唆されており、例えば、急性出血性下痢（Acute hemorrhagic diarrihea; AHD）に罹患したイヌの糞便において顕著な増加が見られることから、係る疾患に関与することが示唆されている（非特許文献１；表３および図３など）。

【0004】

イヌのＡＨＤは、血液の混じった嘔吐や下痢といった症状を特徴とし、血液が濃縮されて重篤な状態となる場合もある消化器系疾患である。ＡＨＤの治療には、従来、体液調整や栄養補給を目的として輸液が行われるほか、クロストリジウム属感染症を疑って、また、敗血症予防を目的として、抗生物質の投与が行われている（非特許文献２）。しかしながら、抗生物質は、ＡＨＤの治療上での有効性に議論の余地がある上、腸内細菌叢の破壊や耐性菌を生じさせるといったリスクがある（非特許文献３）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｊａｎ Ｓ．Ｓｕｃｈｏｄｏｌｓｋｉら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ、Ｖｏｌ．７（１２）、ｅ５１９０７、２０１２年１２月

【文献】Ettinger, Feldman, Cote編、Textbook of Veterinary Internal Medicine 8th ed.、第１５３８－１５３９頁、２０１７年

【文献】Ｓ．Ｕｎｔｅｒｅｒら、Ｊ Ｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、Ｖｏｌ．２５、第９７３－９７９頁、２０１１年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

そこで、本発明者らは、抗生物質の使用に伴う上述のリスクを生じさせずに、フソバクテリウム属細菌やステレラ属細菌の菌数を抑制することを課題とした。また、係る細菌の菌数を抑制することにより、ＡＨＤ等の疾患の予防や治療に寄与することを課題とした。すなわち、本発明は、フソバクテリウム属細菌やステレラ属細菌の菌数を効果的に抑制することができる物質および方法、ならびに、ＡＨＤ等の疾患の予防や治療に寄与しうる物質および方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、鋭意研究の結果、１－ケストースが、体内のフソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の少なくともいずれかの菌数を顕著に抑制することを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。

【0008】

（１）本発明に係るフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制剤は、１－ケストースを有効成分とする。

【0009】

（２）本発明に係る菌数抑制剤は、イヌにおけるフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数を抑制するために好適に用いることができる。

【0010】

（３）本発明に係る菌数抑制剤は、急性出血性下痢の予防または治療に好適に用いることができる。

【0011】

（４）本発明に係るフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制用食品組成物は、１－ケストースを有効成分とする。

【0012】

（５）本発明に係るフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制用動物用飼料は、１－ケストースを有効成分とする。

【0013】

（６）本発明に係るフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の菌数抑制方法は、ヒトまたは動物に１－ケストースを摂取させることにより前記ヒトまたは動物の体内におけるフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の数を抑制する工程を有する。

【0014】

（７）本発明に係るＡＨＤの予防または治療方法は、ＡＨＤを罹患している、または、罹患する可能性があるヒトもしくは動物に、１－ケストースを摂取させることにより、前記ヒトもしくは動物の体内におけるフソバクテリウム属細菌および／またはステレラ属細菌の数を抑制する工程を有する。

【0015】

（８）本発明に係る１－ケストースの使用は、ＡＨＤの予防または治療用医薬品を製造するための１－ケストースの使用である。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、ヒトや動物の生体におけるフソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の少なくともいずれかの菌数を効果的に抑制することができる。また、係る細菌の菌数を抑制することにより、ＡＨＤ等の疾患の予防や治療に寄与することができる。

【0017】

また、１－ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれているオリゴ糖の一種であり、古来より食経験を有する物質であることや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は極めて高い（食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．１２、第９頁、２０１４年）。さらに、１－ケストースは水溶性が高く、砂糖に似た良好な甘味質を有するため、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品、動物用飼料等に容易に配合することができる。

【0018】

したがって、本発明によれば、上述の抗生物質使用によって生じるようなリスク（腸内細菌叢の破壊や耐性菌の発生）を全く懸念することなく、簡便かつ効果的に、フソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の少なくともいずれかの菌数を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】試験開始時から３ヶ月後（１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後）までの、糞便中の全真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を示す折れ線グラフである。

【図2】試験開始時から３ヶ月後（１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後）までの、糞便中のフソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を示す折れ線グラフである。

