▶ ミルテニイ ビオテック ベー．ファー． ウント コー．カーゲーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-13
(45)【発行日】2023-04-21
(54)【発明の名称】ＮＫ細胞形質導入のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20230414BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230414BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230414BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230414BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230414BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230414BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z ZNA
C12N7/01
A61K35/76
A61K38/20
A61K35/17
A61P35/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020533699
(86)(22)【出願日】2018-12-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-03-11
(86)【国際出願番号】 EP2018085890
(87)【国際公開番号】W WO2019121945
(87)【国際公開日】2019-06-27
【審査請求日】2021-12-13
(31)【優先権主張番号】62/607,944
(32)【優先日】2017-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520493902
【氏名又は名称】ミルテニイ ビオテック ベー．ファー． ウント コー．カーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】バリ，ラフィジュル
(72)【発明者】
【氏名】グランジン，マルカス
(72)【発明者】
【氏名】ルン，ウィング
(72)【発明者】
【氏名】モーカー，ニナ
(72)【発明者】
【氏名】ユッペル，フォルカー
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／０４５６３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１３９４６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－０１２０１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５２６２４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】C. LEVY et al.，Baboon envelope pseudotyped lentiviral vectors efficiently transduce human B cells and allow active factor IX B cell secretion in vivo in NOD/SCIDγc-/- mice.，J. Thromb. Haemost.，2016年11月08日，Vol.14, No.12，p.2478-2492，doi: 10.1111/jth.13520
【文献】Anais Girard-Gagnepain et al.，Babool envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs.，Blood，2014年06月20日，Vol.124, No.8，p.1221-1231，doi: 10.1182/blood-2014-02-558163
【文献】Jeffrey W. Leong et al.，Preactivation with IL-12, IL-15, and IL-18 induces CD25 and a functional high-affinity IL-2 receptor on human cytokine-induced memory-like natural killer cells.，Biol. Blood Marrow Transplant.，2014年01月13日，Vol.20, No.4，p.463-473，doi: 10.1016/j.bbmt.2014.01.006
【文献】Wolfgang Glienke et al.，Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells.，Front. Pharmacol.，2015年02月12日，6:21，doi: 10.3389/fphar.2015.00021
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ７／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入するためのｉｎ－ｖｉｔｒｏでの方法であって、ａ）ＮＫ細胞を活性化するステップと、
ｂ）前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を前記活性化ＮＫ細胞に添加するステップと
を含み、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含み、それにより前記活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入する、方法。
【請求項2】
ＮＫ細胞の前記活性化の前に、ＮＫ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１陽性およびＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞を含む試料から、ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞について濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、少なくともヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または
細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＮＫ細胞の前記活性化が、少なくとも１つのサイトカイン、またはフィーダー細胞もしくはフィーダー細胞の膜粒子、あるいはＮＫ細胞活性化試薬を前記ＮＫ細胞に添加することにより達成される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＮＫ細胞の前記活性化が、ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインと、ＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、サイトカインの組合せを添加することにより達成され、それによりＮＫ細胞の短期的活性化をもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
サイトカインの前記組合せが、ＩＬ２および／またはＩＬ－１５と、ＩＬ－１ファミリーサイトカインである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子によるＮＫ細胞の形質導入効率が、少なくとも５０％である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記生体物質が、前記レトロウイルスベクター粒子により前記ＮＫ細胞に形質導入される場合、１つまたは複数の核酸である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
前記レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、レンチウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
閉鎖系の自動化プロセスにおいて実施される、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
活性化ＮＫ細胞に生体物質をｉｎ－ｖｉｖｏで導入することによる、障害を患うヒトの治療における使用のための医薬組成物であって、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を含み、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含み、それにより前記活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入するものである、医薬組成物。
【請求項14】
活性化ＮＫ細胞に生体物質をｉｎ－ｖｉｖｏで導入することによる、障害を患うヒトの治療における使用のための、組成物の組合せであって、ａ）ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインを含む第１の組成物と、
ｂ）シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を含む組成物
とを含み、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む、組成物の組合せ。
【請求項15】
前記第１の組成物が、ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインと、ＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、サイトカインの組合せを含む、請求項１４に記載の組成物の組合せ。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、細胞へ生体物質を導入する分野に、特に、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞へ生体物質を導入することに関する。
【背景技術】
【0002】
ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」とも略す）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞としても知られる悪性変性細胞を検出および破壊可能である、ユニークなリンパ球集団である。加えて、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞との接触時にサイトカインを産生および分泌する。これらの機能的特徴により、ＮＫ細胞は、がん治療のための魅力的な薬物となっている。臨床試験では、ＮＫ細胞の臨床的使用の可能性を強調している（Ｍｉｌｌｅｒら２００５；Ｒｕｂｎｉｔｚら２０１０；Ｃｈｉｌｄｓ＆Ｂｅｒｇ ２０１３）。
【0003】
患者のためのドナーＮＫ細胞の使用（「同種間使用」）では、望ましいＮＫ細胞の効果を、非ＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞の望ましくない禁忌効果から分離するための細胞分離方法を必要とする。それらの方法は、十分に確立されており（Ｌｅｕｎｇ ２０１４）、無菌閉鎖系内において自動化することができる（Ａｐｅｌら２０１３）。
【0004】
遺伝子操作は、ＮＫ細胞特性をさらに修飾する有望な戦略であり、例えば、がん治療において、多様な臨床的意義を有する（Ｃｈｉｌｄｓ＆Ｃａｒｌｓｔｅｎ ２０１５）。例えば、免疫細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用は、ＣＡＲ Ｔ細胞による臨床試験において示されるように、がんのための有望な治療の選択肢である。ＣＡＲ ＮＫ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞の良い代替物であり得るが、初代ＮＫ細胞の遺伝子操作が、主要な技術的課題となっている（Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ ２０１４）。
【0005】
トランスフェクション方法、例えば、エレクトロポレーションは、導入遺伝子の効率的な送達をもたらすが、導入遺伝子発現は、一過性である。したがって、ＮＫ細胞のトランスフェクションは、持続的効果を必要とする場合、臨床適用に使用することができない。その上、トランスフェクションは、高い細胞死の割合をもたらし、これは別の主要な不利益となっている。
【0006】
一方、ウイルスベクターをベースとする、ＮＫ細胞への形質導入は、持続的遺伝子修飾のための選択肢である。ＮＫ細胞へのレトロウイルス形質導入は可能であるが、高いウイルス力価を必要とし、一方、効率は低いままである（Ｓｕｅｒｔｈら２０１５）。さらにより重要なことには、レトロウイルスベクターの挿入変異のため、レトロウイルスアプローチの臨床的使用は、臨床研究において明らかとなった遺伝毒性効果に関して、重大な安全性への懸念がある（Ａｉｕｔｉ＆Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ ２００９；Ａｉｕｔｉら２００９）。
【0007】
しかし、レトロウイルスベクター群では、レンチウイルスベクターは、遺伝毒性がより低く、臨床適用のためのより安全な選択肢となっている（Ｍｏｎｔｉｎｉら２００９；Ｐａｐａｙａｎｎａｋｏｓ＆Ｄａｎｉｅｌ ２０１３）。残念なことには、種々のサイトカインの組合せで刺激し、高力価のレンチウイルスベクターを使用した後であっても、ＮＫ細胞の約１０％しか形質導入することができず、このことは、ＮＫ細胞の抗ウイルス防御機構により説明することができる（Ｓｕｔｌｕら２０１２）。この形質導入効率は、高力価のレンチウイルスベクターをプロタミン硫酸塩、およびＴＢＫ１／ＩＫＫｅ複合体の阻害物質であるＢＸ７９５とともに使用して、約４０％に増加させることができる（Ｓｕｔｌｕら２０１２）。しかし、ＴＢＫ１は有糸分裂に必須であり、ＢＸ７９５は、一般に、細胞周期停止を引き起こし、非増殖細胞をもたらすことが知られている（Ｐｉｌｌａｉら２０１５；Ｂａｉら２０１５）。したがって、重大で、望ましくない副作用により、ＢＸ７９５は臨床的なＮＫ細胞形質導入に不適切なものとなり、そこで、安定な形質導入、および着実な細胞増殖を含む適切なＮＫ細胞の機能性が、緊急に必要とされている。
【0008】
ＷＯ２０１３／０４５６３９Ａ１では、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ｂａｂｏｏｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化したウイルスベクターを使用した、静止ＨＳＣならびに休止ＴおよびＢ細胞への形質導入のための方法を開示している。
【0009】
結論として、ＮＫ細胞の効率的かつ持続的な遺伝子修飾のための、方法および／またはウイルスベクター粒子系は、治療に臨床的に適用することができ、現在の最先端技術によってかなえられていない、差し迫ったニーズとなっている。
【発明の概要】
【0010】
驚くべきことに、活性化後の初代ヒトＮＫ細胞では、ＮＫ細胞抗ウイルス防御機構の阻害物質を必要としなくても、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子を使用することにより、効率的に形質導入することができ、一方、休止ＮＫ細胞では、これらのベクター粒子により、効率的に形質導入することができないことが見出された。形質導入は、低力価のレトロウイルスベクター粒子、例えば、低力価のレンチウイルスベクター粒子であっても検出可能であり、９０％超に達することができ、これは、これまで報告された他のウイルスベクター粒子には見られない。低力価のベクター粒子を使用すると、先行技術の方法と比較して、より良い実用性がもたらされる。例えば、修飾ヒヒエンベロープタンパク質を有する、本明細書に開示のレンチウイルスベクター粒子は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を有するベクター粒子よりも、はるかに高い形質導入効率（７～１０倍高い）を付与する。本明細書に開示の形質導入方法は、形質導入ＮＫ細胞に対して、細胞死を誘引しないか、または他の毒性効果を示さない。その上、この方法は、ＮＫ細胞有糸分裂に影響せず、このため、形質導入ＮＫ細胞は、非形質導入の対応物と同レベルで、長期にわたって高度に増殖性である。まとめると、使用するシュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子が、不要な副作用を有さず、性質が臨床的に適合していることにより、本明細書に開示の方法は、治療適用のための、ＮＫ細胞の安定な遺伝子修飾に関して、ユニークなものとなっている。
【0011】