【図3】試験開始時から３ヶ月後（１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後）までの、糞便中のステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を示す折れ線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0021】

本発明において、「フソバクテリウム属細菌」は、フソバクテリウム属に属する細菌をいう。フソバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、Fusobacterium mortiferum, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium gonidoformans, Fusobacterium russii, Fusobacterium perfoetens, Fusobacterium rectum, Fusobacterium simiae, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium varium, Fusobacterium sp. M3333などを挙げることができる。

【0022】

本発明において、「ステレラ属細菌」は、ステレラ属に属する細菌をいう。ステレラ属に属する細菌としては、例えば、Sutterella wadsworthensis, Sutterella parvirubra, Sutterella stercoricanisなどを挙げることができる。

【0023】

１－ケストースは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。１－ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８－２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β－フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃～５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１－ケストース含有反応液を得る。この１－ケストース含有反応液を、特開２０００－２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１－ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１－ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１－ケストース溶液を濃縮した後、特公平６－７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１－ケストースを結晶として得ることができる。

【0024】

また、１－ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１－ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１－ケストースとして、１－ケストースを含有するオリゴ糖などの１－ケストース含有組成物を用いてもよい。１－ケストース含有組成物を用いる場合、１－ケストースの純度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、１－ケストースの「純度」とは、糖の総質量を１００とした場合の、１－ケストースの質量％をいう。

【0025】

１－ケストースは、ヒトまたは動物に摂取させることにより用いる。１－ケストースの摂取量（投与量）としては、例えば、１日あたり０．０４ｇ／ｋｇ体重以上を挙げることができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。

【0026】

１－ケストースをヒトや動物に摂取させる方法としては、フソバクテリウム属細菌やステレラ属細菌の生息場所である腸内に到達させる方法であればよい。そのような方法として、具体的には、１－ケストースを、そのまま、あるいは飲食物や医薬品、動物用飼料の形態で、ヒトまたは動物に経口摂取させる方法を挙げることができる。その他、１－ケストースを肛門から直接あるいは挿入したチューブを経由して投与する方法、１－ケストースを経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法などを挙げることができる。

【0027】

上述のとおり、フソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の菌数は、急性出血性下痢（ＡＨＤ）に罹患したイヌの糞便中において、健康なイヌと比較して顕著に増加していることが報告されており（非特許文献１；表３および図３など）、このことから、係る疾患に関与することが示唆されている。

【0028】

したがって、１－ケストースをヒトや動物に摂取させてその体内ないし腸内においてフソバクテリウム属細菌またはステレラ属細菌の少なくともいずれかの菌数を抑制することにより、ＡＨＤを予防または治療することができる。また、１－ケストースは、ＡＨＤの予防または治療用医薬品を製造するために使用することができる。

【0029】

本発明において、細菌の「菌数を抑制する」とは、生体のいずれかの細胞ないし組織・器官における当該細菌の菌数の増加を抑制することをいう。

【0030】

例えば、腸における当該細菌の菌数は、糞便中の当該細菌の菌数と相関していると考えられるため、糞便中の当該細菌の菌数を計測することにより、腸において当該細菌の菌数が抑制されたか否かを確認することができる。具体的には、例えば、後述する実施例１（５）に示すように、１－ケストースの摂取前後の糞便を試料として、当該細菌に特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行って１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を計測する。当該細菌に特異的なプライマーは、当該細菌の公知の塩基配列に基づいて設計することができる。例えば、フソバクテリウム属細菌であれば配列番号１～４に、ステレラ属細菌であれば配列番号５に、それぞれ示す１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて特異的プライマーを設計することができる。また、簡便には、当該細菌を定量するための市販のキットを用いてリアルタイムＰＣＲ法を行うこともできる。

【0031】

当該細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数と当該細菌の菌数とは相関関係にあるため、１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は、菌数の指標とすることができる。よって、フソバクテリウム属細菌またはステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を計測した結果、１－ケストースの摂取後の糞便における１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が摂取前よりも小さければ、１－ケストースの摂取により菌数が抑制されたと判断することができる。また、急性出血性下痢（ＡＨＤ）の罹患者などの、フソバクテリウム属細菌やステレラ属細菌の菌数が時間経過に伴い増加する状態にある者については、１－ケストース摂取前後の糞便における菌数が同程度（一定）、あるいは増加していても、その増加の程度が小さければ、１－ケストースの摂取により菌数が抑制されたと判断することができる。

【0032】

本発明の菌数抑制剤やＡＨＤの予防または治療用医薬品の形態としては、有効成分である１－ケストースのみからなるもののほか、医薬品や食品添加剤、サプリメントなどの形態を挙げることができる。医薬品や食品添加剤、サプリメントの形態とする場合、その剤型としては、例えば、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型を挙げることができる。

【0033】

上記各剤型の医薬品や食品添加剤、サプリメントは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、散剤であれば、１－ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１－ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１－ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０（ｖ／ｖ）％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させ、湿潤粉末を得る。この湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒した後、顆粒４７０ｇに対してショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合する。これを、ロータリー打錠機（６Ｂ－２、菊水製作所）に供して打錠することにより、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１－ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。その他、後述する実施例１（１）に記載の方法で錠剤を製造することもできる。

【0034】

また、本発明の菌数抑制用食品組成物の形態としては、有効成分である１－ケストースのみからなるもののほか、菓子や飲料、加工食品、健康食品、乳幼児食品などの通常の飲食物の形態を挙げることができる。飲食物の形態とする場合は、通常の製造過程で、有効成分を添加して製造することができる。１－ケストースの甘味度は３０で、その味質・物性・加工性はショ糖に近いことから、各種飲食物の製造過程において、砂糖の一部または全部を１－ケストースに置き換えるなどして、砂糖と同様に扱って各種飲食物を製造することができる。

【0035】

本発明の菌数抑制用動物用飼料の形態もまた、有効成分である１－ケストースのみからなるもののほか、乳牛飼料や肉牛用飼料、養豚飼料、養鶏飼料等の家畜用飼料、イヌ用飼料やネコ用飼料等の愛玩動物用飼料（ペットフード）といった通常の動物用飼料の形態を挙げることができる。通常の動物用飼料の形態とする場合は、その製造過程で有効成分を添加して製造することができる。

【0036】

以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

【実施例】

【0037】

＜実施例１＞１－ケストース摂取によるフソバクテリウム属およびステレラ属の菌数変化
（１）１－ケストースを主成分とする錠剤の調製
１－ケストース（純度９８質量％以上；物産フードサイエンス）８００ｇおよびステアリン酸マグネシウム８ｇをよく混合した後、連続打錠機（ＲＴ－Ｓ－９、菊水製作所）に供して打錠することにより、直径８ｍｍ、重量４００ｍｇの錠剤２０００錠（１－ケストース含有量３９６ｍｇ／１錠）を得た。

【0038】

（２）１－ケストースを経口摂取させたビーグル犬の飼育および糞便の採取
試験期間を３ヶ月として、５頭のビーグル犬に、本実施例１（１）の錠剤を１日当たり２ｇ（１日当たりの１－ケストース摂取量が１９８０ｍｇ）摂取させながら２ヶ月間飼育した。その後、経過観察の為に、錠剤を摂取させずに１ヶ月間飼育した。試験開始時、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後、および３ヶ月後（試験終了時）に、採便容器スプーン型キットを用いて直腸便を採取し、－８０℃で凍結保存した。

【0039】

（３）総ＤＮＡの抽出
〈Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＰＬｏｓＯＮＥ、第９巻、第８号、ｅ１０５５９２、２０１４年８月〉に記載の方法に従って、本実施例１（２）の糞便から総ＤＮＡを抽出した。具体的には、まず、４Ｍのグアニジンチオシアネート、１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）および４０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液に、氷上で融解した糞便１００ｍｇを懸濁し、FastPrep FP100A(MP Biomedicals)を用いてジルコニアビーズで粉砕して懸濁液を得た。Magtration System 12GC（Precision System Science）およびGC series MagDEA DNA 200（Precision System Science）を用いて、この懸濁液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの濃度を分光測光器ND-1000（NanDrop Technologies）を用いて測定し、１０ｎｇ／μＬとなるように調製して、これを糞便由来総ＤＮＡとした。