ヒトＮＫ細胞を活性化し、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子を使用すると、思いのほか、形質導入ＮＫ細胞の存在頻度が高くなる。好ましくは、ＮＫ細胞は、可溶型もしくは表面結合型のいずれかの刺激作用物質により、またはフィーダー細胞の部分を含む、フィーダー細胞、例えば、膜粒子により活性化される。より好ましくは、ＮＫ細胞は、サイトカインなどの少なくとも１つの増殖因子、またはサイトカインなどの増殖因子の組合せにより活性化される、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１を含むがそれらに限定されない共通ガンマ鎖サイトカイン、もしくはＩＬ－１アルファ、ＩＬ１ベータ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、Ｉｌ－３６、ＩＬ３７およびＩＬ３８を含むがそれらに限定されないＩＬ－１ファミリーサイトカインである。さらにより驚くべきことに、形質導入効率は、種々のサイトカインをＩＬ－１ファミリーサイトカインとともに、例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５をＩＬ－１ファミリーサイトカイン、例えば、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータとともに組み合わせることにより、さらに増加させることができ。ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、例えば、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータを、ＮＫ細胞を活性化する他の周知のサイトカインに添加すると、ＮＫ細胞の短期的活性化がもたらされ、ＮＫ細胞への形質導入が、先行技術のＮＫ活性化方法、すなわち、ＩＬ－１ファミリーサイトカインを用いない方法を使用するよりも早く効率的に可能となる。本明細書に開示の条件下で、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、本明細書に開示のウイルスベクター粒子により形質導入した、活性化ＮＫ細胞の割合が、非常に高いだけでなく、導入遺伝子発現も低下せずに、数週間安定なままであることは、驚くべき知見である。導入遺伝子発現の持続時間は、例えば、２、４、６、８週間以上にわたって維持され得る。ウイルスベクター粒子の代わりに、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、本明細書に開示のウイルス様粒子により、活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入することもできる。
【0012】
さらにより驚くべきことに、これらのＮＫ細胞の活性化および形質導入の前に、ＣＸ３ＣＲ１陰性およびＣＸ３ＣＲ１陽性ＮＫ細胞を含む試料からＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞を濃縮すると、修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、本明細書に開示のウイルスベクター粒子によって、優れた増殖および形質導入がもたらされる。ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞の濃縮は、ＣＸ３ＣＲ１陰性およびＣＸ３ＣＲ１陽性細胞を含む、試料またはＮＫ細胞の集団から、ＣＸ３ＣＲ１陽性およびＣＸ３ＣＲ１陰性細胞を分離することにより達成することができる。
【0013】
本明細書に開示の活性化ＮＫ細胞への形質導入のための方法はまた、ＧＭＰ条件下で、好ましくは閉鎖系において、自動化プロセスとして、完全に実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＧＦＰの発現により実証されるように、ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによりＮＫ細胞の形質導入は高くなるが、ＮＫ細胞を活性化する必要がある。
【図2A】実験で使用したＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＰＢＭＣから単離して、高度に精製された細胞集団がもたらされた。
【図2B】ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターによるＴ細胞への形質導入はうまくいくが、高力価であっても、ＮＫ細胞には極めて非効率的である。
【図2C】ＮＫ－９２細胞株への、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターによる形質導入は、初代ＮＫ細胞への形質導入と同様に非効率的であるが、驚くべきことに、ＮＫ－９２は、ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターにより効率的に形質導入することができる。
【図2D】Ｔ細胞および活性化初代ＮＫ細胞はがともに、ヒヒエンベロープシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより非常に効率的に形質導入することができる。
【図3A】驚くべきことに、ＩＬ－３３を用いたＮＫ細胞の短期的活性化は、ＩＬ－３３を用いない場合よりも、ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによるＮＫ細胞の高い形質導入率を可能にする。
【図3B】ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによる場合と同様に、ＩＬ－３３でのＮＫ細胞の短期的活性化は、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターを使用する場合であっても、ＮＫ細胞の形質導入率を増加させる。
【図4】ＩＬ－１８でのＮＫ細胞の活性化は、ＩＬ－３３と同様に、ＮＫ細胞の形質導入率を増加させる。
【図5】ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターにより形質導入した活性化ＮＫ細胞が、非形質導入ＮＫ細胞と同様の増殖率を示し、形質導入それ自体により、細胞死は誘導されず、細胞増殖は影響されない。
【図6】ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによるＮＫ細胞への形質導入後の導入遺伝子発現は長期間安定である。
【図7A】ＮＫ細胞の活性化およびＢａＥＶシュードタイプ化の使用は、非常に高い形質導入率を可能にし、これによりＣＡＲ発現が高いＮＫ細胞の生成が可能となる。
【図7B】異なる標的細胞は、表面マーカーＣＤ１９について異なる発現プロファイルを示し、これにより、それらはＣＤ１９－ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の機能性試験に適した標的となる。
【図7C】形質導入方法により、Ｋ５６２細胞の殺滅（ｋｉｌｌｉｎｇ）により実証される不変で高い細胞毒性、及びＣＤ１９陽性のＲＳ４；１１細胞およびＲａｊｉ細胞の殺滅により実証される著しく増加したＣＤ１９特異的細胞毒性活性を有する、ＣＤ１９－ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の生成を可能にする。
【図8】ナイーブおよび活性化ＮＫ細胞をウエスタンブロットに供して、ヒヒエンベロープ受容体ＡＳＣＴ２の発現を調べた。ナイーブではない活性化ＮＫ細胞は、ヒヒエンベロープＡＳＣＴ２の受容体を発現した。
【図9A】細胞増殖および形質導入アッセイは、静止ＮＫ細胞ではなく、増殖性ＮＫ細胞のみが、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入可能であることを示した。
【図9B】増殖性および形質導入可能なＮＫ細胞のサブセットは、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔである。対照的に、非増殖性かつ形質導入不可能なＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｄｉｍである。
【図10】増殖性及び形質導入したＮＫ細胞サブセット、増殖性であるが形質導入していないＮＫ細胞サブセット、ならびに静止状態のＮＫ細胞サブセット間におけるいくつかのＮＫ細胞受容体の比較は、静止ＮＫ細胞は、増殖性ＮＫ細胞とは表現型が著しく異なることを示した。増殖性細胞は、よりＣＤ５６強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）であり、ＣＤ１６発現がより低く、活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現がより高く、ならびにＴＲＡＩＬおよびＮＫＧ２Ａの発現がより高い傾向を有した。
【図11A-B】増殖された静止状態のＮＫ細胞のサブセットの細胞表面タンパク質のマーカースクリーニング。５人のドナー由来のＮＫ細胞を使用して、３７１種の表面マーカーについて、フローサイトメトリーにより解析した。静止ＮＫ細胞との直接比較では、増殖性およびＧＦＰ陽性のＮＫ細胞は、３２種のマーカーをより高いレベルで、５種のマーカーをより低いレベルで発現した（図１１Ａ）。増殖性および形質導入可能なＮＫ細胞サブセットの最も明白なマーカーは、ＣＸ３ＣＲ１発現の非存在およびＴＲＡＩＬを強力に発現する細胞の高い頻度であった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
【図12A】種々のＮＫ細胞サブセットを、形質導入および培養の前に、それらのＣＸ３ＣＲ１発現に基づいて、ＭＣＡＳソーティングを使用して分離した。ソーティングなしでは、ドナー由来の血液由来ＮＫ細胞間のＣＸ３ＣＲ１の発現は、８６％であり、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞は、１４％であった。ソーティング後、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の平均頻度は、ＣＸ３ＣＲ１の濃縮により２％に低下し、一方、マーカーの枯渇はＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞集団の９１％の濃縮をもたらした。
【図12B】別々にソートしたＮＫ細胞画分の培養の直後、増殖における顕著な違いを観察した。非ソートＮＫ細胞サブセット、ＣＸ３ＣＲ１濃縮（ＣＸ３ＣＲ１陽性）ＮＫ細胞サブセット、およびＣＸ３ＣＲ１枯渇（ＣＸ３ＣＲ１陰性）ＮＫ細胞サブセット間では、ＮＫ細胞増殖の割合は、それぞれ２８、１１および８１であった。
【図12C】ＮＫ細胞のＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ画分は、高度に形質導入可能である。ソートしたＮＫ細胞画分の形質導入から２日後、非ソートＮＫ細胞サブセット、ＣＸ３ＣＲ１ｅｎｒｉｃｈｅｄＮＫ細胞サブセット、およびＣＸ３ＣＲ１ｄｅｐｌｅｔｅｄＮＫ細胞サブセットの形質導入は、それぞれ２１％、７％および６９％であった。
【図13】ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターおよびＩＬ－１ベータを使用したＮＫ細胞へのレンチウイルス形質導入から１０日後のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現。
【発明を実施するための形態】
【0015】
一態様において、本発明は、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入するためのｉｎ－ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）ＮＫ細胞を活性化するステップと、
ｂ）前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を前記活性化ＮＫ細胞に添加するステップと
を含み、
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含み、それにより前記活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入する、方法を提供する。
ａ）ＮＫ細胞を活性化するステップと、
ｂ）前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を前記活性化ＮＫ細胞に添加するステップと
を含み、
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含み、それにより前記活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入する、方法を提供する。
【0016】
前記ＮＫ細胞が、ヒトＮＫ細胞である、前記方法。
【0017】
活性化する前記ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞を含む試料、例えば、全血試料、または、例えば、バフィーコートから得ることができる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料中に存在する、前記方法。
【0018】
ＮＫ細胞の前記活性化の前に、ＮＫ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１陽性およびＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞を含む集団または試料から、ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞について濃縮され得る、前記方法。
【0019】
ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞またはＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞サブセット／亜集団の前記濃縮は、ＣＸ３ＣＲ１陽性およびＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞を含む試料または集団からの分離プロセスにおけるＣＸ３ＣＲ１陰性細胞の枯渇により実施することができ、枯渇した画分は、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体またはその断片を使用した、例えば、細胞分離方法などの分離方法、例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）またはフローサイトメトリーなどの蛍光活性化細胞ソーティングによる、ＣＸ３ＣＲ１陰性細胞を含む標的画分である。
【0020】
ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞亜集団（またはＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞）は、極めて高い形質導入率を達成するため、本明細書に開示の方法により形質導入するために好ましい（実施例９を参照）。
【0021】
ステップａ）において活性化する前記ＮＫ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞である、前記方法。好ましくは、前記ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞は、本明細書に開示の方法において活性化されるために使用されるＮＫ細胞を含む組成物中に、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満のＣＸ３ＣＲ１陽性ＮＫ細胞を含む。
【0022】
造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、当技術分野において周知であり、例えば、ＷＯ２０１３／０４５６３９Ａ１に開示されている。
【0023】
造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な前記修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質が、
ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または
細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
であってもよい、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子。
ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または
細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
であってもよい、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子。
【0024】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子は、少なくとも
ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または
細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
を含んでもよい。
ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または
細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質
を含んでもよい。
【0025】
前記ＮＫ細胞の前記活性化が、少なくとも１つのサイトカイン、またはフィーダー細胞もしくはフィーダー細胞の膜粒子、あるいはＮＫ細胞活性化試薬を前記ＮＫ細胞に添加することにより達成することができる、前記方法。通常は、２～３日後に、ＮＫ細胞活性化の効果によってＮＫ細胞の増殖がもたらされる。
【0026】
前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１を含むがそれらに限定されない共通ガンマ鎖サイトカイン、またはＩＬ－１ａ（ＩＬ－１アルファ）、ＩＬ１ｂ（ＩＬ－１ベータ）、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、Ｉｌ－３６、ＩＬ３７およびＩＬ３８を含むがそれらに限定されないＩＬ－１ファミリーサイトカインからなる群から選択される、前記方法。
【0027】
前記少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２であり得る。
【0028】
前記少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－１５であり得る。
【0029】
前記サイトカインは、ＩＬ－２およびＩＬ１５であり得る。
【0030】
ＮＫ細胞を活性化する、サイトカインまたはサイトカインの組合せ（例えば、ＩＬ－２および／またはＩｌ－１５）が、ＩＬ－１ファミリーサイトカインと組み合わされ、それにより、ＩＬ－１ファミリーサイトカインを用いない活性化と比較して、前記ＮＫ細胞の早期の活性化（「短期的活性化」）をもたらす、前記方法。
【0031】
ＮＫ細胞の前記活性化が、ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインと、ＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、サイトカインの組合せを添加することにより達成され、それによりＮＫ細胞の短期的活性化をもたらす、前記方法。
【0032】
サイトカインの前記組合せが、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５とＩＬ－１ファミリーサイトカインである、前記方法。ＮＫ細胞を活性化する１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５）をＩＬ－１ファミリーサイトカイン（例えば、ＩＬ－１８またはＩＬ－３３）とともに使用すると、例えば、ＮＫ細胞の活性化のための培養プロセスの開始と、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子による活性化ＮＫ細胞の効率的な形質導入を可能とする開始点との間の期間を減少させる、短期的活性化がもたらされる。驚くべきことに、ＩＬ－１ファミリーサイトカインとＮＫ細胞を活性化する１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５）との組合せ、および本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子による形質導入により、より長いプロセスにおいて活性化された、すなわち、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータなどのＩＬ－１ファミリーサイトカインの存在により誘導される短期的活性化プロセスからの利点を得ない、ＮＫ細胞へのレトロウイルスベクター粒子の形質導入と比較して、より高い形質導入率がもたらされる。
【0033】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６アルファ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３６ベータ、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－３８およびＩＬ－３３からなる群から選択することができる。
【0034】
好ましくは、前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータであり得る。
【0035】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインが、ＩＬ－１８であり、それにより、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）以内の短期的活性化がもたらされる、前記方法。
【0036】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインが、ＩＬ－３３であり、それにより、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）以内の短期的活性化がもたらされる、前記方法。
【0037】
ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、例えば、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータを、例えば、細胞培養系の初期に、ＮＫ細胞を活性化することが知られている他のサイトカインとともに、ＮＫ細胞を含む培地に添加すると、前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインの添加後、早ければ、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）で前記ＮＫ細胞の活性化がもたらされる。したがって、ＩＬ－１ファミリーサイトカインを、好ましくは細胞培養培地中の、ＮＫ細胞に添加すると、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）以内にＮＫ細胞の短期的活性化がもたらされる。
【0038】
上記のサイトカインは、当業者に周知であり、一般的に使用される濃度で、前記ＮＫ細胞を含む細胞培養培地に与えることができる。
【0039】
前記ＮＫ細胞の前記活性化が、他のサイトカイン、またはフィーダー細胞もしくはフィーダー細胞の膜粒子、あるいはＮＫ細胞活性化試薬を、前記ＮＫ細胞に添加せずに、１つのＩＬ－１ファミリーサイトカインを添加することにより達成することができる、前記方法。
【0040】
前記ＮＫ細胞の前記活性化が、１つのＩＬ－１サイトカインを、フィーダー細胞もしくはフィーダー細胞の膜粒子、またはＮＫ細胞活性化試薬とともに、前記ＮＫ細胞に添加することにより達成することができる、前記方法。
【0041】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子によるＮＫ細胞の形質導入効率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％である、前記方法。
【0042】
前記生体物質が、前記レトロウイルスベクター粒子により前記ＮＫ細胞に形質導入される場合、１つまたは複数の核酸である、前記方法。
【0043】
前記レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、レンチウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子である、前記方法。
【0044】
閉鎖系の自動化プロセスにおいて実施される、前記方法。
【0045】
別の態様において、本発明は、活性化ＮＫ細胞に生体物質をｉｎ－ｖｉｖｏで導入することによる、障害を患うヒトの治療における使用のための、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子であって、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な、本明細書に開示の修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含み、それにより前記活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入する、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を提供する。
【0046】
障害は、前記ＮＫ細胞により治療されるか、または治療可能であり得る、障害であり得る。
【0047】
さらなる態様において、本発明は、活性化ＮＫ細胞に生体物質をｉｎ－ｖｉｖｏで導入することによる、障害を患うヒトの治療における使用のための、組成物の組合せであって、
ａ）ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインを含む第１の組成物と、
ｂ）シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を含む組成物
とを含み、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な、本明細書に開示の修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む、組成物の組合せを提供する。
ａ）ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインを含む第１の組成物と、
ｂ）シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子を含む組成物
とを含み、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な、本明細書に開示の修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む、組成物の組合せを提供する。
【0048】
障害は、前記ＮＫ細胞により治療されるか、または治療可能であり得る、障害であり得る。
【0049】
前記第１の組成物が、ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインとＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、サイトカインの組合せを含む、前記組成物の組合せ。
【0050】
サイトカインの前記組合せが、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５とＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、前記組成物の組合せ。
【0051】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインが、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータである、前記組成物の組合せ。
【0052】
改変ＮＫ細胞を調製するための前記組成物の組合せ。
【0053】
前記生体物質が、キメラ抗原受容体をコードする核酸である、前記組成物の組合せ。
【0054】
別の態様において、本発明は、活性化ＮＫ細胞に生体物質を導入するための、シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子の使用であって、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子が、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な、本明細書に開示の修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質を含む、使用を提供する。
【0055】
改変ＮＫ細胞を調製するための、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子の使用。
【0056】
前記生体物質が、キメラ抗原受容体をコードする核酸である、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子の使用。
【0057】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示の方法により入手可能な、形質導入および／または改変ＮＫ細胞を提供する。
【0058】
前記ＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体を発現するように改変される、前記改変ＮＫ細胞。
【0059】
一態様において、本発明は、本明細書に開示の方法により得た改変ＮＫ細胞の医薬組成物を提供する。
【0060】
前記改変ＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、前記医薬組成物。
【0061】
別の態様において、本発明は、ＮＫ細胞を活性化する少なくとも１つのサイトカインとＩＬ－１ファミリーサイトカインとを含む、ＮＫ細胞の短期的活性化のためのサイトカインの組合せを提供する。
【0062】
前記サイトカインの組合せは、ＩＬ２および／またはＩＬ－１５とＩＬ－１ファミリーサイトカインであり得る。
【0063】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータであり得る。
【0064】
本発明の態様、例えば、本発明の第１の態様に関する、本明細書に定義のすべての定義、特性および実施形態は、本明細書に開示の本発明の他の態様の文脈においても準用する。
【0065】
定義
他に定義しない限り、本明細書において使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
他に定義しない限り、本明細書において使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【0066】
レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）は、ＤＮＡ中間体に逆転写され、次いで、宿主細胞ゲノムに組み込まれる、１本鎖で２倍体のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスファミリーである。レトロウイルス科由来のウイルスは、直径８０～１２０ｎｍの、エンベロープを有する粒子である。
【0067】
（レトロ／レンチ／ガンマレトロ）ウイルスベクターは、対応するウイルスファミリーに由来する、複製欠損ウイルス粒子である。それらは、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質、１本鎖ＲＮＡゲノムを含有し、通常、他のウイルスに由来する異種性エンベロープタンパク質により、例えば、本明細書に開示のヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質により、シュードタイプ化される。前記ウイルスベクターのＲＮＡゲノムは、後代ウイルスを産生するいかなるウイルス遺伝子をも含有しないが、ＤＮＡの効率的なパッケージングおよび逆転写に必要とされるｐｓｉエレメントおよびＬＴＲを含有する。ＤＮＡ中間体は、適切なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターの制御下で目的の遺伝子を含有し得、目的の遺伝子は、前記ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込むと発現する。宿主細胞への侵入、ＲＮＡゲノムの送達、目的の遺伝子の組込みおよび発現のプロセスは、形質導入と呼ばれる。ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスをベースとするウイルスベクターの最小必要要件は、当技術分野において十分に説明されている。
【0068】
加えて、インテグラーゼ欠損レトロウイルスベクター（ＩＤ－ＲＶ）が開発されており、これは、レトロウイルスベクターゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むことができない。ＩＤ－ＲＶは、従来のレトロウイルスベクターに由来するが、レトロウイルスインテグラーゼもその変異型も含有しない。宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスベクターゲノムは、細胞質で逆転写され、核に送達されるが、宿主細胞ゲノムに安定には組み込まれない。ＩＤ－ＲＶは、目的の遺伝子を一過性に発現させるために有用なツールである。レトロウイルスベクターおよび形質導入の定義は、組込み欠損レトロウイルスベクターおよびその適用にも及ぶ。
【0069】
レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、長い潜伏期間により特徴づけられる、慢性的かつ致命的な疾患を、ヒトおよび他の哺乳動物種において引き起こす、レトロウイルス科の属である。最も知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）のＨＩＶであり、これは、非分裂細胞に効率的に感染させることができ、このため、レンチウイルス由来のレトロウイルスベクターは、遺伝子送達の最も効率的な方法のうちの１つである。
【0070】
ガンマレトロウイルス属（Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）は、レトロウイルス科ファミリーの属である。代表的な種は、マウス白血病ウイルスおよびネコ白血病ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）である。
【0071】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に似ているが、ウイルス様粒子のタンパク質をコードするウイルス遺伝物質をそれらが含有しないため、感染または形質導入しない。特に、レトロウイルスベクターの文脈におけるＶＬＰは、ｐｓｉ陽性核酸分子を含有しない。一部のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含有し得る。ウイルス構造タンパク質、例えば、エンベロープまたはカプシドが発現すると、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の集合がもたらされ得る。レトロウイルスベクターと同様に、ＶＬＰは、レトロウイルスベクターと同一のエンベロープ構築物を使用して、シュードタイプ化することもできる。ＶＬＰを使用して、タンパク質だけでなく核酸も、標的細胞の細胞質に送達することができる。特に、ＶＬＰは、ワクチンとして有用である。
【0072】
用語「ＶＬＰ取込み」は、本明細書において使用する場合、ＶＬＰが標的細胞膜に結合し、それにより核酸分子、タンパク質またはペプチドを標的細胞に放出することを指す。
【0073】
用語「活性化」は、本明細書において使用する場合、標的細胞の機能、増殖および／または分化を高める細胞により生理学的変化を誘導することを指す。
【0074】