【0040】

（４）糞便中の微生物由来ＤＮＡの網羅的解析
本実施例１（２）の糞便に含まれる、細菌および古細菌の種類と存在比率の網羅的解析を行った。具体的には、〈Ｓｈｕｎｓｕｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉら、ＰＬｏｓＯＮＥ、第９巻、第８号、ｅ１０５５９２、２０１４年８月〉に記載の方法に従い、ユニバーサルプライマーを用いて、本実施例１（３）の糞便由来総ＤＮＡに含まれる、細菌由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅した後、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（Illumina）によりその塩基配列を解読した。得られた塩基配列データから、データの質（クオリティ）が低いものおよびキメラ配列由来のものを排除した後、相同性が高い配列を１つの群としてまとめ、これを１菌種（または１属）として扱った。当該１群の中で出現頻度が最も高い配列を代表配列として、配列データベースとの相同性解析を行い菌種を同定した。存在比率は、総リード数に占める各群のリード数の割合を百分率として算出した。なお、キメラ配列のチェックは〈Robert C. Edgarら、BIOINFORMATICS、第２７巻、１６号、第２１９４－２２００頁、２０１１年６月〉に、相同性解析は〈Chika Kasaiら、BMC Gastroenterology、第１５巻、記事１００号、２０１５年８月〉に、それぞれ記載の方法に準じて行った。

【0041】

この網羅的解析の結果、フソバクテリウム属およびステレラ属、ならびに、Fusobacterium mortiferum、Fusobacterium varium、Fusobacterium perfoetens、Fusobacterium necrogenesおよびSutterella stercoricanisの存在比率に顕著な減少が見られた。各菌種の代表配列（１６Ｓ ｒＤＮＡの部分配列）を配列番号１～５にそれぞれ示す。また、各菌種（属）の存在比率を表１に示す。なお、表１において、存在比率の値は、５頭のビーグル犬における中央値を示す。

【0042】

【表1】

【0043】

表１に示すように、フソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は７．１８であったのに対して、試験開始から１ヶ月後は１．５３、２ヶ月後は１．４４、１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）は２．４１であった。また、Fusobacterium mortiferumの１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は５．９７であったのに対して、１ヶ月後は１．６４、２ヶ月後は１．５５、３ヶ月後は１．８５であった。また、Fusobacterium variumの１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は０．５５であったのに対して、１ヶ月後は０．０９、２ヶ月後は０．０７、３ヶ月後は０．２３であった。また、Fusobacterium perfoetensの１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は０．４６であったのに対して、１ヶ月後は０．０３、２ヶ月後は０．０６、３ヶ月後は０．０８であった。また、Fusobacterium necrogenesの１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は０．１３であったのに対して、１ヶ月後は０．０２、２ヶ月後は０．０４、３ヶ月後は０．０１であった。

【0044】

以上のとおり、フソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれの時点においても、試験開始時と比較して顕著に小さかった。この結果から、１－ケストースの摂取により、糞便中のフソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率が減少することが明らかになった。

【0045】

また、ステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は０．２２であったのに対して、１ヶ月後は０．１０、２ヶ月後は０．０９、１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）は０．０２であった。また、Sutterella stercoricanisの１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始時は０．３１であったのに対して、１ヶ月後および２ヶ月後は０．１１、３ヶ月後は０．０２であった。

【0046】

以上のとおり、ステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率は、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれの時点においても、試験開始時と比較して顕著に小さかった。この結果から、１－ケストースの摂取により、糞便中のステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡの存在比率が減少することが明らかになった。

【0047】

そこで、フソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の菌数について定量的解析を行うこととした。

【0048】

（５）リアルタイムＰＣＲ法による菌数の定量的解析
本実施例１（２）の糞便中のフソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌の菌数を、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。具体的には、本実施例１（３）の糞便由来総ＤＮＡを鋳型として、Fusobacterium Detection Kit（Cat. No. RO-0005）（テクノスルガ・ラボ）、リアルタイムＰＣＲ試薬「SYBR Premix Ex Taq II (T1i RNase H Plus)」（タカラ）およびリアルタイムＰＣＲ装置「Rotor-Gene Q 」（キアゲン）を用いて、添付の使用書に従ってリアルタイムＰＣＲを行い、糞便１ｇあたりのフソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を定量した。