用語「シュードタイプ化する」または「シュードタイプ化」は、本明細書において使用する場合、エンベロープを有する他のウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質を有するベクター粒子を指す。したがって、本発明のレンチウイルスベクターまたはベクター粒子の宿主範囲は、糖タンパク質により使用される細胞表面受容体のタイプに応じて拡大または変更することができる。
【0075】
レトロウイルスベクターを生成するために、ベクター粒子の集合に必要とされるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質は、パッケージング細胞株、例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔによってトランスに供給される。これは、通常、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを用いた、パッケージング細胞株のトランスフェクションにより達成される。シュードタイプ化ベクターの生成では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、ならびにＲＮＡ分子または発現ベクターと同一のレトロウイルスに元来由来するｅｎｖ遺伝子は、エンベロープを有する異なるウイルスのエンベロープタンパク質（複数可）と交換される。
【0076】
ヒヒ内在性レトロウイルスまたはＢａＥＶは、ヒヒのＤＮＡの複数のプロウイルスコピーに存在するＣ型レトロウイルスである。ＷＯ２０１３０４５６３９Ａ１では、野生型ＢａＥＶ糖タンパク質よりも高レベルでレンチウイルス表面に組み込まれた、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質（非修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質）および定義の変異（修飾）を有するＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質が、詳細に記載されている。
【0077】
用語「ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質」は、本明細書において使用する場合、野生型形態のＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質、または前記変異糖タンパク質が、造血細胞膜に結合し、それと融合する野生型糖タンパク質の能力を保持する限りにおいて、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一の、前記野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の変異体を指す。
【0078】
好ましくは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号１の配列からなる。当業者に公知のように、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、細胞質尾部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインで構成される。エンベロープ糖タンパク質配列中の、細胞質尾部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインに対応する領域は、当業者により容易に決定することができる。典型的には、細胞質尾部ドメインは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸５３０～５６４の間に位置する。典型的には、膜貫通ドメインは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸５０７～５２９の間に位置する。典型的には、細胞外ドメインは、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸１～５０６の間に位置する。
【0079】
本発明の特定の実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインは、融合阻害Ｒペプチドを欠く。
【0080】
本発明の文脈では、表現「融合阻害Ｒペプチド」は、チロシンエンドサイトーシスシグナル－ＹＸＸＬ－（配列番号２）を内部に有し、ビリオンの成熟中にウイルスプロテアーゼにより切断され、それによりエンベロープ糖タンパク質の膜融合が促進される、エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインのＣ末端部を指す。ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の融合阻害Ｒペプチドは、典型的には、野生型ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸５４７～５６４の間に位置する。
【0081】
したがって、特に好ましい実施形態では、細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはそれにより構成される。
【0082】
別の特定の実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインにより置換される。
【0083】
マウス白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、好ましくは、４０７０Ａ株のエンベロープ糖タンパク質である。
【0084】
本発明の文脈では、用語「ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質」は、野生型形態のＭＬＶエンベロープ糖タンパク質、または前記変異糖タンパク質が、ウイルスコアタンパク質と、特に、レンチウイルスコアタンパク質と相互作用する野生型エンベロープ糖タンパク質の能力を保持する限りにおいて、前記野生型ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％同一の、前記野生型ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質の変異体を指す。
【0085】
エンベロープ糖タンパク質配列中の細胞質尾部ドメインに対応する領域は、当業者により容易に決定することができる。典型的には、ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインは、野生型ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸６２２～６５４の間に位置する。
【0086】
したがって、特に好ましい実施形態では、ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、ＭＬＶエンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、またはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれにより構成される。
【0087】
本明細書において意図するように、表現「生体物質」は、細胞の構造および／または機能を変更しやすい、１つまたは複数の化合物に関する。本発明の文脈では、生体物質が、１つまたは複数の核酸であることが好ましく、これは、レンチウイルスベクター粒子の場合、ベクター粒子のゲノムに含むことができる。
【0088】
本明細書において意図するように、「導入すること」は、標的細胞に結合すると、標的細胞の膜または細胞質に生体物質を初めに送達する、ベクター粒子またはベクター様粒子の能力に関する。本明細書では、通常、標的細胞は、ＮＫ細胞である。
【0089】
用語「ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）」は、本明細書において使用する場合、通常、ヒトＮＫ細胞であり、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、リンパ球系共通前駆細胞を産生するＢおよびＴリンパ球から分化した第３種の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺内で分化および成熟し、次いで、それらが循環に入ることが知られている。ＮＫ細胞は、由来およびそれぞれのエフェクター機能によって、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）と表現型的に異なり、ＮＫＴ細胞活性により、ＩＦＮγが分泌されることによりＮＫ細胞活性が促進されることが多い。ＮＫＴ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）もしくはｐａｎ ＴマーカーＣＤ３または表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体を発現しないが、それらは、通常、表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６をヒトにおいて、ＮＫ１．１またはＮＫ１．２をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて発現する。最大８０％のヒトＮＫ細胞は、ＣＤ８も発現する。持続的に増殖するＮＫ細胞株は、がん患者から確立することができ、一般的ＮＫ細胞株は、例えば、ＮＫ－９２、ＮＫＬおよびＹＴＳである。
【0090】
用語「力価」または「形質導入効率」は、それらの標的細胞を形質導入するそれらの能力に関して、ベクター粒子を特徴づけ、比較する手段として使用する。したがって、「力価が高い」または「形質導入効率が高い」ベクター粒子は、同量の他のベクター粒子よりも多数の細胞に、所与のベクター粒子量で形質導入可能である。
【0091】
用語「活性化ＮＫ細胞」は、本明細書において使用する場合、ナイーブな新たに単離した非活性化ＮＫ細胞と比較した、刺激条件による細胞の変化を指し、これは、遺伝子発現プロファイルの変化または細胞シグナル伝達の変化として現れ、非活性化ＮＫ細胞と比較して種々の細胞特性を有するＮＫ細胞をもたらす。「活性化ＮＫ細胞」は、例えば、ある特定の表面受容体、例えば、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１もしくはＴＲＡＩＬの発現を増加させるか、またはサイトカイン受容体の発現を変化させ、例えば、ＣＤ２５を上方制御し得る。活性化ＮＫ細胞は、それらの細胞周期を、Ｇ０の静止細胞からＧ１、ＳまたはＧ２へと変化させることができ、増殖を開始させるか、またはより急速に増殖させることができる。
【0092】
用語「ＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞」または「ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞」または「ＣＸ３ＣＲ１－ＮＫ細胞」または「ＣＸ３ＣＲ１枯渇ＮＫ細胞」または「ＣＸ３ＣＲ１ｄｅｐｌｅｔｅｄＮＫ細胞」は、マーカーＣＸ３ＣＲ１をそれらの細胞表面に発現しないＮＫ細胞の集団を指す。
【0093】
フラクタルカイン受容体としても知られるＣＸ３Ｃケモカイン受容体１（ＣＸ３ＣＲ１）またはＧタンパク質共役受容体１３（ＧＰＲ１３）は、ヒトにおいてＣＸ３ＣＲ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。名称が示唆するように、この受容体は、ケモカインＣＸ３ＣＬ１（ニューロタクチンまたはフラクタルカインとも呼ばれる）を結合させる。
【0094】
用語「短期的活性化」は、本明細書において使用する場合、Ｉｌ－１ファミリーサイトカインを、例えば、活性化するＮＫ細胞を含む細胞培養培地に添加することにより、例えば、ＮＫ細胞を活性化することが知られている種々のサイトカインを使用するが、ＩＬ－１ファミリーサイトカインは使用しない標準的なＮＫ細胞活性化と比較して、ＮＫ細胞を迅速に活性化させる可能性を指す。ＮＫ細胞活性化は、ＩＬ－１ファミリーの存在下で１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）を過ぎた後に発生する。
【0095】
用語「ＮＫ細胞活性化試薬」は、ＮＫ細胞に活性化シグナルをもたらす１つまたは複数の刺激作用物質、例えば、ＣＤ２およびＣＤ３３５に対する刺激抗体とカップリングさせた分子、例えば、粒子、ビーズまたはナノマトリックス（ｎａｎｏｍａｔｒｉｘ）を指す。そのようなＮＫ細胞活性化試薬の例は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＮＫ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、注文番号１３０－０９４－４８３）またはＥＰ２８２４１１２Ｂ１に記載されているナノマトリックスである。
【0096】
インターロイキン－１ファミリー（ＩＬ－１ファミリー）は、１１種のサイトカインの群であり、感染症または無菌性傷害に対する免疫および炎症応答の制御において中心的役割を果たす。
【0097】
前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＩＬ－１アルファ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３６Ｒａ、ＩＬ－３６アルファ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３６ベータ、ＩＬ－３６ガンマ、ＩＬ－３８およびＩＬ－３３である。本明細書に開示するように、例えば、他のサイトカインを使用した、標準的（先行技術の）ＮＫ細胞活性化プロセスに、ＩＬ－１ファミリーサイトカインを添加すると、ＮＫ細胞活性化が加速され、ＮＫ細胞の短期的活性化がもたらされる。
【0098】
ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、一部のアミノ酸が欠失、付加または置換されているがサイトカインの機能は依然として保持する、その変異体でもあり得る。したがって、この定義では、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の、アミノ酸配列レベルにおける配列同一性を有する、野生型サイトカインのアミノ酸配列の変異体を含む。本発明の文脈では、「配列同一性」は、当技術分野において周知のアミノ酸配列用アラインメントプログラムを使用した、ペアワイズアラインメントを使用して決定することができる。
【0099】
ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、完全長サイトカイン（「Ｉｌ－１ファミリーサイトカインまたはその機能性断片」）の対応する部分に対する、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、アミノ酸配列レベルにおける配列同一性を有する、前記完全長サイトカインの機能性断片でもあり得る。
【0100】
一般に、すべてのアミノ酸の変異（すなわち、ＩＬ－１ファミリーサイトカインのアミノ酸の置換、付加または欠失）が、この定義の下で包含され、これは、本明細書に開示のＩＬ－１ファミリーサイトカインの特性の喪失をもたらさない。
【0101】
用語「発現」は、本明細書において使用する場合、細胞において、そのプロモーターにより引き起こされる、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義する。
【0102】
用語「フィーダー細胞」は、標的細胞（すなわち、ここではナチュラルキラー細胞）の培養物に添加して、それらの生存および／または増殖を支持する細胞を指す。フィーダー細胞は、インタクトおよび機能性の細胞外マトリックスおよびマトリックス関連因子をもたらし、公知および未知のサイトカインを馴化培地中に分泌する。フィーダー細胞は、通常、増殖が停止しており、培養物中でその増殖は阻止されるが、その生存は維持される。増殖停止は、有効量の放射線照射または有効量のマイトマイシン（Ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃなどの化学物質による処置により達成することができる。放射線照射した末梢血単核細胞（以下、「ＰＢＭＣ」とも略す）、ＮＫ細胞が枯渇したＰＢＭＣ、がん細胞株、遺伝子改変がん細胞株、およびエプスタイン－バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）（以下、「ＥＢＶ」とも略す）による自然感染により不死化したリンパ球を含む、数種類のフィーダー細胞が存在する。
【0103】
本明細書において使用する場合、用語「培養すること」は、ＮＫ細胞の維持に必要とされる化学的および物理的条件（例えば、温度、気体）、ならびに増殖因子を供給することを含む。ＮＫ細胞を培養することは、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）（増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ））のための条件をＮＫ細胞に供給することを含むことが多い。ＮＫ細胞の増殖を支持し得る化学的条件の例としては、通常、ＮＫ細胞増殖に適する細胞培養培地に供給される（または手動で与えられ得る）、バッファー、血清、栄養素、ビタミン、抗生物質、サイトカインおよび他の増殖因子を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＮＫ細胞培養培地は、５％のＡＢ型ヒト血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加した、ＮＫ ＭＡＣＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を含む。ＮＫ細胞を増殖させるための使用に適する他の培地は、当技術分野において周知である。
【0104】
用語「細胞培養培地」は、本明細書において使用する場合、ＮＫ細胞の維持に必要とされる化学的条件を供給する液体を含む。ＮＫ細胞の増殖を支持し得る化学的条件の例としては、通常、細胞培養培地に供給される（または手動で与えられ得る）、溶液、バッファー、血清、血清成分、栄養素、ビタミン、サイトカインおよび他の増殖因子を含むが、これらに限定されない。当技術分野において公知の、ＮＫ細胞を培養するための使用に適する培地は、ＮＫ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、ＢＩＮＫＩＴ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ ＵＳＡ）、ＡＩＭ－Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ｕｐｃｙｔｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。用語「ＩＬ－２」および「ＩＬ－１５」は、本明細書において使用する場合、サイトカインであるインターロイキン－２およびインターロイキン－１５ならびにそれらの誘導体、例えば、ＩＬ－２スーパーカイン、ＩＬ－２ジフテリア毒素融合タンパク質またはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを指す。
【0105】
用語ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、一般的に、共通ガンマ鎖およびＩＬ２／ＩＬ１５Ｒβ（ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ１２２としても知られる）を共有する、ＩＬ２およびＩＬ１５のヘテロ３量体の受容体に結合する、サイトカインの４α－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーを指す。
【0106】
用語「有効濃度のＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を（繰返し）添加すること」は、本明細書において使用する場合、１Ｕ／ｍＬ～５０００Ｕ／ｍＬの間、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ～１０００Ｕ／ｍＬの間、より好ましくは５０～５００Ｕ／ｍＬの間の、前記細胞培養培地中のＩＬ－２の濃度を指し、および／または０．１～１０００ｎｇ／ｍＬの間、好ましくは１～２００ｎｇ／ｍＬの間、より好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍＬの間の、前記細胞培養培地中のＩＬ－１５の濃度を指す。通常、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の濃度は、培養プロセス中、経時的に低下し、それによりＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を、細胞培養培地に繰返し添加して、有効濃度（複数可）のサイトカイン（複数可）のレベルを維持することができる。通常、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５は、細胞培養培地を交換することにより細胞培養物に再度添加することができる。この文脈において、「繰返し」は、全培養プロセスにおける少なくとも１回の繰返しを意味する。培養プロセスの初期にＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を添加することは必要ではないが、少なくとも最初の培地交換、すなわち、７日後に添加することは必要である。しかし、それにもかかわらず、培養プロセスの初期にＩＬ２および／またはＩＬ－１５を添加することは、有益である。
【0107】
本明細書において使用する場合、用語「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」または「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」は、細胞増殖または細胞数の増倍を指す。増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、本明細書において使用する場合、培養プロセス中に発生するＮＫ細胞数の上昇に関する。
【0108】
用語「培養プロセス」または「培養」は、本明細書において使用する場合、ＮＫ細胞の培養および増殖を指し、培養プロセス、すなわち、ＮＫ細胞増殖の開始日（開始点）は、０日目と定義する。培養プロセスは、オペレーターにより所望の限り持続させることができ、細胞培養培地が、細胞を生存および／または成長および／または増殖可能とする条件を有する限り実施することができる。
【0109】
用語「培養プロセスの初期」は、本明細書において使用する場合、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５などの増殖因子を細胞培養培地に添加することによる増殖プロセスの開始、すなわち、細胞の増殖プロセスの開始を惹起することを指す。ＩＬ－１８またはＩＬ－３３などのＩＬ－１ファミリーサイトカインを添加すると、ＮＫ細胞の活性化プロセスが加速され、効率的な形質導入が準備されるため、ＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＮＫ細胞を活性化する他の周知のサイトカインとともに培地に与えるべきである。好ましくは、有効濃度のＩＬ－１ファミリーサイトカインは、細胞培養培地に一度だけ添加する。あるいは、有効濃度のＩＬ－１ファミリーサイトカインは、繰返して、例えば、２回またはそれよりも頻繁に前記細胞培養培地に添加する。
【0110】
用語「有効濃度のＩＬ－１ファミリーサイトカインを（繰返し）添加すること」は、本明細書において使用する場合、１Ｕ／ｍＬ～５０００Ｕ／ｍＬの間、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ～１０００Ｕ／ｍＬの間、より好ましくは５０～５００Ｕ／ｍＬの間の、前記細胞培養培地中の前記ＩＬ－１ファミリーサイトカインの濃度を指す。用語「フィーダー細胞の膜粒子」は、本明細書において使用する場合、フィーダー細胞の表面分子を刺激するＮＫ細胞を含有する、フィーダー細胞の膜調製物を指す。フィーダー細胞の膜粒子は、生フィーダー細胞の考えられる不利益を回避するために利用することができる。フィーダー細胞の膜粒子は、窒素キャビテーションの後、密度勾配遠心分離による細胞膜画分の単離および精製を使用した、細胞の溶解および破壊により生成することができ、例えば、Ｏｙｅｒらに記載されている（Ｏｙｅｒ ２０１５）。通常は、本明細書に開示の方法では、フィーダー細胞は、前記フィーダー細胞の膜粒子により置換することができる。好ましくは、膜粒子は、使用する生フィーダー細胞により得ることができる量と同等の量で使用すべきである。好ましくは、使用する膜粒子の濃度は、１００～４００μｇ／ｍＬの間、より好ましくは１５０～２５０μｇ／ｍＬの間であり得る。膜粒子の添加は、生フィーダー細胞を添加する場合と同じ頻度で実施することができる。
【0111】
用語「改変細胞」および「遺伝子修飾細胞」（本明細書においては特にＮＫ細胞）は、本明細書において使用する場合、互換的に使用することができる。用語は、外来の遺伝子または核酸配列を含有および／または発現し、次いで、細胞またはその後代の遺伝子型または表現型を修飾することを意味する。特に、用語は、当技術分野において周知の組換え方法により細胞を操作して、これらの細胞において自然の状態では発現しない、ペプチドまたはタンパク質を安定または一過性に発現させることができるということを指す。用語「閉鎖系」は、本明細書において使用する場合、新しい物質の導入などの培養プロセスの実施、ならびに細胞の増殖、分化、活性化、および／または分離などの細胞培養ステップの実施の間の細胞培養物夾雑のリスクを低下させる、任意の閉鎖系を指す。そのような系により、ＧＭＰまたはＧＭＰ様の（「無菌」）条件下で操作して、臨床的に適用可能な細胞組成物をもたらすことが可能となる。本明細書では例として、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を閉鎖系として使用する。この系は、ＷＯ２００９／０７２００３に開示されている。しかし、本発明の方法の使用を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙに限定することを意図していない。用語「自動化方法」または「自動化プロセス」は、本明細書において使用する場合、自動ではなくオペレーターにより手動で実施し得るか、または実施可能な、デバイスならびに／またはコンピュータおよびコンピュータソフトウェアの使用によって自動化された任意のプロセスを指す。自動化された方法（プロセス）は、実現に必要なヒトによる介入が少なく、人的時間が少なくて済む。ある場合では、本発明の方法は、本方法の少なくとも１つのステップを、いかなるヒトの支援または介入もなしに実施する場合、自動化されている。好ましくは、本発明の方法は、本明細書に開示の方法のすべてのステップを、ヒトの支援または介入なしに実施する場合、自動化されている。好ましくは、自動化プロセスは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙなどの閉鎖系上で実行する。ＣＡＲは、ヒンジおよび膜貫通領域を介して細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインとカップリングさせた、ある特定の標的抗原に特異的な抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。最も一般的なリンパ球活性化部分は、細胞トリガー（例えば、ＣＤ３ζ）部分と協力する、細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２７）ドメインを含む。ＣＡＲにより媒介される養子免疫療法により、ＣＡＲ移植細胞が、ＨＬＡによって制限されずに標的細胞上の所望の抗原を直接認識することが可能となる。
【0112】
実施形態
本発明の一実施形態では、トランスジェニック核酸、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸は、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子により活性化ＮＫ細胞に導入する。
本発明の一実施形態では、トランスジェニック核酸、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸は、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子により活性化ＮＫ細胞に導入する。
【0113】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く、修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含んでもよい。
【0114】
ＮＫ細胞を含む細胞培養培地中のＮＫ細胞は、例えば、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５を培地に添加することにより、活性化する。２～５日後、ＮＫ細胞活性化の効果により、ＮＫ細胞の増殖がもたらされる。次いで、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子を培地に、すなわち、活性化ＮＫ細胞に添加することができる。活性化ＮＫ細胞は、前記ベクター粒子により形質導入し、培地中で増殖させて、導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体を発現させる。
【0115】
これらの改変ＮＫ細胞を使用して、それを必要とする対象を治療することができる。
【0116】
本発明の別の実施形態では、トランスジェニック核酸、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸は、造血細胞膜に結合し、それと融合することが可能な修飾ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質によりシュードタイプ化した、レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子により活性化ＮＫ細胞に導入される。
【0117】
前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子は、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）エンベロープ糖タンパク質の膜貫通および細胞外ドメインと、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部ドメインとの融合を含むか、もしくはそれにより構成されるキメラエンベロープ糖タンパク質、または細胞質尾部ドメインが融合阻害Ｒペプチドを欠く修飾ＢａＥＶエンベロープ糖タンパク質を含んでもよい。
【0118】
ＮＫ細胞を含む細胞培養培地中のＮＫ細胞は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５と、ＩＬ－１ファミリーサイトカイン、例えば、ＩＬ－１８またはＩＬ－３３とを培地に添加することにより活性化する。１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間（１日）、２８時間、３６時間、４２時間または４８時間（２日）後、ＮＫ細胞は、活性化される。次いで、前記シュードタイプ化レトロウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスベクター粒子を培地に、すなわち、活性化ＮＫ細胞に添加する。活性化ＮＫ細胞は、前記ベクター粒子により形質導入し、培地中で増殖させて、導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体を発現させる。
【0119】
これらの改変ＮＫ細胞を使用して、それを必要とする対象を治療することができる。
【0120】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、臨床規模の細胞分離装置（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ３の枯渇およびＣＤ５６の濃縮により精製したＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0121】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、完全な閉鎖系（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）における、すべての磁気標識するステップを含む、ＣＤ３の枯渇およびＣＤ５６の濃縮により精製することができる。
【0122】
これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0123】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、ヒト血液試料、例えば、ＰＢＭＣから、陰性磁気細胞分離により精製したＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞は、非ＮＫ細胞に結合する抗体またはその断片のカクテルとカップリングさせた磁気ビーズを使用することにより分離する。次いで、濃縮したＮＫ細胞の集団を含む陰性画分を、ＮＫ細胞の活性化および後続の形質導入に適する細胞培養培地、すなわち、Ｉｌ－２および／またはＩＬ－１５および／またはＩＬ－１８を含む培地に添加する。
【0124】
これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0125】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、例えば、ＷＯ２０１３０７６０７０Ａ１に開示するように、陰性磁気細胞分離および赤血球沈降により、ヒト全血から精製した（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＮＫ細胞単離キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ＮＫ細胞であり得る。
【0126】
これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0127】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、精製したＮＫ細胞の亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0128】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、精製したＣＸ３ＣＲ１陰性ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0129】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、精製したＫＬＲＧ１またはＣＤ５７陰性ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0130】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、精製したＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0131】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、精製したメモリー様ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0132】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、サイトカイン誘導メモリー様ＮＫ細胞である、ＮＫ細胞であり得る。これらのＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0133】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、単一ＫＩＲ分子に対して陽性であるか、または特定のＫＩＲ分子に対して陽性の、精製ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0134】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、ウイルスペプチドに特異的な精製ＮＫ細胞亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの精製ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0135】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、サイトカインおよびケモカインを分泌する亜集団について濃縮した、ＮＫ細胞であり得る。これらの濃縮ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0136】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、蛍光活性化セルソーターを使用して単離した亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの単離ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0137】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、マイクロチップをベースとするセルソーター、例えば、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｔｙｔｏ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用して単離した亜集団である、ＮＫ細胞であり得る。これらの単離ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0138】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることができる。
【0139】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、タグ化タンパク質、例えば、ビオチン化抗体に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることができる。
【0140】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0141】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、１つまたは複数のケモカイン受容体を発現させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0142】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、天然に存在する受容体よりも親和性バージョンが高いか、または低いＮＫ細胞受容体を発現させることができるＮＫ細胞であり得る。前記ＮＫ細胞受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３３５／ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ２２６／ＤＮＡＭ－１またはキラー免疫グロブリン様受容体の群から選択され得る。
【0143】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、免疫制御分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＤ３９またはＣＤ７３を発現させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0144】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、阻害受容体、例えば、ＫＩＲ分子、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１またはＡ２ＡＲの発現を増加または低下させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0145】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を産生することができるＮＫ細胞であり得る。
【0146】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、ペプチド治療薬またはタンパク質治療薬、例えば、治療抗体を発現させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0147】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の集団を含む細胞培養培地中の前記ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入して、細胞追跡用のタンパク質、例えば、蛍光追跡用ＧＦＰ、またはルシフェリンによる化学発光追跡用ルシフェラーゼを発現させることができるＮＫ細胞であり得る。
【0148】
本発明の一実施形態では、ＮＫ細胞の単離、ＮＫ細胞の培養およびＮＫ細胞への形質導入からなる方法は、当業者により公知の閉鎖系において実施する。さらなる実施形態では、閉鎖系は、細胞処理デバイスに取り付けられた使い捨てのチューブセットである。さらなる実施形態では、前記細胞処理デバイスは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）である。さらなる実施形態では、形質導入ＮＫ細胞は、第２の閉鎖系において、より大量に、さらに培養する。
【0149】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、形質導入後に、約２００～１０００リットルの容量で大規模に増殖させ、多数の患者のための遺伝子修飾ＮＫ細胞の臨床的産物がもたらされる。
【0150】
本発明の一実施形態では、前記形質導入ＮＫ細胞は、凍結保存する。凍結保存したＮＫ細胞のアリコートは、解凍し、前記培養プロセスにおいてさらに培養し、凍結保存した細胞バンクから、形質導入ＮＫ細胞が生成可能となる。
【0151】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、単一ＮＫ細胞から、限界希釈して、表現型的に均一なＮＫ細胞産物を生成することにより増殖させる。この均一なＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0152】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、腫瘍生検から単離した腫瘍浸潤ＮＫ細胞である。これらの単離ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0153】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、細胞培養プロセスにおいて、臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞から生成する。これらの生成ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0154】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、細胞培養プロセスにおいて、誘導多能性幹細胞から生成する。これらの生成ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0155】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、高いＮＫ細胞機能性のために選択したドナーの血液から単離する。これらの単離および選択したＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【0156】
本発明の一実施形態では、前記ＮＫ細胞は、臍帯血から単離する。これらの単離ＮＫ細胞は、本明細書に開示のレトロウイルスベクター粒子またはそのウイルス様粒子により形質導入することができる。
【実施例】
【0157】
実施例１：驚くべきことに、ヒヒエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）によりシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは、ＮＫ細胞が予め活性化されている場合、初代ＮＫ細胞への高い形質導入効率を示す。
バフィーコートからのＮＫ細胞の単離では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、標準的な密度勾配遠心分離により実施した。ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を適用して、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を、そのまま濃縮（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）した。単離したＮＫ細胞を３つの群に分割し、それらを異なる期間活性化し、ＧＦＰを含有するＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。すべての形質導入は、１０ｎｇ／ｍｌのｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）およびスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を用いて、製造者のプロトコールに従って実施した。第１の群のＮＫ細胞は、単離直後に（活性化せずに）形質導入した。第２の群のＮＫ細胞は、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、１日培養し（ＩＬ－２＋ＩＬ－１５中で１日活性化）、次いで、形質導入した。第３の群のＮＫ細胞は、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、２日間培養し（ＩＬ－２＋ＩＬ－１５中で２日間活性化）、次いで、形質導入した。各形質導入群の対照として、ウイルスベクターを添加しないことを除いて（非形質導入）形質導入細胞と同一条件下で、ＮＫ細胞を培養した。形質導入から３日後、非活性化ＮＫ細胞は、わずか２．４４％の形質導入を示した（非活性化、図１の左下パネル）。一方、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、１日および２日間培養したＮＫ細胞群は、１４．５９％および２２．６１％のＧＦＰ発現をそれぞれ示した（図１、形質導入、中央および右下のパネル）。各群では、非形質導入ＮＫ細胞は、ＧＦＰ発現をまったく示さなかった（図１、上のパネル、非形質導入）。
バフィーコートからのＮＫ細胞の単離では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、標準的な密度勾配遠心分離により実施した。ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を適用して、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を、そのまま濃縮（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）した。単離したＮＫ細胞を３つの群に分割し、それらを異なる期間活性化し、ＧＦＰを含有するＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。すべての形質導入は、１０ｎｇ／ｍｌのｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）およびスピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を用いて、製造者のプロトコールに従って実施した。第１の群のＮＫ細胞は、単離直後に（活性化せずに）形質導入した。第２の群のＮＫ細胞は、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、１日培養し（ＩＬ－２＋ＩＬ－１５中で１日活性化）、次いで、形質導入した。第３の群のＮＫ細胞は、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、２日間培養し（ＩＬ－２＋ＩＬ－１５中で２日間活性化）、次いで、形質導入した。各形質導入群の対照として、ウイルスベクターを添加しないことを除いて（非形質導入）形質導入細胞と同一条件下で、ＮＫ細胞を培養した。形質導入から３日後、非活性化ＮＫ細胞は、わずか２．４４％の形質導入を示した（非活性化、図１の左下パネル）。一方、５％のＡＢ型血清、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で、１日および２日間培養したＮＫ細胞群は、１４．５９％および２２．６１％のＧＦＰ発現をそれぞれ示した（図１、形質導入、中央および右下のパネル）。各群では、非形質導入ＮＫ細胞は、ＧＦＰ発現をまったく示さなかった（図１、上のパネル、非形質導入）。
【0158】
実施例２：ＢａＥＶによる活性化ＮＫ細胞の形質導入は、ＶＳＶ－Ｇによる形質導入よりも著しく高く、長期にわたって安定であり、細胞死を誘導しない。
初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離することで、純粋なＣＤ３－およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞を得た（図２Ａ）。Ｔ細胞を同一の血液試料から、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＣＤ４に対するＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＣＤ８に対するＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ユーザーマニュアルに従って単離し、純粋なＣＤ３陽性Ｔ細胞をもたらした（図２Ａ）。単離後、ＮＫ細胞を２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。単離後、Ｔ細胞を２日間、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２およびＭｉｌｔｅｎｙｉのＴ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ ｈｕｍａｎを含むＴｅｘＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で、ユーザーマニュアルに従って活性化した。次いで、活性化した初代Ｔ細胞およびＮＫ細胞、ならびにＮＫ－９２細胞株に、ＶＳＶ－ＧエンベロープまたはＢａＥＶのいずれかでシュードタイプ化した、ＧＦＰ発現をコードするレンチウイルスベクターを含有する上清により形質導入した。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ウイルス粒子による形質導入から３日後、ＮＫ細胞は、高ウイルス力価でも、約２％のＧＦＰ発現しか示さず、一方、Ｔ細胞は、同一条件下で、約７７％の高いＧＦＰ発現を示した（図２Ｂ）。この知見により、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターによるＮＫ細胞への形質導入は、非効率的であるが、Ｔ細胞を含む他の細胞型には作用することが確認される。驚くべきことに、ＢａＥＶシュードタイプ化ウイルスベクターによるＮＫ細胞株ＮＫ－９２への形質導入から３日後、ほぼ１００％の高いＧＦＰ発現が観察されたが、ＶＳＶ－ＧによるＧＦＰ発現は、初代ＮＫ細胞と同様に、非効率的であった（図２Ｃ）。ＮＫ－９２細胞は、活性化条件下で、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中に維持した。ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによる形質導入を適用した場合、ＮＫ－９２についての知見と一致して、６０％の驚くほど高い割合の活性化初代ＮＫ細胞がＧＦＰを発現し、Ｔ細胞と同等の形質導入率に達した（図２Ｄ）。重要なことには、細胞数の経時的上昇を意味する増殖率は、非形質導入ＮＫ細胞、およびＢａＥＶシュードタイプ化により形質導入したＮＫ細胞と同等であり、形質導入方法により、ＮＫ細胞の細胞死も誘導されず、増殖も影響されないことが示された（図５）。これは、治療により高度の細胞死が引き起こされる、遺伝子修飾のための他の方法、例えば、エレクトロポレーションとは異なる。加えて、遺伝子修飾のための他の方法、例えば、エレクトロポレーションでは、導入遺伝子の一過性発現のみが可能となる。注目すべきことに、ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターによる形質導入後、導入遺伝子を発現したＮＫ細胞が、常に高い割合で、数週間にわたって安定であった（図６）。