【0049】

また、Fusobacterium Detection Kitに代えてSutterella Detection Kit（テクノスルガ・ラボ）を用いて、同様にリアルタイムＰＣＲを行い、糞便１ｇあたりのステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を定量した。さらに、ユニバーサルプライマー（フォワードプライマー；ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号６）、リバースプライマー；ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号７））を用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行い、糞便１ｇに含まれる全真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を定量した。

【0050】

なお、フソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌を定量するための検量線は、上記キットに含まれる標準試料を使用して同条件でリアルタイムＰＣＲを行った結果を基に作製した。一方、全真正細菌を定量するための検量線は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣＭ１６４９Ｔの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号８）を組み込んだプラスミドＤＮＡを標準試料として、フォワードプライマー；ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号９）およびリバースプライマー；ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ（配列番号１０）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果を基に作製した。

【0051】

求めた１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は、糞便の採取時期ごとに、中央値を算出した。全真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数（中央値）を図１の折れ線グラフに、フソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数（中央値）を図２の折れ線グラフに、ステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数（中央値）を図３の折れ線グラフに、それぞれ示す。また、試験開始時の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を１００％として、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を百分率で表し、これを変化率（％）とした。また、全真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を１００％として、フソバクテリウム属細菌およびステレラ属細菌のそれぞれの１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数を百分率で表し、これを占有率（％）とした。全真正細菌についての結果を表２に、フソバクテリウム属細菌についての結果を表３に、ステレラ属細菌についての結果を表４に、それぞれ示す。

【0052】

【表2】

【0053】

【表3】

【0054】

【表4】

【0055】

図１および表２に示すように、全真正細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は、試験開始時から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）と、時間経過に伴って増加した。これに対して、図２および表３に示すように、フソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数は試験開始時から時間経過に伴って減少した。ステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数もまた、図３および表４に示すように、試験開始時から時間経過に伴って減少した。

【0056】

詳細には、表３に示すように、フソバクテリウム属細菌の変化率は、試験開始から１ヶ月後では３３％、２ヶ月後では４０％、３ヶ月後では３２％であった。すなわち、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれにおいても、試験開始時と比較して、フソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が１／３程度まで顕著に小さくなった。

【0057】

また、フソバクテリウム属細菌の占有率は、試験開始時は４．７６％であったのに対して、試験開始から１ヶ月後では１．２０％、２ヶ月後では１．３５％、３ヶ月後では０．８２％であった。すなわち、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれにおいても、全真正細菌中に占めるフソバクテリウム属細菌の割合が、試験開始時と比較して、それぞれ１／４程度、１／３程度および１／６程度まで、顕著に小さくなった。

【0058】

以上のとおり、糞便中のフソバクテリウム属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数および全真正細菌中に占める割合は、いずれも、１－ケストースの摂取により顕著に小さくなった。また、係る減少効果は１－ケストースの摂取終了後も継続していた。この結果から、１－ケストースは、イヌの生体内において、フソバクテリウム属細菌の菌数を抑制する作用が顕著に大きいことが明らかになった。

【0059】

次に、表４に示すように、ステレラ属細菌の変化率は、試験開始から１ヶ月後では５９％、２ヶ月後では５０％、３ヶ月後では１７％であった。すなわち、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれにおいても、試験開始時と比較して、ステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数が１／２程度～１／５未満まで顕著に小さくなった。

【0060】

また、ステレラ属細菌の占有率は、試験開始時は０．１３％であったのに対して、試験開始から１ヶ月後では０．０６％、２ヶ月後では０．０４％、３ヶ月後では０．０１％であった。すなわち、試験開始から１ヶ月後、２ヶ月後および１－ケストースの摂取終了から１ヶ月後（３ヶ月後）のいずれにおいても、全真正細菌中に占めるステレラ属細菌の割合が、試験開始時と比較して、それぞれ１／４、１／６および１／２４まで、顕著に小さくなった。

【0061】

以上のとおり、糞便中のステレラ属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡコピー数および全真正細菌中に占める割合は、いずれも、１－ケストースの摂取により顕著に小さくなった。また、係る減少効果は１－ケストースの摂取終了後も継続していた。この結果から、１－ケストースは、イヌの生体内において、ステレラ属細菌の菌数を抑制する作用が顕著に大きいことが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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