初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離することで、純粋なＣＤ３－およびＣＤ５６＋ＮＫ細胞を得た（図２Ａ）。Ｔ細胞を同一の血液試料から、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＣＤ４に対するＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＣＤ８に対するＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ユーザーマニュアルに従って単離し、純粋なＣＤ３陽性Ｔ細胞をもたらした（図２Ａ）。単離後、ＮＫ細胞を２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。単離後、Ｔ細胞を２日間、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２およびＭｉｌｔｅｎｙｉのＴ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ ｈｕｍａｎを含むＴｅｘＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で、ユーザーマニュアルに従って活性化した。次いで、活性化した初代Ｔ細胞およびＮＫ細胞、ならびにＮＫ－９２細胞株に、ＶＳＶ－ＧエンベロープまたはＢａＥＶのいずれかでシュードタイプ化した、ＧＦＰ発現をコードするレンチウイルスベクターを含有する上清により形質導入した。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ウイルス粒子による形質導入から３日後、ＮＫ細胞は、高ウイルス力価でも、約２％のＧＦＰ発現しか示さず、一方、Ｔ細胞は、同一条件下で、約７７％の高いＧＦＰ発現を示した（図２Ｂ）。この知見により、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターによるＮＫ細胞への形質導入は、非効率的であるが、Ｔ細胞を含む他の細胞型には作用することが確認される。驚くべきことに、ＢａＥＶシュードタイプ化ウイルスベクターによるＮＫ細胞株ＮＫ－９２への形質導入から３日後、ほぼ１００％の高いＧＦＰ発現が観察されたが、ＶＳＶ－ＧによるＧＦＰ発現は、初代ＮＫ細胞と同様に、非効率的であった（図２Ｃ）。ＮＫ－９２細胞は、活性化条件下で、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中に維持した。ＢａＥＶシュードタイプ化ベクターによる形質導入を適用した場合、ＮＫ－９２についての知見と一致して、６０％の驚くほど高い割合の活性化初代ＮＫ細胞がＧＦＰを発現し、Ｔ細胞と同等の形質導入率に達した（図２Ｄ）。重要なことには、細胞数の経時的上昇を意味する増殖率は、非形質導入ＮＫ細胞、およびＢａＥＶシュードタイプ化により形質導入したＮＫ細胞と同等であり、形質導入方法により、ＮＫ細胞の細胞死も誘導されず、増殖も影響されないことが示された（図５）。これは、治療により高度の細胞死が引き起こされる、遺伝子修飾のための他の方法、例えば、エレクトロポレーションとは異なる。加えて、遺伝子修飾のための他の方法、例えば、エレクトロポレーションでは、導入遺伝子の一過性発現のみが可能となる。注目すべきことに、ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターによる形質導入後、導入遺伝子を発現したＮＫ細胞が、常に高い割合で、数週間にわたって安定であった（図６）。
【0159】
実施例３：驚くべきことに、ＩＬ－３３によるＮＫ細胞の短期的活性化により、ＮＫ細胞の形質導入率が、ＩＬ－３３を使用しない場合よりも高くなる。
初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離した。精製ＮＫ細胞を２日間、ＩＬ－２（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ－２（５００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－３３（３０Ｕ／ｍｌ）のいずれかを含有する、５％のＡＢ型血清を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。２日目に、目的の遺伝子を含有する、ヒヒ（ＢａＥＶ）（図３Ａ）またはＶＳＶ－Ｇ（図３Ｂ）エンベロープによりシュードタイプ化した、レンチウイルスベクターによって細胞を形質導入した。形質導入は、実施例１に記載のように行った。非形質導入細胞は、形質導入細胞と同一条件下で培養した。形質導入後、ＩＬ－３３を含まない培地中で細胞を培養した。形質導入ＮＫ細胞における導入遺伝子発現を、目的の遺伝子の産物に対する特異的モノクローナル抗体により、形質導入後３日目、８日目、および１４日目に検出した。形質導入後３日目の導入遺伝子発現はそれぞれ、ＩＬ－３３を用いない場合は、１６．６２であり、ＩＬ－３３を用いた場合は、２１．２７％であった（図３Ａ、左下のパネル）。形質導入後８日目の導入遺伝子発現はそれぞれ、ＩＬ－３３を用いない場合は、３２．５９％であり、ＩＬ－３３を用いた場合は、４５．０３％であった（図３Ａ、中央のパネル）。形質導入後１４日目では、導入遺伝子発現は、ＩＬ－３３を用いない場合、３３．６６％であり、ＩＬ－３３を用いた場合、６０．１７％であった（図３Ａ、右下のパネル）。この結果は、ＮＫ細胞をＩＬ－３３により予め刺激すると、形質導入に相加効果があることを示唆する。非形質導入ＮＫ細胞は、非常に低いレベルの抗体染色を示した（１％未満、図３Ａ、上のパネル）。ＶＳＶ－Ｇエンベロープによりシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは、ヒヒシュードタイプ化ベクターと比較して著しく低い形質導入効率を示したが、ＩＬ－３３の相加効果は、依然として著しい（図３Ｂ）。
初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離した。精製ＮＫ細胞を２日間、ＩＬ－２（５００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ－２（５００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－３３（３０Ｕ／ｍｌ）のいずれかを含有する、５％のＡＢ型血清を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。２日目に、目的の遺伝子を含有する、ヒヒ（ＢａＥＶ）（図３Ａ）またはＶＳＶ－Ｇ（図３Ｂ）エンベロープによりシュードタイプ化した、レンチウイルスベクターによって細胞を形質導入した。形質導入は、実施例１に記載のように行った。非形質導入細胞は、形質導入細胞と同一条件下で培養した。形質導入後、ＩＬ－３３を含まない培地中で細胞を培養した。形質導入ＮＫ細胞における導入遺伝子発現を、目的の遺伝子の産物に対する特異的モノクローナル抗体により、形質導入後３日目、８日目、および１４日目に検出した。形質導入後３日目の導入遺伝子発現はそれぞれ、ＩＬ－３３を用いない場合は、１６．６２であり、ＩＬ－３３を用いた場合は、２１．２７％であった（図３Ａ、左下のパネル）。形質導入後８日目の導入遺伝子発現はそれぞれ、ＩＬ－３３を用いない場合は、３２．５９％であり、ＩＬ－３３を用いた場合は、４５．０３％であった（図３Ａ、中央のパネル）。形質導入後１４日目では、導入遺伝子発現は、ＩＬ－３３を用いない場合、３３．６６％であり、ＩＬ－３３を用いた場合、６０．１７％であった（図３Ａ、右下のパネル）。この結果は、ＮＫ細胞をＩＬ－３３により予め刺激すると、形質導入に相加効果があることを示唆する。非形質導入ＮＫ細胞は、非常に低いレベルの抗体染色を示した（１％未満、図３Ａ、上のパネル）。ＶＳＶ－Ｇエンベロープによりシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは、ヒヒシュードタイプ化ベクターと比較して著しく低い形質導入効率を示したが、ＩＬ－３３の相加効果は、依然として著しい（図３Ｂ）。
【0160】
実施例４：ＩＬ－１８により、ＩＬ－３３と同様に、ＮＫ細胞形質導入率が増加し、ＩＬ－１ファミリーサイトカインの一般的役割を示唆した。
３人の異なるドナーから、初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離した。単離後、同一のドナー由来のＮＫ細胞を、２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８を添加するか、またはＩＬ－１８を添加せずに活性化した。次いで、活性化初代ＮＫ細胞を、ＢａＥＶによりシュードタイプ化した、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した。形質導入後、ＩＬ－１８を含まないが、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含む培養培地中で、細胞を培養した。形質導入から３日後、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１８を用いずに予め活性化した場合、４０％の平均ＧＦＰ発現を示したが、同一のドナー由来のＮＫ細胞は、ＩＬ－１８を用いて予め活性化した場合、６６％の著しく高いＧＦＰ発現を示した（図４）。
３人の異なるドナーから、初代ＮＫ細胞を実施例１に記載のように単離した。単離後、同一のドナー由来のＮＫ細胞を、２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１８を添加するか、またはＩＬ－１８を添加せずに活性化した。次いで、活性化初代ＮＫ細胞を、ＢａＥＶによりシュードタイプ化した、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した。形質導入後、ＩＬ－１８を含まないが、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含む培養培地中で、細胞を培養した。形質導入から３日後、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１８を用いずに予め活性化した場合、４０％の平均ＧＦＰ発現を示したが、同一のドナー由来のＮＫ細胞は、ＩＬ－１８を用いて予め活性化した場合、６６％の著しく高いＧＦＰ発現を示した（図４）。
【0161】
実施例５：ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターの使用により、ＣＤ１９ ＣＡＲを活性化ＮＫ細胞に効率的に形質導入して、ＣＤ１９陽性標的細胞を特異的に殺滅することが可能となる。
ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞白血病の治療のための臨床試験において非常に肯定的な結果をもたらした。ＣＡＲ ＮＫ細胞が、ＣＡＲ Ｔ細胞の代替物であり得るため、本発明者らは、ＮＫ細胞形質導入についての一例示的適用のように、ＣＤ１９に対するＣＡＲをＮＫ細胞に形質導入した。初代ＮＫ細胞は、４人の異なるドナーから、実施例１に記載のように単離した。単離後、同一のドナー由来のＮＫ細胞を２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。次いで、活性化初代ＮＫ細胞を、ＣＤ１９－ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した。使用した「ＣＤ１９Ｂ」ＣＡＲ構築物およびＶＳＶ－Ｇによる形質導入後のＴ細胞におけるその発現は、これまでに記載されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら２０１７）。ＮＫ細胞への形質導入では、ＢａＥＶによりシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは、この構築物のために生成し、使用した。形質導入から７日後、ＣＡＲ発現およびＮＫ細胞の細胞毒性を解析した。詳細には、ＮＫ細胞を４８時間、無血清培養培地中でインキュベーション後、２５μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＤ１９ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との３０分間の結合により、ＣＤ１９－ＣＡＲ発現を判定し、Ｆｃに対するマウスＡＰＣコンジュゲートｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、フローサイトメトリーにより検出した。ＣＤ１９－ＣＡＲの発現は、平均して、種々のドナー由来のＮＫ細胞間で７０％であり、一部のドナーは、形質導入率が９０％に達した（図７Ａ）。種々の標的細胞株の標的細胞の殺滅を、フローサイトメトリーをベースとするアッセイにより解析した。標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により標識し、１ウェルあたり２×１０３細胞を、９６ウェルの丸底プレート中に播種した。次いで、対照として培地、またはＮＫ細胞を種々のＮＫ対標的比で添加した。２４時間後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性標的細胞を、フローサイトメトリーにより定量化した。ＮＫ細胞を含む試料中の生標的細胞とＮＫ細胞を含まない対応する試料との差を、殺滅された標的として定義した。Ｋ５６２細胞は、ＣＤ１９を発現しないが（図７Ｂ）、それらが、ＮＫ細胞の天然の細胞毒性に対する感受性を有するため、ＮＫ細胞の一般的細胞毒性能を試験するための標準的な標的であると考えることができる。予想どおり、ＣＡＲ ＮＫ細胞および非形質導入ＮＫ細胞はともに、まったく同様に用量依存的に、Ｋ５６２細胞を非常に効率的に殺滅し、ＣＤ１９非依存性の天然細胞毒性が、形質導入により影響されないことを立証した（図７Ｃ）。Ｋ５６２細胞とは対照的に、ＲＳ４；１１細胞は、ＣＤ１９を発現するが（図７Ｂ）、それらは、ＮＫ細胞の天然細胞毒性に対して完全に非感受性である。結果的に、非形質導入ＮＫ細胞は、ＲＳ４；１１細胞を殺滅することが不可能であり、一方、ＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞と同等に効率的にＲＳ４；１１を殺滅し、使用したＣＤ１９ ＣＡＲの高い機能性および特異性を実証した（図７Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１９陽性であるが（図７Ｂ）、ＲＳ４；１１とは異なり、それらは、活性化ＮＫ細胞の天然細胞毒性に対して感受性であるが、Ｋ５６２細胞ほどではない。したがって、非形質導入ＮＫ細胞は、既に、用量依存的にＲａｊｉ細胞を殺滅可能であったが、それにもかかわらず、ＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞によるＲａｊｉ細胞の殺滅は、著しくより高く、ＣＤ－１９特異的殺滅の相加効果を示唆していた。結論として、ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターによるＮＫ細胞への形質導入は、白血病標的細胞のＣＤ１９特異的殺滅が向上したＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を効率的に生成することを可能とした。
ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞白血病の治療のための臨床試験において非常に肯定的な結果をもたらした。ＣＡＲ ＮＫ細胞が、ＣＡＲ Ｔ細胞の代替物であり得るため、本発明者らは、ＮＫ細胞形質導入についての一例示的適用のように、ＣＤ１９に対するＣＡＲをＮＫ細胞に形質導入した。初代ＮＫ細胞は、４人の異なるドナーから、実施例１に記載のように単離した。単離後、同一のドナー由来のＮＫ細胞を２日間、５％のＡＢ型血清、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ中で活性化した。次いで、活性化初代ＮＫ細胞を、ＣＤ１９－ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターにより形質導入した。使用した「ＣＤ１９Ｂ」ＣＡＲ構築物およびＶＳＶ－Ｇによる形質導入後のＴ細胞におけるその発現は、これまでに記載されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら２０１７）。ＮＫ細胞への形質導入では、ＢａＥＶによりシュードタイプ化したレンチウイルスベクターは、この構築物のために生成し、使用した。形質導入から７日後、ＣＡＲ発現およびＮＫ細胞の細胞毒性を解析した。詳細には、ＮＫ細胞を４８時間、無血清培養培地中でインキュベーション後、２５μｇ／ｍＬの組換えヒトＣＤ１９ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）との３０分間の結合により、ＣＤ１９－ＣＡＲ発現を判定し、Ｆｃに対するマウスＡＰＣコンジュゲートｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、フローサイトメトリーにより検出した。ＣＤ１９－ＣＡＲの発現は、平均して、種々のドナー由来のＮＫ細胞間で７０％であり、一部のドナーは、形質導入率が９０％に達した（図７Ａ）。種々の標的細胞株の標的細胞の殺滅を、フローサイトメトリーをベースとするアッセイにより解析した。標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により標識し、１ウェルあたり２×１０３細胞を、９６ウェルの丸底プレート中に播種した。次いで、対照として培地、またはＮＫ細胞を種々のＮＫ対標的比で添加した。２４時間後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性標的細胞を、フローサイトメトリーにより定量化した。ＮＫ細胞を含む試料中の生標的細胞とＮＫ細胞を含まない対応する試料との差を、殺滅された標的として定義した。Ｋ５６２細胞は、ＣＤ１９を発現しないが（図７Ｂ）、それらが、ＮＫ細胞の天然の細胞毒性に対する感受性を有するため、ＮＫ細胞の一般的細胞毒性能を試験するための標準的な標的であると考えることができる。予想どおり、ＣＡＲ ＮＫ細胞および非形質導入ＮＫ細胞はともに、まったく同様に用量依存的に、Ｋ５６２細胞を非常に効率的に殺滅し、ＣＤ１９非依存性の天然細胞毒性が、形質導入により影響されないことを立証した（図７Ｃ）。Ｋ５６２細胞とは対照的に、ＲＳ４；１１細胞は、ＣＤ１９を発現するが（図７Ｂ）、それらは、ＮＫ細胞の天然細胞毒性に対して完全に非感受性である。結果的に、非形質導入ＮＫ細胞は、ＲＳ４；１１細胞を殺滅することが不可能であり、一方、ＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞と同等に効率的にＲＳ４；１１を殺滅し、使用したＣＤ１９ ＣＡＲの高い機能性および特異性を実証した（図７Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１９陽性であるが（図７Ｂ）、ＲＳ４；１１とは異なり、それらは、活性化ＮＫ細胞の天然細胞毒性に対して感受性であるが、Ｋ５６２細胞ほどではない。したがって、非形質導入ＮＫ細胞は、既に、用量依存的にＲａｊｉ細胞を殺滅可能であったが、それにもかかわらず、ＣＤ１９ ＣＡＲ ＮＫ細胞によるＲａｊｉ細胞の殺滅は、著しくより高く、ＣＤ－１９特異的殺滅の相加効果を示唆していた。結論として、ＢａＥＶシュードタイプ化レンチウイルスベクターによるＮＫ細胞への形質導入は、白血病標的細胞のＣＤ１９特異的殺滅が向上したＣＤ１９ ＣＡＲ発現ＮＫ細胞を効率的に生成することを可能とした。
【0162】
実施例６：ナイーブＮＫ細胞ではなく、活性化ＮＫ細胞が、ヒヒエンベロープＡＳＣＴ２の受容体を発現した。
ＮＫ細胞は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）中で２日間、増殖することにより活性化した。ナイーブおよび活性化細胞をともに、ＲＩＰＡ溶解バッファー中に溶解し、ＡＳＣＴ２に対する抗体を使用してウエスタンブロット解析に供した。この結果は、ヒヒエンベロープ、ＡＳＣＴ２の受容体が、ＮＫ細胞活性化後のみに発現するが（図８）、ナイーブＮＫ細胞では発現しないことを示し、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入するために、ＮＫ細胞を活性化する必要があることを示唆した。
ＮＫ細胞は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５を含むＮＫ ＭＡＣＳ ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）中で２日間、増殖することにより活性化した。ナイーブおよび活性化細胞をともに、ＲＩＰＡ溶解バッファー中に溶解し、ＡＳＣＴ２に対する抗体を使用してウエスタンブロット解析に供した。この結果は、ヒヒエンベロープ、ＡＳＣＴ２の受容体が、ＮＫ細胞活性化後のみに発現するが（図８）、ナイーブＮＫ細胞では発現しないことを示し、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入するために、ＮＫ細胞を活性化する必要があることを示唆した。
【0163】
実施例７：静止ＮＫ細胞ではなく、増殖性ＮＫ細胞は、形質導入可能である。
ＮＫ細胞を増殖色素で標識し、広範に洗浄し、次いで、ＧＦＰを含有するヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。増殖開始および形質導入から４日後、細胞増殖および形質導入をフローサイトメトリーにより判定した。結果は、静止ＮＫ細胞ではなく、増殖性ＮＫ細胞のみが、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入可能であることを示唆する（図９Ａ）。ＧＦＰ形質導入ＮＫ細胞を抗ＣＤ５６抗体で染色し、３つのＮＫ細胞群（増殖ＧＦＰ＋、増殖ＧＦＰ－、静止状態）にゲーティングしてＣＤ５６発現のレベルを判定した（図９Ｂ）。増殖し形質導入したＮＫ細胞のすべてが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔであり、一方、形質導入せず静止状態のＮＫ細胞が、ＣＤ５６ｄｉｍであり、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫサブセットは、増殖性でなく、形質導入不可能であることを示唆した。次に、本発明者らは、他のＮＫ細胞受容体を、増殖し形質導入した、増殖性であるが形質導入していない、および静止状態のＮＫ細胞のサブセット間でさらに比較した（図１０）。ＮＫ細胞を増殖色素で標識し、広範に洗浄し、次いで、ＧＦＰを含有するヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。形質導入から４日後、種々のＮＫ細胞受容体に対するモノクローナル抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を判定した。一般的に公知のＮＫ細胞マーカーの種々のサブセット間での発現を示す（図１０）。ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ｃの発現は、すべての異なるＮＫ細胞サブセット間で同等であった。増殖性細胞の画分においては、ＧＦＰ＋とＧＦＰ－との間の異なるＮＫ細胞マーカーの発現の差は、顕著ではなかった。しかし、いくつかのマーカーの発現によれば、静止ＮＫ細胞は、増殖性ＮＫ細胞よりも表現型が顕著に異なった。増殖性細胞は、よりＣＤ５６強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）であり、ＣＤ１６発現がより低く、活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現がより高く、ならびにＴＲＡＩＬおよびＮＫＧ２Ａの発現がより高い傾向を有した（図１０）。
ＮＫ細胞を増殖色素で標識し、広範に洗浄し、次いで、ＧＦＰを含有するヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。増殖開始および形質導入から４日後、細胞増殖および形質導入をフローサイトメトリーにより判定した。結果は、静止ＮＫ細胞ではなく、増殖性ＮＫ細胞のみが、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入可能であることを示唆する（図９Ａ）。ＧＦＰ形質導入ＮＫ細胞を抗ＣＤ５６抗体で染色し、３つのＮＫ細胞群（増殖ＧＦＰ＋、増殖ＧＦＰ－、静止状態）にゲーティングしてＣＤ５６発現のレベルを判定した（図９Ｂ）。増殖し形質導入したＮＫ細胞のすべてが、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔであり、一方、形質導入せず静止状態のＮＫ細胞が、ＣＤ５６ｄｉｍであり、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫサブセットは、増殖性でなく、形質導入不可能であることを示唆した。次に、本発明者らは、他のＮＫ細胞受容体を、増殖し形質導入した、増殖性であるが形質導入していない、および静止状態のＮＫ細胞のサブセット間でさらに比較した（図１０）。ＮＫ細胞を増殖色素で標識し、広範に洗浄し、次いで、ＧＦＰを含有するヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより形質導入した。形質導入から４日後、種々のＮＫ細胞受容体に対するモノクローナル抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーを使用して発現を判定した。一般的に公知のＮＫ細胞マーカーの種々のサブセット間での発現を示す（図１０）。ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ｃの発現は、すべての異なるＮＫ細胞サブセット間で同等であった。増殖性細胞の画分においては、ＧＦＰ＋とＧＦＰ－との間の異なるＮＫ細胞マーカーの発現の差は、顕著ではなかった。しかし、いくつかのマーカーの発現によれば、静止ＮＫ細胞は、増殖性ＮＫ細胞よりも表現型が顕著に異なった。増殖性細胞は、よりＣＤ５６強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）であり、ＣＤ１６発現がより低く、活性化受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現がより高く、ならびにＴＲＡＩＬおよびＮＫＧ２Ａの発現がより高い傾向を有した（図１０）。
【0164】
実施例８：ＣＸ３ＣＲ１
ｎｅｇ
ＮＫ細胞サブセットは、高度に増殖性かつ形質導入可能である。
５人のドナー由来のＮＫ細胞を使用して、３７１種の表面マーカーについて、フローサイトメトリーにより解析した。静止ＮＫ細胞と増殖性ＮＫ細胞のマーカープロファイル間の差を解析し、これをさらに、ＧＦＰ発現集団とＧＦＰ陰性集団とに分けた。スクリーニングから、ＧＦＰを発現しない静止ＮＫ細胞と、形質導入することができＧＦＰを発現する増殖性ＮＫ細胞との間で最良に識別されたマーカーを判定した。全体的に、静止ＮＫ細胞との直接比較では、増殖性およびＧＦＰ陽性のＮＫ細胞は、３２種のマーカーをより高いレベルで、５種のマーカーをより低いレベルで発現した（図１１Ａ）。これらのマーカーのうち、一部は、発現レベルが異なっただけでなく、特異的マーカーを発現するＮＫ細胞の存在頻度も異なった。最も明白であったことは、増殖性およびＧＦＰ陽性のＮＫ細胞間の、ＣＸ３ＣＲ１の発現の非存在およびＴＲＡＩＬを強力に発現する細胞の存在頻度の高さであった（図１１Ｂ）。
５人のドナー由来のＮＫ細胞を使用して、３７１種の表面マーカーについて、フローサイトメトリーにより解析した。静止ＮＫ細胞と増殖性ＮＫ細胞のマーカープロファイル間の差を解析し、これをさらに、ＧＦＰ発現集団とＧＦＰ陰性集団とに分けた。スクリーニングから、ＧＦＰを発現しない静止ＮＫ細胞と、形質導入することができＧＦＰを発現する増殖性ＮＫ細胞との間で最良に識別されたマーカーを判定した。全体的に、静止ＮＫ細胞との直接比較では、増殖性およびＧＦＰ陽性のＮＫ細胞は、３２種のマーカーをより高いレベルで、５種のマーカーをより低いレベルで発現した（図１１Ａ）。これらのマーカーのうち、一部は、発現レベルが異なっただけでなく、特異的マーカーを発現するＮＫ細胞の存在頻度も異なった。最も明白であったことは、増殖性およびＧＦＰ陽性のＮＫ細胞間の、ＣＸ３ＣＲ１の発現の非存在およびＴＲＡＩＬを強力に発現する細胞の存在頻度の高さであった（図１１Ｂ）。
【0165】
実施例９：ＣＸ３ＣＲ１
ｎｅｇ
ＮＫ細胞サブセットは、ヒヒシュードタイプ化レンチウイルスベクターにより高度に形質導入可能であり、マーカーとして使用され得る。
増殖および形質導入と最良に相関した表面分子から、さらなる調査のためにＣＸ３ＣＲ１を選択して、このマーカーが、増殖および形質導入の種々の能力を有するＮＫ細胞サブセット間で直接識別可能かどうかを試験した。種々のＮＫ細胞サブセットは、形質導入および培養の前に、ＭＣＡＳソーティングを使用して、それらのＣＸ３ＣＲ１発現に基づいて分離した。ソーティングなしでは、種々のドナー由来の血液由来ＮＫ細胞間のＣＸ３ＣＲ１の発現は、８６％であり、すべてのＮＫ細胞のうちの約１４％の小画分のみが、ＣＸ３ＣＲ１を発現しなかったことを意味した（図５Ａ）。ソーティング後では、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の平均存在頻度は、ＣＸ３ＣＲ１の濃縮により２％に低下させることができ、一方、マーカーの枯渇により９１％のＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の平均存在頻度がもたらされた（図１２Ａ）。別々にソートしたＮＫ細胞画分の培養および形質導入の直後、本発明者らは、導入遺伝子発現および増殖率に関して有意差を観察した（図１２Ｂ、１２Ｃ）。非ソート画分間では、増殖率およびＧＦＰ発現は、それぞれ２８％および２１％であった。同時に、限界容量のＣＸ３ＣＲ１陰性細胞を有するＣＸ３ＣＲ１濃縮画分は、たった１１％の増殖細胞および７％のＧＦＰ陽性細胞しか含有しなかった。印象的なことには、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の高い開始存在頻度を有するＣＸ３ＣＲ１枯渇画分間で、既に８１％が増殖し、６９％がＧＦＰ陽性であった。ＣＸ３ＣＲ１濃縮画分においても、増殖およびＧＦＰ発現は、残存ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ細胞において、主に観察された（図１２Ｃ）。まとめると、実験により、ＢａＥＶシュードタイプ化ＬＶにより効率的に形質導入することができ、高度に増殖性のＮＫ細胞のサブセットを同定した。このＮＫ細胞サブセットは、ＣＸ３ＣＲ１発現の非存在により明らかに定義することができ、この特性は、形質導入可能なＮＫ細胞の予備濃縮に使用することができる。
増殖および形質導入と最良に相関した表面分子から、さらなる調査のためにＣＸ３ＣＲ１を選択して、このマーカーが、増殖および形質導入の種々の能力を有するＮＫ細胞サブセット間で直接識別可能かどうかを試験した。種々のＮＫ細胞サブセットは、形質導入および培養の前に、ＭＣＡＳソーティングを使用して、それらのＣＸ３ＣＲ１発現に基づいて分離した。ソーティングなしでは、種々のドナー由来の血液由来ＮＫ細胞間のＣＸ３ＣＲ１の発現は、８６％であり、すべてのＮＫ細胞のうちの約１４％の小画分のみが、ＣＸ３ＣＲ１を発現しなかったことを意味した（図５Ａ）。ソーティング後では、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の平均存在頻度は、ＣＸ３ＣＲ１の濃縮により２％に低下させることができ、一方、マーカーの枯渇により９１％のＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の平均存在頻度がもたらされた（図１２Ａ）。別々にソートしたＮＫ細胞画分の培養および形質導入の直後、本発明者らは、導入遺伝子発現および増殖率に関して有意差を観察した（図１２Ｂ、１２Ｃ）。非ソート画分間では、増殖率およびＧＦＰ発現は、それぞれ２８％および２１％であった。同時に、限界容量のＣＸ３ＣＲ１陰性細胞を有するＣＸ３ＣＲ１濃縮画分は、たった１１％の増殖細胞および７％のＧＦＰ陽性細胞しか含有しなかった。印象的なことには、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇＮＫ細胞の高い開始存在頻度を有するＣＸ３ＣＲ１枯渇画分間で、既に８１％が増殖し、６９％がＧＦＰ陽性であった。ＣＸ３ＣＲ１濃縮画分においても、増殖およびＧＦＰ発現は、残存ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ細胞において、主に観察された（図１２Ｃ）。まとめると、実験により、ＢａＥＶシュードタイプ化ＬＶにより効率的に形質導入することができ、高度に増殖性のＮＫ細胞のサブセットを同定した。このＮＫ細胞サブセットは、ＣＸ３ＣＲ１発現の非存在により明らかに定義することができ、この特性は、形質導入可能なＮＫ細胞の予備濃縮に使用することができる。
【0166】
実施例１０：ＩＬ－１ベータによりＮＫ細胞形質導入率が増加した。
新たなＮＫ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５またはＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１β（ＩＬ－１ベータ）で３日間刺激した。活性化後２日目に、感染多重度（ＭＯＩ）３でリンパ球に形質導入した。翌日、細胞を洗浄し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５の存在下で、さらに７日間、増殖を継続させた。遺伝子修飾ＮＫ細胞の存在頻度を検出するために、ＣＡＲのｓｃＦｖドメインを特異的に標的とするビオチン化抗イディオタイプ抗体で細胞を標識した。ビオチンコンジュゲートの検出は、抗ビオチンＰＥ ２次ｍＡｂ標識化を使用して実施した。陽性細胞の割合は、各ドットプロットにより示し、ＩＬ－１ベータを含まずＩＬ－２／ＩＬ－１５で刺激したものと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１ベータで刺激した新たなＮＫ細胞により、優れた形質導入率をもたらすことを示す（６８％対５２％）。結果は、３つの独立した実験を代表する。
新たなＮＫ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５またはＩＬ－２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１β（ＩＬ－１ベータ）で３日間刺激した。活性化後２日目に、感染多重度（ＭＯＩ）３でリンパ球に形質導入した。翌日、細胞を洗浄し、ＩＬ－２／ＩＬ－１５の存在下で、さらに７日間、増殖を継続させた。遺伝子修飾ＮＫ細胞の存在頻度を検出するために、ＣＡＲのｓｃＦｖドメインを特異的に標的とするビオチン化抗イディオタイプ抗体で細胞を標識した。ビオチンコンジュゲートの検出は、抗ビオチンＰＥ ２次ｍＡｂ標識化を使用して実施した。陽性細胞の割合は、各ドットプロットにより示し、ＩＬ－１ベータを含まずＩＬ－２／ＩＬ－１５で刺激したものと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１ベータで刺激した新たなＮＫ細胞により、優れた形質導入率をもたらすことを示す（６８％対５２％）。結果は、３つの独立した実験を代表する。
【0167】
参考文献
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【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A-B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【配列表】